JP5210634B2 - スペーサー領域を使用するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出、同定および鑑別 - Google Patents

Description

本発明は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のために使用される１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）遺伝子間のＩＴＳ（内部転写スペーサー）領域から誘導される新規の核酸配列に関する。

本発明はまた、ＩＴＳ領域から誘導される新規の核酸配列を使用するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の特異的検出ならびに／あるいは同定のための方法に関する。

腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属は、次の１１種：セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）群（上記のＳ．リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓ．グリメッシィ（Ｓ．ｇｒｉｍｅｓｉｉ）およびＳ．プロテアマクランス（Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ））、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムティカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・クイニボランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｑｕｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ならびにセラチア・ルビダエア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ）よりなる。

セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属のメンバーは、水および土壌中ならびに葉、果物、野菜、マッシュルーム、コケ類および昆虫において見出される。ヒト疾患と日常的に関連している唯一のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種は、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の他のほとんどの種もまたヒトから単離されており、ここで、それらは、通常、一過的に存在し、日和見感染を生じ得る。これまで、Ｓ．エントモフィラ（Ｓｅｒｒｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）のみがヒトから単離されていない。

セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）感染の最も一般的な部位として、尿路、呼吸器および血流が挙げられる。ＣＮＳ感染は、神経手術後に最も生じる。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）は毒性生物体である。それが血流に進入する場合、内毒素が放出され、熱、敗血症性ショック、血小板減少および散在性血管内凝固症候群を生じる。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）菌血症由来の死亡率は高い。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）は、通常、いくつかの抗生物質に耐性であり、酵素産生により他の抗生物質に迅速に耐性になる。

セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の院内感染は、医療従事者の汚染された手から最も多く生じる。汚染された装置は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）感染のもう１つの供給源である。尿路感染は、留置カテーテルに常に関連する。呼吸器感染は、機械的に通気されている場所に存する患者に一般的である。ヒトがセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）によってコロニー化されると、それらは、侵襲デバイス、手術および病気の重症度によって、容易に感染されるようになる。

現在、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種は、培養に基づく方法ならびに表現型生化学的試験によって、同定および鑑別される。

それらは、富化された培地（例えば、血液寒天）上、３５〜３７℃で良好に増殖する。それらは乳糖非発酵菌であり、運動性である。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種は、２５℃で細胞外ＤＮａｓｅおよび２２℃でゼラチナーゼを産生する。それらは、リパーゼを作り出し、コリスチン、アンピシリンおよびセファロチンに耐性である。これらの特性は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）に特異的であり、他のいずれの腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の特徴ではない。長年にわたって、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）は、その特徴的な赤色の色素形成によって、他の腸内細菌から鑑別された。しかし、すべてのＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）生物体が典型的な赤色の色素プロジギオシンを産生するとは限らない。脱炭酸化および発酵反応によって、多様なセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種をＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から識別することができる。

非特許文献１は、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）生物体のｒＤＮＡ１６Ｓ−２３Ｓスペーサー領域の増幅および制限ヌクレアーゼを使用するそのフラグメント化について記載している。スペーサー領域についても、またそのフラグメントについても開示されていない。この方法を用いてＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種からの同定は実証されていない。

健康安全の見地から、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）は、その増加する症例数、毒性およびその増加する抗生物質に対する耐性のため、大いに関心が寄せられている。従って、迅速かつ特異的な同定アッセイは、この生物体によって生じる感染のより適切な抗微生物管理の基礎である。

Ｊ．クル（Ｊ．Ｋｕｒ）ら（（１９９５年）Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ ４４（３／４）：２１９−２２５）

本発明の目的は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出および／または同定のために使用することができるセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種のＩＴＳから誘導される新規の核酸配列を提供することである。

従って、本発明は、配列番号１〜５７、それらの相補形態、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、および相同物からなる群から選択される単離された核酸分子を提供する。

セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための前記核酸分子およびそれらのフラグメントの使用もまた、本発明の目的である。グルタミン、イソロイシンおよびアラニンをコードするｔＲＮＡ配列が前記検出および／または同定に適切ではないことは、当業者に明らかである。

本発明の態様は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出および／または同定のためのプローブならびに／あるいはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドに関する。

従って、本発明は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための配列番号１２〜５７、それらの相補形態、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相同配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される核酸分子を含んでなるか、あるいは該核酸分子よりなる標的配列に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。

本発明のもう１つの態様は、サンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出ならびに／あるいは同定のためのプローブの組に関する。

本発明のもう１つの態様は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域の特異的増幅を可能にするプライマーに関する。

本発明のもう１つの目的は、本発明の新規の配列のいずれか、または本発明のプローブおよび／もしくはプライマーのいずれか、あるいはそれらの組み合わせを含有する組成物である。

本発明のもう１つの目的は、前記プローブならびに／あるいはプライマーが、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出および／または同定のために使用されるキットである。

本発明のもう１つの目的は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出ならびに／あるいは同定のための迅速かつ信頼し得るハイブリダイゼーション方法である。

本発明のもう１つの目的は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出ならびに／あるいは同定のためのリアルタイムＰＣＲに基づくハイブリダイゼーション方法である。

表の説明
表１：実施例において使用した増幅および融解曲線プログラム。
表２：使用したＨｙｂＰｒｏｂｅの異なる組み合わせ。
表３：配列番号２６および４４によって表されるＨｙｂＰｒｏｂｅの組み合わせの特異性について試験された微生物のリスト。
表４：配列番号１〜５９のリスト。

以下の定義は、以下に記載の本発明の異なる実施態様において使用される用語および表現を例示する役割を果たす。

用語「スペーサー」および「ＩＴＳ」（内部転写スペーサー）は、省略形の用語であって、両方とも１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの間または１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間の領域を指す。

用語「プローブ」は、標的配列にハイブリダイズするのに十分に相補的である配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。

本発明の枠内における標的配列は、配列番号１〜１１、それらの相補形態、それらのＲＮＡ形態、相同物またはそれらのフラグメントのいずれかによって表される任意の核酸分子を含んでなる検出すべき配列である。

標的配列は、ゲノムＤＮＡもしくは前駆体ＲＮＡ、またはその増幅されたバージョンのいずれかであり得る。

好ましくは、本発明のプローブは、標的配列の正確な相補体に対して、約８０％もしくはそれ以上、より好ましくは約８５％もしくはそれ以上、さらにより好ましくは約９０％もしくはそれ以上、および最も好ましくは約９５％もしくはそれ以上相同である。

本発明のプローブは、対応するヌクレオチド配列を含む挿入物を含有する組換えプラスミドのクローニングによって、必要であれば、適切なヌクレアーゼを使用してクローニングされたプラスミドから後者を切断し、例えば、分子量による分画によりそれらを回収することによって、形成することができる。

本発明に従うプローブもまた、例えば、従来のホスホトリエステル法によって、化学的に合成することもできる。

本明細書において使用される用語「相補的な」核酸は、核酸配列が相互に完全な塩基対形成をした二重螺旋を形成することができることを意味する。本特許出願を通して、相補形態が配列およびそのＲＮＡ形態に関連して述べられている場合、配列およびそのＲＮＡ形態の両方の相補形態を意味する。

