CN110438219B - 基于微滴式数字pcr无创产前诊断巴氏水肿胎的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物、探针、试剂盒及方法。该引物和探针包括α珠蛋白基因簇定量目标基因的上、下游引物、α珠蛋白基因簇定量目标基因探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示；该引物和探针还包括内参基因ALB的上、下游引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～6所示。本发明中的引物和探针具有快速、高通量、高灵敏度且检测成本较低的优点，可将其制成试剂盒用于无创产前诊断巴氏水肿胎，尤其适用于父母双方均为东南亚型缺失的携带者的产前诊断。
Description
技术领域
本发明涉及单基因病的无创产前诊断领域，特别涉及一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
α地中海贫血是α珠蛋白基因异常导致相关珠蛋白链无法合成引起的，α地中海贫血是我国最常见的地中海贫血类型之一，其中在广东、广西地区最高。根据有功能的α珠蛋白基因的拷贝数，可分为静止型地中海贫血、标准型地中海贫血、HbH病和巴氏水肿胎，分别具有3、2、1、0拷贝的α珠蛋白基因。根据单条链上有功能的珠蛋白基因分为α+和α0地中海贫血，α+地中海贫血的常见类型包括右侧缺失(-α3.7)和左侧缺失(-α4.2)两种，而α0贫血中的东南亚型缺失最为常见，携带率达到66％。
当只缺失单个拷贝的α珠蛋白基因，患者表现为静止型地中海贫血。当父母双方均为东南亚型缺失携带者时，胎儿有1/4的概率为东南亚型纯合子，即4个拷贝的α珠蛋白基因均缺失，由于缺乏指导合成α珠蛋白链的功能基因，胎儿无法合成正常的α珠蛋白肽链，α珠蛋白肽链和β珠蛋白肽链含量失衡，γ链形成不稳定的四聚体，导致红细胞破坏，进而导致严重溶血性贫血。巴氏水肿胎常在宫内即发生贫血，出现胎盘水肿、胎儿皮下水肿、胸腔和腹腔积液等贫血表现，随后胎儿可发生宫内死亡或在出生后24小时内死亡。由于东南亚型缺失的人群携带率高，且巴氏水肿胎给孕妇及其家庭带来痛苦，借助分子诊断阻断巴氏水肿胎的发生具有重要的防控意义。
目前检测地中海贫血的分子诊断方法主要依赖于在有创产前诊断的基础上获取胎儿遗传物质，包括羊水、绒毛、脐血等，进一步通过Gap-PCR(裂口PCR)、反向斑点杂交(RDB)、MLPA(多重连接探针扩增技术)等方法明确胎儿核型。有创产前检测方法具有1％的致胎儿流产风险，而上述的多种检测方法都存在不少的局限性。Gap-PCR是大片段缺失型地中海贫血常用分子诊断手段，大量样本检测仍依赖较多的手工操作，同时检测结果容易受模板量的影响。反向斑点杂交是非缺失型α地中海贫血的检测方法，操作繁琐，容易受缓冲液配置、洗涤时间、显色时间、模板浓度和纯度等多种因素影响，且不适用于缺失型地中海贫血的检测。MLPA方法同样是大片段缺失型地中海贫血的检测方法，但操作周期长、步骤较繁琐，容易受探针结合效率影响，较少用于常见缺失类型的检测。
1997年，孕妇血浆中首次检出男性的胎儿的Y染色体特异序列，证明了孕妇血浆中胎儿遗传物质的存在。使得借助孕妇血浆游离DNA中胎儿成分在不进行侵入性产前即可检测单基因病成为可能。目前主要技术平台包括高通量测序、荧光定量PCR等技术。高通量测序可以完整检测孕妇血浆中的胎儿基因组，借助生物信息学手段识别胎儿突变位点，但是实验周期长，实验成本高，易受建库、胎儿浓度等因素影响，难以推广。荧光定量PCR在检测微量的DNA重复性较差，且对于胎儿基因组含量的微量变化难以有效检测，缺乏质控手段。而微滴式数字PCR平台的出现极大扩充了无创单基因病的检测手段技术手段。
微滴式数字PCR是第三代数字PCR技术，利用油包水体系将扩增体系分散至上万个甚至上百万个独立的“扩增室”，从而将每个模板中的分子分散至独立的扩增体系中，每个包含反应所需的酶、离子、引物和探针，在扩增中每个孔均进行平行的扩增反应，在反应完成后对单个反应孔中每个油滴的荧光信号进行检测。而由于目标分子在极度分散的体系中满足泊松分布，从而借助阳性油滴数计算出样品中的目的分子数，实现目标序列的绝对定量。该技术的优势在于每个模板分子都在独立的“扩增室”，有效减少复杂序列、相似序列与目的序列的竞争，可以从在大量均质的相似序列中检测出微量的突变序列。微滴式数字PCR是不依赖扩增曲线的定量技术，其结果重复性高、稳定性强，且能达到绝对定量的精度，从而定量目的基因在基因组中的拷贝数变化。相较于第二代微滴式数字PCR即微流体芯片PCR，微滴式数字PCR并不需要特制的芯片，仅需要96孔板即可完成，单管中即包含上万个均质的反应体系，分散更加均匀，且不需要增加检测通道即可有效提高反应体系的分散程度，检测通量更高。目前的微滴式数字PCR商业化试剂盒原理基本一致，提高了单管中微滴的数量，反应体积上的灵活优势。其中最具代表性的Bio-Rad微滴式数字PCR，在单基因病的无创产前检测具有多项应用，包括血友病致病位点检测、β地中海贫血父源性突变检测等，并在多种基因组疾病的检测、肿瘤检测获得应用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物和探针。
