CN108277255A

CN108277255A - 一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法

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Publication number: CN108277255A
Application number: CN201810088383.0A
Authority: CN
Inventors: 陈晓凤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2018-07-13

Abstract

一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，通过人工合成带上荧光的病毒，且带上荧光的病毒能靶向感染活性上皮肿瘤细胞；将带上荧光的病毒注入体外的人体混合液中，带上荧光的病毒将在上皮肿瘤细胞中复制，荧光被放大，通过对混合液中带上荧光病毒的识别，定位上皮肿瘤细胞，达到对上皮肿瘤细胞的检测；利用病毒靶向感染活性上皮细胞的特性，以及病毒携带荧光，并复制放大荧光的多重特性提高上皮肿瘤细胞在特定混合液中被发现的敏感性和特异性进行上皮肿瘤细胞的检测。

Description

一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法

技术领域

本发明涉及到一种细胞的检测方法，具体涉及到一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，主要用于活性上皮肿瘤细胞检测，并从体外混合液中检测出活性上皮肿瘤细胞的存在。属生物医药技术领域。

背景技术

肿瘤是当今威胁人类健康的重大疾病之一，早发现、早治疗是当前的研究热点，但各种原因仍使大多数患者发现时已属晚期，肿瘤产生转移，病人则患有不治之症。据报道当前我国每年新发现肿瘤400多万，死亡280万。其中约70%左右的肿瘤是源于上皮发生的恶性肿瘤。

这种肿瘤可以从原发灶脱落进入淋巴液、血液、腹膜腔、胸膜腔、脑脊液而产生转移，也可以出现在尿液、唾液、大便中。如果能高效发现这些混合液中的上皮肿瘤细胞将有助于疾病的诊断、预后的判断和疗效监测。当前发现上皮肿瘤细胞的方法主要有两类技术：一是化学方法，原理是寻找上皮肿瘤细胞的标志物，利用标志物来鉴定上皮肿瘤细胞，这种方法由于肿瘤细胞的高度异质性及上皮可转化为间质的特性，灵敏度及特异度会受一定的影响，临床推广有限；二是物理方法，原理是利用肿瘤细胞大小、形状的改变进行鉴定，这种方法鉴定单个肿瘤细胞较为困难。因此，研究新方法检测活性上皮肿瘤细胞是解决上皮类肿瘤诊断的关键。

通过专利检索没发现有与本发明相同技术的专利文献报道，与本发明有一定关系的专利主要有以下几个：

1、专利号为CN200980153704.X，名称为“鉴定、选择和分析肿瘤细胞的方法” 的发明专利，该专利公开了一种诊断肿瘤状况和/或相应的肿瘤发展状况的方法，其中从患者获取有机液体样本富集在CTC或DTC群中，所述有机液体具有含至少一种循环肿瘤细胞(CTC)或扩散肿瘤细胞(DTC)或其部分的可能性高。根据本发明，CTC或DTC中至少一种类型是通过在微流体装置中逐个选择单个细胞分离的，以便形成纯度至少为90％的诊断样本。对这样获得的样本随后执行分子分析，以便突出其中适于能够进行诊断的特征。

2、专利申请号为CN201710492563.0，名称为“外周血中分选B淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统” 发明专利，该专利公开了一种外周血中分选B淋巴细胞的方法、试剂盒及系统、鉴定血源性淋巴肿瘤细胞的试剂盒及系统。其中，该方法包括以下步骤：S1，采用红细胞密度离心分离介质将外周血细胞中的红细胞去除；以及S2，使用流式细胞分选法将B淋巴细胞从去除了红细胞的外周血细胞中分选出来。该专利的技术方案，能够快速、高效地将人的体液样品中的所有红细胞与血液中的其它有核白细胞包括淋巴瘤细胞进行有效分离，不会对人血液内的各种细胞(包括肿瘤细胞)产生任何影响，从而很好地保持了原有的细胞形态，以极大地便于利用流式细胞仪进行肿瘤细胞分选以及后续的鉴别与判断。

3、专利申请号为CN201410810209.4，名称为“ 一种ACAP4活性抑制蛋白的鉴定及其在细胞迁移中的作用”的发明专利，该专利公开了一种ACAP4活性抑制蛋白的鉴定及其在细胞迁移中的作用。其目的是提供一种ACAP4活性抑制蛋白及其编码基因与其在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。该蛋白是下述氨基酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO.1；2)将序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且对ACAP4和ARF6活性具有调节作用的蛋白质。该蛋白是ACAP4活性抑制蛋白，它可以通过调节和ACAP4结合能力及其底物ARF6的活性来发挥信号通路的作用，调控肿瘤细胞的迁移功能。因此，可以其为药物靶标进行小分子化合物的筛选，发掘可能抑制肿瘤细胞转移的药物。

