JPH04500315A

JPH04500315A - ユニバーサル　ユーバクテリア核酸プローブ及び方法

Info

Publication number: JPH04500315A
Application number: JP2509520A
Authority: JP
Inventors: レーン，デビッド・ジェイ; シャー，ジョツナ; バーリン，アメリア; ワイズバーグ，ウィリアムス・ジー
Original assignee: ジーン―トラック・システムス
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-31
Publication date: 1992-01-23
Anticipated expiration: 2017-02-18
Also published as: DE69022180T2; JP3258658B2; AU5950690A; CA2031499A1; WO1990015157A1; ATE127530T1; US5401631A; EP0431149A1; JP2002051799A; DE69022180D1; JP3368268B2; EP0431149B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ユニバーサル　ニーバクテリア核酸グローブ及び方法発明の分野本発明は臨床及びその他のサンプル中のバクテリアの検出に関する。そこに何らかのバクテリアが存在することにより生命が脅やかされるような通常無菌の身体組織若しくは二液、尿及び髄液等の体液中のバクテリアを検出する方法は特に重要である。本発明は、核酸グローブ及び組成物をそのようなサンプル中の何らかのバクテリアを特異的に検出するためにそれらを使用する方法とともに提供するものである。

発明の背景ここで用いる“ニーバクテリア（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ　）”という用語は、たとえばバーシイ（Ｂｅｒｇｅｙ）の細菌分類マニュアル（Ｎ、Ｒ，クリープ及びＪ、Ｇ、　ホルト編（Ｎ、Ｒ，Ｋｒｉｅｇ　ａｎｄ　Ｊ、Ｇ、Ｈｏ１ｔ、ｅｄ、　）、　１９８４年、ウィリアムスアンド　ゥイルキンズ社、ボルチモア）に述べられ℃いる原核生物のグループ（バクテリア）を意味する。群としてニーバクテリアは、ヒト若しくは動物に病気をひき起こすことが知られており検出に関し ℃は最も重要であるバクテリアを、全て含んでいる。

唯一の他に述べられるバクテリアの群であるアルカニバクテリア（始原細菌〕は、生物学的及び遺伝学的にニーバクテリアとは性質が異なる（　Ｃ，Ｒ，ワオウスＣＣ，Ｒ，Ｗｏｅｓｅ　）、サイエンティフィック　アメリカン（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ　）、１９８１年、２４４巻、第９８−１０２頁）。プルカニバクテリアは群として、温泉、超低酸素泥、塩水等の、通常ニーバクテリアが成育できない種々の“過激な″環境中に住む。アルカニバクテリアで病原体として仰られているものはな（、従ってそれらの検出に臨床上の意義はほとんどない。

真核生物は第３の基本的遺伝系統を構成し、ニーバクテリア及びアルカニバクテリアと共に全℃の既知の生命形態を含むことになる（図１）。真残生物にはヒト、動物、植物及び、原生動物、真菌、Ｒ毛虫等を含む多数の組織的複雑さの低い自由生活性及び寄生性の“原生生物′が含まれる。臨床関係では、ニーバクテリアを、同じ症状を呈するが太き（異なる抗薗若しくは化学療法を必要とするような真核生物、たとえば真菌及び原生動物による感染と識別することは特に重要である。従つ工これらの遺伝的識別は診断及び抗画化学療法の見地から臨床上重要である。

ニーバクテリア、ヒト（ヒトのミトコンドリアのものを含む）及び真菌のｒＲＮＡ分子を識別する核酸プローブを提供することが、本発明の一面である。

グラニ湯性及びグラム陰性のニーバクテリア？識別する基準を提供するプローブ及びプローブセットを提供することが、本発明の他の一面である。

通常無菌の体液中のバクテリアを検出、同定及び計数する方法はサンプルのタイプ及び疑われる病原体によって異なる。現在使用できる方法で全ての病原体の検出に最適なものはない。しばしば、病原体が検出される可能性を高めるために複数の方法を用いねばならない。たとえば菌血症若しくは細菌性敗血症の検出に養人工培地中で１ないし１４日間＠！及び監視される。この間、該培地を検量するかあるいは盲目的に二次培養（プレート上）するか、若しくは細菌の成育あるいは発酵過程の証拠を化学的にあるいはアイソトープによりアッセイされる。臨床医は通常、陽性の診断のためのわずか１ないし、１０１固のコロニーを形１１ぜる単位のバクテリアをもたらすよ５な１０ｍＪの血液サンプルを２ないし３１ｆＩＡ採取する。診断用固型培地上の１面々のバクテリアコロニーの分離の後、がっ／又はダラム染色により、該バクテリア（若しくは真菌）の推定的同定がなさｎろ。

培養による方法は金工、以下のような多数の重大な欠点を持つニー材料の高コスト；ｍ−労力の過大さ；ｍ−技術者が危険な体液を広範に処理すること；−処理による偽りの陽性；一目に見える細胞数が少ないことによる偽りの陰性；−可能性のある多くの病原体に対する厄介な培地要件による偽りの陰性；及び−一−−陽性の診断及び同定に相対的に長い時間を９すること。

診断を達成するために現在の方法では相対的に長い時間が必要とされること。

及びそのような感染の生命を脅かしかねない性質により、抗医療法はしばしばこのような試験の結果が判明する以前に経験的に開始される。

それゆえ、全１のニーバクテリアに対して広（特異的であり、かつ好ましくはサンプルである材料中に存在し５る他の真仮生物病原体類、特に真菌に反応しない核酸プローブを提供することが、本発明の他の一面である。

さらに、伝統的な多日数￥！ｉｉｉ法乙伴なう多くの不都合を避：）己多様なアッセイ系で使用できるプローブを提供することが本発明の他の一面である。

また、通常のアッセイ条件下で標的となるニーバクテリア生物のりボンームリボ核酸（ｒＲＮＡ）にハイブリダイズ（対合：　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）することができろプローブを提供することも本発明の他の一面である。

コーネら（Ｋｏｈｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、バイオフィジカルジャーナル（ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ　）、８巻、第１１．０４−１１１８頁、１９６８年）はｒＲＮＡ配列に対するプローブを製造する一方法を考察しているが、彼らは広範な特異性を持つニーバクテリア用プローブを作るのに必要な教示を提供してはいない。

ベースとキャンベル（Ｐａｃｅ　ａｎｄ　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ジャーナル　オブ　バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）、１０７巻、第５４３−５４７頁、１９７１年）は多様なバクテリア種のリポソームリボ核酸の相同関係とこのような相同関係のレベルを数量化するためのハイブリダイゼーション法を考察している。彼らは、バクテリアは共有するが真核生物には存在しない特定の核酸配列を同定してはいない。ウオワス（Ｗｏｅｓｅ＋ミクロバイオロジカルレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　）、５１巻、第２２１−２７１頁、　１９８７年）はニーバクテリアのｒＲＮＡ配列に関する幅を述べているが、完全なバクテリアの包含性を見るために興味深い配列を示し又はいない。これらの参考文献は、もつとも、ニーバクテリア用プローブに関してコーネ（Ｋｏｈｎｅ　）の教示に欠けていたものを補ってはおらず、特に臨床若しくはその他のサンプル中のニーバクテリアを検出するためのアッセイにおいて有用なニーバクテリアに特異的なプローブを提供し℃はいない。

