JPH08297A - バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ - Google Patents
バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブInfo
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- JPH08297A JPH08297A JP7151379A JP15137995A JPH08297A JP H08297 A JPH08297 A JP H08297A JP 7151379 A JP7151379 A JP 7151379A JP 15137995 A JP15137995 A JP 15137995A JP H08297 A JPH08297 A JP H08297A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、真正細菌に特徴的な核酸配列を増
幅し、続いて検出することに関する。 【構成】 本発明は、真正細菌の特徴的な核酸標的配列
の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関す
る。核酸標的配列の検出において用いられるオリゴヌク
レオチドプローブにも関する。プライマーおよびプロー
ブはキットに含めてもよい。
幅し、続いて検出することに関する。 【構成】 本発明は、真正細菌の特徴的な核酸標的配列
の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーに関す
る。核酸標的配列の検出において用いられるオリゴヌク
レオチドプローブにも関する。プライマーおよびプロー
ブはキットに含めてもよい。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、広義には、真正細菌に
特徴的な核酸配列を増幅し、続いて検出することに関す
る。
特徴的な核酸配列を増幅し、続いて検出することに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】敗血症は、血液中の病原性微生物の存在
および存続（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）に関連した全身
性疾患である。敗血症は、米国における１３番目の死因
であり、そして外科の集中治療ユニットにおける最も共
通の死因である。老人人口、脈管内装置の使用および免
疫日和見患者のために、１９８０年以来、敗血症の発生
率が１４０％に増加してきた。
および存続（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ）に関連した全身
性疾患である。敗血症は、米国における１３番目の死因
であり、そして外科の集中治療ユニットにおける最も共
通の死因である。老人人口、脈管内装置の使用および免
疫日和見患者のために、１９８０年以来、敗血症の発生
率が１４０％に増加してきた。
【０００３】敗血症検出のための現在の方法は臨床サン
プルからの生物の培養に基づく。血液を患者から採り、
培養培地にて培養し、そして検出可能な成長に関して１
日から７日観察する。別法として、臨床サンプルはしば
しば他の検出手段により評価され、グラム染色、生化学
分析、および顕微鏡形態学に関する純粋培養の単離等を
含む。これらの診断法は、臨床サンプル中の低い細胞数
により偽陰性の結果を被る。さらに、この疾患は治療す
るのが難しい。しばしば、阻止されなかった炎症性反応
が組織を破壊し始めた後に治療の関与が始まるため、患
者の器官不全を引き起こし、結局死に至らしめる。即
ち、敗血症のショックに関する信頼できる診断は、結果
を得るために短い時間で治療の効率を潜在的に増加さ
せ、そして患者の予後を改良することができた。
プルからの生物の培養に基づく。血液を患者から採り、
培養培地にて培養し、そして検出可能な成長に関して１
日から７日観察する。別法として、臨床サンプルはしば
しば他の検出手段により評価され、グラム染色、生化学
分析、および顕微鏡形態学に関する純粋培養の単離等を
含む。これらの診断法は、臨床サンプル中の低い細胞数
により偽陰性の結果を被る。さらに、この疾患は治療す
るのが難しい。しばしば、阻止されなかった炎症性反応
が組織を破壊し始めた後に治療の関与が始まるため、患
者の器官不全を引き起こし、結局死に至らしめる。即
ち、敗血症のショックに関する信頼できる診断は、結果
を得るために短い時間で治療の効率を潜在的に増加さ
せ、そして患者の予後を改良することができた。
【０００４】即ち、バクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡの保
存された領域に対応する莫大な核酸配列が同定され、そ
して敗血症に貢献するかまたは治療の関与が患者の予後
を改良してきたか否かを決定することに貢献する、バク
テリア生物の検出および同定に有用なオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびプローブとして記載されてきた。例
えば、バクテリアの溶菌工程の効率を決定するためにス
クリーニングするためのプローブがジョーンズ（Ｊｏｎ
ｅｓ，Ｃ．Ｌ．）ら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １８１，２３（１９８９）に報告され
ている。「パンプローブ」は、遺伝的に関連のない１２
の真正細菌種からの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を並べて高度
に保存された配列を同定するために開発された。
存された領域に対応する莫大な核酸配列が同定され、そ
して敗血症に貢献するかまたは治療の関与が患者の予後
を改良してきたか否かを決定することに貢献する、バク
テリア生物の検出および同定に有用なオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびプローブとして記載されてきた。例
えば、バクテリアの溶菌工程の効率を決定するためにス
クリーニングするためのプローブがジョーンズ（Ｊｏｎ
ｅｓ，Ｃ．Ｌ．）ら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １８１，２３（１９８９）に報告され
ている。「パンプローブ」は、遺伝的に関連のない１２
の真正細菌種からの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を並べて高度
に保存された配列を同定するために開発された。
【０００５】バクテリア検出のためのユニバーサルプロ
ーブおよびバクテリア核酸配列の増幅のためのプライマ
ーも、ＥＰ−Ａ−０４７９１１７（Ａ１）に開示されて
いる。２つのユニバーサルプローブが１６Ｓ ｒＲＮＡ
遺伝子の高度に保存された領域に対応するものとして開
示されている。２つのユニバーサルバクテリアプライマ
ーも開示されている。
ーブおよびバクテリア核酸配列の増幅のためのプライマ
ーも、ＥＰ−Ａ−０４７９１１７（Ａ１）に開示されて
いる。２つのユニバーサルプローブが１６Ｓ ｒＲＮＡ
遺伝子の高度に保存された領域に対応するものとして開
示されている。２つのユニバーサルバクテリアプライマ
ーも開示されている。
【０００６】１６Ｓ ｒＲＮＡに対するユニバーサルバ
クテリアプローブもＰＣＴ国際公開番号９０／１５１５
７号に開示されている。この国際公開は７つのバクテリ
アプローブも同定している。
クテリアプローブもＰＣＴ国際公開番号９０／１５１５
７号に開示されている。この国際公開は７つのバクテリ
アプローブも同定している。
【０００７】バクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡの高度に保
存された領域に相補的な他のバクテリア核酸プローブ
は、ＰＣＴ国際公開番号９１／００９２６号に開示され
ている。このプローブを用いてサンプル中の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡを検出し、そしてサンプル中の全バクテリア数の
見積もりに使用される公知の標準と比較される。
存された領域に相補的な他のバクテリア核酸プローブ
は、ＰＣＴ国際公開番号９１／００９２６号に開示され
ている。このプローブを用いてサンプル中の１６Ｓ ｒ
ＲＮＡを検出し、そしてサンプル中の全バクテリア数の
見積もりに使用される公知の標準と比較される。
【０００８】さらに５つのバクテリアＤＮＡがＰＣＴ国
際公開番号９０／０１５６０号に開示されている。
際公開番号９０／０１５６０号に開示されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】実際に選択可能な存在
する核酸増幅システムはポリメラーゼチェインリアクシ
ョン（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）で
あるから、上記プライマーを利用して５０塩基対以上の
長さの標的核酸配列を増幅する（即ち、プライマーは互
いに５０塩基対以上の標的配列とハイブリダイズす
る）。また、上記プローブは、したがって、５０塩基対
より長い標的配列を検出する。しかしながら、短い標的
配列（即ち、５０塩基対以下）は、プローブとのより特
異的なハイブリダイゼーションのため、および５０塩基
対より長い標的の増幅には現在効果的ではないが５０塩
基対以下の標的には極めて効果的な鎖置換増幅（Ｓｔｒ
ａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，
Ｇ．Ｔ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９，３９２（１９９２）を参照された
い）のような他の増幅システムにおける非有用性のた
め、より有利である。
する核酸増幅システムはポリメラーゼチェインリアクシ
ョン（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）で
あるから、上記プライマーを利用して５０塩基対以上の
長さの標的核酸配列を増幅する（即ち、プライマーは互
いに５０塩基対以上の標的配列とハイブリダイズす
る）。また、上記プローブは、したがって、５０塩基対
より長い標的配列を検出する。しかしながら、短い標的
配列（即ち、５０塩基対以下）は、プローブとのより特
異的なハイブリダイゼーションのため、および５０塩基
対より長い標的の増幅には現在効果的ではないが５０塩
