CN102618655B - 一种检测肺炎支原体的lamp试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测肺炎支原体的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含有4条LAMP引物，与LAMP反应液一起构成检测体系，本发明的4条LAMP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-4所示。本发明的试剂盒可快速、灵敏地检测肺炎支原体，最低检测限为100个拷贝。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，易于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种检测肺炎支原体的环介导等温扩增技术(LAMP)试剂盒。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是引起人类呼吸道感染的重要病原菌，约10％～40％的社区获得性肺炎(CAP)是由Mp感染引起的。婴幼儿由于免疫功能相对低下，更容易引起重症Mp感染，甚至引起肺炎支原体脑炎等严重感染。近几年国内报道的Mp感染引起的肺炎发病率比重不断升高，给社会造成的疾病负担日趋明显。鉴于肺炎支原体分离培养困难，目前其检测方法主要依靠血清学检测和核酸检测。由于血清学技术主要针对抗体进行检测，有明显的滞后性，且受个体免疫差异影响大，所以检测灵敏度和特异度较差。
随着分子生物学的发展，目前已有多种PCR方法用于肺炎支原体的检测，包括：普通PCR，巢式PCR，荧光PCR等，这些虽在灵敏度方面有所改进，但由于核酸检测需要较严格的检测环境，需要精密仪器的配套使用，检测费用较高，同样也无法满足基层和现场检测的需求。
环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermamplification，LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的LAMP检测体系。
LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见基于颜色判定的LAMP方法在肺炎支原体检测中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组。
本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作简单的LAMP检测试剂盒。
本发明提供了一种用于检测肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)的靶序列，其具有SEQ ID NO.5所示的序列或其特异性片段。
本发明提供了用于扩增SEQ ID NO.5所示靶序列的特异性引物组合。
本发明提供了一种用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物：
F3：5’-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’；
B3：5’-CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’；
FIP：5’-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’；
BIP：5’-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。
本发明提供了上述引物组在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了一种含有上述4条引物的检测试剂。
本发明提供了一种含有上述4条引物的肺炎支原体的LAMP检测试剂盒。
本发明的试剂盒还包含变色指示剂羟基萘酚蓝(HNB)。
本发明还提供了上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用。
上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用中，25μL LAMP检测体系的具体配置为：10mM dNTP混合溶液2.5μl，3mM羟基萘酚蓝1μl，4M甜菜碱1μl，8U/μl Bst酶1μl，10×Bst buffer2.5μl，10μM F3引物0.5μl，10μM B3引物0.5μl，100μM FIP引物0.4μl，100μM BIP引物0.4μl，150mM硫酸镁1μl，去核酸水13.2μl，模板1μl。
进一步地，检测反应条件为：63℃恒温1h，85℃3min，然后终止反应。
本发明试剂盒还包含阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为去核酸水，所述阳性对照为肺炎支原体基因组DNA。每次检测标本时必须设立NEG对照(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NEG(-)和POS(+)
无效扩增：NEG(+)和POS(+)提示体系污染
无效扩增：NEG(-)和POS(-)提示体系错误或者试剂失效。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。
结果判定方法为：反应结束后，肉眼直接观测反应管，深蓝色体系为阴性结果(图1右)，天蓝色体系为阳性结果(图1左)。
本发明的肺炎支原体LAMP检测试剂盒对20种呼吸道常见菌株进行检测用于评价该试剂盒的特异性，同时对肺炎支原体进行检测下限的确定。结果显示，利用该方法检测59株肺炎支原体均阳性，其余20种非肺炎支原体和人类染色体均扩增阴性，说明该方法的灵敏度、特异性良好，达100％。在对纯菌检测中，本发明LAMP试剂盒的最低检测限为100个拷贝，说明本发明的检测试剂盒具有很高的灵敏度。
本发明提供的试剂盒使用颜色变化代替浊度变化判定结果，易于观察；使用的变色指示剂为羟基萘酚蓝(HNB)价格便宜，比使用荧光指示剂的LAMP反应更加经济实惠；且变色指示剂HNB性质稳定，在反应前添加，避免了荧光指示剂在检测后打开反应管添加，增加了污染的可能性。本发明LAMP检测试剂盒检测肺炎支原体整个试验只需要1h左右即可，相对于常规PCR反应要2～4h才能完成检测，大大缩短了检测时间，本发明试剂盒可快速、灵敏地检测出肺炎支原体，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为体系检测结果判定；体系检测结果判定。反应结束后肉眼根据体系颜色直接判定实验结果，天蓝色(左图)为阳性，深蓝色(右图)为阴性。
图2为体系检测限评价，以肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板系列浓度梯度1拷贝/μl-105拷贝/μl为模板，每个浓度梯度取1μl检测，其中0-2为深蓝色，3-7为天蓝色。0：阴性对照；1：1拷贝；2：10拷贝；3：102拷贝；4：103拷贝；5：104拷贝；6：105拷贝；7：阳性对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1引物的设计
本发明首先在国内分离到60株肺炎支原体临床株，并将这60株肺炎支原体的p1基因全长进行扩增测序。通过对60株国内肺炎支原体p1基因和NCBI数据库已报道的p1基因序列比对，选取p1基因中最为保守的区域使用Primer Explorer V3软件设计特异性引物。该保守区域的特异性靶序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
设计4条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，其核酸序列如下：
F3：5’-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’；
B3：5’-CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’；
