CN114262697A - 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌，涉及生物技术领域。本发明提供的融合Bsu DNA聚合酶，含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到95％以上。本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala，缺失了3′→5′核酸外切酶活性，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到97％以上，能够和其他相关蛋白相互作用实现恒温扩增。

Description

融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、 基因工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌。

背景技术

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化。聚合酶链式反应(PCR)作为一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，1985年由美国科学家Mullis发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。而DNA扩增在PCR技术是非常关键的一步。它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，因此常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。

随着分子生物学技术的革新，重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)技术应运而生，作为一项新型的恒温扩增技术，其独特的优势使得使不需借助精密温度循环系统进行等温核酸扩增逐渐成为可能。RPA技术包括3种关键组分，分别是重组酶(如T4 UvsX、E.coli recA等)、单链结合蛋白(如T4 gp32等)和链置换DNA聚合酶(如B.subtilis Pol I、S.aureus Pol等)。RPA技术的原理：重组酶与长约30-35nt的引物结合形成的复合物在双链DNA模板中寻找靶位点；复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应形成D-Loop结构，单链结合蛋白随即结合被置换的DNA链，稳定形成的D-Loop结构并且防止引物解离；重组酶-引物复合物主动水解体系中的ATP导致复合物构象改变，重组酶解离后引物3'端暴露并被DNA聚合酶识别，DNA聚合酶按照模板序列在引物3'端添加相应碱基，DNA扩增启动；链置换DNA聚合酶在延伸引物的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。重组酶聚合酶扩增技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。

重组酶聚合酶扩增技术中Bsu DNA聚合酶具有重要作用，在实际应用中，由于野生型Bsu DNA聚合酶存在一定的3′→5′核酸外切酶活性，导致在宿主细胞内的表达水平较低，所以目前获得的Bsu DNA聚合酶的纯度不高，而且Bsu DNA聚合酶基因在基因工程菌中的表达量低，量产化成本高，在恒温扩增效果也较差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种融合Bsu DNA聚合酶，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种编码上述融合Bsu DNA聚合酶的基因。

本发明的第三目的在于提供一种重组质粒包括上述编码融合Bsu DNA聚合酶的基因。

本发明的第四目的在于提供一种基因工程菌，能够表达上述融合Bsu DNA聚合酶；

本发明的第五目的在于提供一种Bsu DNA聚合酶突变体，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第六目的在于提供一种编码上述Bsu DNA聚合酶突变体的基因。

本发明的第七目的在于提供一种重组质粒，包括上述编码Bsu DNA聚合酶突变体的基因。

本发明的第八目的在于提供一种基因工程菌，能够表达上述Bsu DNA聚合酶突变体。

本发明的第九目的在于提供一种上述融合Bsu DNA聚合酶或者Bsu DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

第一方面，本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶，所述融合Bsu DNA聚合酶含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段；所述Bsu DNA聚合酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；表达所述蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为进一步技术方案，表达所述Bsu DNA聚合酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述融合Bsu DNA聚合酶的基因。

第三方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码融合Bsu DNA聚合酶的基因；

所述载体包括pET-22b。

第四方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；

所述基因工程菌包括大肠杆菌。

第五方面，本发明提供了一种Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中BsuDNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala。

第六方面，本发明提供了一种编码上述Bsu DNA聚合酶突变体的基因。

第七方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码BsuDNA聚合酶突变体的基因；

所述载体包括pET-22b。

第八方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；

所述基因工程菌包括大肠杆菌。

第九方面，本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶或者Bsu DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的融合Bsu DNA聚合酶，含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述BsuDNA聚合酶片段N端的蛋白片段，能够在大肠杆菌中高效表达，表达的融合Bsu DNA聚合酶纯度可达到95％以上，得率高，能够实现批量生产，具备非常出色的DNA聚合酶效能。

本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体，以上述融合Bsu DNA聚合酶为模板，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala，缺失了3′→5′核酸外切酶活性，能够在大肠杆菌中高效表达，表达的融合Bsu DNA聚合酶纯度可达到97％以上，能够实现恒温扩增。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为三维模拟与突变点选择；

图2为pET22-b-Bsu/BL21转化子验证；

图3为Bsu蛋白纯化SDS-PAGE质控结果；

图4为E.coli 16s rDNA恒温扩增；

图5为重组质粒的结构图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶，所述融合Bsu DNA聚合酶含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段；所述Bsu DNA聚合酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；表达所述蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为进一步技术方案，表达所述Bsu DNA聚合酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中蛋白片段有助于目的蛋白的高效表达，提高表达量，从而有利于纯化步骤中的纯度提高。

本发明提供的融合Bsu DNA聚合酶，能够在大肠杆菌中高效表达，有利于纯化步骤中的纯度提高，表达的融合Bsu DNA聚合酶纯度可达到95％以上，得率高，能够实现批量生产，具备非常出色的DNA聚合酶效能。

