CN101354390A

CN101354390A - 鼻咽癌早期血清特异蛋白及其应用

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Publication number: CN101354390A
Application number: CNA2008100706688A
Authority: CN
Inventors: 潘建基; 叶韵斌; 刘枋; 李建成; 陈强; 陈慧菁; 倪晓雷; 郭福榕
Original assignee: FUJIAN CANCER HOSPITAL
Current assignee: FUJIAN CANCER HOSPITAL
Priority date: 2008-02-28
Filing date: 2008-02-28
Publication date: 2009-01-28

Abstract

本发明公开了一种鼻咽癌早期血清特异蛋白及其应用，属生物检测技术领域。本发明应用SELDI－TOF－MS技术，通过建立鼻咽癌患者和健康对照者之间血清蛋白质的指纹图谱，并进行差异分析，寻找新的蛋白质标志物，从而对鼻咽癌进行早期筛查和检测。由于本发明应用了SELDI－TOF－MS技术，从蛋白质组学的角度对鼻咽癌患者外周血血清进行质谱检测、分析，从而建立了有效的鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱，并将其用于体外检测鼻咽癌发生的风险性评估的方法。该方法可作为鼻咽癌无创性的辅助筛查手段。

Description

鼻咽癌早期血清特异蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及肿瘤标志物-鼻咽癌早期血清特异蛋白，可在体外检测鼻咽癌发生的危险性的一种方法及其应用。

背景技术

鼻咽癌是原发于鼻咽粘膜被覆上皮的恶性肿瘤，是耳鼻喉科最常见的癌症，其发病具有明显的地区性，种族和家族聚集性，好发于黄种人。中国的福建、广东等省是鼻咽癌高发的区域，发病率可达30/10万～50/10万。其症状主要表现为听力减退、咽部异物感、咽炎、舌炎、龈炎、吞咽困难、呼吸异常等。

临床研究发现，鼻咽癌的临床分期是影响治疗效果的重要因素，早期鼻咽癌(I、II期)的5年生存率(89.7％、75.9％)远比晚期(III、IV期)(51.3％、22.2％)好。因此加强鼻咽癌的二级预防，早期发现、早期诊断和早期治疗，是鼻咽癌防治工作的重要环节。目前鼻咽癌的早期筛查主要是鼻咽间接镜检查、颈部淋巴结触诊和鼻咽纤维镜，但均为体内检查，且检查繁琐，准确度也不高。现在较简便的体外检查方法是EB病毒抗体的检测，但还不成熟，灵敏度及特异性也存在较大缺陷。因此，本领域迫切需要开发新的更有效的早期检测鼻咽癌的方法。

蛋白质是生命活动的最终执行者，肿瘤细胞基因的改变最终也都会反映在蛋白质的改变上，因此在肿瘤细胞的发生、发展以及侵袭转移过程中必定伴随着蛋白质种类与数量的改变，并且这些蛋白质有可能释放入血。从理论上讲，通过检测血清中蛋白质的动态变化就有可能筛查出与肿瘤相关的蛋白质，作为疾病早期的指标对肿瘤发生的危险性进行早期评估。近几年来，蛋白质组学的快速发展使我们从血清中寻找肿瘤特异相关蛋白质成为可能，尤其是质谱技术的产生，凭借其高灵敏度、高通量、快速简便等优点，已经成为微量蛋白质检测的最重要手段之一。

SELDI-TOF-MS即蛋白质芯片和质谱技术相结合的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪技术，该技术中的蛋白质芯片具有高度并行性、高通量、微型化和自动化等其他方法难以比拟的优越性，同时该芯片采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好，使筛选低丰度小分子蛋白质甚至肽成为现实，弥补了传统方法如色谱、光谱、凝胶电泳等技术的不足，对筛选和鉴定新的肿瘤相关特异性标志物产生了巨大的影响。同时，该质谱技术可以直接对血清样品进行鉴定，方便快速，半天即可得出结果，提供了临床应用的价值。

