CN102426186A - 用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型，该质谱模型由质荷比为1451m/z和2673m/z的峰构成，模型中表征为质荷比1451m/z的蛋白和表征为质荷比2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，当其它们上调表达时，预示为卵巢癌患者或潜在患者。本发明的质谱模型，可用于卵巢癌早期检测和筛查，方法简单易于操作，准确性高。为卵巢癌早期检测和筛查提供了新的思路。

Description

用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型及构建方法

技术领域

本发明涉及恶性肿瘤检测领域，为一种全新的非入侵性检测方法，在体外对卵巢癌进行早期的发现和检测，其敏感性和特异性均达到85％以上。

背景技术

据WHO近期世界范围统计资料，卵巢癌发病率和死亡率在女性生殖道恶性肿瘤中均仅低于官颈癌占第二位。而在西方国家，卵巢癌死亡率占第一位，甚至比官颈癌和子宫内膜癌死亡人数的总和还多。由于尚无成熟的早期诊断方法，卵巢癌发现时70％-80％均为晚期，治疗极其困难。常规的手术、化疗难以治愈，即使暂时缓解亦常在2-3年后复发，而对这一部分病人反复手术、化疗严重影响患者生存质量。如果说卵巢癌是妇科肿瘤医生面临的最大挑战并不过分。

对于卵巢癌的诊断，根据其生物学特征、年龄、性别、好发部位及临床过程进行分析，在病史及体征基础上，采用电生理、超声波、放射性核素、放射学及核磁共振等辅助检查。近年，随着影像学诊断技术的进步和显微神经外科技术的应用，卵巢癌的诊断和治疗总体上取得了显著进步。然而，对恶性卵巢癌的治疗似乎并没有突破性进展，患者大多在确诊后一年内死亡，迫切需要一种更早期的诊断方法。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF的准确度高达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，但在肿瘤标志物尤其是卵巢癌标志物的应用中仍然存在一些缺陷，因此国内迄今为止尚无采用MALDI-TOF-MS技术获得检测卵巢癌标志物或卵巢癌血清特征蛋白的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测卵巢癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱标记，该质谱标记是质荷比为1451m/z、2673m/z的峰。表征为质荷比1451m/z的蛋白和表征为质荷比2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，当其它们上调表达时，预示为卵巢癌患者或潜在患者。

进而本发明提供一种用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型，该质谱模型由质荷比为1451m/z和2673m/z的峰构成，模型中表征为质荷比1451m/z的蛋白和表征为质荷比2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，当其它们上调表达时，预示为卵巢癌患者或潜在患者。根据ClinProtools软件对数据经过统一的归一化处理后，导出的峰面积参数作相对定量，上调表达的临界值是分别是24.63±0.2、19.74±0.27。

本发明质谱模型的构建方法包括如下步骤：

1)收集多例临床确诊的卵巢癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的卵巢癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)对所得数据进标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的2个卵巢癌特征蛋白：1451m/z、2673m/z，对差异多肽1451m/z、2673m/z进行多肽序列测定，根据这两个质荷比峰建立检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型。

上述方法其中步骤2)预处理的方法是采用SPE-C磁珠对血清蛋白进行富集。

本发明结合生物信息学方法筛选出相应的肿瘤标志并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选期望的血清特征蛋白并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。其中，所述的实验质控处理指保留峰数量大于50的质谱图谱数据，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选。本发明中，变异系数优选为14.7％。

本发明检测卵巢癌特征蛋白的质谱标记，可用于建立血清特征蛋白质谱模型以及应用于在卵巢癌早期检测和筛查。本发明的质谱模型，可用于卵巢癌早期检测和筛查。

本发明与其它卵巢癌的检测方法比较，具有以下优点：

第一，本发明采用卵巢癌患者与正常人具有差异的两个特征蛋白组合进行对卵巢癌血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到卵巢癌患者和健康人血清蛋白质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。

第二，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选抗卵巢癌的药物中。

第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供卵巢癌的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新的思路。

第四，利用本发明分析了39份血清样品，训练组30例，验证结果显示，1451m/z、2673m/z在患病组和正常组间有明显差异，因此本发明可对卵巢癌作出早期的诊断，提高病人的存活率和生活质量。

附图说明

图1为部分健康人血清和卵巢癌患者血清的多肽图谱。

图2为重复做样的5个Sigma血清质谱指纹图。

图3-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的质荷比为1451m/z的卵巢癌特征蛋白峰；图3-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的1451m/z的特征蛋白带。

图4-A为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的质荷比为2673m/z的卵巢癌特征蛋白峰；图4-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的2673m/z的特征蛋白带。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1卵巢癌特征蛋白质谱模型的建立

1、样本和仪器：

共39例血清样本，其中29例来自卵巢癌患者，另外10例来自健康人群，卵巢癌患者均经术后病理报告确定。均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80度低温冰箱中。

