CN101113475B - 病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病原微生物检测用引物，以检测包括霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌和李斯特菌等在内的病原微生物。本发明还涉及利用所述引物进行多重扩增检测的方法。本发明进一步涉及所述病原微生物检测用引物在制备检测剂中的应用。本发明进一步涉及包含上述引物的病原微生物检测用试剂盒。

Description

病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增

本发明基于以下受资助的课题

1.课题一：国家自然科学基金批准号：30170052《格林-巴利综合征相关空肠弯曲菌的分子生物学研究》2002.01-2004.12；

2.课题二：科技部社会公益项目：《国家进出口食品快速检测方法体系的建立》2003；项目编号：2002DIA50036；

3.课题三：科技部社会公益项目：《食品中病原体及转基因标签的快速检测体系建立》2005；项目编号：2004DIB2J065。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增。

背景技术

由微生物导致的传染病仍是目前威胁全球人类健康的主要疾病。其防治与监控在我国仍是当前面临的一个严重问题。随着我国经济发展越来越快，人员流动越来越频繁，一些传统的监控方法已不能适应我国经济发展的需要。另一方面，我国地域宽广，各地差异很大，对传染病的防治与监控十分不利。而且在广大的农村及偏远地区，传染病仍然是人群的主要危险因素之一。传染病的控制主要从发现、诊断、治疗和预防几个方面进行。其中，诊断对于尽早确认、尽早控制传染病非常重要。目前我国对于微生物的诊断主要依靠血清学诊断和微生物的培养。这些诊断方法，从采样、培养到鉴定，往往需要数十小时到几天的时间，在一些偏远地区和难培养病原体，花费的时间会更长，特别是要在短时间内完成相关鉴别诊断则更加困难。另一方面，随着我国加入WTO，我国对外贸易发展迅速，各种食品、化妆品的进出口量迅猛增加。进出口检疫面临巨大压力。以食品为例，一些保质期很短的食品在病原微生物方面的检疫就需要几天的时间，加上运输所需的时间，往往刚刚到货就过了保质期。这大大阻碍了食品的进出口。因此，目前迫切需要有新的技术和设备满足高通量和日益增加的各种基因修饰物的低成本检测。

此外，感染性腹泻在我国发病率居各类传染病之首，长期以来严重危害人民健康。并具有发病急、传播快等特点，对其进行快速诊断以确定传染源是传染病防治工作面临的首要问题。目前在我国基层疾控单位大多沿用以分离培养生化鉴定为主的传统检测方法，烦琐耗时，已不能满足复杂多变的疫情处理工作。免疫学方法和细菌快速鉴定仪的使用在一定程度上缓解了这一情况，但由于缺乏特异性高质量好的诊断血清，而且受诊断菌种数量和通量的限制，仍不能进行快速准确的诊断。

发明内容

一方面，本发明提供了一套病原微生物检测用引物，其中组合一的扩增引物包括分别为检测以下目标基因：ompW、olag、rtxC、ol391、rfbe(ol57)、ipaH、aaF、bfpA、st、toxR、mapA、iroB、rfbG、rfbR、wzy、prf的扩增引物，优选为本发明的以下扩增引物：SEQ IDNos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ ID Nos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68，用于以用于定性检测以下病原微生物：霍乱弧菌，出血性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌，黏附集聚性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，产毒性大肠杆菌，副溶血弧菌，空肠弯曲菌，沙门菌，志贺菌A，F2A，D群，单增李斯特菌；组合二包括组合一中的所有引物，还包括用于检测目标基因ct、tl、tdh、trh、lt、vt1、vt2、hlyA、spvC、cdt、yst、hlyO的引物，优选本发明的以下扩增引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ ID Nos.13和14、SEQ ID Nos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.29和30、SEQ ID Nos.55和56、SEQ ID Nos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、SEQ ID Nos.65和66，以进一步鉴定所述病原微生物的产毒情况；组合三的引物包括组合一和二中的所有引物，还包括用于检测目标基因eaeA、ceuE、invA、yad、virF、iap的扩增引物，优选本发明的以下扩增引物：SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.35和36、SEQ ID Nos.53和54、SEQ ID Nos.45和46、SEQ ID Nos.49和50、和SEQ ID Nos.63和64，以进一步鉴定所述病原微生物的侵袭力。

另一方面，本发明还提供了一种多重扩增检测方法，该方法包括利用本发明的引物进行多重扩增检测或利用本发明中的任意3种或3种以上引物进行混合扩增。优选所述扩增选自：聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。该方法进一步包括在所述扩增之后进行定性或定量分析；优选所述的定性分析包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。

此外，本发明还提供了病原微生物检测用引物在制备检测剂中的应用。所述检测剂可用于检测霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌和李斯特菌以及包含以上任何一种或一种以上病原体的鉴别诊断用样品。在本发明中，检测剂优选用于对排泄物、肠积液、呕吐物进行检测。

此外，本发明还提供一种病原微生物检测用试剂盒，该试剂盒包括本发明所述的引物。该试剂盒还可以包括以下标记或未标记的探针SEQ ID No.73、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.77、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.74、SEQ ID No.90、SEQ ID No.84、SEQ ID No.94、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.97、SEQ ID No.99、SEQ ID No.102；优选还进一步包括以下探针：SEQ ID No.69、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.75、SEQ ID No.78、SEQ IDNo.79、SEQ ID No.83、SEQ ID No.96、SEQ ID No.85、SEQ ID No.92、SEQ ID No.101；更优选还进一步包括以下探针：SEQ ID No.76、SEQ ID No.86、SEQ ID No.95、SEQ ID No.91、SEQ ID No.93、SEQ ID No.100。

有益效果

本发明的多重扩增引物以及多重扩增方法具有较高的特异性，可单独作为一种快速检测方法应用于离体病人样品、可能混有病原微生物的水样、土壤、食品、化妆品等样品的检测，可快速鉴定毒力因子，同时完成病原菌属、种、血清群以及生物型的诊断和鉴别诊断。在临床诊断和传染病预防控制等方面具有广阔的应用前景。

多重PCR技术是在同一反应体系中存在多对较低浓度的引物，这些引物具有一致的反应条件，因此经过与单重PCR相同的反应时间可以同时得到多个目标基因，相对于单重PCR更加节省原料，而且大大缩短了准备时间和工作量。

附图说明

图1A、图1B和图1C显示单重PCR及种属内、种属间混合引物PCR结果；其中：

在图1A中，M：100bp Ladder Marker；1：rfbE；2：eaeA；3：lt；4：st；5：ipaH；6：bfpA；7：副溶血弧菌143株多重PCR tl tdh trh；8：tl；9：tdh；10：trh；

在图1B中，M：100bp梯度标记；1：霍乱弧菌O1群埃尔托生物型18506株多重PCR；2：霍乱弧菌古典生物型16502株多重PCR；3：霍乱弧菌O139群B2株PCR；4：olag；5：ct；6：rtx；7：mapA；8：bp；9：cdt；10：空肠弯曲菌cj31与霍乱弧菌18506混合模板多重PCR；11：沙门菌27株多重PCR；12：iroB；13：rfbS；

在图1C中，1：沙门菌27株；2：iroB；3：rfbS；4：产毒性大肠杆菌10407株；5：lt；6：st；7：侵袭性大肠杆菌8401株；8：ipaH；9：出血性大肠杆菌933株；10：rfbE；11：eae；12：bfpA；13：致病性大肠杆菌2348/69株。

图2A和图2B显示掺入荧光素的17对引物多重PCR结果，其中：

图2A中，1：霍乱弧菌18506不含荧光素；2：含荧光素；3：olag；4：ct；5：rtx；6：霍乱古典16502不含荧光素；7：霍乱古典16502含荧光素；8：霍乱O139群B2不含荧光素；9：霍乱O139群B2含荧光素；

图2B中，1：副溶血143无荧光素；2：副溶血143含荧光素；3：18506+cj19含荧光素；4：tl；5：tdh；6：trh；7：沙门菌27无荧光素；8：沙门菌27含荧光素。