用語「ポリ核酸」、「核酸」、および「ポリヌクレオチド」は、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０または５０連続ヌクレオチドを含有する二本鎖もしくは一本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれかに対応する。１００ヌクレオチド長より小さなポリ核酸は、しばしば、「オリゴヌクレオチド」と称される。本特許出願において述べられているヌクレオチドの数は、用語「約」と同じ意味でプラスまたはマイナス２の範囲を示すものとみなすべきである。

それらはまた、イノシンまたはそれらのハイブリダイゼーションの特徴を本質的に変更しない改変された基を含有するヌクレオチドのような改変されたヌクレオチドを含有することができる。

本発明のポリ核酸分子は、常に、５’末端から３’までが表される。しかし、それらは、任意の形態、即ち、それらの二本鎖または一本鎖形態（２つの鎖のいずれか）、それらのＤＮＡまたはＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）（改変されているまたは改変されていない）で使用することができる。

用語「最も緊密な近接体」は、ＤＮＡ相同性について最も緊密に関係することが公知であるかまたはそのように予想され、目的の生物体から鑑別されなければならないタクソンを意味する。

表現「タクソン特異的ハイブリダイゼーション」または「タクソン特異的プローブ」は、プローブが、タクソン由来のＤＮＡまたはＲＮＡ（これらを対象にプローブが設計された）にのみハイブリダイズし、他のタクソン由来のＤＮＡまたはＲＮＡにはハイブリダイズしないことを意味する。

タクソンという用語は、完全な属または属内のサブグループ、種または種内のサブタイプ（亜種、血清型、配列型（ｓｅｑｕｅｖａｒ）、生物型など）を指し得る。

用語「特異的増幅」または「特異的プライマー」は、前記プライマーが、生物体由来の関連領域（これを対象にプライマーが設計された）のみを増幅し、他の生物体由来のものは増幅しないという事実を指す。

用語「スペーサー特異的増幅」または「スペーサー特異的プライマー」は、前記プライマーが、生物体由来のスペーサー領域（これを対象にプライマーが設計された）のみを増幅し、他の生物体由来のものは増幅しないという事実を指す。

用語「特異的プローブ」は、生物体由来の関連領域（これを対象にプライマーが設計された）のみにハイブリダイズし、他の生物体由来の対応する領域にも、他のいずれの領域にもハイブリダイズしないプローブを指す。

用語「スペーサー特異的プローブ」は、生物体由来の関連スペーサー（これを対象にプライマーが設計された）のみにハイブリダイズし、他の生物体由来のスペーサーにはハイブリダイズしないプローブを指す。

用語「感度」は、偽陰性の数：即ち、検出しようとする１００株のうちの１株が見落とされる場合、試験は（１００−１／１００）％＝９９％の感度を示す。

用語「特異性」は、偽陽性の数：即ち、検出される１００株に対して、２株が生物体（これに対して試験が設計されていない）に属するようである場合、試験の特異性は（１００−２／１００）％＝９８％である。

「選好的」であるように選択されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、８０％を超える、好ましくは９０％を超える、最も好ましくは９５％を超える感度および特異性を示す。

用語「固相支持体」は、ポリヌクレオチドプローブを結合することができる任意の基体を指すことができ、但し、プローブはそのハイブリダイゼーションの特徴を保持し、かつハイブリダイゼーションのバックグランドレベルは低く保持する。通常、固体基質は、マイクロタイタープレート、メンブラン（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース）またはマイクロスフェア（ビーズ）であり、これらの例に限定されない。メンブランへの適用または固定化の前に、固定化を容易にするかまたはハイブリダイゼーション効率を改善するために、核酸プローブを改変すると都合がよい。そのような改変は、ホモポリマーテーリング、脂肪族基、ＮＨ_２基、ＳＨ基、カルボキシル基のような異なる反応基との結合、またはビオチン、ハプテンもしくはタンパク質との結合を包含し得る。

用語「標識された」は、標識核酸の使用を指す。標識化は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１）もしくはベジュ（Ｂｅｊ）ら（（１９９０年）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ４：３５３−３６５）によって例示されるような増幅のポリマー化工程中に組み入れられる標識ヌクレオチドの使用または標識プライマーの使用、あるいは当業者に公知の他の任意の方法によって行ってもよい。標識の性質は、アイソトープ（^３２Ｐ、^３５Ｓなど）であっても、または非アイソトープ（ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光染料、酵素など）であってもよい。

用語「シグナル」は、一連の電磁波は（例えば、蛍光）、または情報を担持する電流の変化を指す。シグナルは、直接目視することができるか、あるいは異なる手段またはデバイスによって可視化するおよび／もしくは解釈可能にすることができる。

「サンプル」は、いずれの生物学的材料であってもよい。この生物学的材料は、感染したヒト、もしくは動物から直接、または培養もしくは富化後、あるいは食物、環境などのいずれから採取してもよい。

生物学的材料は、例えば、任意の種類の喀痰、気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｅｏｌａｖａｇｅ）、血液、皮膚組織、生検、リンパ球の血液培養材料、コロニーなどであってもよい。前記サンプルは、当該分野において公知の技術のいずれかに従って調製または抽出することができる。

本発明の趣旨において臨床的に関連するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種は、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）である。

異なるセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種は、スペーサー領域に挿入されるｔＲＮＡ遺伝子のタイプ、ｔＲＮＡ^ｇｌｕまたはｔＲＮＡ^{ｉｌｅ−ａｌａ}に基づく異なる２つのタイプのスペーサーを示す。さらに、それぞれのタイプのスペーサーおよびそれぞれのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種について、異なるクラスターまたはグループを識別することができる。

例えば、３つのＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の株のうち、第１のタイプ（即ち、ｔＲＮＡ^ｇｌｕの挿入を伴う）のスペーサーを考慮すると、それぞれ、配列番号１〜２によって表される異なる２つのグループが規定され得る。

第２のタイプ（即ち、ｔＲＮＡ^{ｉｌｅ−ａｌａ}の挿入を伴う）を考慮すると、それぞれ、配列番号３〜５によって表される異なる３つのグループが規定され得る。

すべてのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、もしくはそれぞれのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、または少なくとも２つのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の任意の組み合わせを検出および／あるいは同定するために、本発明は新規の核酸分子を提供する。

本発明のＩＴＳ配列は、配列番号１〜１１、それらの相補形態、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、およびそれらの任意の相同配列からなる群から選択される核酸分子を含んでなるか、または該核酸分子よりなる。

「相同物」とも称せられる任意のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種のＩＴＳにおいて見出される相同配列もまた、本発明の目的である。配列全体に関する相同性の程度は９５％より高い。

次いで、本発明の枠内において、「相同物」は、配列番号１〜１１のいずれかあるいは任意のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種のＩＴＳ領域に局在し、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定に適切な少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチドのそれらの任意のフラグメントに対する相同配列である。

配列番号１〜５はＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から誘導され、配列番号６および７はＳ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）から誘導され、配列番号８〜１１はＳ．フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）から誘導される。

本発明はまた、任意のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出のためのＩＴＳから誘導される新規の核酸分子を提供し、挿入されるｔＲＮＡを顧慮する異なるタイプ（それぞれのタイプが異なるグループを含んでなる）のＩＴＳが存在するという事実により極めて高い変動性によって生じる問題を解決する。

