CN111154739A

CN111154739A - 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111154739A
Application number: CN202010081170.2A
Authority: CN
Inventors: 陈翀; 刘华勇; 季宇; 谢婵芳; 文荻琛
Original assignee: Guangzhou Universal Junan Biotechnology Co Ltd; Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Universal Junan Biotechnology Co Ltd; Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2040-02-06
Also published as: CN111154739B

Abstract

本发明公开了一种新型重组酶依赖型扩增方法（Recombinase‑dependent amplification，RDA）及试剂盒。本发明研究得到一种新的重组酶KX及其辅助蛋白KY，可用于对核酸模板进行特异灵敏地恒温扩增。在此基础上本发明开发了一种新的稳定性高、特异性强、灵敏度高的重组酶依赖型扩增技术的检测方法和检测系统。本发明重组酶KX和KY蛋白制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低，所开发的RDA技术所需引物短，对靶标序列长度要求低，适用范围广，且对核酸靶标序列检测特异性好、灵敏度高，可在25‑37℃的恒温条件下实现高灵敏、高特异性的核酸检测，检测成本低廉、操作方便，具有广阔的应用前景。

Description

一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种新型重组酶依赖型扩增技术(RDA)及基于此技术开发的检测试剂盒。

背景技术

核酸扩增在许多分子生物学检测方法中都是非常关键的一步。PCR是在1986 年就发展起来的应用最为广泛的DNA扩增技术，常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。恒温扩增技术不需要变温即可实现对靶标片段进行特异性扩增，对仪器的要求大为简化，反应时间明显缩短，降低了核酸扩增技术的应用门槛。操作方法的简便性，使恒温扩增技术得到了快速发展，多种新的技术方法不断提出。在技术开发和临床应用有较多研究的主要有重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP ) 等。除此之外，还有转录介导扩增（TMA）、滚环扩增技术（RCA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）等，但这些技术由于应用范围，技术复杂等因素，都还没有在临床应用方面有大的突破。

其中，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，通过模拟DNA体内扩增，在常温条件下扩增目的片段。该技术主要依赖重组酶UvsX、重组酶UvsY、单链结合蛋白gp32 和链置换DNA聚合酶。重组酶UvsX能够不通过加热就解开双链DNA，重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶UvsX利用ATP结合引物，形成重组酶UvsX-引物复合体，这些复合体能够识别与之互补的目标双链DNA；接着重组酶引物复合体侵入目标双链DNA 5’端位点形成D状环，单链结合蛋白gp32与被置换单链结合使其不能复性。同时，链置换DNA聚合酶结合在引物3’端进行链延伸，形成新的互补链。重组酶聚合酶扩增技术中，重组酶UvsY可以改变重组酶UvsX-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于RPA 的进行，此外肌酸激酶可以使扩增过程中形成的ADP再生为ATP，保持扩增反应持续稳定的进行。

作为一项相对新的技术，重组酶聚合酶扩增技术（RPA）尚未得到广泛的应用，但其具有灵敏度高、特异性强、操作快速便捷、反应快速等优点，且该技术对硬件设备的要求很低，无需精密仪器，适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。上述技术优势使重组酶聚合酶扩增技术同其他等温扩增技术相比更适于床旁诊断或疾病防控等现场快速检测，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。

虽然重组酶聚合酶扩增技术（RPA）具有以上优点及应用前景，但该技术本身还存在着一些缺点和不足，RPA反应体系中包含UvsX、UvsY、gp32、肌酸激酶、Bsu DNA 聚合酶五种蛋白酶，对工具酶的活性及质量有较高的要求，反应体系中蛋白的工业化生产工艺复杂，量产成本高。如重组酶UvsX在含有50%的甘油的保存液中依然会在低温（-20℃）凝结，使其长期稳定保存较为困难；UvsY对反应体系中的盐离子浓度敏感，活性不稳定。其次，RPA反应所需的探针和引物比其他核酸扩增技术长（需30-35bp），不适用于短序列核酸检测，对靶标序列的要求高，导致引物设计和产品开发难度大。

发明内容

本发明为了解决以上问题，利用生物信息学方法，对批量的蛋白结构进行分析模拟和高通量虚拟筛选，并通过大量的生物学实验验证，最终研究得到一种新的稳定性高的重组酶组合。具体地所开发的新的重组酶组合为重组酶KX和辅助蛋白KY，可以替代重组酶UvsX参与RPA反应，重组酶KX与T4 UvsX 蛋白序列同源性为50%(201/395)；而且本发明中重组酶KX和辅助蛋白KY的制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。进一步地，基于此重组酶组合，本发明开发了一种新的稳定性高、特异性强的重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）的检测方法和检测系统，该技术所需引物短（18-30bp），对靶标序列的长度要求低，适用性广；且对核酸靶标序列的检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的恒温条件下实现高灵敏、高精度的快速分子检测，检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景。

本发明的目的是提供一种新的恒温扩增反应用重组酶KX。

本发明另一目的是提供一种所述重组酶KX的辅助蛋白KY。

本发明另一目的是提供一种新的恒温扩增反应用重组酶组合。

本发明再一目的是提供一种新型重组酶依赖型扩增技术（RDA）反应体系。

本发明再一目的是提供一种新型重组酶依赖型扩增试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明开发了一种重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

同时还筛选得到重组酶KX的辅助蛋白KY，使扩增反应更加灵敏、高效。蛋白KY的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述重组酶KX和蛋白KY来源于Escherichia phage phT4A噬菌体，Escherichiaphage phT4A属于Myoviridae科，Tevenvirinae亚科中Slopekvirus属。

所述重组酶KX和蛋白KY能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达。

具体地作为一种可选择的方案，其制备方法如下：

S1. 将目的基因表达片段导入表达载体中，得到重组表达载体；

S2. 将所述重组表达载体转入表达菌，得到重组工程菌；

S3. 对所述重组工程菌进行诱导培养，经过工程菌富集和超声破碎后离心得到未纯化的重组酶；

S4. 将未纯化的重组酶经过层析纯化得到重组酶KX。纯化得到的重组酶KX在低温不出现凝结或沉淀的现象。

其中，步骤S1中所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列，所述目的基因表达片段的 5’端具有BamHI 酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的 3’端具有Sall 酶切位点黏性末端。

