CN114230644A

CN114230644A - 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114230644A
Application number: CN202111640735.7A
Authority: CN
Inventors: 刁含文
Original assignee: Nanjing Jujiang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Jujiang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-03-25

Abstract

本发明公开了一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，本发明构建了一种GP32蛋白突变体，相对于其他GP32蛋白而言，该突变体结合单链DNA的效率更高，可更有效地促进限制性内切酶的水解效果、提高RT‑PCR中反转录的效率、增强T4DNA聚合酶的活性以及提高PCR的产量，在RPA中应用效率极佳。此外，本发明提供的载体的构建，克服了现有工业化生产中GP32蛋白菌体表达量较低、纯度不高的技术问题，实现了表达载体在宿主细胞中的高表达，提高了GP32蛋白的得率，为GP32蛋白的研究、应用提供了途径。

Description

一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用。

背景技术

单链结合蛋白(SSB，single strand DNA-binding protein)：又称DNA结合蛋白，是DNA复制所必须的。单链结合蛋白不属于酶，大肠杆菌细胞中的单链结合蛋白由4个相同的亚基组成，相对分子质量为74000，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位；DNA解旋后，DNA分子只要碱基配对，就有结合成双链的趋向。SSB结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。ssb作用时表现协同效应，保证SSB在下游区段的继续结合。它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动，而是不停的结合，脱离。在实际应用中，gp32单链结合蛋白提升限制性内切酶的水解效果、增强T4DNA聚合酶的活性和提高PCR的产量、提高RT-PCR中反转录的效率。来自大肠杆菌的单链结合蛋白已用于体外RNA/单链结合蛋白(SSB)复合物形成试验以及蛋白质纯化，用于测定整合子attC位点的完整性和功能性。对单链DNA的高特异性结合。可用于提高PCR的特异性，启动有问题的DNA模板测序。

随着RPA技术的推广，目前T4GP32在使用中的结合效率成为了关注点，现有的GP32单链结合蛋白虽然具备结合活性，但是结合效率不高，且工业化生产中GP32单链结合蛋白单位菌体的表达量较低，纯度不够高，这也使得其在RPA中的使用效果相对较差。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GP32蛋白突变体及其应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种GP32蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

第二方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其包括编码如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的核酸序列。

第三方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的分离的核酸。

第四方面，本发明实施例提供了一种重组载体的构建方法，其包括：将所述分离的核酸或其表达盒插入载体中构建获得。

第五方面，本发明实施例提供了一种基因工程菌，其含有如前述实施例所述的重组载体。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的制备方法，其包括培养如前述实施例所述的基因工程菌，以诱导表达GP32蛋白突变体。

第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的GP32蛋白突变体在核酸扩增中的应用，所述核酸扩增不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

本发明具有以下有益效果：

本发明构建了一种GP32蛋白突变体，相对于其他GP32蛋白而言，该突变体结合单链DNA的效率更高，可更有效地促进限制性内切酶的水解效果、提高RT-PCR中反转录的效率、增强T4 DNA聚合酶的活性以及提高PCR的产量，在RPA中应用效率极佳。

此外，本发明还提供了GP32蛋白突变体的表达载体的构建以及蛋白的纯化，克服了现有工业化生产中GP32蛋白菌体表达量较低、纯度不高的技术问题，实现了表达载体在宿主细胞中的高表达，提高了GP32蛋白的得率，为GP32蛋白的研究、应用提供了途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为GP32单链结合功能的区域第27～241位氨基酸对应的三维结构；

图2为GP32蛋白突变体的纯化质控结果；

图3为GP32蛋白突变体在普通PCR中的应用效果；

图4为GP32蛋白突变体在qPCR中的应用效果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种GP32蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示：

