CN103409546A - 一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过等温核酸扩增方法检测猪链球菌2型核酸的试剂盒及其在猪链球菌2型核酸检测中的应用，所述试剂盒包括扩增反应液、引物反应液、DNA聚合酶、核酸染料、S.suis2型阳性标准品以及阴性对照品。使用该试剂盒用于S.suis2型阳性检测的方法包括待检标本细菌DNA的提取、S.suis2型CPS2J基因的LAMP扩增、扩增产物的电泳检测、LAMP扩增产物的显色反应以及S.suis2型链球菌阳性判断五个步骤。本发明用于S.suis2型链球菌阳性检测时，具有快速方便、特异性强、灵敏度高的优点，非常适合医疗或食品行业中S.suis2型链球菌的快速检测。

Description

一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测病源微生物的试剂盒及其应用，具体涉及一种通过等温核酸扩增方法检测猪链球菌2型核酸的试剂盒及其在猪链球菌2型核酸检测中的应用，属于病源微生物检测领域。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)2型是一种致病力强的重要人兽共患病病原体，可引起猪和人感染发病，并可导致死亡。1998年，江苏省南通市爆发了猪群S.suis2型疫情，并在国内首次报道了人感染S.suis2型病例，近年来国内已多次发生人感染S.suis2型疫情，S.suis2型疫情成为了一个重要的公共卫生问题。

现有的猪链球菌检测方法有微生物学方法、血清学鉴定及PCR检测等。微生物学检测方法是根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。链球菌在显微镜下呈圆形或卵圆形，直径小于0.2μm，常成双排列或成链状。革兰氏染色阳性，除D群个别细菌外，均无鞭毛，多数有荚膜。血琼脂平板上可长成直径0.1～1.0mm，灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落，多数致病菌株具有溶血能力，溶血环的大小和类型因菌株而异。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、协同凝集试验、毛细沉淀或平板凝聚试验，其中ELISA与协同凝集试验的应用最为广泛。PCR检测方法有很强的特异性和高度的敏感性，应用越来越广泛，但其敏感性和特异性仍有很大提高空间。

环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，英文名称为loop-mediated isothermalamplification,是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。Notomi报道了一种名为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的新型核酸扩增方法，该方法利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增，LAMP反应需要特别设计2条内引物(FIP和BIP)和2条外引物(F3和B3)，靶DNA在60℃到65℃恒温条件下(如水浴锅内)保温约60分钟，LAMP扩增结果即可判定。LAMP最终产物是由大量菜花样结构组成的茎环状DNA混合物，由于LAMP扩增产生了巨大数量的DNA产物，故可通过反应管内副产物的浊度或荧光来对产物进行检测。

CN1896279A公开了一种PCR法检测猪链球菌2型的方法，其中同时使用了3对引物进行PCR扩增，该方法只能在菌浓度为450个/ml以上时具有阳性结果。

CN102605046A公开了一种试剂盒和检测猪链球菌2型的方法，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修饰；所述探针的5’端和/或3’端被地高辛修饰；所述探针能够与所述双链DNA扩增产物中带有生物素修饰的单链DNA杂交，该方法特异性较强，但该方法操作复杂、检测耗费时间长，且其灵敏度具有很大的改进空间。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种快速方便、特异性强、灵敏度高的基于LAMP的猪链球菌2型(S.suis2型)核酸检测试剂盒，并提供一种使用该种试剂盒快速检测S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因的方法，从而为猪链球菌的监测和临床诊断提供一种有益的检测手段。

本发明所述的试剂盒包括扩增反应液、引物反应液、DNA聚合酶、S.suis2型阳性标准品、核酸染料以及阴性对照品，其中扩增反应液包括10×Bst DNA聚合酶缓冲液(10×Bst DNA Polymerase Buffer)，甜菜碱(Betaine)，dNTP混合物(dNTP Mixture)，Mgso₄和双蒸水(ddH₂o)；引物反应液包括CPS2J-F3引物、CPS2J-B3引物，CPS2J-FIP引物、CPS2J-BIP引物；所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)；所述的S.suis2型阳性标准品为S.suis2型菌株基因组DNA；所述的核酸染料为核苷酸绿色胶体染料；所述的阴性对照品为ddH₂o。