実際、配列番号１７、１８、１９、２０、３３、３８、３９、および５７よりなる新規の核酸分子が、試験したすべてのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、臨床に関連するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の特定のタイプのスペーサーの異なるグループにおいて見出されることが発見されている。

次いで、該特異的ポリヌクレオチド、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、好ましくは、約２０ヌクレオチド（１８、１９、２０、２１、もしくは２２）のそれらの任意のフラグメント、それらのＲＮＡ形態および属特異的ポリヌクレオチドとも称させるそれらの相補形態は、任意のまたはすべてのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、臨床に関連するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出のためのプライマーおよび／またはプローブを設計するために使用することができるＩＴＳの特異敵領域である。

１つ、２つもしくはそれ以上のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のためのプローブおよび／またはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドが提供される。

言い換えれば、本発明の目的は、１つ、２つもしくはそれ以上のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための本発明の標的配列とハイブリダイズするプローブならびに／あるいはプライマーとしての使用のための新規のポリヌクレオチドに関する。

特に、本発明の目的は、配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、それらの任意の相補物、およびそれらの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、もしくは３００連続ヌクレオチドのフラグメントからなる群から選択される核酸を含んでなるかまたは該核酸よりなる標的配列に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子である。

好適なポリヌクレオチドプローブは、約５〜約５０塩基長、より好ましくは、約１０〜約２５ヌクレオチドの間であり、標的配列に十分相同である。

配列番号１２〜５７のポリヌクレオチドまたはそれらの相補物、それらの相補形態もしくはそれらのＲＮＡ形態のいずれかをプローブとして使用してもよい。

本発明の好適なプライマーは、本発明の標的配列の合成のための開始点として作用することが可能な一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明のプライマーの長さおよび配列は、それらが伸長産物の合成をプライムすることを可能にするようなものでなければならない。

好ましくは、本発明のプライマーは、約５〜約５０ヌクレオチド長、好ましくは、約１５〜約２５である。その特異的長さおよび配列は、温度およびイオン強度のような使用される条件に依存して選択されるべきである。

本発明のプライマーは、標的配列を増幅する。言い換えれば、本発明のプライマーは、配列番号１〜１１、それらの相補鎖および／または相同物のいずれかを含んでなる核酸分子を増幅する。

ｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域、即ち、１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子に局在するユニバーサルプライマーを使用することができる。セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種がサンプル中に存在する場合、増幅産物、標的配列は、配列番号１〜１１および／または相同物のいずれかよりなる核酸分子を含んでなる。

好ましくは、標的配列は、それぞれ約４０〜約５０ヌクレオチド以下の１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡによって隣接される配列番号１〜１１および／または相同物からなる群から選択される任意の核酸分子よりなる。

増幅プライマーは、適切な増幅を保証するために対応するテンプレート配列に正確に一致する必要はないという事実は、参考文献（クウォック（Ｋｗｏｋ）ら（１９９０年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：９９９）に詳細に立証されている。

使用される増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、（（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ランドグレン（Ｌａｎｄｇｒｅｎ）ら、（（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０）、ウー（Ｗｕ）およびウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、（（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９）；バーラーニ（Ｂａｒａｎｙ）、（（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９−１９３）核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；ガテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、（（１９９０年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８）、コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、（（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ ３５０：９１−９２）転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ；クヲ（Ｋｗｏｈ）ら、（１９８９年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ダック（Ｄｕｃｋ）、（（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９：１４２−１４７）；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、（（１９９２年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６）またはＱβレプリカーゼによる増幅（リザード（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、（（１９８８年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２）、ロメリ（Ｌｏｍｅｌｉ）ら、（（１９８９年）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３５：１８２６−１８３１）または当該分野において公知の核酸分子を増幅するための他の任意の適切な方法のいずれかであり得る。

プライマーもしくはプローブとしての使用のため、または本発明の方法において使用すべきさらなるプライマーおよびプローブを設計するための本発明の好適なポリヌクレオチドは、配列番号１２〜５７によって表される。

本発明のポリヌクレオチドは、それらのそれぞれの末端のいずれかに対する１つもしくはいくらかのヌクレオチドの付加もしくは除去によって、または前記配列内の１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを変更することによって、あるいは両方の組み合わせのいずれかにより、配列番号１２〜５７によって表されるポリヌクレオチドと配列が異なり得、但し、得られる等価物はなお、標的配列にハイブリダイズする。前記等価なポリヌクレオチドは、対応する改変されていないポリヌクレオチドと少なくとも８０％相同性、好ましくは、８５％を超える、より好ましくは、９０％を超える相同性、最も好ましくは、９５％を超える相同性を共有する。

ポリヌクレオチドの等価物を使用する場合、対応する改変されていないポリヌクレオチドと同じ特異性を得るために、ハイブリダイゼーション条件を改変する必要があり得る。

結果として、ポリヌクレオチドを同じハイブリダイゼーション条件下での設定において使用しようとする場合、それに応じて他のポリヌクレオチドの配列を改変する必要もある。これらの改変は、ヘイムズ Ｂ（Ｈａｍｅｓ Ｂ）およびヒギンズ Ｓ（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ）（編）：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、英国、１９８５年に記載のような原理に従って、行うことができる。

本発明のポリヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブはまた、ホスホロチオエート（マツクラ（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ）ら、（（１９８７年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（２１）：７７０６−７７１０）、アルキルホスホロチオエート（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、（（１９７９年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８（２３）：５１３４−５１４３）またはペプチド核酸（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７−１５００）；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（（１９９３年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（２）：１９７−２００）のようなヌクレオチドアナログを含んでなり得るか、またはインターカレート剤（アセライン（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）ら、（（１９８４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１１）：３２９７−３３０１）などを含有し得る。

改変されたプライマーまたはプローブは、要求される特異性および感度を得るためにそれらが使用される条件に関連する適応を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションの結果は、改変されていないポリヌクレオチドで得られる結果と本質的に同じものを保持するべきである。

これらの改変の導入は、ハイブリダイゼーション速度論、ハイブリッド形成の可逆性、ポリヌクレオチド分子の生物学的安定性などのようないくつかの特徴に影響を及ぼすために有利であり得る。

本発明のプローブおよびプライマーは、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、および／またはセラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法、また目的において使用される。

標的配列の検出および／または同定は、電気泳動法、ハイブリダイゼーション法または配列決定法を使用することによって実施することができる。

サンプル中の１つもしくはそれ以上のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出のための本発明の方法は、以下の工程を含んでなる：
・第１に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および／またはハイブリダイゼーションに利用可能にする。
・第２に、また、必要であれば、核酸が存在するならば、１つもしくは別の標的増幅システムにより増幅する。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するために必要である。しかし、いくつかのサンプル、またはいくつかの高感度のシグナル増幅システムについては、増幅は必ずしも必要ではない。
・第３に、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物をプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、簡便かつ適合性の検出システムを使用して、ハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、１つ、２つもしくはそれ以上のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の有無を推測することができる。

増幅工程では、ユニバーサルプライマーとも呼ばれるｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域（１６Ｓおよび２３Ｓ遺伝子）に局在するプライマーを使用することができる。配列番号５８および５９によって表されるプライマー対は、ユニバーサルプライマーのそのような例である。

