CN108624657A

CN108624657A - 基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒及方法

Info

Publication number: CN108624657A
Application number: CN201810567186.7A
Authority: CN
Inventors: 骆明勇; 胡听听; 胡思琪; 杨笑函; 张畅斌; 詹文丽; 王继成
Original assignee: Guangdong Provincial Maternity And Child Care Center (guangdong Obstetrics And Gynecology Hospital Guangdong Children's Hospital)
Current assignee: Guangdong Provincial Maternity And Child Care Center (guangdong Obstetrics And Gynecology Hospital Guangdong Children's Hospital)
Priority date: 2018-05-26
Filing date: 2018-05-26
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β‑地中海贫血基因扩增试剂盒及方法。该试剂盒包括RPA扩增引物，分别为如SEQ ID NO.1所示的P1F‑1、如SEQ ID NO.2所示的P1Rbio‑1、如SEQ ID NO.3所示的P2F‑1、如SEQ ID NO.4所示的P2Rbio‑1、如SEQ ID NO.5所示的P3F‑1、如SEQ ID NO.6所示的P3Rbio‑1。使用前述RPA扩增引物对待检测标本的基因组DNA进行扩增，能在30分钟内完成，且灵敏度高；得到的扩增产物能通过液相芯片进行检测，准确率高。

Description

基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种β-地中海贫血基因的扩增试剂盒和方法，特别涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒及方法。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia)，简称地贫，是一种因珠蛋白合成障碍所致的遗传性溶血性疾病，分α-地中海贫血(简称α-地贫)和β-地中海贫血(β-地贫)两种类型。本病主要见于地中海沿岸国家和东南亚各国，是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病，全世界约有九千万徵患与基因携带者。我国以南方地区多见，是我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，尤以广西、广东和海南为甚。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24～48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致死产；另一方面，重型β地贫以及部分中间型α地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折，给家庭和社会带来沉重负担，严重影响人口素质。因此，在全国甚至东南亚地贫高发地区有效开展婚前、孕前以及产前地贫基因检测，对防止重型地贫患儿出生，减少出生缺陷以及优生优育具有重要意义。

β-地中海贫是由于β珠蛋白链合成异常的一类地贫，重型β-地贫患儿因为在出生时与正常婴儿相同，一般在半岁左右出现进行性的加重性的贫血才被发现，后续就必须靠输血维持生命；而重型α地中海贫血(Bart′s水肿胎)在妊娠中可以被超声影像发现，并往往在妊娠晚期流产或出生后数小时死亡。所以重型β-地贫具有更严重的危害性，对家庭和社会造成更为严重的后果。目前200多种引起β-地贫的突变被鉴定，其中大部分为点突变。这些突变具有种族特异性，各个种族都有几种常见的突变类型。中国大陆人群常见的突变频率较高的突变类型有十几种，其中常见突变位点有8个，大约占中国大陆人群突变发生频率的90％以上(如表1和2所示)。

表1中国人群β珠蛋白基因常见8个突变位点

序号	突变位点
		1	CD41-42(-TCTT)
2	IVS-II-654 C＞T
		3	CD17 A＞T
4	-28A＞G
		5	CD26 G＞A
6	CD71-72(+A)
		7	CD43 G＞T
8	-29A＞G

表2中国人群β-珠蛋白基因突变频率较高的位点

序号	突变位点	序号	突变位点
				1	起始密码子ATG＞AGG	6	IVS-I-1 G＞T
2	CD14-15(+G)	7	IVS-I-5 G＞C
				3	CD27-28(+C)	8	CD31(-C)
4	-32C＞A	9	CAP+40-+43(-AAAC)
				5	-30T＞C

目前国际常规的实验室诊断方法是血常规检测分析红细胞参数的基础上，对可疑人群直接进行基因检测，而国内常规做法是在血红蛋白电泳筛查的基础上，对可疑人群进行基因诊断。目前，β地贫的基因诊断方法主要都是基于PCR的方法，先进行PCR扩增然后再对PCR产物进行检测。主要有方法有：PCR结合反向斑点膜杂交(RDB)的技术(简称PCR-RDB)、液相芯片等。市场上都已有相应的商品化试剂盒可检测上述β地贫的点突变。液相芯片技术也称悬浮阵列技术(suspension array)，是由美国Luminex公司研制开发的最新一代诊断技术平台。目前已经有商品化的地中海贫血液相芯片检测试剂，必须采用常规的PCR进行扩增步骤。

但是PCR扩增还存在依赖于大型仪器、扩增速率慢等缺点。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增方法。

本发明的再一目的还在于提供上述基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒，包括如表3所示的RPA扩增引物：

表3 RPA引物序列(均为5’-3’)

表中的F表不上游引物，Rbio表不5’端生物素修饰的下游引物。

所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒还包括用于RPA扩增的Basic试剂和用于RPA扩增的水中的至少一种。