MFKRKSTADLAAQMAKLNGNKGFSSEDKGEWKLKLDASGNGQAVIRFLPAKTDDALPFAILVNHGFKKNGKWYIETCSSTHGDYDSCPVCQYISKNDLYNTNNEGKVFKYRFGKKIWDKINAMIAVDTEMGETPVDVTCPWEGANFVLKVKQVSGFSNYDESKFLNQSAIPNIDDESFQKELFEQMVDLSEMTSKDKFKSFEELNTKFNQVLGTAALGGAAAAAASVADKVASDLDDFDKDMEAFS。

野生型的氨基酸序列为：MFKRKSTADLAAQMAKLNGNKGFSSEDKGEWKLKLDASGNGQAVIRFLPAKTDDALPFAILVNHGFKKNGKWYIETCSSTHGDYDSCPVCQYISKNDLYNTNNEGKVFKYRFGKKIWDKINAMIAVDTEMGETPVDVTCPWEGANFVLKVKQVSGFSNYDESKFLNQSAIPNIDDESFQKELFEQMVDLSEMTSKDKFKSFEELNTKFNQVLGTAALGGAAAAAASVADKVASDLDDFDKDMEAFSSAKTEDDFMSSSSSDDGDLDDLLAGL。

本发明通过一系列创造性劳动，分析对比了不同来源的GP32结构上的差异性，结合蛋白的三维结构分析，进行了GP32原始序列C端氨基酸序列(247～272)段的敲除，从而获得了有着高效ssDNA结合效率的GP32蛋白突变体。该突变体的单链结合功能区域为27～241段，三维结构见图1。

本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其包括编码如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的核酸序列。

优选地，其序列如SEQ ID No.2所示(5’-3’)：

atgtttaaacgtaagtctactgctgatttagccgcacaaatggcgaaattgaatggtaacaagggcttctcctcagaagacaaaggagagtggaagcttaaactcgatgcttcggggaatggtcaggccgttattcgctttctacctgcaaagaccgacgatgcgctgcccttcgctatcttagtcaaccatggctttaaaaagaatggaaaatggtatatagaaacatgtagtagcacgcacggggactacgattcttgcccagtatgtcaatatatttccaagaacgacttgtacaatactaacaatgagggtaaagtgttcaagtatcgatttggcaaaaagatctgggataaaataaacgccatgattgcagttgacaccgaaatgggagagacaccggtcgatgtaacgtgcccttgggaaggggcgaatttcgtgcttaaggttaaacaggtctcaggtttttcgaactacgacgagagtaagttcctcaatcaaagcgctatccccaacatagatgacgaatcttttcagaaagagctattcgaacaaatggtagatctgtccgagatgacttcaaaggacaaatttaagtcgttcgaagagttaaataccaaatttaaccaggtgttgggcacagccgcacttggaggggcggctgccgcagcggctagtgttgccgataaggtcgcaagcgacctcgatgacttcgataaagacatggaagcgttttcttccgctaagacggaggatgacttcatgtcatcgagtagctctgatgacggtgatctagacgatctgttagccggcttg。

本发明实施例还提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的分离的核酸。

优选地，所述重组载体是以pET系列为框架基础构建获得的。优选地，所述pET系列包括pET22-b质粒和pET32-a质粒中的任意一种。

本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的重组载体的构建方法，其包括：将所述分离的核酸或其表达盒插入载体中构建获得。

优选地，将所述分离的核酸或其表达盒插入载体的步骤包括：对所述载体进行线性化处理，获得线性化载体；

将线性化载体与所述分离的核酸或其表达盒进行重组，获得重组载体。

优选地，将线性化载体与所述分离的核酸进行重组的步骤包括：对所述载体进行线性化处理，获得线性化载体；采用引物对，以如前述实施例所述的GP32蛋白突变体基因为模板进行扩增；将线性化载体与扩增后的产物混合重组，获得重组载体。

优选地，所述引物对的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示。

优选地，所述载体选自质粒、噬菌体和病毒载体中的任意一种。

优选地，所述质粒为pET22-b质粒，所述线性化载体为将pET22-b质粒进行XhoI和XbaI双酶切后的产物。

本发明实施例还提供了一种基因工程菌，其含有如前述实施例所述的重组载体。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的制备方法，其包括培养如前述实施例所述的基因工程菌，以诱导表达GP32蛋白突变体。