いくつかのアプリケーションでは、サンプル中に存在するすべての細菌ではないが、１つもしくはいくらかの属、または１つもしくはいくらかのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を増幅するのに適切であり得る。

後者の場合、これは、属特異的プライマーまたはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種のＩＴＳ領域から誘導される種特異的プライマーを使用することによって達成することができる。

特に、サンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための本発明の方法は、以下の工程
（ｉ）所望により、サンプル中に存在するポリ核酸を単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）所望により、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または標的配列もしくは（ａ）そのフラグメントの少なくとも１つを、少なくとも１つの適切なプライマー対で増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、配列番号１〜１１、それらの相同物、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態およびそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つの標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程、
（ｉｖ）形成されるハイブリダイズを検出する工程、ならびに
（ｖ）得られるシグナルを解釈し、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の存在を推察し、および／またはサンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を同定する工程、を含んでなる。

例えば、本発明の任意の方法の増幅またはハイブリダイゼーション工程において述べられるようなフラグメントは、本発明の核酸分子の約１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００連続ヌクレオチドを含んでなるか、または該ヌクレオチドよりなり得る。

好ましくは、本発明のプローブは、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。

高いストリンジェンシー条件下では、相補的な核酸ハイブリッドのみが形成される。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、標的および非標的核酸と共に形成されるハイブリッド間の安定性における差異を最大にするために選択される。

いずれにせよ、適切なハイブリダイゼーション条件は、本発明のポリヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズする場合に得られるハイブリダイゼーションのシグナルが、前記ポリヌクレオチドが非特異的様式で標的配列にハイブリダイズする場合に得られるシグナルと異なるような方法で選択される。

実際には、異なるシグナルは、例えば、標的配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションと比較して、標的に対する特異的ハイブリダイゼーションにより、その強度が２、５、１０もしくはそれ以上強い場合、可視化され得る。Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ（ＬｉＰＡ）システムは、これに関連する良好な例である。

異なるシグナルもまた、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を使用する場合に融解曲線解析において異なるピークが描かれる場合、可視化され得る。

一実施態様では、サンプル中に存在する可能性のある標的配列の検出のための極めて簡便かつ有利な技術はリアルタイムＰＣＲ法である。

本発明の枠内において使用することができる増幅されたＤＮＡの検出のための異なる形式、特に、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓプローブ、「Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ」、またはＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブが存在する。

ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブに関して、一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは、２つの成分で標識される。第１の成分、いわゆる蛍光剤が適切な波長の光で励起される場合、吸収されるエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第２の成分、いわゆるクエンチャーに移される。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中に、ハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、伸長フェーズ中にポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。結果として、励起された蛍光成分およびクエンチャーは、空間的に相互に離れており、従って、第１の成分の蛍光発光を測定することができる（ＥＰＢ０５４３９４２および米国特許第５，２１０，０１５号明細書）。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓプローブに関して、プローブはまた、第１の成分およびクエンチャーで標識され、標識は、好ましくは、少なくとも部分的に自己相補的なプローブの異なる末端に局在する。プローブの二次構造の結果として、両方の成分は、溶液において空間的に近接にある。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、適切な波長の光による励起後に、第１の成分の蛍光発光を測定することができるように、両方の成分を相互に分離する（米国特許第５，１１８，８０１号明細書）。

「Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ」に関して、プローブおよびプライマーは、１つの分子に含まれる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓシステムと同様に、それぞれのプローブは、第１の成分およびクエンチャーで標識され、標識は、少なくとも部分的に自己相補的なプローブの異なる末端に局在する。プライマーは、二次構造が特異的標的配列の非存在下で開放されることを防止するＰＣＲストッパーを介してそれぞれのプローブに連結される。（ホワイトクーム，Ｄ．（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｄ．）ら、（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７；セルウェール，Ｎ．（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ，Ｎ．）ら、（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第２８巻、１９号：３７５２−３７６１；スヴァンヴィク（Ｓｖａｎｖｉｋ）らＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７：１７９−１８２（２０００年））。

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、すべての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である（マシューズ，Ｊ．Ａ．（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ａ．）およびクリカ，Ｌ．Ｊ．（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｊ．）、（１９８８年）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ１６９：１−２５）。それは、同時に使用され、（増幅された）標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である２つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブによって特徴付けられる。両方のプローブとも、異なる蛍光成分によって標識される。適切な波長の光で励起される場合、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出しようとする標的分子の隣接位置に結合する場合にのみ第２の成分の蛍光発光を測定することができるように、第１の成分は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、吸収されるエネルギーを第２の成分に移動する。

標的配列にアニーリングされる場合、ハイブリダイゼーションプローブは、頭−尾配列で相互に極めて緊密に局在しなければならない。通常、第１のプローブの標識された３’末端と第２のプローブの標識された５’末端との間の間隙は可能な限り小さく、特に、約０〜２５塩基、好ましくは、約１〜約５塩基よりなる。このことは、ＦＲＥＴドナー化合物とＦＲＥＴアクセプター化合物との緊密な近接を可能にし、典型的に、１０〜１００オングストロームである。

あるいは、ＦＲＥＴアクセプター成分の蛍光の増加をモニターするために、ハイブリダイゼーション事象の定量測定としてＦＲＥＴドナー成分の蛍光減少をモニターすることも可能である。

リアルタイムＰＣＲの当該分野において公知のすべての検出形式のうち、ＦＲＥＴ−ハイブリダイゼーションプローブ形式は、高感度、正確および信頼性があることが証明されている（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット；同第９７／４６７１２号パンフレット；同第９７／４６７１４号パンフレット）。なお、適切なＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、時々、検出しようとする標的核酸配列の特別な特徴によって制限され得る。

２つのＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの使用に対する代替物として、蛍光標識プライマーおよびただ１つの標識ポリヌクレオチドプローブを使用することも可能である（バーナード，Ｐ．Ｓ．（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｐ．Ｓ．）ら、（１９９８年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：１０１−７）。これに関して、それは、プライマーがＦＲＥＴドナー化合物で標識されようと、またはＦＲＥＴアクセプター化合物で標識されようと任意に選択され得る。

伸長工程中の蛍光を測定して、増殖曲線を作製することができ、該曲線から、使用するプライマーおよび／またはプローブ、それらのＴｍならびにハイブリダイゼーション条件に依存して、検出しようとするセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の存在を推察するかまたはどのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種が存在するかを推察することが可能である。

ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅまたはＦＲＥＴ−プローブとも呼ばれる）はまた、融解曲線解析に使用することもできる（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット；同第９７／４６７１２号パンフレット；同第９７／４６７１４号パンフレット）。そのようなアッセイでは、標的核酸は、まず、適切な増幅プライマーによる典型的なＰＣＲ反応において増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応中に常に存在し得るか、または続いて添加し得る。ＰＣＲ反応の完了後、サンプルの温度を連続的に増加させる。ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合する限り、蛍光が検出される。融解温度では、ハイブリダイゼーションプローブは、それらの標的から遊離し、直ちに、蛍光シグナルがバックグランドレベルにまで減少する。この減少は、１次導関数の負数を算出することができるように、適切な蛍光対温度−時間プロットでモニターされる。次いで、そのような関数の得られる最大値に対応する温度の値を、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの前記対の決定された融解温度として採用する。