本发明中，Bsu DNA聚合酶片段的氨基酸序列如下：

Msfvhlqvhsgysllnsaaaveelvseadrlgyaslaltddhvmygaiqfykackarginpiigltasvftddseleayplvllaksntgyqnllkissvlqskskgglkpkwlhsyregiiaitpgekgyietllegglfeqaaqaslefqsifgkgafyfsyqpfkgnqvlseqilklseetgipvtatgdvhyirkedkaayrclkaikagekltdapaedlpdldlkpleemqniyrehpealqasveiaeqcrvdvslgqtrlpsfptpdgtsaddyltdicmeglrsrfgkpderylrrlqyeldvikrmkfsdyflivwdfmkhahekgivtgpgrgsaagslvayvlyitdvdpikhhllferflnpervsmpdididfpdtrrdeviqyvqqkygamhvaqiitfgtlaakaalrdvgrvfgvspkeadqlaklipsrpgmtldearqqspqldkrlressllqqvysiarkieglprhasthaagvvlseepltdvvplqegpegiyltqyamdhledlgllkmdflglrnltliesitsmiekeenikidlssisysddktfsllskgdttgifqlesagmrsvlkrlkpsgledivavnalyrpgpmeniplfidrkhgrapvhyphedlrsiledtygvivyqeqimmiasrmagfslgeadllrravskkkkeildrershfvegclkkeysvdtanevydlivkfanygfnrshavaysmigcqlaylkahyplyfmcglltsvignedkisqylyeakgsgirilppsvnkssfpftvengsvryslraiksvgvsavkdiykarkekpfedlfdfcfrvpsksvnrkmlealifsgamdefgqnratllasidvalehaelfaadddqmglfldesfsikpkyveteelplvdllafeketlgiyfsnhplsafrkqltaqgavsilqaqravkrqlslgvllskiktirtktgqnmafltlsdetgemeavvfpeqfrqlspvlregallftagkcevrqdkiqfimsraellenmdaekapsvyikiessqhsqeilakikrillehkgetgvylyyerqkqtiklpesfhinadhqvlyrlkellgqknvvlkqw(SEQ ID NO.13)。