ジョバノ一二ら（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ　、、ジャーナル　オブ　バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）、１７０巻、第７２０−７２６ｊｉ。

１９８　ｓ年）は幅広い群のニーバクテリア、アルカニバクテリア及び真核生物の同定に有用であると主張される複数のプローブを述べている。もつとも、ジョバノ一二らは本発明のプローブ類を発表してはいない。彼らは筐たそのようなプローブ類を設計するのに必要な教示も提供していない。

ホーガンら（Ｈｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、欧州特許公開ＷＯ第８８１０３９５７号）はニーバクテリアの広範な表現型（てハイブリダイズすると開示される複数のプローブを述べている。もつとも、ホーガンらは本発明のプローブ類を教示してはおらず、またこれらのプローブに関し℃コーネ（Ｋｏｈｎｅ　）の教示に欠けていたものを補つ℃もいない。

リポソームは、それらが細胞の蛋白に遺伝情報を翻訳するための唯一の手段として働くため、全ての生物にとって実に重要である。この重要性を明らかに示すもの力ζ全ての細胞がリポソームを持つという観察である。活発に成育し℃いるバクテリアはａ＠１ｍあたり２０，０００若しくはそれ以上のリポソームを持つものと思われる。このことからリポソームは、細胞中の最も豊富な高分子存在のひとつであり、かつ魅力おる診断用アッセイの標的となる。

リポソームは、エシェリヒア−コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　：大腸菌）におｔ、’ｉ５ｓ、１６５及び２３Ｓ　ｒＲＮＡと呼ばれる３個の異なるＲＮＡ分子を含有する。これらの合名は歴史的に、−ｆ：れらの沈降速度により決定されるＲＮＡ分子の大きさに符合し工いる。もつとも、実際にはリポソームＲＮＡ分子は生物間で大きさが異なる。ではあるが、５Ｓ、ｉ６ｓ及び２３Ｓ　ｒＲＮＡはいずれのバクテリア中にもある相同なＲＮＡ分子に対する一般名として普通に用いられ℃おり、ここでもその慣習に従うものとする。考察は１６Ｓ及び２３Ｓ　ｒＲＮＡに限定されよう。

ここでは、プローブ（類）とは、標的となる核酸配列に対して５限定されあらかじめ決められた厳重さく　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｉｅｓ　）で特異的に（すなわち、選択的に、以下のハイブリダイゼーシヨ／に関する記載を８照）それらをハイブリダイズさぜる特異的なヌクレ・オチド配列を、設計若しくは選択により含有する１合成石しくは生物学的に製造された核酸類（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を意味する。それらのハイブリダイゼーション特性に顎えて、プローブ類は特殊なアッセイ条件下でそれらが正しく若しくは最適知機能するのにふされしい何らかの薄酸要素を含んでもよい。たとえば、プローブ類はヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善する（たとえば、宋瑞キャップによる）、検出用リガンドを付ける（たとえば、フルオレセイン、３２ −リン、ビオチン等）、若しくは固型担体上へのそれらの捕獲を促進する（たとえば、ポリデオキシアデノシン”テール＃）ために修飾してもよい。このような修飾は、ノ・イブリダイゼーションアツセイにおいて標的及び非標的生物を有効に識別する能力とも言える基本的プローブ機能への仕上げである。

ハイブリダイゼーションは、あらかじめ決められた反応条件下で２本の部分的に若しくは完全に相補的な鎖の核酸を逆平行に（一方は５′から３′方向に、他方は３′から５′方向に）合わせて特異的かつ安定な水素結合による２本鎖の核酸を形成させる過程であると伝統的に考えられ１いる。（核酸は極性を有することを銘記すべきである；すなわち、核酸鎖の一方の末端はもう一方とは化学的に異なる。これは、該ヌクレオチド成分の不斉の境部分の化学結合の極性により定義される。５′及び３′という用語は、それらの呼称を持つリボース環の炭素に特異的に関連する。まれな、若しくは異常な環境中を除い℃、核酸鎖は塩基部分の水素結合により平行に会合することはない。この概念は当業者において周知である。）特定の組のハイブリダイゼーション条件の厳重度は、２本の核酸の間の誤対合の割合及び結合形態によるのと同時に、プローブ／標的二本鎖の塩基組成によって定義される。

厳重度はまた２該ハイブリダイゼーシヨン溶液中に存在するイオン橿の濃度及び型、存在する変性削類の型及び濃度、かつ／又はハイブリダイゼーション温度等の反応パラメーターに左右されろこともある。通常ハイブリダイゼーション条件が厳重になるほど、安定なハイブリッドを形成させるべき場合にはより長いプローブが好ましい。結果として、ハイブリダイゼーションが行なわれる条件の厳重度（たとえば、実施されるアッセイの型に基づ（）は使用される好ましいプローブの性質を指図すると考えられる。このような関連性は当業者に周昶であり、容易に処理することができる。

一般に、プローブの長さによって、このような人々は厳重な条件というものが約０．９モルの塩溶液中の約３５℃−６５℃を意味することを理解している。

発明の要約本発明の多様な本質及び局面により、特異的な条件下でニーバクテリアのリポソームＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）、ｒＲＮＡ遺伝子ＣｒＤＮＡ）及び、それらの増；したもの及びｆノビ１″：での翻訳産物には対合す乙が、同じ条件下で試験サンプル中に存在しうる真核細胞のｒＲＮＡ若しくはｒ　ＤＮＡには対合しないデオキシリボ核酸ＣＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）配列を含む核酸プローブ及びプローブセットが提供される。さらに、ここで述べるある種のプローブ類及びプローブセット類は、ポリメラーゼ鎖反応（ＵＳ第４，６８３，２０２号〕等の方法若しくは転写増幅系（たとえばＴＡＳ、フォーら（Ｋｗｏｈ　ｅｔ　ａｌ、）、　プロシーデイングズ　オブ　ザ　ナショナル　ア力デミイ　オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　）、８６巻、第１１７３−１１７７頁、１９８９年ノによりサンプル中に存在し５るニーバクテリアのｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡ配列の特異的増幅のプライマーとして使用してもよ本発明のプローブ類は、ヒト若しくは動物からの血液、尿、髄液、生検（ｂｉ。

ｐｓｙ）、滑液（５ｙｎｏｖｉａｌ　ｆｌｕｉｄ　）、若しくは他の組織あるいは液体サンプル等の臨床サンプル中のニーバクテリアの特異的検出のための貴重な少数ハイブリダイゼーションアッセイの開発における基礎を有利に提供するものである。該プローブ類はまた、たとえば品質管理に？いて、無菌と仮定されている物質、たとえば医薬品を試験する基礎を提供するものである。ここで述べるプローブ類はある高度に保存されているバクテリア２３Ｓ若しくは１６５　ｒＲＮＡ配列に特異的に相補的である。