图3A、图3B和图3C显示基因芯片杂交结果，其中：

图3A为阵列构成示意图，图中，各基因在基因芯片上的位置如下：

点阵位置	基因探针	点阵位置	基因探针
				b2-5c2-5d2-5e2-5b8-11c8-11d8-11e8-11b14-17c14-17d14-17e14-17	检测rfbE基因的探针检测eaeA基因的探针检测bfpA基因的探针检测ipaH基因的探针检测tl基因的探针检测tdh基因的探针检测trh基因的探针DMSODMSO检测iroB基因的探针检测rfbS基因的探针DMSO	h2-5i2-5j2-5k2-5h8-11i8-11j8-11k8-11h14-17i14-17j14-17k14-17	检测lt因的探针检测st基因的探针DMSODMSO检测mapA基因的探针检测ceuE基因的探针检测cdt基因的探针DMSODMSO检测olag基因的探针检测ct基因的探针检测rtx基因的探针

图3B显示副溶血弧菌143株基因芯片杂交结果；

图3C显示沙门菌27株芯片杂交结果。

图4A为临床样品检测芯片点阵示意图，其中芯片上的点阵具体位置如下：

点阵位置	检测以下基因的探针	点阵位置	检测以下基因的探针	点阵位置	检测以下基因的探针
						b2-5c2-5d2-5e2-5b8-11c8-11d8-11e8-11b26-29c26-29d26-29e26-29h20-23k20-23	rtxrfbErfbRiapolageaeAtlyadA阴性对照vt2virFctaaF/ItoxR	h2-5i2-5j2-5k2-5h8-11i8-11j8-11k8-11h14-17i14-17h20-23i20-23i20-23	spvChlyAmapArfbG阳性对照wzyol39agyst阴性对照ceuE阴性对照cdtiroB	b14-17c14-17d14-17e14-17b20-23c20-23d20-23e20-23j14-17k14-17j20-23k20-23j20-23	阴性对照ltipaHhlyO阴性对照stompWprfAvt1trhbfpAtdhinvA

图4B为阳性点克隆测序后与Genbank序列比对结果，其中：

a.样品sd10扩出的mapA与原始序列相似性比对结果，相似性100％；

b.样品sd10扩出的ceuE与原始序列相似性比对结果，95.8％；

c.样品sd10扩出的cdt与原始序列相似性比对结果，99.8％；

d.样品sd22、sd7、sd18扩出的ipaH与原始序列相似性比对结果，100％。

图5A～图5F显示基因芯片杂交检测结果。

图6A和图6B显示芯片阳性杂交点的PCR扩增，其中：

图6A显示通过常规PCR进行的扩增后检测结果，其中，a：DNA标记100bp梯度；b：mapA；c：ceuE；d：cdt；e：hlyA；f：lt；g：st；h：virF；i：lt；j：st；k：hlyA；l：ipaH(样品sd22的检测结果)；m：ipaH(样品sd7的检测结果)；n：ipaH(样品sd18的检测结果；o：yst；p：cd t(o-p是样品sd16的检测结果)；

图6B显示用巢式PCR进行的扩增后检测结果，其中，a：DNA标记100bp梯度；b：virF(样品sd10的检测结果)216bp；c：hly(样品sd16的检测结果)327bp；d：hly(样品sd10的检测结果)327bp；e：lt(样品sd16的检测结果)149bp；f：st(样品sd16的检测结果)256bp；g：lt(样品sd10的检测结果)272bp；h：wzy(样品sd3的检测结果)。

具体实施方式

由于与常规PCR技术相比，多重PCR技术涉及多对引物和多对模板，随着引物对数的增加，影响因素也更多，增加了得到错配扩增产物的机会。因此引物的选择至关重要。在选择的多对引物基础上，优选对反应体系和条件进行优化。

本发明人针对病原微生物毒力因子设计特异、退火温度一致的引物，将引物分别按种属内混合和种属间混合的方案排查引物间的竞争性抑制扩增等干扰因素，再将不同菌属的模板混合，用相对应的混合引物扩增，筛选出高效特异的引物组合，确定了能同时检测8种常见的病原微生物包括致病性大肠(EHEC，ETEC，EPEC，EIEC)、霍乱弧菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、沙门菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、志贺菌和李斯特菌等的多重扩增引物，确定了本发明的优选引物(见表1)。

表1

在上述步骤中，可以将所述引物分成三个组，然后再用每个组分别进行扩增并标记，这样可以尽量减少多对引物间的干扰。对这三组引物分别标记后再扩增，这样既没有损失检测信息，且仍可以体现高通量的特点。例如这些扩增引物可以分为以下但不局限于以下3个组合。其中组合一的扩增引物包括分别为检测以下目标基因：ompW、olag、rtxC、ol391、rfbe(o157)、ipaH、aaF、bfpA、st、toxR、mapA、iroB、rfbG、rfbR、wzy、prf的扩增引物，优选为本发明的以下扩增引物：SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ ID Nos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、SEQ ID Nos.67和68，以用于定性检测以下病原微生物：霍乱弧菌，出血性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌，黏附集聚性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，产毒性大肠杆菌，副溶血弧菌，空肠弯曲菌，沙门菌，志贺菌A，F2A，D群，单增李斯特菌；组合二包括组合一中的所有引物，还包括用于检测目标基因ct、tl、tdh、trh、lt、vt1、vt2、hlyA、spvC、cdt、yst、hlyO的引物，优选本发明的以下扩增引物：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ ID Nos.13和14、SEQ ID Nos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.29和30、SEQ ID Nos.55和56、SEQ ID Nos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、SEQ ID Nos.65和66，以进一步鉴定所述病原微生物的产毒情况；组合三的引物包括组合一和二中的所有引物，还包括用于检测目标基因eaeA、ceuE、invA、yad、virF、iap的扩增引物，优选本发明的以下扩增引物：SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.35和36、SEQ ID Nos.53和54、SEQ ID Nos.45和46、SEQ ID Nos.49和50、和SEQ ID Nos.63和64，以进一步鉴定所述病原微生物的侵袭力。

另一方面，本发明建立起一套快速、灵敏、高通量、低成本、易于在基层单位推广使用的多重扩增检测方法。本发明提供的多重扩增检测方法包括利用上述组合一、组合二或组合三所述的引物进行扩增，用于基于引物与模板的特异结合产生特异扩增产物的酶促核酸体外扩增检测技术中；优选所述扩增选自：聚合酶链式反应(PCR)连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。其中，在PCR中，PCR系统是由耐热DNA聚合酶、引物、脱氧核苷酸、待扩增的DNA模板和缓冲液组成。耐热DNA聚合酶包括：从水生栖热菌中分离的Taq DNA聚合酶、从嗜热栖热菌中分离的Tth DNA聚合酶、从litoralis栖热球菌中分离的VENT DNA聚合酶和从酶热浴硫化裂片菌中分离的Sac耐热DNA聚合酶等。连接酶链式反应(LCR)，目的为检测靶序列中有无点突变：设计一对引物A、B覆盖了靶序列，经退火与靶序列结合后，A、B间留下一个缺口，加入连接酶封闭缺口，两引物与靶序列形成完整的互补链。如果靶序列中有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，变性后引物仍是两个。链置换扩增(SDA)，在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增；核酸单碱基取代、转录介导扩增(包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification，TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acid s sequence based amplification，NASBA)。TMA是一种利用Money鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶和T7 RNA多聚酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统，主要扩增原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。NASBA的原理与TMA相似，只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。在本发明中，更优选PCR反应。本发明提供一种优选的PCR反应，其条件为：95℃预变性3～5min；94℃变性1min；50～58℃退火40秒；72℃延伸30秒；进行40个循环；72℃延伸0.5～5min。

对于本发明所述的多重扩增检测方法，优选进一步包括在所述扩增之后进行定性或定量分析。定性或定量方法是本领域普通技术人员已知。对于定性方法，例如包括用溴乙锭染色后利用凝胶电泳显示所述扩增的产物。本领域技术人员可根据扩增产物的大小，确定所用的凝胶和浓度，例如采用1.5％的琼脂糖电泳。对于定量方法，可以使用荧光标记技术，荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物成正比。而根据扩增原理，扩增是呈指数增长，因此在反应体系和反应条件完全一样下，样本含量应与扩增产物的对数成正比，故在一定的条件下荧光强度和样本含量成正比。荧光标记方法基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据标记的方法不同，扩增产物分离的方法也不同：进行单引物标记的，其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；对一个引物用生物素标记，另一个引物用荧光素标记的，一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物，通过变性处理使荧光标记的产物解链。此外，也有用生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲合素连接的荧光物，通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测。还有一种方法为杂交探针标记法：用荧光素标记在探针上，由探针与靶基因特异性结合成双链而产生荧光效应。此时的探针优选为本发明的探针。