4、专利号为CN201210009890.3，名称为“用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体”的发明专利，该专利公开了一种用于鉴定肿瘤细胞或肿瘤组织的CREPT抗体。提供了用于检测CREPT蛋白的试剂在如下(a)或(b)或(c)中的应用：(a)辅助鉴定肿瘤细胞；(b)辅助鉴定肿瘤组织；(c)辅助鉴定肿瘤患者。本发明发现CREPT基因在肿瘤细胞系的表达水平远高于正常细胞中的表达水平，在肿瘤组织中的表达水平远远高于癌旁组织和正常组织。

上述这些专利虽然有的涉及到了肿瘤细胞或肿瘤组织的鉴定和分析，并提出了一些改进的技术方案，但通过仔细阅读发现，这些专利并未涉及活性上皮肿瘤细胞的检测或鉴定，而且直接采用这些检测或鉴定方法来进行活性上皮肿瘤细胞的检测或鉴定是不行的，所以如何准确检测活性上皮肿瘤细胞尚有待进一步研究。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有活性上皮肿瘤细胞检测或鉴定所存在的问题，提出一种新的活性上皮肿瘤细胞检测方法，该种新的活性上皮肿瘤细胞方法可以有效解决体外活性上皮肿瘤细胞的检测，能进行单细胞诊断，且准确率高，检测速度快。

为了达到这一目的，本发明提供了一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，通过人工合成带上荧光的病毒，且带上荧光的病毒能靶向感染活性上皮肿瘤细胞；将带上荧光的病毒注入体外的人体混合液中，带上荧光的病毒将在上皮肿瘤细胞中复制，荧光被放大，通过对混合液中带上荧光病毒的识别，定位上皮肿瘤细胞，达到对上皮肿瘤细胞的检测；利用病毒靶向感染活性上皮细胞的特性，以及病毒携带荧光，并复制放大荧光的多重特性提高上皮肿瘤细胞在特定混合液中被发现的敏感性和特异性进行上皮肿瘤细胞的检测。

进一步地，所述的带上荧光的病毒为任何可以带上荧光的病毒，且带上荧光的病毒只靶向感染上皮细胞，并在靶向感染上皮肿瘤细胞中大量复制，使荧光放大，便于在背景中识别，定位该细胞；并且带上荧光的病毒不感染血细胞，因此当带上荧光的病毒与血液混合时，血细胞不会带上荧光。

进一步地，所述的带上荧光的病毒靶向感染上皮细胞是靶向感染活性上皮肿瘤细胞，使该细胞带上荧光，在24-48小时后在荧光显微镜下识别该细胞，定位该细胞；且带上荧光的病毒感染上皮细胞是单个上皮细胞，或多个上皮细胞组成的上皮细胞团。

进一步地，所述的带上荧光病毒的荧光包括绿色荧光、红色荧光或者其他种类荧光，目的是进行荧光检测或分离定位。

进一步地，所述的荧光为单色荧光，或双色以上的荧光混合体。

进一步地，所述的荧光检测或分离定位是联合应用物理分离和免疫化学分离，互为补充，克服单一方法分离的缺点，显著提高上皮肿瘤细胞发现和分离的效能。

进一步地，所述的体外混合液是体外血液，或体外骨髓、胸水、腹水、脑脊液、淋巴液。

进一步地，所述的体外混合液为血液时，所述上皮肿瘤细胞为循环血中肿瘤细胞，即单个循环血中肿瘤细胞（CTC），数个循环血中肿瘤细胞成团（CTM）。

进一步地，所述的体外混合液是口腔、呼吸道、鼻腔、泌尿生殖道及消化道中排泄物，在排泄物上混有脱落的上皮肿瘤细胞，包括血痰、血尿、血便。

进一步地，所述的混合液是细胞培养液。

进一步地，所述的混合液包括了预先在实验动物体内或研究对象人体内注入了上述特殊病毒后收集的混合物或者是预先收集了混合物再加注上述特殊病毒后的混合物。

进一步地，所述的对上皮肿瘤细胞的检测包括以下步骤：

1）检测病毒的准备

将用于检测的检测病毒带上荧光，冻存至-80℃冰箱保存；

2）混合液准备

从待检测的各种体液中收取定量的混合液，用物理或化学方法去除干扰结果的因素。

3）培养

将冻存的检测病毒复苏并过滤后加入处理后的混合液中，一起培养24~48小时，得到检测液；

4）检测

将检测液分别在0h，24h，48h 荧光显微镜下观察并记录，通过荧光计数判断检测结果，如外周血即可观察到检测液中单个肿瘤细胞（即CTC）或多个肿瘤细胞成团（即CTM）荧光显像。