核酸ハイブリダイゼーシヨ／によるバクテリアの検出は、以下の理由により、現在利用できる培養による試験に比較して、高い成果を得ることができる：ａ）感度が高い；すなわち、与えられたサンプル中の当該バクテリアをより高頻度に検出することができる；ｂ）安価な試薬類の使用と低い労力によりアッセイコストを著しく低くすることができる；Ｃ）栄養条件の難しいバクテリア株も正確に検出できる；ｄ）このような試験は試験に先立ってサンプルから標的バクテリアを単離する必要がないため、結果が早く出せる；ｅ）バッチの形式で多数のサンプルをスクリーニングでき、“ノ・イブリダイゼーンヨン陽性″と同定されたものだけを培養できる；ｆ）食菌された微生物を検出でき１周期的な°時間帯“にある生育中の微生物（おそらく宿主の免疫周期による）をサンプリングするために複数回の血液サンフルを採る必要がない；ｇ）感染の可能性のある体液を取り扱う技術者が少人数で済む；ｈ）インビトロの核酸増幅を利用して、バクテリアの信号若しくは標的のいずれかを増幅することにより少数しかない標的を検１ｆｉすることができる。

本発明のプローブ類をｒＲＮＡに向けたことによる他の有利さには、検出されるｒＲＮＡ類が細胞質の重要な成分を構成するという事案が含まれることが仰られてい親細胞中のリポソーム含量の評価は多様であるが、たとえば活発に成育中のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　−ｃｏｌ　ｉ　）は細胞１個あたりに５０．０００以上のリポソーム、及びそれゆえに（リポソーム中に１：１：１の（ｆＪｔで存在する〕各ｒＲＮＡの５０，０００以上のコピーを含有すると思われる。個々に他の好適性の低い代謝条件下にある他のバクテリア中のリポソーム量は相当ニ低いと思われる。もつともいかなる環境におい又も全ての型の細胞中でｒＲＮＡは最も豊富な細胞内核酸のひとつである。対照的に、遺伝子若しくはそのＲＮＡ転写物等の他に細胞中標的たつ５る分子は、それらの存在量がはるかに少ないために理想度からいうとより低い。

さらに予期しなかった利点には、ｒＲＮＡ類（及びそれらを規定する遺伝子類）が現存の生物体間で横の転移を受けないらしいことがある。このように、ｒＲＮＡの一次構造は、たとえば現存の生物間の横の伝達を受けることがあるプラスミド上の遺伝子若しくはその産物の場合にそ５であるような遺転子籍異性標的ではな（生物特異性分子標的を提供する。

加えて１本発明は試験するニーバクテリアのほとんど若しくは全てに−Ｊ６い℃ 十分に同等であるニーバクテリアｒＲＮＡ標的配列に対するプローブ類で、そのようなニーバクテリアの標的領域にハイブリダイズすることができるプローブ類を提供するものである。好ましいことに、これらの同じｒＲＮＡ標的配列はほとんどの非ニーバクテリアｒＲＮＡ中のものと異なつ℃おり、該プローブ類がユーバと定義される。ニーバクテリアに関して本発明のプローブ類のような驚くべき包含性及び排他性特性を持つプローブ徴を生み出しうるという発見は予測も期待もできなかった。

図面の簡単な説明以下の図中の表記を参照することにより、本発明の本質及び局面をさらに理解できると思われる：図１−主な遺伝学上の生命の１王国”の進化の〕じ（ウォウス、　（Ｗｏｅｓｅ。

ミクロバイオロジカル　レビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）、５１巻、第２２１−２．７１頁、１９８７年）を示す。枝分かれのパターンは表示の生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列間の変異の間隔を表わしている。

このような比較から、約１０の主な分類／門が１６３配列の比較に基づいて定義されている。ニーバクテリア門の中での確実な識別は臨床関係において重要なことがあり、本発明のプローブのあるものは１個以上のニーバクテリア門に選択的にハイブリダイゼーションする。それゆえに１表３．４及び５に掲げた被験生物は１重要なハイブリダイゼーションパターンが最も容易に認められるよ５に図２に示された分類に従つ℃グループ分けされている。

表の簡単な説明表１−１６８　ｒＲＮＡを標的とする本発明の好ましいプローブ類のヌクレオチド配列をイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）の１６Ｓ　ｒＲＮＡにおけるその標的ヌクレオチド配列とともに示す。約３５０ヌクレオチドからなる１６Ｓ及び１８Ｓ　ｒＲＮＡ配列に対する非常に広範囲な配列比較を、本発明のプローブを開発する間に行なった。この分析を詳細に示すことは単に実際的ではない。もっとも、高度に保存されている１６Ｓ　ｒＲＮＡヌクレオチド部位の一致配列（Ｃ０Ｎ５ −９０％）１１代表的ニーバクテリア間に児られたヌクレオチド配列変異パターンの要約として提示しである。Ｃ０Ｎ５−９０％ライン上のヌクレオチドはそのヌクレオチドが検査したニーバクテリア配列の９０チ以上の頬面位置に見られることを示し１いる。該プローブの標的領域は全℃、ニーバクテリア１６８及び２３Ｓ　ｒＲＮＡ分子間で配列が高度に保存されている集団に対応していることを銘記すべきである。

イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ：大Ｖｋ菌）の１６Ｓ及び２３Ｓ　ｒＲＮＡ配列は最初にｒＲＮＡ配列が完全に得られたもののひとつであるため、指定の部位ナンバーは考察中の慣のｒＲＮＡ配列中の相同な領域を明快に同定するためのり利かつ一般に認められた基準となっている。表１に？いては、該イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＲＮＡ（標的〕配列は５′から３′方向に書かれ工いる。プローブ配列は、ｒＲＮＡ自身よりもむしろ該ｒＲＮＡに相補的な配列にハイブリダイズするように設計され℃いるプローブ１６３８．１６４２及び１６４３を除い℃は、ＤＮＡであり３′から５′方向に書かれている。これらの例外のプローブ類は該ｒＲＮＡと同様の“向き＃（すなわち、極性〕を持ち、５′から３′方向に書かれている。

表２−２３Ｓ　ｒＲＮＡを標的とする本発明の好ましいプローブ類のヌクレオチド配列をイー會；す（Ｅ、ｃｏｌｉ）の２３Ｓ　ｒＲＮＡにおけるその標的ヌクレオチド配列とともに示す。表４と同様に、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）配列ナンバーを、全２３Ｓ　ｒＲＮＡＩＣおける相同のプローブ標的配列を同定するための基準とじ℃用いている。Ｃ０Ｎ５−９ｏ％は表１におけるものと同様の意味を持つ。

該２３Ｓ　ｒＲＮＡ分析にあたっては、わずかに約３０の配列しか入手できなかった。しかしながら、これらは図２に示される主要なニーバクテリア分類のほとんどを代茨し℃いる。プローブ１７３０の配列において、＠Ｒ＃はその部位はＡ及びＧの１：ｌ混合であることを示す。

表３−ドットフ′ロットハイブリダイゼーションアッセイにおけるニーバクテリア及び非ニーバクテリアｒＲＮＡの代表的サンプルに対する複数の好ましい１６Ｓ　ｒＲＮＡ標的プローブの包含性及び排他性の冥例を示す。

表４−ドットグロットハイブリダイゼーションアソセイにおけるニーバクテリア及び非ニーバクテリアｒＲＮＡの代表的サンプルに対する複数の好ましい２３Ｓ　ｒＲ，ＮＡ標的プローブの包含性及び排慣性の実例を示す。

