CN108103026A - 用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法 - Google Patents

用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，该γδT细胞外泌体负载有miR‑138。利用γδT细胞来源的外泌体(γδTDE)携带外源miR‑138直接靶向识别并杀伤肿瘤细胞，同时抑制PD‑1/PD‑L1增强T淋巴细胞/NK细胞的抗肿瘤免疫活性，通过直接和间接途径达到抑制肿瘤生长/侵袭/转移的效果。

Description

用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体。
背景技术
肿瘤的免疫治疗近来受到极大关注，于2013年被Science评为年度十大科技突破之首，具有广阔的应用前景。尽管肿瘤免疫治疗血液系统肿瘤和恶性黑色素瘤治疗中取得了令人振奋的效果，但是在大多实体肿瘤中却收效甚微。
T淋巴细胞是抗肿瘤免疫的最终效应细胞，将肿瘤特异性抗原(tumor-associatedantigens,TAAs)激活后的T淋巴细胞回输以治疗肿瘤的过继细胞治疗(Adoptive CellTherapy，ACT)近年来得到了广泛关注。尤其是嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)修饰T细胞(CAR-T)技术取得了快速发展，在血液性恶性肿瘤治疗上显示出强大的疗效。
T淋巴细胞根据T细胞受体(TCR)双链肽的构成不同分为TCRαβT淋巴细胞(αβT细胞)和TCRγδT淋巴细胞(γδT细胞)。与目前主流的CAR-T免疫治疗技术相比，γδT细胞用于肿瘤免疫治疗有其特有的优势。一方面，CAR-T需要根据特定的肿瘤抗原来设计CAR，对于大多实体肿瘤来说，尚无特异性的肿瘤抗原可供使用，而γδT细胞免疫无需嵌合肿瘤特异性抗原即可识别并杀伤肿瘤细胞；另一方面γδT细胞活化无需共刺激信号如CD28，在IL-2刺激下可以体外大量扩增；再者，γδT细胞具备抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)功能，发挥抗原递呈作用，激活αβT细胞和自然杀伤(NK)细胞的抗肿瘤免疫活性。这些特征使得γδT细胞成为肿瘤免疫治疗一支“潜力股”。
然而，体内试验中，γδT细胞免疫治疗同样遭遇了CAR-T技术面对实体肿瘤所表现出的低效能。其原因是实体瘤微环境的抑制性特点以及肿瘤体积巨大，免疫细胞在肿瘤内趋化和弥散不足。因此，探索一种体积小、兼具活化γδT细胞免疫功能的替代物，可弥补细胞免疫的缺陷，促进γδT细胞在抗肿瘤免疫中的应用。
肿瘤免疫治疗除了过继细胞治疗外，采用免疫检查点抑制法来增强T细胞的功能也取得了令人振奋的结果。目前已知的免疫检查点分子中，程序性死亡蛋白-1(programmeddeath protein 1，PD-1)/程序死亡配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是肿瘤产生适应性免疫抵抗的一对关键分子，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。目前，多个PD-1和PD-L1抗体已经获批上市。因此基于PD-1/PD-L1检查点抑制的免疫治疗具有广阔的前景。然而目前单抗药物费用昂贵，因此，探寻一种相对经济的替代手段来抑制PD-1/PD-L1检查点具有重要的意义。
miRNA是一类由21-25个核苷酸组成的内源性非编码RNA，可以通过靶向一个或多个mRNA在转录后或翻译水平调节靶基因的表达，从而在发育和疾病中发挥重要作用。miR-138是近来发现的一个典型的具有多重作用的抑癌miRNA。miR-138通过靶向多个癌基因(如：PDK1、Acyl protein thioesterase(APT)、EZH2、线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)、HIF-1α等)参与肿瘤侵袭、上皮-间充质转化(EMT)、细胞周期调控、DNA损伤修复、衰老、分化等生理病理过程。最近的研究发现，miR-138一方面可以直接靶向肿瘤细胞内的多个癌基因，直接抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移；另一方面可通过同时靶向抑制PD-1和PD-L1，阻断免疫检查点，增强内源性抗肿瘤免疫应答，从而间接实现对肿瘤生长的抑制。通过直接和间接途径，miR-138发挥了“一石二鸟”的作用，在抗肿瘤治疗中具有重要的潜在应用价值。
