CN117683741A - 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 - Google Patents

一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用。所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：A325、A454或S460中任意一种或至少两种的组合。本发明获得的Taq DNA聚合酶突变体比活力达到野生型Taq DNA聚合酶的2‑5倍，扩增速率提高2倍以上，在qPCR体系中，缩短qPCR程序中的延伸时间后，突变型Taq DNA聚合酶Taq‑Mut与野生型Taq DNA聚合酶的检测性能无显著差异，可显著缩短检测所需时长，提高qPCR的检测效率。

Description

一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用。
背景技术
DNA扩增是分子生物学和遗传学研究中重要的基础技术之一。PCR(Polymerasechain reaction)是一种基于DNA扩增原理的技术，已经在医学、农业、环境、食品安全等领域广泛应用。在PCR扩增循环中需要将温度升高至94-96℃的高温以实现双链DNA的变性。Taq DNA聚合酶是一种从Thermus aquaticus细菌中分离得到的热稳定聚合酶，由于其可以耐受高温，使得该酶被广泛应用于PCR技术。另外，Taq DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，适用于基于TaqMan探针法的荧光定量PCR反应，这使得该酶被广泛应用于定量PCR检测、突变检测及病原检测等领域。
虽然Taq DNA聚合酶非常有用，但需注意它还是有局限性的。例如，在每个PCR循环的早期步骤中需要高温以使DNA双链解离，这易导致Taq DNA聚合酶的失活或者活性下降；Taq DNA聚合酶还容易产生非特异性扩增产物，并且不适合在高GC含量序列的PCR反应中使用。此外，现代分子生物检测技术对PCR反应的速度、灵敏度、检出率、耐用性等要求越来越高，野生型Taq DNA聚合酶已无法完全满足实际应用的需求。
在野生型Taq DNA聚合酶序列上进行突变，可以改善该酶的某些性能。例如，CN114369586A公开了一种Taq DNA聚合酶突变体的基因、质粒和基因工程菌及其应用，所述Taq DNA聚合酶突变体，将Taq DNA聚合酶的第142位Asp突变为Lys，第695位Arg突变为Trp。该Taq DNA聚合酶突变体常温下聚合酶活性显著降低，解决了Taq DNA聚合酶在常温条件下也具备DNA聚合酶活性的问题，提升了PCR反应的特异性，对于复杂样本的检测灵敏度显著提升，能够用于制备核酸扩增产品中。
综上所述，为了满足当前的需求，亟需开发一种性能优异的Taq DNA聚合酶。这种酶应具备更高的聚合活性和扩增效率，以显著缩短检测时间。通过对野生型Taq DNA聚合酶进行蛋白质工程改造，可以有效地提升其性能。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用，解决了野生型Taq DNA聚合酶聚合活性低，扩增效率低等问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种Taq DNA聚合酶突变体，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A325、A454或S460中任意一种或至少两种的组合。
本发明获得的Taq DNA聚合酶突变体比活力达到野生型Taq DNA聚合酶的2-5倍，扩增速率提高2倍以上。在qPCR体系中，缩短qPCR程序中的延伸时间后，Taq DNA聚合酶突变体Taq-Mut与野生型Taq DNA聚合酶的检测性能无显著差异，可显著缩短检测所需时长，提高PCR的扩增效率。
SEQ ID NO.1：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE。
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A325T、A454E或S460G中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
H28R或H28C、L30R或L30Y、A325T或A325D或A325E、E388G、A454E或A454D或A454T、S460G或S460L或S460P、E507K、K508R、Q534R、S612G、H676R、E742G或E742D、A743S、M761V或E820G中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下突变：
H28R、L30R、S612G、A743S、E820G中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
(1)E388G、A454E、S460G和H676R；
(2)A325T、E742D和A743S；
(3)H28C和L30Y；
(4)Q534R、S612G和E820G；
(5)E507K和K508R；
(6)A325T和A454E；
(7)A325D和S460G；
(8)A454D和S460P；
(9)A325D、A454T和S460L。
优选地，所述Taq DNA聚合酶突变体的比活力为野生型Taq DNA聚合酶的2-5倍。
以上Taq DNA聚合酶突变体可通过以下技术方案来获得：
以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型Taq DNA聚合酶作为突变母本，对如SEQ ID NO.1所示序列的第1-832位氨基酸进行随机突变，结合高通量筛选，鉴别获得多个扩增效率显著提升的Taq DNA聚合酶突变体。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的TaqDNA聚合酶突变体的编码序列。