表５−−ドソトブーットハイプリダイゼーンヨンア２ノセイにおけＳニーバクテリア及び非ニーバクテリアｒＲＮＡ乃代表的サンプルに対する複数の池の好ましいｉ６Ｓ及び２３Ｓ　ｒＲＮＡ標おノ°ニーブの包含性及び排池仁の実例こ・示す。これらのプローブは特定なサブグループ類のニーバクテリア−特にダラム陽性及びグラム陰性バクテリア（心対し、て有用なハイブリｉ゛イ七−ンヨンパターンヲ示ス。

本発明のプへ−八ｌ）開発に１１（い″（とられた第−碧）ステップには、ニーバクテリア符異性核酸プローブ類に対する欅的部位となり５るような１６Ｓ及び２３Ｓｒ　ＲＮＡｌ７１：Ｉ領域の同定が含まれた。これには以下の特徴を有する部位の発見が必要であった：１）ニーバクテリアｒＲＮＡ配りＩＪの間で高度に保存され℃いる（ヌクレオチド変化、欠失若しくは挿入がζミとんどない）こと、及び２）非ニーバクテリアｒＲ，ＮＡ配列中では実質的に異なること。

この分析にむけて、入手できた１６５及び２３Ｓ　ｒＲＮＡ配列を正確に解明した。この努力の一部として、複数の１６Ｓ及び２３Ｓ　ｒＲ，ＮＡ配列が決定された。このようなヌクレオチド配列は、該ｒＲＮＡ類を規定する遺伝子類をクローニングしくマニアテスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、）、分子クローニング；実験マニュアル、コールドスプリングハーバ−研’に所、ニューヨーク、第５４５ｆｉ、１９８２年）、配列決定する（マキ／ツム及びギルバート（Ｍａｘａ五ηａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ）、ブロンーデイングズ　オフ゛　ザ　ナショナル　ア力デミイ　オフ゛　サイエンスＬＪＳＡ　（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｕ　ＳＡ　）、７４巻、第５６０−５６４頁、１９７７年；サンガーら（Ｓａｎｉｚｅｒ　ｅｔ　ａ！、）、プロシーデイングズ　オフ　ザ　す／ヨナル　ア力デミイ　オフ　サイエンス　しＩＳＡ（Ｐｒｃｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ）、７４巻、第５４６３−５４６７頁、１９７７年〕か、かつ／又は逆転写酵素を用いて該ｒＲ，ＮＡＲＮＡｌ７１列決定する（レーンら（Ｌａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、）、フ′ロターデイングズ　オフ′　ザ　ナンヨナＬ　Ｔ力デミイ　オフ　サイ！７．Ｘ　ＵＳＡ−（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｎｎｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ）、８２巻、第６９５５−６９５９頁、１９８５年；レーン（Ｌａｎｅ　）、原稿憔備中）ことにより標準的実験プロトコ　、−：てより決定さたｍ；１６Ｓ及び２３　Ｓ　ｒ　ＲＮＡＵｅ列の組につい又コンピューターアルゴリズムを、ユ〜バクテリア間で最も類似性の大きい領域の同定のため（−用いた。このような領域に対する核酸プローブ類は多様なニーバクテリア間に最も＠広くハイブリダイズするであろ５゜ニーバクテリア間で相同性を持つこのような領域を次に非ニーバクテリアｒＲＮＡ配列との相違性について評価した。特に、ニーバクテリアとヒト、真菌及びミトコンドリアの配列の間の配列相速性を探求した。

４１のプローブがこれらの分析に基づいて設計された；２２は２３Ｓ　ｒＲＮＡを標的とし、１９は１６Ｓ　ｒＲＮＡを標的とした。

これらのプローブ類の広範囲のニーバクテリアに対するハイブリダイゼーション特性をドツトプロットフォーマットのハイブリダイゼーション分析により測定した。

プローブ類の物理的説明：上述のプローブ選択計島からサンプル中のニーバクテリアを同定するために有用な複数のプローブが得られ、以下の好ましいオリゴヌクンオチドプローブ類が含まれる：１６Ｓ　ｒＲＮＡ標的プローブニブローブ　１６３８　：　５’　−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ −３’プローブ　１６４２　：　５’　−ＡＧＡＧＴ’ｒＴＧＡ　ＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’プローブ　１６４３　：　５’　−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧ−３’プローブ　１７３８：５’　−ＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴ−３’プローブ　１７４４　：　５’　−ＣＡＧＣＧＴＴ　ＣＧＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＣＴ　−３’プローブ　１６５９：５’−ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’プｏ−ブ　１６６０：５’　−ＣＴＧＣＴ（ＥＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＴＧＴ−３’グローブ　１６６１：５’　−ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧ−３’ グローブ　１７３９　：　５　’　−ＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣＧＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧ−３’７’Ｏ−ブ　１７４０：５’−ＧＧＧＴＴＧＣ（３ＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴ−３’ グローブ　１７４１：５’−ＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴ−３′ ７’ｏ−ブ　１７４２：５’　−ＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴ−３’ プローブ　１７４５：５’−ＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴ−３’プローブ　１７４６：ｓ’　−ＴＣＡＴＡＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＴ−３′ プローブ　１７４３：５’　−ＧＡＴＣＡＡ（３ＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧ−３’プローブ　１６３７：５’　−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’プローブ　１６３９：５’−ＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’グローブ　１６４０：５’−Ａ、ＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’プローブ　１６４１：５’−ＡＣＧＧＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’２３Ｓ　ｒＲ，ＮＡ標的プローブ：プローブ　１７３０＋５’　−ＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＲＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＲＣＴＡＴＣＧＧＴＣ’　３グローブ　１７３１：５’−ＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＧＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＧＣＴＡＴＣＧＧＴＣ’　３グローブ　１６５８：５’　−ＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧ（３ＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧ−３’ ７”ａ−ブ　１６５６：５’−ＣＴＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＴＴ（３ＣＧＧＴＡＣＧＧＧＣ−３’プローブ　１６５７：５’−ＧＧＴＡＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧｒＴＴＧＧＧＧＴＡＣＧ−３’ プローブ　１６５３：５’　−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’ プローブ　１６５４：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣ’ＴＴ−３’ プローブ　１６５５　：　５’　−ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’ プローブ　１６５１：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡ（３ＧＣ−３′ プローブ　１６５２：５’−ＴＴＣＧＡＴＣＡＧ（３ＧＧＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡ−３’ プローブ　１５１２：５’　−ＴＴＡＧＧＡＣＣＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＴ−３’ プローブ　１２５６：５’−ＧＧＴＣＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴαＫＴＡＣＣＴＴＡＧ−３’ プローブ　１３９８：５’　−ＧＧＴＣＧＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧ−３’ プローブ　１５１１コ５’　−ＣＧＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣ３’ プローブ　１５９５：５’　−ＣＧＡＴＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＣＧＧ−３’ プローブ　１６ｏＯ：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣ−３’ プローブ　１６０１　：　ｓ’　−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡ（３ＧＴＧＣＣＡＡＡＣ−３’ プローブ　１６０２：５’−ＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＧＣＧＡＴＧＡＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣ−３’ プローブ　１５９８：５’−ＣＧＴＡＣＣＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣ−３’ プロー７−　１５９９：５’−ＣＧＴＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴ（３ＧＧＡＣＣ−３’ プローブ　１５９６：５’　−ＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴ−３’ プローブ　１５９７：５’　−ＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴ−３’ 上記のグローブ類の特異的性質は、かなりの範囲がそれらの用いられるアッセイフォーマットに依存している。逆に、該アッセイフォーマットが特定のグローブ類の何らかの最適の設計要件を指図するであろう。本発明のグローブ類の“本質 ″は指定されたグローブ類の特定のヌクレオチド列に限定されると解釈すべきではない。例えば、これらの特定のオリゴヌクレオチドの長さは下で述べるドツトプロットアッセイ（及び何らかの他の予想されるアッセイ）におげろ使用に最適にしｔム最適なグローブの長さは選択されたハイブリダイゼーション条件の厳重度の関数となり、それゆえに本プローブ類の長さはそれらに応じ℃変化するであろうことは当業者には同類である。また、２個以上のグローブを含むセットを考える場合、全℃のグローブがそれらの使用される特定のフォーマットにおい℃矛盾のない方式で機能することが望ましい。このように、特定のプローブの正確な長さはその特異的な意図された使用法をある程度反映するであろう。さらに、本発明のグローブ類について言えば、通常の当業者はこれらを熟知している。