外泌体是细胞释放的一种直径约30–100nm的膜性囊泡。外泌体一度被认为是细胞产生的碎片和代谢废物。然而最近的研究表明外泌体能够携带细胞特异的信息，并将相应信息传递给其它细胞和远处组织。作为细胞-细胞间交流的“运载工具”，外泌体在生理、病理状态下都发挥着重要的调控作用。外泌体中除了脂质、蛋白外还存在mRNA和miRNA等遗传物质。外泌体携带的miRNA对靶细胞内基因进行转录后调控，从而实现细胞-细胞间的信息交换。作为纳米级“运载工具”，外泌体在抗肿瘤药物/免疫/基因治疗载体方面的应用价值近年来也获得了极大的关注。外泌体作为细胞分泌的纳米级小泡，具有高效传递蛋白质和核酸的能力，其作为载体进行药物运输有以下优势：①外泌体的磷脂双分子膜结构在体内稳定性好，且可以有效保护其负载的药物；②自身来源的外泌体注入体内后引起免疫排斥反应率低；③外泌体具有一定的靶向性，可以与靶细胞膜融合将药物释放到细胞中；④外泌体积小，可以在实体肿瘤中很好地弥散，从而有效地将药物携带至肿瘤内部。
然而，外泌体在药物投递中的应用研究才刚刚起步，仍有以下诸多问题值得深入研究：①选择何种细胞作为外泌体的母细胞。作为外泌体“工厂”，理想的母细胞应易于从自身获取、易于体外扩增并产生大量外泌体、能够靶向杀伤肿瘤细胞、能够识别并激活自身抗肿瘤免疫等。目前研究较多的是采用DC来源外泌体携带肿瘤特异性抗原用于抗肿瘤治疗，但I期临床试验显示出非常有限的疗效。因此寻找更为有效的母体细胞是外泌体作为药物载体应用的关键问题之一。②如何增加外泌体的靶向性，即让外泌体能够特异性识别肿瘤细胞或免疫细胞。③外泌体所携带何种“货物”能够最大发挥其抗肿瘤治疗的效果等；
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体。本发明利用γδT细胞来源的外泌体(γδTDE)携带外源miR-138直接靶向识别并杀伤肿瘤细胞，同时抑制PD-1/PD-L1增强T淋巴细胞/NK细胞的抗肿瘤免疫活性，通过直接和间接途径达到抑制肿瘤生长/侵袭/转移的效果。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，该γδT细胞外泌体负载有miR-138。
本发明的γδT细胞外泌体用肿瘤免疫治疗的作用机制如下：
①γδT细胞免疫无需嵌合肿瘤特异性抗原即可识别并杀伤肿瘤细胞；另一方面γδT细胞活化无需共刺激信号如CD28，在IL-2刺激下可以体外大量扩增；再者，γδT细胞具备抗原提呈细胞功能，发挥抗原递呈作用，激活αβT细胞和自然杀伤(NK)细胞的抗肿瘤免疫活性。
②免疫细胞来源的外泌体都在一定程度上表达其母体细胞的标志物和具备母体细胞的功能，且外泌体体积小，易于在实体肿瘤内弥散，能够将药物携带至肿瘤内部，是理想的药物载体。
③miR-138一方面可以直接靶向肿瘤细胞内的多个癌基因，直接抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移；另一方面可通过同时靶向抑制PD-1和PD-L1，阻断免疫检查点，增强T淋巴细胞抗肿瘤免疫应答，从而间接实现对肿瘤生长的抑制。
其中，所述miR-138的表达水平为500-2000copy/ul。在该表达水平内能最大发挥miR-138抑肿瘤、增免疫的双重功能。
本发明还提供了该γδT细胞外泌体的制备方法：
(1)培养γδT细胞
获取患者静脉血组织，分离获得人外周血白细胞(PBMC)，PBMC培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，将细胞接种至平板中；第二天，用含有6μg/ml polybrene的新鲜培养基替换原培养基，加入mir-138的慢病毒悬液；35-40℃孵育3-5小时后加入新鲜培养基，继续培养24小时后，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，连续培养12-15天，得到γδT细胞；
优选地，γδT细胞在含100ng/ml的IL-2和5mM的唑来磷酸环境中培养。
优选地，在连续培养12-15天的过程中，每三天更换新鲜培养液；
(2)分离外泌体
采用超速离心法提取γδT细胞培养液中的外泌体，生理盐水稀释获得的外泌体，获得富miR-138的γδT细胞外泌体。
本发明的有益效果在于：
