CN106244546A - 一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用 - Google Patents

一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106244546A
CN106244546A CN201610718019.9A CN201610718019A CN106244546A CN 106244546 A CN106244546 A CN 106244546A CN 201610718019 A CN201610718019 A CN 201610718019A CN 106244546 A CN106244546 A CN 106244546A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
associated macrophages
cell
model
type tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610718019.9A
Other languages
English (en)
Inventor
时雨
平轶芳
曹棉富
张厦
卞修武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of TMMU
Original Assignee
First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of TMMU filed Critical First Affiliated Hospital of TMMU
Priority to CN201610718019.9A priority Critical patent/CN106244546A/zh
Publication of CN106244546A publication Critical patent/CN106244546A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells

Abstract

本发明涉及一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用，本发明在体外环境中将永生化的单核细胞(以U937单核细胞系为例)在PMA和IL‑4、IL‑10、TGFβ生长因子刺激下诱导为肿瘤相关巨噬细胞，并以此为基础，采用肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞体内外共培养方法，研究肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进中的生物学功能及靶向治疗价值，为肿瘤免疫基础研究和基于肿瘤免疫巨噬细胞的治疗手段的研发提供重要工具和实验手段。

Description

一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用
技术领域
本发明属于动物细胞系领域，特别涉及一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用。
背景技术
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated Macrophages)是肿瘤微环境中一类单核巨噬细胞来源特殊炎症细胞，广泛存在于胶质瘤、乳腺癌等各类实体肿瘤组织中。作为肿瘤相关炎症的主要参与者，肿瘤相关巨噬细胞能调控增殖、侵袭、血管生成等恶性生物学行为并产生免疫抑制，对肿瘤的发生发展产生重要影响。
根据其特殊膜表面标记物的表达及肿瘤免疫学功能，肿瘤相关巨噬细胞可分为M1和M2两个亚型。M1型肿瘤相关巨噬细胞高表达iNOS、MHCII、CD80等膜表面分子，通过直接吞噬或分泌肿瘤抑制性细胞因子，发挥免疫监视、肿瘤杀伤的作用；M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达CD163、Fizz1、Arg1、CD206等膜表面分子，通过旁分泌肿瘤细胞所需的生长因子或趋化因子，发挥促进肿瘤细胞免疫逃避、维持肿瘤生长及侵袭转移的作用。此外，肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞间常存在密切的相互作用，例如，胶质瘤细胞可通过分泌POSTN(Periostin,Osteoblast Specific Factor)募集外周循环系统的单核细胞并促进其分化为肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞则通过旁分泌途径，促进胶质瘤细胞的“干性”维持和肿瘤生长。鉴于M2型肿瘤相关巨噬细胞在促进肿瘤恶性生物学行为及肿瘤演进重要功能，以M2型肿瘤相关巨噬细胞作为免疫治疗靶点，或成为治疗胶质瘤、乳腺癌等多种实体肿瘤的新策略。
由于肿瘤相关巨噬细胞的维持依赖肿瘤体内微环境，难以分离培养，目前尚缺乏针对肿瘤相关巨噬细胞的理想的细胞实验模型。鉴于肿瘤相关巨噬细胞多来源于血液中的单核巨噬细胞，探索体外条件下将单核细胞诱导为肿瘤相关巨噬细胞的新方法，或为肿瘤相关巨噬细胞的基础研究与临床应用提供有效的解决途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用，本发明在体外环境中将永生化的单核细胞(以U937单核细胞系为例)在PMA和IL-4、IL-10、TGFβ生长因子刺激下诱导为肿瘤相关巨噬细胞，并以此为基础，采用肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞体内外共培养方法，研究肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进中的生物学功能及靶向治疗价值，为肿瘤免疫基础研究和基于肿瘤免疫巨噬细胞的治疗手段的研发提供重要工具和实验手段。
本发明的技术方案是：
一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型，该细胞模型为将人单核淋巴细胞系U937(U937单核细胞)经活化和生长因子刺激诱导而成。
所述活化采用PMA活化。
所述生长因子刺激为IL-4、IL-10和TGF-β序贯刺激。
一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的建立方法，有以下步骤：
1)PMA活化U937单核细胞，得到U937源性巨噬细胞；
2)步骤1)所述的U937源性巨噬细胞，经生长因子刺激后，分选，得到U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞。
步骤1)所述活化，其PMA为5nM，活化时间为48小时。
步骤2)所述生长因子刺激是IL-4、IL-10和TGF-β生长因子序贯刺激，时间为72小时，所述分选采用CD163抗体流式分选CD163+细胞。
上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞的基因特征和肿瘤演进中的生物学功能的应用。
上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞与各类肿瘤细胞的相互作用及机制中的应用。
上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤成瘤的影响及衍生的药物靶向治疗的应用。
上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在促进胶质瘤生长的应用。