ここで述べるグローブ類の“本質”は、上で述べられており衣１及び表２に示されている特異的配列の発見及び利用にある。

プローブ特性のハイブリダイゼーション分析発表された標的配列の発見を導いた配列比較は該グローブ類の多くはかなりの数のニーバクテリアにハイブリダイズするであろうことを８役した。１６Ｓ　ｒＲＮＡ分析につい℃は、該グローブ類の設計において約３５０の配列が考察さＩｔ、２３Ｓ　ｒＲＮＡ分析については約３０の配列しか入手できなかった。全てのニーバクテリア株を試験することは不可能であるため、より大きな配列の多様性が配列分析によって調べられていない他のニーバクテリア株に存在し、そのような未試験のニーバクテリアに対して見込みがあるプローブ類によるノ・イブリダイゼーションを減少若しくは消失させると思われる。表３．４及び５に見ることができるよ５に、非常に幅広い包含性を持つプローブのい（つかはそれにもかかわらずある種のバクテリアにはハイブリダイズしない。それゆえに、多数の全体を代表するよ５な数のニーバクテリア（（対するハイブリダイゼーション特性を注意深（証明することは、そのようなプローブ類が全℃のニーバクテリアを検出しうろことを証明するための、若しくはそ５できない場合はどのニーバクテリアが検出されないかを証明するための重要な要素である。そのような“検出されないこと″は臨床的には重要でないと２Ｂわｊ１若しくは代わりに本発明の地のプローブ類の適当な包含性により補われるであろう。

該プローブ類の包含性と同じくらい重要なものがそれらの刊−ε性、すなわちそれらの非ニーバクテリアに対する反応性である。先に述べたようにヒト及び真菌のｒＲＮＡ類にハイブリダイゼーションしないことの豆証はこのようなプローブ類に想定されるタイプの臨床応用にＳいては非常に大きな重要性を持つ。それゆえ１代表的なニーバクテリア、ヒト及び真菌のｒＲＮＡに対する該プローブ類の特性をドツトプロット法を用いてのハイブリダイセーフ３フ分析により測定した。

実　施　例　１ニブローブハイブリダイゼーシヨン特性のドツト−プロット分析周矧の手法によるドツト−プロット分析は、ニトロセルロース、ナイロン、若しくは容易に購入できるこの目的用に特殊に誘導された膜等のフィルター上に核酸若しくは核酸群を固定することを含む。ＤＮＡかＲＮＡのいずれかをそのようなフィルター上に容易に固定することができ、続いて多様な条件〔すなわち厳重度〕のいずれかに′Ｊ６ける興味のあるヌクレオチド配列若しくはプローブに対するハイブリダイゼーションについ℃、プローブと作用させる若しくは試験することができる。厳重な条件下では、標的配列に対してより大きな相補性を持つヌクレオチド配列のプローブ類は相補性のより小さなプローブ類に比べて高いハイブリダイゼーションレベルを示すと思われる。ここで述べるオリゴヌクレオチドプローブのほとんどについ℃、６０℃で１４−１６時間のｒＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーシヨ／（０，９Ｍ　ＮａＣ１，０，１２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ、　ｐＨ７，８，６ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＫＰＯ，、０，１％ＳＤＳ、０．１％ピｏ　ＩＪ　７酸、０．００２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ及び０．００２％ポリビニルピロリジンを含む）１イブリダイゼーシヨン溶液中で行ない、その後未結合の、及び非特異的にノ・イブリダイズしたプローブを除去するための標準的後ノ・イブリダイゼーション洗浄（６０℃；Ｑ、０３Ｍ　ＮａＣ１，０，００４Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ、ｐＨ７，８，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ及びＯ９１％ＳＤＳ中）８行なう）は、表３，４及び５に表わした特異性レベルをもたらすに十分の厳重度を持つと思われる。これらの条件についての例外は。

プローブ１７３８（３７℃でハイブリダイズさせた）及びプローブ１７４６　（３７℃でハイブリダイズさせ、５０℃で洗浄した〕である。

粗（未精製）細胞溶解物中に存在するＤＮＡ若しくはＲＮＡを、問題の核酸を最初に精製する必要な（固定できる技法も使用できる（たとえば、マニアチス。

Ｔ、、フリツツエ、　Ｅ、Ｆ、及びサンプルツクｒ　Ｊ、（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ。

Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、　）、分子クローニング：冥験マニュアル、１９８２年）。

表３．４及び５に示したドツトプロット法・イブリダイゼーションデータは表示のプローブの表示のニーバクテリア、真菌及びヒト種から精製されたＲＮＡに対するハイブリダイゼーションから出された。バクテＪア及び真菌のＲＮＡは表示の微生物の純粋培養から精製した。マウスＲＮＡはＬ細胞（組織培養細胞系列）から精製した。小麦胚芽ＲＮＡは市販の穀物製品から精製した。ヒト血ＵＲＮＡ及び大便ＲＮＡは正常な健康個体から得た適当な標本から精製した。

複数の単純な技術的理由から細胞溶解物よりも、精製したＲＮＡを使用した。

これらの理由のうち最も重要なものは個々の生物に対するある特定のプローブのハイブリダイゼーションから得られる相対的シグナルの適正な解釈に関わっている。細胞あたりのＲＮＡ含量は種々のバクテリア間で太き（異なることが仰られ ℃お９．バクテリアと真残細胞の間ではより太き（異なっている。さらに採収時の細胞の特定の代謝状態は回収されるＲＮＡの量及び完成度に大きな影響を与え５る。たとえば、ある種のバクテリアは定常的氏長期に到達すると直ちにそのＲＮＡを分解し始める。夛３．４及び５に示した生物はあらゆる点で非常に多様な採集を含む。グラム陽性及びグラム陰性バクテリア、光合成及び化学合成、有機栄養及び無機栄養、及び嫌気性及び好気性の代謝を代表している。個々の°ドツト”中に既知の等量の精製ＲＮＡを使用することにより、各プローブの各生物に対するハイブリダイゼーションの相対レベルカミ表示の個々のタイプのバクテリアからの核酸調製物の特異性に関係な（、意味を持って比較できる。

