CN103343164B - 产志贺毒素大肠杆菌多重pcr检测方法、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用。该方法及其试剂盒通过三重PCR反应，经电泳染色、紫外观察，能同时检出stx1、stx2、wzy_O157基因，且stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和stx_1c亚型，stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株。本发明能有效检测出stx及其主要变种，可用于区分O157和其他非O157型大肠埃希氏菌，既可以用于直接检测食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌，也可以用于鉴定临床株和食品分离株。<!--1-->

Description

产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学应用技术领域，具体涉及一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

产志贺毒素大肠杆菌是一种重要的食源性致病菌，主要代表为大肠杆菌O157:H7。产志贺毒素大肠杆菌能产生志贺毒素，可以牛肉、鸡肉、水果和蔬菜等为载体传播，引起人得出血性肠炎、溶血性尿毒综合症等严重食物中毒并发症，严重者甚至会发生急性肾衰竭而死亡。产志贺毒素大肠杆菌主要毒力因子是位于噬菌体上的stx1、stx2基因，这两种基因分别编码志贺毒素Stx1、Stx2。

我国自1986年首次报告大肠杆菌O157:H7感染的病例以来，曾于2001年在江苏、安徽等地两度暴发大肠杆菌O157:H7导致的感染性腹泻。共造成177人死亡，中毒人数超过2万人。这是迄今为止人类历史上最为严重的O157:H7感染疫情。近年来，世界各国产志贺毒素大肠杆菌的感染流行均呈上升趋势。非O157型产志贺毒素大肠杆菌引起的食物中毒并发症严重程度也在不断增加。2011年德国致病性大肠杆菌暴发的元凶亦为一种少见的血清型O104:H4。

随着对大肠杆菌O157:H7研究的深入，很多国家和地区相继报道发现了不产志贺毒素，即不具有致病性的O157:H7菌株。而现有的大肠杆菌O157检测方法只检测O157标志基因，如rfb_O157基因（食品中多种致病菌快速检测方法PCR法，SN/T1869-2007），不能进一步判定大肠杆菌O157是否具有毒力。另外，由于stx1和stx2基因的不同亚型核苷酸序列差异较大，stx1基因的变种根据基因序列的差异，分为stx₁、stx_1c、stx_1d，而stx2基因的变种可分为stx₂、stx_2c、stx_2d、stx_2e和stx_2f，很难用一种通用引物同时扩增出所有基因亚型或主要基因亚型。再者，一个反应中使用的引物数目越多，引物之间越容易相互干扰，形成引物发夹环或引物二聚体，导致PCR扩增困难，检测灵敏度大大降低。因此，针对产志贺毒素大肠杆菌的PCR检测来说，设计一种能在一个PCR反应中完成志贺毒素编码基因和O157特征基因的检测，并能鉴别O157血清型大肠杆菌致病菌和检测出stx1和stx2基因及其常见亚型、具有特异性、广谱性的多重PCR引物比较困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、快速、简便、特异性强、广谱性好的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法。

本发明的另一个目的在于提供一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法及试剂盒在食品检测中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：

一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法，该方法通过三重PCR反应，经电泳染色、紫外观察，能同时检出stx1、stx2、wzy_O157基因，且stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和stx_1c亚型，stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株；

所述stx1基因的检测引物为：

上游引物stx1F序列为SEQ.ID.No.1，

下游引物stx1R序列为SEQ.ID.No.2，

所述stx1基因的扩增序列为SEQ.ID.No.3；

所述stx2基因的检测引物为：

上游引物stx2F序列为SEQ.ID.No.4，

下游引物stx2R序列为SEQ.ID.No.5，

所述stx2基因的扩增序列为SEQ.ID.No.6；

所述wzy_O157基因的检测引物为：

上游引物wzyF序列为SEQ.ID.No.7，

下游引物wzyR序列为SEQ.ID.No.8，

所述wzy_O157基因的扩增序列为SEQ.ID.No.9。

为实现本发明的第二个目的，本发明采用如下技术方案：

一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括stx1基因的检测引物、stx2基因的检测引物和wzy_O157基因的检测引物，所述stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和stx_1c亚型，所述stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，所述wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株；