第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述的重组载体包括：含有Taq DNA聚合酶突变体编码基因的pET21b。
第四方面，本发明提供了一种重组表达转化体，所述重组表达转化体含有第二方面所述的核酸分子和/或第三方面所述的重组载体。
优选地，所述重组表达转化体包括：含有所述重组载体且表达Taq DNA聚合酶的大肠杆菌。
优选地，所述的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。
第五方面，本发明提供了一种第四方面所述重组表达转化体的制备方法，所述重组表达转化体的制备方法包括以下步骤：
(1)将野生型Taq DNA聚合酶基因插入pET21b质粒上的NdeI/XhoI酶切位点中，得到野生型Taq DNA聚合酶重组表达载体pET21b-Taq；
(2)将重组表达载体pET21b-Taq转化入大肠杆菌表达宿主中，筛选阳性转化子得到所述的重组表达转化体。
优选地，所述大肠杆菌的培养基包括LB培养基。
优选地，所述大肠杆菌的培养方法包括：将构建好的重组大肠杆菌按1％(v/v)的接种量接种至含有氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-30℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，洗涤，即得所述重组表达转化体。
上述0.6-0.8中的具体点值可以选择0.6、0.7、0.8等。
上述0.1-0.5mM中的具体点值可以选择0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM等。
上述16-30℃中的具体点值可以选择16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等。
上述16-24h中的具体点值可以选择16h、18h、20h、22h、24h等。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的Taq DNA聚合酶突变体。
优选地，所述Taq DNA聚合酶突变体的制备方法包括：将含有重组表达转化体的细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，获得所述Taq DNA聚合酶突变体的粗酶液。纯化所述粗酶液即得所述Taq DNA聚合酶突变体。
上述5-10中的具体点值可以选择5、6、7、8、9、10等。
第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的Taq DNA聚合酶突变体在qPCR中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明对现有的野生型Taq DNA聚合酶进行定向进化以提高其聚合活性，通过高通量筛选获得了聚合活性显著提升的Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体的比活力达到野生型Taq DNA聚合酶的2-5倍，扩增速率提高2倍以上；
(2)在qPCR体系中，缩短qPCR程序中的延伸时间后，Taq DNA聚合酶突变体与野生型Taq DNA聚合酶的检测性能无显著差异，可显著缩短检测所需时长；
(3)在PCR体系中，在相同的延伸时长下，Taq DNA聚合酶突变体Taq-Mut能够扩出长度两倍于野生型Taq DNA聚合酶所扩增出来的产物，可显著提高PCR的扩增效率。
附图说明
图1为突变体M2与WT的扩增速度及扩增产量比较结果图；
图2为退火/延伸时长为30s时M5和WT的qPCR扩增曲线图；
图3为退火/延伸时长为20s时M5和WT的qPCR扩增曲线图；
图4为退火/延伸时长为10s时M5和WT的qPCR扩增曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
构建Taq DNA聚合酶随机突变体文库。
利用基因合成的方法，合成引物序列如下：
Taq-F:GGAGATATACATATGCGTGGAATG(SEQ ID NO.2)。
Taq-R:CTCGAGTTATTCCTTAGCAGACAGCC(SEQ ID NO.3)。
以野生型Taq DNA聚合酶重组质粒pET21b-Taq为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。以Taq-F和Taq-R为引物，利用PCR技术对野生型Taq DNA聚合酶的编码基因进行扩增。具体地，易错PCR体系(50μL)：引物Taq-F(10μM)2μL，引物Taq-R(10μM)2μL，rTaq DNA聚合酶1μL，10×PCRbuffer(Mg2+Plus)5μL，dNTPMixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为100μM的MnCl2，pET21b-Taq质粒30ng，加无菌水补足至50μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸150s；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收。对回收后的目的基因DNA片段与空载质粒pET21b分别用限制性内切酶NdeI和XhoI在37℃双酶切5h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4DNA连接酶将得到的线性化pET21b质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养，12h后即可长出来Taq DNA聚合酶随机突变体的单克隆。