標的核酸内の点変異誘発または多型は、標的核酸とＦＲＥＴプローブとの間の１００％未満の相補性を生じ、従って、減少した融解温度を生じる。これは、ＦＲＥＴ−ＨｙｂＰｒｏｂｅハイブリダイゼーションによる配列変種のプールの一般的な検出を可能にする一方、続いて、前記プールの異なるメンバーが、融解曲線解析を実施することによって識別され得る。

ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブの代わりに、融解曲線解析のために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓを代替的に使用してもよい。

リアルタイムＰＣＲおよび相同リアルタイムＰＣＲ融解曲線解析の利用可能時は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ^ＴＭＩのような二本鎖ＤＮＡ結合性染料、あるいは、異なるが類似の標的配列にハイブリダイズする特異的に設計されたハイブリダイゼーションプローブのいずれかを使用して、所定のタイプの種または株の識別が可能になる。

第１の場合、作製される二本鎖ＰＣＲ産物の融解温度が決定されなければならない。なお、若干の配列変動は精妙な融解温度の差異しか生じないことから、僅かな差異を効率的にモニターすることができないため、この方法は、限られたアプリケーションしか有さない。

あるいは、ハイブリダイゼーションプローブは、プローブ／標的核酸ハイブリッドの融解温度が決定されるような方法で使用してもよい。

ＡＢＩ／Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ装置、特に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭ器具のような使用することができる異なるリアルタイムＰＣＲプラットフォームが存在し、発光を測定すること、融解サイクル中の放射ピークを連続的にモニターすること、標識プローブが増殖産物から分離する温度（融解ピーク）を決定および可視化することを含んでなる同じ原理にすべて基づく。プローブと標的との間のミスマッチは、融解の速度論に影響を及ぼし、目的のそれぞれの種に対して異なる融解ピークを生じるため、融解ピークデータは、特定の［プローブ：標的］配列の特徴である。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプラットフォームは、多くの利点、特に、時間の利得ならびにハイブリダイゼーションプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅ）、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブおよびバイプローブ（ｂｉｐｒｏｂｅ）（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ^ＴＭＩ）のようないくらかの異なる配列特異的蛍光プローブ検出システムの可能な使用を付与する。

本発明の好適な方法では、頭−尾配向で、若干のヌクレオチド、一般に０〜２５、好ましくは、約１〜約５だけ相隔てた本発明の標的配列から誘導される２つの隣接ポリヌクレオチドプローブよりなるＨｙｂＰｒｏｂｅシステムが使用される。プローブのうちの一方は、ドナー染料によりその３’末端で標識され、他方は、その５’末端でアクセプター分子で標識され、（プライマーとしてそれが作用することを防止するために）３’末端でリン酸基がブロックされる。ドナー染料は、一般に、フルオレセインであり、アクセプター分子は、一般に、ＬＣ Ｒｅｄ ６１０、６４０、６７０または７０５である。

本発明の標的配列の検出は、内部標識ＰＣＲ鎖および対向鎖上に配置される検出プローブによっても達成することができる。シグナルは、染料の空間的接近に依存し、標的の量に依存する。

両方のプローブがそれらの標的配列に対してハイブリダイズされる場合、ドナーの発光した光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、アクセプターフルオロフォアに伝達され、発光した蛍光（６１０、６４０、６７０もしくは７０５ｎｍ）を検出することができる。蛍光は、標的ＤＮＡ、増幅の産物と同時に増加する。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプローブは、加水分解を必要とせず、従って、ＰＣＲ時間のさらなる延長を伴わない（アニーリング〜伸長≦１２秒）ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブを超える利点を付与する。従って、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭの高速熱サイクルを利用して、僅か４５分間内でＰＣＲプログラムを完了することが可能である。

そして、最近の世代のリアルタイムＰＣＲプラットフォームは、単一の反応でいくらかのプローブをモニターすることが可能であり、種レベルでの異なるセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の検出および／または同定、ならびに／あるいは異なるタイプのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）スペーサーの区別を可能にする。

さらに、ＴａｑＭａｎ^ＴＭ技術のために設計された方法を、等価な結果を伴うＨｙｂＰｒｏｂｅ技術に対して容易に変換することができることが示されている（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ 第８５巻（１２）１２４８−１２５４頁、２０００年１２月）。

従って、本発明の別の目的は、ＨｙｂＰｒｏｂｅとも称される少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブの組に関し、両方のＨｙｂＰｒｏｂｅは、前記２つのＨｙｂＰｒｏｂｅ間に２５個以下のヌクレオチド、好ましくは、１０ヌクレオチド以下、特に、５個以下のヌクレオチドで相互に隣接する同じ標的配列にハイブリダイズする。

２つのＨｙｂＰｒｏｂｅが存在する場合、２つのＨｙｂＰｒｏｂｅの標的配列とのハイブリダイゼーション時に、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアが相互の０〜２５個のヌクレオチド内、好ましくは、相互の０〜５個のヌクレオチド内に存在するように、一方はアクセプターフルオロフォアで標識され、他方はドナーで標識される。

３つ以上のＨｙｂＰｒｏｂｅが存在する場合、ＨｙｂＰｒｏｂｅの標的配列とのハイブリダイゼーション時に、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアが相互の０〜２５個のヌクレオチド内、好ましくは、相互の０〜５個のヌクレオチド内に存在するように、一方はアクセプターフルオロフォアで標識され、他方はドナー（または逆）で標識される。

セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、臨床に関連するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を検出および／または同定するために、少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブの組が使用され得、前記プローブは、配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、および相同物からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つとハイブリダイズし、ここで、前記プローブ間に２５以下のヌクレオチド、好ましくは、５個以下のヌクレオチドが存在する。

本発明のプローブの組は、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれ以上のプローブよりなり得るが、それは、好ましくは、２〜５個のプローブよりなる。

表２に列挙されるプローブの組およびそれらの相同物は、本発明の好適な組である。

３つのポリヌクレオチドの組（２つがプライマーとしての使用のため、他方がプローブとしての使用のため）もまた使用することができる。次いで、前記プライマーと前記プローブとの間に２５個以下のヌクレオチド、好ましくは、５個以下のヌクレオチドが存在するように、前記プライマーおよび前記プローブのうちの一方は、配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、および相同物からなる群から選択される標的配列の少なくとも１つにハイブリダイズする。

本発明の少なくとも２つのポリヌクレオチドの組は、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）および／またはＳ．フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出ならびに／あるいは同定のための方法において使用される。

サンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種、特に、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）および／またはＳ．フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）の検出ならびに／あるいは同定のための本発明の方法は、以下の工程
（ｉ）所望により、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または少なくとも１つの標的配列、もしくはそのフラグメントを、少なくとも１つの適切なプライマー対で増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、任意の相同物、またはそれらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つの標的配列にハイブリダイズする少なくとも２つのＨｙｂＰｒｏｂｅの少なくとも１つの組とを接触させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されるハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られるディファレンシャルハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の存在を推察するか、またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を同定する工程、を含んでなる。