优选地，所述培养的步骤包括：将所述基因工程菌接种于含抗生素的第一培养基中过夜培养；

将过夜培养后的产物再接种于第二培养基中，培养至OD600至0.2～0.8时，添加IPTG诱导剂，继续培养后进行菌体沉淀；

将所述菌体沉淀的产物破壁后离心收集上清液，经Ni离子亲和层析柱和阳离子柱纯化后，获得GP32蛋白突变体。

优选地，所述抗生素为卡那霉素，所述卡那霉素在所述第一培养基中的作用浓度优选为40～60μg/ml，具体可以为40μg/ml、42μg/ml、44μg/ml、46μg/ml、48μg/ml、50μg/ml、52μg/ml、54μg/ml、56μg/ml、58μg/ml和60μg/ml中的任意一项或任意两项之间的范围，优选为50μg/ml。

优选地，所述第一培养基和所述第二培养基可以包括但不限于LB培养基。

优选地，所述菌体在第一培养基和/或所述第二培养基中的接种量为1％～2％。

优选地，在所述第一培养基和/或所述第二培养基中的培养温度为30～45℃，具体可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃和45℃中的任意一项或任意两项之间的范围，更优选为37℃。

优选地，菌体沉淀后，所述制备方法还包括：采用A液对菌体进行重悬，重悬后再进行所述破壁。

优选地，所述A液的组分包括：终浓度为20～50mM Tris-HCl、终浓度为100～800mMNaCl、终浓度为0.1～0.5mM DTT以及终浓度为0.1mM-2mM EDTA，PH＝7.8。

优选地，所述破壁的条件为：600～750bar，可循环破壁2～3次。

优选地，所述蛋白沉淀的步骤包括：在破壁后离心收集上清，然后在上清液的中添加硫酸铵(作用浓度为0.2mol/L～5mol/L)盐析将蛋白质沉积，离心后收集蛋白沉淀。

优选地，所述培养的步骤还包括将收集的蛋白沉淀用B液进行冲洗，然后经0.1～0.5μm的滤膜过滤后用于Ni离子亲和层析柱纯化。

优选地，所述B液的组分包括：终浓度为20～50mM Tris-HCl、终浓度为100～800mMNaCl、终浓度为0.1～0.5mM DTT以及体积分数为0.3％～0.7％曲拉通X-100，PH＝7.8。

优选地，所述培养的步骤还包括在蛋白沉淀或经过滤后的产物中添加咪唑(作用浓度为5～15mM)后，经Ni粒子亲和柱层析纯化。

优选地，Ni离子亲和柱层析纯化的步骤包括：对柱体进行冲洗，然后将添加有咪唑的蛋白产物加入Ni柱中，通过100～500mM咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白。

优选地，将Ni离子亲和柱层析纯化后的产物经阳离子柱进行进一步的纯化，洗脱液可采用500mM～2M NaCl进行梯度洗脱。

优选地，所述方法还包括将经Ni离子亲和层析柱和阳离子柱纯化后的产物浓缩至一定浓度，具体可以为0.5～2mg/ml。

本发明实施例还提供了如前述实施例所述的GP32蛋白突变体在核酸扩增中的应用，所述核酸扩增不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

优选地，所述核酸扩增包括PCR扩增、逆转录反应、RT-PCR扩增、荧光定量扩增、重组酶聚合酶介导的等温扩增RPA中的任意一种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种GP32蛋白突变体及其高效表达以及纯化方法。

(1)获得GP32蛋白突变体。

采用引物对1，以pMD-18-GP32(质粒中的GP32的序列如SEQ ID No.2所示)为模板，进行PCR扩增，获得GP32蛋白突变体，PCR反应体系如表1所示。

