CN103160587B - 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对10种常见致病军团菌（ Legionella ）的基因分型芯片及检测用试剂盒，其主要针对嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，长滩军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌等10种军团菌。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针包含从16s-23s间区序列（ITS）上选取的DNA片段或其互补的DNA片段。利用设计的引物将待检测样品基因组DNA扩增并标记后，用上述基因芯片进行杂交，根据杂交信号，可检测出不同种类的军团菌。利用本发明的基因芯片可达到检测常见致病军团菌的目的，操作简便，准确性高，重复性强，并且可更准确的指导医疗用药。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，长滩军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌等10种军团菌的的基因芯片及检测用试剂盒。
背景技术
水是生命得以存在的必要条件，它使我们人类得以繁衍生息，人类的生活、生产、娱乐都离不开水。它同时也是许多病原微生物滋生、传播的场所和载体，这些病原微生物一旦进入人体则将可能使人患病、甚至导致死亡，严重威胁着人类健康。随着社会的发展和生活水平的提高，人们越来越关心自身的健康问题，而各种水体（包括生活饮用水，江河湖泊，游泳场馆等）的安全问题也日益成为人们关注的热点。因此，为了保护人们的身体健康，对各种水体尤其是饮用水中病原微生物的检测是十分必要和亟需的。
军团菌（legionella）是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然和人工环境的水体、土壤中，可以通过含菌气溶胶的方式在空气中播散而被人体吸入导致人类感染，引发急性发热性肺部疾病——军团病。自1976年首次在美国发现军团病以来，该病已呈现出世界性分布及病死率高的两大特点。军团菌的生长繁殖与环境因密切相关，集中空调的冷却塔冷却水、冷凝水以及温泉水是军团菌在外界适宜的生存环境。当环境水中的军团菌繁殖到一定浓度，则会形成气溶胶进而感染人。宿主感染主要受其易感性和细菌毒力的影响，任何年龄均可发生，但中老年、基础免疫较差者、长途旅行者、吸烟者为高危人群，并以医院、宾馆、大型建筑工地等公共场所易染军团菌。
此外，军团菌属种类多样，常规的细菌培养和血清鉴定分型，耗时长，工作量大，通量低，不能满足流行病学调查及对突发致病事件快速分析需要。免疫血清学方法是利用细菌抗原的独特性及抗原抗体结合的特异性建立起来的现代检测技术，具有特异性强等特点。许多临床疾病已经开始使用这种方法进行病原体检测，如利用HBV表面抗原检测HBV病毒。然而，由于这种方法需要经过至少48小时的细菌培养、扩增和单菌落的分析，并需要对每一个样品的大量单菌落进行抗血清凝聚反应，耗时长且可能出现假阴性。另外，世界上没有一家公司或单位能生产全部细菌的抗血清，即使是最常用的大肠杆菌的抗血清，也只有少数几个公司和单位有全部血清型的抗血清而且价格昂贵。
1993年，Luk，J.M.C et.al选取沙门氏菌（S.enterica）O-抗原基因簇的特异核苷酸序列，通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原 [Luk, J.M.C. et.al (1993) “Selective amplification of abequose and paratose synthase genes (rfb) by polymerase chain reaction for identification of S. enterica major serogroups (A, B, C2 and D)”, J. Clin. Microbiol. 31: 2118-2123]，开启了从O抗原基因簇中筛选特异分子标识的先河，为细菌多样的O-抗原检测提供了高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高的分子检测方法。细菌O抗原种类繁多，一般不同的细菌具有不同的O-抗原，同一种属内的细菌也大多有不同的O-抗原。研究表明，细菌O-抗原的多样性是由负责其合成的基因簇的遗传学多样性导致，O-抗原基因簇中的一些特定基因对于其编码的表面抗原具有极高的特异性，由此为启发，可以从O抗原基因簇中筛选特异分子标识，用于军团菌分子分型。
目前，应用军团菌检测方面的专利或专利申请主要有：
（1）扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物及其应用（公布号: CN102168131）， 该专利申请提供了一种分别扩增米克戴德军团菌(Legionella micdadei)；博兹曼军团菌(Legionella bozemanii)；长滩军团菌(Legionella longbeachae)中gyrB基因 (DNA gyrase B subunit gene，以下简称gyrB) 特异区的引物，还提供了一种包括扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，利用该PCR试剂盒对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于水体和临床样品的监督和检测、饮用水中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。