本发明中，表达Bsu DNA聚合酶片段的核苷酸序列如下：

ATGTCTTTTGTTCATTTACAAGTCCACTCCGGTTATTCATTGCTTAATTCGGCTGCCGCAGTAGAAGAGCTCGTGAGTGAAGCGGATCGTCTAGGCTACGCTAGCCTGGCCTTAACTGACGATCATGTTATGTATGGAGCAATTCAGTTCTACAAAGCGTGTAAGGCTCGCGGGATCAACCCTATAATTGGTTTGACCGCCTCTGTCTTTACAGACGATTCCGAGCTTGAAGCATATCCCCTCGTACTACTGGCGAAATCAAATACGGGCTACCAAAACTTATTGAAGATCTCGAGTGTGCTTCAGAGCAAATCTAAGGGAGGGCTCAAACCAAAGTGGCTACACTCCTATCGAGAGGGTATAATTGCTATCACTCCGGGCGAAAAAGGATACATAGAGACCCTGTTAGAAGGGGGTTTGTTCGAGCAAGCCGCACAGGCGTCACTTGAATTTCAATCGATTTTCGGCAAGGGAGCTTTTTATTTCAGTTACCAGCCTTTTAAAGGGAATCAAGTTCTCAGCGAGCAGATCCTAAAGCTGTCTGAAGAGACAGGTATACCCGTCACGGCCACTGGCGACGTACATTATATTCGGAAAGAAGATAAGGCAGCGTACAGATGCTTAAAAGCTATCAAGGCCGGAGAGAAATTGACCGACGCACCAGCGGAAGATCTTCCGGACCTCGATCTAAAGCCTCTGGAGGAAATGCAAAACATATATAGGGAGCACCCCGAAGCTTTACAGGCCTCCGTGGAGATTGCAGAACAATGTCGTGTTGACGTCTCATTGGGGCAGACACGCCTTCCATCGTTCCCGACGCCTGATGGTACTAGTGCGGACGATTACCTCACCGACATCTGCATGGAGGGCCTACGAAGCCGGTTTGGAAAACCCGATGAAAGATATCTGAGGCGTTTACAATACGAGTTGGACGTAATAAAGCGCATGAAATTCTCTGATTATTTTCTTATTGTGTGGGACTTCATGAAGCATGCTCACGAAAAAGGGATCGTTACAGGTCCAGGCCGAGGATCCGCCGCAGGGTCACTCGTCGCGTACGTACTATATATAACGGATGTGGACCCGATTAAGCATCACCTGTTATTTGAGCGGTTCTTGAATCCTGAAAGAGTTTCGATGCCCGATATCGACATAGATTTTCCAGACACTAGGCGTGATGAGGTCATTCAGTACGTACAACAGAAATATGGTGCTATGCATGTGGCCCAAATCATAACCTTCGGCACACTTGCAGCGAAGGCTGCCCTCCGCGACGTTGGACGAGTCTTTGGGGTAAGTCCGAAAGAAGCAGATCAGCTAGCGAAGCTGATTCCTAGCCGGCCCGGTATGACGTTAGACGAGGCTAGACAACAGTCTCCACAATTGGATAAAAGGCTTCGTGAATCCTCACTCCTACAGCAAGTGTACTCGATCGCCCGCAAGATAGAGGGCCTGCCGCGACACGCAAGTACTCATGCGGCTGGAGTTGTCTTAAGCGAAGAGCCTTTGACCGACGTAGTGCCCCTTCAGGAAGGGCACGAGGGTATTTATCTCACACAATACGCCATGGATCATCTAGAAGACCTGGGCTTATTGAAAATGGATTTCCTTGGACTCCGGAACCTAACGCTGATCGAGTCTATAACTTCCATGATTGAAAAGGAGGAAAATATCAAAATAGACTTATCATCGATTAGTTATAGCGATGACAAGACCTTTTCTTTGCTTTCCAAAGGGGATACAACGGGTATCTTCCAGCTCGAGTCAGCAGGCATGAGATCGGTTCTAAAGAGGCTGAAACCAAGTGGATTAGAAGACATAGTCGCGGTAAACGCTTTGTACCGTCCGGGGCCTATGGAGAATATTCCCCTTTTTATCGATCGCAAGCACGGTCGAGCCCCAGTGCATTATCCGCACGAAGACCTCCGGAGCATACTAGAGGATACTTACGGCGTTATTGTCTATCAAGAACAGATCATGATGATAGCATCTAGAATGGCGGGATTCTCCCTGGGGGAGGCTGACTTATTGAGGCGTGCCGTATCAAAAAAGAAAAAGGAAATTCTTGATCGCGAGCGATCGCATTTTGTGGAAGGTTGTCTCAAAAAGGAGTACAGTGTTGACACCGCAAACGAAGTCTATGATCTAATCGTAAAATTCGCGAATTACGGCTTTAACCGGAGCCACGCTGTGGCCTATTCTATGATAGGATGCCAACTGGCATACTTAAAGGCGCATTATCCTTTGTACTTCATGTGTGGGCTTCTCACATCCGTTATTGGTAATGAGGACAAAATCTCACAGTATCTATACGAAGCTAAGGGCTCGGGAATAAGAATTCTGCCCCCAAGTGTCAACAAAAGCTCTTTTCCGTTCACGGTAGAGAATGGGTCCGTGAGGTATTCATTACGTGCCATCAAGTCGGTTGGTGTCAGTGCAGTAAAAGATATATACAAGGCGCGCAAAGAAAAGCCTTTTGAGGACTTGTTCGATTTTTGCTTCCGAGTGCCCAGCAAATCTGTTAACCGGAAGATGCTTGAAGCTCTCATTTTTTCCGGCGCCATGGACGAGTTCGGACAAAATAGAGCAACTCTACTGGCGTCAATCGATGTCGCTTTAGAACACGCCGAGTTGTTTGCAGCGGACGATGACCAGATGGGGCTTTTCCTCGATGAATCGTTTAGTATAAAACCAAAGTATGTAGAGACCGAAGAGCTACCGCTGGTGGACTTATTGGCTTTCGAAAAAGAGACACTTGGTATTTACTTTAGCAACCATCCTCTCTCTGCCTTCAGGAAGCAACTAACGGCACAGGGCGCGGTTAGCATCCTGCAAGCTCAGCGTGCCGTCAAACGCCAATTATCATTGGGAGTACTTCTCTCGAAGATAAAAACTATTCGAACCAAGACAGGGCAGAATATGGCATTTCTAACGCTGAGTGATGAAACTGGTGAGATGGAAGCGGTGGTTTTCCCCGAGCAATTTCGGCAGTTAAGCCCAGTCTTGAGAGAAGGCGCTCTTCTCTTCACCGCCGGAAAATGTGAGGTAAGGCAAGACAAGATCCAGTTTATAATGTCTCGTGCAGAACTACTGGAGAACATGGATGCGGAAAAAGCTCCGTCCGTGTATATTAAGATCGAGTCATCGCAACACAGTCAGGAAATATTAGCCAAAATTAAGCGCATCTTGCTTGAGCATAAAGGGGAAACAGGTGTTTACCTCTATTACGAGCGACAAAAGCAGACGATAAAACTACCTGAAAGCTTCCACATTAATGCAGACCATCAAGTCCTGTATCGGTTAAAGGAGTTGCTTGGCCAGAAAAACGTAGTGCTCAAGCAATGG(SEQ ID NO.1)。

本发明中，表达蛋白片段的核苷酸序列如下：

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCACCATCATCACAGCAGCGGCTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTACGTCGTCTGATGGAAGCGTTCGCTAAACGTCAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTACGCTTCTTGTACGACGGTATTCGTATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGTGGTGCTACGTATCAT(SEQ ID NO.2)。

第二方面，本发明提供了一种编码上述融合Bsu DNA聚合酶的基因。

第三方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码融合Bsu DNA聚合酶的基因；

所述载体包括pET-22b，或者本领域技术人员所熟知的其他载体。重组质粒的制备方法例如可以直接通过同源臂将载体、表达Bsu DNA聚合酶片段核苷酸序列和表达蛋白片段的核苷酸序列首尾连接，连接得到的重组质粒如图5所示。

第四方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；

所述基因工程菌包括大肠杆菌，大肠杆菌例如可以为BL21(DE3)。

对于Bsu DNA聚合酶的三维结构通过SWISS-MODEL软件进行模拟，其结构如图1，对其进行理性设计选择其外切酶催化结构域进行突变，选择其中两个位点D41/V194活性位点进行点突变改造，使其缺失3′→5′核酸外切酶活性。

第五方面，本发明提供了一种Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中BsuDNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala。