基対以下の標的には極めて効果的な鎖置換増幅（Ｓｔｒ
ａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，
Ｇ．Ｔ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８９，３９２（１９９２）を参照された
い）のような他の増幅システムにおける非有用性のた
め、より有利である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】他の増幅技術例えばＳＤ
ＡにおけるようにＰＣＲに有用なオリゴヌクレオチドプ
ローブを提供するため、本発明は、真正細菌に特徴的な
核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライ
マーに関する。これらのプライマーは、配列番号１およ
び２を含み、そしてプライマーセットとして利用可能で
ある。本発明は配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプ
ローブにも関し、そして真正細菌に特徴的な核酸標的配
列の検出に使用される。
ＡにおけるようにＰＣＲに有用なオリゴヌクレオチドプ
ローブを提供するため、本発明は、真正細菌に特徴的な
核酸標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライ
マーに関する。これらのプライマーは、配列番号１およ
び２を含み、そしてプライマーセットとして利用可能で
ある。本発明は配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプ
ローブにも関し、そして真正細菌に特徴的な核酸標的配
列の検出に使用される。
【００１１】プライマーセットおよびプローブは、真正
細菌に特徴的な核酸標的配列の在否の決定に関する方法
に使用することもできるが、その際、核酸配列増幅法は
プライマーセットを用いて実施され、そして核酸標的配
列の存否はそれに対するプローブのハイブリダイゼーシ
ョンまたはハイブリダイゼーションの欠如により決定さ
れる。本発明の方法を実施者にとって便利なようにする
ため、本発明は、本発明のプライマーセットおよびプロ
ーブを含むキットも包含する。
細菌に特徴的な核酸標的配列の在否の決定に関する方法
に使用することもできるが、その際、核酸配列増幅法は
プライマーセットを用いて実施され、そして核酸標的配
列の存否はそれに対するプローブのハイブリダイゼーシ
ョンまたはハイブリダイゼーションの欠如により決定さ
れる。本発明の方法を実施者にとって便利なようにする
ため、本発明は、本発明のプライマーセットおよびプロ
ーブを含むキットも包含する。
【００１２】本発明の理解の手助けのために、本明細書
にて用いられる以下の単語は以下の意味を有する。
にて用いられる以下の単語は以下の意味を有する。
【００１３】「プローブ」は、標的核酸配列へのプロー
ブのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド配列を含
むオリゴヌクレオチドであり、合成によるかまたは生物
学的に製造される。それらのハイブリダイゼーション特
性に加えて、プローブは特定の分析条件下でそれらの正
確で適切な機能に関わる特定の構成物も含む。そのよう
な修飾は、ハイブリダイゼーション分析において標的生
物と非標的生物を便利に識別する能力である基本的なプ
ローブの機能に基づいた精巧さである。
ブのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド配列を含
むオリゴヌクレオチドであり、合成によるかまたは生物
学的に製造される。それらのハイブリダイゼーション特
性に加えて、プローブは特定の分析条件下でそれらの正
確で適切な機能に関わる特定の構成物も含む。そのよう
な修飾は、ハイブリダイゼーション分析において標的生
物と非標的生物を便利に識別する能力である基本的なプ
ローブの機能に基づいた精巧さである。
【００１４】「プライマー」は、標的核酸配列のあるセ
クションへのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド
配列をデザインまたは選択により含む、合成によるかま
たは生物学的に生産されたオリゴヌクレオチドである。
プライマーは、ポリメラーゼまたは同様な酵素により伸
長合成されて完全な標的核酸配列にハイブリダイズする
ことができる。プライマーは核酸配列増幅法、例えばポ
リメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ）および鎖
置換増幅（ＳＤＡ）において利用される。特定のプライ
マー、特にＳＤＡ技術において有用なものは、標的核酸
にハイブリダイズ可能な配列に加えて、制限エンドヌク
レアーゼの認識配列、およびポリメラーゼまたはポリメ
ラーゼ様活性を継続する他の酵素がそれ自身その鋳型特
異的オリゴヌクレオチド合成の開始を指示するための任
意の配列を含む。
クションへのハイブリダイズを許す特異的ヌクレオチド
配列をデザインまたは選択により含む、合成によるかま
たは生物学的に生産されたオリゴヌクレオチドである。
プライマーは、ポリメラーゼまたは同様な酵素により伸
長合成されて完全な標的核酸配列にハイブリダイズする
ことができる。プライマーは核酸配列増幅法、例えばポ
リメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ）および鎖
置換増幅（ＳＤＡ）において利用される。特定のプライ
マー、特にＳＤＡ技術において有用なものは、標的核酸
にハイブリダイズ可能な配列に加えて、制限エンドヌク
レアーゼの認識配列、およびポリメラーゼまたはポリメ
ラーゼ様活性を継続する他の酵素がそれ自身その鋳型特
異的オリゴヌクレオチド合成の開始を指示するための任
意の配列を含む。
【００１５】「ハイブリダイゼーション」は、予め決定
された反応条件下にて部分的または完全に相補的な核酸
鎖が逆平行（アンチパラレル）様式にて向かい合うよう
にして、特異的かつ安定な水素結合により二本鎖の核酸
を形成する工程である。
された反応条件下にて部分的または完全に相補的な核酸
鎖が逆平行（アンチパラレル）様式にて向かい合うよう
にして、特異的かつ安定な水素結合により二本鎖の核酸
を形成する工程である。
【００１６】上記のとおり、本発明は、真正細菌に特徴
的な核酸標的配列の在否を決定するために有用なオリゴ
ヌクレオチドプライマーおよびプローブに関する。その
ような決定を行うための方法は、増幅工程、続いて、増
幅された標的核酸配列にプローブをハイブリダイズする
ことを含む。本発明のプライマーは真正細菌の１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の高度に保存された配列に特異的である。
本発明のプローブはプライマー増幅産物内の内部コンセ
ンサス配列に特異的である。
的な核酸標的配列の在否を決定するために有用なオリゴ
ヌクレオチドプライマーおよびプローブに関する。その
ような決定を行うための方法は、増幅工程、続いて、増
幅された標的核酸配列にプローブをハイブリダイズする
ことを含む。本発明のプライマーは真正細菌の１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子の高度に保存された配列に特異的である。
本発明のプローブはプライマー増幅産物内の内部コンセ
ンサス配列に特異的である。
【００１７】バクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡはその構造
内に高度に保存された配列を有することが知られてい
る。ノラー（Ｎｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．）およびボエス
（Ｗｏｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２，
４０３（１９８１）；ペース（Ｐａｃｅ，Ｎ．Ｒ．），
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．３７，５６２（１９７
３）；およびウエス（Ｗｏｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．）ら，Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７，６２１（１９８３）を
参照されたい。したがって、本発明のプライマーを開発
するために、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）により同
定されたエシェリヒアコリ、バクテロイデスフラジリ
ス、ナイセリアゴノロエ、スタフィロコッカスアウリウ
ス、エンテロコッカスおよびリステリアモノサイトゲネ
スの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、マ
ッキントッシュジーンワークのソフトウエア（インテレ
ンジェネティックス）により並べた。これら１６Ｓ ｒ
ＲＮＡを、次に同じソフトウエアにより高度に保存され
た配列に関して評価した。印をつけた位置の数字はエシ
ェリヒアコリの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づいた。
内に高度に保存された配列を有することが知られてい
る。ノラー（Ｎｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．）およびボエス
（Ｗｏｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１２，
４０３（１９８１）；ペース（Ｐａｃｅ，Ｎ．Ｒ．），
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．３７，５６２（１９７
３）；およびウエス（Ｗｏｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．）ら，Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４７，６２１（１９８３）を
参照されたい。したがって、本発明のプライマーを開発
するために、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）により同
定されたエシェリヒアコリ、バクテロイデスフラジリ
ス、ナイセリアゴノロエ、スタフィロコッカスアウリウ