自2001年以来，应用SELDI技术对血清样品进行检测来寻找新的肿瘤标志物用于肿瘤的早期诊断，成为了肿瘤研究的热点之一。美国的多家蛋白质组学研究机构已用该技术分别对卵巢癌、前列腺癌等体液样本进行了研究，发现了新的标志物，其特异性和灵敏度均优于现有的检测方法。国内也应用该技术对肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌等部分肿瘤进行了研究，得到了一些肿瘤标志物，取得了一些成果和专利，如专利申请号为200410053632.0，200410066304.4，200510080787.8等。

结合上述情况，利用SELDI技术获取血清蛋白质标志物成为从分子水平诊断鼻咽癌发生风险性的有效途径之一。目前尚未发现与鼻咽癌相关的血清标志物或标志蛋白，因此应用质谱技术对鼻咽癌患者血清进行分析来获得特异肿瘤标志物，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是建立一套有效的方法，用于在分离的血清中体外检测鼻咽癌发生的风险性进行评估。即应用SELDI-TOF-MS技术，通过建立鼻咽癌患者和健康对照者之间血清蛋白质的指纹图谱，并进行差异分析，寻找新的蛋白质标志物，从而对鼻咽癌进行早期筛查和检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：为了达到上述目的，本发明提供了一种从分离的外周血清中体外检测鼻咽癌发生危险性的方法，该方法包括下列步骤：

(a)制备鼻咽癌患者的血清样本；

(b)利用表面增强激光解吸电离飞行质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测血清样品，获得血清蛋白质谱；

(c)采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件对数据进行分析处理；

(d)确定该血清所获自的患者发生鼻咽癌的风险。

本发明所述的利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术检测步骤(a)的血清样本的条件是：使用Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA提供的PBSII-C型蛋白质芯片阅读机，设定的最适激光强度为235，检测灵敏度8。

本发明的有益效果是：由于本发明应用SELDI-TOF-MS技术，从蛋白质组学的角度对鼻咽癌患者外周血血清进行质谱检测、分析，从而建立了有效的鼻咽癌血清蛋白质指纹图谱，并将其用于体外检测鼻咽癌发生的风险性评估的方法。该方法可作为鼻咽癌无创性的辅助筛查手段。

附图说明

下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。

图1为鼻咽癌相关血清蛋白质谱分类模型图。选择102例鼻咽癌和118例健康对照建立鼻咽癌相关血清蛋白质谱分类模型。此模型图根据差异性最显著的质核比为4182Da标志蛋白，将样本分为2组，划分的界值6.406。然后依次根据质核比3276Da，4298Da，13775Da和6450Da的标志蛋白分类，划分的界值分别为3.251，5.251，12.775和20.719。最终220例样本中划分为鼻咽癌的有108例，划分为健康对照的有112例。

图2显示蛋白峰在2000～5000Da检测范围内鼻咽癌和健康对照的血清差异蛋白图谱，其中1代表鼻咽癌，2代表健康对照。质核比为3276Da，4182Da，4298Da标志蛋白在鼻咽癌组较健康对照组明显降低。

图3是图2的胶图形式。其中1代表鼻咽癌，2代表健康对照，质核比为3276Da，4182Da，4298Da标志蛋白在鼻咽癌组较健康对照组明显降低。

图4显示蛋白峰在5000～10000Da检测范围内鼻咽癌和健康对照的血清差异蛋白图谱。其中1代表鼻咽癌，2代表健康对照，质核比为6450Da标志蛋白在鼻咽癌组较健康对照组明显降低。

图5是图4的胶图形式。其中1代表鼻咽癌，2代表健康对照，质核比为6450Da标志蛋白在鼻咽癌组较健康对照组明显降低。

图6显示蛋白峰在10000～20000Da检测范围内鼻咽癌和健康对照的血清差异蛋白图谱，其中1代表鼻咽癌，2代表健康对照。质核比为13755Da标志蛋白在鼻咽癌组较健康对照组明显降低。