所述stx1基因的检测引物为：

上游引物stx1F序列为SEQ.ID.No.1，

下游引物stx1R序列为SEQ.ID.No.2，

所述stx1基因的扩增序列为SEQ.ID.No.3；

所述stx2基因的检测引物为：

上游引物stx2F序列为SEQ.ID.No.4，

下游引物stx2R序列为SEQ.ID.No.5，

所述stx2基因的扩增序列为SEQ.ID.No.6；

所述wzy_O157基因的检测引物为：

上游引物wzyF序列为SEQ.ID.No.7，

下游引物wzyR序列为SEQ.ID.No.8，

所述wzy_O157基因的扩增序列为SEQ.ID.No.9。

为实现上述第三个目的，本发明采用如下技术方案：

1）制备DNA样本：将食品样品用TSB增菌培养后，用有机试剂提取法提取DNA；

2）进行三重PCR检测。

上述方法具体包括以下步骤：

提供待检测DNA样品。

进行三重PCR检测，所述三重PCR检测使用上述三重引物对进行。同时以标准品DNA和无菌去离子水作为阳性和阴性对照样本进行PCR扩增。

PCR反应的体系和扩增程序分别为：

反应体系：2.5μL10×buffer；2μL2.5mMdNTPs；10μM引物各加入0.5μL；1μLDNA；和0.15μLTaqDNApolymerase（购于大连宝生物工程有限公司）；加无菌双蒸水补足至总反应体积为25μL。

扩增程序：首先，94℃预变性3min；然后，94℃1min，55℃45s，72℃60s，35个循环；最后，72℃延伸10min。

PCR反应结束后，取PCR反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳胶中加入Goldview进行染色，电泳结束后，在紫外投射仪下观察拍照。

本发明优点：根据NCBI数据库大肠杆菌stx1、stx2、wzy_O157基因序列，分别在保守区设计了特异引物，可扩增出大肠杆菌stx1、stx2基因序列。在实际应用中，我们采用该试剂盒检测了120株临床大肠杆菌毒株。这120株菌stx基因型已经用其他的商业化试剂盒反复验证，证实这些菌株分别属于stx₁、stx_1c、stx_1d、stx₂、stx_2c和stx_2d基因型，这也是临床中常见的stx亚型。120株菌中有88株属于O157血清型，32株属于非O157血清型。这些非O157血清型大肠杆菌包括O111、O114、O8、O6、O26、O103、O121、O74、O152、O128、O91等，基本涵盖了非O157血清型主要流行株。用本发明设计的试剂盒检测这120株菌，其中stx1引物可有效扩增出stx₁和stx_1c亚型，stx2检测引物能有效扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型。由于Stx_1d、stx_2e和stx_2f非常少见，甚少感染人类。说明本发明能有效检测出stx及其主要变种。O157菌株的O抗原聚合酶基因wzy_O157是其特异的标志基因，可用于区分O157和其他非O157型大肠埃希氏菌，但采用该基因设计的检测方法和试剂盒甚少。本发明采用wzy_O157基因检测引物鉴别O157，在实际应用中，88株O157血清型临床株均能扩增出wzy_O157基因产物，余下的32株非O157血清型临床株均不能扩增出wzy_O157基因产物。沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、蜡样芽孢杆菌等参考菌株PCR反应均呈阴性。以上实验结果说明本发明能鉴别出O157血清型大肠杆菌，具有很好的特异性。相对类似的试剂盒来说（多重PCR法检测食品中大肠杆菌O157，李睿等，武汉工业学院学报，2010，3:1-3），本发明能检测出stx1和stx2基因及其常见亚型，具有很好的广谱性；引物设计更合理，引物间不形成干扰，灵敏性更强。本发明通过一次PCR反应，可良好地区分出不具有致病性的O157菌株和非O157型产志贺毒素大肠杆菌，大大缩短了检测时间和工作量。既可以用于直接检测食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌，也可以用于鉴定临床株和食品分离株。

附图说明

图1是大肠杆菌O157:H7标准株stx1、stx2、wzy_O157基因的PCR电泳图。M是marker。大肠杆菌O157:H7标准株由武汉市疾病与预防控制中心提供。