ＲＮＡは当研究所で開発した標準公示方法の変法〔Ｗ、ワイスバーブ（Ｗ、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ）、未発表〕により調製し′ｐ４該方法からは迅速に大量の高分子ｔＲＮＡが高精製度だが比較的分別され℃いない形態で得られる。この様式ではＤＮＡ若しくは低分子１ＲＮＡ種は調製されたＲＮＡ中にほとんど若しくは全く見られない。完全な細胞中での該ＲＮＡがそうであるように該ＲＮＡの大部分は１６Ｓ及び２３Ｓ　ｒＲＮＡである（真後生物では１８Ｓ及び２８Ｓ　ｒＲＮＡである）。該方法は迅速かつ便利であるが、他のものは表３，４及び５に表わしたドツト−プロットの結果の解釈につい℃は適切でない。妥当な無傷性を持つＲＮＡを得るための、文献中に見られる他の現在許容できるほとんどの方法は同等のハイブリダイゼーション結果をもたらすであろ５゜表３．４及び５に報告したハイブリダイゼーション実験については、プローブ類を標準手法を用いて放射性ｓｔｐで末端ラベルした。上述のようにノ・イブリダイゼーション及び洗浄した後、ハイブリダイゼーションフィルターをＸ線フィルムに感光し、既知の配列の既知の量の標的ＲＮＡを含有する対照ＲＮＡスポットのシグナル強度に対して該シグナル強度を評価しｔう十←＋（対照スポットと同等の）・イブリダイゼーションシグナル）から＋（Ｘ線フィルムに長期間感光してもほとんど検出不能ンまでの範囲のＩ・イブリダイゼーショ７強度のスクールを、生物とプローブ類との間の）・イブリダイゼーションシグナルを比較するのに用いた。＋十＋シグナルは対照スポットよりわずかに強度が劣るのみの非常に強いシグナルを示す。＋十は明らかに認められるノ・イブリダイゼーションシグナルではあるが、対照スポットよりも著しく弱いものを示す。

ハイブリダイゼーションシグナルを記録するためのより”定量的”な方法もあるが、それらははるかに使用しづらく、我々の経験では１表３．４及び５で使用した方法に比べてプローブ評価において実際には少しも有用ではないことを銘記すべきである。事実、このよった異種生物類から得られた（同等の無傷性を持つン標的ＲＮＡを正確に同等蓋スボントする際のある制御できない変数により、数；口開してより１確なカウント方法は倶囃を招くだけの定量性のよさ：てずぎない。我々の経験では、特定σ）プローブに対し℃→以上のシグナルを示す微生物は “〜”シグナル・２示すものとは容易に環別できる。このことは試験した多様なアッセイフォーマットにあてはまる。

５３　、’ｉ　９３４１’：　’Ｊ穆も、シナよツ１−１２３　Ｓ　ｒ　Ｈ，’ ：Ａ標ａ’：Ｚ痴−７’２１６００、】６０２、】５９６．１２５６及び１５１２、及び１．６Ｓ　ｒＲＮＡ標的プローブ！Ａ１７３８．１６６０，１６３９、】７３９．１７４０，１．７４１及び】７４３は該ユーバ７クフーリア間に最も幅広（ハイブリダイズし、そのために最も好ましい。他のプローブ類は種々のパターンをもってニーバクテリアのサブグループ頌（１ζ・飄イブリダイズし５、それらのサブグループの検出用若Ｌ＜はより広範な包含性を持つプローブセットの成分として好ましいと思われろ。たとえば、プローブ１５９９．１６５６．１７４４．１７４５及び１７４６はグラム陽性バタテリアに優先的にハイ−７゛リダイズする。プローブ１６５７．１５９８及Ｕ１５９５はグ表３．４及び５のデータを見て明らかなよ５シて、地のプローブ類は他の有用なハイブリダイゼーションパターンを示す。これらのプローブ類は多様な方法で組み合わせて、成分となるプローブ類の複合ハイブリダイゼーンヨｙ％性を示すプローブセット２創造することができる。このようｔハイフ゛リタ゛イゼーションフォーマットの一例を下に示す（実施例２）。

あるいは、該プローブ類は標的である微生物に巷異的なプローブ類に先立つ王、あるいはそれらと同時に、微生物の混合群中に存在するプールから特異的ｒＲＮＡ分子を＄９除く多様な負のハイブリダイゼーション計画に使用することができる（たとえば、コリンズＣＣｏｆｆ１ｎｓ）、欧州特許出願第８７３０９３０８．２号）Ｏ実　施　例　２：二重プローブ、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ本発明のプローブ類苔しくはそれらの誘導体類は多様な他のハイブリダイゼーションフォーマットにおい工有効に使用することができる。そのようなフォーマットのひとつは、たとえばＵ　Ｓ　Ｓ　Ｎ第２７７．５７９号；ＵＳＳＮ第１６９，６４５号、若しくはＵＳＳＮ第２３３，６８３号ＩＣ述べられているような二重プローブ、サンドインチ型ハイブリダイゼーションアツセイである。このような二重プローブ使用では、一方のプローブ（たとえば、プローブ１６０２若しく（よその誘導体）は理想的には３′宋端に約２０　２００デオキシアデノンン（ｄＡ）残基からｌる領域を含むように誘導これるで方ろ冗これは、試験す′７プル中から該標的ｒＲＮＡｔ−（液体中のハイブリダイゼーンヨ／の後〕、この目的のためにポリデオキシチミジン（ｄＴ）で適当に誘導しておいた固型担体（たとえば、ビーズ、プラスチック表面、フィルター等）上哨甫獲′するために用られるであろ５゜第２のプローブ（たとえば、プローブ１５９６若しくはその誘導体）は検出プローグとして有効に使用され、何らかの検出リガンド（たとえば、３２Ｐ、フルオレセイン、ビオチン等〕により適当に誘導されているであろう。

そうして試験サンプル中の標的シ酸の存在の検出が、一連のハイブリダイゼーション相互作用を通じ又該固体表面上に核検出リガンドを捕獲することにより示されるであろ５：ｎ−ＡＡＰＡＭ区幻μ（捕獲プローブ）（検出プローブ）これは該標的核酸が試験サンプル中に存在する場合にのみ起こ９得るであろ５゜原則とし℃、上記の機構はたとえば該アッセイの包含性の改善若しくは感度の向上の目的で複数の捕獲及び検出プローブ類により用いることができるであろづ。

笑　施　例　３：１６Ｓ　ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅ポリメラーター反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔＩｏｎ　：　ＰＣＲ）（１２個の標的配列間にある核酸配列を“コピー”することにより標的核酸を増幅する周知の方法である（ＵＳ第４，６８３，２０２号〕。該ＰＣＲ過程はたとえば非ウィルス性病原体を該病原体のｒＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ遺伝子をコード化している遺伝子を増幅した後、その産物を検出することにより診断するためのアッセイにおいて有用であろう。この診断方法の実行には該標的微生物（類）のｒＲＮＡを増幅することができるプライマーの発明が必要である。このようなプライマーの第２の重要な応用は増幅されたｒＲＮＡ遺伝子のクローニングにおいτなさへ第３の応用は増幅されたｒＲＮＡ遺伝子の直接配列決定である。