引物对1的序列具体如下：

上游引物F：5’-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTAT-3’(SEQ ID No.3)；

下游引物R：5’-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCC-3’(SEQ ID No.4)。

表1

体系	使用量
		模板DNA	2μl
2×ATG proofast MIX	25μl
		引物F	1.5μl
引物R	1.5μl
		ddH<sub>2</sub>O	补齐至50μl

反应程序：预变性95℃5min、变性95℃15s、退火58℃15s、延伸72℃20s、循环30、在延伸72℃5min。

将上述所获得的PCR产物进行琼脂糖核酸电泳，参考《分子实验操作手册》。

(2)构建表达载体

对pET22-b质粒通过XhoI和XbaI进行酶切，酶切反应体系如表2所示。

表2酶切反应体系

试剂	50μl体系/μl
		质粒DNA	25μl
Xho I	2.5μl
		Xba I	2.5μl
10×Green Buffer	5μl
		dd H<sub>2</sub>O	To 50μl

将上述所得的酶切产物跑琼脂糖核酸电泳，切取正确的条带用南京巨匠生物科技有限公司ATGPure^TMPCR product purification kit试剂盒回收获得线性化载体DNA片段。

将上述所获得的GP32蛋白突变体的DNA片段与线性化载体DNA片段按照表3所述的体系进行重组反应，获得重组连接产物作为表达载体。

表3反应体系

ddH<sub>2</sub>O	Up to 20μl
		5×UFO Buffer	4μl
线性化载体	50-200ng
		扩增片段	20-200ng
UvsXase	2μl

(3)高表达菌株的筛选

转化菌株和阳性克隆转化子的筛选：

将重组反应所获得的重组连接产物取10μl转化至100μl BL21(Rosseta)感受态中，置于冰上冷击30min，然后42℃热击45s，再置于冰上冷击5min，加入890μl LB培养基之后置于37℃、200rpm摇床孵育1h。4000rpm离心1min收集菌体，留100μl上清重悬之后涂布到Kan抗性的平板中，筛选出阳性克隆子。通过T7引物与T7terminator引物进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆转接测序。

工程菌的发酵培养：

将测序验证正确的GP32突变体菌株转接至含50μg/ml Kan抗性的3ml LB培养基过夜培养获得一级种子，再按1％的接种量转接至50ml LB培养基中获得二级种子，再转接5ml二级种子至500ml LB培养基中与37℃继续2-4h至OD600＝0.2-0.8时加入0.1-1mM IPTG诱导剂诱导GP32突变体的表达。

蛋白纯化：

将诱导发酵之后的菌液离心收集，称量菌泥重量，按1：5～1:10的稀释比用BufferA(20-50mM Tris-HCl、100-800mM NaCl、0.1-0.5mM DTT、0.1mM-2mM EDTA、PH＝7.8)重悬菌体，将菌体充分混匀之后通过高压均值匀浆机破碎细胞，破碎条件为600-750bar、循环破碎三次。离心收集上清、过膜除杂；

将所获得的沉淀用Buffer B(20-50mM Tris-HCl、100-800mM NaCl、0.1-0.5mMDTT、0.5％曲拉通X-100、PH＝7.8)冲洗，再用0.2μm的滤膜过滤，获得粗蛋白液；

向所得到的粗蛋白液中加入10mM咪唑通过Ni离子亲和层析纯化以获得目的蛋白，具体先通过Buffer B冲洗柱材料，再讲已加入咪唑的粗蛋白液流加到Ni柱当中，利用HIS-Tag标签的亲和性与Ni离子结合。通过100mM-500mM咪唑洗脱杂蛋白与目的蛋白；

进一步为得到高纯度的目的蛋白将所得的原酶液再通过阳离子柱进行纯化除杂，所采用的条件为500mM-2M NaCl梯度洗脱；

将所获得的洗脱液进行10Kda过膜浓缩至1mg/ml，获得GP32蛋白突变体。

取浓缩后的原液(GP32蛋白突变体)20μl进行SDS-PAGE实验分析，具体步骤包括：取20μl待测样品加入5μl 5×Loading Buffer，置于沸水中加热5min，制作8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，结果如图2，本发明所获得的GP32有较高的纯度超过97％。