图2是本发明的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法特异性试验的PCR电泳图。M是marker。泳道1-12分别为：1是O157菌株EC194(stx₁ ⁺stx_2c ⁺wzy_O157 ⁺)，2是O152菌株EC108(stx₁ ⁺)，3是O157菌株EC121(stx_1c ⁺stx_2c ⁺wzy_O157 ⁺)，4是O114菌株EC17(stx₂ ⁺)，5是O121菌株EC109(stx₂ ⁺)，6是O74菌株EC115(stx_2d ⁺)，7是O103菌株EC112(stx₁ ⁺)，8是O157菌株EC182(stx_2c ⁺wzy_O157 ⁺)，9是O157菌株EC28(stx_1C ⁺stx₂ ⁺wzy_O157 ⁺)，10是O157菌株EC150(stx₁ ⁺stx₂ ⁺wzy_O157 ⁺)，11是O8菌株EC92(stx₂ ⁺)，12是O26菌株EC100(stx₁ ⁺)。图2所示菌株为日本九州大学食品卫生实验室提供，括号内为实验菌株采用商业化试剂盒鉴别出来的stx基因亚型。

图3是本发明的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法灵敏度试验的PCR电泳图。M是marker。泳道1-6分别为：1是330ngDNA，2是33ngDNA，3是3.3ngDNA，4是330pgDNA，5和6都是33pgDNA。M是marker。试验菌株为大肠杆菌O157:H7标准株，由武汉市疾病与预防控制中心提供。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

1、产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

1.1材料与方法

1.1.1试验菌株

120株大肠杆菌临床株DNA样本由日本九州大学食品卫生实验室提供。沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、蜡样芽孢杆菌等参考菌株由武汉轻工大学食品安全团队实验室保存。大肠杆菌O157:H7标准株，由武汉市疾病与预防控制中心提供。

1.1.2主要仪器和试剂

德国BiometraTGRADIENT型PCR仪，北京市六一仪器厂DYY-8C型电泳仪，英国SyngeneGBox-HR-E-M型自动凝胶成像分析系统。细菌基因组DNA提取试剂盒购置于天根生化科技（北京）有限公司。PCR试剂、DNAmarker购于大连宝生物工程有限公司。

1.1.3引物设计

下载NCBIGenBank数据库收录的大肠杆菌stx1、stx2、wzy_O157基因序列，进行多序列比对，分析保守区域。根据JQ327853.1序列（见序列表SEQ.ID.No.3）在保守区设计stx1引物，引物序列为stx1F：5’-AAACCGTAACATCGCTCTTG-3’（见序列表SEQ.ID.No.1），stx1R：5’-TCGCCATTCGTTGACTACTT-3’（见序列表SEQ.ID.No.2）。

根据FM180578.1序列（见序列表SEQ.ID.No.6）在保守区设计stx2引物，引物序列为stx2F:5’-GCCATAAACATCTTCTTCATACT-3’（见序列表SEQ.ID.No.4），stx2R：5’-GGGGCGAATCAGCAAT-3’（见序列表SEQ.ID.No.5）。

根据BA000007.21序列（见序列表SEQ.ID.No.９）在保守区设计wzy_O157引物，引物序列为wzyF：5’-CATTTTGTTCTCCGTCTTGTC-3’（见序列表SEQ.ID.No.７），wzyR：5’-TTGGTGTTGCTCATTCTTCA-3’（见序列表SEQ.ID.No.８）。

PCR扩增产物大小分别为stx1（91bp），stx2（320bp），wzy_O157（157bp）。引物由北京鼎国昌盛生物公司合成。

1.1.4细菌DNA模板的制备

1.1.4.1热裂解法

用煮沸法提取待检菌株的基因组DNA：将菌株在LB液体培养基中培养过夜，取1mL菌液12000rpm离心5min，弃上清液；细胞沉淀用1mL无菌水洗涤，12000rpm离心5min，弃尽上清液。加入100μL无菌去离子水于沉淀中形成悬浮液，煮沸10min，冰浴5min，12000rpm离心5min，上清液即为基因组DNA，用做PCR扩增的模板。

1.1.4.2试剂盒提取法

将待检菌株在LB液体培养基中培养过夜，取1mL菌液12000rpm离心5min，弃上清液；细胞沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒按照说明书操作，提取基因组DNA，用做PCR扩增的模板。