优选地，步骤S1中所述表达载体为pET-28a载体。

优选地，步骤S2中所述表达菌为大肠杆菌。

该制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。

重组酶KX可以替代RPA反应中重组酶UvsX或RecA使用，KY蛋白可以替代RPA反应中UvsY蛋白使用。

基于上述得到的重组酶KX和辅助蛋白KY，本发明还提供了一种RDA反应用重组酶组合，包括所述重组酶KX和KY蛋白。

具体地，所述RDA反应用重组酶组合包括重组酶KX、KY蛋白、gp32蛋白、BSu DNA 聚合酶、肌酸激酶。

进一步地，本发明还提供一种新型重组酶依赖型扩增（RDA）反应体系，包括如下试剂：上述重组酶组合、Tris-缓冲液、醋酸钾或醋酸钠、PEG20000或PEG35000、二硫苏糖醇、dNTPs、dATP、磷酸肌酸、引物、醋酸镁。

优选地，所述引物的长度为18-30bp。

现有RPA反应技术对扩增引物长度的要求一般为30-35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性。但扩增引物过长并不一定能提高扩增性能，还会增加形成二级结构的可能性，增加引物设计的难度和降低RPA技术的适用性。本发明的RDA技术对实验中的引物长度进行了优化，RDA反应体系中引物的最适长度在18-30bp。

优选地，Tris-缓冲液为Tris-tricine。

优选地，Tris- tricine的浓度为100mM。

Tris- tricine 为高效的缓冲体系，用于维持反应体系的 pH 值。使用该缓冲体系的试剂在冻干过程中pH值不发生偏移，使冻干操作容易进行，冻干后的干粉试剂稳定性高，可以在常温下长期保存，能大大减少试剂的存储和运输成本。

反应体系中dATP、肌酸激酶和磷酸肌酸组成整个反应体系的能量再生系统。优选地，体系中dATP的终浓度为2mM、肌酸激酶的终浓度为0.2mg/ml，磷酸肌酸的终浓度为50mM。

更具体优选地，所述反应体系包括如下配比的试剂：

序号	组分	浓度
			1	Tris-tricine（PH 7.4-8.4）	20~100mM
2	醋酸钾或醋酸钠	0-150mM
			3	PEG20000或PEG35000	2.5%-10%
4	二硫苏糖醇(DTT)	1-12mM
			5	dNTPs	150-600nM each
6	dATP	1-5mM
			7	肌酸激酶（Creatine kinase）	0.1-0.8mg/ml
8	磷酸肌酸（Creatine phosphate）	25-75mM
			9	Bacillus subtilis DNA聚合酶(Bsu)	3-100ng/ul
10	gp32蛋白	100-1000 ng/ul
			11	重组酶KX	60-600 ng/ul
12	KY蛋白	16-192ng/ul
			13	上游引物	150nM-600nM
14	下游引物	150nM-600nM
			15	醋酸镁	10-30mM

最优选地，所述反应体系的最优配比如下：

序号	组分	浓度
			1	Tris-tricine（PH 7.9）	100mM
2	醋酸钾	50mM
			3	PEG20000或PEG35000	5%
4	二硫苏糖醇(DTT)	2mM
			5	dNTPs	200nM each
6	dATP	2mM
			7	肌酸激酶（Creatine kinase）	0.2mg/ml
8	磷酸肌酸（Creatine phosphate）	50mM
			9	Bacillus subtilis DNA聚合酶(Bsu)	50ng/ul
10	gp32蛋白	300 ng/ul
			11	重组酶KX	120 ng/ul
12	KY蛋白	60ng/ul
			13	上游引物	500nM
14	下游引物	500nM
			15	醋酸镁	14mM

另外进一步地，上述反应体系还包括检测模板，如待检样本DNA或RNA。

优选地，所述反应体系的反应条件为25-42℃下反应10-60min。

更优选地，所述反应体系的反应条件为37℃反应30min。

本发明提供的新型重组酶依赖型扩增（RDA）反应体系的反应原理为：（1）反应体系中重组酶与18-30bp 的特异性引物结合形成的重组酶-引物复合体，在双链 DNA 模板中寻找靶位点；（2）重组酶-引物复合体识别模板特异性序列后，发生定位并引发链交换，单链结合蛋白随即结合被置换的 DNA 链形成的D-Loop结构；（3）重组酶-引物复合体水解体系中的 dATP 构象改变，重组酶解离后引物 3' 端暴露并被 DNA 聚合酶识别，DNA 聚合酶按照模板序列在引物3'端启动DNA 合成；（4）DNA 聚合酶具有链置换功能，在引物延伸的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；（5）两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子；（6）在反应体系中dATP水解为重组酶供能后变成dADP，磷酸肌酸能在肌酸激酶的催化下将其磷酸基转移到dADP分子中形成dATP，从而恢复反应体系中dATP的水平。上述过程不断重复，最终实现核酸的高效扩增。

基于上述反应体系构建一种新型重组酶依赖型扩增试剂盒。

所述试剂盒的使用方法，即一种新型重组酶依赖型扩增方法，包括如下步骤：

（1）提取待测样本DNA或RNA ；

（2）加入上述反应体系试剂，25-42℃下反应10-60min，即完成核酸的扩增。

本发明具有以下有益效果：替代重组酶UvsX使用，使用。

本发明提供了一种新的重组酶KX，重组酶KX可以替代重组酶UvsX或RecA参与RPA反应。该酶制备工艺简单，重组酶的产量和稳定性大幅提高，量产成本低。作为重组酶聚合酶扩增领域中的一种重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶UvsY一起实现核酸扩增，重组酶KX的应用可以使得DNA或RNA 的扩增反应灵敏、高效、经济、便捷。