本发明还提供了病原微生物检测用引物在制备检测剂中的应用。优选所述检测剂用于检测霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌和李斯特菌。所述检测剂优选用于用于对排泄物、肠积液、呕吐物进行检测，还可以用于检测可能混有病原微生物的水样、土壤、食品、化妆品等样品的检测，这些样品可以经过或不经过任何富集。

本发明还涉及一种肠道病原菌检测用试剂盒，该试剂盒包括本发明的组合一、组合二、和/或组合三所述的引物。所述试剂盒还可以包括用于检测目标基因的目标检测探针。其中组合一包括16对引物，分别为检测以下目标基因：ompW、o1ag、rtxC、o1391、rfbe(o157)、ipaH、aaF、bfpA、st、toxR、mapA、iroB、rfbG、rfbR、wzy、prf的本发明的目标检测探针：SEQ ID No.73、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQID No.77、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.74、SEQ ID No.90、SEQ ID No.84、SEQ ID No.94、SEQ ID No.98、SEQ ID No.97、SEQ ID No.99、SEQ ID No.102，以用于定性检测以下病原微生物：霍乱弧菌，出血性大肠杆菌，侵袭性大肠杆菌，黏附集聚性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，产毒性大肠杆菌，副溶血弧菌，空肠弯曲菌，沙门菌，志贺菌A、F2A、D群，单增李斯特菌。组合二包括组合一中的所有引物，还包括用于检测目标基因ct、tl、tdh、trh、lt、vt1、vt2、hlyA、spvC、cdt、yst、hlyO的本发明目标检测探针：SEQ ID No.69、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQID No.75、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.83、SEQ ID No.96、SEQ ID No.85、SEQ ID No.92、SEQ ID No.101，以检测所述病原微生物的产毒情况。组合三包括组合一和二中的所有引物，还包括用于检测目标基因eaeA、ceuE、invA、yad、virF、iap的本发明目标检测探针：SEQ ID No.76、SEQ ID No.86、SEQ ID No.95、SEQ ID No.91、SEQID No.93、SEQ ID No.100，以检测所述病原微生物的相关侵袭力。组合一多为具种属特异性且与毒力相关的管家基因，单独应用组合一可以对样品中所含有的一种或几种病原菌定性检测，并区分不同的血清群和生物型，组合二多为编码各菌带有的与致病力强弱密切相关的毒素，与组合一联合应用可以判断所检测的病原菌的毒力强弱，组合三为决定病原侵袭力的毒力因子，与组合一和组合二联合应用可综合判断该病原侵袭性与毒性致病力的强弱。采用这种方法的另一个优点是通过一次PCR反应扩增即可确定样品是否为含有多种致病菌的混合感染以及这些病原菌的毒力与致病性情况。

本发明还提供了PCR反应体系掺入荧光素对扩增效率和基因芯片杂交效率的影响，为传染病诊断芯片的靶基因标记提供合适的反应条件。

实施例

实施例1、种属内和种属间混合引物PCR

1.模板制备

从培养皿上挑取单菌落接种于液体培养基培养，取适量菌液置沸水浴中10分钟，13000rpm离心10分钟，取上清液作为模板。

2.肠道病原菌毒力基因及特异引物的选择

通过查阅文献和GenBank数据库选择如下基因(见表2)：EHEC的rfbE、eaeA，ETEC的lt、st，EPEC的eaeA、bfpA，EIEC的ipaH，霍乱弧菌O1血清群Eltor生物型的o1ag、ct、rtx，O1classic的o1ag、ct，O139群o139ag、rtx，副溶血弧菌的tl、tdh、trh，空肠弯曲菌的mapA，bp，cdt，沙门菌的iroB，rfbS。

根据基因保守区设计引物，产物长度300～500bp，退火温度相同，筛选出特异性好的引物。见表1。

表2.肠道病原菌毒力基因及其Genbank序列号

菌名称	菌株号	目的基因	Genbank接受序列号	片段长度(bp)
					致病性大肠杆菌EHEC O157：H7ETECEPECEIEC霍乱弧菌O1classicO1eltorO139副溶血弧菌沙门菌空肠弯曲菌	933104072348/6984011650218506B214327cj19，cj31	rfbE，eaeAlt stbfpA，eaeAipaHo1ag，ct，rtxo1ag ctct rtxtl tdh trhiroB rfbsmapA ceuE cdt	S83460，Z36899AB011677，M25607AF304477Z11541M32063X59554，X51948，AF119150X59554，X51948AB012956，X51948M10069S67850L11929U62129X80135，X82427，U51121	418，386440，325331，386338412，310，390412，310310，390447，294，345294，340508，346，464

本发明检测的基因的中英文名称对照表

基因英文名称	中文名称(编码蛋白)	基因英文名称	中文名称(编码蛋白)
				ompW	外膜蛋白	aaf/I	集聚黏附性菌毛
o1ag	O1抗原	ipaH	侵袭素
				o139ag	O139抗原	iroB	菌毛调节因子
rtxC	毒素激活子	invA	侵袭因子
				ct	霍乱肠毒素	spvC	沙门菌质粒毒力基因
toxR	毒力表达调控子	mapA	外膜蛋白A

tl	产热稳定溶血素相关因子	ceuE	铁转运因子
				tdh	热稳定直接溶血素	cdt	细胞致死毒素
trh	热稳定间接溶血素	yad	耶尔森氏菌黏附素
				rfbe o157：H7	o157：H7抗原	yst	耶尔森氏菌热稳定毒素
eaeA	黏附抹平因子	virF	毒力相关因子
				hlyA	溶血素	rfbR	志贺菌O抗原
vt1	vero毒素I	rfbG	志贺菌O抗原
				vt2	vero毒素II	wzy	O-抗原聚合酶基因
bfpA	束状菌毛	iap	P60蛋白
				lt	不耐热肠毒素	hlyO	李斯特菌溶血素O
st	耐热肠毒素	prf	转录激活调节蛋白

3.目的基因的单重(uniplex)和多重(multiplex)PCR

经过单重PCR扩增目的基因筛选出扩增效率和特异性好的引物，将各菌属的引物进行菌属内的混合扩增，以单重PCR扩增产物为位置参照。大肠杆菌六对引物混合，分别扩增EHEC(rfbE，eaeA)，ETEC(lt，st)，EPEC(eaeA，bfpA)，EIEC(ipaH)；霍乱弧菌四对引物混合分别扩增O1群埃尔托生物型(olag，ct，rtx)，O1群古典生物型(olag，ct)，O139群；副溶血弧菌三对引物分别扩增tl，tdh，trh；空肠弯曲菌三对引物扩增mapA，bp，cdt；沙门菌二对引物分别扩增iroB，rfbS。对空肠弯曲菌和霍乱弧菌初步进行了菌属间引物的混合实验，扩增olag，ct，rtx，mapA，bp，cdt。

单重PCR反应体系：25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，四种dNTP(10mM)0.5μl，taq酶1u，引物(10μM)2.5μl，模板0.5μl，去离子水18.5μl。反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行40个循环，72℃延伸5分钟。

多重PCR反应体系：25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，四种dNTP(10mM)0.5μl，taq酶1u，引物(1.6μM)2.5μl，模板0.5μl，去离子水18.5μl混合引物浓度/对。反应条件与单重相同。

结果：用单重PCR产物作为位置参照，先对各种属内的引物混合扩增标准菌株，致病性大肠杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌以及沙门菌的菌属内引物混合扩增结果均得到相应特异片段，提示种属内引物间基本不存在交叉抑制。见图1A-图1C。在副溶血弧菌的多重PCR中tl基因扩增效率明显高于tdh和trh，见图1A。ETEC中lt的产量高于st。基因芯片杂交结果也显示tl杂交信号明显高于tdh和trh，与多重PCR结果一致。图1C：当把17对引物混合起来时并没有非特异扩增现象。这些实验充分说明了本发明的引物为特异性好扩增效率高的引物，适合多重扩增。

