CN104974985B - 一种快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞分离技术领域，涉及高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离方法。本发明方法包括：获得离体的乳腺癌新鲜的组织样品，组织样品前处理和质控，高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离，批量快速分离高纯度乳腺癌原代肿瘤活细胞，本方法从乳腺癌组织块中分离活的乳腺癌细胞，肿瘤细胞纯度达90%以上。分离的乳腺癌原代肿瘤活细胞可用于药敏试验。本方法克服了现有技术原代乳腺癌细胞分离纯度低且极易受成纤维细胞污染等缺陷，能为临床药敏试验提供可靠的研究对象，为原代肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白的建库以及为肿瘤在体研究提供新的方法和更广阔的材料来源。

Description

一种快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法

技术领域

本发明属于细胞分离技术领域，涉及乳腺癌原代肿瘤活细胞分离方法，尤其涉及高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离方法。分离的乳腺癌原代肿瘤活细胞可用于药敏试验。

背景技术

据报道，目前国内外对绝大多数的恶性肿瘤患者手术后采用化学药物治疗。而研究表明，化疗只对其中约25%的肿瘤患者有效，对于化疗无效的其余75%的患者来说，无疑是忍受了痛苦同时加重了对家庭以及社会的经济和精神双重压力。有研究表明，对那些化疗药物不敏感的乳腺癌细胞给予化疗药物的刺激，将促进肿瘤细胞的EMT和转移，由此可见，耐药的肿瘤细胞更容易发生转移。因此，准确的肿瘤药敏试验对肿瘤尤其是乳腺癌的治疗和预后的判断显得至关重要。

目前，现有技术的肿瘤药敏试验中所采用的肿瘤单细胞分离技术是用胶原酶消化分离技术。实践显示，该种技术分离得到的单细胞在体外培养的前四周生长的大多数为肿瘤间质中的非肿瘤细胞，即成纤维细胞，很难想像，用非肿瘤细胞为主的成纤维细胞为载体获得的所谓肿瘤细胞药敏试验的结果能在何种程度上准确反映肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。事实上，目前临床对肿瘤药敏试验结果的反馈的确不如人意。鉴于此，国内外业内研究人员均试图努力改进肿瘤药敏试验技术。本申请的发明人认为，只有将高纯度肿瘤细胞作为药敏试验的载体，将有助于获得肿瘤细胞对化疗药物敏感性的正确结果，并用以指导临床正确选择化疗药物进行抗肿瘤治疗。

以乳腺癌为例，肿瘤化疗药敏检测通常采用体外与体内两类检测方法。国内外常用的体外药敏试验检测法有MTT法、CD-DST法和ATP-TCA法。但其中国内业界常用MTT法已遭逐渐淘汰；日本目前常采用CD-DST法；而欧美常采用ATP-生物荧光体外抗肿瘤药物敏感性检测技术（ATP-TCA法）。ATP-TCA法是近年来发展起来的较先进的肿瘤药敏检测技术，临床试验证实该技术的应用提高了肿瘤的疗效。美国国立卫生研究院的GOG(GynecologicOncologyGroup)项目组认为ATP-生物荧光体外检测肿瘤化疗敏感性方法是最有发展前途的一种药敏试验方法。该技术原理是根据细胞内源性ATP含量与活细胞数呈正相关，测定细胞内源性ATP的含量以反映细胞的活性和活细胞数量，在体外测定经不同浓度化疗药物直接杀伤的培养肿瘤细胞中的ATP含量，从而计算肿瘤细胞的抑制率，进而判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。

但是，该ATP-TCA法的前提是所检测的细胞必须是高纯度的乳腺癌肿瘤细胞，该技术中，只有对高纯度的乳腺癌肿瘤细胞给予抗肿瘤药物，才能真正检测出该药物对肿瘤细胞的直接杀伤作用，若这些用于做肿瘤药物敏感性试验的细胞中除了肿瘤细胞外还含有其他对该药物敏感的细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞等，那么在给药时将有大量非肿瘤细胞被杀死，从而出现药敏试验的假阳性或疗效扩大的结果。这对于个性化治疗或预后的预测将会起到误导的作用，甚至于出现过度治疗的危害。