本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体，缺失了3′→5′核酸外切酶活性，能够在大肠杆菌中高效表达，表达的融合Bsu DNA聚合酶纯度可达到97％以上，能够和其他相关蛋白相互作用实现恒温扩增。

第六方面，本发明提供了一种编码上述Bsu DNA聚合酶突变体的基因。

第七方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码BsuDNA聚合酶突变体的基因；

所述载体包括pET-22b，或者本领域技术人员所熟知的其他载体。

第八方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；

所述基因工程菌包括大肠杆菌，大肠杆菌例如可以为BL21(DE3)。

第九方面，本发明提供了一种融合Bsu DNA聚合酶或者Bsu DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

本发明提供的融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体的纯度高，表达量高，能够用于制备核酸扩增产品。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中所用到的引物序列及编号图下表所示。

编号	引物序列5’-3’
		(SEQ ID NO.3)	GGTGGTGCTACGTATCATATGTCTTTTGTTCATTTACAAGTCCACTCCGGT
(SEQ ID NO.4)	GTGCGGCCGCAAGCTTCCATTGCTTGAGCACTACGTTT
		(SEQ ID NO.5)	TGAGCGGATAACAATTCCCCATGGGCAGCAGCCATCATCATC
(SEQ ID NO.6)	ATGATACGTAGCACCACCAATCTGTT
		(SEQ ID NO.7)	TAATACGACTCACTATAGGG
(SEQ ID NO.8)	TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
		(SEQ ID NO.9)	GCCTGGCCTTAACTGAAGATCATGTTATGTA
(SEQ ID NO.10)	TACATAACATGATCTTCAGTTAAGGCCAGGC
		(SEQ ID NO.11)	ACTGGCGACGCACATTATATTCGGAAAGAAG
(SEQ ID NO.12)	GAATATAATGTGCGTCGCCAGTGGCCGT

实施案例1：Bsu DNA聚合酶表达载体的构建

从NCBI数据库中获取相关Bsu的相关信息，选择如SEQ ID NO.1序列。

具体地，以SEQ ID NO.1核酸序列为模板设计引物序列SEQ ID NO.3和引物序列SEQ ID NO.4进行克隆，并胶回收纯化得到线性DNA片段a；以SEQ ID NO.2核酸序列为模板设计引物序列SEQ ID NO.5和引物序列SEQ ID NO.6序列进行克隆，并胶回收纯化得到线性DNA片段b。以上克隆均采用南京巨匠生物科技有限公司高保真聚合酶2×Proofast MaxMaster Mix(Dye)PCR试剂盒。PCR程序如下：

表1 PCR反应程序

通过XbaI/Hind III对pET22-b酶切得到线性化pET22-b载体，胶回收得到片段c。

以上述片段通过一步法克隆试剂盒CloneUFO^TM Multi One Step Cloning Kit(南京巨匠生物科技有限公司)进行同源重组连接，获得重组连接产物，重组表达载体如图5所示。再将连接产物转入大肠杆菌中。

感受态细胞为BL21(DE3)。

具体地，将上述重组载体转化到BL21(DE3)感受态中，然后涂布在具有kan抗性的玻璃平板中进行筛选，挑取一定量的转化子进行菌落PCR验证，以确保获得正确的阳性转化子(pET22-b-Bsu/BL21转化子)。

进一步为确保重组载体转化进入BL21(DE3)宿主中，通过验证引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行菌落PCR验证。并将PCR产物进行琼脂糖核酸电泳，条带大小与理论一致则视为验证成功，反之视为转化失败，结果如图2，图中挑选的12个转化子，均能扩增出目的条带，表明均获得了阳性克隆子。

将验证成功的转化子单菌落转接至Kan抗性LB培养基中，送至测序，进一步确认连接转化成功，并确认目标表达基因未异常突变。

实施案例2：Bsu DNA聚合酶定突变

通过SWISS-MODEL三维建模与数据模拟分析，设计针对D41E位点设计SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10，通过反向PCR以上述构建Bsu重组质粒为模板获得突变载体d；将片段d通过重组连接转化BL21感受态细胞，涂布在带有50μg/ml的固体LB平板中，筛选出转化子单菌落，再用验证引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行菌落PCR验证，挑取多个验证成功菌株进行测序验证。

对上述测序验证成功的菌株，转接至3ml含Kan抗性的LB液体培养基中培8h，所获得的菌液取1ml通过离心获得菌体，参考南京巨匠生物科技有限公司ATGPure^TMPlasmidMini Kit提取D41E突变点质粒。

对V194位点设计SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，以D41E突变体质粒为模板克隆得到片段e，胶回收之后获取得到高纯度的DNA片段，通过如上述实施案例中的重组连接方式获得重组载体，转化至BL21感受态中，涂布Kan抗性LB平板获取阳性克隆子菌株；用验证引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行菌落PCR验证，挑取多个验证成功菌株进行测序验证。

实施案例3：Bsu DNA聚合酶的表达纯化

将上述构建成功的两位点突变体菌株进行诱导表达，纯化。具体操作如下：取30μl菌液转接至5ml含50μl/ml卡那霉素液体LB培养基于37℃摇床培养过夜；从过夜培养的菌液中取10ml转接含50μl/ml卡那霉素100ml液体LB培养基中培养至OD600＝1-2时转接至500ml发酵培养基中培养至OD600＝0.4-1.2然后加入终浓度为0.1-1mM IPTG诱导剂，继续在16℃-37℃培养12-20h。