1.1.4.3有机试剂提取法

将食品样品用TSB进行增菌培养过夜，取1mL增菌液于1.5mL无菌EP管中，8000rpm离心5min，弃上清液；沉淀中加入1.5mL1×TE缓冲液旋涡振荡混匀；加入20μL(浓度为50mg/mL)溶菌酶，37℃保温2h；加入50μL(浓度为5mol/L)的NaCl，100μL重量百分比为10%的SDS（十二烷基磺酸钠），3μL(浓度为20mg/mL)的蛋白酶K，旋涡振荡混匀，55℃水浴保温至混合液完全变为澄清透明液体，加入5μLRNaseA温和混匀，室温静置30min。将混合液分装到两个无菌EP管中，分别进行以下处理：加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比为25：24：1），温和混匀后，再冰上静置5min，然后12000rpm离心10min；取上清液于新的EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24：1），温和混匀后，再冰上静置5min，然后12000rpm离心10min；重复上述的用氯仿和异戊醇进行抽提的步骤一次。将分别处理得到的上清液合并置于一个新的EP管中，加入0.6倍体积的在-20℃预冷过的异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10min，12000rpm离心10min。弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，室温晾干，用做PCR扩增的模板。

1.1.5三重PCR产物的序列测定

采用步骤1.1.3所设计的三种检测引物对提取的细菌基因组DNA进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳完成后切下电泳带。用Takara公司切胶回收试剂盒对PCR产物进行切胶回收。然后将PCR产物分别与PGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板。将平板上长出的白斑加入含有氨苄青霉素（终浓度为50ug/ml）的LB液体培养基中培养过夜，按Omega质粒提取说明书抽提质粒。重组质粒DNA经EcoRI单酶切，验证为阳性的重组质粒送上海生工生物技术有限公司测序。

1.1.6三重PCR反应条件和反应体系的优化

改变退火温度（54-57℃）和PCR反应液成分、改变三组引物的量比，在PCR仪器上反复进行PCR扩增，优化三重PCR反应条件和反应体系。

1.1.7三重PCR反应的特异性试验

用优化后的三重PCR方法，对120株临床大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、蜡样芽孢杆菌等标本DNA进行PCR扩增，检验该方法的特异性。

1.1.8三重PCR反应的灵敏性试验

将330ng的大肠杆菌O157DNA进行10倍梯度稀释，用优化的三重PCR方法对梯度稀释的DNA样本进行PCR扩增，检验三重PCR反应的灵敏性。

具体操作包括如下步骤：

制备DNA样本：如用于直接检测食品样品，可将食品样品用TSB增菌培养后，用有机试剂提取法提取DNA，再进行三重PCR检测。如用于鉴定临床或食品分离株，可将单菌用热裂解法或试剂盒提取法提取DNA后，再进行三重PCR检测。

试剂盒使用：

以提取的待检样品基因组DNA为模板按以下比例进行三重PCR反应。优化后的PCR体系为：2.5μL的10×buffer，2μL的2.5mMdNTPs，10μM的引物各加入0.5μL，1μLDNA，0.15μL的TaqDNApolymerase（购于大连宝生物工程有限公司），加无菌双蒸水补足至总反应体积25μL。

优化后的PCR扩增程序：首先，94℃预变性3min；然后，94℃1min，55℃45s，72℃60s，35个循环；最后，72℃延伸10min。

以携带stx1和stx2的大肠杆菌O157DNA作为阳性对照，以无菌去离子水作为阴性对照样本进行PCR扩增。

PCR反应结束后，取5μL反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳胶中加入Goldview进行染色。电泳结束后在紫外投射仪下观察拍照。

2.结果

2.1DNA提取方式对PCR反应的影响

对纯菌株来说，热裂解法、试剂盒提取法制备的基因组DNA模板进行三重PCR时，均能获得良好的扩增效果，从成本角度，可采用热裂解法提取制备基因组DNA模板。检验食品样品时，因食品样本中的杂质有可能干扰PCR反应，宜采用有机试剂提取法，既节约成本，又能获得良好的扩增效果。

2.2三重PCR产物的序列测定

采用三重PCR引物对大肠杆菌O157毒株进行PCR扩增，经电泳验证，PCR产物大小与预期产物大小一致，如图1所示。PCR产物进行切胶回收后，连接到PGEM-T载体并转化大肠杆菌DH5α。阳性重组质粒经酶切鉴定后送上海生工生物技术有限公司测序。测序结果经拼接和比对，确认为大肠杆菌stx1（91bp）、stx2（320bp）和wzy_O157（157bp）序列。

