CN103278554B - 肺炎支原体基因型快速分型试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肺炎支原体基因型快速分型试剂盒，涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明基于质谱技术，构建了针对肺炎支原体进行快速分型鉴定的特异性多肽质谱模型，以及使用质谱技术进行分型的试剂盒。本发明试剂盒能够通过特异性指纹图谱鉴定肺炎支原体基因1型、2型，分型准确、重复性好，操作时间约30分钟，成本低廉，能够解决大批量肺炎支原体的分析检测费时费力的难题，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域，具体地，涉及用于肺炎支原体基因型分型的质谱模型和基于该质谱模型进行基因型分型的方法以及分型试剂盒。
背景技术
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,Mp）是引起人类呼吸道感染的重要病原菌，每年约有10%-30%的社区获得性肺炎是由其感染引起的。一般每4-7年发生一次周期性的肺炎支原体大流行，给社会造成了沉重的医疗负担。近年研究发现，肺炎支原体的流行与其基因型别密切相关，因此，肺炎支原体基因分型技术不但是研究其基因差异和抗原变异的重要途径，也是了解其流行暴发的最重要手段。
目前使用的肺炎支原体的基因分型技术主要有p1基因依赖的PCR-RFLP技术（Sasaki,T.,T.Kenri,N.Okazaki,M.Iseki,R.Yamashita,M.Shintani,Y.Sasaki,and M.Yayoshi.1996.Epidemiological study ofMycoplasma pneumoniae infections in japan based on PCR-restrictionfragment length polymorphism of the P1cytadhesin gene.J.Clin.Microbiol.34:447-449.）和p1基因依赖的多重PCR技术（Kenri,T.,N.Okazaki,T.Yamazaki,M.Narita,K.Izumikawa,M.Matsuoka,S.Suzuki,A.Horino,and T.Sasaki.2008.Genotyping analysis ofMycoplasma pneumoniae clinical strains in Japan between1995and2005:type shift phenomenon of M.pneumoniae clinical strains.J.Med.Microbiol.57:469-475.），两种方法均将肺炎支原体分为两个基因型：1型和2型。上述两种肺炎支原体分型方法均为核酸分型技术，首先需要对待分型菌株提取基因组核酸，然后再使用分子生物学技术如：PCR扩增和限制性酶切进行分型。其分型所需试剂成本高，且检测耗时一般超过4个小时，加之操作步骤繁琐，在进行大批量菌株分型时工作量非常大，成为了制约肺炎支原体分型的技术的瓶颈亟待解决。因此研发一种快速、经济且灵敏特异的肺炎支原体分型技术十分必要。随着研究深入，目前两种型别菌株出现了少数p1基因部分核酸序列同源重组的变异型别菌株，但其整体基因水平上仍然属于1型和2型这两大型别范畴。了解当地肺炎支原体型别构成和监测型别转换，是对该地区肺炎支原体大流行监测预警的重要手段，因此，分型技术对与肺炎支原体意义重大。
目前质谱鉴定技术凭借其快速、准确、高通量的特点，在国外已经广泛应用于临床病原菌鉴定。但在国内仅限于实验室使用，且尚无使用质谱技术进行病原分型研究。
发明内容
本发明的目的是提供用于肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）基因分型的试剂盒。
本发明另一目的在于基于质谱技术，提供针对肺炎支原体进行快速分型鉴定的特异性多肽质谱模型。
本发明提供的用于肺炎支原体基因型分型的特征蛋白的质谱模型，含有以下两组肺炎支原体特征蛋白，
1）27个特征蛋白，其分别为:分子量2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83，9901.70；
2）32个特征蛋白，其分别为:分子量2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26，9902.45；上述分子量单位为Da。