在利用本发明的引物进行扩增时，不同引物对检测到所说的扩增产物表明样品中该引物所对应的特异性基因的存在。其他引物对未检测到所说的扩增产物表明样品中该引物所对应的特异性基因的不存在。检测扩增的方法包括但不限于：电泳。其中引物所对应的特异性基因及检测时的意义如下所列：

本发明所涉及的实验菌株包括以下菌株：

菌株编号	血清型/亚型	菌株编号	血清型/亚型
				霍乱弧菌：B2Yn51212-19L1650216508185061851093072	O139O1，El TorO1，El TorO1，ClassicO1，El TorO1，El TorO1，El TorO139	沙门菌：2742250029-65033650773-1STM阿贡纳德尔卑	不清不清C群D群不清B群不清B群

致病性大肠杆菌：17-2O429332348/6988-236484011040744825副溶血弧菌：87-17宣89Vp143V276V441Vp98392-112192-1248空肠弯曲菌：Cj1Cj2Cj4Cj6

EAggECEAggECEHEC，O157EPECEHEC，O157EIECETECEIEC不清不清不清不清不清不清不清不清不清不清不清不清

小肠结肠炎耶尔森氏菌：P20P48良43良4482028820348300883018志贺菌：51360512505136151571511365119751081Cj18Cj19Cj28Cj31

O:3O:3O:3O:3O:10KO:3O:22O:10ClF2aC2F1aA2A1DS不清不清不清不清

实施例2、多重PCR掺入荧光素对照无荧光素的产量

分别在反应体系中掺入和不掺入荧光素对比扩增产物产量的差异。

反应体系：25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，三种dNTP(10mM，不含dTTP)0.5μl，dTTP(1mM)4μl，cy5-dUTP(1mM)0.5μl，taq酶1u(2u/μl)，引物(1.6μM)2.5μl，模板0.5μl，去离子水14μl。反应条件与单重相同。

结果：反应体系中掺入荧光素明显降低了扩增产量(见图2A和图2B)。

实施例3、基因芯片的制作与杂交

采用点样仪(GeneTAC Microarraying，Perkin Elmer公司，美国)将特异毒力基因片段按一定顺序点致氨基修饰的载玻片，包括6个6×6的矩阵，每个矩阵由四个定位坐标点和四个探针构成，每个探针纵向重复四个点。芯片经再水合、紫外交联高温干烤进行固定。点阵构成见图3A。将处理好的芯片置GenTAC Hybridization杂交仪，加入预杂交液100μl，42℃搅动(agitate)40分钟，用0.1％SDS冲洗。取纯化后的标记样品20μl，加入80μl杂交液混匀，注入杂交仪，覆盖芯片探针样品阵列上，42℃杂交12小时，用清洗液将未结合探针洗脱并除盐，晾干。扫描仪读取杂交结果，设置Gain为60，Black为10，用analyzer4.0将荧光强度数值化，对照阵列构成图判读样品检测结果。

根据图3B和图3C的结果可知，反应体系中掺入荧光素明显降低了扩增产量，从芯片杂交结果来看这种扩增效率的降低可能会降低芯片检测的灵敏度，但对杂交信号的判读并没有影响。因此，本发明的引物适合用于芯片的靶基因扩增与标记。

实施例4、腹泻病人粪便样品的检测

1.材料

34份腹泻病人粪便标本取自某医院2005年8-10月间就诊腹泻病人；cy5标记dNTP(Amersham pharmacia)；氨基化玻片(上海百傲)；PCR纯化试剂盒(Quigen)。

2.方法

(1)粪便标本中细菌DNA的提取

样品以0.9％NaCl溶解混匀，95℃进行10分钟裂解，4000rpm离心5分钟，取上清2μl用于荧光标记。

(2)多重PCR标记目的基因。分别用组合一、组合二、组合三的混合引物扩增标记病原菌DNA(标记反应体系见实施例2)，将标记产物混合后与芯片杂交。

(3)芯片制作(与前述相同)

3.杂交反应

取纯化后的标记样品20μl，加入80μl杂交液(购于博大泰克生物公司)混匀，注入杂交仪，覆盖按照实施例1方法制备的芯片探针样品阵列上，不同之处在于点阵排列见图4A，42℃杂交12小时，用清洗液将未结合探针洗脱并除盐，晾干。

芯片杂交结果扫描检测与分析

用GenTAC LS IV扫描仪(Genomic Solutions Inc公司，美国)读取杂交结果，设置Gain为60，Black为10，用Analyzer4.0将荧光强度数值化，对照阵列构成图判读样品检测结果。

结果：34份标本中24份检出阳性信号，其中5份提示可能存在2种以上腹泻病原的混合感染。部分见图5A～图5F。其中，图5A.样品sd10：其中显示如下阳性信号：空肠弯曲菌的检测探针map(j2-5)，ceuE(i14-17)，cdt(i20-23)，产毒性大肠杆菌lt(c14-17)和st(c20-23)；大肠埃希菌EHEC O157：H7的hlyA基因(i2-5)，小肠结肠炎耶尔森菌属的virF(d26-29)，yad(e8-11)，霍乱弧菌CT基因(e26-29)，其中mapA为空弯种属特异性基因，编码外膜蛋白A，据此基因可以与结肠弯曲菌相鉴别。ceuE编码铁载体转运蛋白(siderphore transport)，铁摄取是感染的重要方面，故铁结合蛋白转运系统是重要的毒力相关因素。Cdt(cytolethal distending toxin)编码细胞扩张致死性毒素，为AB型细胞毒素，包括A，B，C三个亚单位，B为毒素活性单位，AC为结合单位，其作用机制是通过损伤细胞DNA，在G2/M期发生作用，使细胞周期停滞，导致胞质膨胀，与细菌定植能力和致病力密切相关。lt编码不耐热肠毒素，st编码耐热肠毒素，是ETEC的主要致泻因子。hlyA编码溶血性大肠EHEC：O157溶血素。所以该样品含有弯曲菌、产毒性大肠杆菌、耶尔森菌、出血性大肠、霍乱弧菌；提示病人可能存在两种以上病原菌的混合感染。这种情况用常规的培养鉴定或免疫学方法通常很难鉴定。图5B.样品sd16，显示如下阳性信号：大肠埃希菌EHEC O157：H7的hlyA基因(i2-5)，空肠弯曲菌的检测探针cdt(i20-23)，产毒性大肠杆菌ETEC的st毒素(c20-23)，志贺D群探针wzy(i8-11)，霍乱弧菌CT毒素基因(e26-29)，小肠结肠炎耶尔森菌yst(k8-11)和virF(d26-29)。图5C.样品sd3：其中显示如下阳性信号，志贺D群探针wzy(i8-11)。图5D.样品sd22：其中显示如下阳性信号：侵袭性大肠EIEC的ipaH基因(d14-17)。图5E.样品sd7：其中显示如下阳性信号：侵袭性大肠EIEC的ipaH基因(d14-17)。图5F.样品sd18：其中显示如下阳性信号：侵袭性大肠EIEC的ipaH基因(d14-17)。志贺菌D群检测探针wzy(i8-11)。

实施例5、杂交阳性基因的克隆测序分析

(1)第一次PCR扩增

用芯片阳性杂交点对应的特异引物扩增相应的样品。反应体系与反应条件(见上)。模板样品为6个粪便样品，分别称为sd10，sd16，sd3，sd22，sd7，sd18。扩增基因包括mapA，ceuE，cdt，hlyA，lt，st，virF，wzy，ipaH，wzy，ct，yad，yst。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带胶回收纯化，连载体，克隆扩增，测序。

结果：参见图6A，通过对这些点的PCR克隆验证，只有hlyA，st，cdt扩增阳性序列一致，其余四个均未扩出。对于这些常规PCR未扩出而芯片检测呈阳性的结果，利用下述巢式PCR进行扩增。

(2)巢式PCR扩增

在芯片特异探针的内侧设计嵌套式引物(用于扩增VirF基因的上下游引物分别见SEQ ID NO.103和104；用于扩增hlyA基因的上下游引物分别见SEQ ID NO.105和106；用于扩增lt基因的上下游引物分别见SEQ ID NO.107和108；用于扩增st基因的上下游引物分别见SEQ ID NO.109和110)，对于部分经第一轮PCR未扩出的，取扩增产物2μl进行第二轮扩增，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化克隆测序。