所述的用于RPA扩增的Basic试剂包括Basic干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种。

所述的Basic干粉试剂中包含用于RPA扩增的酶。

所述的用于RPA扩增的酶为能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种。

所述的试剂盒优选包含引物预混液，引物预混液的主要组成成分如下：P1F、P1Rbio、P2F、P2Rbio、P3F、P3Rbio。

所述的引物预混液中各引物按摩尔比配比如下：P1F-1∶P1Rbio-1∶P2F-1∶P2Rbio-1∶P3F-1∶P3Rbio-1＝0-04∶0.2∶0.04∶0.2∶0.02∶0.1。

所述的用于RPA扩增的水优选为双蒸水或超纯水。

一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增方法，是采用上述试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)对待检测样本提取基因组DNA；

(2)RPA反应；

每50μl反应体系的组成如下：浓度为10μM的引物P1F-1 0.2μl、浓度为10μM的引物P1Rbio-1 1μl、浓度为10μM的引物P2F-1 0.2μl、浓度为10μM的引物P2Rbio-1 1μl、浓度为10μM的引物P3F-1 0.1μl、浓度为10μM的引物P3Rbio-1 0.5μl、1管Basic干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度20～40ng/μl的基因组DNA 1～2μl，用于RPA扩增的水补足至47.5μl；加入280mM乙酸镁2.5μl；

加入乙酸镁后立刻进行RPA扩增，38℃扩增25min；得到扩增产物。

步骤(1)中所述的标本包括外周血、脐带血、绒毛和羊水。

步骤(1)中所述的基因组DNA的纯度优选为OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.7-2.0之间。

通过上述基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒获得的生物素的单链DNA，可利用杂交技术，如液相芯片，检测β-地中海贫血基因；因此，上述基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒可用于制备β-地中海贫血基因检测试剂盒。

一种β-地中海贫血基因检测试剂盒，包括上述RPA扩增引物和液相芯片。

所述的液相芯片优选为依据专利号为“201110084698.6”、名称为“基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用”制备得到的液相芯片。

所述的β-地中海贫血基因检测试剂盒的应用，包括如下步骤：

1)杂交检测：

取通过RPA引物对待检测标本的基因组DNA扩增得到的产物5μl，采用地贫液相芯片试剂盒进行杂交检测；

2)结果判读：

按照地贫液相芯片试剂盒要求进行结果判读，判读标准如下：

A、正常标本

各位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≤0.5，各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3；

B、突变杂合标本

有突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值0.5≤(M/N)≤1.5，无突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≤0.5，各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3；

C、突变纯合标本

有突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≥2，无突变的基因位点相应的突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)≤0.5，各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3；

D、突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)不在上述判断标准范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证(采取技术重复和测序等方法进行确证)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

①采用RPA等温扩增技术，扩增时间快速，30分钟内完成DNA的扩增，灵敏度高；并首次将不对称扩增体系应用于RPA，保证获得了足够的杂交用单链的标记有生物素的DNA靶分子。

②不需要高精度的温度控制仪器设备。

③可与液相芯片，特别是本发明发明人前期的研究成果(ZL201110084698.6)搭配使用，能快速、准确，对β-地中海贫血进行检测。

附图说明

图1是引物优化过程中的部分电泳检测结果图；其中，泳道1为DL2000Marker，泳道2为P2F-1和P2Rbio-1单重扩增产物，泳道3为P2F-1和P2Rbio-2单重扩增产物，泳道4为P3F-2和P3Rbio-2单重扩增产物，泳道5为P3F-1和P3Rbio-1单重扩增产物，泳道6为P1F-1和P1Rbio-1、P2F-2和P2Rbio-2、P3F-1和P3Rbio-2三重扩增产物，泳道7为P2F-2和P1Rbio-1、P2F-1和P2Rbio-2、P3F-1和P3Rbio-2三重扩增产物，泳道8为P1F-1和P1Rbio-1、P2F-1和P2Rbio-1、P3F-1和P3Rbio-1三重扩增产物。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因检测扩增方法。本发明采用RPA等温扩增技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对β-珠蛋白基因序列进行分析，设计出了用于RPA扩增的特异性RPA扩增引物，并对引物进行了优选，同时对RPA扩增体系及反应条件进行了优化。

本发明中所使用的基因组模板为从外周血、绒毛。羊水和脐血提取基因组得到。

实施例1

(一)引物设计和优选

运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对β-珠蛋白基因序列进行分析，设计出了用于RPA扩增的特异性RPA扩增引物，并对其序列进行分析，特别是引物对的组合后的序列分析，挑选出符合条件的引物进入实验验证和优选。备选引物见表4。

表4备选PCR引物序列(均为5’-3’)