（2）一种检测水中常见致病菌的DNA微阵列（公布号：CN1396270A ，公开日：2003年2月12日），该专利申请公开了一种DNA微阵列检测水中常见致病菌的技术。该技术利用16S rRNA基因检测与鉴定水中常见致病菌，两条引物分别设计在16S rRNA基因的保守区，探针在16S rRNA基因的可变区。该DNA微阵列技术可检测埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属、厌氧梭状芽孢杆菌属、链球菌属、军团杆菌、结核分枝杆菌、耶尔森氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌，可用于临床疾病诊断、水和食品的监督与检测与流行病学调查。该技术由于16S rRNA的高度保守性，分辨能力较低，无法区分到种，也无法区分大肠杆菌和志贺氏菌。
（3）一种扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物及其应用（公布号: CN101967474），该专利申请公开了一种扩增嗜肺军团菌中gyrB基因 (DNA gyrase B subunit gene， 以下简称gyrB) 特异区的引物，还提供了一种包括扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，利用该PCR试剂盒对嗜肺军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于水体和临床样品的监督和检测、饮用水中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。 （4）嗜肺军团菌mip基因克隆、重组、表达和蛋白纯化方法（公布号: CN1664105），该专利申请公开了一种嗜肺军团菌Legionella pneumophila macrophage infectivity potentiator （mip）基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及MIP蛋白及其类似物、衍生物在军团菌感染病人的临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的嗜肺军团菌基因组DNA，用PCR方法获得mip基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取MIP蛋白，进而应用亲和层析方法得到高纯度的蛋白，为临床进一步诊断嗜肺军团菌感染应用于检测嗜肺军团菌抗原和抗体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒，以弥补传统饮用水水质检测技术存在的费时、耗力，分辨能力差的缺陷，扩展病原微生物检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：
一种检测致病军团菌（Legionella）的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：
（1）嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，长滩军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌等10种军团菌的16s-23s间区序列（ITS）中所选取的至少一种DNA片段；
（2）（1）中选取的DNA片段的互补DNA片段；
本发明所述的固相载体为带有活性基团的玻璃片。
所述寡聚核苷酸探针优选具有SEQ ID NO:1-29 所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO:1-29 但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-29 所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；本发明所述的基因芯片，还包括正对照探针。
上述的优选序列及功能如下所示：
SEQ ID (5'-3')
NO:1 CAAGAATCGGAACGCGGTCCAAGATTGG 用于检测嗜肺军团菌
NO:2 AAGCGATTGGTATTTGCATCATGTGATTT 用于检测嗜肺军团菌
NO:3 CATAGAAAGGCACAGAAGGAACTAGAGTGC 用于检测嗜肺军团菌
NO:4 GCATGCATCAGTATGTGACCAAGCGAGCGAG 用于检测安氏军团菌
NO:5 CGAGCGAGTGGATGCAATGAAAACAAATTT 用于检测安氏军团菌
NO:6 AAAGCCGTGACCGAGAGGAAGCGGGAAGA 用于检测博滋曼军团菌
NO:7 AAGCGGGAAGATGCGCGGTCACGCTGAAAGC 用于检测博滋曼军团菌
NO:8 TCGTGACCGAGAGGAAGCGGGAAGATGCGC 用于检测博滋曼军团菌
NO:9 TGAATGATGAATAAATCCTAAGCTTCTGAA 用于检测杜莫夫军团菌
NO:10 CTGAAAGGAAGCAAATGCTTGATAAAGC 用于检测杜莫夫军团菌
NO:11 TCCTAACCGTAATTTTTTATGCGGAAAGAAT 用于检测杜莫夫军团菌
NO:12 GATTGCCGTATTTTTTGGGTGGATTGGAATG 用于检测费菲军团菌