2.3三重PCR反应的特异性试验

用建立的三重PCR方法检测临床大肠杆菌，共120株，以及沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、蜡样芽孢杆菌等质控菌株，结果如图2所示。大肠杆菌O157能扩增出wzy_O157，非O157血清型大肠杆菌均不能扩增出wzy_O157。三重PCR反应能检出stx₁、stx_1c、stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，而沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、蜡样芽孢杆菌等PCR反应均呈阴性。说明本发明涉及的三重PCR试剂盒具有良好的特异性，能检测stx基因及其主要亚型，具有广谱性。

2.4三重PCR反应的灵敏性试验

将大肠杆菌O157菌株DNA样本进行10倍梯度稀释，然后用建立的三重PCR方法检测。结果如图3所示。三组引物可同时检测低至330pg的DNA。低至33pg的DNA样本中stx1和wzy_O157基因有明显扩增，而stx2基因无PCR扩增产物。低至3.3pg的DNA样本中仍能检测到stx1基因PCR扩增产物。

3.产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测试剂盒

本发明的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测试剂盒包括PCR反应液，在一个PCR反应中，所述PCR反应液组成包括：

4.产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法及试剂盒在食品检测中的应用

本发明的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法及试剂盒可用于检测食品中是否具有有毒大肠杆菌，特别是是否有产志贺毒素的O157菌株和非O157型产志贺毒素大肠杆菌，

本发明的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法及试剂盒在用于检测食品中是否具有有毒大肠杆菌时，首先要按“1.1.4.3有机试剂提取法”进行处理后，再按本发明的检测方法和试剂盒进行检测。

Claims (4)

1.一种非诊断目的的产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测方法，其特征在于：该方法通过三重PCR反应，经电泳染色、紫外观察，能同时检出stx1、stx2、wzy_O157基因，且stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和stx_1c亚型，stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株；

所述stx1基因的检测引物为：

上游引物stx1F序列为SEQIDNo：1，

下游引物stx1R序列为SEQIDNo：2，

所述stx1基因的扩增序列为SEQIDNo：3；

所述stx2基因的检测引物为：

上游引物stx2F序列为SEQIDNo：4，

下游引物stx2R序列为SEQIDNo：5，

所述stx2基因的扩增序列为SEQIDNo：6；

所述wzy_O157基因的检测引物为：

上游引物wzyF序列为SEQIDNo：7，

下游引物wzyR序列为SEQIDNo：8，

所述wzy_O157基因的扩增序列为SEQIDNo：9。

2.一种产志贺毒素大肠杆菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括stx1基因的检测引物、stx2基因的检测引物和wzy_O157基因的检测引物，所述stx1基因的检测引物能扩增出stx₁和stx_1c亚型,所述stx2基因的检测引物能扩增出stx₂、stx_2c和stx_2d亚型，所述wzy_O157基因的检测引物能鉴别O157血清型菌株；

所述stx1基因的检测引物为：

上游引物stx1F序列为SEQIDNo：1，

下游引物stx1R序列为SEQIDNo：2，

所述stx1基因的扩增序列为SEQIDNo：3；

所述stx2基因的检测引物为：

上游引物stx2F序列为SEQIDNo：4，

下游引物stx2R序列为SEQIDNo：5，

所述stx2基因的扩增序列为SEQIDNo：6；

所述wzy_O157基因的检测引物为：

上游引物wzyF序列为SEQIDNo：7，

下游引物wzyR序列为SEQIDNo：8，

所述wzy_O157基因的扩增序列为SEQIDNo：9。

3.权利要求1所述检测方法在食品检测中的应用，其特征在于：包括如下步骤：

1）制备DNA样本：将食品样品用TSB增菌培养后，用有机试剂提取法提取DNA；

2）进行三重PCR检测。

4.权利要求2所述试剂盒在食品检测中的应用，其特征在于：包括如下步骤：

1）制备DNA样本：将食品样品用TSB增菌培养后，用有机试剂提取法提取DNA；

2）进行三重PCR检测。