然而，本领域技术人员知晓，乳腺癌肿瘤组织并不是单一种类的细胞样本，而是多种细胞的混合体。在不同病例中肿瘤细胞的比例也存在很大差异：肿瘤细胞丰富者可以占组织中细胞总数的90%以上；而在某些病例中，肿瘤细胞数所占比例还不到肿瘤组织总细胞数的10%，其余多为间质细胞，炎症细胞，甚至于肿瘤组织中的正常上皮细胞等。倘若直接用手术切除组织做药敏试验，非肿瘤细胞的存在将严重影响药敏试验结果的准确性和可靠性。由于肿瘤细胞系经过体外长期培养后，生物学行为发生了改变，无法正确反应化疗药物在体内的反应，并且不同的乳腺癌患者对化疗药物的反应存在着个体差异性，因此，如果用已经建系的乳腺癌细胞作为药敏试验的载体，会出现与临床用药的结果相去甚远的情形，因此利用细胞系作为化疗药物的载体是不合适的。

目前国内外现有技术的乳腺癌肿瘤细胞分离技术方法和药敏体系均存在或多或少的缺点，无法快速批量分离高纯度的原代肿瘤细胞。如：传统酶消化法获取的单细胞多为成纤维细胞，尤其在原代分离的前4周内成纤维细胞作为优势细胞会抑制肿瘤细胞的生长，以这些细胞作为抗肿瘤药物的靶细胞则会造成药敏试验结果的假阳性；若采取多次传代后在成纤维细胞中挑取肿瘤细胞克隆的方法，则需要消耗3-4周的时间，无法满足临床快速诊断的要求；且因长时间体外培养后可能改变肿瘤细胞的生物学行为，从而影响化疗药物的响应程度；显微切割技术（Lasercapturemicrodissection，LCM）是利用激光能量从组织切片或细胞培养皿中捕获感兴趣的细胞，虽然LCM可以快速准确地从组织中捕获目的细胞，但捕获过程中激光的能量会破坏RNA的完整性，且每次操作时所能捕获的细胞量也十分有限，不利于后续非扩增性实验的开展；此外，LCM技术也无法直接捕获组织中的活细胞。因此，在药敏试验的细胞准备中无法运用LCM等上述方法和技术获取靶细胞。

本申请的发明人拟提供一种可以快速批量分离高纯度的原代肿瘤活细胞的方法，既可以弥补LCM的不足，又可以用于临床药敏试验。

与本发明相关的现有技术有下述参考文献：

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发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术中存在缺陷，提供一种乳腺癌原代肿瘤活细胞分离方法，尤其是高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离方法。本方法分离的乳腺癌原代肿瘤活细胞可用于药敏试验。

本发明针对目前生物学和医学研究领域，原代乳腺癌细胞分离纯度低且极易受成纤维细胞污染，从而无法用于临床药敏试验的问题，提出了一种可用于药敏试验的高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离的方法。该方法通过机械振荡、反复吹打的方法实现，不仅可以批量快速分离高纯度乳腺癌原代肿瘤活细胞，同时能够进一步运用于临床药敏试验中。本发明的方法可为临床药敏试验提供可靠的研究对象，同时可为原代肿瘤细胞DNA、RNA和蛋白的建库以及为肿瘤在体研究提供新的方法和更广阔的材料来源。

本发明基于如下现状：

准确的肿瘤药敏试验对治疗和预后判断至关重要。然而肿瘤组织中除了肿瘤细胞还有很多间质和炎症细胞。若直接用手术切除组织做药敏试验，非肿瘤细胞的存在将严重影响药敏试验结果的准确性。目前国内外在肿瘤细胞药敏实验中广泛采用的单细胞分离技术为胶原酶消化分离技术，用该技术分离到的单细胞大多数为肿瘤组织中的成纤维细胞。因为国内外现有的技术方法无法批量快速分离得到高纯度原代肿瘤细胞。如直接用手术切除组织做药敏试验，非肿瘤细胞的存在将严重影响药敏试验结果的准确性；传统酶消化法获取的单细胞多为成纤维细胞，会造成药敏试验假阳性；若通过多次传代后挑取肿瘤细胞克隆，耗时3-4周，且因长时间体外培养后可能会改变肿瘤细胞的生物学行为，无法满足临床快速诊断的要求；显微切割技术（Lasercapturemicrodissection，LCM）虽然可以快速准确地从组织中捕获目的细胞，但不能从组织中捕获活细胞，所以不能用于细胞培养和药敏实验；且捕获时激光可能破坏RNA完整性，会影响后续的实验结果，而且由于LCM获得的细胞数量少，无法进行后续实验和蛋白质分析实验。