NO:13 AGAGTCTGCATTGTGTAGCATTGATTATTG 用于检测费菲军团菌
NO:14 TGGGTGGATTGGAATGGTTTCATGAA 用于检测费菲军团菌
NO:15 TGAGCCCGGTTCATAACGTTGTGAGTGCGGC 用于检测戈尔曼军团菌
NO:16 AGATAATTTTTCTTTAGTTCAAGTAAGTGTT 用于检测戈尔曼军团菌
NO:17 GTAAAATTGCACTGTCTTGCGTTGGAG 用于检测戈尔曼军团菌
NO:18 ACTCCGATGCGAGGGAGCGAAGCGACCAA 用于检测乔丹河军团菌
NO:19 TGCTGAGCGAGGGAGCTTCGTAACCAAGGGGT 用于检测乔丹河军团菌
NO:20 ACCTTTATTGATTTTAGCGATGGCTTTGAA 用于检测乔丹河军团菌
NO:21 AAGCGGTAACAAAAGAGTGACTCGAAGC 用于检测长滩军团菌
NO:22 CCAATTTTAGGGTTTTCAAGGATAGTCCA 用于检测长滩军团菌
NO:23 CAGAAAGATGAAAAATCTTAAGCTGCG 用于检测长滩军团菌
NO:24 ATTCCTTAATCGAGATGTCAACGCGAAGG 用于检测米氏军团菌
NO:25 GCTCGGTATGTGACCGAGGAAAAGCATGTC 用于检测米氏军团菌
NO:26 TACCGATGGCGCTTGGAACGGGCTAATGAGCC 用于检测米氏军团菌
NO:27 AAGACAAGGAAAAGAATAGCAGATTCTGCG 用于检测迈氏军团菌
NO:28 GCATCGGTGCGAAAGAGTAAGGGAGCCTACG 用于检测迈氏军团菌
NO:29 ACGCAAGTAGGTGGCTGAACGAAAGGGTAT 用于检测迈氏军团菌
NO:30 OA-1993
TTTTTTTTTTTTTTTTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT 为正对照探针
Cy3 : TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy-3为荧光探针
本发明的基因芯片，可用于嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，长滩军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌等10种军团菌中至少一种致病菌的检测。
本发明所述的基因芯片的制备方法，主要包含步骤：
1）根据权利要求1所述军团菌的16s末端保守序列和23s前端保守序列设计并制备出用于PCR扩增的通用引物；
2）制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1）中的引物，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，得到靶序列；
3）标记步骤2）中得到的靶序列；
4）将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；
5）用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
其中，步骤1）中所述的引物包括SEQ ID NO: 31-32所示的核苷酸序列，各条引物探针的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是：
P1 （SEQ ID NO：31） TGTACACACCGCCCGTC 用于扩增10种致病军团菌ITS序列的上游引物；
P2 （SEQ ID NO:32） GGTACTTAGATGTTTCAGTTC 用于扩增10种致病军团菌ITS序列的下游引物；
本发明的另一目的是提供一种军团菌检测用试剂盒，该试剂盒包括上述的基因芯片，所述的基因芯片包含SEQ ID NO:1-29的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种；还包含PCR扩增的引物，该引物具有SEQ ID NO: 31-32的核苷酸序列的至少一种，本发明所述的试剂盒还包括杂交盒、杂交液等。
本发明所述的试剂盒，可用于对嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，长滩军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌等10种军团菌至少一种致病菌的检测。
本发明公开的用于检测重要致病菌军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒与现有技术相比，有益效果在于：
（1）现有芯片技术研究所设计的引物和探针基本都位于16S rRNA基因，本发明将在具有明显进化优势的 16s-23s间区序列（ITS）上上，设计特异探针和引物，有效的避免了分辨能力较低，无法区分到种的弊端，大大弥补了现有技术中检测芯片的检测范围的欠缺。
（2）该检测方法大约需24小时。在一张片基上可同时检测8个样品，减少了成本，实现高通量，同时检测多个样品的目的，特别适合于检测那些多重感染的样品。
（3）本发明将芯片技术引入到水体重要致病菌的快速检测中，建立了一种快速、灵敏、高通量、准确性高、重复性强的全新的分型检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到对10种主要的病原微生物进行检测的目的，由于操作简便，准确性高，能一次完成多种型别的检测，重复性强，因此对于水质监测部门水质监测有重要的应用价值，实现对嗜肺军团菌的快速准确的检测。