同时本发明开发了重组酶KX的辅助蛋白KY，使扩增反应更加灵敏、高效。

基于重组酶KX及其辅助蛋白KY发明了一种新的能量再生系统，针对该能量再生系统利用重组酶聚合酶扩增技术可实现靶标序列的恒温扩增，由此开发了一种新的稳定性高、特异性强的重组酶依赖型扩增技术（RDA）的检测方法和检测系统，该RDA技术具有诸多优势：

（1）RDA反应体系所需引物短，对靶标序列的长度要求低，适用性广；

（2）重组酶KX 蛋白和KY 蛋白在扩增过程中对靶标序列具有高度特异性，只有引物和模板序列完全互补扩增才会发生，降低因碱基错配导致的非特异性扩增；

（3）RDA反应体系对核酸靶标序列的检测灵敏度高，可以实现单拷贝模板扩增；

（4）RDA反应体系在25-42℃的恒温条件下进行扩增，不需要 PCR 技术的热循环设备，从而可实现便携式的核酸检测，使检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景；

（5）RDA反应体系容易实现多重扩增，只需要在反应体系中增加特异性引物对，即可一次性检测多个靶标基因；

（6）RDA反应体系既可以适用于 DNA模板扩增，也可以适用于 RNA模板扩增；

（7）RDA反应体系使用高效的缓冲盐体系，该缓冲体系在试剂冻干过程中保持pH值不发生偏移，冻干后的试剂稳定性高，可在常温下长期保存。

附图说明

图1为实施例1重组酶筛选中4个蛋白的ATP水解活性结果图。

图2为实施例1重组酶筛选中 4个蛋白的恒温扩增反应琼脂糖胶图。

图3为实施例1中KX蛋白三维结构图。

图4为实施例1中KY蛋白七聚体三维结构图。

图5为实施例5中的RDA技术的应用案例图。

图6为实施例6中引物长度优化测试图。

图7为实施例7中灵敏度测试图。

图8为实施例8中特异性测试图。

图9为实施例9中多重反应测试图。

图10为实施例10中RNA病毒检测图。

图11为实施例11试剂真空干燥及常温稳定性测试图。

图12为实施例12不同浓度dATP对RDA体系扩增效率影响图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克( Sambrook )、弗里奇( Fritsch )和马尼亚蒂斯( Maniatis )，《分子克隆：实验室手册》( MOLECΜLARCLONING:A LABORATORY MANUAL )，第2次编辑( 1989 )；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY )( F .M .奥苏贝尔( F .M .Ausubel )等人编辑，( 1987 ))；《酶学方法》( METHODS IN ENZYMOLOGY )系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》( PCR 2:A PRACTICAL APPROACH )( M .J .麦克弗森( M .J .MacPherson )、B.D .黑姆斯( B .D .Hames )和G .R .泰勒( G .R .Taylor )编辑( 1995 ))、哈洛(Harlow )和拉内( Lane )编辑( 1988 )《抗体：实验室手册》( ANTIBODIES ,A LABORATORYMANUAL )，以及《动物细胞培养》( ANIMAL CELL CΜLTURE )(R .I .弗雷谢尼(R .I.Freshney )编辑(1987 ))。

实施例1 重组酶KX和KY蛋白的获取

已报道的重组酶UvsX稳定性差，难以量产和长期保存，为了解决这一问题，本研发团队利用生物信息学方法，通过对大批量的蛋白结构进行分析模拟，最终找到了一种新的重组酶KX及其辅助蛋白KY。

在本实施例中，研发团队通过提取重组酶结构中的关键功能位点信息，如DNA结合位点、ATP水解位点等，映射到蛋白质三维空间结构，获取二级结构信息和三级结构信息，通过综合一级结构序列的功能残基、二级结构特征和三级结构空间距离，构建了一个用于重组酶蛋白结构筛选的数据模型。通过从SwissProt、PDB数据查找在一级结构与重组酶蛋白匹配的模板，初步筛选出312个蛋白序列，然后分别进行二级结构和三级结构比对，计算相似性分值，根据相似性评分排名，模拟筛选出了15个疑似有重组酶活性的蛋白。

将这15个蛋白分别构建重组蛋白表达载体，分别表达纯化后，检测其水解ATP的能力，其中有4个蛋白有ATP水解活性，分别为KX、X-1、X-2、X-3蛋白。实验中使用萤火虫荧光素酶 ATP 生物发光检测试剂盒，严格按照说明书的操作进行实验，结果如图1所示。

将有ATP水解活性4个蛋白配制成恒温扩增体系进行扩增反应，结果如图2所示，N为阴性对照，P为加入T4UvsX扩增的阳性对照，1~4分别加入的蛋白为KX、X-1、X-2、X-3，其中只有KX蛋白有扩增活性。KX蛋白源自Escherichia phage phT4A噬菌体，其三维结构图如图3所示。

以同样的方法，我们筛选出了重组酶KX源自Escherichia phage phT4A噬菌体的辅助蛋白KY，其三维结构图如图4所示。其中辅助蛋白KY需以七聚体的形式发挥活性作用。

本实施例中发现的一种新的可用于RDA扩增的重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；重组酶KY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2 重组酶KX的制备

实施例1所得重组酶KX可采用基因工程技术进行量产，方法如下：

（1）将目的基因表达片段导入pET 28a载体中，得到重组表达载体。

所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’ 端具有BamHI 酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’ 端具有Sall酶切位点黏性末端：

（2）将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌。

（3）对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶KX。

所述诱导表达的方法为：在重组工程菌的菌落OD值为0.6-0.8 时，加入终浓度为0.1mM/L-0.5mM/L异丙基硫代半乳糖苷，并在16℃-22℃诱导表达20h-30h，固液分离收集沉淀，得到表达菌；将所述表达菌经超声裂解后固液分离收集上清，得到粗产物。将所述粗产物采用亲和层析后，再经阴离子层析，纯化得到所述重组酶KX。

上述制备得到的重组酶KX纯度大于95%。

实施例3 重组酶辅助蛋白KY的制备

实施例1所得KY蛋白的量产，将目的基因表达片段导入pET 28a载体中，在其编码基因C端增加TrxA和SUMO双促溶标签，得到重组表达载体。将上述重组表达载体导入大肠杆菌中实现大量可溶性表达。