本发明的另一目的在于提供一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物和探针，包括α珠蛋白基因簇定量目标基因的上、下游引物、以及α珠蛋白基因簇定量目标基因探针；其中：
α珠蛋白基因簇定量目标基因上游引物的核苷酸序列如下所示：
5′-ACTTCCTCAGTGGCAAAC-3′(SEQ ID NO：1)；
α珠蛋白基因簇定量目标基因下游引物的核苷酸序列如下所示：
5′-TAAACCTGCTCTGTCTG-3′(SEQ ID NO：2)；
α珠蛋白基因簇定量目标基因探针的核苷酸序列如下所示：
5′-FAM-ACTGAGGACTTCCTCCCGACCTCAT-MGB-3′(SEQ ID NO：3)；其中，FAM表示6-羧基荧光素标记；MGB表示小沟结合基团(Minor Groove Binder)。
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物和探针，还包括内参基因的上、下游引物和探针，其中：
内参基因ALB的上游引物的核苷酸序列如下所示：
5′-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3′(SEQ ID NO：4)；
内参基因ALB的下游引物的核苷酸序列如下所示：
5′-TTCATCGACTTCCAGAGCT-3′(SEQ ID NO：5)；
内参基因ALB的探针的核苷酸序列如下所示：
5′-VIC-AAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAG-MGB-3′(SEQ ID NO：6)；其中，VIC表示VIC荧光染料标记，MGB表示小沟结合基团(Minor Groove Binder)。
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物和探针在制备无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中的应用。
一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，包含上述引物和探针。
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中4条引物(SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)的摩尔浓度比为1:1:1:1；上、下游引物和探针的摩尔浓度比为1:1:0.5～2(优选为1:1:2)。
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中还含有双蒸水(ddH20)。
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中各引物的浓度优选为5.0～8.0μmol/L，各探针的浓度优选为3.0～4.0μmol/L。
所述的试剂盒构建的PCR反应体系为20μL或25μL反应体系；其中，
20μL反应体系如下：1uL预混反应液，10uL ddPCR Supermix，2～10ng模板，用双蒸水或无核酶水补足至20μL；
25μL反应体系如下：1.25uL预混反应液，12.5μL ddPCR Supermix，2～10ng模板，用双蒸水或无核酶水补足至25μL。
所述的微滴式数字PCR扩增条件优选为：95℃5min预变性；95℃20s，50℃30s，72℃30s，45～50个循环，98℃10min，4℃保存不超过30min。
一种应用上述基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物和探针，或基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒进行无创产前检测巴氏水肿胎的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取待检孕妇外周血血浆中的游离DNA，然后进行小片段DNA的筛选富集并进行定量，得到DNA模板；
(2)配制PCR反应体系：
20μL反应体系如下：1uL预混反应液，10uL ddPCR Supermix，2～10ng DNA模板，用双蒸水或无核酶水补足至20μL；