FIP：5’-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’；
BIP：5’-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。
实施例2肺炎支原体LAMP检测方法的建立
通过设置不同浓度的MgSO4(150mM)：0μl，0.5μl，1μl，1.5μl，2μl；不同浓度的甜菜碱(4M)：0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，16μl；以及实施例1得到的4个引物浓度，FIP/BIP引物(100uM)：0.2μl，0.4μl，0.8μl，1.6μl；F3/B3引物(10μM)：0.5μl，1.0μl，1.5μl，2.0μl。其它条件选择实验过程的优选试验条件。
分别在不同的温度(61℃至65℃)反应1h，85℃3min，终止反应，由于在65℃反应1h的条件下扩增最快，优选在此条件下进行反应。
在63℃反应1h，85℃3min，对不同浓度的MgSO4、Betaine和内外引物浓度比例的反应体系进行优化反应，最终通过对含有103拷贝的肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板扩增效果作为反应的最终浓度，结果为，FIP/BIP引物终浓度为1.6uM，F3/B3引物终浓度为0.2μM，MgSO4终浓度为6mM，甜菜碱终浓度为0.16M时体系扩增效果最好，体系优化可参见表1，表2。
表1LAMP扩增体系硫酸镁与甜菜碱试剂浓度优化
使用浓度103拷贝的ATCC15531模板标准品优化扩增体系。每个反应重复3次，“+”为三次全阳性结果，“-”为三次全阴性结果，“±”为3次扩增有阳性也有阴性结果。提示体系硫酸镁1μl(终浓度6mM)，甜菜碱1μl(0.16M)体系扩增最稳定。
表2LAMP扩增体系内外引物浓度优化
使用浓度103拷贝的ATCC15531模板标准品优化扩增体系。每个反应重复3次，“+”为三次全阳性结果，“-”为三次全阴性结果，“±”为3次扩增有阳性也有阴性结果。提示FIP/BIP引物0.4μl(终浓度1.6uM)，F3/B3引物0.5μl(0.2uM)体系扩增最稳定。
因此，得到优化的检测体系(25μL)如下：
检测反应条件：63℃恒温1h，85温度3min，终止反应。
反应结束后根据体系颜色肉眼直接判定实验结果，体系天蓝色为阳性结果，深蓝色为阴性结果(见图1)。
实施例3LAMP检测试剂盒特性评价
1、灵敏度评价
灵敏度(sensitivity)，又称真阳性率(true positive rate)，即实际上是肺炎支原体并按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的肺炎支原体基于颜色判定LAMP体系检测9株ATCC标准株(ATCC39505，ATCC15531，ATCC29085，ATCC29342，ATCC29343，ATCC15377，ATCC15492，ATCC49894，ATCC15293)和实验室保存的50株肺炎支原体临床分离株DNA。除阴性对照外，所有59株肺炎支原体基于颜色判定LAMP体系检测结果呈阳性，灵敏度达100％。
2.特异度评价
特异度(specificity)，又称真阴性率(true negative rate)，即实际上不是肺炎支原体而按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的基于颜色判定LAMP体系检测呼吸道常见菌株20种及人类染色体(表3)，以肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板为阳性对照。结果除阳性对照外，其余21种非肺炎支原体模板均为阴性，特异度达100％。
表3基于颜色判定LAMP试剂盒特异性所用的DNA
ATCC：美国模式培养物集存库
3、检测下限的评价
本实施例以该优化的检测方法(见实施例2结果)对一系列倍比稀释的阳性模板进行检测。以肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板系列浓度梯度1拷贝/μl-105拷贝/μl为模板，每个浓度梯度取1μl检测。按照优化的反应体系和反应条件进行基于颜色判定LAMP检测，每个浓度梯度做3个平行样。该基于颜色判定LAMP检测体系的检测限为100个拷贝(图2)。
实施例4LAMP检测试剂盒临床标本实际应用评价
使用本发明基于颜色判定LAMP检测试剂盒与已报道的普通PCR方法(Development of a Genomics-Based PCR Assay for Detectionof Mycoplasma pneumoniae in a Large Outbreak in New York State.ALFRED L.WARING，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，Apr.2001，1385-1390)分别检测60份临床咽拭子标本。检测结果见表4。本发明试剂盒标本检测阳性率为31.7％(19/60)，普通PCR方法的阳性率为20.0％(12/60)，经统计学计算两种方法阳性率存在显著性差异(0.01＜P＜0.05，卡方＝5.14)，说明本发明试剂盒对于临床标本检测能力优于普通PCR方法。
表4基于颜色判定LAMP检测与普通PCR方法对60份临床标本检测结果
注：+检测阳性，-检测阴性
实施例5肺炎支原体常用检测方法比较
本实施例对肺炎支原体的几种常用检测方法进行了比较，包括普通PCR、荧光PCR、血清学试剂盒和本发明的LAMP检测试剂盒，通过综合比较发现(见表5)，本发明的基于颜色判定LAMP检测技术是一种灵敏度较高，方便，快速的肺炎支原体检测技术。其成本费用低廉，易于操作，非常适用于基层单位和疾控系统应对大量检测任务及现场突发事件。
表5常见肺炎支原体检测
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于检测肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）的特异性引物组合，由以下4条引物组成：
F3： 5’-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’；
B3： 5’-CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’；
FIP： 5’-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’；
BIP： 5’-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。
2.权利要求1所述的引物组合在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。
3.一种含有权利要求1所述引物组合的检测试剂。
4.一种含有权利要求1所述引物组合的肺炎支原体的LAMP检测试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含变色指示剂羟基萘酚蓝。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其25μL LAMP检测体系的具体配置为：10mM dNTP混合溶液2.5μl，3mM羟基萘酚蓝1μl，4M甜菜碱1μl，8U/μl Bst酶1μl，10×Bst buffer2.5μl，10μM F3引物0.5μl，10μM B3引物0.5μl，100μM FIP引物0.4μl，100μM BIP引物0.4μl，150mM硫酸镁1μl，去核酸水13.2μl，模板1μl。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，反应条件为：63℃恒温1h，85℃3min，然后终止反应。
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