附图说明：
图 1 为本发明的基因芯片结构外形示意图；
图 2 为本发明芯片的单一点阵结构示意图；
图3 为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌的的杂交结果示意图；
图4 为利用本发明的基因芯片检测安氏军团菌的的杂交结果示意图；
图 5 为利用本发明的基因芯片检测博滋曼军团菌的杂交结果示意图；
图 6 为利用本发明的基因芯片检测杜莫夫军团菌的杂交结果示意图；
图7 为利用本发明的基因芯片检测费菲军团菌的杂交结果示意图；
图8 为利用本发明的基因芯片检测戈尔曼军团菌的杂交结果示意图；
图 9 为利用本发明的基因芯片检测乔丹河军团菌的杂交结果示意图；
图10 为利用本发明的基因芯片检测长滩军团菌的杂交结果示意图；
图11 为利用本发明的基因芯片检测米氏军团菌的杂交结果示意图；
图12 为利用本发明的基因芯片检测迈氏军团菌的杂交结果示意图；
图13 为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测100ng/μL杜莫夫军团菌的杂交结果示意图；
图14 为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测10ng/μL杜莫夫军团菌的杂交结果示意图；
图15 为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测1ng/μL杜莫夫军团菌的杂交结果示意图；
图16 为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测0.1ng/μL杜莫夫军团菌的杂交结果示意图。
具体实施方式
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：
表1 实验所用标准菌株
实施例1 探针的设计和制备
1. 序列获得：
（1）长滩军团菌ITS序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到长滩军团菌ITS序列；
（2）嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌的ITS序列由本实验室破译获得；
2. 探针设计举例：
安氏军团菌的探针：将安氏军团菌ITS序列导入Glustal X软件中，选取一条代表序列在公共数据NCBI中作Blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入OligoArray 2.0软件中。运行程序在线设计探针。
3. 探针合成：将下表1中的探针序列的5’端加T延长至40 bp并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
4. 探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异的探针。
其它探针的设计方法与安氏军团菌探针设计方法相同。
本发明通过多次杂交实验进行探针筛选，得到的优选的探针如表1所示：
表2. 本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的嗜肺军团菌
| SEQ ID | 探针编号 | 序列(5'-3') | 检测军团菌种类 |
| NO:1 | NO.1 | CAAGAATCGGAACGCGGTCCAAGATTGG | 用于检测嗜肺军团菌 |
| NO:2 | NO.2 | AAGCGATTGGTATTTGCATCATGTGATTT | 用于检测嗜肺军团菌 |
| NO:3 | NO.3 | CATAGAAAGGCACAGAAGGAACTAGAGTGC | 用于检测嗜肺军团菌 |
| NO:4 | NO.4 | GCATGCATCAGTATGTGACCAAGCGAGCGAG | 用于检测安氏军团菌 |
| NO:5 | NO.5 | CGAGCGAGTGGATGCAATGAAAACAAATTT | 用于检测安氏军团菌 |
| NO:6 | NO:6 | AAAGCCGTGACCGAGAGGAAGCGGGAAGA | 用于检测博滋曼军团菌 |
| NO:7 | NO.7 | AAGCGGGAAGATGCGCGGTCACGCTGAAAGC | 用于检测博滋曼军团菌 |
| NO:8 | NO.8 | TCGTGACCGAGAGGAAGCGGGAAGATGCGC | 用于检测博滋曼军团菌 |
| NO:9 | NO.9 | TGAATGATGAATAAATCCTAAGCTTCTGAA | 用于检测杜莫夫军团菌 |
| NO:10 | NO.10 | CTGAAAGGAAGCAAATGCTTGATAAAGC | 用于检测杜莫夫军团菌 |
| NO:11 | NO.11 | TCCTAACCGTAATTTTTTATGCGGAAAGAAT | 用于检测杜莫夫军团菌 |
| NO:12 | NO.12 | GATTGCCGTATTTTTTGGGTGGATTGGAATG | 用于检测费菲军团菌 |
| NO:13 | NO.13 | AGAGTCTGCATTGTGTAGCATTGATTATTG | 用于检测费菲军团菌 |
| NO:14 | NO.14 | TGGGTGGATTGGAATGGTTTCATGAA | 用于检测费菲军团菌 |
| NO:15 | NO.15 | TGAGCCCGGTTCATAACGTTGTGAGTGCGGC | 用于检测戈尔曼军团菌 |