或：
25μL反应体系如下：1.25uL预混反应液，12.5μL ddPCR Supermix，2～10ng DNA模板，用双蒸水或无核酶水补足至25μL；
(3)向PCR反应体系中加入微滴生成油，生成微滴(生成油包水体系)；
(4)进行PCR扩增，然后可以根据PCR扩增结果进行判断：通过微滴分析软件，获得α珠蛋白基因/ALB基因比值Ra/b(即Ratio(a/b))，当Ra/b低于cut-off值0.50时，判定孕妇怀有巴氏水肿胎的风险为高风险；当Ra/b高于cut-off值0.50时，判定孕妇怀有巴氏水肿胎的风险为低风险，即胎儿可能为正常(αα/αα)与东南亚型缺失α-地中海贫血(杂合型缺失型基因；-/αα)两种情况。
步骤(1)中所述的游离DNA的提取方法优选为用HiPure circulating DNA acidMidi Kit(Magen)，MagPure Mini Kit或Circulating DNA LQ Kit(Magen)进行提取。
步骤(1)中所述的筛选富集优选采用
纯化磁珠B1和B2进行筛选富集。
步骤(1)中所述的定量为采用Qubit荧光定量仪进行定量。
步骤(2)中所述的反应体系中DNA模板的用量优选为2～5ng。
步骤(3)中所述的微滴发生油为Bio-Rad微滴发生油(美国伯乐公司)或新羿微滴发生油(北京新羿公司)。
步骤(3)中所述的微滴的生成为在微滴发生仪中进行微滴生成。
步骤(4)中所述的PCR扩增条件优选为：95℃5min预变性；95℃20s，50℃30s，72℃30s，45～50个循环，98℃10min，4℃保存不超过30min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明能检测在低至2ng的DNA加样量准确识别巴氏水肿胎，需要的血浆量较少。
(2)本发明快速、高通量、高灵敏度，可以在24小时内完成96孔板的PCR产物检测，可应用于父母双方均为东南亚型缺失携带者中无创产前诊断巴氏水肿胎。
(3)本发明借助于QX200微滴式数字PCR技术及配套的Quantasoft分析软件，检测平台技术成熟，且加样量小，自动化程度高，检测重复性好。
(4)本发明检测成本较低，检测周期短，无须胶回收方法富集胎儿成分，且完全闭管操作，避免了PCR产物污染问题，适用于大规模检测。
附图说明
图1是油滴的标准分布图(图中：channel1-FAM表示α珠蛋白基因，channel2-VIC表示ALB基因)。
图2是正常人、东南亚型α-地中海贫血携带者、巴氏水肿胎gDNA的α珠蛋白基因/ALB基因比值分布图(图中：相对拷贝数即为α珠蛋白基因/ALB基因比值；Normal为正常基因型胎儿(纯合野生型基因)，Thalassemia Trait为东南亚型缺失α-地中海贫血(杂合型缺失型基因)；Bart’s fetus为巴氏水肿胎(纯合型缺失型基因)。
图3是混合样品中检测巴氏水肿胎的能力图(图中：相对拷贝数即为α珠蛋白基因/ALB基因比值；胎儿DNA比例指巴氏水肿胎DNA在混合样品中的浓度比例)。
图4是使用本发明的引物和探针在血浆中验证结果图(图中：相对拷贝数即为α珠蛋白基因/ALB基因比值；Normal为正常基因型胎儿(纯合野生型基因)；Thalassemia Trait为东南亚型缺失α-地中海贫血(杂合型缺失型基因)；Bart’s fetus为巴氏水肿胎(纯合型缺失型基因)。
图5是18例孕妇微滴式数字PCR无创产前检测结果及介入性产前诊断Gap-PCR验证结果；其中，a为微滴式数字PCR无创产前检测结果及产前诊断Gap-PCR验证结果(图中：Bart’s表示巴氏水肿胎，非Bart’s表示非巴氏水肿胎)；b为产前诊断Gap-PCR电泳结果(图中：P表示Positive阳性对照；泳道1～18分别与a中的病例1～18相对应)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照生产厂商所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
1、基于微滴式数字PCR平台的无创产前检测巴氏水肿胎的引物和探针，其序列如下(含2对引物、1对探针)：
α珠蛋白基因簇定量目标基因上游引物为：
5′-ACTTCCTCAGTGGCAAAC-3′(SEQ ID NO：1)；
α珠蛋白基因簇定量目标基因下游引物为：
5′-TAAACCTGCTCTGTCTG-3′(SEQ ID NO：2)；
α珠蛋白基因簇定量目标基因探针为：
5′-FAM-ACTGAGGACTTCCTCCCGACCTCAT-MGB-3′(SEQ ID NO：3)；其中，FAM表示羧基荧光素标记；MGB表示小沟结合基团(Minor Groove Binder)。