本发明的优点在于：

本发明采用带上荧光病毒，并使得带上荧光病毒在上皮肿瘤细胞中复制，荧光被放大，通过对混合液中带上荧光病毒的识别，定位上皮肿瘤细胞，达到对上皮肿瘤细胞的检测；主要具有以下一些优点：

1.本发明首次将具有严格组织选择性的一种特殊病毒用于示踪活性上皮类肿瘤细胞，在临床检测中用于判别混合物中是否存在活性上皮类肿瘤细胞及其量的变化，为检测与确定鉴别提供有益的参考价值。

2.本发明首次特异性示踪活性上皮肿瘤细胞，如用于体外血液中活性上皮肿瘤细胞的检测，联合CtDNA（循环血中肿瘤DNA）的检测，可以直接或间接反应肿瘤的存在与肿瘤负荷，从而决定肿瘤治疗策略。

3.本发明可以定位示踪活性上皮肿瘤细胞，从而可以进行该单个细胞挑选、分离，为单上皮肿瘤细胞基因测序提供分选方法。

4.本发明可以示踪混合液中上皮肿瘤细胞，可以根据荧光分选方法（如流式细胞仪分选）获取大量高纯度的上皮肿瘤细胞，为制备该细胞疫苗提供了分选途径。

本发明方法可以通过将带上荧光的特种病毒注入实验研究对象体内示踪血液、骨髓及转移器官中活性上皮肿瘤细胞的分布。

附图说明：

图1为带上荧光的病毒电镜示意图；

图2为上皮肿瘤细胞系在细胞培养液中加入带上荧光的病毒培养48小时后上皮肿瘤细胞荧光显像图；

图3为肿瘤病人外周血经过处理后加入带上荧光的病毒培养48小时后单个肿瘤细胞荧光显像图；

图4为肿瘤病人外周血经过处理后加入带上荧光的病毒48小时后肿瘤细胞成团显像图；

图5为健康人外周血经过处理后加入带上荧光病毒48小时，未见有核细胞荧光显像。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明。

实施例一

一种循环血中肿瘤细胞（单个细胞即CTC、数个细胞团即CTM）的检测方法，检测方法如下：

1）检测病毒的准备

（1）将检测病毒带上荧光。

（2）将检测病毒冻存至-80℃冰箱保存。

2）外周血准备

（1）取患者外周静脉血5ml，EDTA-K2抗凝处理；

（2）使用红细胞裂解液去除外周血红细胞，裂解洗涤红细胞后待用。

3）培养

将冻存的检测病毒复苏并过滤后加入处理后的外周血中，共培养24~48小时，获得检测液。

4）检测

将培养后的检测液分别在0h，24h，48h 荧光显微镜下观察并记录，通过荧光数判断检测结果，即可观察到检测液中单个肿瘤细胞（即CTC）或多个肿瘤细胞成团（即CTM）荧光显像。

实施例二

一种动物骨髓中肿瘤细胞的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

1）检测病毒的准备

（1）将检测病毒带上荧光。

（2）将检测病毒冻存至-80℃冰箱保存。

2)实验动物的准备

小鼠，背部皮下接种1x10⁶个已标记肿瘤细胞后饲养45天。

3)骨髓的准备

（1）小鼠处死后，放入75%酒精溶液中浸泡10min进行消毒。

（2）去除小鼠双下肢的皮肤和肌肉，取其股骨、胫骨，生理盐水洗涤，再分别剪去股骨、胫骨的两端少许。

（3）取2ml注射器，吸取2ml培养基，针尖刺入一端的骨髓腔中冲洗，收集骨髓冲洗液；

（4）将每只老鼠骨髓冲洗液吹散，裂解红细胞，离心去上清液，所得沉淀细胞即为提取的骨髓细胞。

4）实验动物骨髓肿瘤细胞的检测

（1）将冻存病毒复苏并过滤后与处理后的骨髓一起培养24~48小时；

（2）分别在0h，24h，48h 荧光显微镜下观察并记录。

实施例三

一种上皮肿瘤细胞系检测方法，具体步骤：

1)检测病毒的准备

（1）将检测病毒带上荧光。

（2）将检测病毒冻存至-80℃冰箱保存。

2)培养肿瘤细胞系

3)肿瘤细胞系的检测

（1）将冻存的检测病毒复苏并过滤后与培养好的肿瘤细胞系一起培养24~48小时；

（2）分别在0h，24h，48h荧光显微镜下观察并记录。

很显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的限定，任何基于本发明的原理，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