ス、エンテロコッカスおよびリステリアモノサイトゲネ
スの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、マ
ッキントッシュジーンワークのソフトウエア（インテレ
ンジェネティックス）により並べた。これら１６Ｓ ｒ
ＲＮＡを、次に同じソフトウエアにより高度に保存され
た配列に関して評価した。印をつけた位置の数字はエシ
ェリヒアコリの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に基づいた。
【００１８】この技術を用いて、２つのプライマーを開
発した：（１）配列番号１からなりヌクレオチド番号８
８１から８９３のエシェリヒアコリ配列のセンス鎖に対
応するプライマー１６Ｓ ８９５；および（２）配列番
号２からなりヌクレオチド番号９４７から９６０のエシ
ェリヒアコリ配列のアンチセンス鎖に対応するプライマ
ー１６Ｓ ９４７。プライマー１６Ｓ ８９５および１
６Ｓ ９４７を用いて増幅された標的核酸配列の検出用
プローブはエシェリヒアコリのアンチセンス鎖を含み、
ヌクレオチド番号９０６から９２４に位置し、そして配
列番号３と称される。
発した：（１）配列番号１からなりヌクレオチド番号８
８１から８９３のエシェリヒアコリ配列のセンス鎖に対
応するプライマー１６Ｓ ８９５；および（２）配列番
号２からなりヌクレオチド番号９４７から９６０のエシ
ェリヒアコリ配列のアンチセンス鎖に対応するプライマ
ー１６Ｓ ９４７。プライマー１６Ｓ ８９５および１
６Ｓ ９４７を用いて増幅された標的核酸配列の検出用
プローブはエシェリヒアコリのアンチセンス鎖を含み、
ヌクレオチド番号９０６から９２４に位置し、そして配
列番号３と称される。
【００１９】次に、本発明のプライマーおよびプローブ
は、カリフォルニアのフォスターシティのアプライドバ
イオシステムズのアプライドバイオシステムズ３８０Ｂ
自動合成機を用いて、シアノメチルホスホアミダイト化
学により指示書のとおりに合成した。プライマーおよび
プローブは５０℃にて一晩脱保護し、そして指示書のと
おりにバイオラッド電気溶出機上でポリアクリルアミド
電気泳動により精製した。これらの技術はウオーカー
（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０，１６９１（１９９２）に明記されている
とおり、当業界には知られている。
は、カリフォルニアのフォスターシティのアプライドバ
イオシステムズのアプライドバイオシステムズ３８０Ｂ
自動合成機を用いて、シアノメチルホスホアミダイト化
学により指示書のとおりに合成した。プライマーおよび
プローブは５０℃にて一晩脱保護し、そして指示書のと
おりにバイオラッド電気溶出機上でポリアクリルアミド
電気泳動により精製した。これらの技術はウオーカー
（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０，１６９１（１９９２）に明記されている
とおり、当業界には知られている。
【００２０】本発明のプライマーおよびプローブは、次
にＰＣＲ増幅法にて利用され、さまざまなゲノミックバ
クテリアＤＮＡ調製物を用いたＳＤＡ法に供される。こ
れらの増幅法にて利用されたバクテリアの株は以下の表
１に示される。
にＰＣＲ増幅法にて利用され、さまざまなゲノミックバ
クテリアＤＮＡ調製物を用いたＳＤＡ法に供される。こ
れらの増幅法にて利用されたバクテリアの株は以下の表
１に示される。
【００２１】
【表１】 バクテリア ＡＴＣＣ番号 スタフィロコッカスアウリウス ２５９２３ シュードモナスエルギノサ ２７８５３ コリネバクテリウムゼロシス ３７３ エシェリヒアコリ １１７７５ クレブシエラニューモニエ １３８８３ セラティアマルセンセンス ８１００ モルガネラモルガニ ２５８３０ モラクセラオスロエンシス ９２８１ ヘモフィルスインフルエンザ ３３５３３ ストレプトコッカスニューモニエ ６３０３ エンテロバクターエロゲネス １３０４８ ナイセリアゴノロエ １９４２４ アシネトバクタールボフィ １９００１ ユーバクテリウムレンタム ４３０５５ プロテウスブルガリス １３３１５ ストレプトコッカスフェーカリス ２９２１２ ストレプトコッカスピオゲネス １９６１５ リステリアモノサイトゲネス ７６４４ 上記バクテリアからのゲノミックＤＮＡはＣｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，グリーネ出版（Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）お
よびワイリーー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨークに記載されて
いるとおりに調製した。
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，グリーネ出版（Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）お
よびワイリーー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨークに記載されて
いるとおりに調製した。
【００２２】バクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の標
的配列のＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅法は、高温安定性酵素を利用した自動化法と
してその最も好ましい態様にて実施された。この方法に
おいて、反応混合物は、変性工程、プライマーアニーリ
ング工程、および合成工程を循環した。高温安定性酵素
を伴う使用に特別に適合させたＤＮＡ温度循環器（パー
キン−エルマー）を利用した。
的配列のＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅法は、高温安定性酵素を利用した自動化法と
してその最も好ましい態様にて実施された。この方法に
おいて、反応混合物は、変性工程、プライマーアニーリ
ング工程、および合成工程を循環した。高温安定性酵素
を伴う使用に特別に適合させたＤＮＡ温度循環器（パー
キン−エルマー）を利用した。
【００２３】本発明のプライマー（配列番号１を含むも
の、および配列番号２を含むもの）は、上記の１８バク
テリア種のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、且つひとつの
非バクテリアゲノミックＤＮＡをさらに別の鋳型として
用いたＰＣＲ増幅法にて評価された。非バクテリアゲノ
ミックＤＮＡはカンジダアービカンス（ＡＴＣＣ４４８
０８）のＤＮＡであった。この菌類のゲノミックＤＮＡ
も、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているとおり
に調製した。
の、および配列番号２を含むもの）は、上記の１８バク
テリア種のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、且つひとつの
非バクテリアゲノミックＤＮＡをさらに別の鋳型として
用いたＰＣＲ増幅法にて評価された。非バクテリアゲノ
ミックＤＮＡはカンジダアービカンス（ＡＴＣＣ４４８
０８）のＤＮＡであった。この菌類のゲノミックＤＮＡ
も、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているとおり
に調製した。
【００２４】各ＰＣＲ増幅法は、１００ｎｇのゲノミッ
クバクテリアＤＮＡまたは菌類ＤＮＡ、１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．
５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、
２００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐおよび２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（配列番号１お
よび配列番号２を含む）を含む５０μｌの反応物として
実施した。この反応物をミネラルオイル上に重層して９
５℃にて５分間加熱することにより標的ＤＮＡを変性さ
せ、続いて１．２ユニットのアンプリタック（Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ（商標名））ポリメラーゼ（パーキン−エルマ
ーシータス）を加えた。増幅のパラメーターは、９４℃
にて１分、３７℃にて１分、７２℃にて２分を３０回繰
り返し、続いて４℃に浸けた。増幅された産物の検出は
１×ＴＢＥ中の１．５％アガロースゲル上で測定した。
クバクテリアＤＮＡまたは菌類ＤＮＡ、１０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．
５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、
２００μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐおよび２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（配列番号１お
よび配列番号２を含む）を含む５０μｌの反応物として
実施した。この反応物をミネラルオイル上に重層して９
５℃にて５分間加熱することにより標的ＤＮＡを変性さ
せ、続いて１．２ユニットのアンプリタック（Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ（商標名））ポリメラーゼ（パーキン−エルマ
ーシータス）を加えた。増幅のパラメーターは、９４℃
にて１分、３７℃にて１分、７２℃にて２分を３０回繰
り返し、続いて４℃に浸けた。増幅された産物の検出は
１×ＴＢＥ中の１．５％アガロースゲル上で測定した。
【００２５】このＰＣＲ法の結果は、カンジダアービカ
ンスと交差反応性をもたないことが調べられている１８
すべてのバクテリアに関する７９塩基対の断片の増幅を
示した。しかしながら、ナイセリアゴノロエの７９塩基
対の増幅はバックグラウンドと同じほどの弱いシグナル
を示した。
ンスと交差反応性をもたないことが調べられている１８
すべてのバクテリアに関する７９塩基対の断片の増幅を
示した。しかしながら、ナイセリアゴノロエの７９塩基
対の増幅はバックグラウンドと同じほどの弱いシグナル
を示した。
【００２６】ナイセリアゴノロエの増幅産物の配列分析