所述的试剂盒中，所述扩增反应液按每管20.0μL计，其最佳组成为：10×BstDNAPolymerase Buffer2.5μl、dNTP Mixture(10mM)3.5μl、Betaine(5M)5.0μl，Mgso₄(50mM)1.6μl，7.4μLddH₂o。

所述的试剂盒中所述的CPS2J-F3引物为SEQ ID NO：1，所述的CPS2J-B3引物为SEQ ID NO：2，所述的CPS2J-FIP引物为SEQ ID NO：3，所述CPS2J-BIP引物为SEQ IDNO：4。

所述的试剂盒中Bst DNA Polymerase的浓度为8U/μl。所述引物反应液中含有10uM CPS2J-F3引物、10uM CPS2J-B3引物、40uM CPS2J-FIP引物和40uM CPS2J-BIP引物。

本发明另一个目的在于提供利用所述试剂盒检测S.suis2型CPS2J基因的方法，所述的检测方法依次包括下列步骤：

(1)待检标本细菌DNA的提取：利用通用型核酸提取试剂提取待检标本细菌模板DNA；细菌模板DNA提取可采用常规方法或试剂进行提取，这对于本领域技术人员是熟知的。如可利用广州华瑞安生物科技有限公司生产的通用型核酸提取试剂进行细菌模板DNA提取。

(2)S.suis2型CPS2J基因的LAMP扩增：恒温条件下，利用试剂盒中引物反应液中的引物对S.suis2型的特异性荚膜多糖CPS2J基因进行LAMP扩增得到LAMP扩增产物；

该步骤中具体包括如下两个步骤：A.向标明编号的LAMP反应管中加入扩增反应液20.0μL、引物混合液3.0μL、待检模板1μL和Bst DNA Polymerase1.0μL；B.将上述LAMP反应管混匀点离后置于恒温水箱内进行以下反应：①65℃60mmin，②80℃2min；反应完毕即可得到LAMP扩增产物。

(3)LAMP扩增产物的显色反应初筛：向含有步骤(2)获得的LAMP扩增产物的反应管内加入核苷酸绿色胶体染料染色1-5分钟，通过肉眼判断反应液的颜色，反应液变绿为阳性，反应液保持染料的棕色不变为阴性；其中所述的核苷酸绿色胶体染料的型号优选为

核苷酸绿色胶体染料(

Green I nucleic acid gelstain，SYBR Green I invitrogen)。见附图2。

(4)扩增产物的电泳检测：将步骤(3)中显色反应为阳性的待检标本的LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现。具体如下：取1.5μl扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶中，80V电泳40min后放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现，梯状条带的位置如附图1所示。

(5)S.suis2型链球菌阳性判断：步骤(4)电泳检测中出现小于100bp的梯状条带的待检标本含有S.suis2型链球菌。

本发明实施例2还通过对扩增产物的基因测序鉴定验证了本发明的准确性，对利用上述试剂盒和检测方法确定S.suis2型链球菌的标本的LAMP扩增产物进行核苷酸测序，测序结果表明与相应的S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因序列同源性达100％，这表明本发明所述的检测S.suis2型链球菌的方法具有很高的准确性。本发明实施例3通过对多种非猪链球菌的试剂盒及本发明检测方法检测，结果显示本发明试剂盒和检测方法具有很高的特异性，其仅识别S.suis2型中的CPS2J基因，其它菌株DNA中所包含的基因不对本发明检测方法造成影响。本发明实施例4证明本试剂盒和检测方法敏感度达1.2×10¹cfu/mL，显示了较好的灵敏度。

基于上述试剂盒和利用试剂盒进行S.suis2型链球菌特异性荚膜多糖CPS2J基因阳性检测的结果，本发明请求保护上述试剂盒在猪链球菌2型阳性检测中的应用。与此同时，本发明还请求保护上述检测CPS2J基因的方法在猪链球菌2型阳性检测中的应用。