内参基因ALB的上游引物为：
5′-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3′(SEQ ID NO：4)；
内参基因ALB的下游引物为：
5′-TTCATCGACTTCCAGAGCT-3′(SEQ ID NO：5)；
内参基因ALB的探针为：
5′-VIC-AAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAG-MGB-3′(SEQ ID NO：6)；其中，VIC表示VIC荧光染料标记，MGB表示小沟结合基团(Minor Groove Binder)。
上述引物和探针均由上海生工生物公司合成。
2、基于微滴式数字PCR平台的无创产前检测巴氏水肿胎的试剂盒，其中包含1个检测试剂盒，内含上述2对引物(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5)、2条探针(SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6)；
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中引物及探针的摩尔浓度比如下：
(1)引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的摩尔浓度为1:1:1:1；
(2)引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和探针SEQ ID NO：3的摩尔浓度比为1:1:0.5～2(优选为1:1:2)；
(3)引物SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和探针SEQ ID NO：6的摩尔浓度比为1:1:0.5～2(优选为1:1:2)。
所述试剂盒包含上述引物、探针和双蒸水(ddH20)；试剂盒中的每条引物的浓度为5.0～8.0μmol/L，每个探针的浓度约为3.0～4.0μmol/L。
所述试剂盒可应用于夫妻双方均为东南亚型缺失α地中海贫血携带者的病例的孕妇中无创产前检测巴氏水肿胎。
实施例2
(1)提取孕妇血浆：取10mL孕妇外周血，在EDTA管中保存运输，抽血后6小时内分离血浆，1600×g离心10min；取上清液，在16000×g离心10min；取上清液分装至2mL离心管中，长期保存于-30℃或-80℃冰箱中。每管血浆一次取尽，避免反复冻融；
(2)提取孕妇血浆中游离DNA；使用不小于1200μL(约1200μL～2000μL)血浆。使用HiPure circulating DNA acid Midi Kit(Magen)(或MagPure Mini Kit试剂盒或HiPurecirculating DNA LQ Kit(Magen))试剂盒进行提取。根据实际的血浆使用量把血浆分成多管进行提取，使用TE洗脱液，洗脱后再将同一份血浆提取的洗脱液合并，注意合并后体积应不大于80μL；
(3)小片段DNA的筛选和富集：使用
胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)试剂盒(半导体测序法)中纯化磁珠B1、B2进行纯化筛选，洗脱体积可选择30～50μL；
(4)使用Qubit荧光定量仪进行定量；
(5)配置微滴式数字PCR反应体系：根据游离DNA浓度调整微滴式数字PCR加样量为2～6ng；
按照20μL总体积配置
或按照25μL总体积配置
预混反应液为引物和探针混合得到的反应液；其中，预混反应液中的每条引物的浓度为5.0～8.0μmol/L，每个探针浓度约为3.0～4.0μmol/L(引物和探针为实施例1获得，目标基因及内参基因的引物和探针的摩尔浓度比为1:1:2)。微滴式数字PCR使用预混扩增酶ddPCR Supermix(no dUTP)(美国伯乐Bio-Rad公司)。
(6)将反应体系转移至8孔微滴发生板中，在油孔中加入60μL～70μL的微滴发生油(微滴发生油可选择Bio-Rad微滴发生油(美国伯乐公司)或新羿微滴发生油(北京新羿公司))，盖上胶垫后放置于微滴发生仪中进行微滴生成，微滴生成后，总体积以不小于40μL为宜，否则应重新配置体系。
(7)将微滴发生板取出，将微滴发生孔中悬浊液转移至96孔板中；
(8)将96孔板放置于PCR仪中扩增：PCR扩增条件为：95℃5min预变性；95℃20s，50℃30s，72℃30s，45～50个循环，98℃10min，4℃保存不超过30min；
(9)荧光信号分析：将96孔板取出后放置于微滴读取仪，使用Quantasoft软件进行进行解读。操作步骤如下：