序列测定由北京奥科生物公司完成。测序结果用vector NTI与原序列作相似性比对。

结论：序列相似性为95.8％～100％(见图4B)。证明了阳性点的准确性，也为诊断芯片技术方法的改进提供可靠的依据。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增

<130>GBI07CN0253-C

<160>110

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

ggcatacagt cctcatccag              20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

actttgggtt ttttcatcgc              20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

tagacccgca gaggtagaaa              20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

tcatcgcctt gagttattcc              20

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

taggtggtgt gatgctgct          19

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gcacctttcg gatacagc           18

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gtggtctatg ggttgatgat g       21

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

aatggataag ggcgttgg           18

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

 ccacctacct ttatggtcc         19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

gaacttataa ccacccgcg          19

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

aagcgagtgc acctcgacat         20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

atggagcaca ggcaggatta c       21

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ggcgacagat tataccgtgc         20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

cggtctctat attccctgtt         20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

actatactcc gattcctctg g       21

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

gctttggctt ccgctat          17

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

agattgcgct gaagcctttg       20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

tctttcctct gcggtcctag       20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

tgattgatag tggcacaggg       20

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

acagtaacaa accgtaacat cg    22

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

gccttctaag caatcggtc        19

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

gatagacatc aagccctcgt        20

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

acggacaaca gaatacact         19

<210>24

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

ctgatggacc aggagg            16

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

tattataagg acggcacaac        20

<210>26

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

agtatcgccc agacacg           17

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

gaaatacgaa aaaggtctgt ct        22

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

cgcttcagca ggagtaatag           20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

agtaaaatag gaagaaccgc           20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

ggactgatag ccagcataac           20

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

ttcttgtgaa agtcctggtg gtt       23

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

gtacatcttg cttggtgcgg att       23

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

agaacagcca ctccaacagg        20

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

gtccctccgc ttgcttg           17

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

cgctttgaga ttattcacga tg     22

<210>36

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

agagactagc ccttgcgaag tt     22

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

gcaaggttac aacatcacg         19

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

acgctttacc agtctttagg            20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