1、现已证实体外扩增的γδT细胞对多种肿瘤细胞具有直接杀伤作用，同时具有抗原提呈功能。但因其在实体肿瘤内趋化和弥散困难，γδT细胞免疫治疗对实体肿瘤的体内试验收效甚微。由于外泌体体积小，且具有外泌体母体细胞所具备的特征和功能。因此本发明采用γδT细胞来源的外泌体作为治疗载体，一方面其传承了γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤能力和抗原提呈能力，另一方面其易于在实体肿瘤内趋化和弥散，避免了常规免疫治疗中免疫细胞在实体瘤内弥散困难的缺陷，为打开肿瘤细胞免疫治疗遭遇的“瓶颈”提供新策略。
2、miR-138可以靶向多个癌基因直接抑制肿瘤生长和侵袭转移，同时miR-138还可以靶向T细胞内PD-1和肿瘤细胞内PD-L1，增强抗肿瘤免疫，从而间接抑制肿瘤生长。这双重作用使得miR-138在抗肿瘤治疗中具有重要的潜在应用价值。由于γδT细胞来源外泌体能够同时识别肿瘤细胞和T淋巴细胞，其作为miR-138的“运载工具”，可以将miR-138“精密制导”至肿瘤细胞和T淋巴细胞，最大发挥miR-138抑肿瘤、增免疫的双重功能。
3、本发明找到了一种体积小、兼具活化γδT细胞免疫功能的替代物——γδT细胞来源外泌体，γδT细胞来源外泌体继承了其母体细胞对肿瘤细胞的直接杀伤能力。
4、携带miR-138的γδT细胞来源外泌体能够激活αβT淋巴细胞和NK细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤能力；无需特异性抗原进行嵌合的基因操作，流程简单、稳定、可靠，可大量获取，价格远远低于PD-1/PD-L1单抗药物。患者自身来源的细胞扩增、操作，一方面实现的是个体化治疗，另一方面最大程度减少了过敏、排斥和毒性反应。
附图说明
图1为体外扩增活化前后γδT细胞含量。
图2为γδT细胞外泌体电子显微镜检测及其表面分子标记的表达。
图3为qRT-PCR检测γδT细胞及外泌体中miR-138表达水平。
图4为不同细胞经miR-138-rich-γδTDE处理后的体外实验结果图。
图5为不同细胞经miR-138-rich-γδTDE处理后的相对凋亡细胞数。
图6为体内实验的瘤体生长曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，该γδT细胞外泌体负载有miR-138。
所述miR-138的表达水平为500copy/ul。
实施例2
一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，该γδT细胞外泌体负载有miR-138。
所述miR-138的表达水平为1000copy/ul。
实施例3
一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，该γδT细胞外泌体负载有miR-138。
所述miR-138的表达水平为2000copy/ul。
实施例4
γδT细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养γδT细胞
获取患者静脉血组织，分离获得人外周血白细胞(PBMC)，PBMC培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，将细胞接种至平板中；第二天，用含有6μg/ml polybrene的新鲜培养基替换原培养基，加入mir-138的慢病毒悬液；35℃孵育5小时后加入新鲜培养基，继续培养24小时后，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，连续培养12天，得到γδT细胞；
(2)分离外泌体
采用超速离心法提取γδT细胞培养液中的外泌体，生理盐水稀释获得的外泌体，获得富miR-138的γδT细胞外泌体。
实施例5
γδT细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养γδT细胞
获取患者静脉血组织，分离获得人外周血白细胞(PBMC)，PBMC培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，培养液含终浓度100ng/ml IL-2、5mM唑来磷酸，将细胞接种至平板中；第二天，用含有6μg/ml polybrene的新鲜培养基替换原培养基，加入mir-138的慢病毒悬液；40℃孵育3小时后加入新鲜培养基，继续培养24小时后，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，在含IL-12(100ng/ml)和唑来磷酸(5mM)的环境中连续培养15天，每三天更换新鲜培养液，得到γδT细胞；
(2)分离外泌体
采用超速离心法提取γδT细胞培养液中的外泌体，生理盐水稀释获得的外泌体，获得富miR-138的γδT细胞外泌体。
实施例6