进一步，本发明提供了上述质谱模型在制备肺炎支原体基因分型试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了用于肺炎支原体基因分型的质谱模型的制备方法，包括以下步骤：
1）分别提取肺炎支原体基因1型、2型的蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的肺炎支原体基因1型、2型菌株，离心，弃上清；将沉淀用蛋白洗涤液A洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用蛋白洗涤液B和C混匀后洗涤，高速离心，弃上层蛋白洗涤液；将菌体沉淀加入蛋白提取液A和B进行抽提，高速离心，取上层液体；
2）将基因1型和2型的肺炎支原体蛋白样品分别上质谱仪，同时设阴性对照，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；
3）采集2000-20000Da范围内的肽图谱，对所得数据进行统计学处理，肺炎支原体基因1型特征蛋白分子量分别为：2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83，9901.70
肺炎支原体基因2型特征蛋白分子量为：2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26，9902.45；上述分子量单位为Da；
其中，步骤1）所述蛋白洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000ml，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；所述蛋白洗涤液B为18.3兆欧超纯水，所述蛋白洗涤液C为100%质谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70%质谱级甲酸，所述蛋白提取液B为乙腈。
其中，步骤1）中所述的离心，其参数为12000g，5min；所述的高速离心，其参数为16000g，5min。
步骤2）中将肺炎支原体蛋白样品加入质谱样本靶上，50-70s后，按体积比1:1在样品上覆盖基质，干燥后上质谱仪进行质谱分析；所述基质：为α-氰基-4羟基肉桂酸在基质溶解液中的饱和溶液，基质溶解液：50%18.3兆欧超纯水，50%乙腈，2.5%三氟乙酸。
步骤2）标准化处理中质谱数据库搜索参数为：谱图校正频率临界值:50;分值计算频率临界值:5;原始谱图最大质量偏差:2000;校正谱图质量容忍度:250;单峰质量偏差限:600;强度校正参数:0.25。
步骤3）中采用Biotyper（version2.0）软件包的MSP创建功能构建特异肽谱峰系列，参数如下：MSP质量偏差,200;峰出现频率最小值,25%；MSP最大峰数目:70。
本发明提供了用于肺炎支原体基因型分型的试剂盒，含有：
1）蛋白洗涤液A：其1L配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000ml，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；
2）蛋白洗涤液B为18.3兆欧超纯水；
3）蛋白洗涤液C为100%质谱级乙醇；
4）蛋白提取液A为70%质谱级甲酸；
5）蛋白提取液B为乙腈；
6）基质：α-氰基-4羟基肉桂酸，基质溶解液：50%18.3兆欧超纯水，50%乙腈，0.1%-3%三氟乙酸；
7）权利要求1所述质谱模型的图谱。
本发明试剂盒还含有肺炎支原体基因1型、2型的蛋白样品作为阳性对照。
进一步地，本发明试剂盒的工作步骤为：
1）提取待测菌体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的菌株，离心，弃上清；将沉淀用蛋白洗涤液A洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用蛋白洗涤液B和C混匀后洗涤，高速离心，弃上层蛋白洗涤液；将菌体沉淀加入蛋白提取液A和B进行抽提，高速离心，取上层液体；
2）将待测菌体蛋白样品分别上质谱仪，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；；
3）采集数据，对所得数据进行统计学处理，若指纹图谱峰图中出现下列至少70%数量的特征蛋白，则待测菌为肺炎支原体基因1型；所述特征蛋白分子量为2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83和9901.70Da的多肽；