ttccatctgt cccttttcct            20

<210>40

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

cttgacctga ttttacgaac ac         22

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

attgacctgc catccatac             19

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

ttctcaccaa cgaaatcact aac        23

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

gtcttctgac gcaatcgttg            20

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

atacgagtgg ttgctgtcat g            21

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

atctgcgttg ttctcatctc              20

<210>46

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

gtaactgccg aatctccc                18

<210>47

<211>22    

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

ttgaaataac taggctgggt cg           22

<210>48

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

cactgaactg ccctgaaact g            21

<210>49    

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

ggcagaacag cagtcagaca ta     22

<210>50

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

ggtgagcata gagaatacgt cg     22

<210>51

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>51

tggtttcgat  tcggaagcgg       20

<210>52

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>52

tggcggcggt aggcgttag         19

<210>53

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>53

gctctttcgt ctggcatt          18

<210>54

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>54

ttccactgcg ataacgg             17

<210>55

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>55

gtagctgctt atgatggg            18

<210>56

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>56

gaggtgttct gtgccgtta           19

<210>57

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>57

gcattccttg ctctatcctc ac       22

<210>58

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>58

aagccgatgt ttctaaatgc gt       22

<210>59

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>59

tcttattcca tccagcgtag cc       22

<210>60

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>60

gccgtattcg caatgagttt       20

<210>61

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>61

ttctttttct ggatagccga gc    22

<210>62

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>62

ccaataatcc ctaactgagc cg    22

<210>63

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>63

caaactgcta acacagctac t     21

<210>64

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>64

tcagcaataa tagcacttgc a     21

<210>65

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>65

actgcgttgt taacgtttga        20

<210>66

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>66

tccgcctgca agtcctaaga        20

<210>67

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>67

aacatcggtt ggctat            16

<210>68

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>68

tctttgagga ctaccgta          18

<210>69

<211>310

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>69

ggcatacagt cctcatccag atgaacaaga agtttctgct ttaggtggga ttccatactc   60

ccaaatatat ggatggtatc gagttcattt tggggtgctt gatgaacaat tacatcgtaa  120

taggggctac agagatagat attacagtaa cttagatatt gctccagcag cagatggtta  180

tggattggca ggtttccctc cggagcatag agcttggagg gaagagccgt ggattcatca  240

tgcaccgccg ggttgtggga atgctccaag atcatcgatg agtaatactt gcgatgaaaa  300

aacccaaagt                                                         310

<210>70

<211>412

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>70

tagacccgca gaggtagaaa cgctgttagg tgatcctagc ctagctaaga aggagcttgg    60

atgggtgcca gaaattactt tacaacagat ggtttctgaa atggtagctt ctgatttaga   120

acaagctcaa agtcatgcac tattgaaaaa acatggctat aacgtaaatg tatctgtaga   180

gtgaggtcct ttaaatgatt cctgtatacg aaccaagttt ggatggaaat gagcgtaaat   240

atctaaacga ttgcattgat tccggttggg tatcctcaag ggggaaatat attgatcgct   300

tcgaaactga gtttgcggag tttttaaaag taaagcacgc cacaacagta tctaatggaa   360

cagttgcgct acatttggca atgagcgcgt tgggaataac tcaaggcgat ga           412

<210>71

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>71

taggtggtgt gatgctgctc agccagcatt cgccgcttca tcgtcgttat gtggttgcag    60

aatggctgca acgcattctg cctgcgtttg agctaaacca gttttgctat tacgaagatg   120

agcatgggcg tccaattgcc ttttgtaatt gggcgtttgt ctctgagcag atccgagatg   180

agctgctttc tggtgtgcgc gaaatatctc catccgactg gcgttcgggc cagcaaatct   240

acattccaga gatgattgct ccattcgggc atggtcgcga ggtcgtcaat gatcttcgtc   300

gtcgtgtatt tcttccgtgg caggggcaga aagtctgtac tgtccgcggc aaggtggatg   360

ctcaaaatga ccgctgtatc cgaaaggtgc                                    390

<210>72

<211>494

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>72

gtggtctatg ggttgatgat gactttggtg tctgtttagc gcacgcacgc ttatcaatac    60

aggatttaag ttcagctggg catcagccga tgcattcaaa atctgagcgc tatgttatga   120

tttttaatgg tgaaatatac aatcatttaa cattgcgtga agaactgatc gagattgtac   180

caagttactg gaatggtcat tcagataccg aaaccttgtt ggctggtttt gaagtgtggg   240

gaatagaaca gaccatacaa aaatgtgtcg gtatgtttgc tatcgtccta tgggataaag   300

tacttaaaca gttgatcttg attcgggatc gatttggtga gaagcctctt tattacgggt   360

ggcagcgcga tacttttctg tttgcttctg agttaaaagc gcttaaagct catcccagtt   420

ttgaaggcag cattaatcgt caggcgttat cgcatttttt tcgtttgaat tacataccaa   480

cgcccttatc catt                                                     494

<210>73

<211>336

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>73

ccacctacct ttatggtcca atactacttt ggtgaagcta attcgacaaa ccgtccatat    60

gttggtgcgg gtttgaatta caccactttc tttgatgaaa gctttaatag tacgggtact   120

aataatgcat tgagtgattt aaaactggac gactcatggg gacttgctgc taacgttggc   180

tttgattata tgctcaatga tagctggttc ctcaacgctt atgtgtggta tgccaatatt   240

gaaacaacgg caacctacaa agcaggtgca gatgccaaat ccacggatgt tgaaatcaat   300

ccttgggtat ttatcatcgc gggtggttat aagttc                             336

<210>74

<211>325

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>74

aagcgagtgc acctcgacat ataacatgat gcaactcaca aaaaaaaata aaaaaattgc    60

aaaatccgtt taactaatct caaatatccg tgaaacaaca tgacgggagg taacatgaaa   120

aagctaatgt tggcaatttt tatttctgta ttatctttcc cctcttttag tcagtcaact   180

gaatcacttg actcttcaaa agagaaaatt acattagaga ctaaaaagtg tgatgttgta   240

aaaaacaaca gtgaaaaaaa atcagaaaat atgaacaaca cattttactg ctgtgaactt   300

tgttgtaatc ctgcctgtgc tccat                                         325

<210>75

<211>440

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>75

ggcgacaaat tataccgtgc tgactctaga cccccagatg aaataaaacg ttccggaggt    60

cttatgccca gagggcataa tgagtacttc gatagaggaa ctcaaatgaa tattaatctt   120

tatgatcacg cgagaggaac acaaaccggc tttgtcagat atgatgacgg atatgtttcc   180

acttctctta gtttgagaag tgctcactta gcaggacagt ctatattatc aggatattcc   240

acttactata tatatgttat agcgacagca ccaaatatgt ttaatgttaa tgatgtatta   300

ggcgtataca gccctcaccc atatgaacag gaggtttctg cgttaggtgg aataccatat   360

tctcagatat atggatggta tcgtgttaat tttggtgtaa ttgatgaacg attacatcgt   420

aacagggaat atagagaccg                                               440

<210>76

<211>386

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>76

actatactcc gattcctctg gtgacgatgg ggatcgatta ccgtcatggt acgggtaatg    60

aaaatgatct cctttactca atgcagttcc gttatcagtt tgataaatcg tggtctcagc   120

aaattgaacc acagtatgtt aacgagttaa gaacattatc aggcagccgt tacgatctgg   180

ttcagcgtaa taacaatatt attctggagt acaagaagca ggatattctt tctctgaata   240

ttccgcatga tattaatggt actgaacaca gtacgcagaa gattcagttg atcgttaaga   300

gcaaatacgg tctggatcgt atcgtctggg atgatagtgc attacgcagt cagggcggtc   360