| NO:16 | NO.16 | AGATAATTTTTCTTTAGTTCAAGTAAGTGTT | 用于检测戈尔曼军团菌 |
| NO:17 | NO.17 | GTAAAATTGCACTGTCTTGCGTTGGAG | 用于检测戈尔曼军团菌 |
| NO:18 | NO.18 | ACTCCGATGCGAGGGAGCGAAGCGACCAA | 用于检测乔丹河军团菌 |
| NO:19 | NO.19 | TGCTGAGCGAGGGAGCTTCGTAACCAAGGGGT | 用于检测乔丹河军团菌 |
| NO:20 | NO.20 | ACCTTTATTGATTTTAGCGATGGCTTTGAA | 用于检测乔丹河军团菌 |
| NO:21 | NO.21 | AAGCGGTAACAAAAGAGTGACTCGAAGC | 用于检测长滩军团菌 |
| NO:22 | NO.22 | CCAATTTTAGGGTTTTCAAGGATAGTCCA | 用于检测长滩军团菌 |
| NO:23 | NO.23 | CAGAAAGATGAAAAATCTTAAGCTGCG | 用于检测长滩军团菌 |
| NO:24 | NO:24 | ATTCCTTAATCGAGATGTCAACGCGAAGG | 用于检测米氏军团菌 |
| NO:25 | NO:25 | GCTCGGTATGTGACCGAGGAAAAGCATGTC | 用于检测米氏军团菌 |
| NO:26 | NO:26 | TACCGATGGCGCTTGGAACGGGCTAATGAGCC | 用于检测米氏军团菌 |
| NO:27 | NO:27 | AAGACAAGGAAAAGAATAGCAGATTCTGCG | 用于检测迈氏军团菌 |
| NO:28 | NO:28 | GCATCGGTGCGAAAGAGTAAGGGAGCCTACG | 用于检测迈氏军团菌 |
| NO:29 | NO:29 | ACGCAAGTAGGTGGCTGAACGAAAGGGTAT | 用于检测迈氏军团菌 |
参照图1，是本发明的基因芯片结构外形示意图，该基因芯片的上部是点样区，下部是标签区域，其中点样区内规则分布有点阵区。探针在玻璃片基上的点阵位置为:第一横排点阵区的上端距离玻璃片基的上方为9.25mm，左侧点阵区距离玻璃片基的左侧、右侧点阵区距离玻璃片基的右侧均为4.5mm，两个点阵区间的横向距离与竖向距离均为13.5mm，第三横排点阵区与第四横排点阵区之间的距离是13.5mm。
参照图2，是本发明芯片的单一点阵列结构示意图，其中的Cy3表示荧光探针，OA1993为正对照探针。其中的编号对应的数字表示的核苷酸序列与表1中示出的核苷酸序列一致。
实施例2 引物的设计和制备
1. 引物设计举例：
因为16s与23s序列在不同军团菌种间具有保守性，因此，我们可以通过在16s末端和23s首端设计通用引物，来保证能够对所有军团菌进行扩增。以上游引物为例，首先将不同菌的16s序列放入MEGA软件分析，并选取通用性最好的片段导入Primer Primier 5.0软件中，设定长度70bp-10bp，G+C%值40%-60%，Hairpin: NONE、Dimer: NONE、False Priming: NONE、Cross Dimer: NONE。
下游引物的设计方法与上述探针引物方法相同，使用的设计参数也相同。
2. 引物合成：将表2中的引物序列委托探针合成公司(英骏生物技术公司)合成(PAGE纯化)，备用。
表3. 用于水体嗜肺军团菌检测的PCR扩增引物序列
| SEQ ID | 编号 | 序列(5’-3’) | 引物作用 |
| NO:31 | P1 | TGTACACACCGCCCGTC | 用于扩增16s-23s序列的上游引物 |
| NO:32 | P2 | GGTACTTAGATGTTTCAGTTC | 用于扩增16s-23s序列的下游引物 |
实施例3
用于检测重要致病军团菌的基因分型芯片的特异性鉴定
本发明基因芯片的特异性实验：
特异性就是指一个探针只能和自己所对应的菌种的靶基因发生杂交反应而不能与其它菌种的基因片段发生杂交反应。这就要求我们不仅要进行大量的生物信息学分析，但是通过生物信息学分析的探针也会出现非特异性结果或者是杂交信号不稳定的情况。所以探针特异性筛选还需要大量的实验来验证。特别是一些用于高通量检测的探针，都必须要和大量近源菌及远源菌进行杂交验证。
实施例4
用于检测重要致病军团菌的基因分型芯片的灵敏度检测
本发明基因芯片的灵敏度检测：
对用Nanodrop定量标准菌株的基因组进行梯度稀释到100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL，对检测范围内每种菌都进行PCR扩增标记，进一步杂交试验，确定本芯片的灵敏度为1ng。以杜莫夫军团菌的灵敏度杂交图为例，如图13-16所示.
实施例5
利用基因芯片快速检测军团菌的方法
1、 样品处理：
(1) 将收集得到的嗜肺军团菌菌株，在BCYE平板上，37℃，5%CO2培养2-3天；
(2) 加2 mL无菌水于BCYE平板上，无菌玻璃棒轻轻刮取菌落，转移入1.5 ml离心管中，15000 g离心10分钟；
(3) 弃上清,加入100μL裂解液,混匀，100℃水浴10分钟；
(4) 上一步得到的裂解产物15000g离心5分钟；
(5) 收集上清,上清中即含有基因组DNA，即可用于检测或-20℃保存。
附：裂解液配方：
50 mmol/L NaOH
10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
0.5% Tween-20
0.5% NP-40
0.5 mmol/L EDTA (pH 8.0)
5% Chelex-100