图7是图6的胶图形式，其中1代表鼻咽癌，2代表健康对照。质核比为13755Da标志蛋白在鼻咽癌组较健康对照组明显降低。

图8为患者张某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，检测范围2000～5000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为4182Da和4298Da蛋白峰较健康对照明显降低。

图9同样是患者张某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围5000～10000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为6450Da蛋白峰较健康对照明显降低。

图10仍然是患者张某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围10000～20000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为13755Da蛋白峰较健康对照明显降低。

图11为患者施某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，检测范围2000～5000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为3276Da，4182Da和4298Da蛋白峰较健康对照明显降低。

图12同样为患者施某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围5000～10000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为6450Da蛋白峰较健康对照明显降低。

图13仍然是患者施某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围10000～20000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为13755Da蛋白峰较健康对照明显降低。

图14为患者林某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，检测范围2000～5000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为3276Da，4182Da和4298Da蛋白峰较健康对照未见明显改变。

图15同样为患者林某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围5000～10000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比为6450Da蛋白峰较健康对照略有降低。

图16仍然为患者林某某外周血血清蛋白飞行质谱检测结果，但检测范围10000～20000Da，其中1为患者，2为健康对照。显示患者质核比13755Da蛋白峰较健康对照未见明显改变。

具体实施方式

本发明的具体方案由以下实施例给出。

实施例1：

鼻咽癌早期血清特异蛋白的确定

(一)实验样本

1、鼻咽癌患者血清：156例，男96例，女60例，中位年龄40岁经临床病理确诊且未经放化疗的患者。

2、对照血清：159例，男98例，女61例，中位年龄45岁，取自健康自愿者。

(二)实验材料

1、试剂及芯片：尿素、醋酸钠、乙腈、三氟乙酸、DTT、CHAPS均购自美国Sigma公司，Sinapinic acid(SPA)、弱阳离子交换芯片(weak cation exchanger)CM10购自Ciphergen Biosytems，Inc Fremont，USA公司。

2、蛋白芯片阅读机：蛋白质芯片阅读机(PBSII-C型，Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA)，根据激光解吸离子飞行时间的原理，可检测小到1000Da的多肽到大到500000Da的大分子蛋白质。

(三)实验步骤

1、血清的制备：鼻咽癌患者在取血前已经临床病理确诊且未接受任何药物治疗和放射治疗等干预措施，患者及健康志愿者于清晨空腹取外周血3ml置于未添加任何试剂的一次性玻璃采血管内，立即放入4℃冰箱静置2小时至血清析出后，4℃3000rmp/min离心15分钟，分离得到的血清后-80℃冰箱保存。检测前取出血清样本，冰上融化后取5μl血清加入10ul尿素缓冲液(9mol/L Urea，2％CHAPS，50mmol/L Tris-HCl，pH9.0)变性，冰浴振荡孵育30min，向上述样品中加入180μl结合缓冲液(0.1M NaAC，pH4.0)稀释，振荡混匀。

2、芯片的预处理：每孔加入200μl的结合缓冲液，室温振荡孵育5min，弃去结合缓冲液，重复一次。

3、上样：每个加样孔中加入100μl稀释血清样品，室温振荡孵育1小时。

4、洗脱：弃去未结合的样品，每孔加入200μl的结合缓冲液，振荡洗脱5min。弃去结合缓冲液，重复操作一次。

5、加能量吸收分子：将芯片从处理器中取出，待表面自然晾干后，加入新鲜配置的SPA(5mgSPA加入200μl乙腈，200μl％TFA，充分振荡5min；12000g离心5min)，每孔1μl，待芯片表面自然晾干后再次点样1μl。室温晾干后即可上机检测。