若指纹图谱峰图中出现下列至少70%数量的特征蛋白，则待测菌为肺炎支原体为基因2型，所述特征蛋白分子量为2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26和9902.45Da的多肽。
在应用本发明试剂盒进行Mp分型的操作中，待测菌可以为肺炎支原体，也可以为其他呼吸道常在菌或致病菌。
进一步，本发明试剂盒工作步骤2）的质谱数据库搜索参数为：谱图校正频率临界值:50;分值计算频率临界值:5;原始谱图最大质量偏差:2000;校正谱图质量容忍度:250;单峰质量偏差限:600;强度校正参数:0.25。
步骤3）中采用Biotyper（version2.0）软件包的MSP创建功能构建特异肽谱峰系列，参数如下：MSP质量偏差,200;峰出现频率最小值,25%；MSP最大峰数目:70。
本发明使用肺炎支原体ATCC标准株和临床分离株进行蛋白提取，使用飞行质谱采集其2000Da-20000Da范围内的肽图谱，建立了两种型别菌株特异的肽指纹图谱数据库。在此基础上开发的检测试剂盒能快速准确的对临床分离的肺炎支原体进行分型检测。本发明分型准确，重复性好，操作简单，可同时进行大批量样品检测；本发明检测单个样品的成本仅需1元左右，相对于目前使用的核酸分型技术单个样品十几元以上的成本，极大节约了检测成本；本发明将现有核酸分型技术所需的几小时以上的检测时间缩短至30分钟左右，极大地节省了检测时间。因此，本发明对解决大批量肺炎支原体分型检测及应对公共卫生应急处理中快速分型具有重要的现实意义。
附图说明
图1为样品不同洗涤次数对质谱结果的影响，其中A图为不洗涤菌体直接离心处理的样品蛋白的质谱肽图谱，B图为洗涤1次后离心处理的样品蛋白的质谱肽图谱，C图为洗涤2次后离心处理的样品蛋白的质谱肽图谱。
图2为肺炎支原体1型菌株特异性肽指纹图谱。
图3为肺炎支原体2型菌株特异性肽指纹图谱。
图4为肺炎支原体菌株质谱分型结果的聚类图。聚类结果显示菌株可明显分成两类，与核酸分型结果一致。
图5为其他常见支原体质谱鉴定图谱，其中A图为发酵支原体肽指纹图谱，B图为穿透支原体肽指纹图谱，C图为梨支原体肽指纹图谱，D图为生殖支原体肽指纹图谱，E图人型支原体肽指纹图谱。上述常见支原体肽指纹图谱均与1型和2型肺炎支原体肽指纹图谱均存在显著区别，可有效进行区分。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂为市售。
实施例1用于肺炎支原体基因型分型的质谱模型的构建
1、提取肺炎支原体蛋白样品
使用肺炎支原体ATCC标准株和临床分离株进行蛋白提取，其中14株1型肺炎支原体，11株2型肺炎支原体，分别收集液体培养至对数生长期的肺炎支原体基因1型、2型各菌株，具体为：分别取5ml培养至对数生长期的1型、2型肺炎支原体液体培养基，12000g，离心5分钟，弃上层液体培养基；菌体沉淀使用蛋白洗涤液A洗涤后12000g，离心5分钟，弃上层洗涤液；菌体沉淀加入200ul蛋白洗涤液B混匀后，再加入600ul蛋白洗涤液C，充分混合；然后16000g，离心2min，去除上层洗涤液（不可残留液体）；加入50ul蛋白提取液A，混匀，再加50ul蛋白提取液B，混匀，16000g高速离心2min，上清液体即为制备好的菌体蛋白样品，用于后续质谱检测。
蛋白洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000ml，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；蛋白洗涤液B为18.3兆欧超纯水，蛋白洗涤液C为100%质谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70%质谱级甲酸，所述蛋白提取液B为乙腈。
2、将1μl的基因1型和2型的肺炎支原体蛋白样品分别加入质谱样本靶上，等待60s液体干燥后，按体积比1:1在样品上覆盖基质，室温干燥后上质谱仪进行质谱分析。基质：α-氰基-4羟基肉桂酸在基质溶解液中的保护溶液，基质溶解液：50%18.3兆欧超纯水，50%乙腈，2.5%三氟乙酸。
采用Bruker Microflex LT质谱仪FlexControlTM(version3.0)采集谱图，Biotyper软件平滑、优化谱图，进行数据库搜索，搜索参数为：谱图校正频率临界值:50;分值计算频率临界值:5;原始谱图最大质量偏差:2000;校正谱图质量容忍度:250;单峰质量偏差限:600;强度校正参数:0.25。