为了检测本专利中构建的U937源性肿瘤相关巨噬细胞的生物学功能及应用价值，申请人采用免疫缺陷小鼠在体原位移植瘤模型(以胶质瘤为例，临床胶质瘤样本中富含肿瘤相关巨噬细胞，且对胶质瘤生长十分关键)，将U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射，观察U937、THP1来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞对胶质瘤生长和荷瘤鼠生存时间的影响，模拟M2型肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤细胞生长的体内环境。
其有益效果是：
1.成功在体外条件下将U937来源的单核细胞诱导为M2型巨噬细胞并鉴定其标记物表达和基因型
本发明采用PMA诱导活化和IL-4、IL-10、TGFβ三种生长因子的联合刺激，使U937来源的单核细胞诱导为M2型肿瘤相关巨噬细胞。申请人经实验验证：PCR检测结果表明，诱导后的M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞标记物CD163、Fizz1、Arg1、CD206，低表达M1巨噬细胞标记物iNOS、MHC-II；免疫荧光染色鉴定结果表明，诱导后的M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞标记物CD163。短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)测序比对结果提示，M2型肿瘤相关巨噬细胞与U937单核细胞具有一致的基因表型，表明M2型肿瘤相关巨噬细胞来源于U937细胞，且在模型建立过程中未发生基因变异。
2.U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞模拟M2型肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤细胞生长的体内环境。
采用免疫缺陷小鼠在体原位移植瘤模型，发现U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射，促进肿瘤细胞生长并显著缩短荷瘤鼠生存期。
3.通过短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)测序比对，明确M2型肿瘤相关巨噬细胞与U937单核细胞具有一致的基因表型，表明M2型肿瘤相关巨噬细胞来源于U937细胞，且在模型建立过程中未发生基因变异。
本发明利用U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞模拟M2型肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤细胞生长的体内环境，结果将为研究肿瘤相关巨噬细胞的功能和研发基于肿瘤免疫巨噬细胞的治疗手段提供重要工具和实验手段。
附图说明
图1为U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞的诱导、分选；
图2为qRT-PCR鉴定U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞中M1、M2型巨噬细胞标记物的表达；
图3为免疫荧光鉴定U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞中M2型巨噬细胞标记物CD163的表达，图中，A为免疫荧光典型图像；标尺＝25ul，B为CD163+细胞的定量结果；
图4为U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞的STR分型图谱；
图5为M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射的颅内原位移植瘤模型，图中，A为共注射模型构建的流程图，B为IVIS活体动物成像检测M2型肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤生长的效果，C为M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射对荷瘤鼠生存期的影响。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
试剂、仪器和来源
青/链霉素混合液 美国Gibco公司
RPMI-1640培养基 美国Sigma公司
NaHCO3 美国Sigma公司
HEPES 美国Sigma公司
胎牛血清(FBS) 美国Gibco公司
0.22μm微孔滤膜 美国BD公司
PMA 美国Sigma公司
IL-4、IL-10和TGF1生长因子 美国Peprotech公司
牛血清白蛋白(BSA) 美国Sigma公司
PBS 美国Hyclone公司
RNAiso 日本Takara公司
三氯甲烷、异丙醇、乙醇(分析纯) 成都天华科技股份有限公司
DEPC 美国Sigma公司
CFX96荧光定量PCR仪 美国Bio-rad公司
PCR引物 美国Invitrogen公司
4％中性多聚甲醛 江苏碧云天公司
10％山羊血清 江苏碧云天公司
CD163抗体 美国Santa Cruz公司
Cy3荧光二抗 美国Invitrogen公司
DAPI染液 江苏碧云天公司
抗荧光淬灭剂 江苏碧云天公司
激光共聚焦显微镜 德国Leica公司
Genomic DNA extraction mini kit 美国QIAGEN公司
Microreader TM21ID System 北京阅微基因技术有限公司
ABI 3730xl型遗传分析仪 美国Applied Biosystems公司
NOD/SCID小鼠 北京维通利华实验动物技术有限公司
蛋白微量进样器 宁波镇海三爱仪器厂
Luciferin 美国BioVision公司
IVIS活体动物成像仪 PerkinElmer公司
人单核淋巴细胞系U937购买自美国菌种保藏中心(ATCC)。
实施例1 U937细胞培养及U937源性M2肿瘤相关巨噬细胞的诱导、分选
人单核淋巴细胞系U937，培养于含10％FBS的RPMI-1640培养基中。每袋RPMI-1640培养基(500ml装)用去离子水溶解，加入1.7g NaHCO3、1.2g HEPES、5ml青/链霉素混合液(100×)，定容至450ml，磁力搅拌15min，调整pH值至7.3-7.4，得到RPMI-1640基础培养液。然后加入50ml胎牛血清(FBS)，充分混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得到含FBS浓度为10％的RPMI-1640培养基，分装后置于4℃保存。
为了诱导U937源性巨噬细胞，我们将U937细胞用PMA(5nM)活化48h。PMA溶液配制方法为：取PMA(1g装)粉末，加入DMSO溶液32.4ml，反复吹打混匀，即得到浓度为50μM的PMA浓缩液(1：10000使用)，避光置于-20℃保存。
细胞换液后，继续用IL-4、IL-10和TGF-β(20ng/ml)的RPMI-1640培养基处理72h。IL-4、IL-10和TGFβ溶液配制方法为：取IL-4、IL-10和TGFβ(50μg装)，分别加入2.5ml含0.1％BSA的PBS溶液，即得到20μg/ml的浓缩液(1：1000使用)，分装后置于-20℃保存。