agattcagca tagcggaagc caaagc                                        386

<210>77

<211>418

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>77

agattgcgct gaagcctttg gttctaaata taaaggtaaa tatgtgggaa catttggaga    60

tatttctact tttagctttt ttggaaataa aactattact acaggtgaag gtggaatggt   120

tgtcacgaat gacaaaacac tttatgaccg ttgtttacat tttaaaggcc aaggattagc   180

tgtacatagg caatattggc atgacgttat aggctacaat tataggatga caaatatctg   240

cgctgctata ggattagccc agttagaaca agctgatgat tttatatcac gaaaacgtga   300

aattgctgat atttataaaa aaaatatcaa cagtcttgta caagtccaca aggaaagtaa   360

agatgttttt cacacttatt ggatggtctc aattctaact aggaccgcag aggaaaga     418

<210>78

<211>555

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>78

ttcgctctgc aataggtact ccattacaga ctatttcatc aggaggtacg tctttactga    60

tgattgatag tggcacaggg gataatttgt ttgcagttga tgtcagaggg atagatccag   120

aggaagggcg gtttaataat ctacggctta ttgttgaacg aaataattta tatgtgacag   180

gatttgttaa caggacaaat aatgtttttt atcgctttgc tgatttttca catgttacct   240

ttccaggtac aacagcggtt acattgtctg gtgacagtag ctataccacg ttacagcgtg   300

ttgcagggat cagtcgtacg gggatgcaga taaatcgcca ttcgttgact acttcttatc   360

tggatttaat gtcgcatagt ggaacctcac tgacgcagtc tgtggcaaga gcgatgttac   420

ggtttgttac tgtgacagct gaagctttac gttttcggca aatacagagg ggatttcgta   480

caacactgga tgatctcagt gggcgttctt atgtaatgac tgctgaagat gttgatctta   540

cattgaactg gggaa                                                    555

<210>79

<211>385

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>79

gccttctaag caatcggtca ctggttcgaa tccagtacaa cgcgccatac ttattttttc    60

tggctcgctt ttgcgggcct tttttatatc tgcgccgggt ctggtgctga ttacttcagc   120

caaaaggaac acctgtatat gaagtgtata ttatttaaat gggtactgtg cctgttactg   180

ggtttttctt cggtatccta ttcccgggag tttatgatag acttttcgac ccaacaaagt   240

tatgtctctt cgttaaatag tatacggaca gagatatcga cccctcttga acatatatct   300

caggggacca catcggtgtc tgttattaac cacaccccac cgggcagtta ttttgctgtg   360

gatatacgag ggcttgatgt ctatc                                         385

<210>80

<211>338

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>80

acggacaaca gaatacactc catcgccccc tggctgatgc cgtgacagca tggttcccgg    60

aaaacaaaca atctgatgta tcacagatat ggcatgcttt tgaacatgaa gagcatgcca   120

acaccttttc cgcgttcctt gaccgccttt ccgataccgt ctctgcacgc aatacctccg   180

gattccgtga acaggtcgct gcatggctgg aaaaactcag tgcctctgcg gagcttcgac   240

agcagtcttt cgctgttgct gctgatgcca ctgagagctg tgaggaccgt gtcgcgctca   300

catggaacaa tctccggaaa accctcctgg tccatcag                           338

<210>81

<211>505

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>81

tattataagg acggcacaac aagcaacttc aaaggggttg ttaccccctc cacacctgta    60

aatacgaacc aagacattaa caagacaaat aaggttggag tccaaaaata tagtgctcta   120

accgaatggg ttaaataata tcgagctcta gctaaaattt caactctcca cgctggattc   180

ctatccagcg ttttgggaat gacatttctt gtgattgatc ccaccctcgt aatatggaca   240

caggtctaag cgaggttcta gttttcaaat tgttccggac tgagaccacc aggtgccagc   300

gattgtaatc acattcgata taattaaaca ctgttgcccg cattatttcc cggctgataa   360

aatgttcttc gtggagacat tccactttca gcgaatgaaa gaacctttcc acgcaggcat   420

tatcgtagca gtatcccttg gcgcgcatcc tgtatattat tggcgatatg ccaacatacg   480

ggtatcaccg tgtctgggcg atact                                         505

<210>82

<211>331

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>82

ccagtctgcg tctgattcca ataagtcgca gaatgctatt tcagaagtaa tgagcgcaac    60

gtctgcaatt aatggtctgt atattgggca gaccagttat agtggattgg actcaacgat   120

tttacttaac acatctgcaa ttccggataa ttacaaagat acaacaaaca aaaaaataac   180

caacccattt gggggggaat taaatgtagg tccagcaaac aataacaccg catttggtta   240

ctatctgacg cttaccaggt tggataaagc ggcatgtgtt agtcttgcaa ccttgaactt   300

aggtacttca gcgaaaggct acggtgttaa t                                  331

<210>83

<211>584

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>83

agtaaaatag gaagaaccgc tgaaaatgta ggtaataatc tgggaaaagc cggaacagtt    60

ctctcagcac tacagaattt tacggggatt gctttatcag gcatggctct tgatgaattg   120

ctgagaaaac aacgggaagg agaggatata agtcagaatg atattgccaa aagtagtatt   180

gaacttatta atcagcttgt agatacagta tcaagtataa acagtaccgt tgattcattt   240

tctgagcagc ttaaccagct tggctcattt ttatccagta aacctcgctt aagttctgtt   300

ggtgggaaat tacaaaattt accagacctg ggctccctgg gggatgggct ggatgttgtc   360

tccggaattc tttctgctgt atcagcaagc tttattctgg gaaacagtga cgcacataca   420

ggaacaaaag ctgcagcggg tatcgaactg acaactcagg ttcttggaaa tgttggtaaa   480

gctgtttcgc aatatattct ggctcagaga atggcacagg ggttatcgac aacagctgca   540

agtgcgggtc tgatcacatc ggctgttatg ctggctatca gtcc                    584

<210>84

<211>437

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>84

ttcttgtgaa agtcctggtg gttttgaagc aaagattaaa gggcttttat acattagcga    60

tgttggaatt caatgttgtg ccaataaacg cactttagac actggtattg ctttgaaaaa   120

ggtttattta catagatttt atgatttaaa agaagggcaa aaggttttaa atgctaaagg   180

gaaaaagtta tttgtcgatg tgaattttaa tgcggtattt tatacttatt taaaacaaga   240

acttgaagct agaggaatag ttgtgcttga caataacgat caaaattcac cttatgtgag   300

taagattgat ttagaattta tatcttatgg agcaactcaa gatgctatag gattacattc   360

aaaactagta ggagttttac aagttagtga tataaataaa aataagaaat ttacaatccg   420

caccaagcaa gatgtac                                                  437

<210>85

<211>464

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>85

agaacagcca ctccaacagg acgccatgtg caacaaggtg gaacacctat tgatgaatat    60

gagtggaatt taggaactct ttcaaggcct gatagggttt ttatttatta ttctcgcgtt   120

gatgtaggag ctaatcgtgt aaatttagct atagtttcaa gaatgcaagc tgaagaagtg   180

attgttttac ctccacctac tacagtttca agacccatta taggaattcg caatggaaat   240

gatgcttttt tcaatatcca tgctttagct aatggaggaa cagatgtagg agcaattatc   300

acagctgtag atgcacattt tgcaaatatg cctcaagtta actggatgat agcaggggat   360

tttaaccgtg atccttctac tataacaagt acagtggata gagaattagc aaatagaatt   420

agagtggttt ttccaactag cgcaactcaa gcaagcggag ggac                    464

<210>86

<211>346

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>86

cgctttgaga ttattcacga tgttttaggg attaacgcag tagatgagaa tataaaagta    60

ggcactcacg gcaaaagtat caattctgaa tttatactag aaaaaaatcc tgattatatt   120

tttgttattg atagaaatat cattgtaggc aacaaagaac gcgctcaagg catactcgat   180

aatgcacttg tcgctaaaac caaagcagca caaaacaaaa agatcatcta tcttgatcca   240

gaatactggt atttagcaag tggaaatgga ctagagtctt taaaaactat gattttagaa   300

atcaaaaacg ctgtaaaata atataacttc gcaagggcta gtctct                  346

<210>87

<211>447

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>87

gcaaggttac aacatcacgt tgtttgatac tcacgccttg ttcgagacgc taacttctgc    60

gcccgaagag cacggtttcg tgaacgcgag cgatccttgt ttggacatca accgctcatc   120

gtctgtcgat tacatgtaca cccacgcatt gcgctctgag tgtgcagcgt ctggtgctga   180

gaagtttgtg ttctggaatg tcacgcatcc aacaacagca actcaccgct atgttgcaga   240

gaaaatgcta gaaagtagca acaacttagc cgagtaccgt ttctaaccgg acacggcttc   300

tgagttgaaa ccttatcttc gtacacacgt tgataacgaa cacatcgtgg ccatttttat   360

cgaaggaacg ttgtggtcac agcagtcaca acgctaaaca agttacagtg gcgcgacgtc   420

ggttccccct aaagactggt aaagcgt                                       447

<210>88

<211>294

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>88

ttccatctgt cccttttcct gcccccggtt ctgatgagat attgtttgtt gttcgagata    60

caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg acaaaccgta   120

atgtaaaaag aaaaccgtac gaagatgttt atggtcaatc agtattcaca acgtcaggta   180

ctaaatggtt gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat acaatggcag   240

cggtgtctgg ctataagagc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcaggt caag         294