(四)芯片检测及数据的采集

制备好的芯片放入PBSII-C型蛋白芯片阅读机读取芯片信息。使用前先对仪器进行校正，校正采用加有标准蛋白质的NP20芯片，使误差范围小于0.1％。设置仪器参数如下：激光强度230，检测灵敏度8，优化范围2000～10000，最高分子量50000。用Ciphergen proteinchip3.0.2版本的分析软件采集数据，采用Biomaker Wizard软件分析鼻咽癌患者和健康志愿者外周血血清蛋白质谱的差异，用Biomarker Pattern软件建立分类树模型并进行盲筛。

(五)数据分析

1、鼻咽癌相关血清蛋白质谱模型的建立

随机选取102例鼻咽癌患者血清和118例健康对照血清建立鼻咽癌相关差异蛋白模型。步骤如下：

(1)将鼻咽癌患者和健康对照的图谱进行归一化处理。即假定建模所用的所有图谱的的总离子流是相等的，用总离子流来校正所有图谱，剔除所有系数在0.5～2范围外的图谱，以减少不同芯片之间、仪器状态波动等因素所引起的误差。并对所有图谱的质核比(M/Z)进行校正。

(2)采用Biomarker Warzard软件计算样本中相同质核比(M/Z)在鼻咽癌组和对照组峰值的差异及表达强度的差异，以P值表示，P＜0.01为有统计学意义。

(3)采用Biomarker Pattern软件，通过优化参数，对鼻咽癌组和对照组间具有统计学差异的蛋白峰进行线性分析，确定最佳分类模型，即鼻咽癌相关蛋白模型。

2、盲筛法验证鼻咽癌相关蛋白模型的有效性

随机选取另外的95例标本(其中鼻咽癌患者血清54例，健康对照血清41例)的蛋白质质谱图谱，根据盲筛法的分析结果计算该模型能有效区分鼻咽癌患者和健康对照者的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，评价该模型的有效性。

(六)实验结果

1、鼻咽癌相关血清蛋白质谱模型的数据分析：采用Biomarker Wizard软件对102例鼻咽癌患者和118例健康对照血清的蛋白质谱图进行比较和统计学分析，结果显示有28个蛋白质峰在鼻咽癌患者和健康对照血清中表达有显著差异(P＜0.01)，鼻咽癌患者血清中有18个蛋白峰标志分子表达下调，10个蛋白标志分子表达上调(见表1)。

表1鼻咽癌患者与健康对照者比较的血清质谱差异蛋白峰

2、鼻咽癌相关血清蛋白质谱分类模型的建立：采用Biomarker Pattern软件对来源于Biomarker Wizard的数据进行分析。最终确定由质核比4182Da，6450Da，4298Da，3276Da，13755Da五个蛋白质组合模型对鼻咽癌和健康对照血清进行分类。此分类树具有6个节点(如图1所示)，220样本在母节点1处被质核比为4182Da的标志蛋白划分为2组，划分的界值6.406，即峰值＞6.406的被分到右边的节点，初步判定为健康对照，而峰值≤6.406被分到左边的节点，初步判定为鼻咽癌患者，再依次在节点2和节点3根据质核比为3276Da，4298Da的标志蛋白对初步判定为健康对照和鼻咽癌患者的图谱进行再次分类，划分的界值分别为3.251和5.251，在节点2处，峰值≤3.251被确定为鼻咽癌，而峰值＞3.251的仍不能确定为肿瘤或是正常，在节点3处，峰值＞5.251被确定为健康对照，而峰值≤5.251仍被怀疑为鼻咽癌，如此根据分类树在未确定的节点4和节点5内，分别根据质核比为13775Da和6450Da蛋白标志再次划分，划分的界值为12.775和20.719。根据此划分标准，这220例样本中被划分为鼻咽癌的有108例，划分为健康对照的有112例。结合临床病理资料，此五个蛋白质组合模型对建模的共220例鼻咽癌和健康对照血清的分析结果如表2所示。