因此，本申请提供了用于临床药敏试验的高纯度批量原代肿瘤活细胞快速分离方法，获得的高纯度批量原代肿瘤活细胞对于临床肿瘤个性化治疗的具有至关重要的临床意义。

乳腺癌是导管上皮或腺上皮细胞来源的肿瘤，在乳腺癌中E-cadherin失活，从而使得细胞间连接减少，最终造成癌细胞脱落并产生种植或转移。本发明利用癌细胞粘附性差这一生物学特点，建立了通过机械震荡达到批量快速分离高纯度乳腺癌原代肿瘤活细胞的方法。该方法能从乳腺癌组织块中分离活的乳腺癌细胞，肿瘤细胞纯度可达90%以上。

更具体的，本发明的快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法，其特征在于，其包括步骤：

1）获得离体的乳腺癌患者新鲜的组织样品；

2）组织样品前处理和质控；

3）高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离。

本发明中，所述的新鲜的组织样品包括：未经中性福尔马林固定的手术切除组织和穿刺组织。

本发明中，所述的组织样品前处理由特定的专业人员质控，通常，所述的特定的专业人员选自病理科医生。

本发明中，将获得的手术切除离体的新鲜的组织样品制成细小组织块，用培养液清洗并反复吹打；静置、移出上清、离心、弃去上清；重悬细胞沉淀；进一步用显微镜观察所获得的细胞，并拍照；用于药敏试验。

本发明的实施例中采用以下步骤实现高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离：

1)获取新鲜乳腺癌标本

手术室获取新鲜乳腺癌标本，立即送病理科；

2)预处理获取的新鲜乳腺癌标本

由病理科医生在手术切除新鲜组织标本非坏死区域且含肿瘤组织较多的区域，切取1cm³大小组织块；

3)预处理获取的组织块制备冰冻切片和HE染色

预处理获取的组织块同时做冰冻切片和HE染色做质量控制，以保证肿瘤细胞含量达到75%以上；

4)将组织块切割成1mm³大小的组织碎片；

5)用10ml含有庆大霉素的199培养液清洗组织两遍，并反复吹打2分钟；

6)将步骤5）所述含组织的10ml的199培养液移至15ml离心管中并静置1分钟；

7)小心地移出上清至另一个干净的15ml离心管中，避免吸取底部的组织块；

8)将步骤7）获取的上清按1000RPM的速度离心5分钟，并小心弃去上清；

9)用10ml的Ham’sF-12培养液重悬步骤7）获得的细胞沉淀，

所述的Ham’sF-12培养液中含5%FBS，1μg/ml胰岛素和1μg/ml氢化可的松；

10)将上步骤获得的细胞移至培养皿或96孔板中，在37oC，9%CO₂的环境下培养；

11)显微镜观察所获得的细胞，并拍照；

12)分离第二天即换液，之后每隔三天换一次培养液。

观察结果显示，本方法分离获得的细胞中所含成纤维细胞少，肿瘤细胞含量高且呈半悬浮状态，批培养一周后发现，其中90%以上为肿瘤细胞，并且肿瘤细胞成克隆性生长，未见明显梭形的成纤维细胞。可进一步用于药敏试验。

本发明通过附图和实施例进一步描述，所述实施例只是例证了本发明的具体实施方案，证实本发明所涉及方法的有效性，无以任何方式限制本发明范围之意。

附图说明

图1是本方法分离获得的原代乳腺癌细胞，╳400，

其中，批量快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞并培养一周后发现，其中90%以上为肿瘤细胞，并且肿瘤细胞成克隆性生长，未见明显梭形的成纤维细胞。