例えば、ハイブリダイゼーション工程において使用される２つのＨｙｂＰｒｏｂｅの組は、配列番号２６によって表されるＨｙｂＰｒｏｂｅと配列番号４４および４５によって表されるＨｙｂＰｒｏｂｅ、またはそれらの相同物のいずれかとの組み合わせであり得る。

配列番号２６によって表されるＨｙｂＰｒｏｂｅは、フルオレセインで標識され得、他方は、ＬＣＲ６１０、ＬＣＲ６４０、ＬＣＲ６７０またはＬＣＲ７０５のいずれかで標識され得る。

ＨｙｂＰｒｏｂｅシステムの利点の１つは、次の分子概念に基づいて、それが変異、多型および他の変種核酸種を含む配列変動の検出を可能にするという事実にある：ＨｙｂＰｒｏｂｅの１つは、緊密に結合する「アンカープローブ」である一方、隣接「センサープローブ」は、配列変動の領域に及ぶ。最終ＰＣＲ産物の融解中、センサープローブの融解温度（Ｔｍ）の変化として、配列改変が検出される。

例えば、サンプルが配列番号１のみを含有する場合、前記配列番号１に特異的にハイブリダイズするＨｙｂＰｒｏｂｅを使用することにより、単一の融解ピークが作製される。サンプル中に相同物も存在する場合、一般に、容易に観察され得る温度シフトを含む少なくとも１つのミスマッチ塩基が存在する限り、２つの同じＨｙｂＰｒｏｂｅを使用することにより、２つのピークが作製される。

増幅の産物の検出のために使用されるプローブの形式、選択（または設計される）ポリヌクレオチド、それらのＴｍおよびハイブリダイゼーション条件に依存して、増殖工程（次いで、増幅曲線が作成される）中、または融解曲線解析、融解曲線解析、融解曲線を作成するための増幅工程後、蛍光が測定され得る。

従って、得られるシグナルは、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の存在を推察するおよび／またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種のうちのどの種が存在するかを推察することが可能である増幅曲線の形態または融解曲線の形態で可視化され得る。

特に、サンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための方法はまた、以下の工程、
（ｉ）必要であれば、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、ならびに
（ｉｉ）配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、任意の相補物、それらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントからなる群から選択される標的配列の少なくとも１つを、プライマーの対（そのうち一方が標識される）で増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸と、前記標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのＨｙｂＰｒｏｂｅ（間に２５個未満のヌクレオチドを伴う前記標識プライマーに隣接する）とを接触させる工程、
（ｉｖ）形成されるハイブリダイズを検出する工程、ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られるシグナルからサンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の存在を推察する、および／またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を同定する工程を含んでなる。

ＨｙｂＰｒｏｂｅシステムを使用する本発明の方法は、１つもしくはいくらかのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および同定に適応され得、他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種からのその／それらの区別を可能にする。

特に、ＨｙｂＰｒｏｂｅシステムを使用する本発明の方法は、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の検出および同定に適応され得、他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種からのその区別を可能にする。

次いで、増幅工程では、適切なプライマーは、配列番号１〜５、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態および相同物からなる群から選択される標的配列を特異的に増幅するプライマー対である。

ハイブリダイゼーション工程では、ＨｙｂＰｒｏｂｅは、例えば、配列番号１２〜１４、２１〜２３、２６、２７〜３２、４０〜４６、４９および５０〜５６のいずれか、またはそれらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、もしくはそれらの相補形態に特異的にハイブリダイズすべきである。

従って、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびセラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）株は、融解曲線解析によって試験される他のすべての生物体から明白に識別することができる。

非セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種またはヒトゲノムＤＮＡでは関連シグナルは得られない。

２つのＨｙｂＰｒｏｂｅの好適な組は、配列番号２６または相同物および配列番号４４もしくは４５または相同物よりなる。

配列番号２６および４４もしくは４５よりなるＨｙｂＰｒｏｂｅのこの組は、高い感度でセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を検出することが可能である。

配列番号１２〜配列番号５７およびそれらの相同物のいずれかに対応する表４に列挙された各ポリヌクレオチドは、プライマーおよび／またはプローブとして、単独あるいは組み合わせで本発明の任意の方法において使用され得る。

ハイブリダイゼーション法にも基づく第２の実施態様は、Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ技術である。Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ（ＬｉＰＡ）は、いくらかのポリヌクレオチドプローブ（ネガティブまたはポジティブコントロールポリヌクレオチドを含む）を並列ラインとして簡便に適用することができるメンブランストリップを使用する逆ハイブリダイゼーション形式（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、（１９８９年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１６：６２３０−４）である。

ストイヴェラ（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら（（１９９３年）、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７４（Ｐｔ６）：１０９３−１０２）によって記載およびＥＰＢ０６３７３４２明細書におけるＬｉＰＡ技術は、迅速かつ使用し易いハイブリダイゼーション試験を提供する。結果は、増幅の開始後４時間以内に読み取ることができる。通常、非アイソトープ標識が増幅された産物に組み入れられる増幅、およびアルカリ変性後、増幅される産物は、メンブラン上のプローブと接触され、ハイブリダイゼーションは、約１〜１．５時間行われる。従って、形成されるハイブリッドは酵素手順によって検出され、紫〜褐色の沈殿物が目視で認められる。ＬｉＰＡ形式は、市販の走査デバイスと完全に適合可能であり、従って、結果の自動装置での解釈を可能にする。それらのすべての利点は、ＬｉＰＡ形式を、日常的施設におけるアプリケーションに適切にする。

ＬｉＰＡ形式は、種レベルであるが、また分類学的により高等または下等なレベルでの病原体の検出および／または同定のための有利なツールである。例えば、ＬｉＰＡストリップ上でのプローブ形状は、それらがセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）の完全な属を検出することができるか、あるいは属内の種（例えば、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）および／またはＳ．フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）など）を同定することができるか、あるいはいくつかの場合において、種内のサブタイプを検出することさえできるような様式で、選択することができる。

多数のプローブによってハイブリダイゼーションの結果を同時に生じさせる能力は、ＬｉＰＡ技術の別の利益である。多くの場合、プローブの特定の組み合わせによって得られる情報の量は、単一のプローブアッセイを使用して得られるデータよりもかなり多い。従って、最適化された組のプローブは、情報の最大化を可能にするため、メンブランストリップ上のプローブの選択は、最も重要である。

これらのプローブは、異なる局在でメンブランストリップに適用することができ、これらのプローブの少なくとも１つがポジティブである場合、結果はポジティブと解釈される。あるいは、これらのプローブは、同じ局在で混合物として適用し、ストリップ上のラインの数を減少することができる。ストリップをより簡潔にするかまたはストリップ上のプローブの総数を拡大することが可能であるためには、この減少は都合がよい。

もう１つのアプローチは、ＬｉＰＡ−ｓｔｒｉｐの製造手順をかなり簡便にすることができる縮重プローブである。

上記の特性によって、ＬｉＰＡシステムは、ハイブリダイゼーション法の効率的な形式とみなすことができ、ここで、いくらかの生物体は、サンプルにおいて同時に検出される必要がある。