将发酵诱导之后的菌体用Buffer：50mM Tris-HCl、300-500mNaCl、5％-10％甘油、PH＝7.0-8.5重悬于700bar条件下破碎30min。

将所获得的粗酶液过滤之后，加入1mol/L～8mol/L硫酸铵沉淀，通过硫盐析沉淀目的蛋白质，使粗酶样品得到初步纯化，此步骤操作过程中应保持低温的环境。

盐析时间控制在30min-60min，通过盐析之后可以获得大量的蛋白，可除去细胞破碎之后的其他杂质蛋白。

通过盐析沉淀之后，在10000-13000rpm条件下离心1小时，收集含有目标蛋白的盐析产物。

将含有目标蛋白酶液产物通过Ni离子亲和柱纯化与阴阳离子柱纯化，获得高纯度的Bsu DNA聚合酶。

将上样之后的Bsu蛋白，在Buffer：50mM Tris-HCl、300-500mNaCl、5％-10％甘油、10mM咪唑PH＝7.0-8.5冲洗，冲洗5-10倍柱体积冲出未结合的杂蛋白，再用200mM-500mM的高浓度咪唑洗脱目的蛋白。

在洗脱目的蛋白质后进行脱盐纯化，用脱盐Buffer洗脱目的蛋白，具体地脱盐Buffer为20-50mM Tris-HCl、0.1-1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、0.2-1mM DTT(二硫苏糖醇)、PH＝7.5。在使用过程中加入10％-50％的甘油，于-20℃保存。纯化得到的Bsu DNA聚合酶突变体纯度可达到97％以上。

纯化出来的目标蛋白在8％浓度的SDS-PAGE的电泳结果如图3(图3中分别左侧分别为1μg、2μg和5μg的BSA，右侧分别为1μg、2μg和5μg的目标蛋白)。

特别说明Bsu蛋白的纯化过程包括以上步骤，但不仅限于以上步骤，本发明团队在多方面处理过程中有进一步的优化。

实施案例4突变体Bsu在重组酶恒温扩增中的应用

通过上述技术以及方法获得Bsu DNA聚合酶原酶液，将其配置成MIX反应液，按如下配方配置反应体系：

按上述方法配置，在37℃下条件下恒温反应30min，将反应之后的样品跑1％的琼脂糖凝胶电泳，其结果如图4，按照上述方法分别对野生型Bsu DNA聚合酶、D41E和V194A进行实验，结果如图4所示。

图4中，野生型是指，由序列SEQ ID NO.1表达的Bsu DNA聚合酶；D41E是指，较野生型相比，Bsu DNA聚合酶的第41位Aps突变为Glu；V194A是指，较野生型相比，Bsu DNA聚合酶的第194位Val突变为Ala；D41E/V194A是指本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体。从图4的结果中可以看出，本发明提供的Bsu DNA聚合酶突变体能够实现恒温扩增。并且组合突变体D41E/V194A相较野生型以及单点突变体D41E、V194A扩增产量更高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京巨匠生物科技有限公司

<120> 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3345

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcttttg ttcatttaca agtccactcc ggttattcat tgcttaattc ggctgccgca 60

