CN110106238A - 一种用于检测x染色体失活的双重pcr分子诊断试剂盒 - Google Patents
一种用于检测x染色体失活的双重pcr分子诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术和DNA检测技术领域,尤其涉及一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒及其使用方法,本发明试剂盒由甲基化敏感性限制性内切酶、一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的带有FAM荧光标记的引物、一对扩增MIC2基因的带有FAM荧光标记的引物和DNA聚合酶组成。采用本试剂盒诊断和家系分析,可判断异常X染色体的来源。此外,本试剂盒含有双重PCR引物进行扩增,扩增条件稳定、特异、灵敏。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及核酸检测技术领域,尤其涉及一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒及其使用方法,此外,本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。
背景技术
1、X染色体失活简介
X染色体失活或里昂化(lyonization)是指雌性哺乳类细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象,在此过程中X染色体会被包装成异染色质,进而因功能受抑制而沉默化。女性体细胞组织是由两类细胞构成的嵌合体,部分细胞中父本X染色体有活性(图1中浅色小球代表),其余细胞中母本X染色体有活性(图1中深色小球代表)。理论上这两部分细胞的比例应为1:1,当这一比率发生显著偏差(图1中B或C)时,称为X染色体失活偏移(showedX-chromosome inactivation,SXCI)。
2、X染色体失活检测的应用领域
针对伴X染色体隐性遗传病(XR)的女性患者来说,遗传检测证实其存在疾病相关基因突变,但突变为杂合子,理论是不发病的,可以推断其携带野生型基因的X染色体发生了失活,适用于该项检测;针对伴X染色体显性遗传病 (XD)的患者家属来说,遗传检测证实其存在基因突变,理论是发病的,但其临床表型正常,可以推断其携带突变型的X染色体发生了失活,同样适用于该项检测。因此X染色体失活多用于X染色体连锁疾病的研究上,X染色体失活的具体类型是该类疾病病因诊断的重要指标:此类疾病常见的有血友病、杜氏进行性肌营养不良、神经性腓骨肌萎缩症、Alport综合征、肾上腺脑白质营养不良、无汗性外胚层发育不良、红绿色盲、眼脑肾综合征、Lesch-Nyhan综合征、睾丸女性化、X连锁隐形遗传(女性遗传性)肾性尿崩症等。
3、X染色体失活的剂量补偿效应
Lyon假说是1961年M.F.Lyin提出的阐明哺乳动物剂量补偿效应的X染色体失活假说,主要内容有:正常雌性哺乳动物体细胞中,两条染色体中只有一条在遗传上是有活性的,其结果是X连锁基因得到了剂量补偿,保证雌性个体具有相同的有效基因产物。失活是随机的,发生在胚胎发育早期,某一细胞的一条染色体一旦失活,这个细胞的所有后代细胞中的该条X染色体均处于失活状态。杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体,即某些细胞中来自父方的伴性基因表达,某些细胞中来自母方的伴性基因表达,这两类细胞镶嵌存在。
4、X染色体失活的检测
X染色体失活中心(Xic)的存在对于X染色体失活至关重要:携带Xic的 X染色体可以遭受失活,而缺乏它的则不能。Xic的功能依赖于Xist,一个编码特定功能性非编码RNA的基因,XIST并不足以维持体细胞杂交体中X染色体的失活,同时,XIST也不是X失活的维持所必须的,在X失活的维持中起主要作用的是DNA的甲基化。其检测方法主要有表达方法和甲基化方法两种。表达方法是用RT-PCR的方法仅使表达的XIST基因反转录成cDNA,然后用PCR扩增反转录DNA。表达方法需进行反转录操作,过程繁琐,对技术人员要求较高。甲基化方法主要是利用甲基化敏感性的限制性内切酶对基因组DNA进行消化,失活的X染色体是甲基化的,不会被酶切,而有活性的X染色体是非甲基化的,可以被酶切为碎片。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或变性高效液相色谱法对酶切前后的PCR产物进行检测,判断出两条X染色体的失活比例。聚丙烯酰胺凝胶电泳法费时费力,变性高效液相色谱法灵敏度低,特异性不好,二者均不适用于临床推广。
发明内容
为了进一步提高X染色体失活检测方法的特异性和敏感性,我们在反复试验的基础上,研制开发出了一种新的用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒,本发明试剂盒具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测方法简便快速等优点。