经PMA和IL-4、IL-10和TGF-β序贯刺激后的U937细胞，采用CD163抗体流式分选CD163+细胞。分选方法为：(1)胰酶消化并收集细胞，离心1000rpm×3min，PBS洗涤3次；(2)细胞计数，用流式细胞分选用缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/100μl；(3)在100μl细胞悬液中加入10μl CD163-APC抗体，阴性对照组加入等量同型对照IgG，混匀后4℃孵育30min；(4)PBS洗涤3次，BD FACSAria II流式细胞仪分选CD163+细胞，即为U937源性M2肿瘤相关巨噬细胞。如图1所示。
实施例2 qRT-PCR鉴定U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞中M1、M2型巨噬细胞标记物的表达
2.1细胞RNA提取及浓度测定
(1)将细胞用PBS清洗3次，取1×106个细胞用1ml RNAiso裂解，置于1.5ml EP管中；
(2)每组样品加入0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡20sec，常温静置5min；
(3)12000g，4℃离心15min；
(4)将已分层的样本取上层移入新的1.5ml EP管中，加入250μl异丙醇，上下倒转数次以混匀，冰浴静置20-30min；
(5)12000g，4℃离心15min；
(6)弃上清，加1ml 75％乙醇，上下倒转数次以洗涤沉淀物；
(7)12000g，4℃离心5min；
(8)去除乙醇，打开1.5ml EP管管盖，室温干燥10min；
(9)加入20-50μl DEPC水溶解RNA，置于冰上放置。
(10)测定RNA浓度。RNA浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μl
2.2 RT-PCR反应
采用Takara公司qRT-PCR试剂盒进行，操作步骤及条件参照说明书进行，PCR检测在CFX96荧光定量PCR仪上进行。GAPDH作为内参。所需PCR引物由Invitrogen公司合成，序列引物见表1：
表1 PCR序列引物
Gene Forward primer(5'to 3') Reverse primer(5'to 3')
CD163 TTTGTCAACTTGAGTCCCTTCAC TCCCGCTACACTTGTTTTCAC
Fizz1 AGAGTACAGTCCCTCTCC AACCACAGCCATAGCCACAA
Arg1 TGGACAGACTAGGAATTGGCA CCAGTCCGTCAACATCAAAACT
CD206 CGATCCGACCCTTCCTTGAC TGTCTCCGCTTCATGCCATT
iNOS TTCAGTATCACAACCTCAGCAAG TGGACCTGCAAGTTAAAATCCC
MHCII GAGCAGGTTAAACATGAGTGTCA CTCTCCACAACCCCGTAGT
GAPDH AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC GGGGTCATTGATGGCAACAATA
2.3 qRT-PCR实验结果：
诱导后的M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞标记物CD163、Fizz1、Arg1、CD206，低表达M1巨噬细胞标记物iNOS、MHC-II。如图2所示。
实施例3免疫荧光染色检测U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞与对照U937单核细胞间M2型巨噬细胞标记物CD163的表达差异
3.1实验方法：
(1)收集U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞与对照U937单核细胞，置于离心管中，离心1000rpm×3min，PBS洗涤1次；
(2)用4％中性多聚甲醛(PH＝7.4)固定20min；离心1000rpm×3min，PBS洗涤1次；
(3)加入100ul PBS重悬细胞，采用涂片法将细胞涂在多聚赖氨酸包被的防脱片上；
(4)用PBS水化切片，5min×3次；
(5)用10％山羊血清封闭切片，室温孵育30min；
(6)一抗孵育：加入稀释后的CD163一抗，4℃孵育过夜；
(7)次日，用PBS漂洗切片，5min×3次；
(8)二抗孵育：加入稀释后的Cy3荧光二抗，室温孵育2h；
(9)用PBS漂洗切片，5min×3次；
(10)DAPI染液室温孵育10min；
(11)用PBS漂洗切片，5min×5次；
(12)用抗荧光淬灭剂封片，置于湿盒内4℃避光保存；
(13)激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察、采集图像。
3.2实验结果：免疫荧光检测结果表明，诱导后的M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞标记物CD163。如图3所示。
实施例4细胞STR检验
4.1实验方法：
取U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞，用Genomic DNA extraction mini kit(QIAGEN公司)提取DNA，采用Microreader TM21 ID System(北京阅微基因技术有限公司)扩增20个STR位点和性别鉴定位点，使用ABI 3730xl型遗传分析仪(Applied Biosystems公司)进行PCR产物检测，使用GeneMapper3.2软件(Applied Biosystems)对检测结果进行分析，并与ATCC数据库进行比对。
4.2实验结果：
通过短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)测序比对，明确M2型肿瘤相关巨噬细胞与ATCC数据库中的U937单核细胞的STR数据匹配率为100％(表2、图4)，具有一致的基因表型，表明M2型肿瘤相关巨噬细胞来源于U937细胞，且在模型建立过程中未发生基因变异。
实施例5移植瘤成瘤实验及活体动物成像
采用免疫缺陷小鼠在体原位移植瘤模型，将U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射，观察U937、THP1来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞对胶质瘤生长和荷瘤鼠生存时间的影响。
5.1实验方法：
5.1.1构建M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射的颅内原位移植瘤模型：
收集M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞，细胞计数；取4-6周龄雄性NOD/SCID小鼠(购自第三军医大学西南医院实验动物中心，采用标准无菌条件饲养于该中心)，用戊巴比妥钠麻醉剂麻醉，用蛋白微量进样器将5μl细胞悬液注射入小鼠颅内，进针位点在小鼠前正中线与外眦连线交接点后右侧旁开0.5cm处，进针深度为0.5cm。恶性胶质瘤细胞组注射细胞量为：5×103个/只(每组各8只小鼠)；共注射组为：恶性胶质瘤细胞5×103个+M2型肿瘤相关巨噬细胞2×104个(每组各8只小鼠)。
5.1.2分析M2型肿瘤相关巨噬细胞对胶质瘤生长和荷瘤鼠生存时间的影响：于移植瘤构建的第11天、第18天，每只小鼠腹腔注射200μl Luciferin底物，10分钟后，用IVIS活体动物成像仪检测各组小鼠的成瘤大小。待各组小鼠自然死亡后，分析各组小鼠生存期。
5.2实验结果：
采用免疫缺陷小鼠在体原位移植瘤模型，发现U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射，促进肿瘤细胞生长并显著缩短荷瘤鼠生存期。