双促溶表达标签的KY蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将目的基因表达片段导入pET 28a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI 酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有Sall 酶切位点黏性末端：

将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌：以及对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述KY蛋白。

对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述KY蛋白的步骤中，包括：

在重组工程菌的菌落OD值为为0.6-0.8 时，加入终浓度为0.1mM/L-0.5mM/L异丙基硫代半乳糖苷，并在 16℃～22 ℃诱导表达20h-30h，固液分离收集沉淀，得到表达菌，将所述表达菌经超声裂解后固液分离收集上清，得到粗产物，将所述粗产物纯化，得到所述KY蛋白。

其中，将所述粗产物纯化，包括：将所述粗产物采用聚乙烯亚胺沉淀和硫酸镀盐析后经亲和层析，再用Ulp1酶切除TrxA和SUMO标签，最后经阴离子层析得到所述KY蛋白。

上述KY蛋白的纯度能达到95%以上，作为重组酶依赖型扩增技术（RDA）中的重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶KX协同实现核酸的指数扩增。KY蛋白的应用使得DNA 或RNA的扩增反应灵敏、高效。

实施例4 基于重组酶KX的新型重组酶依赖型扩增技术（RDA）

基于重组酶KX构建了一种新型重组酶依赖型扩增技术（RDA），所用酶组合为：重组酶KX、KY蛋白、gp32蛋白、BSu DNA 聚合酶、肌酸激酶。

进一步地，RDA反应体系包括如下试剂：上述重组酶组合、Tris-tricine、醋酸钾、PEG20000或PEG35000、二硫苏糖醇、dNTPs、dATP、磷酸肌酸、引物、醋酸镁。

具体地，所述反应体系的配比如下表1：

表1

序号	组分	含量浓度
			1	Tris-tricine（PH 7.4-8.4）	20~100mM
2	醋酸钾或醋酸钠	0-150mM
			3	PEG20000或PEG35000	2.5%-10%
4	二硫苏糖醇(DTT)	1-12mM
			5	dNTPs	150-600nM each
6	dATP	1-5mM
			7	肌酸激酶（Creatine kinase）	0.1-0.8mg/ml
8	磷酸肌酸（Creatine phosphate）	25-75mM
			9	Bacillus subtilis DNA聚合酶(Bsu)	3-100ng/ul
10	gp32蛋白	100-1000 ng/ul
			11	重组酶KX	60-600 ng/ul
12	KY蛋白	16-192ng/ul
			13	上游引物	150-600nM
14	下游引物	150-600nM
			15	醋酸镁	10-30mM

所述反应体系的最优配比如下表2：

表2

序号	组分	含量浓度
			1	Tris-tricine（PH 7.9）	100mM
2	醋酸钾	50mM
			3	PEG20000或PEG35000	5%
4	二硫苏糖醇(DTT)	2mM
			5	dNTPs	200nM each
6	dATP	2mM
			7	肌酸激酶（Creatine kinase）	0.2mg/ml
8	磷酸肌酸（Creatine phosphate）	50mM
			9	Bacillus subtilis DNA聚合酶(Bsu)	50ng/ul
10	gp32蛋白	300 ng/ul
			11	重组酶KX	120 ng/ul
12	KY蛋白	60ng/ul
			13	上游引物	500nM
14	下游引物	500nM
			15	醋酸镁	14mM

所述反应体系的反应条件为：25-42℃下反应10-60min。

最佳反应条件为：37℃反应30min。

实施例5 基于重组酶KX的RDA技术的应用案例

基于RDA技术的淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）核酸检测方法。

对收集的5例经荧光定量PCR验证均为淋球菌DNA阳性的生殖泌尿道分泌物样本，进行核酸提取后使用实施例4的RDA技术进行检测。

1、检测方法

步骤一、样本核酸提取（基于DP316 微量样品基因组DNA提取试剂盒）：

1.将收到的样本置于65℃水浴30min进行灭活处理。2. 破壁处理，往洁净的1 ml EP管内加入100μL玻璃珠并标记将要处理的样本编号；3. 往上一步的管内加入600μL对应的样本；用Laboratory Film将管盖封住，室温涡旋震荡30分钟；4. 8000g室温离心1分钟，吸取300μL上清于新的1ml EP管内，加入10μL 蛋白酶K，涡旋振荡10s；加入300μL的GbMix，涡旋振荡10s，70℃水浴15min；室温静置5min，加入300μL预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀后室温静置5min；5. 掌上离心机离心10s，将溶液加入到一个吸附柱CR2中，13400g离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。往吸附CR2中加入500μL缓冲液GD，13400g离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。往吸附CR2中加入600μL缓冲液PW，13400g离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。13400g离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置3-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CR2转入一个干净的1mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL 洗脱缓冲液TB，室温放置5 min，13400g离心2 min，将溶液收集到离心管中，即为制备好的样本核酸。

步骤二、样本核酸定量及质控：

核酸提取后，使用Nanodrop仪测定核酸浓度，质控提取的效果。

步骤三、NG特异性引物设计：

根据淋球菌特异性靶标序列设计用于恒温扩增的引物NG-F1/ NG-R1，扩增片段大小为293bp，引物的变性温度可为54-67℃、优选60，长度为15-30bp、优选32，引物中GC含量为40-60%，根据设计的序列合成DNA引物。

设计以下引物，委托广州艾基生物技术有限公司进行合成：

选择的模板（NG-F1 模板）序列如SEQ ID NO.5所示。

NG-F1-30：GCCTATCCGATTTGGCGGCATTTRGGCCGG（SEQ ID NO.6）

NG-R1-30：GCCCGGYGCTYCATYACCTTAGGGAAYCGT（SEQ ID NO.7）

步骤四、NG核酸恒温扩增反应：

1. 按以下体系配制50μL核酸扩增反应mix，具体如下：

重组酶KX: 120ng/μL，KY蛋白: 60ng/μL，gp32蛋白: 300ng/μL，dNTPs: 200nM each，引物对: 500nM，DTT: 2mM，磷酸肌酸: 50mM，肌酸激酶: 0.2mg/ml，dATP: 2mM，Bsu: 50ng/ul，Tris-tricine: 100mM，醋酸钾: 50mM，PEG20000: 5%。