2、扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的上清作为模板加入 PCR反应混合液中；PCR反应PCR反应混合液配方如下表3所示。(注：以下表3-表4中的PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 混合物，Taq酶均购自Sangon公司)。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
50℃ 40秒
72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟
3、荧光标记靶序列：取10μL扩增产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。
表5. 标记反应混合液配方
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
50℃ 40秒
72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟；
4、杂交：将标记产物置于65℃烘箱中烘干，向杂交盒(博奥公司)内预加入70μL ddH2O以保持湿度。取18μL -2杂交液与烘干标记产物混合均匀，并加在实施例1中制备的饮用水常见病原微生物检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042) (注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，44℃水浴锅中杂交12小时。
杂交液配方：25% formamide, 0.1% SDS, 6× SSPE。
5、洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
洗液A： 1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1% SDS
洗液B： 0.05×SSC
洗液C： 95%乙醇
6、 扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON instrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name: 575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测本发明所涉及饮用水中病原微生物的检测时的杂交扫描结果分别如图3-13所示。
7、杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中OA532为阳性对照探针，有两方面作用：a) 显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；b) 临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。
8、双盲实验：
从实验所用的菌种打乱顺序，编号序号做双盲实验。通过扩增标记、杂交试验证明实验者本人与实验参与者的判读结果相一致。
结论：确定了该芯片检测结果的可靠性，证明了重要致病军团菌基因分型芯片的应用效果。
实施例6
本发明芯片试剂盒
杂交盒(博奥公司)
杂交液配方：25% formamide, 0.1% SDS, 6× SSPE
上述Taq酶购自Sangon公司，杂交液、阳性对照品（含有嗜肺军团菌11中血清型的一种的样品）、阴性对照品（将模板换成ddH2O）、芯片、超纯水、洗液A和洗液B由我们自行制备，盖片和杂交盒购买于博奥公司。
实施例7
利用生产的试剂盒进行饮用水中主要病原微生物的模拟检测
在研制微生物检测芯片时，对样品的处理是整个过程的重点和关键之一，同时也是提高芯片灵敏度的要素。因受水样自身污染影响和芯片灵敏度的限制，应用基因芯片技术对水样中病原微生物进行检测时，需对水样中的病原微生物进行前增菌，才能满足基因芯片检测灵敏度的要求。如果对每种致病菌都按国标规定进行单独的前增菌和选择性增菌，这会增加样品取样数量，同时也加大实验的工作量和复杂程度，为了符合基因芯片高灵敏度、高通量的特点，我们建立了水样中病原微生物快速增菌的方法。
1、具体步骤为：
（1）将培养的军团菌从BCYE生长平板上用无菌生理盐水轻轻刮下，依次梯度稀释至103-100 CFU/mL，然后分别取1mL菌液掺入到100 mL无菌水中
（2）将上述水样用孔径为0.22μm的水系滤膜进行过滤，然后将滤膜取下，用2 mL无菌生理盐水（0.85%）冲洗滤膜
（3）取100μL均匀涂布于BCYE生长平板上，37℃，CO2培养3-5天。
（4） 用无菌水轻轻刮取培养物菌落，取1 mL菌液加入500 μL的DNA裂解液（1×PCR Buffer， 2.5 mM Mg2+， 0.5% NP40， 0.5% Tween-20， and 0.1 ng/μL Proteinase K），50℃温浴1小时
（5）100℃水浴15分钟
（6）4℃，12000 rpm离心10分钟
（7）将上一步得到的DNA进行靶基因的PCR扩增和标记
2、扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的3 μL上清作为模板加入 PCR反应混合液中；PCR反应PCR反应混合液配方如表3所示。(注：表3-表4中的PCR 缓冲液、MgCl2、dNTP 混合物，Taq酶均购自Sangon公司)。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