は、１６Ｓ ９４７プライマー（配列番号２）のヌクレ
オチド番号９４７から９５４における２つのミスマッチ
を明らかにした。したがって、ＳＤＡ法における使用の
ための１６Ｓ ９４７プライマーは、それら２つのミス
マッチのひとつ（即ち、９４７番目におけるミスマッ
チ）を除くようにデザインされた。この除去の選択は、
そのミスマッチがプライマーの５’末端に存在し、他方
のミスマッチがプライマーのほぼ中央に存在することに
よった。したがって、ＳＤＡ１６Ｓ ９４７プライマー
（配列番号４を含む）は、それら２つのミスマッチの一
つを除くために１塩基対のシフトのみを必要とする。ま
た、他方のミスマッチ（９５４番目）は最も保存された
ヌクレオチド（Ｔ）であった。
は、１６Ｓ ９４７プライマー（配列番号２）のヌクレ
オチド番号９４７から９５４における２つのミスマッチ
を明らかにした。したがって、ＳＤＡ法における使用の
ための１６Ｓ ９４７プライマーは、それら２つのミス
マッチのひとつ（即ち、９４７番目におけるミスマッ
チ）を除くようにデザインされた。この除去の選択は、
そのミスマッチがプライマーの５’末端に存在し、他方
のミスマッチがプライマーのほぼ中央に存在することに
よった。したがって、ＳＤＡ１６Ｓ ９４７プライマー
（配列番号４を含む）は、それら２つのミスマッチの一
つを除くために１塩基対のシフトのみを必要とする。ま
た、他方のミスマッチ（９５４番目）は最も保存された
ヌクレオチド（Ｔ）であった。
【００２７】バクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の標的
配列のＳＤＡ増幅 鎖置換増幅（ＳＤＡ）は恒温核酸増幅法であり、プライ
マーの伸長合成、一本鎖伸長合成産物の置換、伸長合成
産物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリ
ング、および続くプライマーの伸長合成が反応混合物中
で、連続して起こる。これは、反応物の温度の束縛の結
果として別の相またはサイクルにて反応工程が起こるＰ
ＣＲとは対照的である。ＳＤＡは、（１）ヘミホスホロ
チオエート形態の二本鎖認識部位の被修飾鎖にニックを
入れる制限エンドヌクレアーゼの能力、および（２）該
ニックから複製を開始して下流の非鋳型鎖を置換する特
定のポリメラーゼの能力に基づく。
配列のＳＤＡ増幅 鎖置換増幅（ＳＤＡ）は恒温核酸増幅法であり、プライ
マーの伸長合成、一本鎖伸長合成産物の置換、伸長合成
産物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリ
ング、および続くプライマーの伸長合成が反応混合物中
で、連続して起こる。これは、反応物の温度の束縛の結
果として別の相またはサイクルにて反応工程が起こるＰ
ＣＲとは対照的である。ＳＤＡは、（１）ヘミホスホロ
チオエート形態の二本鎖認識部位の被修飾鎖にニックを
入れる制限エンドヌクレアーゼの能力、および（２）該
ニックから複製を開始して下流の非鋳型鎖を置換する特
定のポリメラーゼの能力に基づく。
【００２８】プライマーのアニーリングのために二本鎖
標的核酸配列を変性するための高温（約９５℃）におけ
る最初のインキュベーションの後、新たに合成された鎖
の引き続く合成および置換は常温（通常は約３７℃）に
て起こる。標的配列の新たなコピーの各々の生産は、以
下の５工程：（１）元の標的配列または予め合成された
置換一本鎖伸長合成産物への増幅プライマーの結合、
（２）エキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ-）クレノーポ
リメラーゼによりα−チオデオキシヌクレオチド３リン
酸を取り込むプライマーの伸長合成、（３）ヘミホスホ
ロチオエート化された二本鎖の制限部位のニッキング、
（４）ニック部位からの制限酵素の解離、および（５）
非鋳型鎖の下流の置換を伴うｅｘｏ-クレノーによるニ
ックの３’末端からの伸長合成からなる。ニックからの
伸長合成は別のニック可能な制限部位を生じるので、ニ
ッキング、合成（重合）および置換は常温にて共同して
連続的に起こる。
標的核酸配列を変性するための高温（約９５℃）におけ
る最初のインキュベーションの後、新たに合成された鎖
の引き続く合成および置換は常温（通常は約３７℃）に
て起こる。標的配列の新たなコピーの各々の生産は、以
下の５工程：（１）元の標的配列または予め合成された
置換一本鎖伸長合成産物への増幅プライマーの結合、
（２）エキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ-）クレノーポ
リメラーゼによりα−チオデオキシヌクレオチド３リン
酸を取り込むプライマーの伸長合成、（３）ヘミホスホ
ロチオエート化された二本鎖の制限部位のニッキング、
（４）ニック部位からの制限酵素の解離、および（５）
非鋳型鎖の下流の置換を伴うｅｘｏ-クレノーによるニ
ックの３’末端からの伸長合成からなる。ニックからの
伸長合成は別のニック可能な制限部位を生じるので、ニ
ッキング、合成（重合）および置換は常温にて共同して
連続的に起こる。
【００２９】二本鎖標的配列の両方にハイブリダイズす
るプライマーを用いる場合、増幅は対数的であり、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖は次のラウンドの増幅におい
て反対のプライマーの鋳型となる。ＳＤＡは、ウオーカ
ー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９２２ａ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９
２−３９６および１９２２ｂ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒ
ｅｓ．２０，１６９１−１６９６）により記載されてい
る。α−チオｄＮＴＰを導入した場合に二本鎖認識部位
にてニックを入れる制限酵素の例は、ＨｉｎｃＩＩ，Ｈ
ｉｎｄＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩで
ある。これらの制限酵素および必要なニッキング活性を
示す他の酵素のすべてがＳＤＡにおける使用に適してい
る。ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）らの上記文献の開示は
引用により本明細書の一部をなすが、ＳＤＡ法の詳細は
以下の実施例において見いだされる。
るプライマーを用いる場合、増幅は対数的であり、セン
ス鎖およびアンチセンス鎖は次のラウンドの増幅におい
て反対のプライマーの鋳型となる。ＳＤＡは、ウオーカ
ー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９２２ａ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９
２−３９６および１９２２ｂ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒ
ｅｓ．２０，１６９１−１６９６）により記載されてい
る。α−チオｄＮＴＰを導入した場合に二本鎖認識部位
にてニックを入れる制限酵素の例は、ＨｉｎｃＩＩ，Ｈ
ｉｎｄＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよびＦｎｕ４ＨＩで
ある。これらの制限酵素および必要なニッキング活性を
示す他の酵素のすべてがＳＤＡにおける使用に適してい
る。ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）らの上記文献の開示は
引用により本明細書の一部をなすが、ＳＤＡ法の詳細は
以下の実施例において見いだされる。
【００３０】ＳＤＡによる増幅の標的はエンドヌクレア
ーゼを用いた制限により大きな核酸を断片化することに
より調製される。しかしながら、標的核酸は、標的生成
工程の使用を通したＳＤＡの前にこの制限工程を用いず
に増幅されるのが最も好ましい。上記ウオーカー（Ｗａ
ｌｋｅｒ）ら１９２２ｂを参照されたい。この標的生成
の概要も、米国特許出願番号０７／７９４，３９９（１
９９１年１１月１９日出願）に記載されており、その開
示は引用により本明細書の一部をなす。ＳＤＡにより増
幅可能な標的配列を生成するためのこの方法は、標的配
列を含む二本鎖核酸を熱変性し、そして標的配列に対す
る４つのプライマーにハイブリダイズさせることよりな
る。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）は以下に記載さ
れるとおりＳＤＡ増幅プライマーであり、３’末端近傍
の標的結合配列および該標的結合配列の５’の制限酵素
認識部位を有する。両増幅プライマーを用いる場合、増
幅は対数的であるが、しかしながら、増幅プライマー一
方のみの使用は標的配列の直鎖状増幅をもたらす。他の
２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）は以下に記載される
とおり任意のプライマーであり、標的結合配列のみから
なる。Ｓ1およびＳ2は標的配列周辺の二本鎖核酸の反対
の鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2はＳ1およびＳ2の５’
（即ち、上流）の標的配列に結合する。次に、エキソヌ
クレアーゼ欠損クレノーポリメラーゼ（ｅｘｏ-クレノ
ーポリメラーゼ）を用いて、３種類のデオキシヌクレオ
シド３リン酸および１種類の修飾されたデオキシヌクレ
オシド３リン酸（例えば、デオキシアデノシン５’−
［α−チオ］３リン酸 ｄＡＴＰ［αＳ］）の存在下
で、４つのプライマーから同時に伸長合成する。Ｓ1お
よびＳ2の伸長合成は２つの伸長合成産物Ｓ1−ｅｘｔお
よびＳ2−ｅｘｔを生じる。Ｂ1およびＢ2の伸長合成
は、元の標的配列の鋳型からのＳ1およびＳ2伸長合成産
物の下流の置換をもたらす。置換された一本鎖Ｓ1伸長
合成産物はＳ2とＢ2の結合のための標的として働く。同
様に、置換された一本鎖Ｓ2伸長合成産物はＳ1とＢ1の
結合のための標的として働く。次に、４つすべてのプラ
イマーをＳ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔ鋳型上で伸長合
成して、前のように任意プライマーの伸長合成により置
換される第２の対の伸長合成産物を生じる。これらの置
換された伸長合成産物上での相補的増幅プライマーの結
合および伸長合成は相補鎖の合成をもたらす。これは、
ＳＤＡによる増幅に適した、各末端にヘミ修飾された