实施例2

将实施例1中获得的高纯度的GP32蛋白突变体原液添加到常规PCR反应体系中进行测试，对应设置2组对照组，对照组1采用野生型GP32蛋白，对照组2未添加GP32蛋白。所采用的测试对象均为pUC19上的amp基因。测试反应体系如表4所示。

表4反应体系

反应条件为：孵育37℃10min，95℃3min、(95℃15s、58℃15s、72℃1min)×30循环、72℃5min。

结果如图3，相比于野生型GP32和未加GP32的对照组，添加突变体GP32的PCR产物的产量有较高的提升。

实施例3

将实施例1中获得的高纯度的GP32蛋白突变体原液加入到南京巨匠生物科技有限公司的ATGStart^TMPlus qPCR SYBR Green Master Mix中测试其效果，采用的是新冠病毒N基因作为测试对象，反应体系如表5所示。

表5反应体系

2×ATGStart<sup>TM</sup>Plus qPCR SYBR Green Master Mix	10μl
		引物F	0.5μl
引物R	0.5μl
		50×ROX Reference Dye1	0.4μl
N基因	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	To 20μl

其结果如图4所示，相对于GP32野生型而言，GP32蛋白突变体(C端切除)对于qPCR的质量有显著改善，即有较低的Ct值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京巨匠生物科技有限公司

<120> 一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Phe Lys Arg Lys Ser Thr Ala Asp Leu Ala Ala Gln Met Ala Lys

1 5 10 15

Leu Asn Gly Asn Lys Gly Phe Ser Ser Glu Asp Lys Gly Glu Trp Lys

20 25 30

Leu Lys Leu Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gln Ala Val Ile Arg Phe Leu

35 40 45

Pro Ala Lys Thr Asp Asp Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu Val Asn His

50 55 60

Gly Phe Lys Lys Asn Gly Lys Trp Tyr Ile Glu Thr Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Gly Asp Tyr Asp Ser Cys Pro Val Cys Gln Tyr Ile Ser Lys Asn

85 90 95

Asp Leu Tyr Asn Thr Asn Asn Glu Gly Lys Val Phe Lys Tyr Arg Phe

100 105 110

Gly Lys Lys Ile Trp Asp Lys Ile Asn Ala Met Ile Ala Val Asp Thr

115 120 125

Glu Met Gly Glu Thr Pro Val Asp Val Thr Cys Pro Trp Glu Gly Ala

130 135 140

Asn Phe Val Leu Lys Val Lys Gln Val Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Asp

145 150 155 160

Glu Ser Lys Phe Leu Asn Gln Ser Ala Ile Pro Asn Ile Asp Asp Glu

165 170 175

Ser Phe Gln Lys Glu Leu Phe Glu Gln Met Val Asp Leu Ser Glu Met

180 185 190

Thr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Ser Phe Glu Glu Leu Asn Thr Lys Phe

195 200 205

Asn Gln Val Leu Gly Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala

210 215 220

Ala Ser Val Ala Asp Lys Val Ala Ser Asp Leu Asp Asp Phe Asp Lys

225 230 235 240

Asp Met Glu Ala Phe Ser

245

<210> 2

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtttaaac gtaagtctac tgctgattta gccgcacaaa tggcgaaatt gaatggtaac 60