本发明所述的试剂盒及其用于检测CPS2J基因的方法，与现有技术相比，具有如下优势：

(1)本发明基于LAMP的S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因检测试剂盒，在普通恒温水箱的恒温条件下，利用本发明针对CPS2J基因所设计的特异性引物，对S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因进行恒温扩增，可以达到快速准确检测S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因的目的。

(2)本发明与现有S.suis2型检测方法相比具有灵敏度高、特异性强、方便快捷和可以肉眼观察结果的优点，可以为猪链球菌的监测和临床诊断提供一种有益的检测手段。

附图说明

图1本发明所述试剂盒及方法进行S.suis2型荚膜多糖CPS2J基因LAMP扩增后电泳结果：图中，M：100bp marker；1：S.suis2型HN201001菌株，阳性，出现梯状条带；2：S.suis2HN201101菌株，阳性，出现梯状条带：3：S.suis2HN201102菌株，阳性，出现梯状条带；4：阴性对照双蒸水，阴性，无梯状条带出现。

图2本发明所述试剂盒及方法进行S.suis2型荚膜多糖CPS2J基因LAMP特异性检测后电泳结果：

图中，M：100bp marker；1：S.suis2型HN201001菌株，阳性，出现梯状条带；2：S.suis2HN201101菌株，阳性，出现梯状条带：3：S.suis2HN201102菌株，阳性，出现梯状条带；4～20为阴性结果(未出现梯状条带)，分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌SEA菌、金黄色葡萄球菌SEB菌、金黄色葡萄球菌SEC菌、金黄色葡萄球菌SEE菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、大肠杆菌O157：H7、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、肠毒素型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌。

具体实施方式

以下通过具体实例是对本发明的进一步说明，但不应该当作对本发明的限制。

以下通过上述试剂盒检测待检样本中是否含有S.suis2型CPS2J基因，并通过实验用菌株测定本发明检测方法的准确度和灵敏度。本实施例实验用菌株及编号为：S.suis2型HN201001菌株、S.suis2型HN201101菌株、S.suis2型HN201102菌株、金黄色葡萄球菌(CMCC-26003-25)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌(ATCC-13565)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌(ATCC-14458)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌(ATCC-19095)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌(ATCC-27664)、肠炎沙门菌(ATCC-13076)、鼠伤寒沙门菌(CMCC-50115)、伤寒沙门菌(CMCC-50071)、痢疾志贺菌(CMCC-51252)、大肠杆菌O157：H7(CMCC-44050-3)、副溶血性弧菌(VPL4-90)、奇异变形杆菌(CMCC-49005)、福氏志贺菌(CMCC-51572)、肠毒素型大肠埃希菌(CMCC-44824-3)、肠侵袭型大肠埃希菌(CMCC-44825-3)、肠致病型大肠埃希菌(CMCC-44155-10)、肠出血型大肠埃希菌(CMCC-44050-3)，上述供试菌株均由申请人保存。

实施例1：本发明试剂盒及检测猪链球菌2型的方法

按下列配方制作基于LAMP的S.suis2型荚膜多糖CPS2J基因检测试剂盒：

(1)扩增反应液：扩增反应液每管20.0μL的组成为：10×Bst DNA PolymeraseBuffer2.5μl、dNTP Mixture(10mM)3.5μl、Betaine(5M)5.0μl，Mgso₄(50mM)1.6μl，7.4μL ddH₂o。

(2)混合引物液：包含CPS2J-F3、CPS2J-B3引物各10uM；CPS2J-FIP、CPS2J-BIP引物各40uM。

(3)Bst DNA Polymerase：8U/μl；

(4)S.suis2型阳性标准品为S.suis2型菌株基因组DNA(1～100nM)；

(5)阴性对照品为ddH₂o。

本发明上述试剂盒用于检测S.suis2型CPS2J基因按照以下程序进行进行：

(1)细菌DNA的提取：细菌待检标本利用广州华瑞安生物科技优先公司生产的通用型核酸提取试剂提取模板DNA；

(2)S.suis2型CPS2J基因的LAMP扩增：在恒温水箱的恒温条件下，利用本发明针对CPS2J基因所设计的扩增引物，对S.suis2型的特异性荚膜多糖CPS2J基因进行扩增得到LAMP扩增产物。具体包括如下两个步骤：