表中的F表示上游引物，R表示下游引物；bio表示5’端Biotin修饰。

(1)将各个引物配制成10μM，备用。以人基因组DNA(通过外周血提取得到，地贫阴性，广东)为模板，按照以下过程进行引物优选：本发明将β-珠蛋白基因分为3个片段进行扩增，分别为P1、P2和P3，每段扩增采用一对引物(正向F和反向R)，上表为设计的候选引物；先将上述各段候选正向引物和反向引物进行两两组合(如P1F和P1Rbio-1、P1F和P2Rbio-1、P2F和P1Rbio-1、P2F和P2Rbio-1，以此类推)按下面单重扩增体系进行单重扩增，然后进行琼脂糖电泳，剔除扩增失败和扩增特异性差的引物对组合，将筛选出的扩增条带亮度较好的引物对进行三重扩增筛选。将单重筛选出来的引物对按照针对3个扩增片段(P1、P2和P3)各一对共三对引物进行组合，进行三重扩增效果的筛选，三重扩增产物进行琼脂糖电泳，优选出3个目的条带的亮度最好的和没有非特异扩增的三重引物组合。优选过程中的电泳图如图1所示。

最后优选出的针对P1、P2和P3三个扩增靶片段的三重RPA扩增的引物序列见表3。

单重RPA扩增反应体系如下：基因组DNA(20～40ng/μl)2μl、1管Basic干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的引物F和R各2μl(共4μl)、水补足至47.5μl；然后加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μl，混匀后立即进行RPA扩增，38℃反应30min。

三重RPA扩增反应体系如下：基因组DNA(20～40ng/μl)2μl、1管Basic干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度为10μM的三对引物各2μl(共12μl)、水补足至47.5μl；然后加入浓度为280mM的乙酸镁2.5μl，混匀后立即进行RPA扩增，38℃反应30min。

(2)再对上述三重RPA扩增体系中的三对引物的浓度进行优化，10μM的三对引物分别采用2μl、1μl和0.5μl(如三对引物分别采用2μl，在50μl反应体系中加入引物体积量为12μl；如P1引物对用2μl、P2引物对用1μl、P3引物对用0.5μl，在50μl反应体系中加入引物体积量为7μl)加入扩增体系进行扩增，最后将扩增产物进行琼脂糖电泳，观察扩增效果，优选出扩增效果最好的引物浓度。

优选出引物浓度为：50μl反应体系中，浓度为10μM的P1引物对(P1F-1和P1Rbio-1)和P2引物对(P2F-1和P2Rbio-1)用1μl、，P3引物对(P3F-1和P3Rbio-1)用0.5μl。

(二)RPA扩增温度和时间的优化

将上述RPA三重扩增体系配制好以后(使用优选后的引物及引物浓度)，扩增温度分别采用36℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃进行扩增反应，反应时间30min，然后将扩增产物通过琼脂糖电泳观察其扩增效果。

同样将上述体系配制好以后，扩增温度采用37℃，扩增反应时分别采用5min、10min、15min、20min、25min和30min，然后将扩增产物进行琼脂糖电泳观察其扩增效果。

结果显示，在38℃扩增25min的扩增效果最好。

(三)多重不对称RPA优化

采用上述的RPA三重扩增体系，以人基因组DNA为模板，三对引物进行不对称RPA扩增，正反向引物浓度分别采用1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶7.5和1∶10进行，即：每50μl反应体系中，浓度为10μM的引物P1F-1和P1Rbio-1分别为：1∶1μl(即1μl配比1μl，下面的引用用量以此类推)，0.4∶1μl，0.2∶1μl和0.1∶1μl，浓度为10μM的引物P2F-1和P2Rbio-1分别为：1∶1μl，0.4∶1μl，0.2∶1μl和0.1∶1μl，浓浓度为10μM的引物P3F-1和P3Rbio-1分别为：0.5∶0.5μl，0.2∶0.5μl，0.1∶0.5μl和0.05∶0.5μl；每一反应体系中，引物对的稀释比例是相同的，即在一50μl反应体系中，各引物的用量为：P1F-1 1μl、P1Rbio-1 1μl、P2F-1 1μl、P2Rbio-1 1μl、P3F-1 0.5μl、P3Rbio-1 0.5μl；在一50μl反应体系中，各引物的用量为：P1F-1 0.1μl、P1Rbio-11μl、P2F-1 0.1μl、P2Rbio-1 1μl、P3F-1 0.05μl、P3Rbio-1 0.5μl。

扩增完成后，取扩增产物5μl，采用地贫液相芯片试剂盒(依据专利号为“201110084698.6”、名称为“基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用”实施例1制备得到)进行杂交检测(杂交检测的步骤按专利号为“201110084698.6”实施例1进行)，根据杂交信号强弱确定最合适的引物比例。

表5不对称RPA扩增的检测结果(荧光信号值MFI)