しかし、異なるプローブが同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で使用される他の任意のハイブリダイゼーションアッセイは、上記の検出および／または選択方法に使用することができることが明らかであるべきである。例えば、標的核酸を固相支持体に固定化し、異なるプローブ（すべてが異なる標識をされている）の混合物を使用し、標的に対してハイブリダイズされるプローブのそれぞれについて異なる検出シグナルを生じさせることが可能であり得る。そして、今日では、異なる多くの支持体が利用可能である。

例として、ＬｉＰＡ形式を使用してサンプル中の１つもしくはそれ以上のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出のために従うべき手順は、以下のように概略される：
・第１に、必要であれば、サンプル中に存在する核酸を、増幅および／またはハイブリダイゼーションに利用可能にする。
・所望により、核酸を、１つもしくは別の標的増幅システムで増幅する。通常、増幅は、以後のハイブリダイゼーションシグナルを増強するために必要である。
・第３に、結局は、変性工程後、サンプル中に存在する核酸または得られる増幅された産物を、目的の生物体の検出を可能にする１つもしくはそれ以上のプローブが固定化されるＬｉＰＡストリップと接触させ、ハイブリダイゼーションを進行させる。
・最後に、結局は、洗浄工程を実施した後、簡便かつ適合性の検出システムを使用して、ハイブリッドを検出する。観察されるハイブリダイゼーションシグナルまたはパターンから、特に、生物学的サンプルにおいてスクリーニングされる１つもしくはいくらかの生物体の有無を推測することができる。

ｒＲＮＡスペーサーの保存されたフランキング領域、即ち、１６Ｓ遺伝子および２３Ｓ遺伝子に局在する普遍的プライマーを使用することができる。

いくつかのアプリケーションでは、サンプル中に存在する異なる細菌は増幅しないが、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種をより特異的に増幅することは適切であり得る。

サンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための本発明の方法は、以下の工程、
（ｉ）必要であれば、サンプル中に存在するポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
（ｉｉ）必要であれば、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、もしくはその一部を、少なくとも１つの適切なプライマー対で増幅する工程、
（ｉｉｉ）ポリ核酸を、配列番号１〜１１、もしくは前記配列番号１〜１１のＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、またはそれらの相補形態、または相同物、あるいはそれらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブと接触させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されるハイブリッドを検出する工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）において得られるディファレンシャルハイブリダイゼーションシグナルからサンプル中に存在する微生物を検出および／または同定する工程、を含んでなる。

増幅の工程において述べられるＩＴＳの部分は、標的配列を含んでなるポリヌクレオチド、または標的配列自体、配列番号１〜１１、もしくはそれらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）のいずれか、またはそれらの相補形態、あるいは任意の相同物、あるいはそれらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列である。

優先的に、本発明は、上記の方法を提供し、ここで、少なくとも２つの微生物が同時に検出される。本発明の好適な方法では、上記のプロセスの工程（ｉｉｉ）において、少なくとも２つのプローブの組が使用される。工程（ｉｉｉ）に記載のプローブのそのような組は、本発明の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つもしくはそれ以上のプローブを含んでなる。

好適なプローブは、配列番号１２〜５７のポリヌクレオチド、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、任意の相同物、およびそれらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントである。

本発明はまた、上記の方法を提供し、ここで、工程（ｉｉｉ）において詳記されるプローブは、同じサンプル中に存在し易い異なる病原性細菌の同時検出を可能にする優先的に１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域由来の別の微生物の少なくとも１つのプローブと接触される。

好適なプローブは、それらが、同時ハイブリダイゼーションのための組において使用することができるように、同じハイブリダイゼーション条件下で至適性能を達成するために設計され；これは、これらのプローブの有用性を高度に増加し、有意な時間および労働面での利得がもたらされる。

本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含有するキットもまた、本発明の目的である。

本発明のキットは以下の組成物を含んでなる：
・セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のために、配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、もしくはそれらの相補物、またはそれらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド；
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分。

好適なキットは以下を含んでなる：
・セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のために、配列番号１〜１１、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、それらの相補形態、もしくはそれらの相補物、またはそれらの少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドのフラグメントよりなる標的配列にハイブリダイズする、２５個未満のヌクレオチド、好ましくは、５個未満のヌクレオチドで相互に隣接する２つのＨｙｂＰｒｏｂｅの少なくとも１つの組；
・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分。

結論として、標的としてセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）ＩＴＳを使用して、異なる検出および／または同定方法において使用すべきプローブを設計することが可能である。

一方、リアルタイムＰＣＲ方法では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭシステムにおいて単一の融解ピークを発生する単一のＨｙｂＰｒｏｂｅの組（実施例４）を使用して、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、特に、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）、およびＳ．フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）を検出ならびに同定することが可能である。

一方、種特異的シグナルは、１つもしくはそれ以上の特定の種（実施例３におけるＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびＳ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ））に対する１つの特定の融解ピークの存在、または特定の種（実施例３における他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を参照のこと）に対して特異的であるＴｍでのピークの存在によって、得ることができる。

また、完全ＩＴＳ領域を配列決定し、それをここで与えられた参照配列と比較することは、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を検出および同定するための方法として使用することができる（実施例５）。

上記の説明または以下の実施例は、本明細書において具体的に開示される実施態様に本発明を限定するものと解釈されるべきではない。

以下の実施例では、それぞれ１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの保存された領域において設計されたプライマーを使用して、１６Ｓ−２３Ｓ内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を増幅した。

実施例１：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプロトコル
標準的な方法に従ってＤＮＡを調製し、約１０^４ゲノム等価物を増幅のための標的として使用した。

定量曲線および融解ピークが該サンプルに対して存在する場合、サンプルをポジティブとした。

プローブは、リアルタイム蛍光ＰＣＲ検出を可能にするＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭｖ１．２（ソフトウェアｖ４）においてＨｙｂＰｒｏｂｅとして稼動するように設計した。

１つのＨｙｂＰｒｏｂｅは、その３’末端においてフルオレセイン染料で標識する一方、隣接するＨｙｂＰｒｏｂｅは、その５’末端においてＬＣ−ｒｅｄ６４０またはＬＣ−ｒｅｄ７０５染料で標識した。

キットＬＣ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ（カタログ番号第３００３２４８または同第２２３９２７２）の製造者の指示に従って：
・精製、濃縮、およびインヒビターの非存在に関するＰＣＲに適切な任意のサンプル材料を使用することができる；
・プライマーは、それぞれ０．３〜１μＭの最終濃度であるべきである；
・それぞれ０．２μＭ、もしくはその二倍の最終濃度のＨｙｂＰｒｏｂｅ；
・ＭｇＣｌ_２の濃度は最適化すべきであり、１〜５ｍＭに変動し得る；
・ネガティブコントロールを稼動すべきである。

増幅および融解条件について、以後説明する。ＬＣソフトウェアバージョン４を使用した。定量化の設定値はＦ２／ｂａｃｋＦ１（サンプル）であった。基底値調整のために、計算モードを使用した。通過点（Ｃｔ）の計算は２次導関数の最大値に基づいた。融解ピークのための計算方法は、多項式であった。Ｔｍを算出するためにピーク面積を使用した。