プローブ１６３８．１６４２．１６４３．１６３７．１６３９，１６４０及び１６４１はニーバクテリアの１６Ｓ　ｒＲＮＡ類若しくはそれらをコード化する遺伝子類を酵素的にコピーかつ／又は増幅するためのプライマーとし工理想的に使用することができる。該ＰＣＲ処置は該標的残酸が一本鎖であるか若しくは二本鎖であるか、及びそれがＤＮＡであるか若しくはＲＮＡであるかによってわずかに異なる。１〜かしながら、いずれの場合も原理は同じである。該ステップは簡単には次のようである：１）二本鎖ＤＮＡを変性させる、２）姉妹ＤＮＡＭのそれぞれに相補的なオリゴヌクレオチドブライマーをアニールさくる、及び３）ＤＮＡポリメラーゼかつ、／又は逆転写酵素を用いて該プライマー類をその３′末端から延長させることにより新たに合成された姉妹ＤＮＡ＠中にデオキシヌクＶオチド３リン酸プリカーサ−（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を組み入れる。

このように、該標的遺伝子中の各鎖に相補的な一組のオリゴヌクレオチドブライマーが該ＰＣＲ反応には必要である。それらは一方のプライマーの新たに合成さ、れた産物が他方のプライマーの標的／鋳型＋Ｃもなるよ５に配置さｉする。このように２個のプライマーがアニールした部位の間にある標的ヌクレオチド配列は１列挙したステップを約２０ないし３０回繰り返すことにより何倍にも増幅できる。

グローブ１６３８．１６４２．１６４３．１６３７．１６３９．１６４０及び１６４１はニーバクテリアの１６Ｓ　ｒＲＮＡ類若しくはそれらをコード化する遺伝子類の酵素的コピーかつ／又は増幅におけるプライマーとしτの使用に適し℃ いる。すなわち、セットとし℃、それらはニーバクテリアのｒＲＮＡ類及びｒＲＮＡ遺伝子類の間に非常に幅広くアニールし、その結果サンプル中に存在するいずれのニーバクテリアｒＲＮＡ配列をも増幅すると思われる。

グローブ１６３７．１６３９．１６４０及び１６４１は１６Ｓ　ｒＲＮＡ（若しくはリポソームＲＮＡ遺伝子のｒＲＮＡ様ｆｉＡ）の３′末端付近に対合する（表１）。該鋳型鎖は３′から５′方向に読まれ、該プライマー自身をその５′床端に組み込んだｒＲＮＡ相補性鎖を産生ずる。

プローブ１６３８．１６４２及び１６４３は該ｒＲＮＡ遺伝子のｒＲＮＡ相補性鎖の５’Ｘ端付近、若しくはすぐ上で述べたように産生された相補物にハイブリダイズする。

それぞれ、上記の１６８　ｒＲＮＡ増幅プライマー類はおよそ以下の特異性を持つ：５′プライマーニブローブ１６３８：ｉ”ｍとんどのニーバクテリアプローブ１６４２：請内細１！］（ｅｎｔｅｒｉｃｓ）及びその近縁菌プローブ１６４３：ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　）ｙ、ピロベータ３′プライマーニブローブ１６３７：はとんどのニーバクテリアプローブ１６３９：鳴門細菌（ｅｎｔｅｒｉｃｓ　）、ディノコッヵス（Ｄｅｉｎ。

ｃｏｃｅｕｓ　）、カンピロバクタ−（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）グローブ１６４０：ｆｋとんどのニーバクテリアグローブ１６４１：紡＠菌、ある種のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ八種標的バクテへアが既知である試験サンプルにおいては、特異的プライマーを使用することができろ。標的微生物が明確には知られていない（たとえば、何らかのニーバクテリアであるン場合には、上記のプライマー類のすべてをセットにし℃使用することができる。

上述のプライマー類は１６Ｓ　ｒＲＮＡ配列のほぼ全体を増幅するよ５に設計されている。本発明の他のプローブ類及びそれらの誘導体のいずれも１６Ｓ及び２３　Ｓ　ｒ　ＲＮＡａ、及び遺伝子類のサブセグメントをすぐ上で述べたのと同様の様式で増幅させるのに使用することができる。

このようなプライマー類はいずれも、増幅された転写物中にたとえばＲＮＡポリメラーゼプロモーター類、クローニング部位等を組み込むような多数の方法により修飾することができろ◎ 本発明の記述はｒＲＮＡの検出に関してなされ℃いるが、ここに述べたプローブ類及びここに述べたものに相補的なプローブ類は該ｒＲＮＡを規定する遺伝子＠（ＤＮＡ）の検出にも有用であろうということ、及び従ってこのようなプローブ類は記述されているプローブ類と同等であると考え、本発明の精神及び範囲及び請求の範囲の字に含まれ乙べきでる石ということは容易に理解されよ５゜表２：２ＢＳ　ｒＲＮＡｌｊ的プローブ類及び標的配列表２（Ｉ＆き）：２３ＳｒＲＮＡ標的プローブ拳及び標的配列イー・コリ配夕ｊ］す・シー　２４４２　２４８１イーリリ（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ）２：うＳ　Ａ（？［ＪＣＣＧ４Ｘ；ＧＡＵＡＡＣＡＧＧＣＬＩＧＡｔＪＡＣＣＧＣＣＣＡＡＧＡＧＩＪＬＪＣ`ＵＡＵＣＧＡＣＧプμｍブ１５９５３′へ℃ＣＣＣＣＴＡＴＴＧＴＣｃＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＧＧ γ■丁Ｃ鮎ＧＴＡＴＡαン５′イー　・”　：、’　（Ｅ、　ｅｏｌ　ｉ　）２３．Ｓ　ＧＧＵＧＩＪＬ’１Ｊ（Ｘ；ＣＡＣＣＵＣＧＡＵＧＵＣＧＧＣＵＣＡＬＩＣＡＣＡtＣＣＩＪＧＧＧＧ（？Ｌ’ＧＡＡＧブーーー：’１６０１）３’−ＣＡＡＡＣＣＧＴＧＧＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＡＧＴＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＣ−５’ブ１】−プ１６０１　３’　−ＣＡＡＡＣ（、ＧＴＧＧＡＬＸ：ＴＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＣ−５’ブーｌ−ｊ　１．６０２　３’　−ＣＡＡＡＣＣＧＴＧＧＡＧ σＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧα汀Ａ弱ＡＣＣＣＣＧＡＣ−５’イー；ゴリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）２３Ｓ−ンＵＡＧＧ１１ＣＣＣｒう、ＡＧＧＧＩＪＡＵ（Ｘ”、０ＪＧＬＩＩ下ＣＧＣＣＡＩＬＩＪＩ〜ＡＧＵfＧＵＡＣＧＣＧＡ：１ｏ−７’１５９８　３’−ＣＣＡＣ＝ｒ−ＧＴＴＣＣＣＡＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣ−５’ブ自−ブ１５９９　３’　− ＣＣＡＧＧＧ１″ｒＣＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＡＡＴｒＴα’ｌｆ：ＧＴＧＣ−５’イー、、＋１１（Ｅ、ｃｏｌｉ）２：う５ＧＣＧＡＧＣＵＧＧｆａＪＵＡ（λ＾−ＡＣＧＵＣＧＵＧＡＧＡＣＡＧＬ”ＵＣＧＧＵＣＣＣ１ｊ `ＵＣＬＩＧＣブａ−ブｌ　５９６　３’　−ＴＣＧＡＣＣＣＡＡＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴ（？ＴＧＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＡＧ　−５’ブｏ−７’１５９７　３’− ＴＣＧＡＣＣＣＡＡＧＴ（？ｎ’ＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＡＧ−５’国際調査報告畷＾＋−−＋−５ｓａｌＡｅｌｉ＋−＋ｔ−ｗ−ＰＣＴ／ＵＳ９０１０３００４国際調査報告和；″ｍｍｍ−二二”’ユニー二：二；コ、二：’−’：ＩＭ？：フ”：”二ｔ＝；二：：Ｑ：二、：＝“ン１７二フ１τニア７°゛゛“２汲香|ｉ品乃Ｔ′− “°−”−“””“ ｔｈ＠ｔａｍｌＩｈｌｌｌｌｌｌ＠イ１ｉｅｓｉｔｉｓｓｅ＋＋＋＋ｙ１１８１＋９ｊａｒｋ＊％ｒｂｃｖｌａＮｗｈ＋ｃｂ＃ｆｆｍ１＄１SｍｔｈｅｋｍｍｍｌＲ１ｙ＋ｉ１−啼−自−喝。