Claims (10)

1.一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型，其特征在于：该细胞模型为将人单核淋巴细胞系U937(U937单核细胞)经活化和生长因子刺激诱导而成。
2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述活化采用PMA活化。
3.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述生长因子刺激为IL-4、IL-10和TGF-β序贯刺激。
4.一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的建立方法，其特征在于，有以下步骤：
1)PMA活化U937单核细胞，得到U937源性巨噬细胞；
2)步骤1)所述的U937源性巨噬细胞，经生长因子刺激后，分选，得到U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)所述活化，其PMA为5nM，活化时间为48小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)所述生长因子刺激是IL-4、IL-10和TGF-β生长因子序贯刺激，时间为72小时，所述分选采用CD163抗体流式分选CD163+细胞。
7.权利要求1-3任一所述的M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞的基因特征和肿瘤演进中的生物学功能的应用。
8.权利要求1-3任一所述的M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞与各类肿瘤细胞的相互作用及机制中的应用。
9.权利要求1-3任一所述的M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤成瘤的影响及衍生的药物靶向治疗的应用。
10.权利要求1-3任一所述的M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在促进胶质瘤生长中的应用。
CN201610718019.9A 2016-08-24 2016-08-24 一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用 Pending CN106244546A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610718019.9A CN106244546A (zh) 2016-08-24 2016-08-24 一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610718019.9A CN106244546A (zh) 2016-08-24 2016-08-24 一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106244546A true CN106244546A (zh) 2016-12-21