具体实施方式

实施例1样本收集

本发明在实施过程中用到的所有样品均来源于乳腺癌患者的手术切除标本，所有参与患者对科学研究都知情同意。

用于本发明的检测样品通常以临床可以接受的方式收集，优选以核酸（特别是RNA）或蛋白质被保护的方式收集。

患者资料（年龄、性别、影响报告、治疗过程、其他医疗状况、家族史等）得自医院数据库，用于匹配所收集的各种样品。病理学跟踪研究（例如通过苏木素和伊红染色，即H&E染色进行组织学分析）用于明确给定样品的疾病状态以及保证样品的一致分级。

手术室获取新鲜乳腺癌标本，立即送病理科。

实施例2：组织前处理

由病理科医生在待检测样品的非坏死区域且含肿瘤组织较多的区域，切取1cm3大小组织块。同时，该组织块做冰冻切片和HE染色做质量控制，以保证肿瘤细胞含量达到75%以上。将组织至于10ml含有庆大霉素的199培养液中，可冰上保存24小时以便标本运输。

实施例3：高纯度原代乳腺癌细胞快速批量分离

将1cm³大小乳腺癌组织块切割成1mm³大小的组织碎片，用10ml含有庆大霉素的199培养液清洗组织两遍，并反复吹打2分钟，将含组织的10ml的199培养液移至15ml离心管中并静置1分钟，小心地移出上清至另一个干净的15ml离心管中，且避免吸取底部的组织块，将上述获取的上清按照1000RPM的速度离心5分钟，并小心弃去上清，用10ml的Ham’sF-12培养液重悬细胞沉淀，其中Ham’sF-12培养液中含5%FBS，1μg/ml胰岛素和1μg/ml氢化可的松，将所获得的细胞移至培养皿中，在37oC，9%CO₂的环境下培养，用显微镜观察所获得的细胞，用台盼蓝计数并拍照；检测结果显示，本发明共分离获得2x10⁶的原代乳腺癌细胞，其中90%以上为肿瘤细胞及肿瘤细胞克隆，未见明显梭形的成纤维细胞；分离第二天即换液，之后每隔三天换一次培养液。

Claims (3)

1.一种快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法，其特征在于，其包括：获得离体的乳腺癌患者新鲜的组织样品；组织样品前处理和质控；高纯度批量乳腺癌原代肿瘤活细胞快速分离；通过下述步骤：

1）取离体的新鲜的乳腺癌组织标本进行前处理，

由所述组织标本非坏死区域且含肿瘤组织多的区域，切取1cm³大小组织块；

2）同时，将前处理获取的组织块做冰冻切片和HE染色做质量控制，以保证肿瘤细胞含量达到75%以上；

3）将上述2）的组织块切制成1mm³大小的组织碎片；

4）用10ml含有庆大霉素的199培养液清洗组织两遍，并在两次清洗过程中均反复吹打2分钟；

5）将上述步骤所述含组织的10ml的199培养液移至15ml离心管中并静置1分钟；

6）移出上清至另一个干净的15ml离心管中，避免吸取底部的组织块；

7）将上述步骤获取的上清按1000RPM的速度离心5分钟，并弃去上清；

8）用10ml的Ham’s F-12培养液重悬步骤7）获得的细胞沉淀，

所述的Ham’s F-12培养液中含5%FBS，1μg/ml胰岛素和1μg/ml氢化可的松；

9）将上步骤获得的细胞移至培养皿或96孔板中，在37^oC，9% CO₂的环境下培养；

10）显微镜观察所获得的细胞，并拍照；

11）分离第二天换液，之后每隔三天换一次培养液。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的新鲜的组织样品包括：未经中性福尔马林固定的手术切除组织和穿刺组织。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤8）重悬步骤7）中获得的细胞中含成纤维细胞少，肿瘤细胞含量高且呈半悬浮状态，培养一周后，其中90%以上为肿瘤细胞，且成克隆性生长。