3）采用Biotyper（version2.0）软件包的MSP创建功能构建特异肽谱峰系列。参数如下：MSP质量偏差,200;峰出现频率的最小值,25%;MSP中的最大峰数目:70。对蛋白质指纹图谱进行标准化处理，采集2000-20000Da范围内的肽图谱。
对所得数据进行统计学处理，肺炎支原体基因1型共有27个型别特异性肽段，其特征蛋白分子量分别为：2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83，9901.70；
肺炎支原体基因2型共有32个型别特异性肽段，特征蛋白分子量为：2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26，9902.45；上述分子量单位为Da；
使用14株1型菌株的280张谱图及11株2型菌株的220张谱图，采用Biotyper MSP功能构建14个1型、11个2型特征肽谱，并构建两种型别的超级特征肽谱库，参数如下：MSP质量偏差,200;峰出现频率的最小值,25%;MSP最大允许峰数目max.desired peaknumber for the MSP:70。
实施例2肺炎支原体蛋白样品洗涤条件的优化
样品洗涤是制约检测结果准确性的重要条件，洗涤不充分，培养基残留成分会影响质谱峰图；多次洗涤尽管可以去除杂质，但会浪费时间，影响检测效率。因此找到合适的洗涤次数非常必要。细菌主要洗涤步骤是通过蛋白洗涤液A完成的，本实施例分别将肺炎支原体不经过洗涤液A洗涤，经洗涤液A洗涤1次和洗涤2次进行肽指纹图谱分析，每次洗涤后需12000g，离心5分钟。
（1）不洗涤菌体直接离心处理，耗时5分钟，获得的肺炎支原体的质谱肽图谱分辨率及信噪比均不理想，信噪比6以上的峰数目不超过10个，不可以用于分型鉴定（图1A）；
（2）洗涤1次后离心处理，耗时12分钟左右，可获得理想的肽指纹图谱：分辨率可达103，信噪比6以上的峰数目超过100，没有离子影响的杂信号可以用于分型鉴定（图1B）；
（3）洗涤2次耗时19分钟左右，可获得与1次洗涤同样的理想肽指纹图谱，可以用于分型鉴定（图1C）。
因此，对于菌体标本洗涤1次完全可以达到质谱分型鉴定要求，增加洗涤，肽指纹图谱分辨能力没有提升，但操作耗时延长。因此洗涤步骤确定为使用蛋白洗涤液A清洗样品1次。
实施例3基于质谱技术的肺炎支原体基因型分型方法的建立
以1型肺炎支原体标准株ATCC29342和2型肺炎支原体标准株ATCC15531为阳性对照，以临床分离株P15、P36、P27以及发酵支原体ATCC19989，穿透支原体ATCC55252，梨支原体ATCC25960，生殖支原体ATCC33530，人型支原体ATCC23114作为检测对象。
其中临床分离株已通过PCR-RFLP分型方法验证其P15为肺炎支原体1型，P36、P27为肺炎支原体2型。
1、提取待测菌体蛋白样品
参照实施例1中步骤1的方法对实验菌株进行蛋白提取。
2、上质谱仪
提取上述各菌株的蛋白后，分别取1μl的菌蛋白样品加入质谱样本靶上，等待65s液体干燥后，按体积比1:1在样品上覆盖基质，基质为α-氰基-4羟基肉桂酸在基质溶解液中的饱和溶液，基质溶解液：50%18.3兆欧超纯水，50%乙腈，2%三氟乙酸。室温干燥后上质谱仪进行质谱分析。
3、数据采集与分析
采用Bruker Microflex LT质谱仪FlexControlTM(version3.0)采集谱图，Biotyper软件平滑、优化谱图，进行数据库搜索，搜索参数为：谱图校正频率临界值:50;分值计算频率临界值:5;原始谱图最大质量偏差:2000;校正谱图质量容忍度:250;单峰质量偏差限:600;强度校正参数:0.25。
采用Biotyper（version2.0）软件包的MSP创建功能构建特异肽谱峰系列。参数如下：MSP质量偏差,200;峰出现频率的最小值,25%;MSP最大允许峰数目max.desired peak number for the MSP:70。对蛋白质指纹图谱进行标准化处理，采集2000-20000Da范围内的肽图谱。
根据实施例1建立的质谱模型，分析本实施例的结果，发现肺炎支原体标准株ATCC29342和临床分离株P15分别有27个型别特异性肽段（图2），其特征蛋白分子量分别为：2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83，9901.70；结论：ATCC29342和临床分离株P15为肺炎支原体1型。