2. 向各反应体系加入1μL模板，以加入灭菌水替代基因组作为空白对照。

3. 向上述反应体系中加入终浓度为14mM醋酸镁溶液，充分混匀并离心。

4. 恒温条件下扩增反应：将反应管置于37℃水浴或金属浴中反应30min。

步骤五、电泳：反应结束后，取出离心管，取1μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图5所示，N为空白对照，1~5分别为5例淋球菌DNA阳性样本。5例阳性样本均出现263bp目的条带。

结果表明，本实施例的重组酶聚合酶扩增方法能够有效对人生殖泌尿道分泌物样本中的淋球菌进行扩增。

实施例6 RDA反应体系中引物长度优化及测试

现有RPA反应技术对扩增引物长度的要求一般为30-35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性，但扩增引物过长并不一定能提高扩增性能，还会增加形成二级结构的可能性，增加引物设计的难度和RPA技术的适用性。

本发明基于开发的重组酶KX构建的RDA反应体系可控制引物长度在合适范围内。在本实施例中，对RDA扩增的引物长度进行了优化，确认了本RDA反应体系中引物的最适长度在15-30bp。

具体操作如下：

步骤一、引物设计：针对淋球菌基因组的特异性靶标位点（靶标序列为SEQ ID NO.5），设计了两组引物，引物长度为30bp，他们分别为：SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21。

在本实施例中，我们分别对上述两组引物进行截短，截短后的引物长度分别约为28bp，25bp，20bp，18bp，15bp，14bp，各所得6组引物序列分别如表1所示。

步骤二、RDA扩增：按照实施例5步骤四配制RDA扩增反应体系，以上述不同组合的引物，加入1μL实施例5中提取的基因组核酸进行检测，以加入灭菌水替代基因组作为空白对照。37℃水浴或金属浴中反应30min。

步骤三、取1μL反应产物进行电泳，观察条带位置和亮度。

结果如图6所示，N为空白对照，1~14分别对应表1的各组别。第1-6组、第8-13组可见清晰目的条带，第7组、第14组设计无目的条带。表明RDA反应体系中引物长度低于15bp时，扩增无法完成。

结果表明，本发明RDA扩增反应体系中引物长度可缩短到15bp，最佳范围在15bp-30bp。

表1 引物序列

实施例7 RDA反应体系灵敏度测试

将菌液浓度为OD₆₀₀=4.39的NG-F1菌液（即浓度约为4.39×10⁸CFU/mL），按10倍梯度稀释至4.39×10⁴、4.39×10³、4.39×10²、4.39×10¹、4.39×10⁰ CFU/mL，样本提取后，进行RDA检测其灵敏度。

具体操作如下：

步骤一、NG-F1菌液核酸提取：各取100μL下述NG-F1菌液稀释液，4.39×10⁴、4.39×10³、4.39×10²、4.39×10¹、4.39×10⁰ CFU/mL，按照DP316 微量样品基因组DNA提取试剂盒的说明书进行核酸提取（方法同实施例5），最后用50 μL水洗脱DNA。

步骤二、RDA检测：1.按照实施例5 步骤四配制RDA扩增反应体系，各反应体系加入1μL模板，以加入灭菌水替代基因组作为空白对照，以加入NG-F1质粒作为阳性对照。2. 向上述反应体系中加入280mM醋酸镁溶液，充分混匀并离心。3. 37℃水浴或金属浴中反应30min。

步骤三、取1μL 产物于2％琼脂糖胶进行电泳，观察条带位置和亮度。

结果如图7所示，N、P分别为空白对照、阳性对照，1~5分别对应菌液稀释液浓度为4.39×10⁴、4.39×10³、4.39×10²、4.39×10¹、4.39×10⁰CFU/mL的核酸提取产物，都在263bp处有目的条带。

结果表明，本发明的恒温扩增方法，最低能检测到1个拷贝的模板。

实施例8 RDA反应体系特异性测试

按照实施例5中的提取试剂和方法，分别提取淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)、解脲支原体（ureaplasmaurealyticum, UU）的基因组当模板，对实施例6中NG的两对引物NG-F1-28（SEQ ID NO.8）、NG-R1-28（SEQ ID NO.9）和NG-F2-28（SEQ ID NO.22），NG-R2-28（SEQ ID NO.23）进行检测，检验两对引物的特异性。

具体操作如下：

步骤一、1.按照实施例5 步骤四配制RDA扩增反应体系，各反应体系加入1μL上述基因组模板，以加入灭菌水替代基因组作为空白对照、以加入NG-F1质粒作为阳性对照。 2. 向上述反应体系中加入2.5μL浓度为280 mM的醋酸镁溶液，充分混匀并离心。3. 37℃水浴或金属浴中反应30min。

步骤二、取1μL 产物用2%琼脂糖胶进行电泳，观察条带位置和亮度。

结果如图8所示，N1、N2为NG两对引物的空白对照，P1、P2为NG两对引物的阳性对照，1~4加入的基因组模板分别为NG、CT、HSV、UU，5~8加入的基因组模板分别为NG、CT、HSV、UU。仅当模板为NG基因组时，引物对NG-F1-28、NG-R1-28在目的区域出现条带，而其他模板则无目的条带；当模板为NG基因组时，引物对NG-F2-28、NG-R2-28在目的区域出现条带，而其他模板则无目的条带。

结果表明，本发明的RDA恒温扩增方法，能特异性检测靶标序列。

实施例9 RDA多重反应测试

为验证本发明的RDA恒温扩增体系能对多种基因组同时检测，我们开发了针对4种病原体淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)、解脲支原体（ureaplasmaurealyticum, UU）的检测方法。本实施例中，在反应体系中同时加入四种引物对，分别加入这四种引物对的特异性模板进行测试。