（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ：二本鎖の一方の鎖のみが
修飾されている）制限酵素認識部位を有する２つの二本
鎖核酸断片を生じる。Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔに
ハイブリダイズした任意プライマーの伸長合成物は、一
方の末端のみにヘミ修飾された制限酵素認識部位を有す
る２つの大きな二本鎖断片を形成する。ＳＤＡにおける
ように、標的生成反応の各々の工程は共同して連続的に
起こり、ＳＤＡにおける制限酵素によるニッキングのた
めの、必要な認識部位を両末端に有する標的配列を生じ
る。ＳＤＡ反応のすべての成分はすでに標的生成反応に
おいて存在するので、生成した標的配列は自動的かつ連
続的にＳＤＡサイクルに入り、そして増幅される。この
工程は、ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．）ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，
３９２（１９９２）により、当業者にはよく知られてい
る。
ーゼを用いた制限により大きな核酸を断片化することに
より調製される。しかしながら、標的核酸は、標的生成
工程の使用を通したＳＤＡの前にこの制限工程を用いず
に増幅されるのが最も好ましい。上記ウオーカー（Ｗａ
ｌｋｅｒ）ら１９２２ｂを参照されたい。この標的生成
の概要も、米国特許出願番号０７／７９４，３９９（１
９９１年１１月１９日出願）に記載されており、その開
示は引用により本明細書の一部をなす。ＳＤＡにより増
幅可能な標的配列を生成するためのこの方法は、標的配
列を含む二本鎖核酸を熱変性し、そして標的配列に対す
る４つのプライマーにハイブリダイズさせることよりな
る。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）は以下に記載さ
れるとおりＳＤＡ増幅プライマーであり、３’末端近傍
の標的結合配列および該標的結合配列の５’の制限酵素
認識部位を有する。両増幅プライマーを用いる場合、増
幅は対数的であるが、しかしながら、増幅プライマー一
方のみの使用は標的配列の直鎖状増幅をもたらす。他の
２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）は以下に記載される
とおり任意のプライマーであり、標的結合配列のみから
なる。Ｓ1およびＳ2は標的配列周辺の二本鎖核酸の反対
の鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2はＳ1およびＳ2の５’
（即ち、上流）の標的配列に結合する。次に、エキソヌ
クレアーゼ欠損クレノーポリメラーゼ（ｅｘｏ-クレノ
ーポリメラーゼ）を用いて、３種類のデオキシヌクレオ
シド３リン酸および１種類の修飾されたデオキシヌクレ
オシド３リン酸（例えば、デオキシアデノシン５’−
［α−チオ］３リン酸 ｄＡＴＰ［αＳ］）の存在下
で、４つのプライマーから同時に伸長合成する。Ｓ1お
よびＳ2の伸長合成は２つの伸長合成産物Ｓ1−ｅｘｔお
よびＳ2−ｅｘｔを生じる。Ｂ1およびＢ2の伸長合成
は、元の標的配列の鋳型からのＳ1およびＳ2伸長合成産
物の下流の置換をもたらす。置換された一本鎖Ｓ1伸長
合成産物はＳ2とＢ2の結合のための標的として働く。同
様に、置換された一本鎖Ｓ2伸長合成産物はＳ1とＢ1の
結合のための標的として働く。次に、４つすべてのプラ
イマーをＳ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔ鋳型上で伸長合
成して、前のように任意プライマーの伸長合成により置
換される第２の対の伸長合成産物を生じる。これらの置
換された伸長合成産物上での相補的増幅プライマーの結
合および伸長合成は相補鎖の合成をもたらす。これは、
ＳＤＡによる増幅に適した、各末端にヘミ修飾された
（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ：二本鎖の一方の鎖のみが
修飾されている）制限酵素認識部位を有する２つの二本
鎖核酸断片を生じる。Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔに
ハイブリダイズした任意プライマーの伸長合成物は、一
方の末端のみにヘミ修飾された制限酵素認識部位を有す
る２つの大きな二本鎖断片を形成する。ＳＤＡにおける
ように、標的生成反応の各々の工程は共同して連続的に
起こり、ＳＤＡにおける制限酵素によるニッキングのた
めの、必要な認識部位を両末端に有する標的配列を生じ
る。ＳＤＡ反応のすべての成分はすでに標的生成反応に
おいて存在するので、生成した標的配列は自動的かつ連
続的にＳＤＡサイクルに入り、そして増幅される。この
工程は、ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．）ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，
３９２（１９９２）により、当業者にはよく知られてい
る。
【００３１】ＳＤＡ増幅プライマーを用いて表１の以下
の生物の標的ゲノミックＤＮＡ６ｎｇ（１×１０6ゲノ
ム）を評価した：リステリアモノサイトゲネス、ユーバ
クテリウムレンタム、ストレプトコッカスピオゲネス、
クレブシエラニューモニエ、ヘモフィルスインフルエン
ザ、ナイセリアゴノロエ、スタフィロコッカスアウリウ
ス、コリネバクテリウムゼロシス、シュードモナスエル
ギノサおよびエシェリヒアコリ。ＰＣＲ法を用いるよう
に、カンジダアービカンスのゲノミックＤＮＡ６ｎｇ
（１×１０6ゲノム）もプロトコルに含めた。
の生物の標的ゲノミックＤＮＡ６ｎｇ（１×１０6ゲノ
ム）を評価した：リステリアモノサイトゲネス、ユーバ
クテリウムレンタム、ストレプトコッカスピオゲネス、
クレブシエラニューモニエ、ヘモフィルスインフルエン
ザ、ナイセリアゴノロエ、スタフィロコッカスアウリウ
ス、コリネバクテリウムゼロシス、シュードモナスエル
ギノサおよびエシェリヒアコリ。ＰＣＲ法を用いるよう
に、カンジダアービカンスのゲノミックＤＮＡ６ｎｇ
（１×１０6ゲノム）もプロトコルに含めた。
【００３２】
【実施例】各ＳＤＡ反応物は、６ｎｇの標的ＤＮＡ、１
０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、５０ｍＭ ＫiＰＯ4（ｐＨ
７．４）、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アル
ブミン、７ｍＭ ＭｇＣｌ2、２３％のグリセロール、
０．２ｍＭの各ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，チオ−ｄＡＴＰお
よび０．５ｍＭのｄＵＴＰ、５００ｎＭの１６Ｓ８９５
プライマー（配列番号１プラスＨｉｎｃＩＩ制限部位お
よび付加的ヌクレオチドを含むＳ１プライマーであり、
このプライマーは配列番号７を示す）および修飾された
１６Ｓ９４７プライマー（即ち、９４７番目のＧの除
去）（配列番号４プラスＨｉｎｃＩＩ制限部位および付
加的ヌクレオチドを含むＳ２プライマーであり、このプ
ライマーは配列番号８を示す）からなった。各反応物に
は、増幅のための鋳型の創造の手助けに用いられる任意
のプライマー（配列番号５を含むＢ１プライマー；配列
番号６を含むＢ２プライマー）も含まれる。これらの目
的および技術は、ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．
Ｔ．）ら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０，１６９１
（１９９２）のような文献により、当業者には公知であ
る。
０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、５０ｍＭ ＫiＰＯ4（ｐＨ
７．４）、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アル
ブミン、７ｍＭ ＭｇＣｌ2、２３％のグリセロール、
０．２ｍＭの各ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，チオ−ｄＡＴＰお
よび０．５ｍＭのｄＵＴＰ、５００ｎＭの１６Ｓ８９５
プライマー（配列番号１プラスＨｉｎｃＩＩ制限部位お
よび付加的ヌクレオチドを含むＳ１プライマーであり、
このプライマーは配列番号７を示す）および修飾された
１６Ｓ９４７プライマー（即ち、９４７番目のＧの除
去）（配列番号４プラスＨｉｎｃＩＩ制限部位および付
加的ヌクレオチドを含むＳ２プライマーであり、このプ
ライマーは配列番号８を示す）からなった。各反応物に
は、増幅のための鋳型の創造の手助けに用いられる任意
のプライマー（配列番号５を含むＢ１プライマー；配列
番号６を含むＢ２プライマー）も含まれる。これらの目
的および技術は、ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．
Ｔ．）ら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０，１６９１
（１９９２）のような文献により、当業者には公知であ
る。
【００３３】反応物を９５℃において３分間インキュベ
ートし、そして４０℃において２分間おいた。次に、１
５０ユニットのＨｉｎｃＩＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）および２ユニッ
トのｅｘｏ-クレノーポリメラーゼ（ＵＳＢ社）を各反
応物に加えて、４０℃において２時間増幅をさせた。反
応は９５℃において３分間加熱することにより停止し
た。ＳＤＡ法に含まれる技術のより詳細な記述は、ウオ
ーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２（１９
９２）により、当業者にはよく知られている。
ートし、そして４０℃において２分間おいた。次に、１
５０ユニットのＨｉｎｃＩＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）および２ユニッ
トのｅｘｏ-クレノーポリメラーゼ（ＵＳＢ社）を各反
応物に加えて、４０℃において２時間増幅をさせた。反
応は９５℃において３分間加熱することにより停止し
た。ＳＤＡ法に含まれる技術のより詳細な記述は、ウオ
ーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２（１９
９２）により、当業者にはよく知られている。
【００３４】増幅されたＳＤＡ産物は、上記のとおり
５’−32Ｐ標識された検出用プローブ（配列番号３を含
む）を用いて検出された。プローブは、１μＭの配列番
号３；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ、および７０μＣｉ−32Ｐ−ＡＴＰ（３０
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍｌ）を含む１０μ
ｌの反応物中でリン酸化した。反応は３７℃において３
０分間行い、７０℃において２分間加熱することにより
停止した。ＳＤＡ産物は、０．１μＭの32Ｐ−検出用プ
ローブを含む５０ｍＭのＫiＰＯ4、０．５ｍＭのｄＵＴ
Ｐ、０．２ｍＭの各チオ−ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、６ｍＭのＭｇＣｌ2を
含む反応物および５μｌのＳＤＡ反応物中でのプライマ
ー伸長合成により、ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．
Ｔ．）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９
１（１９９２）に記載されているとおりに検出した。各
サンプルを９５℃において２分間加熱し、そして３７℃
において２分間冷やした。プライマー伸長合成は２ユニ
ットのｅｘｏ-クレノーを加えて実施され、さらに１０
分間３７℃においてインキュベートした。反応は、７．
５μｌの５０％（Ｗ／Ｖ）尿素、２０ｍＭのＮａ2ＥＤ
ＴＡ、０．５×ＴＢＥ、０．０５％のブロモフェノール
ブルー／キシレンシアノールの添加により停止した。Ｓ
ＤＡプライマー伸長合成産物は、８％変性ゲルを用いた
ゲル電気泳動により分析され、そして増感スクリーンと
共に−７０℃にてＸ線フィルム（ＦＵＪＩ）に１６時間
露出することにより可視化した。
５’−32Ｐ標識された検出用プローブ（配列番号３を含
む）を用いて検出された。プローブは、１μＭの配列番
号３；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ、および７０μＣｉ−32Ｐ−ＡＴＰ（３０
００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍｌ）を含む１０μ
ｌの反応物中でリン酸化した。反応は３７℃において３
０分間行い、７０℃において２分間加熱することにより
停止した。ＳＤＡ産物は、０．１μＭの32Ｐ−検出用プ
ローブを含む５０ｍＭのＫiＰＯ4、０．５ｍＭのｄＵＴ
Ｐ、０．２ｍＭの各チオ−ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、６ｍＭのＭｇＣｌ2を
含む反応物および５μｌのＳＤＡ反応物中でのプライマ
ー伸長合成により、ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．
Ｔ．）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９
１（１９９２）に記載されているとおりに検出した。各
サンプルを９５℃において２分間加熱し、そして３７℃
において２分間冷やした。プライマー伸長合成は２ユニ
ットのｅｘｏ-クレノーを加えて実施され、さらに１０
分間３７℃においてインキュベートした。反応は、７．
５μｌの５０％（Ｗ／Ｖ）尿素、２０ｍＭのＮａ2ＥＤ
ＴＡ、０．５×ＴＢＥ、０．０５％のブロモフェノール
ブルー／キシレンシアノールの添加により停止した。Ｓ
ＤＡプライマー伸長合成産物は、８％変性ゲルを用いた
ゲル電気泳動により分析され、そして増感スクリーンと
共に−７０℃にてＸ線フィルム（ＦＵＪＩ）に１６時間
露出することにより可視化した。
【００３５】標的特異的ＳＤＡ産物はＨｉｎｃＩＩニッ
ク産物を表す32Ｐ−４７マーおよびニックが入っていな
い鎖を表す32Ｐ−７１マーとして観察された。これらの
産物は試験されたすべてのバクテリア生物に関して検出
されたが、しかし、ユーバクテリウムレンタムのシグナ
ルは比較的弱かった。さらに、カンジダアービカンスお
よび１０ｎｇのヒトＤＮＡを用いたゼロ標的サンプルは
バックグラウンド増幅を示さなかった。
ク産物を表す32Ｐ−４７マーおよびニックが入っていな
い鎖を表す32Ｐ−７１マーとして観察された。これらの
産物は試験されたすべてのバクテリア生物に関して検出
されたが、しかし、ユーバクテリウムレンタムのシグナ
ルは比較的弱かった。さらに、カンジダアービカンスお
よび１０ｎｇのヒトＤＮＡを用いたゼロ標的サンプルは
バックグラウンド増幅を示さなかった。
【００３６】１６Ｓ ｒＲＮＡ ＳＤＡ増幅プライマー
Ｓ１（配列番号７）およびＳ２（配列番号８）の感度を
測定するために、１から１０，０００のストレプトコッ
カスピオゲネスのゲノムコピーをそれぞれ増幅し、前記
の概要にしたがって検出した。各々のサンプルは０．４
５μｇのヒトＤＮＡも含んだ。１６時間のオートラジオ
グラフィーの露出により、ストレプトコッカスピオゲネ
スの１０ゲノムコピーがゼロ標的サンプルにおける検出
可能なバックグラウンドなしに検出された。
Ｓ１（配列番号７）およびＳ２（配列番号８）の感度を
測定するために、１から１０，０００のストレプトコッ
カスピオゲネスのゲノムコピーをそれぞれ増幅し、前記
の概要にしたがって検出した。各々のサンプルは０．４
５μｇのヒトＤＮＡも含んだ。１６時間のオートラジオ
グラフィーの露出により、ストレプトコッカスピオゲネ
スの１０ゲノムコピーがゼロ標的サンプルにおける検出
可能なバックグラウンドなしに検出された。
【００３７】実施例１ コンセンサス１６Ｓ配列の真正細菌プライマーおよびプ
ローブとしての使用可能性に関する決定 コンセンサス１６Ｓ配列の真正細菌プライマーおよびプ
ローブとしての使用可能性に関する決定は、ジーンバン
ク（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ）のフォーマット化された配列に
より、マッキントッシュのジンワークプログラムを用い
て行った。ジーンバンクから公知のエシェリヒアコリ、
バクテロイデスフラジリス、ナイセリアゴノロエ、スタ
フィロコッカスアウレウス、エンテロコッカスおよびリ
ステリアモノサイトゲネスに関する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺
伝子のヌクレオチド配列を並べた（ａｌｉｇｎｅｄ）。
ローブとしての使用可能性に関する決定 コンセンサス１６Ｓ配列の真正細菌プライマーおよびプ
ローブとしての使用可能性に関する決定は、ジーンバン
ク（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ）のフォーマット化された配列に
より、マッキントッシュのジンワークプログラムを用い
て行った。ジーンバンクから公知のエシェリヒアコリ、
バクテロイデスフラジリス、ナイセリアゴノロエ、スタ
フィロコッカスアウレウス、エンテロコッカスおよびリ
ステリアモノサイトゲネスに関する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺
伝子のヌクレオチド配列を並べた（ａｌｉｇｎｅｄ）。
【００３８】真正細菌のプライマーの開発のために、高
度に保存されたコンセンサス配列の領域に関して、示さ
れたバクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を評価した。
ヌクレオチド番号８８１−８９３およびヌクレオチド番
号９４７−９６０の配列の保存された性質により、１６
Ｓ ｒＲＮＡ配列の中の２つの領域がプライマーの開発
のために選ばれた。プライマー１６Ｓ ８９５はエシェ
リヒアコリ配列のセンス鎖のヌクレオチド番号８８１−
８９３（５’−ＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧ−３’）
（配列番号１）を表し、そしてプライマー１６Ｓ ９４
７はアンチセンス鎖のヌクレオチド番号９４７−９６０
（５’−ＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列
番号２）を表す。これらのプライマーは１８種類のバク
テリアおよび１種類の非バクテリアのゲノミックＤＮＡ
を鋳型として用いてＰＣＲ増幅システムにおいて評価さ
れた。ＰＣＲ増幅を用いて、プライマーがバクテリアの
ゲノミックＤＮＡを検出および増幅するか否かを測定し
た。
度に保存されたコンセンサス配列の領域に関して、示さ
れたバクテリアの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を評価した。
ヌクレオチド番号８８１−８９３およびヌクレオチド番
号９４７−９６０の配列の保存された性質により、１６
Ｓ ｒＲＮＡ配列の中の２つの領域がプライマーの開発
のために選ばれた。プライマー１６Ｓ ８９５はエシェ
リヒアコリ配列のセンス鎖のヌクレオチド番号８８１−
８９３（５’−ＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧ−３’）
（配列番号１）を表し、そしてプライマー１６Ｓ ９４
７はアンチセンス鎖のヌクレオチド番号９４７−９６０
（５’−ＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧ−３’）（配列
番号２）を表す。これらのプライマーは１８種類のバク
テリアおよび１種類の非バクテリアのゲノミックＤＮＡ
を鋳型として用いてＰＣＲ増幅システムにおいて評価さ
れた。ＰＣＲ増幅を用いて、プライマーがバクテリアの
ゲノミックＤＮＡを検出および増幅するか否かを測定し
た。
【００３９】実施例２ プライマーおよびプローブの効果を測定するためのポリ
メラーゼチェインリアクション この実験は、プローブ１６Ｓ ８９５（配列番号１）お
よび１６Ｓ ９４７（配列番号２）が１８種類のバクテ
リアおよび１種類の非バクテリアのゲノミックＤＮＡを
増幅する効果について試験した。
メラーゼチェインリアクション この実験は、プローブ１６Ｓ ８９５（配列番号１）お
よび１６Ｓ ９４７（配列番号２）が１８種類のバクテ
リアおよび１種類の非バクテリアのゲノミックＤＮＡを
増幅する効果について試験した。
【００４０】ポリメラーゼチェインリアクションによる
増幅は、５０μｌの反応体積にて実施された。すべての