①预热QX200微滴分析仪至少20min，启动Quantasoft分析软件，将QX200微滴分析仪配套的固定板放置于QX200微滴分析仪内，运行Flush System清洗管路，及时清除废液罐里的废液，保证微滴发生油液面在报警线以上；
②将扩增完成后的96孔板固定于QX200微滴分析仪固定板上，平放于QX200微滴分析仪中；
③在设置面板中，选择需要检测的行和列，在channel 1和channel 2输入所检测基因，一般channel 1对应FAM荧光通道，channel 2对应VIC或HEX荧光通道，Type均选择“unknown”；Experiment选择实验方法为“ABS”；Supermix选择种类为“ddPCR Supermix(nodUTP)”每个孔均标注样品号；
④选择“RUN”，弹出对话框后选择“FAM/HEX”荧光通道，确定后即可开始分析。
(10)结果判读
①样品检测质量评价：调用Quantasoft软件中“Analyze”界面的“Event”选项，勾选“pos”和“total”，观察阳性油滴数及总微滴数，可计数的微滴数不应小于12000，内参照基因的阳性油滴数不应100。当样品参照基因阳性油滴数过低，提示模板浓度过低，结果将不可靠，应重测；当微滴数量过少，提示反应体系、微滴生成体系或过程以及微滴读取过程任何一个或多个环节存在问题，应注意；
②样品质控：每次检测可同时加入已知基因型的质控品进行平行的扩增，可选择经分子诊断明确为--SEA/αα及αα/αα碎片化的样品，或同实验室已检测明确孕妇和胎儿基因型均为--SEA/αα的cfDNA样品，作为质控品进行平行扩增，作为每次检测的正常参考值；
③阳性微滴的选取：在“Analyze”界面，根据2D油滴分布图“2D Amplitude”，根据实际油滴分布情况选取阳性油滴，可选取
阈值选取或/>
选取阳性油滴：
正常油滴分布如图1所示。选取FAM信号值>2000，HEX信号值>2500的微滴，亦可根据实际情况在1500～3000之间选择，应保证阳性油滴和阴性油滴足够区分，尽量选取荧光强度聚集的油滴，不要过多选取荧光信号较低的散在油滴。阴性油滴分布。选取“ratio”界面下“Ratio(a/b)”，求得α珠蛋白基因/ALB基因比值，其中a对应FAM通道，即对应引物SEQID NO：1、引物SEQ ID NO：2和探针SEQ ID NO：3扩增目标序列产生的荧光，b对应HEX荧光通道(替代VIC荧光通道)，即为引物SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和探针SEQ ID NO：6扩增内参基因产生的荧光，进行下一步分析。
④根据α珠蛋白基因/ALB基因比值的降低估计巴氏水肿胎的风险，当东南亚型α-地中海贫血携带者孕妇血浆背景中存在1拷贝的α珠蛋白目标基因及2拷贝的ALB内参基因，α珠蛋白基因/ALB基因比值在一定范围内波动；当东南亚型α-地中海贫血携带者孕妇怀有巴氏水肿胎时，α珠蛋白基因/ALB基因比值下降，低于孕妇血浆背景中α珠蛋白基因/ALB基因比值(图2)，将判定为阳性结果。本方法通过设定cut-off值用于进行诊断，cut-off值设定为0.50，当α珠蛋白基因/ALB基因比值低于cut-off值时，将判定孕妇怀有巴氏水肿胎的风险为高风险；当α珠蛋白基因/ALB基因比值高于cut-off值时，将判定孕妇怀有巴氏水肿胎的风险为低风险，即胎儿可能为正常(αα/αα)与东南亚型缺失α-地中海贫血(杂合型缺失型基因；-/αα)两种情况。
实施例3
1、对已知基因型的样品的检测
将已知基因型为--/--即巴氏水肿胎的gDNA，按终浓度为体积百分比5％、10％、20％的比例，混合到已知基因型为--/αα(即东南亚型缺失α-地中海贫血)的gDNA中，其中基因型为--/--的gDNA使用胎儿胎盘绒毛样品提取，基因型为--/αα的gDNA使用孕妇外周血提取，提取均使用Qiamp DNA Blood Mini kit(货号：51106，美国Qiagen公司)。混合前基因型为--/--及--/αα的已稀释至相同浓度，混合后将每一个浓度梯度样品浓度稀释至10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL，使用本发明的试剂盒25μL总体积反应体系进行检测(方法参考实施例2)。结果如图3所示。
2、试剂盒的灵敏度和特异性
分别吸取从25个孕妇的外周血分离得到的血浆(各1.2mL)，分别使用HiPurecirculating DNA acid Midi Kit(美国Magen公司)(或MagPure Mini Kit试剂盒或HiPurecirculating DNA LQ Kit(Magen))试剂盒进行提取。根据实际的血浆使用量把血浆分成多管进行提取，使用50μL TE洗脱液洗脱，使用65μL B1磁珠和100μL B2磁珠用于提取短片段游离DNA(B1、B2磁珠均来自于
胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)试剂盒(半导体测序法)；具体提取方法可参考文献：Hu P,Liang D,Chen Y,et al.An enrichment methodto increase cell-free fetal DNA fraction and significantly reduce falsenegatives and test failures for non-invasive prenatal screening:a feasibilitystudy[J].J Transl Med,2019,17(1):124.DOI:10.1186/s12967-019-1871-x.PMID:30975179)。最终洗脱体积为10μL，使用本发明试剂盒25μL总体积反应体系进行检测(方法参考实施例2)。结果如图4所示。
通过相应胎儿取材(羊水/绒毛/脐血)的Gap-PCR验证胎儿基因型，具体为：选取适量的胎儿取材(羊水/绒毛/脐血)使用Qiamp Blood Mini kit(德国Qiagen公司)提取DNA，操作方法参照试剂盒说明书，提取DNA浓度为5～200ng/μL，将提取的DNA使用α-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)(亚能生物技术(深圳)有限公司)进行PCR扩增，引物信息参照该试剂盒相关专利(发明名称：诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒，专利号：200710074203.5)，操作方法均按照试剂盒说明书进行，PCR扩增后，配制1.2％的琼脂糖凝胶，在170V电压下电泳20min，详细结果判读参照试剂盒说明书。
结果发现，本发明试剂盒的灵敏度为96％(24/25)，特异度为100％(40/40)，阳性预测值为100％，阴性预测值为100％。
3、18例临床血浆样本及其验证结果
18对夫妻双方(将其编号为1-18)均为东南亚型缺失α-地中海贫血携带者(--/αα)，在行有创产前检测前进行前抽取孕妇外周血用于分离血浆，然后采用本发明的试剂盒(25μL总体积)进行无创产前检测巴氏水肿胎，同时使用胎儿取材(羊水、绒毛)提取gDNA(Qiamp DNA Blood Mini kit试剂盒，货号：51106，美国Qiagen公司))，采用Gap-PCR技术验证胎儿基因型。Gap-PCR技术验证过程如下：
选取适量的胎儿取材(羊水/绒毛/脐血)使用Qiamp Blood Mini kit(德国Qiagen公司)提取DNA，操作方法参照试剂盒说明书，提取DNA浓度为5～200ng/μL，将提取的DNA使用α-地中海贫血基因检测试剂盒(gap-PCR法)(亚能生物技术(深圳)有限公司)进行PCR扩增，引物信息参照该试剂盒相关专利(发明名称：诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒，专利号：200710074203.5)，操作方法均按照试剂盒说明书进行，PCR扩增后，配制1.2％的琼脂糖凝胶，在170V电压下电泳20min，详细结果判读参照试剂盒说明书。
18例孕妇微滴式数字PCR无创产前检测结果及介入性产前诊断Gap-PCR验证结如图5所示。其中，图5a为微滴式数字PCR无创产前检测结果，图中Bart’s表示巴氏水肿胎，非Bart’s表示非巴氏水肿胎，即胎儿基因型包含正常(αα/αα)与东南亚型缺失α-地中海贫血(杂合型缺失型基因；--/αα)两种情况。图5b为18例孕妇产前诊断Gap-PCR电泳结果；其中：P为Positive阳性对照，使用已知基因型为--/αα的gDNA进行Gap-PCR，在电泳中显示αα/和--/基因型的扩增条带；泳道1～18分别与图5a中的病例1～18相对应。从图中可以看出，本发明的试剂盒的检测结果与Gap-PCR技术验证结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东省妇幼保健院
<120> 基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的引物、探针、试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α珠蛋白基因簇定量目标基因上游引物
<400> 1
acttcctcag tggcaaac 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α珠蛋白基因簇定量目标基因下游引物
<400> 2
taaacctgct ctgtctg 17