实施例2
Taq DNA聚合酶随机突变体文库的表达和纯化。
(1)利用无菌牙签挑取实施例1中长出来的单菌落于含有200μLLB培养基及0.1g/L氨苄青霉素的96孔板中(野生型Taq DNA聚合酶设为对照)，在96孔板上贴上透气薄膜置于37℃，800rpm的孔板摇床中过夜培养；
(2)使用96孔微孔板样品复制器从上述过夜培养的孔板中将菌液接入到第二块96深孔板中，于37℃，800rpm摇床中培养5h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃培养20h进行蛋白的诱导表达；
(3)使用孔板离心机收集菌体，离心条件为4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基后获得菌体；
(4)每个孔中加入500μL的1×TaqBuffer(10mMTris-HCl，50mMKCl,1.5mMMgCl2，pH8.9)置于孔板振荡培养箱进行振荡重悬(16℃，800rpm，10min)；
(5)使用96通道超声破碎仪对菌体进行超声破碎，释放Taq DNA聚合酶突变体蛋白至buffer中，超声破碎条件为：功率为60％，工作4s/停6s，超声破碎2min；
(6)使用孔板离心机离心，收集破碎上清至新的96孔板，获得含有Taq DNA聚合酶突变体的粗酶液，离心条件为：4℃，3500×g，10min；
(7)将上述含有Taq DNA聚合酶突变体粗酶液的孔板置于90℃的水浴中孵育30min进行Taq DNA聚合酶突变体蛋白的纯化；
(8)使用孔板离心机离心，收集上清至新的96孔板，获得经过热处理纯化后的TaqDNA聚合酶突变体纯酶液，离心条件为：4℃，3500×g，10min。
实施例3
Taq DNA聚合酶随机突变体文库的聚合酶活性筛选方法。
Taq DNA聚合酶的聚合活性可以体现在引物延伸过程中掺入dNTPs的速率，即在单位时间内，Taq DNA聚合酶突变体的聚合活性越高掺入的dNTPs的数量就越多，合成的DNA双链链长也就越长。SYBRGreenI染料是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR GreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系中掺入模板链dNTPs的数量。Ct值，是荧光信号达到荧光阈值时的PCR循环数，在相同条件下聚合酶活性越高，单位时间内获得的dsDNA的量就越大，Ct值也会越小。因此，我们根据上述原理，设计了Taq DNA聚合酶随机突变体文库的96孔板高通量筛选方法，具体筛选体系如下表1。
表1
组分 体积
2×Taq buffer 10μL
实施例2获得的纯酶液 1μL
120pg/μL Human DNA 1μL
10mM上游引物Primer-F 0.5μL
10mM下游引物Primer-R1 0.5μL
dNTPs(各10mM) 1μL
SYBR Green I染料 1μL
H2O 5μL
其中2×Taq buffer为：20mM Tris-HCl，100mM KCl，3.0mM MgCl2，pH8.9。
模板DNA为Human DNA，购自Novagen。
Primer-F：CAATAATATTGGGTGGTGAGCATCTGTGTG(SEQ ID NO.4)。
Primer-R1：CTCATTCCAAACTGTGACCCTTTCCTTATCTTAAAG(SEQ ID NO.5)。
上述扩增体系使用的qPCR程序如下表2，每个循环采集一次荧光信号。
表2
实施例4
Taq DNA聚合酶突变体聚合活性比较。
参考专利CN114574548A公开的方法进行Taq DNA聚合酶聚合活性的测定。野生型及突变型Taq DNA聚合酶的聚合活性见下表3，与野生型Taq DNA聚合酶(序列表中SEQ IDNO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质)相比，“+”表示突变体蛋白的聚合活性提高了0.5～1倍；“++”表示突变体蛋白的聚合活性提高了1～2倍；“+++”表示突变体蛋白的聚合活性提高了2～5倍，具体见表3。
表3
实施例5
Taq DNA聚合酶突变体扩增速度及扩增产量测试。
Taq DNA聚合酶的聚合活性提高可以在相同的时间内扩增更长的DNA片段，基于此，测试并比较了野生型Taq DNA聚合酶和突变体M2的扩增速度。使用实施例3中的HumanDNA作为扩增模板，扩增其中的CCR5基因，使用实施例3中的Primer-F(SEQ ID No.4)作为上游扩增引物，根据需扩增片段的长度不同设计多条下游引物，分别为：
实施例3中的Primer-R1(SEQ ID No.4)，扩增0.7kb；
Primer-R2：GGCAGCTGAGAGAAGCCCCTAG(SEQ ID No.6)，扩增1.1kb；
Primer-R3：CTGGAGTGCAGTGGCACGATC(SEQ ID No.7)，扩增2.1kb；
Primer-R4：CAAGGTTCTTCATGATCTAGCCTTGTCCTTC(SEQ ID No.8)，扩增4.3kb。
扩增体系如下表4。
表4
PCR程序如下表5。
表5
将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并评估产物是否存在，以及正确片段大小的条带强度。结果如图1所示，以母本WT和突变体M2的扩增结果为例，当延伸时间为30s时，野生型Taq DNA聚合酶仅能扩增出0.7kb和1.1kb的片段，而突变体M2可以扩增出0.7kb、1.1kb和2.1kb的片段。当延伸时间为50s时，野生型Taq DNA聚合酶能扩增出0.7kb、1.1kb和2.1kb的片段，而突变体M2可以扩增出0.7kb、1.1kb、2.1kb及4.3kb的片段，该结果可充分说明突变体M2比野生型Taq DNA聚合酶的扩增速度更快。另外，在相同条件下，突变体M2扩增出来的产物条带的亮度都要比WT略微高一点，说明突变体M2具有较高的扩增产量。