50℃ 40秒
72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟
3、荧光标记靶序列：取10μL扩增产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如表4所示。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5分钟
94℃ 30秒
50℃ 40秒
72℃ 30秒 回到第二步，共35个循环
72℃ 5分钟；
4、杂交：将标记产物置于65℃烘箱中烘干，向杂交盒(博奥公司)内预加入70μL ddH2O以保持湿度。取18μL -2杂交液与烘干标记产物混合均匀，并加在实施例1中制备的水体中致病微生物嗜肺军团菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042) (注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，44℃水浴锅中杂交12小时。
杂交液配方：25% formamide, 0.1% SDS, 6× SSPE。
5、洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
洗液A： 1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1% SDS
洗液B： 0.05×SSC
洗液C： 95%乙醇
6、扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON instrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name: 575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
7、杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中OA1993为阳性对照探针，有两方面作用：a) 显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；b) 临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。
结论：该基因芯片检测特异，检测结果可信。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南开大学
<120> 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 用于检测嗜肺军团菌
<400> 1
caagaatcgg aacgcggtcc aagattgg 28
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 用于检测嗜肺军团菌
<400> 2
aagcgattgg tatttgcatc atgtgattt 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测嗜肺军团菌
<400> 3
catagaaagg cacagaagga actagagtgc 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测安氏军团菌
<400> 4
gcatgcatca gtatgtgacc aagcgagcga g 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测安氏军团菌
<400> 5
cgagcgagtg gatgcaatga aaacaaattt 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 用于检测博滋曼军团菌
<400> 6
aaagccgtga ccgagaggaa gcgggaaga 29
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测博滋曼军团菌
<400> 7
aagcgggaag atgcgcggtc acgctgaaag c 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测博滋曼军团菌
<400> 8
tcgtgaccga gaggaagcgg gaagatgcgc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测杜莫夫军团菌
<400> 9
tgaatgatga ataaatccta agcttctgaa 30
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 用于检测杜莫夫军团菌
<400> 10
ctgaaaggaa gcaaatgctt gataaagc 28
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测杜莫夫军团菌
<400> 11
tcctaaccgt aattttttat gcggaaagaa t 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测费菲军团菌
<400> 12
gattgccgta ttttttgggt ggattggaat g 31
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测费菲军团菌