<210>89

<211>351

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>89

gattgacctg ccatccatac cttttccttc tccaggttcg gatgagctac tatttgtcgt    60

tagaaataca acaataaaaa ctgaatcacc agttaacgca atcgttgatg actactggac   120

aaaccgaaac ataaaacgaa aaccatataa aagcgttcac ggtcaatcta ttttcacgac   180

ttcaggctca aaatggttaa gcgcctatat gacggtaaat attaatggaa ataactacac   240

aatggctgct ctttctggct ataaagatgg cctttcaacg gtcttcacaa aatcagaaaa   300

aacaagccta aatcagaact attcttctgt tagtgatttc gttggtgaga a            351

<210>90

<211>367

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>90

gtcttctgac gcaatcgttg aaccagaagc gccagtagta cctgaaaaag cacctgtggc    60

ttctgctgtg aatccttgga ttccacgcgt tattttattt ttggcactat tactaccgat   120

ttgcgtactg ctgtttacaa acccagcgga atctcagttc cgtcagattg gtgagtatca   180

gaacgtacca gtgatgacac ctgtaaatca cccgcaaatc aacaactggt tgccttctat   240

tgagcagtgt attgaacgct acgttaagca ccatgcagaa gactccttac cagtggaagt   300

gattgccact ggcggacaaa ataaccagct gattttgaac tacattcatg acagcaacca   360

ctcgtat                                                             367

<210>91

<211>306

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>91

atctgcgttg ttctcatctc catatgcatt tgccgatgat tacgacggta ttcctaattt    60

gacagcagtt caaataagcc caaatgctga tcctgctttg ggtctggaat atccagtaag   120

accaccagta ccaggcgcag gcgggctcaa tgctagcgct aagggtatcc atagcattgc   180

gattggtgct actgctgaag cagcgaaagg agcagcagtt gctgtgggcg ctggttcaat   240

tgcaacaggc gttaattctg ttgcaattgg tcctttaagt aaggcattgg gagattcggc   300

agttac                                                              306

<210>92

<211>314

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>92

ttgaaataac taggctgggt cgatgaatat aaactatgat taaattagct tgggaaattt    60

aatgctaaaa acagttgtct cggtacttaa atagaatgcg tggtagaccg caaaaacaat   120

ttaactattg gattttattt atttttaaac tcaaaaattc tttttctgtt attgacacca   180

ctgcgtcgat atttttgtac ccattctaca aatgagtgat ggaggatcta tgaaaaagat   240

agtttttgtt cttgtgttaa tgctgtcttc atttggagca ttcggccaag aaacagtttc   300

agggcagttc agtg                                                     314

<210>93

<211>561

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>93

ggcagaacag cagtcagaca tatgatttag atgaggggaa tatgctgttt ttgcgtcgtg    60

gcagctatgc tgttcgatgt ggtacaaaag aaccctgcca attactttgg attccattac   120

caggcagttt tttgagtact tttttacatc ggtttggttc tttgcttagt gaaattagac   180

gagacaatgc cacacccaag ccattgttaa tttttaatat ttcaccaata ttatcacaat   240

ccattcaaaa tctatgtgcc atattggaac ggagtgattt tccgtcagta ttaacgcaac   300

tgcgtattga ggaattattg cttttgcttg cctttagctc gcaaggggct ttattcctct   360

cggctctgcg ccatttaggc aaccgcccag aagaacggtt gcagaaattt atggaggaaa   420

attatctaca agggtggaaa ctaagcaaat ttgcgcgaga attcggcatg ggattaacca   480

cattcaaaga actgtttggt acagtttatg gcatttcacc acgcgcctgg ataagcgagc   540

gacgtattct ctatgctcac c                                             561

<210>94

<211>294

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>94

tggtttcgat tcggaagcgg gttatcgccg tcaggaggca ttgcgaaaag aaaataacat    60

tggaacaaaa atggggaact tctcattttt cagcgaagag atgaccgacc cgctggtcgc   120

gttcgccgga cagtggcggc cagatctcat cgtctatcct ccccttgggg tcgttggacc   180

actgattgcc gctaagtatg acattccggt agtaatgcaa accgtcggct tcggtcatac   240

gccctggcac atcaaaggcg tgacgaaatc actttctaac gcctaccgcc gcca         294

<210>95

<211>373

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>95

gctctttcgt ctggcattat cgatcagtac cagccgtctt atcttgattg aagccgatgc    60

cggtgaaatt atcgccacgt tcgggcaatt cgttattggc gatagcctgg cggtgggttt   120

tgttgtcttc tctattgtca ccgtggtcca gtttatcgtt attaccaaag gttcagaacg   180

cgtcgcggaa gtcgcggccc gattttctct ggatggtatg cccggtaaac agatgagtat   240

tgatgccgat ttgaaggccg gtattattga tgcggatgct gcgcgcgaac ggcgaagcgt   300

actggaaagg gaaagccagc tttacggttc ctttgacggt gcgatgaagt ttatcaaagg   360

tgacgctatt gcc                                                      373

<210>96

<211>484

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>96

gtagctgctt atgatggggc ggaaatacca tctacaaata agcacctgaa aaataatttc    60

aactccttgc acaaccaaat gcggaagatg ccggtatccc actttaaaga ggcgctggat   120

gtgcctgact attcagggat gcgccagagt ggtttctttg ctatgagcca aggttttcag   180

ctgaataacc atggttacga tgttttcatc catgctcgtc gagaatcacc tcagtctcag   240

ggcaaatttg ccggtgacaa gttccacatc agtgtgctca gggatatggt gccacaagca   300

tttcaagcgc tgtccggatt gctgttttca gaggacagtc cggtagataa gtggaaagtg   360

accgatatgg agaaggtcgt tcaacaagcc cgtgttagcc tgggcgctca gttcacgttg   420

tatataaaac cagaccagga aaattcgcag tacagtgcgt cgtttctcca caagacacgg   480

caat                                                                484

<210>97

<211>371

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>97

cgtaaggaac gagataggag tgttctcgtt tgtttctatt taatgaaaag ctatacactt    60

ttatagccta acagctttcg aatattactc tgtgattccg tataagaact taaattattc   120

ttacactttt tattttcgta attactatca cacgaaaaag agctggttct gagacttcaa   180

ctaaatttaa ggtagttata aaacaaactt tgatatagtc gtcgtctcag attacactac   240

tatcagcgcc ccttagggta ttcctctcta cctgatggca tatatctaat gggggtgtga   300

catttgttac attttaaaca ttaatcatca atacgacaca tagcgaatct gcgtaaatct   360

ttgtagccga a                                                        371

<210>98

<211>587

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>98

gccgtattcg caatgagttt atcaaaaaac tttcctgcta tatggataat gaaaatgcaa    60

aaatagctgg cccagttttt attgatagag ataagtcaca ttattatcct atttgtaata   120

tcaaaaaaaa tggtcttcga gagaaaattc atgtcactga aggacagaca ccgtttaaaa   180

gttcagtaac aatctcatcc ggaaccatgg tttcaaaaga agtttttgag attgttggaa   240

tgatggatga ggaacttttt attgattatg tcgatacaga atggtgtctt agatgcttaa   300

actatggcat attagttcat atcattcctg atatagaaat ggttcatgct attggggata   360

agtcagtaaa aatctgtggg attaacatac caattcactc gccagtacgt cgttattatc   420

gagtaagaaa tgcatttctt ttgcttagaa aaaatcatgt gcctctttta ctctctatta   480

gggaagttgt tttttcttta attcatacga ctttaattat cgcaactcaa aaaaataaaa   540

ttgaatatat gaaaaaacat attttggcta cgctggatgg aataaga                 587

<210>99

<211>409

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>99

ttctttttct ggatagccga gcaggaataa tatcatttgc tatatcgttg ttttttgttt    60

ttcttcagtt aacaaagaag gaaaagttat taatatcatt gttttttgtt cctcttctaa   120

ctttaggtat ttcttttact gatataggca ctcgtcttga acgaatgctg tcttcgtcac   180

aggttatatt ctctggtggt aacactctta caaaaagtca gaatgattat cgtcgagttg   240

agttagtatt tattggggtt gatgttttaa aagaaaatta tttaattggc actggattag   300

gtgttgcaaa ttatgtaaag gctatagata aaaagttttt aggaagtacc aactttgggt   360

tggcgcataa tttttattta tcttattcgg ctcagttagg gattattgg               409

<210>100

<211>371

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>100

caaactgcta acacagctac tccaaaagca gaagtgaaaa cggaagctcc agcagctgaa    60

aaacaagcag ctccagtagt taaagaaaat actaacacaa atactgctac tacagagaaa   120

aaagaaacag caacgcaaca acaaacagca cctaaagcac caacagaagc tgcaaaacca   180

gctcctgcac catctacaaa cacaaatgct aataaaacga atacaaatac aaatacaaac   240

aatactaata caccatctaa aaatactaat acaaactcaa atactaatac gaatacaaac   300

tcaaatacga atgctaatca aggttcttcc aacaataaca gcaattcaag tgcaagtgct   360

attattgctg a                                                        371

<210>101

<211>414

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>101

tccgcctgca agtcctaaga cgccaatcga aaagaaacac gcggatgaaa tcgataagta    60

tatacaagga ttggattaca ataaaaacaa tgtattagta taccacggag atgcagtgac   120

aaatgtgccg ccaagaaaag gttacaaaga tggaaatgaa tatattgttg tggagaaaaa   180

gaagaaatcc atcaatcaaa ataatgcaga cattcaagtt gtgaatgcaa tttcgagcct   240

aacctatcca ggtgctctcg taaaagcgaa ttcggaatta gtagaaaatc aaccagatgt   300

tctccctgta aaacgtgatt cattaacact cagcattgat ttgccaggta tgactaatca   360

agacaataaa atcgttgtaa aaaatgccac taaatcaaac gttaacaacg cagt         414

<210>102

<211>342

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>102

aacatcggtt ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat    60

caaaataaac gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt   120

ccaaacccta caaaaacaag tttcatacag tctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa   180

cgggaagctt ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga   240

aactcctgat ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc   300

aagaggcatc gcacatagct cagctgttag cagaattatt tc                      342

<210>103

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>103

acacccaagc cattgttaa                                                 19

<210>104

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>104

tttctgcaac cgttcttct                                                 19

<210>105

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>105

ctttatcagg catggctct                                                 19

<210>106

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>106

tatgtgcgtc actgtttcc              19

<210>107

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>107

tgctcactta gcaggacag              19

<210>108

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>108

cacctaacgc agaaacctc              19

<210>109

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>109

tttaactaat ctcaaatatc cgtga       25

<210>110

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>110

atggagcaca ggcaggatta c           21

Claims (14)

1.一套病原微生物检测用引物，其由以下序列所示的引物组成：SEQ ID Nos.9和10、SEQ ID Nos.3和4、SEQ ID Nos.5和6、SEQ ID Nos.7和8、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.23和24、SEQ ID Nos.25和26、SEQ ID Nos.27和28、SEQ ID Nos.11和12、SEQ ID Nos.43和44、SEQ ID Nos.31和32、SEQ ID Nos.51和52、SEQ ID Nos.59和60、SEQ ID Nos.57和58、SEQ ID Nos.61和62、和SEQ ID Nos.67和68。

2.一套病原微生物检测用引物，其由如权利要求1所述的病原微生物检测用引物以及以下序列所示的引物组成：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.37和38、SEQ ID Nos.39和40、SEQ ID Nos.41和42、SEQ ID Nos.13和14、SEQ ID Nos.19和20、SEQ ID Nos.21和22、SEQ ID Nos.29和30、SEQ ID Nos.55和56、SEQ ID Nos.33和34、SEQ ID Nos.47和48、和SEQ ID Nos.65和66。

3.一套病原微生物检测用引物，其由如权利要求1或2所述的病原微生物检测用引物以及以下序列所示的引物组成：SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.35和36、SEQ ID Nos.53和54、SEQ ID Nos.45和46、SEQ ID Nos.49和50、和SEQ ID Nos.63和64。

4.一种多重扩增检测方法，该方法是用于对土壤、水样、食品或化妆品进行检测，该方法包括利用权利要求1～3任一项所述的引物进行扩增。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述扩增选自：聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。

6.如权利要求4或5所述的方法，该方法进一步包括在所述扩增之后进行定性或定量分析。

7.如权利要求6所述的方法，其中，所述的定性分析包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物或用荧光扫描显示杂交后的液相扩增产物。

8.如权利要求1～3任一项所述的病原微生物检测用引物在制备检测剂中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其中所述的检测剂用于检测霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌和李斯特菌，以及包含以上任何一种或一种以上病原体的鉴别诊断用样品。

10.如权利要求9所述的应用，所述的检测剂用于对排泄物、肠积液、呕吐物、土壤、水样、食品或化妆品进行检测。

11.一种病原微生物检测用试剂盒，该试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的引物。

12.如权利要求11所述的检测用试剂盒，该试剂盒还包括以下标记或未标记的探针：SEQ ID No.73、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.74、SEQ ID No.90、SEQ ID No.84、SEQ ID No.94、SEQ ID No.98、SEQ ID No.97、SEQ ID No.99、SEQ ID No.102。

13.如权利要求12所述的检测用试剂盒，该试剂盒还进一步包括以下探针：SEQ ID No.69、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.75、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.83、SEQ ID No.96、SEQ ID No.85、SEQ ID No.92、SEQ IDNo.101。

14.如权利要求13所述的检测用试剂盒，该试剂盒还进一步包括以下探针：SEQ ID No.76、SEQ ID No.86、SEQ ID No.95、SEQ ID No.91、SEQ ID No.93、SEQ ID No.100。

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