基质辅助激光解析飞行时间质谱Autoflex II TOF/TOF及实验用的SPE-C磁珠试剂盒购自毅新兴业(北京)科技有限公司。使用Bruker公司的数据分析软件ClinProtools做数据的预处理，处理后的数据采用统计分析软件R2.6.2的遗传算法包genalg进行处理。

2、血清采集及处理：

血清的采集：收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结1小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1.400-2.000g离心SST管(真空采血管，BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一血清样品50ul一管，分装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80℃保存多年。

血清样品的磁珠处理：在进行ClinProt实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60～90分钟。取出10μl磁珠结合缓冲液(BS)，10μl混匀的磁珠悬浮液，5μl血清样品至样品管，混匀。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100μl磁珠清洗缓冲液(WS)，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次。最后一次使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100μl磁珠清洗缓冲液，到最后吸去悬浮液体的操作步骤共3次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入5μl磁珠洗脱缓冲液(ES)，溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的刚加入5μl磁珠稳定缓冲液(SS)0.5ml样品管。

3、生物信息学方法

(一)质谱数据采集

应用Autoflex II TOF/TOF质谱仪。激光能量50％时，10shots去杂，36％时50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率：50Hz。数据收集范围：1-20KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于100ppm。

实验质控：(1)对于每一张采集到的原始图谱，设定S/N＞＝5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，舍弃峰数量小于50的图谱。(2)针对整个实验操作，采用Sigma血清的组内变异系数保证实验的一致性，本实例方法的变异系数为14.7％，满足一致性允许范围，说明实验一致性良好。表1为Sigma血清中12个蛋白峰的变异系数值。

表1Sigma血清的组内变异系数

(二)原始数据预处理

原始数据经Bruker公司数据分析软件Clinprotools处理，800-10K的峰值经由Top hat方法做基线校准，最小基线宽度10％，以10％最小阀值聚类；然后用总离子流方法做归一化处理。

(三)卵巢癌特征蛋白的选择

每个质荷比蛋白峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里综合运用了T检验P值和受试者接受曲线(ROC)的方法来评价每个蛋白峰的相对重要性。

(四)遗传算法

遗传算法是一种很有效的全局随机化搜索算法，它借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，其主要特点是群体搜索策略和群体中个体之间的信息交搜索不依赖于梯度信息。遗传算法对多个个体组成的群体进行操作，通过遗传算子可以使个体间的信息得以交换，这样的群体中的个体一代一代地得以优化，并逐步逼近最优解。它尤其适用于处理传统搜索方法难以解决的复杂和非线性问题，可广泛用于涉及高维空间的组合优化领域。本发明方法的遗传算法从统计差异蛋白子集形成的特征空间中搜索次优特征子集。分类函数采用最近邻算法(KNN)。在利用遗传算法和最近邻算法对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本来检验所建立模型的分类能力。

通过以上方法得到用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型，该质谱模型由质荷比为1451m/z和2673m/z的峰构成，模型中表征为质荷比1451m/z的蛋白和表征为质荷比2673m/z的蛋白是卵巢癌血清特征蛋白，当其它们上调表达时，预示为卵巢癌患者或潜在患者，上调表达的临界值分别是24.63±1.2、19.74±0.27。

建立模型后，对上述的39例样本进行训练，利用遗传算法结合最近邻算法建立最终的诊断模型的敏感性为95.4％，特异性90.5％。

图3和图4中依次为蛋白质荷比峰1451m/z和2673m/z的健康组与卵巢癌组样品图谱。

对所有在正常组和卵巢癌组表现差异的蛋白，应用磁珠富集法进行蛋白鉴定。结果见表2。

表2差异蛋白鉴定序列

实施例2卵巢癌检测

应用实施例1的质谱模型，参照实施例1的方法对健康人群15例，临床确诊卵巢癌患者15例的血清蛋白质图谱作了检测分析。用初步筛选的1451、2673质荷比峰按照P值小于0.05为统计差异显著的差异蛋白峰。最终，30例盲样验证结果为24例判断正确，6例判断错误，准确率达到80％。

Claims (5)

1.用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱标记，其包括质荷比为1451m/z、2673m/z的峰。

2.根据权利要求1所述的质谱标记，其特征在于，所述的质荷比为1451m/z的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的质荷比为2673m/z的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.用于检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型，其特征在于，该质谱模型中包含质荷比为1451m/z、2673m/z的峰，当这两个峰上调表达时预示为卵巢癌患者或潜在患者。

4.建立权利要求3所述质谱模型的方法，包括如下步骤：

1)收集多例临床确诊的卵巢癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的卵巢癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)对所得数据进行标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的2个卵巢癌特征蛋白：1451m/z、2673m/z，对差异多肽1451m/z、2673m/z进行多肽序列测定，根据这两个质荷比峰建立检测卵巢癌特征蛋白的质谱模型。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中步骤2)预处理的方法是采用SPE-C磁珠对血清蛋白进行富集。

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