反応物の最終濃度は以下のとおりである。
増幅は、５０μｌの反応体積にて実施された。すべての
反応物の最終濃度は以下のとおりである。
【００４１】１００ｎｇ ゲノミックＤＮＡ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ５０ｍＭ ＫＣｌ １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．０１％（ｗ／ｖ） ゼラチン ２００μＭ ｄＡＴＰ ２００μＭ ｄＴＴＰ ２００μＭ ｄＧＴＰ ２００μＭ ｄＣＴＰ ２０ｐｍｏｌｅ １６Ｓ ８９５（配列番号１） ２０ｐｍｏｌｅ １６Ｓ ９４７（配列番号２） 反応物をミネラルオイルで重層して標的ＤＮＡを変性す
るために９５℃において５分間加熱した。ＡｍｐｌｉＴ
ａｇポリメラーゼ（１．２ユニット）（パーキンエルマ
ーシータス社）のアリコートを各反応混合物に加えた。
増幅のパラメーターは、９４℃において１分間、３７℃
において１分間、７２℃において２分間の３０サイク
ル、続く４℃における浸漬をＤＮＡ温度恒温循環機にて
行った。増幅産物は、１×ＴＢＥ中の１．５％アガロー
スゲル上の電気泳動後のエチジウムブロマイドにより可
視化された。
るために９５℃において５分間加熱した。ＡｍｐｌｉＴ
ａｇポリメラーゼ（１．２ユニット）（パーキンエルマ
ーシータス社）のアリコートを各反応混合物に加えた。
増幅のパラメーターは、９４℃において１分間、３７℃
において１分間、７２℃において２分間の３０サイク
ル、続く４℃における浸漬をＤＮＡ温度恒温循環機にて
行った。増幅産物は、１×ＴＢＥ中の１．５％アガロー
スゲル上の電気泳動後のエチジウムブロマイドにより可
視化された。
【００４２】ＰＣＲの結果から、試験されたすべてのバ
クテリアに関して７９ｂｐの断片の増幅（１．５％アガ
ロースゲル上に観察された太いバンド）が示された。
クテリアに関して７９ｂｐの断片の増幅（１．５％アガ
ロースゲル上に観察された太いバンド）が示された。
【００４３】ＰＣＲにおいて試験されたバクテリア株
（上記結果に関して陽性） スタフィロコッカスアウリウス シュードモナスエルギノサ コリネバクテリウムゼロシス エシェリヒアコリ クレブシエラニューモニエ セラティアマルセンセンス モルガネラモルガニ ヘモフィルスインフルエンザ ストレプトコッカスニューモニエ エンテロバクターエロゲネス ナイセリアゴノロエ アシネトバクタールボフィ ユーバクテリウムレンタム リステリアモノサイトゲネス プロテウスブルガリス ストレプトコッカスフェーカリス ストレプトコッカスピオゲネス モラクセラオスロエンシス ＰＣＲにおいて試験された非バクテリア（上記結果に関
して陰性） カンジダアービカンス ナイセリアゴノロエに関する７９ｂｐ断片の増幅は、上
記バックグラウンドと同じほどの弱いシグナルを示し
た。この種に関する配列分析は、ヌクレオチド番号９４
７および９５４における２つのミスマッチを含むことを
示した。この理由から、ＳＤＡプライマーは９４７番目
のミスマッチを除去し、そして３’末端に３つの付加的
ヌクレオチドを含むように修飾された。このＳＤＡプラ
イマーは１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド番号９４８−
９６３に相当する（ＰＣＲプライマーのヌクレオチド番
号９４７−９６０と比較される）。
（上記結果に関して陽性） スタフィロコッカスアウリウス シュードモナスエルギノサ コリネバクテリウムゼロシス エシェリヒアコリ クレブシエラニューモニエ セラティアマルセンセンス モルガネラモルガニ ヘモフィルスインフルエンザ ストレプトコッカスニューモニエ エンテロバクターエロゲネス ナイセリアゴノロエ アシネトバクタールボフィ ユーバクテリウムレンタム リステリアモノサイトゲネス プロテウスブルガリス ストレプトコッカスフェーカリス ストレプトコッカスピオゲネス モラクセラオスロエンシス ＰＣＲにおいて試験された非バクテリア（上記結果に関
して陰性） カンジダアービカンス ナイセリアゴノロエに関する７９ｂｐ断片の増幅は、上
記バックグラウンドと同じほどの弱いシグナルを示し
た。この種に関する配列分析は、ヌクレオチド番号９４
７および９５４における２つのミスマッチを含むことを
示した。この理由から、ＳＤＡプライマーは９４７番目
のミスマッチを除去し、そして３’末端に３つの付加的
ヌクレオチドを含むように修飾された。このＳＤＡプラ
イマーは１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド番号９４８−
９６３に相当する（ＰＣＲプライマーのヌクレオチド番
号９４７−９６０と比較される）。
【００４４】実施例３ プライマーおよびプローブの効果を測定するための鎖置
換増幅 この実験はＳ１（配列番号７）およびＳ２（配列番号
８）（増幅プライマー）／Ｂ１（配列番号５）およびＢ
２（配列番号６）（外部プライマー）および検出用プロ
ーブが１０種のバクテリアおよび１種の非バクテリアの
ゲノミックＤＮＡを増幅および検出する効果を、鎖置換
増幅により試験した。
換増幅 この実験はＳ１（配列番号７）およびＳ２（配列番号
８）（増幅プライマー）／Ｂ１（配列番号５）およびＢ
２（配列番号６）（外部プライマー）および検出用プロ
ーブが１０種のバクテリアおよび１種の非バクテリアの
ゲノミックＤＮＡを増幅および検出する効果を、鎖置換
増幅により試験した。
【００４５】鎖置換増幅は以下のとおりに実施した。
【００４６】ＳＤＡ真正細菌バクテリアプライマーセッ
ト（増幅プライマー、配列番号７および８；外部プライ
マー、配列番号５および６）を用いて、６ｎｇの標的ゲ
ノミックＤＮＡ（１×１０6ゲノム）を評価した。標的
ＤＮＡは、１ｎｇ／μｌのヒト胎盤ＤＮＡを含む５０ｍ
Ｍ ＫiＰＯ4（ｐＨ７．４）で希釈した。
ト（増幅プライマー、配列番号７および８；外部プライ
マー、配列番号５および６）を用いて、６ｎｇの標的ゲ
ノミックＤＮＡ（１×１０6ゲノム）を評価した。標的
ＤＮＡは、１ｎｇ／μｌのヒト胎盤ＤＮＡを含む５０ｍ
Ｍ ＫiＰＯ4（ｐＨ７．４）で希釈した。
【００４７】すべての反応成分の最終濃度および添加の
順番は以下のとおりであった。
順番は以下のとおりであった。
【００４８】５０ｍＭのＫiＰＯ4（ｐＨ７．４） １００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミン ０．２ｍＭの各ｄＡsＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ ０．５ｍＭのｄＵＴＰ ５００ｎＭのプライマーＳ1およびＳ2 （増幅プライマー、配列番号７および８） ５０ｎＭのプライマーＢ1およびＢ2 （外部プライマー、配列番号５および６） ７ｍＭのＭｇＣｌ2 ２３％のグリセロール ６ｎｇの標的ＤＮＡ １０ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ 反応物を９５℃において３分間インキュベートして標的
ＤＮＡを変性して、４０℃にて２分間プライマーをアニ
ールした。ＨｉｎｃＩＩ（１５０ユニット）およびｅｘ
ｏ-クレノー（ＵＳＢ）２（ユニット）を各反応物に加
えて２時間にわたって４０℃において増幅を起こさせ
た。反応は９５℃において３分間加熱することにより停
止した。
ＤＮＡを変性して、４０℃にて２分間プライマーをアニ
ールした。ＨｉｎｃＩＩ（１５０ユニット）およびｅｘ
ｏ-クレノー（ＵＳＢ）２（ユニット）を各反応物に加
えて２時間にわたって４０℃において増幅を起こさせ
た。反応は９５℃において３分間加熱することにより停
止した。
【００４９】増幅されたＳＤＡ産物は、５’−32Ｐ標識
された検出用プローブ（配列番号３）を用いて検出し
た。32Ｐ標識された検出用プローブへのキナーゼ反応は
１０μｌの体積で実施した。すべての反応成分の最終濃
度は以下のとおりであった。
された検出用プローブ（配列番号３）を用いて検出し
た。32Ｐ標識された検出用プローブへのキナーゼ反応は
１０μｌの体積で実施した。すべての反応成分の最終濃
度は以下のとおりであった。
【００５０】１μＭの配列番号３ ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍＭのＭｇＣｌ2 ７０μＣｉ−32Ｐ−ＡＴＰ（３００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１
０ｍＣｉ／ｍｌ） １０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥバ
イオラブス社） 反応は３７℃において３０分間実施し、そして７０℃に
おいて２分間加熱することにより停止した。
０ｍＣｉ／ｍｌ） １０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥバ
イオラブス社） 反応は３７℃において３０分間実施し、そして７０℃に
おいて２分間加熱することにより停止した。
【００５１】ＳＤＡ産物は、キナーゼにより32Ｐ標識さ
れた検出用プローブを含むプライマー伸長合成反応にお
いて検出された。反応は１０μｌの反応体積にて実施し
た。すべての反応成分の最終濃度は以下のとおりであっ
た。
れた検出用プローブを含むプライマー伸長合成反応にお
いて検出された。反応は１０μｌの反応体積にて実施し
た。すべての反応成分の最終濃度は以下のとおりであっ
た。
【００５２】５０ｍＭのＫiＰＯ4 ０．５ｍＭのｄＵＴＰ ０．２ｍＭの各ｄＡsＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ １００μｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミン ６ｍＭのＭｇＣｌ2 ０．１μＭの32Ｐ−検出用プローブ ５μｌのＳＤＡ反応 各サンプルは９５℃において２分間加熱し、そして３７
℃において２分間冷やした。プライマー伸長合成は２ユ
ニットのｅｘｏ-クレノーの添加により実施し、そして
さらに１０分間３７℃においてインキュベートした。反
応は７．５μｌの５０％（ｗ／ｖ）尿素、２０ｍＭのＮ
ａ2ＥＤＴＡ、０．５×ＴＢＥ、０．０５％ブロモフェ
ノールブルー／キシレンシアノールの添加により停止し
た。ＳＤＡプライマー伸長合成産物は８％変性ゲルを用
いたゲル電気泳動により分析し、そしてｘ線フィルム
（ＦＵＪＩ）に増感スクリーンと共に−７０℃において
１６時間露出することにより可視化した。
℃において２分間冷やした。プライマー伸長合成は２ユ
ニットのｅｘｏ-クレノーの添加により実施し、そして