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> α珠蛋白基因簇定量目标基因探针
<400> 3
actgaggact tcctcccgac ctcat 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 内参基因ALB的上游引物
<400> 4
tgttgcatga gaaaacgcca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 内参基因ALB的下游引物
<400> 5
ttcatcgact tccagagct 19
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 内参基因ALB的探针
<400> 6
aagtgacaga gtcaccaaat gctgcacag 29
Claims (6)
1.一种基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，其特征在于：包括α珠蛋白基因簇定量目标基因的上、下游引物，α珠蛋白基因簇定量目标基因探针，以及内参基因ALB的上、下游引物和探针；其中：
α珠蛋白基因簇定量目标基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
α珠蛋白基因簇定量目标基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
α珠蛋白基因簇定量目标基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
内参基因ALB的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
内参基因ALB的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
内参基因ALB的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述的试剂盒根据PCR扩增结果进行判断：通过微滴分析软件，获得α珠蛋白基因/ALB基因的比值Ra/b，当Ra/b低于cut-off值0.50时，判定孕妇怀有巴氏水肿胎的风险为高风险；当Ra/b高于cut-off值0.50时，判定孕妇怀有巴氏水肿胎的风险为低风险。
2.根据权利要求1所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，其特征在于：
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中4条引物的摩尔浓度比为1:1:1:1；上、下游引物和探针的摩尔浓度比为1:1:0.5～2。
3.根据权利要求2所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，其特征在于：
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中4条引物的摩尔浓度比为1:1:1:1；上、下游引物和探针的摩尔浓度比为1:1:2。
4.根据权利要求1所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，其特征在于：
所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒中各引物的浓度均为5.0～8.0μmol/L，各探针的浓度均为3.0～4.0μmol/L。
5.根据权利要求1所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，其特征在于：
所述的试剂盒构建的PCR反应体系为20μL或25μL反应体系；其中，
20μL反应体系如下：1uL预混反应液，10uL ddPCR Supermix，2～10ng模板，用双蒸水或无核酶水补足至20μL；
25μL反应体系如下：1.25uL预混反应液，12.5μL ddPCR Supermix，2～10ng模板，用双蒸水或无核酶水补足至25μL。
6.根据权利要求1所述的基于微滴式数字PCR无创产前诊断巴氏水肿胎的试剂盒，其特征在于：
所述的微滴式数字PCR扩增条件为：95℃5min预变性；95℃20s，50℃30s，72℃30s，45～50个循环，98℃10min，4℃保存不超过30min。
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Patent Citations (6)
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