具体操作如下：

步骤一、引物设计：对4种病原体靶标序列设计特异性引物，对应的引物序列见表2所示，引物委托广州艾基生物技术有限公司进行合成。

步骤二、1.按照实施例5 步骤四配制反应体系，其中引物浓度分别为：引物对NG-F1-28/NG-R1-28 300nM，引物对CT F1-2/CT R1-2 300nM，引物对HSV F2-3/HSV R2-2300nM，引物对UU F2-1/UU F2-1 300nM。2.分别加入实施例8中提取的四种病原核酸的模板，以加入灭菌水替代基因组作为空白对照，分别加入2.5μL浓度为280 mM的醋酸镁溶液，充分混匀并离心。3. 37℃水浴或金属浴中反应30min。

步骤三、取1μL 产物用2%琼脂糖胶进行电泳，观察条带位置和亮度。

结果如图9所示，N为空白对照，1~4分别对应NG、CT、HSV、UU 4种病原体核酸。分别加入4种模板的反应，电泳均出现相应的目的条带。

结果表明，本发明的RDA恒温扩增方法，能适用于多重扩增反应。

表2 引物序列

实施例10 RDA检测RNA病毒案例

对Lenti 病毒样本进行核酸提取后使用本发明的RDA恒温扩增方法检测。使用的引物序列为Lenti F1（SEQ ID NO.40）/Lenti R1（SEQ ID NO.41），扩增产物长度为190bp。

具体操作步骤如下：

步骤一、1. 将样本30μ l Lenti病毒（10⁵）+300 μL细胞（10⁵）混合，成为10⁵混合液，将其进行10倍梯度稀释，稀释成10⁴混合液、10³混合液。2. Lenti病毒RNA提取（基于全式金EasyPure Viral DNA/RNA Kit）：分别取上述3个浓度的混合液各200μL，加入BB5溶液（含5.6μg Carrier RNA）200μL和Proteinase K 20μL，混匀后56℃孵育15min，加入250μL无水乙醇，混匀后室温放置5min，用掌式离心机瞬离后转移至离心柱中，12000 rpm离心1min。弃废液，加入500μL WB5，12000 rpm离心1min。弃废液，再加入500μL WB5，12000 rpm离心1min，弃废液，12000 rpm离心1min以彻底去除残留的乙醇。用50 μL无核酸酶水洗脱得到RNA模板。

步骤二、RDA检测：1.试剂配置：按照实施例5的优选试剂配比体系配置RDA 扩增反应mix。 2. 加入1μL RNA模板及0.5μL M-MLV反转录酶（菲鹏生物），分别加入2.5μL浓度为280 mM的醋酸镁溶液，充分混匀并离心。3. 37℃水浴或金属浴中反应30min。

结果如图10所示： RNA模板在电泳图上均有特异性条带。

结果表明，本发明的RDA恒温扩增方法，对RNA病毒核酸的检测同样适用。

实施例11 RDA试剂冻干及常温储存的稳定性

液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。而将试剂通过真空干燥成粉状试剂，能在常温下保存。本实施例检测了这种冻干试剂的稳定性。

具体实施步骤如下：

步骤一、试剂配置：重组酶KX: 120ng/μL，KY蛋白: 60ng/μL，gp32蛋白: 300ng/μL，dNTPs: 200nM each，引物对: 500nM，DTT: 2mM，磷酸肌酸: 50mM，肌酸激酶: 0.2mg/ml，dATP: 2mM，Bsu: 50ng/ul，Tris-tricine: 100mM，醋酸钾: 50mM，PEG20000: 5%，海藻糖7.5%，BSA 1%。

具体的，本实施例加入NG-F1-28（SEQ ID NO.8）、NG-R1-28（SEQ ID NO.9）引物。按照每管50μL试剂混合物进行分装，-80℃预冻过夜。

步骤二、冻干：将预冻好的试剂转移到Labconco 真空干燥仪中，干燥24小时。将冻干的重组酶聚合酶试剂密封后常温保存，检测稳定性。

步骤三、稳定性测试：在不同的时间对冻干的RDA干粉试剂进行稳定性检测。具体的，分别在0天，30天，90天，180天分别取干粉试剂做检测。

检测方法：1.配置复溶液：加入H₂O 46.5μL，加入实施例5中提取的基因组模板1μL，以加入灭菌水替代基因组作为空白对照。加入浓度为280 mM的醋酸镁溶液2.5μL，混合均匀。2.将复溶液加入冻干重组酶聚合酶试剂，充分混匀溶解干粉试剂并离心。3. 37℃水浴或金属浴中反应30min。

步骤四、取1μL 产物用2%琼脂糖胶进行电泳，观察条带位置和亮度。

结果如图11所示：本实施例中的试剂在冻干后保存的0天，30天，90天，180天，电泳图上都可见清晰的目的条带。

结果表明，本发明的重组酶聚合酶试剂，经过冻干后常温保存，在第0天，30天，90天，6个月，都有稳定的扩增结果。

实施例12 评估不同浓度dATP对RDA体系扩增效率的影响

为了评估dATP浓度对RDA体系扩增效率的影响，我们对反应体系中dATP的浓度进行调整优化。具体操作如下：

步骤一、RDA反应：1. 按照实施例5步骤四配制RDA扩增反应体系，其中dATP的终浓度分别为0mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM，并以5mM浓度为对照，其他条件不变。具体的，本实施例加入NG-F1-28（SEQ ID NO.8）、NG-R1-28（SEQ ID NO.9）引物，及实施例5中提取的基因组模板1μL。2. 加入浓度为280 mM的醋酸镁溶液2.5μL，混合均匀。3. 37℃水浴或金属浴中反应30min。

结果如图12所示，1~6分别对应dATP浓度0mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM、5mM的反应体系。dATP浓度为1.5-5mM时，反应产物在电泳图上均可见单一目的条带，表明当dATP的浓度的浓度在1.5-5mM时，RDA反应体系可以正常扩增，其中dATP浓度为2mM、3mM与5mM的反应效率一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州普世利华科技有限公司