さらに１０分間３７℃においてインキュベートした。反
応は７．５μｌの５０％（ｗ／ｖ）尿素、２０ｍＭのＮ
ａ2ＥＤＴＡ、０．５×ＴＢＥ、０．０５％ブロモフェ
ノールブルー／キシレンシアノールの添加により停止し
た。ＳＤＡプライマー伸長合成産物は８％変性ゲルを用
いたゲル電気泳動により分析し、そしてｘ線フィルム
（ＦＵＪＩ）に増感スクリーンと共に−７０℃において
１６時間露出することにより可視化した。
【００５３】結果：標的特異的ＳＤＡ産物はＨｉｎｃＩ
Ｉニック産物を表す32Ｐ−４７マーおよびニックが入っ
ていない鎖を表す32Ｐ−７１マーとして観察された。こ
れらの産物は試験されたすべてのバクテリア生物に関し
て観察されたが、ユーバクテリウムレンタムのシグナル
は比較的低かった。
Ｉニック産物を表す32Ｐ−４７マーおよびニックが入っ
ていない鎖を表す32Ｐ−７１マーとして観察された。こ
れらの産物は試験されたすべてのバクテリア生物に関し
て観察されたが、ユーバクテリウムレンタムのシグナル
は比較的低かった。
【００５４】ＳＤＡにより試験されたバクテリアの株
（上記結果に関して陽性） リステリアモノサイトゲネス ユーバクテリウムレンタム ストレプトコッカスピオゲネス クレブシエラニューモニエ ヘモフィルスインフルエンザ ナイセリアゴノロエ ストレプトコッカスアウリウス コリネバクテリウムゼロシス シュードモナスエルギノサ エシェリヒアコリ ＳＤＡにより試験された非バクテリア（上記結果に関し
て陰性） カンジダアービカンス 上記発明は例示の目的で記載されたものであるが、当業
者には、特許請求の範囲において変更および修飾がなさ
れて実施されてもよいことは明らかである。
（上記結果に関して陽性） リステリアモノサイトゲネス ユーバクテリウムレンタム ストレプトコッカスピオゲネス クレブシエラニューモニエ ヘモフィルスインフルエンザ ナイセリアゴノロエ ストレプトコッカスアウリウス コリネバクテリウムゼロシス シュードモナスエルギノサ エシェリヒアコリ ＳＤＡにより試験された非バクテリア（上記結果に関し
て陰性） カンジダアービカンス 上記発明は例示の目的で記載されたものであるが、当業
者には、特許請求の範囲において変更および修飾がなさ
れて実施されてもよいことは明らかである。
【００５５】
【００５６】配列番号：１ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CCTGGGGAGT ACG 13
【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 AATTAAACCA CATG 14
【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CGTCAATTCA TTTGAGTTT 19
【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 TCGAATTAAA CCACAT 16
【００６０】配列番号：５ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 GATTAGATAC CCTG 14
【００６１】配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 CACGAGCTGA CGACA 15
【００６２】配列番号：７ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACCCTGGG GAGTACG 37
【００６３】配列番号：８ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノミックＤＮＡ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACTCGAAT TAAACCACAT 40
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号１を含むオリゴヌクレオチド。
- 【請求項２】 配列番号２を含むオリゴヌクレオチド。
- 【請求項３】 配列番号４を含むオリゴヌクレオチド。
- 【請求項４】 真正細菌に特徴的な核酸標的配列の検出
のための、配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプロー
ブ。 - 【請求項５】 （ａ）請求項１記載のオリゴヌクレオチ
ドと請求項２記載のオリゴヌクレオチドからなるプライ
マーセットを用いて核酸配列増幅法を実施し；そして
（ｂ）請求項４記載のオリゴヌクレオチドプローブが核
酸標的配列にハイブリダイズするか否かを決定する工程
からなる、真正細菌に特徴的な核酸標的配列の在否を決
定する方法。 - 【請求項６】 配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプ
ライマー。 - 【請求項７】 配列番号８を含むオリゴヌクレオチドプ
ライマー。 - 【請求項８】 （ａ）請求項６記載のオリゴヌクレオチ
ドプライマーと請求項７記載のオリゴヌクレオチドプラ
イマーからなるプライマーセットを用いて核酸配列増幅
法を実施し；そして（ｂ）請求項４記載のオリゴヌクレ
オチドプローブが核酸標的配列にハイブリダイズするか
否かを決定する工程からなる、真正細菌に特徴的な核酸
標的配列の在否を決定する方法。 - 【請求項９】 核酸配列増幅法が鎖置換増幅（ＳＤＡ）
である、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 核酸配列増幅法の実施において、配列
番号５を含む第１外部プライマーおよび配列番号６を含
む第２外部プライマーの使用を含む、請求項９記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US26160894A | 1994-06-17 | 1994-06-17 | |
| US261608 | 1994-06-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08297A true JPH08297A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=22994071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7151379A Pending JPH08297A (ja) | 1994-06-17 | 1995-06-19 | バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0692540A3 (ja) |
| JP (1) | JPH08297A (ja) |
| AU (1) | AU687530B2 (ja) |
| CA (1) | CA2150986C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017528136A (ja) * | 2015-01-28 | 2017-09-28 | 中国医科大学附属第一医院 | 異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子 |
Families Citing this family (7)
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|---|---|---|---|---|
| DE19732086C2 (de) * | 1997-07-25 | 2002-11-21 | Univ Leipzig | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien |
| US6280946B2 (en) | 1998-08-07 | 2001-08-28 | Boston Probes, Inc. | PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the universal detection of bacteria and eucarya |
| US7108980B1 (en) | 1998-08-07 | 2006-09-19 | Boston Probes, Inc. | Methods for the analysis of microcolonies of bacteria and yeast |
| FR2811321A1 (fr) * | 2000-07-04 | 2002-01-11 | Bio Merieux | Amplificateur d'une region ribonucleique cible d'un arn ribosomal 16s ou adn pour un tel arn d'une espece eubacterienne et detection de telles especes |
| AT411174B (de) * | 2001-08-09 | 2003-10-27 | Lambda Labor Fuer Molekularbio | Verfahren und chip zur analyse von nukleinsäuren |
| US7807802B2 (en) | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
| AU2014293075A1 (en) * | 2013-07-25 | 2015-12-17 | Dch Molecular Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for detecting bacterial contamination |
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|---|---|---|---|---|
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| JPH05501052A (ja) * | 1989-07-11 | 1993-03-04 | マイクロプローブ・コーポレーション | 核酸ハイブリッド形成アッセイを使用する細菌の定量 |
| JPH05276947A (ja) * | 1991-11-19 | 1993-10-26 | Becton Dickinson & Co | 核酸標的物の生成法 |
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