gtagaagagc tcgtgagtga agcggatcgt ctaggctacg ctagcctggc cttaactgac 120

gatcatgtta tgtatggagc aattcagttc tacaaagcgt gtaaggctcg cgggatcaac 180

cctataattg gtttgaccgc ctctgtcttt acagacgatt ccgagcttga agcatatccc 240

ctcgtactac tggcgaaatc aaatacgggc taccaaaact tattgaagat ctcgagtgtg 300

cttcagagca aatctaaggg agggctcaaa ccaaagtggc tacactccta tcgagagggt 360

ataattgcta tcactccggg cgaaaaagga tacatagaga ccctgttaga agggggtttg 420

ttcgagcaag ccgcacaggc gtcacttgaa tttcaatcga ttttcggcaa gggagctttt 480

tatttcagtt accagccttt taaagggaat caagttctca gcgagcagat cctaaagctg 540

tctgaagaga caggtatacc cgtcacggcc actggcgacg tacattatat tcggaaagaa 600

gataaggcag cgtacagatg cttaaaagct atcaaggccg gagagaaatt gaccgacgca 660

ccagcggaag atcttccgga cctcgatcta aagcctctgg aggaaatgca aaacatatat 720

agggagcacc ccgaagcttt acaggcctcc gtggagattg cagaacaatg tcgtgttgac 780

gtctcattgg ggcagacacg ccttccatcg ttcccgacgc ctgatggtac tagtgcggac 840

gattacctca ccgacatctg catggagggc ctacgaagcc ggtttggaaa acccgatgaa 900

agatatctga ggcgtttaca atacgagttg gacgtaataa agcgcatgaa attctctgat 960

tattttctta ttgtgtggga cttcatgaag catgctcacg aaaaagggat cgttacaggt 1020

ccaggccgag gatccgccgc agggtcactc gtcgcgtacg tactatatat aacggatgtg 1080

gacccgatta agcatcacct gttatttgag cggttcttga atcctgaaag agtttcgatg 1140

cccgatatcg acatagattt tccagacact aggcgtgatg aggtcattca gtacgtacaa 1200

cagaaatatg gtgctatgca tgtggcccaa atcataacct tcggcacact tgcagcgaag 1260

gctgccctcc gcgacgttgg acgagtcttt ggggtaagtc cgaaagaagc agatcagcta 1320

gcgaagctga ttcctagccg gcccggtatg acgttagacg aggctagaca acagtctcca 1380

caattggata aaaggcttcg tgaatcctca ctcctacagc aagtgtactc gatcgcccgc 1440

aagatagagg gcctgccgcg acacgcaagt actcatgcgg ctggagttgt cttaagcgaa 1500

gagcctttga ccgacgtagt gccccttcag gaagggcacg agggtattta tctcacacaa 1560

tacgccatgg atcatctaga agacctgggc ttattgaaaa tggatttcct tggactccgg 1620

aacctaacgc tgatcgagtc tataacttcc atgattgaaa aggaggaaaa tatcaaaata 1680

gacttatcat cgattagtta tagcgatgac aagacctttt ctttgctttc caaaggggat 1740

acaacgggta tcttccagct cgagtcagca ggcatgagat cggttctaaa gaggctgaaa 1800

ccaagtggat tagaagacat agtcgcggta aacgctttgt accgtccggg gcctatggag 1860

aatattcccc tttttatcga tcgcaagcac ggtcgagccc cagtgcatta tccgcacgaa 1920

gacctccgga gcatactaga ggatacttac ggcgttattg tctatcaaga acagatcatg 1980

atgatagcat ctagaatggc gggattctcc ctgggggagg ctgacttatt gaggcgtgcc 2040

gtatcaaaaa agaaaaagga aattcttgat cgcgagcgat cgcattttgt ggaaggttgt 2100

ctcaaaaagg agtacagtgt tgacaccgca aacgaagtct atgatctaat cgtaaaattc 2160

gcgaattacg gctttaaccg gagccacgct gtggcctatt ctatgatagg atgccaactg 2220

gcatacttaa aggcgcatta tcctttgtac ttcatgtgtg ggcttctcac atccgttatt 2280

ggtaatgagg acaaaatctc acagtatcta tacgaagcta agggctcggg aataagaatt 2340

ctgcccccaa gtgtcaacaa aagctctttt ccgttcacgg tagagaatgg gtccgtgagg 2400

tattcattac gtgccatcaa gtcggttggt gtcagtgcag taaaagatat atacaaggcg 2460

cgcaaagaaa agccttttga ggacttgttc gatttttgct tccgagtgcc cagcaaatct 2520

gttaaccgga agatgcttga agctctcatt ttttccggcg ccatggacga gttcggacaa 2580

aatagagcaa ctctactggc gtcaatcgat gtcgctttag aacacgccga gttgtttgca 2640

gcggacgatg accagatggg gcttttcctc gatgaatcgt ttagtataaa accaaagtat 2700

gtagagaccg aagagctacc gctggtggac ttattggctt tcgaaaaaga gacacttggt 2760

atttacttta gcaaccatcc tctctctgcc ttcaggaagc aactaacggc acagggcgcg 2820

gttagcatcc tgcaagctca gcgtgccgtc aaacgccaat tatcattggg agtacttctc 2880

tcgaagataa aaactattcg aaccaagaca gggcagaata tggcatttct aacgctgagt 2940

gatgaaactg gtgagatgga agcggtggtt ttccccgagc aatttcggca gttaagccca 3000

gtcttgagag aaggcgctct tctcttcacc gccggaaaat gtgaggtaag gcaagacaag 3060

atccagttta taatgtctcg tgcagaacta ctggagaaca tggatgcgga aaaagctccg 3120

tccgtgtata ttaagatcga gtcatcgcaa cacagtcagg aaatattagc caaaattaag 3180

cgcatcttgc ttgagcataa aggggaaaca ggtgtttacc tctattacga gcgacaaaag 3240

cagacgataa aactacctga aagcttccac attaatgcag accatcaagt cctgtatcgg 3300

ttaaaggagt tgcttggcca gaaaaacgta gtgctcaagc aatgg 3345

<210> 2

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggcagca gccatcatca tcatcaccat catcacagca gcggctcgga ctcagaagtc 60

aatcaagaag ctaagccaga ggtcaagcca gaagtcaagc ctgagactca catcaattta 120

aaggtgtccg atggatcttc agagatcttc ttcaagatca aaaagaccac tcctttacgt 180

cgtctgatgg aagcgttcgc taaacgtcag ggtaaggaaa tggactcctt acgcttcttg 240

tacgacggta ttcgtattca agctgatcag acccctgaag atttggacat ggaggataac 300

gatattattg aggctcaccg cgaacagatt ggtggtgcta cgtatcat 348

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtggtgcta cgtatcatat gtcttttgtt catttacaag tccactccgg t 51

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgcggccgc aagcttccat tgcttgagca ctacgttt 38

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgagcggata acaattcccc atgggcagca gccatcatca tc 42

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgatacgta gcaccaccaa tctgtt 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taatacgact cactataggg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgctagttat tgctcagcgg 20