実施例２：Ｈｙｂｐｒｏｂｅの異なる組
本実施例では、１つのＨｙｂＰｒｏｂｅは、その３’末端においてフルオレセイン染料で標識する一方、隣接するＨｙｂＰｒｏｂｅは、その５’末端においてＬＣ−ｒｅｄ６４０またはＬＣ−ｒｅｄ７０５染料で標識した。

実施例１と同じＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプロトコルを適用した。

異なるプローブの組み合わせを、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種および臨床に関連する他の細菌のゲノムＤＮＡを使用して評価した。好適なプローブの組み合わせのための第１の選択基準は：定量曲線およびニック（ｎｉｃ）融解ピークを生じる蛍光シグナルの質；同じＴｍにおけるセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および／またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出ならびに他の細菌との交差反応の欠如であった。

実施例３：Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびＳ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）を他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種から識別するためのＨｙｂＰｒｏｂｅ
配列番号２６および配列番号４４によって表されるＨｙｂＰｒｏｂｅを、実施例１に記載のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプロトコルにおいて使用した。第１（配列番号２６）をフルオレセイン標識し、第２（配列番号４４）をＬＣ−Ｒｅｄ６４０標識した。

実施例１に記載と同じＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプロトコルを適用し、使用したサンプルは、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）株を１つ含有した。５８℃で１つの特異的融解ピークを観察した。

このＨｙｂＰｒｏｂｅの組の感度を、４２株のＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）株（１０株は西欧由来、１０株は英国由来、１０株は南欧由来、１０株は米国由来、２株は日本由来）を使用して評価した。すべてのＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）株は、２０．６〜３１．０に変動するＣｔ値を伴う目視可能な定量曲線を有した。

試験したＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）株では、５８℃の融解ピーク（ＳＴＤＥＶＡ ０．２９℃）が観察され、このＨｙｂＰｒｏｂｅの組によりＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）について１００％の感度が示された。

特異性を試験するために、他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種および緊密な近接体を試験した。Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）株は、このＨｙｂＰｒｏｂｅの組ではＳ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）から識別することができず、該ＨｙｂＰｒｏｂｅの組は、後者の種について５８℃で同じ融解ピークを生じる。Ｓ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）の臨床関連性は極めて低いこと、およびこの種は臨床サンプルでは稀にしか見出されないことに留意すべきである。他のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種は、５５℃〜５６℃で融解ピークを有し、これによって、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から識別し得る。エルシニア・シュ−ドツベルクロ−シス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＹ．エンテロコリチカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）のような緊密に関係する種は、４６℃〜４７℃でより低い融解ピークを有した。

これらのセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種および緊密な近縁体の他に、大パネルの他の生物体を試験し（表３を参照のこと）、ヒトＤＮＡでさらなる実験を行った。試験したヒトＤＮＡも、また微生物も、任意の定量曲線または任意の融解ピークを示さなかった。

実施例４：セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種のためのＨｙｂＰｒｏｂｅ
それぞれ、１株のＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、１株のＳ．フィカリア（Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ）、１株のＳ．フォンチコラ（Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、１株のＳ．グリメッシィ（Ｓ．ｇｒｉｍｅｓｓｉ）および１株のＳ．プロテアマクランス（Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）を含有する５つのサンプルを試験した。

配列番号２０および配列番号３７によって表されるＨｙｂＰｒｏｂｅを、実施例１に記載のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭプロトコルにおいて使用した。

各株は、定量曲線を生じ、５６℃で１つの融解ピークが観察された。

エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種のような緊密に関連する属は、何ら定量曲線も融解ピークも生じなかったことから、使用したＨｙｂＰｒｏｂｅの組はセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種に特異的であることが示唆される。

実施例５：ＩＴＳヌクレオチド配列決定によるセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および同定
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の明確な徴候を伴わないが含有することが推測されるサンプルを受容した。

決定しようとする種のＩＴＳ領域を、１６Ｓおよび２３Ｓ領域に局在する普遍的プライマーを使用して増幅した。

アンプリコンをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、ＩＴＳヌクレオチド配列を、プラスミドベクターに局在するプライマーを使用するジデオキシチェーンターミネーティング化学に従って誘導した。

ｔＲＮＡ^ｇｌｕおよびｔＲＮＡ^{ｉｌｅ−ａｌａ}を含有する両方のスペーサーを見出した。

これらのＩＴＳ配列を配列解析に提出し、既に配列決定した他のスペーサーと比較した。

配列番号２によって表されるＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のタイプ−株由来のｔＲＮＡ^ｇｌｕスペーサーのコンセンサスヌクレオチド配列と比較する場合、同定しようとするサンプル由来のｔＲＮＡ^ｇｌｕスペーサーのヌクレオチド配列は、４０３塩基対のうち６塩基対が異なった（９８．５％相同性）。

配列番号４によって表されるＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のｔＲＮＡ^{ｉｌｅ−ａｌａ}スペーサーのコンセンサスヌクレオチド配列と比較する場合、このサンプル由来のｔＲＮＡ^{ｉｌｅ−ａｌａ}スペーサーのヌクレオチド配列は、４７１塩基対のうち１８塩基対が異なった（９６．２％相同性）。

高い程度の相同性を考慮すると、サンプルはＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を含有していたことが推察され得る。

Claims (6)

1. セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のためのポリヌクレオチドプローブの組であって、前記プローブが配列番号１〜１１、配列番号１〜１１に対して８０％より高い同一性を有するヌクレオチド配列、それらのＲＮＡ形態（ここで、ＴはＵに置き換えられる）、およびそれらの相補形態からなる群から選択される核酸に特異的にハイブリダイズし、ここで、前記ポリヌクレオチドプローブの組が、以下のポリヌクレオチドの組み合わせ：配列番号１９および３７、配列番号１９および３９、配列番号２０および３７、配列番号２０および３９、配列番号２４および４７、配列番号２５および４７、配列番号２５および４８、配列番号２２および４４、配列番号２６および４４、配列番号２６および４５、配列番号２６および４６、または配列番号２６および４９のいずれかよりなるものであり、前記プローブ間に２５個以下のヌクレオチドが存在する、組。
2. 以下のポリヌクレオチドの組み合わせ：配列番号１９および３７、配列番号２２および４４、配列番号２６および４４、または配列番号２６および４５のいずれかよりなる、請求項１に記載のポリヌクレオチドプローブの組。
3. 請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプローブの組の少なくとも１つを含んでなる組成物。
4. 請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプローブの組の少なくとも１つを使用するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のための方法。
5. （ｉ）所望により、サンプル中のポリ核酸を遊離、単離および／または濃縮する工程、
   （ｉｉ）所望により、少なくとも１つの適切なプライマー対で、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域、または請求項１に記載の任意の核酸分子を含んでなる標的配列を増幅する工程、
   （ｉｉｉ）ポリ核酸と、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプローブの組の少なくとも１つとを接触させる工程、
   （ｉｖ）形成されるハイブリダイズを検出すること、ならびに
   （ｖ）得られるシグナルを解釈し、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の存在を推察し、および／またはサンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種を同定する工程、
   を含んでなる、サンプル中のセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出ならびに／あるいは同定のための請求項４に記載の方法。
6. 以下の成分：
   ・請求項１または２に記載のポリヌクレオチドプローブの組の少なくとも１つ、
   ・ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分、
   を含んでなる、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出および／または同定のためのキット。