Claims

【特許請求の範囲】

１．ユーバクテリアのｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡにハイブリダイズすることができる核酸フラグメント。
２．当該フラグメントがマウスＬ細胞、小麦胚芽、ヒト血液若しくはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）のいずれのｒＲＮＡ及びｒＤＮＡにもハイプリダイズすることができない請求項１記載の核酸フラグメント。
３．当該フラグメントか１６３８、１６４２、１６４３、１７３８、１７４４、１６５９、１６６０、１６６１、１７３９、１７４０、１７４１、１７４２、１７４５、１７４６、１７４３、１６３７、１６３９、１６４０、１６４１、１７３０、１７３１、１６５８、１６５６、１６５７、１６５３、１６５４、１６５５、１６５１、１６５２、１５１２、１２５６、１３９８、１５１１、１５９５、１６００、１６０１、１６０２、１５９８、１５９９、１５９６、１５９７からなる群から選択されるプローブ類中の任意の１０個の連続的ヌクレオチドを含む配列の最低９０％に相補的である請求項２記載の核酸フラグメント。
４．当該フラクメントが１６３８、１６４２、１６４３、１７３８、１７４４、１６５９、１６６０、１６６１、１７３９、１７４０、１７４１、１７４２、１７４５、１７４６、１７４３、１６３７、１６３９、１６４０、１６４１、１７３０、１７３１、１６５８、１６５６、１６５７、１６５３、１６５４、１５５５、１６５１、１６５２、１５１２、１２５６、１３９８、１５１１、１５９５、１６００、１６０１、１６０２、１５９８、１５９９、１５９６、１５９７からなる群から選択されるプローブ類中の任意の１０個の連続的ヌクレオチドを含も配列の最低９０％に相同である請求項２記載の核酸フラグメント。
５．最低２個の核酸フラグメントを含み、それらのうち少なくとも１個が１６３８、１６４２、１６４３、１７３８、１７４４、１６５９、１６６０、１６６１、１７３９、１７４０、１７４１、１７４２、１７４５、１７４６、１７４３、１５３７、１６３９、１６４０、１６４１、１７３０、１７３１、１６５８、１６５６、１６５７、１６５３、１６５４、１６５５、１６５１、１６５２、１５１２、１２５６、１３９８、１５１１、１５９５、１６００、１６０１、１６０２、１５９８、１５９９、１５９６、１５９７及びそれらに相補的な配列類からなる群から選択されるプローブセット。
６．プローブ１６３８若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
７．プローブ１６４２若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
８．プローブ１６４３若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
９．プローブ１７３８若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１０．プローブ１７４４若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１１．プローブ１６５９若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１２．プローブ１６６０若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１３．プローブ１６６１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１４．プローブ１７３９若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１５．プローブ１７４０若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１６．プローブ１７４１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１７．プローブ１７４２若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１８．プローブ１７４５若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
１９．プローブ１７４６若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２０．プローブ１７４３若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２１．プローブ１６３７若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２２．プローブ１６３９若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２３．プローブ１６４０若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２４．プローブ１６４１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２５．プローブ１７３０若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２６．プローブ１７３１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２７．プローブ１６５８若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２８．プローブ１６５６若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
２９．プローブ１６５７若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３０．プローブ１６５３若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３１．プローブ１６５４若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３２．プローブ１６５５若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３３．プローブ１６５１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３４．プローブ１６５２若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３５．プローブ１５１２若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３６．プローブ１２５６若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３７．プローブ１３９８若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３８．プローブ１５１１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
３９．プローブ１５９５若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
４０．プローブ１６００若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
４１．プローブ１６０１若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラクメント。
４２．プローブ１６０２若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
４３．プローブ１５９８若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
４４．プローブ１５９９若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
４５．プローブ１５９６若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラグメント。
４６．プローブ１５９７若しくはその相補的配列である請求項１記載の核酸フラクメント。
４７．ａ）サンプルを少なくとも１個の核酸フラグメントに、当該ユーバクテリアが当該サンプル中に存在する場合にそのｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡに当該フラグメントがハイブリダイズしてハイブリッド核酸複合体を形成させるが、非ユーバクテリアのｒＲＮＡ及びｒＤＮＡとはハイブリダイズしない条件下で接触させること；及びｂ）当該ハイブリツド核酸複合体を当該サンプル中の当該ユーバクテリアの存在の指標として検出すること、からなるサンプル中のユーバクテリアの存在を検出する方法。
４８．当該接触段階の当該核酸フラグメントが１６３８、１６４２、１６４３、１７３８、１７４４、１６５９、１６６０、１６６１、１７３９、１７４０、１７４１、１７４２、１７４５、１７４６、１７４３、１６３７、１６３９、１６４０、１６４１、１７３０、１７３１、１６５８、１６５６、１６５７、１６５３、１６５４、１６５５、１６５１、１６５２、１５１２、１２５６、１３９８、１５１１、１５９５、１６００、１６０１、１６０２、１５９８、１５９９、１５９６、１５９７からなるプローブの群から選択される請求項４７記載の方法。
４９．当該ユーバクテリアがグラム陽性であり、かつ当該核酸フラグメントが１５９９、１６５６、１７４４、１７４５及び１７４６からなるプローブの群から選択される請求項４７記載の方法。
５０．当該ユーバクテリアがグラム陰性であり、かつ当該核酸フラグメントが１５９９、１６５６、１７４４、１７４５及び１７４６からなるプローブの群から選択される請求項４７記載の方法。
５１．当該接触段階がプローブ１６３８、プローブ１６４２及びプローブ１６４３からなる群から選択される核酸フラグメントを含み、かつ当該検出段階がさらに当該サンプルを１６３７、１６３９、１６４０及び１６４１からなるプローブの群から選択される第２の核酸フラグメントに接触させること、及びユーバクテリアの１６ＳｒＲＮＡ若しくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をポリメラーゼ鎖反応によつて増幅させることを含む請求項４７記載の方法。