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctggcctt aactgaagat catgttatgt a 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tacataacat gatcttcagt taaggccagg c 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

actggcgacg cacattatat tcggaaagaa g 31

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaatataatg tgcgtcgcca gtggccgt 28

<210> 13

<211> 1115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Ser Phe Val His Leu Gln Val His Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Asn

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Val Glu Glu Leu Val Ser Glu Ala Asp Arg Leu Gly

20 25 30

Tyr Ala Ser Leu Ala Leu Thr Asp Asp His Val Met Tyr Gly Ala Ile

35 40 45

Gln Phe Tyr Lys Ala Cys Lys Ala Arg Gly Ile Asn Pro Ile Ile Gly

50 55 60

Leu Thr Ala Ser Val Phe Thr Asp Asp Ser Glu Leu Glu Ala Tyr Pro

65 70 75 80

Leu Val Leu Leu Ala Lys Ser Asn Thr Gly Tyr Gln Asn Leu Leu Lys

85 90 95

Ile Ser Ser Val Leu Gln Ser Lys Ser Lys Gly Gly Leu Lys Pro Lys

100 105 110

Trp Leu His Ser Tyr Arg Glu Gly Ile Ile Ala Ile Thr Pro Gly Glu

115 120 125

Lys Gly Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Glu Gly Gly Leu Phe Glu Gln Ala

130 135 140

Ala Gln Ala Ser Leu Glu Phe Gln Ser Ile Phe Gly Lys Gly Ala Phe

145 150 155 160

Tyr Phe Ser Tyr Gln Pro Phe Lys Gly Asn Gln Val Leu Ser Glu Gln

165 170 175

Ile Leu Lys Leu Ser Glu Glu Thr Gly Ile Pro Val Thr Ala Thr Gly

180 185 190

Asp Val His Tyr Ile Arg Lys Glu Asp Lys Ala Ala Tyr Arg Cys Leu

195 200 205

Lys Ala Ile Lys Ala Gly Glu Lys Leu Thr Asp Ala Pro Ala Glu Asp

210 215 220

Leu Pro Asp Leu Asp Leu Lys Pro Leu Glu Glu Met Gln Asn Ile Tyr

225 230 235 240

Arg Glu His Pro Glu Ala Leu Gln Ala Ser Val Glu Ile Ala Glu Gln

245 250 255

Cys Arg Val Asp Val Ser Leu Gly Gln Thr Arg Leu Pro Ser Phe Pro

260 265 270

Thr Pro Asp Gly Thr Ser Ala Asp Asp Tyr Leu Thr Asp Ile Cys Met

275 280 285

Glu Gly Leu Arg Ser Arg Phe Gly Lys Pro Asp Glu Arg Tyr Leu Arg

290 295 300

Arg Leu Gln Tyr Glu Leu Asp Val Ile Lys Arg Met Lys Phe Ser Asp

305 310 315 320

Tyr Phe Leu Ile Val Trp Asp Phe Met Lys His Ala His Glu Lys Gly

325 330 335

Ile Val Thr Gly Pro Gly Arg Gly Ser Ala Ala Gly Ser Leu Val Ala

340 345 350

Tyr Val Leu Tyr Ile Thr Asp Val Asp Pro Ile Lys His His Leu Leu

355 360 365

Phe Glu Arg Phe Leu Asn Pro Glu Arg Val Ser Met Pro Asp Ile Asp

370 375 380

Ile Asp Phe Pro Asp Thr Arg Arg Asp Glu Val Ile Gln Tyr Val Gln

385 390 395 400

Gln Lys Tyr Gly Ala Met His Val Ala Gln Ile Ile Thr Phe Gly Thr

405 410 415

Leu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Arg Asp Val Gly Arg Val Phe Gly Val

420 425 430

Ser Pro Lys Glu Ala Asp Gln Leu Ala Lys Leu Ile Pro Ser Arg Pro

435 440 445

Gly Met Thr Leu Asp Glu Ala Arg Gln Gln Ser Pro Gln Leu Asp Lys

450 455 460

Arg Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Gln Gln Val Tyr Ser Ile Ala Arg