Family

ID=57594864

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610718019.9A Pending CN106244546A (zh) 2016-08-24 2016-08-24 一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106244546A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109966274A (zh) * 2019-05-05 2019-07-05 上海市中医医院 愈创醇在制备抑制肿瘤相关m2型巨噬细胞的药物中的应用
CN114107204A (zh) * 2021-10-12 2022-03-01 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 脑胶质瘤巨噬细胞类配体的体系构建

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S. MIA等: "An optimized Protocol for Human M2 Macrophages using M-CSF and IL-4/IL-10/TGF-β Yields a Dominant Immunosuppressive Phenotype", 《SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
孟凡斌等: "PMA及IL4序贯诱导人单核细胞系成为M2型巨噬细胞", 《解剖科学进展》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109966274A (zh) * 2019-05-05 2019-07-05 上海市中医医院 愈创醇在制备抑制肿瘤相关m2型巨噬细胞的药物中的应用
CN109966274B (zh) * 2019-05-05 2022-04-12 上海市中医医院 愈创醇在制备抑制肿瘤相关m2型巨噬细胞的药物中的应用
CN114107204A (zh) * 2021-10-12 2022-03-01 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 脑胶质瘤巨噬细胞类配体的体系构建
CN114107204B (zh) * 2021-10-12 2023-10-27 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 脑胶质瘤巨噬细胞类配体的体系构建

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sawamoto et al. Visualization, direct isolation, and transplantation of midbrain dopaminergic neurons
CN103212071B (zh) 干细胞融合癌发生模型
CN106659740A (zh) 凋亡小体
CN104017868B (zh) Setd4在制备胰腺癌诊断和/或预后试剂盒中的用途及setd4阻断剂在制备治疗胰腺癌药物中的用途
CN103243074B (zh) 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用
CN110029168A (zh) 基因fgl1在制备结直肠癌和肺癌诊断试剂盒的应用及试剂盒
CN108103026A (zh) 用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法
CN106102753A (zh) 治疗赘生物形成的方法
CN104262459A (zh) 一种急性单核细胞白血病相关抗原mlaa-34 表位多肽及其疫苗和制药应用
CN105873639A (zh) 自体肿瘤疫苗和方法
CN106367393A (zh) 小鼠前列腺癌循环肿瘤细胞系及前列腺癌循环肿瘤细胞分离和培养方法
CN106244546A (zh) 一种m2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用
CN106754719A (zh) 一种接种液组合物及利用其构建恶性胸腔积液来源异种移植瘤动物模型的方法
CN106390123A (zh) miR‑29及其抑制剂在制备抗器官移植排斥药物中的应用
CN107446024A (zh) 一种可拮抗ddx3蛋白rna结合活性的多肽dip‑13及其应用
CN106635999A (zh) Mmhrl1转基因小鼠肝肿瘤细胞系的建立及应用
CN102108369A (zh) Dna修复蛋白rad51在制备治疗骨肉瘤表达方面的应用
CN110272866A (zh) 一种提升改善细胞状态的方法及其应用
CN101225388A (zh) 弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vα6亚家族的MR基因序列及应用
CN105219732B (zh) 一种永生化人肝癌血管内皮细胞系及其制备方法和应用
CN104693276B (zh) 一种肿瘤特异性靶标及其制备细胞免疫治疗制剂的应用
CN109223801A (zh) 一种新的胃癌肿瘤干细胞杀伤剂及其应用
CN104974985B (zh) 一种快速分离乳腺癌原代肿瘤活细胞方法
CN107325172A (zh) 抗原肽t790m‑2及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用
CN107188957A (zh) 抗原肽t790m‑1及其在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Chongqing city Shapingba street 400038 gaotanyan No. 30

Applicant after: The First Affiliated Hospital of PLA Military Medical University

Address before: Chongqing city Shapingba street 400038 gaotanyan No. 30

Applicant before: No.1 Attached Hospital, No.3 Military Medical College PLA.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161221

RJ01 Rejection of invention patent application after publication