首先,本发明提供了一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒,该试剂盒由下述试剂组成:
(1)甲基化敏感性限制性内切酶及甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液;
(2)一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的带有FAM 荧光标记的引物SEQ ID NO:1-2;
(3)一对扩增MIC2基因的带有FAM荧光标记的引物SEQ ID NO:3-4;
(4)DNA聚合酶。
其中:
SEQ ID NO-1:5’--FAM-CGTCCAAGACCTACCGAGGA--3’;
SEQ ID NO-2:5’--GAACCATCCTCACCCTGCTG--3’;
SEQ ID NO-3:5’--FAM-AGCCGTTCCAGAGAGAAA--3’;
SEQ ID NO-4:5’--CCCGCATCCACAGAGTAT--3’。
上述两对荧光引物可由本领域常用的方法合成,本发明使用的两对荧光引物均由北京天一辉远公司合成提供。
本发明所述的甲基化敏感性限制性内切酶为本领域常用的甲基化敏感性限制性内切酶;
本发明所述的甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液是本领域常用的消化反应液;
本发明所述的DNA聚合酶为本领域常用的DNA聚合酶。
本发明所述的试剂盒甲基化方法主要是利用甲基化敏感性的限制性内切酶对基因组DNA进行消化,失活的X染色体是甲基化的,不会被酶切,而有活性的X染色体是非甲基化的,可以被酶切为碎片。然后通过毛细管电泳对酶切前后的PCR产物进行检测,检测目的基因与参比基因所在位置峰的荧光强度,通过计算,判断出两条X染色体的失活比例及其遗传来源。
本发明所述的两对引物所对应靶基因的具体情况如下所述:
STR基因位点:本发明所述的AR基因是指human androgen receptor,雄激素受体基因,位于X染色体q11-12。目的基因为CAG三碱基重复,重复次数 8-31次。选用的限制性内切酶为HpaII,识别序列及裂解位点为5’…C/CGG… 3’,不能识别经甲基化修饰的基因序列,即失活的X染色体将扩增出200-300bp 的产物,而活性的X染色体被HpaII切断而无扩增产物。所述STR基因位点如图2所示。
MIC2基因位点:本发明所述的MIC2基因是指位于X和Y染色体短臂末端的MIC2基因,为染色体中存在的失活逃逸基因之一。作为内参基因用于报告酶切效果。在酶切的过程中,若酶切不完全,则可能导致假阳性的结果。为了确保酶切效果,予以加入MIC2基因作为内参基因。MIC2基因上的HTF(HpaII tiny fragment)岛包含了3个HpaII酶切位点,并且无论其位于失活与否的X染色体或Y染色体上,HTF岛均始终保持非甲基化状态。因此当酶切不完全时,则将会出现MIC2基因(位于X和Y染色体短臂的末端)的扩增片段长度363bp 的产物。所述MIC2基因位点如图3所示。
其次,本发明提供了上述用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)对女性标本进行基因组DNA抽提后获得DNA样本;
(2)使用甲基化敏感性限制性内切酶HpaII消化步骤(1)获得的DNA样本,反应条件为37℃过夜消化,所采用的甲基化敏感性限制性内切酶HpaII消化的反应体系为本领域常用的反应体系,其组成如下表1所示:
表1 HpaII消化的反应体系
(3)采用本发明所述的双重PCR引物对酶切前后的DNA进行PCR扩增, PCR扩增的反应体系采用本领域常用的反应体系,其组成如下表2所示:
表2 DNA扩增的反应体系
试剂 | 用量 |
灭菌水 | 5.75μL |
2X GC Buffer I | 12.5μL |
dNTP Mix | 4μL |
Taq酶 | 0.25μL |
AR-Primer-F/P(5pmol/μL) | 1μL |
MIC2-Primer-F/P(5pmol/μL) | 0.5μL |
DNA(50ng/μL)或酶切后产物 | 1μL |
其中双重PCR扩增条件为:94℃预变性1min,94℃30s,63℃30s,72℃ 45s,共31个循环,最后72℃延伸5min,12℃保存,如下表3所示:
表3 PCR反应条件
(4)利用毛细管电泳法对PCR产物进行分析,得到峰图,所采用的毛细管电泳体系为本领域常用体系,其组成如下表4所示:
表4 毛细管电泳体系
试剂 | 用量 |
Hi-Di甲酰胺 | 10μL |
600Liz内标 | 0.2μL |
PCR产物 | 0.2μL |
(5)对所得毛细管电泳峰图进行分析,具体方法如下:首先,根据图谱上峰的迁移位置确定每一个峰对应的基因;然后,分析图谱中MIC2基因酶切前后的PCR产物对应的峰;最后,根据峰的荧光强度,对X染色体失活情况以及家系来源进行判读。