A.在标明编号的LAMP反应管中加入扩增反应液20.0uL、引物混合液3.0μL、待检模板1μL和Bst DNA Polymerase1.0uL；

B.将上述LAMP反应管混匀点离后置于恒温水箱内进行以下反应：①65℃60min，②80℃2min；

(3)LAMP扩增产物的显色反应：向含有步骤(2)获得的LAMP扩增产物的反应管内加入

核苷酸绿色胶体染料(

Green I nucleic acid gel stain，SYBR Green I invitrogen)染色1-5分钟，通过肉眼判断反应液的颜色，反应液变绿为阳性，反应液保持染料的棕色不变为阴性；见附图2。

(4)扩增产物的电泳检测：将步骤(3)中显色反应为阳性的待检标本的LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现。具体如下：取1.5μl扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶中，80V电泳40min后放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现，梯状条带的位置如附图1所示。

(5)S.suis2型链球菌阳性判断：步骤(4)电泳检测中出现小于100bp的梯状条带的待检标本含有S.suis2型链球菌。

使用上述试剂盒和检测S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因的方法对S.suis2型HN201001菌株、S.suis2型HN201101菌株、S.suis2型HN201102菌株进行检测，其LAMP扩增后产物的电泳结果显示，S.suis2型HN201001菌株、S.suis2HN201101菌株和S.suis2HN201102菌株均呈现阳性，出现梯状条带；而阴性对照组双蒸水组均没有出现梯状条带，呈现阴性。而其LAMP扩增产物的显色反应结果显示S.suis2型HN201001菌株、S.suis2HN201101菌株和S.suis2HN201102菌株均呈现阳性，反应液颜色为绿色；而阴性对照组双蒸水组反应液颜色为绿色，呈现阴性。这表明本发明所述的试剂盒和检测方法用于S.suis2型检测时能够识别S.suis2型的序列，其有效性高。

实施例2：本发明试剂盒和检测方法的准确性测定

取某待检样本1，2，3，采用本发明实施例1所述的检测方法进行猪链球菌2型阳性检测，结果显示待检标本2含有猪链球菌2型，待检标本1和3不含有猪链球菌2型。将待检标本2的LAMP扩增产物的进行基因测序鉴定，测序结果表明待检标本2的LAMP扩增产物序列与相应的S.suis2型特异性荚膜多糖CPS2J基因序列同源性达100％，这充分表明了本发明的准确性，本发明试剂盒和检测方法可以识别S.suis2型CPS2J基因。

实施例3：本发明试剂盒和检测方法的特异性分析

以金黄色葡萄球菌(CMCC-26003-25)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌(ATCC-13565)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌(ATCC-14458)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌(ATCC-19095)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌(ATCC-27664)、肠炎沙门菌(ATCC-13076)、鼠伤寒沙门菌(CMCC-50115)、伤寒沙门菌(CMCC-50071)、痢疾志贺菌(CMCC-51252)、大肠杆菌O157：H7(CMCC-44050-3)、副溶血性弧菌(VPL4-90)、奇异变形杆菌(CMCC-49005)、福氏志贺菌(CMCC-51572)、肠毒素型大肠埃希菌(CMCC-44824-3)、肠侵袭型大肠埃希菌(CMCC-44825-3)、肠致病型大肠埃希菌(CMCC-44155-10)、肠出血型大肠埃希菌(CMCC-44050-3)为对照菌，利用本发明实施例1所述试剂盒和检测方法同时对S.suis2型HN201001菌株、S.suis2型HN201101菌株、S.suis2型HN201102菌株进行LAMP检测、经对LAMP扩增产物的电泳检测，其电泳检测结果如图2所示，表明上述分型反应液只对S.suis2型HN201001菌株、S.suis2型HN201101菌株、S.suis2型HN201102菌株出现LAMP阳性扩增反应，出现预期梯状片段，对照菌未出现预期梯状条带。这表明本发明试剂盒和检测方法具有很高的特异性，其仅识别S.suis2型中的CPS2J基因，其它菌株DNA中所包含的基因不对本发明检测方法造成影响。