aagggcttct cctcagaaga caaaggagag tggaagctta aactcgatgc ttcggggaat 120

ggtcaggccg ttattcgctt tctacctgca aagaccgacg atgcgctgcc cttcgctatc 180

ttagtcaacc atggctttaa aaagaatgga aaatggtata tagaaacatg tagtagcacg 240

cacggggact acgattcttg cccagtatgt caatatattt ccaagaacga cttgtacaat 300

actaacaatg agggtaaagt gttcaagtat cgatttggca aaaagatctg ggataaaata 360

aacgccatga ttgcagttga caccgaaatg ggagagacac cggtcgatgt aacgtgccct 420

tgggaagggg cgaatttcgt gcttaaggtt aaacaggtct caggtttttc gaactacgac 480

gagagtaagt tcctcaatca aagcgctatc cccaacatag atgacgaatc ttttcagaaa 540

gagctattcg aacaaatggt agatctgtcc gagatgactt caaaggacaa atttaagtcg 600

ttcgaagagt taaataccaa atttaaccag gtgttgggca cagccgcact tggaggggcg 660

gctgccgcag cggctagtgt tgccgataag gtcgcaagcg acctcgatga cttcgataaa 720

gacatggaag cgttttcttc cgctaagacg gaggatgact tcatgtcatc gagtagctct 780

gatgacggtg atctagacga tctgttagcc ggcttg 816

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagtattc aacatttccg tgtcgccc 28

Claims

1.一种GP32蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种分离的核酸，其特征在于，其包括编码如权利要求1所述的GP32蛋白突变体的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求2或3所述的分离的核酸。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET系列为框架基础构建获得的；

优选地，所述pET系列包括pET22-b质粒和pET32-a质粒中的任意一种。

6.如权利要求4或5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，其包括：将所述分离的核酸或其表达盒插入载体中构建获得。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，将所述分离的核酸或其表达盒插入载体的步骤包括：对所述载体进行线性化处理，获得线性化载体；

将线性化载体与所述分离的核酸或其表达盒进行重组，获得重组载体；

优选地，将线性化载体与所述分离的核酸进行重组的步骤包括：采用引物对，以如权利要求1所述的GP32蛋白突变体基因为模板进行扩增；将线性化载体与扩增后的产物混合重组，获得重组载体；

优选地，所述引物对的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示；

优选地，所述载体选自质粒、噬菌体和病毒载体中的任意一种；

8.一种基因工程菌，其特征在于，其含有如权利要求4或5所述的重组载体。

9.如权利要求1所述的GP32蛋白突变体的制备方法，其特征在于，其包括培养如权利要求8所述的基因工程菌，以诱导表达GP32蛋白突变体；

将所述菌体沉淀的产物破壁后离心收集上清液，上清液经Ni离子亲和层析柱和阳离子柱纯化后，获得GP32蛋白突变体；

优选地，所述第一培养基和/或所述第二培养基为LB培养基；

优选地，所述抗生素为卡那霉素；

优选地，所述抗生素在所述第一培养基中的作用浓度为40～60μg/ml；

优选地，所述制备方法还包括：采用A液对所述菌体沉淀的产物进行重悬，重悬后再进行所述破壁，所述A液的组分包括：终浓度为20～50mM Tris-HCl、终浓度为100～800mMNaCl、终浓度为0.1～0.5mM DTT以及终浓度为0.1mM-2mM EDTA，PH＝7.2～8.2；

优选地，所述制备方法还包括对破壁后离心收集的上清液进行硫酸铵盐析，对盐析后产物进行离心，收集蛋白沉淀，用于Ni离子亲和层析柱和阳离子柱纯化；

优选地，所述方法还包括：采用B液对盐析离心后收集的沉淀冲洗后，再用于Ni离子亲和层析柱和阳离子柱纯化，所述B液的组分包括：终浓度为20～50mM Tris-HCl、终浓度为100～800mM NaCl、终浓度为0.1～0.5mM DTT以及体积分数为0.3％～0.7％曲拉通X-100，PH＝7.8；

优选地，所述制备方法还包括对经Ni离子亲和层析柱和阳离子柱纯化后的产物浓缩至0.5～2mg/ml，以获得最终的GP32蛋白突变体。

10.如权利要求1所述的GP32蛋白突变体在核酸扩增中的应用，所述核酸扩增不以疾病的诊断或治疗为直接目的。