其中所述女性标本为经G带核型分析,结果显示具有两个X,没有Y染色体的标本,可以是任何来源的女性器官组织或体细胞,如女性的外周血、脐带血、绒毛、骨髓或上皮细胞等。
其中,对X染色体失活情况的判读方法如下:
通过分析AR位点酶切前后的扩增产物判断X染色体失活情况,当AR位点为单峰时,说明该STR位点为纯合子,无法判断X染色体失活是否正常,当 AR位点为双峰时,根据下述公式信号强度计算失活比例:
a:父源X染色体失活比例=酶切后父源X染色体信号强度/酶切前父源X 染色体信号强度;
b:母源X染色体失活比例=酶切后母源X染色体信号强度/酶切前母源X 染色体信号强度;
3:7<a:b<7:3时,为X染色体随机失活;
a:b≥7:3时,为X染色体非随机失活,且失活来自父源;
a:b≤3:7时,为X染色体非随机失活,且失活来自母源。
另外,所述家系来源判读方法系将家系中先证者及其父母标本PCR产物检测所得毛细管电泳图排布在同一界面,纵向比较,在同一位置所出峰片段长度相同。通过家系比对,可以判断两个X染色体的来源(父源或母源),以便从遗传上追踪异常染色体的传递途径。
此外,本发明还涉及上述试剂盒在生物医学中的应用。
本发明试剂盒的特点与优势:
1、本发明试剂盒引物特异性更好。本发明在引物中加入了FAM荧光信号,可根据荧光颜色,区分靶基因与非特异产物,结果准确度高。与变性高效液相色谱法比较,毛细管电泳检测峰图更加清晰(见图4),而前者峰型不易分辨,且存在较多非特异峰,对结果的判读造成了较大的干扰(见图5,宽箭头为非特异)。
2、本发明试剂盒成本更低。与变性高效液相色谱法比较,毛细管电泳成本可以控制在1.4元/个以内(如下表5所示),而变性高效液相色谱法中的TEAA、乙腈等成本较高,为8元/个(如下表6所示)。同时,本发明试剂盒对PCR扩增条件进行了优化,仅需酶1.25U,而现有方法中至少需酶1.6U。
表5 毛细管电泳成本
表6 变性高效液相色谱法成本
3、本发明试剂盒所需上样量更低。与变性高效液相色谱法比较,毛细管电泳上样量仅为400ng,而前者需要大量的产物上样,约为100-150mg,毛细管电泳的灵敏度比前者高十万倍左右。
4、本发明试剂盒检测效果好,可检测出失活比例大于90%的阳性样本,判断出失活来源于父亲。从图中可以看出,酶切前PCR扩增父源失活峰,电泳检测峰高仅为3950,酶切后PCR扩增父源失活峰,电泳检测峰高达24102,说明引物的扩增效率很高。同时,酶切前母源峰和参比MIC峰高达25134及以上,酶切后母源和参比峰高几乎为零,说明酶切效果很好,检测结果准确(见图6)。
综上所述,本发明试剂盒可以为临床提供X染色体失活异常的分子检测,灵敏度高,特异性好。应用本试剂盒诊断,同时进行家系分析时,还可判断异常X染色体的来源。本发明试剂盒采用双重PCR引物进行扩增,扩增条带稳定、特异、灵敏;同时采用毛细管电泳法对PCR产物进行分析,该分析方法快速、简便、低成本、高通量、自动化,且灵敏性高,容易判读,适用于临床。本试剂盒所对应的核心技术--毛细管电泳技术对检测样本PCR产物的要求低(仅需 0.2μL),灵敏度高于目前通用的聚丙烯酰胺凝胶电泳法,可以将只差一个重复次数的STR片段区分开容易判读,并依靠自动化操作的分析仪完成,可进行完备的质控,能极大地避免人工操作所带来的偶然误差。另外,本技术还具有高通量的特点,每天可同时完成96个样本的检测。本发明试剂盒可用于分析X染色体失活相关疾病,如自然流产、血友病、X连锁智力低下、G6PD缺陷症、Rett 综合征、DMD杜氏肌营养不良等的SXCI情况,对X染色体连锁疾病的临床与研究提供简便可行的方法,并可协助确诊上述疾病或为上述疾病提供病因诊断。
附图说明
图1:X染色体失活偏移(SXCI)示意图;
图2:STR基因酶切位点;
图3:MIC2基因酶切位点;
图4:X染色体失活的毛细管电泳检测峰图;
图5:X染色体失活的变性高效液相色谱检测图;
图6:本发明试剂盒对X染色体失活检测结果图(检测结果:受检者X染色体失活比率大于90%,为非随机失活,图中数字表示片段长度及峰高。最右侧箭头表示内参基因的扩增产物,完全酶切后无扩增产物)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例详细描述本发明的实施方式,但是以下具体实施方式本质上仅是示例,本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另有指明,本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本领域技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下述实施例中所用材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒
一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒,由下述试剂组成:
(1)甲基化敏感性限制性内切酶HpaII及甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液;其中,甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液组成如下表7所示:
表7 甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液
试剂 | 用量 |
灭菌水 | 3.4μL |
RE 10X Buffer | 1μL |
Acetylated BSA(10μg/μL) | 0.1μL |
(2)一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的带有FAM 荧光标记的引物SEQ ID NO:1-2;其序列如下:
SEQ ID NO-1:5’--FAM-CGTCCAAGACCTACCGAGGA--3’;
SEQ ID NO-2:5’--GAACCATCCTCACCCTGCTG--3’;
(3)一对扩增MIC2基因的带有FAM荧光标记的引物SEQ ID NO:3-4;其序列如下:
SEQ ID NO-3:5’--FAM-AGCCGTTCCAGAGAGAAA--3’;
SEQ ID NO-4:5’--CCCGCATCCACAGAGTAT--3’;
(4)DNA聚合酶La Taq酶。
实施例2用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法
(1)对女性标本进行基因组DNA抽提后获得DNA样本,所述女性标本为女性的外周血,经G带核型分析,结果显示该标本具有两个X,无Y染色体;
(2)使用美国Promega公司的甲基化敏感性限制性内切酶HpaII消化上步获得的DNA样本,所用甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液为Takara公司的 La Taq酶附带消化反应液,其组成如下表1所示,反应条件为37℃过夜消化;
表1 HpaII消化的反应体系
(3)采用本发明所述的双重PCR引物对酶切前后的DNA进行PCR扩增, PCR扩增的反应体系组成如下表2所示:
表2 DNA扩增的反应体系
试剂 | 用量 |
灭菌水 | 5.75μL |
2X GC Buffer I | 12.5μL |
dNTP Mix | 4μL |
Taq酶 | 0.25μL |
AR-Primer-F/P(5pmol/μL) | 1μL |
MIC2-Primer-F/P(5pmol/μL) | 0.5μL |
DNA(50ng/μL)或酶切后产物 | 1μL |
其中双重PCR扩增条件为:94℃预变性1min,94℃30s,63℃30s,72℃ 45s,共31个循环,最后72℃延伸5min,12℃保存,如下表3所示;
表3 PCR反应条件
(4)使用ABI 3130毛细管电泳分析仪对PCR产物进行毛细管电泳法分析,得到峰图,所采用的毛细管电泳体系其组成如下表4所示:
表4 毛细管电泳体系
试剂 | 用量 |
Hi-Di甲酰胺 | 10μL |
600Liz内标 | 0.2μL |
PCR产物 | 0.2μL |
其中Hi-Di甲酰胺、600Liz内标均购自ABI公司;
ABI 3130采用的是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。长片段在分离相中的阻力大,跑的慢,短片段在分离相中的阻力小,跑的快。因此,根据毛细管电泳峰的位置及荧光强度差异,通过GeneMap 3.2(ABI公司)将不同长度和拷贝数的STR区分。
(5)对所得毛细管电泳峰图进行分析,具体方法如下:首先,根据图谱上峰的迁移位置确定每一个峰对应的基因;然后,分析图谱中MIC2基因酶切前后的PCR产物对应的峰;最后,根据峰的荧光强度,对X染色体失活情况以及家系来源进行判读;
具体而言,由于本发明试剂盒中两对引物对应的AR基因和MIC2基因,所得扩增片段大小不一样(AR位点扩增片段约200~300bp,MIC2位点扩增片段约为363bp),每对引物的PCR产物在进行毛细管电泳检测时的迁移速度都不一样,且片段大小和迁移速度成正相关,在毛细管电泳图中表现为小片段的峰出现较快(AR位点),大片段的峰出现较慢(MIC2位点),因此可从PCR产物的迁移时间对其进行定性分析,即确定毛细管电泳图中每一个峰所对应的基因;
此外,MIC2基因酶切前后的PCR产物所对应的峰位置不相同,酶切前有峰,酶切后无峰时为酶切完全,以确保没有假阳性结果出现。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施方式和实施例,在本领域技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京康旭医学检验所有限公司
<120> 一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒
<130> 2019