实施例4本发明试剂盒和检测方法的灵敏度分析

以S.suis2型HN201101菌株作为检测菌，过夜增菌培养后用无菌生理盐水做10倍梯度稀释，再经平板菌落计数得知各梯度浓度为1.2×10⁶cfu/mL、1.2×10⁵cfu/mL、1.2×10⁴cfu/mL、1.2×10³cfu/mL、1.2×10²cfu/mL、1.2×10¹cfu/mL、1.2×10⁰cfu/mL，利用本试剂盒和上述检测方法同时进行LAMP检测，检测结果表明本试剂盒和检测方法敏感度达1.2×10¹cfu/mL，显示了较好的灵敏度。

Claims (10)

1.一种用于检测猪链球菌2型的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括扩增反应液、引物反应液、DNA聚合酶、S.suis2型阳性标准品、核酸染料、以及阴性对照品，其中扩增反应液包括10×Bst DNA聚合酶缓冲液，甜菜碱，dNTP混合物，Mgso₄和双蒸水；引物反应液包括CPS2J-F3引物、CPS2J-B3引物，CPS2J-FIP引物和CPS2J-BIP引物，所述的CPS2J-F3引物为SEQ ID NO：1，所述的CPS2J-B3引物为SEQ ID NO：2，所述的CPS2J-FIP引物为SEQ ID NO：3，所述CPS2J-BIP引物为SEQ ID NO：4；所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；所述的S.suis2型阳性标准品为S.suis2型菌株基因组DNA；所述的核酸染料为核苷酸绿色胶体染料；所述的阴性对照品为ddH₂o。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述每20.0μL的扩增反应液由根据下组分组成为：

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中Bst DNA Polymerase的浓度为8U/μl。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物反应液中含有10uMCPS2J-F3引物、10uM CPS2J-B3引物、40uM CPS2J-FIP引物和40uM CPS2J-BIP引物。

5.一种利用权利要求1所述试剂盒检测S.suis2型CPS2J基因的方法，其特征在于：所述的检测方法依次包括下列步骤：

(1)待检标本细菌DNA的提取：利用通用型核酸提取试剂提取待检标本细菌模板DNA；

(2)S.suis2型CPS2J基因的LAMP扩增：恒温条件下，利用试剂盒中引物反应液中的引物对S.suis2型的特异性荚膜多糖CPS2J基因进行LAMP扩增得到LAMP扩增产物；

(3)LAMP扩增产物的显色反应初筛：向含有步骤(2)获得的LAMP扩增产物的反应管内加入核苷酸绿色胶体染料染色1-5分钟，通过肉眼判断反应液的颜色，反应液变绿为阳性，反应液保持染料的棕色不变为阴性；

(4)扩增产物的电泳检测：将步骤(3)中显色反应为阳性的待检标本的LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现；

(5)S.suis2型链球菌阳性判断：步骤(4)电泳检测中出现小于100bp的梯状条带的待检标本含有S.suis2型链球菌。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)包括如下步骤：

(1)向标明编号的LAMP反应管中加入扩增反应液20.0μL、引物混合液3.0μL、待检模板1μL和Bst DNA Polymerase1.0μL；

(2)将上述LAMP反应管混匀点离后置于恒温水箱内进行以下反应：①65℃60min，②80℃2min.反应完毕即可得到LAMP扩增产物。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述核苷酸绿色胶体染料的型号为

核苷酸绿色胶体染料。

8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)包括如下步骤：取1.5ul扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶中，80V电泳40min后放于凝胶成像系统中成像，观察确定LAMP扩增产物有无小于100bp的梯状条带出现。

9.权利要求1所述的试剂盒在猪链球菌2型阳性检测中的应用。

10.权利要求5所述的检测方法在猪链球菌2型阳性检测中的应用。

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