通过上述实施例可以看出，本发明主要涉及一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，通过人工合成带上荧光的病毒，且带上荧光的病毒能靶向感染活性上皮肿瘤细胞；将带上荧光的病毒注入体外的人体混合液中，带上荧光的病毒将在上皮肿瘤细胞中复制，荧光被放大，通过对混合液中带上荧光病毒的识别，定位上皮肿瘤细胞，达到对上皮肿瘤细胞的检测；利用病毒靶向感染活性上皮细胞的特性，以及病毒携带荧光，并复制放大荧光的多重特性提高上皮肿瘤细胞在特定混合液中被发现的敏感性和特异性进行上皮肿瘤细胞的检测。

进一步地，所述的混合液是细胞培养液。

进一步地，所述的对上皮肿瘤细胞的检测包括以下步骤：

1）检测病毒的准备

将用于检测的检测病毒带上荧光，冻存至-80℃冰箱保存；

2）混合液准备

3）培养

4）检测

本发明的优点在于：

5.本发明方法可以通过将带上荧光的特种病毒注入实验研究对象体内示踪血液、骨髓及转移器官中活性上皮肿瘤细胞的分布。

总之，本发明为示踪、定位活性上皮肿瘤细胞提供了一种高效、简便的新方法。

Claims

1.一种体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：通过人工合成带上荧光的病毒，且带上荧光的病毒能靶向感染活性上皮肿瘤细胞；将带上荧光的病毒注入体外的人体混合液中，带上荧光的病毒将在上皮肿瘤细胞中复制，荧光被放大，通过对混合液中带上荧光病毒的识别，定位上皮肿瘤细胞，达到对上皮肿瘤细胞的检测；利用病毒靶向感染活性上皮细胞的特性，以及病毒携带荧光，并复制放大荧光的多重特性提高上皮肿瘤细胞在特定混合液中被发现的敏感性和特异性进行上皮肿瘤细胞的检测。

2.如权利要求1所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的带上荧光的病毒为任何可以带上荧光的病毒，且带上荧光的病毒只靶向感染上皮细胞，并在靶向感染上皮肿瘤细胞中大量复制，使荧光放大，便于在背景中识别，定位该细胞；并且带上荧光的病毒不感染血细胞，因此当带上荧光的病毒与血液混合时，血细胞不会带上荧光。

3.如权利要求2所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的带上荧光的病毒靶向感染上皮细胞是靶向感染活性上皮肿瘤细胞，使该细胞带上荧光，在24-72小时后在荧光显微镜下识别该细胞，定位该细胞；且带上荧光的病毒感染上皮细胞是单个上皮细胞，或多个上皮细胞组成的上皮细胞团。

4.如权利要求3所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的带上荧光病毒的荧光包括绿色荧光、红色荧光或者其他种类荧光；荧光为单色荧光或双色以上的荧光混合体，目的是进行荧光检测或分离定位。

5.如权利要求4所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的荧光检测或分离定位是联合应用物理分离和免疫化学分离，互为补充，克服单一方法分离的缺点，显著提高上皮肿瘤细胞发现和分离的效能。

6.如权利要求1所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的体外混合液是体外血液，或体外骨髓、胸水、腹水、脑脊液、淋巴液；所述体外混合液为血液时，所述上皮肿瘤细胞为循环血中肿瘤细胞，即单个循环血中肿瘤细胞（CTC），数个循环血中肿瘤细胞成团（CTM）。

7.如权利要求1所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的体外混合液是口腔、呼吸道、鼻腔、泌尿生殖道及消化道中排泄物，在排泄物上混有脱落的上皮肿瘤细胞，包括血痰、血尿、血便。

8.如权利要求1所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的混合液是细胞培养液。

9.如权利要求6至9任意一项权利要求所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的混合液包括了预先在实验动物体内或研究对象人体内注入了上述特殊病毒后收集的混合物或者是预先收集了混合物再加注上述特殊病毒后的混合物。

10.如权利要求1所述的体外活性上皮肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：所述的对上皮肿瘤细胞的检测包括以下步骤：

1）病毒的准备

将病毒带上荧光，冻存至-80℃冰箱保存；

2）混合液准备

从待检测的各种体液中收取定量的混合液，用物理或化学方法去除可能干扰结果的因素。

3）培养

将冻存病毒复苏并过滤后加入处理后的混合液中，一起培养24~48小时，得到检测液；

4）检测

将检测液分别在0h，24h，48h 荧光显微镜下观察并记录，通过荧光计数判断检测结果。