表2分类树模型对建模的220例鼻咽癌和健康对照血清的分析结果

3、鼻咽癌相关血清蛋白质谱分类模型有效性的验证：利用所建立的模型对随机另外选取的95例样本的血清蛋白质谱进行盲筛，以判断此模型对区分鼻咽癌患者和健康对照的灵敏度和特异性。结果如表3所示

表3对95例血清样本的盲筛结果

灵敏度：97.56％特异度88.89％

阳性预测值：86.95％阴性预测值：97.95％

有效率：92.63％

实施例2：

鼻咽癌相关血清蛋白质谱分类模型的具体实例，可辅助临床分析患者患鼻咽癌的危险性。

1：患者张某某，女，39岁，病历号76756，患者因发现右颈肿物2月，于2006年11月来肿瘤医院就诊，EB病毒检测为阴性，常规肿瘤标志物检测均为阴性。入院后行血清蛋白飞行质谱检测，结果显示(图8～10所示)：质核比4182Da蛋白峰强度为3.2，质核比为4298Da蛋白峰强度为2.8，质核比6450Da蛋白峰强度为14.3，质核比13755Da蛋白峰强度为5.9，根据鼻咽癌相关血清蛋白模型判定符合鼻咽癌的表现。后经病理活检显示：鼻咽低分化鳞癌。病理分期T3N2M0II期。

2：患者施某某，男，43岁，病历号82836，患者因间歇性左侧鼻塞，偶伴鼻衄，于2007年6月就诊福建省肿瘤医院。入院后行血清蛋白飞行质谱检测，结果显示(图11～13)：质核比为4182Da蛋白峰强度为2.7，质核比为4298Da蛋白峰强度1.6，质核比为3276Da的蛋白峰强度2.8，质核比为6450Da蛋白峰强度15.0，质核比为13755Da蛋白峰强度6.6，根据鼻咽癌相关血清蛋白模型判定符合鼻咽癌的表现。后经病理活检显示：鼻咽低分化鳞癌。病理分期T3N1M0II期。

3：患者林某某，男，52岁，病历号84114，患者因发现右颈肿物8个月，于2007年9月就诊于福建省肿瘤医院。入院前外院右颈肿物活检术后病理：转移性鳞状细胞癌。入院后行血清蛋白飞行质谱检测，结果显示(图14～16)：质核比为3276Da的蛋白峰强度为6.4，质核比为4182Da蛋白峰强度为为8.0，质核比为4298Da蛋白峰强度为4.4，质核比为6450Da蛋白峰强度为14.3，质核比为13755Da蛋白峰强度为13.3，根据鼻咽癌相关血清蛋白模型判定不符合鼻咽癌的表现。后行MRI检查提示：1、鼻咽部粘膜增厚，2、舌根部占位，3、右颈转移性肿大淋巴结累及右腮腺，4、鼻旁窦炎。取右侧口底处进行活检，病理报告：(口底)高分化鳞癌。

以上病例显示本发明能判断鼻咽癌发生的危险性，对鼻咽癌的诊断具有辅助的作用。可用于鼻咽癌高危人群的筛查。其简单、快捷、准确度高的特点是其他方法所无法比拟的。

Claims

1、一种从分离的外周血清中体外检测鼻咽癌发生危险性的方法，该方法包括下列步骤：

(a)制备鼻咽癌患者的血清样本；

(b)利用表面增强激光解吸电离飞行质谱技术检测血清样品，获得血清蛋白质谱；

(d)确定该血清所获自的患者发生鼻咽癌的风险。

2、根据权利要求1所述的利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术检则步骤(a)的血清样本的条件是：使用Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，USA提共的PBSII-C型蛋白质芯片阅读机，设定的激光强度为235，检测灵敏度8。

3、鼻咽癌患者与健康对照者比较的血清质谱差异蛋白峰