参考图1，其他所有突变体的扩增结果列于表6，其中“-”表示未扩增出条带(如图1中，延伸时间为30s时WT扩增2.1kb模板的条带)；“+”表示扩增出的条带较暗(如图1中，延伸时间为50s时WT扩增2.1kb模板的条带)；“++”表示扩增出的条带正常(如图1中，延伸时间为30s时M2扩增0.7kb模板的条带)；“+++”表示扩增出的条带较亮(如图1中，延伸时间为30s时M2扩增1.1kb模板的条带)。
表6
实施例6
Taq DNA聚合酶突变体在荧光定量PCR体系中的应用。
Taq DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，可以切割引物探针5’端的荧光基团，基于该原理开发TaqMan法实时荧光定量PCR已被广发应用于核酸定量分析、基因表达差异分析、基因型/等位基因分析、药物开发研究、无创产前检查、肿瘤基因检测、病原体检测等领域。如实施例3中所述，Ct值是荧光信号达到荧光阈值时的PCR循环数，聚合酶活性提高的突变体往往具有更快的引物延伸速度，因此在缩短qPCR扩增程序中的退火/延伸时间后同样能够达到与母本相同或更低的检测Ct值，从而可以在不影响检测结果的同时节约检测时间。基于此，我们测试并比较了野生型Taq DNA聚合酶和突变体M5在qPCR体系中的应用效果。扩增模板为含有人源RNaseP基因的重组质粒，引物和探针信息如下：
RNaseP-F:AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID No.9)。
RNaseP-R:GAGCGGCTGTCTCCACAAGT(SEQ ID No.10)。
RNaseP-Probe:FAM-5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’-BHQ1(SEQ ID No.11)。
扩增体系如下表7。
表7
qPCR程序如下表8。
表8
qPCR扩增曲线如图2-图4所示，当延伸时间设置为30s时，WT与突变体M5扩增的起峰时间相近(图2)；而当延伸时间设置为20s时，WT的出峰时间明显延后，扩增曲线的最大荧光值也显著低于M5(图3)；当进一步缩短延伸时间至10s时，WT与M5的扩增性能差异进一步扩大(图4)。上述结果表明本发明获得的Taq DNA聚合酶突变体M5较母本具有更高的扩增效率，在实际的qPCR检测中可显著缩短检测时间。
综上所述，本发明获得的Taq DNA聚合酶突变体比活力达到野生型Taq DNA聚合酶的2-5倍，扩增速率提高2倍以上，在qPCR体系中，缩短qPCR程序中的延伸时间后，突变型TaqDNA聚合酶Taq-Mut与野生型Taq DNA聚合酶的检测性能无显著差异，可显著缩短检测所需时长，提高PCR的扩增效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A325、A454或S460中任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A325T、A454E或S460G中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
H28、L30、A325、E388、A454、S460、E507、K508、Q534R、S612、H676、E742、A743、M761或E820中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
H28R或H28C、L30R或L30Y、A325T或A325D或A325E、E388G、A454E或A454D或A454T、S460G或S460L或S460P、E507K、K508R、Q534R、S612G、H676R、E742G或E742D、A743S、M761V或E820G中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下突变：
H28R、L30R、S612G、A743S、E820G中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
(1)E388G、A454E、S460G和H676R；
(2)A325T、E742D和A743S；
(3)H28C和L30Y；
(4)Q534R、S612G和E820G；
(5)E507K和K508R；
(6)A325T和A454E；
(7)A325D和S460G；
(8)A454D和S460P；
(9)A325D、A454T和S460L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶突变体的比活力为野生型Taq DNA聚合酶的2-5倍。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1-5中任一项所述的TaqDNA聚合酶突变体的编码序列。
7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求6所述的核酸分子。
8.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体含有权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的重组载体。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-5中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体在qPCR中的应用。
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