<400> 13
agagtctgca ttgtgtagca ttgattattg 30
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 用于检测费菲军团菌
<400> 14
tgggtggatt ggaatggttt catgaa 26
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测戈尔曼军团菌
<400> 15
tgagcccggt tcataacgtt gtgagtgcgg c 31
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测戈尔曼军团菌
<400> 16
agataatttt tctttagttc aagtaagtgt t 31
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 用于检测戈尔曼军团菌
<400> 17
gtaaaattgc actgtcttgc gttggag 27
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 用于检测乔丹河军团菌
<400> 18
actccgatgc gagggagcga agcgaccaa 29
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 用于检测乔丹河军团菌
<400> 19
tgctgagcga gggagcttcg taaccaaggg gt 32
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测乔丹河军团菌
<400> 20
acctttattg attttagcga tggctttgaa 30
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 用于检测长滩军团菌
<400> 21
aagcggtaac aaaagagtga ctcgaagc 28
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 用于检测长滩军团菌
<400> 22
ccaattttag ggttttcaag gatagtcca 29
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 用于检测长滩军团菌
<400> 23
cagaaagatg aaaaatctta agctgcg 27
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 用于检测米氏军团菌
<400> 24
attccttaat cgagatgtca acgcgaagg 29
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测米氏军团菌
<400> 25
gctcggtatg tgaccgagga aaagcatgtc 30
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 用于检测米氏军团菌
<400> 26
taccgatggc gcttggaacg ggctaatgag cc 32
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测迈氏军团菌
<400> 27
aagacaagga aaagaatagc agattctgcg 30
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 用于检测迈氏军团菌
<400> 28
gcatcggtgc gaaagagtaa gggagcctac g 31
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 用于检测迈氏军团菌
<400> 29
acgcaagtag gtggctgaac gaaagggtat 30
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 正对照探针
<400> 30
tttttttttt tttttttgta cacaccgccc gtcacaccat 40
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 用于扩增16s-23s序列的上游引物
<400> 31
tgtacacacc gcccgtc 17
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 用于扩增16s-23s序列的下游引物
<400> 32
ggtacttaga tgtttcagtt c 21
Claims (2)
1.一种检测多种致病军团菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述寡聚核苷酸探针是SEQ ID NO:1-29所示的核苷酸序列。
2.一种检测致病军团菌的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述SEQ ID NO:1-29所示的核苷酸序列；所述的致病军团菌指的是：嗜肺军团菌，安氏军团菌，博滋曼军团菌，杜莫夫军团菌，费菲军团菌，戈尔曼军团菌，乔丹河军团菌，长滩军团菌，米氏军团菌，迈氏军团菌10种军团菌。
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