肺炎支原体标准株ATCC15531和临床分离株P36、P27分别有32个型别特异性肽段（图3），特征蛋白分子量为：2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26，9902.45；上述分子量单位为Da。结论：ATCC15531和临床分离株P36、P27为肺炎支原体2型。
其他非肺炎支原体菌株发酵支原体ATCC19989，,穿透支原体ATCC55252，梨支原体ATCC25960，生殖支原体ATCC33530，人型支原体ATCC23114（图5），没有出现上述两组特征蛋白中任一个组合，因此证实它们不是肺炎支原体。
实施例4肺炎支原体菌株核酸分型鉴定与质谱分型鉴定比较
分别使用PCR-RFLP核酸分型方法（Sasaki,T.,T.Kenri,N.Okazaki,M.Iseki,R.Yamashita,M.Shintani,Y.Sasaki,and M.Yayoshi.1996.Epidemiological study of Mycoplasma pneumoniae infections injapan based on PCR-restriction fragment length polymorphism of the P1cytadhesin gene.J.Clin.Microbiol.34:447-449.）和p1基因依赖的多重PCR核酸分型方法（Kenri,T.,N.Okazaki,T.Yamazaki,M.Narita,K.Izumikawa,M.Matsuoka,S.Suzuki,A.Horino,and T.Sasaki.2008.Genotyping analysis of Mycoplasma pneumoniae clinical strains in Japanbetween1995and2005:type shift phenomenon of M.pneumoniaeclinical strains.J.Med.Microbiol.57:469-475.）和本发明实施例3建立的质谱分型方法对25株肺炎支原体菌株进行分型（表1）（图4），显示3种方法分型结果一致，25株肺炎支原体中14株为1型菌株，11株为2型菌株。尽管3种分型方法的分型结果一致，但3种分型方法分型检测用时分别为5.5小时，5.0小时和40分钟，由此可见，本发明的质谱分型方法可以极大的节约分型时间，减少工作量。此外，3种分型方法的检测成本分别约为15元/样本、10元/样本和1元/样本，因此质谱分型技术可以极大节约检测成本。
表1两种常用核酸分型技术与质谱分型技术对25株肺炎支原体分型结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种用于肺炎支原体基因分型的质谱模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别提取肺炎支原体基因1型、2型的蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的肺炎支原体基因1型、2型菌株，离心，弃上清；将沉淀用蛋白洗涤液A洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用蛋白洗涤液B和C混匀后洗涤，高速离心，弃上层蛋白洗涤液；将菌体沉淀加入蛋白提取液A和B进行抽提，高速离心，取上层液体；
2)将基因1型和2型的肺炎支原体蛋白样品分别上质谱仪，同时设阴性对照，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；
3)采集2000-20000Da范围内的肽图谱；对所得数据进行统计学处理，肺炎支原体基因1型特征蛋白分子量分别为：2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83，9901.70
肺炎支原体基因2型特征蛋白分子量为：2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26，9902.45；上述分子量单位为Da；