可见，上下游引物按照1∶5的比例进行扩增反应，杂交后信号最好(见表5)。

(三)标本检测

对5例外周血标本提取到的基因组DNA进行检测，其中标本1为地贫阴性、标本2为β⁶⁵⁴/β^N、标本3为β^41-42/β^N、标本4为β^-28/β^N、标本5为β^E/β^N，5例标本都经过测序确认突变位点。

(1)对待检测样本提取基因组DNA；

(2)配制RPA反应体系；

共配制6管反应液，其中一管为空白对照，每管50μl反应体系，组成如下：浓度为10μM的引物P1F 0.2μl、浓度为10μM的引物P1Rbio 1μl、浓度为10μM的引物P2F 0.2μl、浓度为10μM的引物P2Rbio 1μl、浓度为10μM的引物P3F 0.1μl、浓度为10μM的引物P3Rbio 0.5μl、1管Basic干粉试剂、RPA扩增的缓冲液29.5μl、浓度20～40ng/μl的基因组DNA 1～2μl，用于RPA扩增的水补足至47.5μl；加入280mM乙酸镁2.5μl，立刻进行RPA扩增，38℃扩增25min；

(3)检测

取扩增产物5μl，采用地贫液相芯片试剂盒进行杂交检测；

(4)结果

5例样本检测结果见表6：

表6 5个样本的检测结果(荧光信号值MFI)

结果：

标本1：所有位点探针M/N的值都≤0.5，且各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3，为野生型正常标本；

标本2：IVS-II-654探针M/N＝0.94，且各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3，为IVS-II-654C-＞T的杂合突变，基因型为β⁶⁵⁴/β^N；；

标本3：CD41-42探针M/N＝1.08，且各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3，为CD41-42(-TCTT)的杂合突变，基因型为β^41-42/β^N；

标本4：-28的探针M/N＝1.09，且各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3，为-28A＞G的杂合突变，基因型为β^-28/β^N；

标本5：CD26的探针M/N＝0.98，且各位点相应的正常探针(N)和空白对照正常探针(N)比值≥3，为CD26 G＞A的杂合突变，基因型为β^E/β^N；；

5个标本的检测结果和之前的测序结果完全一致。

从上述实施实例看，本发明能很好地进行β-珠蛋白基因的扩增，结合地贫液相芯片可以准确地进行β-地贫常见突变类型的基因检测。能快速、简捷地进行β-珠蛋白基因的扩增，大大地缩短了β-地贫基因的检测时间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒，其特征在于包括如下所示的RPA扩增引物：

P1F-1：5’-ccctagggttggccaatctactcccaggagcaggg-3’；

P1Rbio-1：5’-BIO-TCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACC-3’；

P2F-1：5’-tttctgataggcactgactctctctgcctattgg-3’；

P2Rbio-1：5’-BIO-CACTCAGTGTGGCAAAGGTGCCCTTGAGGTTGTC-3’；

P3F-1：5’-atcatgcctctttgcaccattctaaagaataac-3’；

P3Rbio-1：5’-BIO-CCTTATCCCAACCATAAAATAAAAGCAGAATGG-3’。

2.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒，其特征在于：还包括用于RPA扩增的Basic试剂、用于RPA扩增的水中的至少一种。

3.根据权利要求2所述基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒，其特征在于：所述的用于RPA扩增的Basic试剂包括Basic干粉试剂、用于RPA扩增的缓冲液和乙酸镁中的至少一种；

所述的用于RPA扩增的水为双蒸水或超纯水。

4.根据权利要求1所述基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒，其特征在于：包含引物预混液，引物预混液中各引物按摩尔比配比如下：P1F-1∶P1Rbio-1∶P2F-1∶P2Rbio-1∶P3F-1∶P3Rbio-1＝0.04∶0.2∶0.04∶0.2∶0.02∶0.1。

5.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增方法，其特征在于：是采用权利要求1～4任一项所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)对待检测样本提取基因组DNA；

(2)RPA反应；

6.根据权利要求5所述的基于重组酶聚合酶扩增技术的β-地中海贫血基因扩增方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的标本包括外周血、脐带血、绒毛和羊水；

步骤(1)中所述的基因组DNA的纯度为OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.7-2.0之间。

7.一种β-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的RPA扩增引物和液相芯片。

8.根据权利要求7所述的β-地中海贫血基因检测试剂盒，其特征在于：所述的液相芯片为依据专利号为“201110084698.6”、名称为“基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用”制备得到的液相芯片。

9.权利要求7或8所述的β-地中海贫血基因检测试剂盒的应用，其特征在于包括如下步骤：

1)杂交检测：

2)结果判读：

A、正常标本

B、突变杂合标本

C、突变纯合标本

D、突变探针(M)和正常探针(N)比值(M/N)不在上述判断标准范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证。