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtccaagac ctaccgagga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaccatcct caccctgctg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agccgttcca gagagaaa 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccgcatcca cagagtat 18
Claims (7)
1.一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒,其特征在于:所述试剂盒由下述试剂组成:
(1)甲基化敏感性限制性内切酶及甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液;
(2)一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的带有FAM荧光标记的引物SEQ ID NO:1-2;
(3)一对扩增MIC2基因的带有FAM荧光标记的引物SEQ ID NO:3-4;
(4)DNA聚合酶。
2.如权利要求1所述的试剂盒在生物医学中的应用。
3.如权利要求1所述的用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)对女性标本进行基因组DNA抽提后获得DNA样本;
(2)使用甲基化敏感性限制性内切酶HpaII消化步骤(1)获得的DNA样本,反应条件为37℃过夜消化;
(3)采用本发明所述的双重PCR引物对酶切前后的DNA进行PCR扩增,其中双重PCR扩增条件为:94℃预变性1min,94℃30s,63℃30s,72℃45s,共31个循环,最后72℃延伸5min,12℃保存;
(4)利用毛细管电泳法对PCR产物进行分析,得到峰图;
(5)对所得毛细管电泳峰图进行分析,具体方法如下:首先,根据图谱上峰的迁移位置确定每一个峰对应的基因;然后,分析图谱中MIC2基因酶切前后的PCR产物对应的峰;最后,根据峰的荧光强度,对X染色体失活情况以及家系来源进行判读。
4.如权利要求3所述的用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法,其(1)步骤中所述女性标本是任何来源的女性器官组织或体细胞,所述女性标本为经G带核型分析,结果显示具有两个X,没有Y染色体的标本。
5.如权利要求4所述的用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法,其中所述女性标本为女性的外周血、脐带血、绒毛、骨髓或上皮细胞。
6.如权利要求3所述的用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法,其(5)步骤中对X染色体失活情况的判读方法如下:
通过分析AR位点酶切前后的扩增产物判断X染色体失活情况,当AR位点为单峰时,说明该STR位点为纯合子,无法判断X染色体失活是否正常,当AR位点为双峰时,根据下述公式信号强度计算失活比例:
a:父源X染色体失活比例=酶切后父源X染色体信号强度/酶切前父源X染色体信号强度;
b:母源X染色体失活比例=酶切后母源X染色体信号强度/酶切前母源X染色体信号强度;
3:7<a:b<7:3时,为X染色体随机失活;
a:b≥7:3时,为X染色体非随机失活,且失活来自父源;
a:b≤3:7时,为X染色体非随机失活,且失活来自母源。
7.如权利要求3所述的用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒的使用方法,其(5)步骤中对家系来源的判读方法如下:将家系中先证者及其父母标本PCR产物检测所得毛细管电泳图排布在同一界面,纵向比较,在同一位置所出峰片段长度相同,通过家系比对,判断两个X染色体的来源为父源或母源,以便从遗传上追踪异常染色体的传递途径。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2017109134A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Curevac Ag | Method for producing rna molecule compositions |
CN108531576A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-14 | 北京信诺佰世医学检验所有限公司 | 检测脆性x染色体综合征的试剂盒和系统 |
-
2019
- 2019-05-17 CN CN201910409486.7A patent/CN110106238A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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