广州普世君安生物科技有限公司

<120> 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> 重组酶KX核苷酸序列

<400> 1

atgtcaaaca aagcactact aaaaaaactg atcaaaaact cgaatagcca aactgcatct 60

gtactttctg aaagcgacgt attcaacaat attaccatca cgcgaacccg tgtgccgatt 120

ctgaatctgg cgttgtccgg tgcgtttaac ggtggcctaa cttctggtct tacccttttc 180

gctggcccgt ccaaacactt caaatccaac ttaggtttgc ttactgtagc ggcgtatctc 240

aaaacgtatg aagatgctgt gtgcctgttc tacgattcag aaaaaggtgt tactaaatcc 300

tatctgaaat caatgggtgt tgatccggat cgtgttgtgt atactcgtat cacgacggtc 360

gagcagttgc gtaatgacgt tgtaagccag cttaacgcgc ttgaacgcgg tgataaggtg 420

attgtattcg ttgactcagt aggcaacacg gcaagtaaaa aagaacttgc tgacgcgctt 480

tctgataacg ataaacagga tatgacgcga gcaaaagcat taaaaggtat gttccgtatg 540

gttacgcctt atctggctga cctggatatc ccgatggttt gtatctgtca tacctatgac 600

acacaagaaa tgtacagcaa gaaagttatt tctggtggta ctggtttaat gtattccgct 660

gatactgcga tcatcctggg taaacaacag gtgaaagaag gtactgaggt ggtaggttat 720

gatttcatca tgaatatcga aaaatctcga ttcgtgaaag agaaatcaaa attcccgctg 780

catgttacct atgaaggcgg tattagtatg tattctggcc ttttggatct ggcaatggaa 840

atgaactttg tacagaccgt aaccaaaggc tggcgcaacc gcgctttcct gaataccgag 900

actggcgaac tcgaagttga agaaaagaaa tggcgtgagt cagaaacaaa tagcgttgaa 960

ttctggcgtc ctctgtttac tcatcaacca ttcttgaaag ctatcgaaga aaagtataag 1020

atcccagatc gtgaaatcag tgatggttcc gcgctggaag atttatacag cactgatagc 1080

atcccagatc ctgatctgga tgatgacgat atcccagaat catttgatga tatcgaagaa 1140

aacgacgaaa ttttataa 1158

<210> 2

<211> 385

<212> PRT

<213> 重组酶KX氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Asn Lys Ala Leu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Asn Ser Asn Ser

1 5 10 15

Gln Thr Ala Ser Val Leu Ser Glu Ser Asp Val Phe Asn Asn Ile Thr

20 25 30

Ile Thr Arg Thr Arg Val Pro Ile Leu Asn Leu Ala Leu Ser Gly Ala

35 40 45

Phe Asn Gly Gly Leu Thr Ser Gly Leu Thr Leu Phe Ala Gly Pro Ser

50 55 60

Lys His Phe Lys Ser Asn Leu Gly Leu Leu Thr Val Ala Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Thr Tyr Glu Asp Ala Val Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Lys Gly

85 90 95

Val Thr Lys Ser Tyr Leu Lys Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val

100 105 110

Val Tyr Thr Arg Ile Thr Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Asp Val Val

115 120 125

Ser Gln Leu Asn Ala Leu Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Val Phe Val

130 135 140

Asp Ser Val Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Leu Ala Asp Ala Leu

145 150 155 160

Ser Asp Asn Asp Lys Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly

165 170 175

Met Phe Arg Met Val Thr Pro Tyr Leu Ala Asp Leu Asp Ile Pro Met

180 185 190

Val Cys Ile Cys His Thr Tyr Asp Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Lys

195 200 205

Val Ile Ser Gly Gly Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ala Asp Thr Ala Ile

210 215 220

Ile Leu Gly Lys Gln Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Val Val Gly Tyr

225 230 235 240

Asp Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Ser

245 250 255

Lys Phe Pro Leu His Val Thr Tyr Glu Gly Gly Ile Ser Met Tyr Ser

260 265 270

Gly Leu Leu Asp Leu Ala Met Glu Met Asn Phe Val Gln Thr Val Thr

275 280 285

Lys Gly Trp Arg Asn Arg Ala Phe Leu Asn Thr Glu Thr Gly Glu Leu

290 295 300

Glu Val Glu Glu Lys Lys Trp Arg Glu Ser Glu Thr Asn Ser Val Glu

305 310 315 320

Phe Trp Arg Pro Leu Phe Thr His Gln Pro Phe Leu Lys Ala Ile Glu

325 330 335

Glu Lys Tyr Lys Ile Pro Asp Arg Glu Ile Ser Asp Gly Ser Ala Leu

340 345 350

Glu Asp Leu Tyr Ser Thr Asp Ser Ile Pro Asp Pro Asp Leu Asp Asp

355 360 365

Asp Asp Ile Pro Glu Ser Phe Asp Asp Ile Glu Glu Asn Asp Glu Ile

370 375 380

Leu

385

<210> 3

<211> 420

<212> DNA

<213> KY蛋白核苷酸序列

<400> 3

atgagtttga aattagaaga tctacaaaat gaacttgaaa aggatatgct gatagatccc 60

ctcaagttgc aatcagaatc agcggatatc ccgaagattt gggctaaatg gcttcgatac 120

cattcaaacg ctaagaaaaa attgatccaa cttcatgcga aaaaagaagc tgatgtgaag 180

gatcgtatgt tgtactacac cggaaggcat gacaaagaaa tgtgcgaagt ggtgtatact 240

gggactactg aaattaaaat cgcgatcgct ggggatccga aaattgtaga aaccaacaag 300

ctgatccagt attatgacat ggtggtagat ttcaccagca aagcactgga tatcgtcaaa 360

aacaaaggat actctatcaa aaacatgtta gagatccgta aattagaaag tggtgcataa 420

<210> 4

<211> 139

<212> PRT

<213> KY蛋白氨基酸序列

<400> 4

Met Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Gln Asn Glu Leu Glu Lys Asp Met

1 5 10 15

Leu Ile Asp Pro Leu Lys Leu Gln Ser Glu Ser Ala Asp Ile Pro Lys

20 25 30

Ile Trp Ala Lys Trp Leu Arg Tyr His Ser Asn Ala Lys Lys Lys Leu

35 40 45

Ile Gln Leu His Ala Lys Lys Glu Ala Asp Val Lys Asp Arg Met Leu

50 55 60

Tyr Tyr Thr Gly Arg His Asp Lys Glu Met Cys Glu Val Val Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Thr Thr Glu Ile Lys Ile Ala Ile Ala Gly Asp Pro Lys Ile Val