其中，步骤1)所述蛋白洗涤液A配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000ml，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；所述蛋白洗涤液B为18.3兆欧超纯水，所述蛋白洗涤液C为100％质谱级乙醇；所述蛋白提取液A为70％质谱级甲酸，所述蛋白提取液B为乙腈。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的离心，其参数为12000g，5min；所述的高速离心，其参数为16000g，5min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中将肺炎支原体蛋白样品加入质谱样本靶上，50-70s后，按体积比1:1在样品上覆盖基质，干燥后上质谱仪进行质谱分析；所述基质为α-氰基-4羟基肉桂酸在基质溶解液中的饱和溶液，基质溶解液：50％18.3兆欧超纯水，50％乙腈，2.5％三氟乙酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述标准化处理是通过设定以下质谱数据库搜索参数来实现的：谱图校正频率临界值:50；分值计算频率临界值:5；原始谱图最大质量偏差:2000；校正谱图质量容忍度:250；单峰质量偏差限:600；强度校正参数:0.25。
5.用于肺炎支原体基因型分型的试剂盒，其特征在于，含有：
1)蛋白洗涤液A：其1L配方为磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，加水至1000ml，使用盐酸调节pH值为7.4，高压灭菌；
2)蛋白洗涤液B为18.3兆欧超纯水；
3)蛋白洗涤液C为100％质谱级乙醇；
4)蛋白提取液A为70％质谱级甲酸；
5)蛋白提取液B为乙腈；
6)基质：α-氰基-4羟基肉桂酸，基质溶解液：50％18.3兆欧超纯水，50％乙腈，0.1％-3％三氟乙酸；
7)含有以下两组肺炎支原体特征蛋白的图谱，
1)27个特征蛋白，其分别为:分子量2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83，9901.70；
2)32个特征蛋白，其分别为:分子量2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26，9902.45；上述分子量单位为Da。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还有肺炎支原体基因1型、2型的蛋白样品作为阳性对照。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其工作步骤为：
1)提取待测菌体蛋白样品：收集液体培养至对数生长期的菌株，离心，弃上清；将沉淀用蛋白洗涤液A洗涤，离心，弃上清；沉淀菌体用蛋白洗涤液B和C混匀后洗涤，高速离心，弃上层蛋白洗涤液；将菌体沉淀加入蛋白提取液A和B进行抽提，高速离心，取上层液体；
2)将待测菌体蛋白样品分别上质谱仪，对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；
3)采集数据，对所得数据进行统计学处理，若指纹图谱峰图中出现下列至少70％数量的特征蛋白，则待测菌为肺炎支原体基因1型；所述特征蛋白分子量为2190.59，2798.57，2970.91，3073.09，3102.52，3166.09，3245.77，3297.86，3335.11，3384.04，4143.83，4323.90，4386.72，4715.60，4797.05，4918.58，4952.92，5392.83，5601.63，5625.51，6149.45，6213.71，6596.82，6773.16，6798.83，9837.83和9901.70Da的多肽；
若指纹图谱峰图中出现下列至少70％数量的特征蛋白，则待测菌为肺炎支原体为基因2型，所述特征蛋白分子量为2191.52，2468.44，2799.14，2970.91，3073.91，3102.29，3164.36，3215.28，3384.69，3695.94，4142.42，4386.80，4439.41，4482.32，4511.86，4715.77，4907.63，4953.18，5091.91，5390.40，5601.78，5624.20，6149.11，6212.89，6430.88，6490.60，6773.28，6798.98，8877.41，8964.03，9812.26和9902.45Da的多肽。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，步骤2)所述标准化处理是通过设定以下质谱数据库搜索参数来实现的：谱图校正频率临界值:50；分值计算频率临界值:5；原始谱图最大质量偏差:2000；校正谱图质量容忍度:250；单峰质量偏差限:600；强度校正参数:0.25。
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