465 470 475 480

Lys Ile Glu Gly Leu Pro Arg His Ala Ser Thr His Ala Ala Gly Val

485 490 495

Val Leu Ser Glu Glu Pro Leu Thr Asp Val Val Pro Leu Gln Glu Gly

500 505 510

Pro Glu Gly Ile Tyr Leu Thr Gln Tyr Ala Met Asp His Leu Glu Asp

515 520 525

Leu Gly Leu Leu Lys Met Asp Phe Leu Gly Leu Arg Asn Leu Thr Leu

530 535 540

Ile Glu Ser Ile Thr Ser Met Ile Glu Lys Glu Glu Asn Ile Lys Ile

545 550 555 560

Asp Leu Ser Ser Ile Ser Tyr Ser Asp Asp Lys Thr Phe Ser Leu Leu

565 570 575

Ser Lys Gly Asp Thr Thr Gly Ile Phe Gln Leu Glu Ser Ala Gly Met

580 585 590

Arg Ser Val Leu Lys Arg Leu Lys Pro Ser Gly Leu Glu Asp Ile Val

595 600 605

Ala Val Asn Ala Leu Tyr Arg Pro Gly Pro Met Glu Asn Ile Pro Leu

610 615 620

Phe Ile Asp Arg Lys His Gly Arg Ala Pro Val His Tyr Pro His Glu

625 630 635 640

Asp Leu Arg Ser Ile Leu Glu Asp Thr Tyr Gly Val Ile Val Tyr Gln

645 650 655

Glu Gln Ile Met Met Ile Ala Ser Arg Met Ala Gly Phe Ser Leu Gly

660 665 670

Glu Ala Asp Leu Leu Arg Arg Ala Val Ser Lys Lys Lys Lys Glu Ile

675 680 685

Leu Asp Arg Glu Arg Ser His Phe Val Glu Gly Cys Leu Lys Lys Glu

690 695 700

Tyr Ser Val Asp Thr Ala Asn Glu Val Tyr Asp Leu Ile Val Lys Phe

705 710 715 720

Ala Asn Tyr Gly Phe Asn Arg Ser His Ala Val Ala Tyr Ser Met Ile

725 730 735

Gly Cys Gln Leu Ala Tyr Leu Lys Ala His Tyr Pro Leu Tyr Phe Met

740 745 750

Cys Gly Leu Leu Thr Ser Val Ile Gly Asn Glu Asp Lys Ile Ser Gln

755 760 765

Tyr Leu Tyr Glu Ala Lys Gly Ser Gly Ile Arg Ile Leu Pro Pro Ser

770 775 780

Val Asn Lys Ser Ser Phe Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Ser Val Arg

785 790 795 800

Tyr Ser Leu Arg Ala Ile Lys Ser Val Gly Val Ser Ala Val Lys Asp

805 810 815

Ile Tyr Lys Ala Arg Lys Glu Lys Pro Phe Glu Asp Leu Phe Asp Phe

820 825 830

Cys Phe Arg Val Pro Ser Lys Ser Val Asn Arg Lys Met Leu Glu Ala

835 840 845

Leu Ile Phe Ser Gly Ala Met Asp Glu Phe Gly Gln Asn Arg Ala Thr

850 855 860

Leu Leu Ala Ser Ile Asp Val Ala Leu Glu His Ala Glu Leu Phe Ala

865 870 875 880

Ala Asp Asp Asp Gln Met Gly Leu Phe Leu Asp Glu Ser Phe Ser Ile

885 890 895

Lys Pro Lys Tyr Val Glu Thr Glu Glu Leu Pro Leu Val Asp Leu Leu

900 905 910

Ala Phe Glu Lys Glu Thr Leu Gly Ile Tyr Phe Ser Asn His Pro Leu

915 920 925

Ser Ala Phe Arg Lys Gln Leu Thr Ala Gln Gly Ala Val Ser Ile Leu

930 935 940

Gln Ala Gln Arg Ala Val Lys Arg Gln Leu Ser Leu Gly Val Leu Leu

945 950 955 960

Ser Lys Ile Lys Thr Ile Arg Thr Lys Thr Gly Gln Asn Met Ala Phe

965 970 975

Leu Thr Leu Ser Asp Glu Thr Gly Glu Met Glu Ala Val Val Phe Pro

980 985 990

Glu Gln Phe Arg Gln Leu Ser Pro Val Leu Arg Glu Gly Ala Leu Leu

995 1000 1005

Phe Thr Ala Gly Lys Cys Glu Val Arg Gln Asp Lys Ile Gln Phe

1010 1015 1020

Ile Met Ser Arg Ala Glu Leu Leu Glu Asn Met Asp Ala Glu Lys

1025 1030 1035

Ala Pro Ser Val Tyr Ile Lys Ile Glu Ser Ser Gln His Ser Gln

1040 1045 1050

Glu Ile Leu Ala Lys Ile Lys Arg Ile Leu Leu Glu His Lys Gly

1055 1060 1065

Glu Thr Gly Val Tyr Leu Tyr Tyr Glu Arg Gln Lys Gln Thr Ile

1070 1075 1080

Lys Leu Pro Glu Ser Phe His Ile Asn Ala Asp His Gln Val Leu

1085 1090 1095

Tyr Arg Leu Lys Glu Leu Leu Gly Gln Lys Asn Val Val Leu Lys

1100 1105 1110

Gln Trp

1115

Claims (10)

1.一种融合Bsu DNA聚合酶，其特征在于，所述融合Bsu DNA聚合酶含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段；所述Bsu DNA聚合酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；表达所述蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的融合Bsu DNA聚合酶，其特征在于，表达所述Bsu DNA聚合酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.编码权利要求1或2所述的融合Bsu DNA聚合酶的基因。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括载体和权利要求3所述的基因；

所述载体包括pET-22b。

5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求4所述的重组质粒；

所述基因工程菌包括大肠杆菌。

6.一种Bsu DNA聚合酶突变体，其特征在于，将权利要求1或2所述的融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala。

7.编码权利要求6所述的Bsu DNA聚合酶突变体的基因。

8.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括载体和权利要求7所述的基因；

所述载体包括pET-22b。

9.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求8所述的重组质粒；

所述基因工程菌包括大肠杆菌。

10.权利要求1或2所述的融合Bsu DNA聚合酶或者权利要求6所述的Bsu DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

Images