85 90 95

Glu Thr Asn Lys Leu Ile Gln Tyr Tyr Asp Met Val Val Asp Phe Thr

100 105 110

Ser Lys Ala Leu Asp Ile Val Lys Asn Lys Gly Tyr Ser Ile Lys Asn

115 120 125

Met Leu Glu Ile Arg Lys Leu Glu Ser Gly Ala

130 135

<210> 5

<211> 272

<212> DNA

<213> NG-F1 模板

<400> 5

gcctatccga tttggcggca tttaggccgg taacttgatg ttttaggctg cctgtttgtt 60

ttttaaggcg aatccgcagg taaagcgtgt ttcttgacaa gttaaacgtt gctgcggttt 120

ggccggtgtt tttgcattgt ccgtaatata gcggattaac aaaaaccggt acggcgttgc 180

cccgccccgg cccaaaggga acggttccct aaggtgatgg agcgccgggc ggatcggttc 240

cgtaccattc gtactgcctg cggcccgccg cc 272

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> NG-F1-30

<400> 6

gcctatccga tttggcggca tttrggccgg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> NG-R1-30

<400> 7

gcccggygct ycatyacctt agggaaycgt 30

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> NG-F1-28

<400> 8

gcctatccga tttggcggca tttrggcc 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> NG-R1-28

<400> 9

gcccggygct ycatyacctt agggaayc 28

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> NG-F1-25

<400> 10

gcctatccga tttggcggca tttrg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> NG-R1-25

<400> 11

gcccggygct ycatyacctt aggga 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> NG-F1-20

<400> 12

gcctatccga tttggcggca 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> NG-R1-21

<400> 13

gcccggygct ycatyacctt a 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> NG-F1-18

<400> 14

gcctatccga tttggcgg 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> NG-R1-18

<400> 15

gcccggygct ycatyacc 18

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> NG-F1-15

<400> 16

gcctatccga tttgg 15

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> NG-R1-15

<400> 17

gcccggygct ycaty 15

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> NG-F1-14

<400> 18

gcctatccga tttg 14

<210> 19

<211> 13

<212> DNA

<213> NG-R1-13

<400> 19

gcccggygct yca 13

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> NG-F2-30

<400> 20

ggcgaatccg caggtaaagc gtgtttcttg a 31

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> NG-R2-30

<400> 21

ccgcaggcrg tacraatggt acggaaccg 29

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> NG-F2-28

<400> 22

ggcgaatccg caggtaaagc gtgtttct 28

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> NG-R2-28

<400> 23

ccgcaggcrg tacraatggt acggaacc 28

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> NG-F2-23

<400> 24

ggcgaatccg caggtaaagc gtg 23

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> NG-R2-24

<400> 25

ccgcaggcrg tacraatggt acgg 24

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> NG-F2-20

<400> 26

ggcgaatccg caggtaaagc 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> NG-R2-19

<400> 27

ccgcaggcrg tacraatgg 19

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> NG-F2-18

<400> 28

ggcgaatccg caggtaaa 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> NG-R2-18

<400> 29

ccgcaggcrg tacraatg 18

<210> 30

<211> 15

<212> DNA

<213> NG-F2-15

<400> 30

ggcgaatccg caggt 15

<210> 31

<211> 15

<212> DNA

<213> NG-R2-15

<400> 31

ccgcaggcrg tacra 15

<210> 32

<211> 14

<212> DNA

<213> NG-F2-14

<400> 32

ggcgaatccg cagg 14

<210> 33

<211> 14

<212> DNA

<213> NG-R2-14

<400> 33

ccgcaggcrg tacr 14

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> CT F1-1

<400> 34

gtgatcaagt atgttattgt aaagaaa 27

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> CT R1-3

<400> 35

tctttgctta tcaccagctc gccggagc 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> HSV F2-3

<400> 36

gtccaggcgc tcrcyaagcg ccggatcg 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> HSV R2-2

<400> 37

cgcgcktaga gatgatgcga cagcgcgc 28

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> UU F2-1

<400> 38

gtgcactcat caaaatatag aatttg 26

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> UU R2-1

<400> 39

catctaaata ttggcattga tcaataat 28

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> Lenti F1

<400> 40

gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 30

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> Lenti F2

<400> 41

ctgtccagca gcgggcaagg caggcggcg 29

Claims

1.一种重组酶KX，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组酶KX，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组酶聚合酶扩增反应用重组酶组合，其特征在于，包括权利要求1或2所述重组酶KX，及其辅助蛋白KY；所述辅助蛋白KY核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述重组酶组合，其特征在于，重组酶KX替代重组酶UvsX或RecA使用，KY蛋白替代UvsY蛋白使用。

5.根据权利要求3或4所述重组酶组合，其特征在于，还包括gp32蛋白、BSu DNA聚合酶、肌酸激酶。

6.一种新型重组酶依赖型扩增反应体系，其特征在于，包括权利要求3-5任一所述重组酶组合。

7.根据权利要求6所述反应体系，其特征在于，还包括如下试剂：Tris-缓冲液、醋酸钾或醋酸钠、PEG20000或PEG35000、二硫苏糖醇、dNTPs、dATP、磷酸肌酸、引物、醋酸镁。

8.根据权利要求7所述反应体系，其特征在于，所述引物的长度为18-30bp。

9.根据权利要求7所述反应体系，其特征在于，所述Tris-缓冲液为Tris-tricine。

10.根据权利要求6-9任一所述反应体系，其特征在于，包括如下配比的试剂：

。

11.根据权利要求6-10任一所述反应体系，其特征在于，还包括检测模板，所述检测模板为待检样本DNA或RNA。

12.根据权利要求6-10任一所述反应体系，其特征在于，反应条件为25-42 ℃反应10-60min。

13.一种新型重组酶依赖型扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求6-12任一所述反应体系。