(1)获取患者静脉血或小鼠脾脏组织，分离获得人和小鼠外周血白细胞(PBMC)，PBMC培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，培养液含终浓度100ng/ml IL-2、5mM唑来磷酸，将细胞以2×106/板接种至10cm平板中。第二天，用含有6μg/ml polybrene的10ml新鲜培养基替换原培养基，加入LV-hsa-mir-138-1慢病毒悬液。37℃孵育4小时后加入10ml新鲜培养，继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。在含IL-12(100ng/ml)和唑来磷酸(5mM)的环境中连续培养14天，每三天更换新鲜培养液。14天培养可获得90％以上纯度的γδT细胞。
LV-hsa-mir-138-1：购买自吉凯基因(上海)。
参数控制：流式细胞术检测γδT细胞含量，90％符合要求。
外周血PBMC培养14天后流式细胞术检测γδT细胞的相对比例从培养前的1％-5％增至85％-98％，绝对数量增加了2000-4000倍(图1)。
(2)采用超速离心法提取γδT细胞培养液中的外泌体，生理盐水稀释获得的外泌体，获得miR-138-rich-γδTDE。
参数控制：透射电镜观察γδTDE外泌体形态结构，电子显微镜下显示为囊性结构，直径30-100nm；Westernblot检测外泌体标志CD63和CD81的表达。采用BCA蛋白定量试剂检测外泌体蛋白浓度，以蛋白浓度作为外泌体定量；qPCR检测γδTDE内miR-138表达水平，与对照相比miR-138水平升高4-6倍。miR-138-rich-γδTDE体内外实验：
透射电镜观察γδTDE，显示出外泌体特征性形态结构(图2A)，Westernblot检测出外泌体标志物CD63和CD81的表达，而不表达细胞骨架Tubulin(图2B)。
miR-138导入γδT细胞后，采用qRT-PCR分别检测细胞内机γδTDE内miR-138表达水平，可见细胞和外泌体中miR-138表达水平升高4-6倍，达到质控要求。
I.体外实验：
miR-138-rich-γδTDE对肿瘤细胞的增殖、凋亡的影响。在体外培养的肿瘤细胞中加入miR-138-rich-γδTDE(10ug/105/细胞)，共孵育24小时。
增殖能力检测：MTT法：在细胞中加入MTT染色3h后，加入二甲基亚枫孵育30min，酶标仪下读取OD值，绘制细胞生长曲线。
凋亡检测：采用流式细胞术测经γδTDE处理后的肿瘤细胞，采用AnnexinV/PI双染色，流式细胞仪检测。
体外实验结果显示，与对照脂质体相比，miR-138-rich-γδTDE可以显著抑制肺癌(A459)、乳腺癌(4T1)、恶性黑色素瘤(B16)、鳞状细胞癌(SCC-4)等多种肿瘤细胞的生长(图4)，并促进肿瘤细胞的凋亡(图5)。
II.体内实验：
裸鼠移植瘤：将人1*107个肿瘤细胞注射于裸鼠皮下，建立裸鼠移植瘤，每周观察二次肿瘤情况，测量肿瘤的长、宽并计算肿瘤的体积(体积＝π长*宽2/6)。裸鼠接受尾静脉注射miR-138-rich-γδTDE，每三天注射一次，每次10ug蛋白含量的外泌体；连续四周，注射期间及注射结束后继续观察4周，记录瘤体生长曲线。
小鼠移植瘤模型研究发现，与外泌体相比，携带miR-138的γδT细胞来源外泌注射可以显著抑制移植瘤的生长(图6)。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川省肿瘤医院
<120> 用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法
<130> 2017
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> T细胞外泌体(Exosomes)
<400> 1
gcuacuucac aacaccaggg cc 22

Claims (5)

1.一种用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，其特征在于，该γδT细胞外泌体负载有miR-138。
2.根据权利要求1所述用于肿瘤免疫治疗的γδT细胞外泌体，其特征在于，所述miR-138的表达水平为500-2000copy/ul。
3.根据权利要求1或者2所述γδT细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养γδT细胞
获取患者静脉血组织，分离获得人外周血白细胞，人外周血白细胞培养于含10％FBS的RPMI1640培养基中，将细胞接种至平板中；第二天，用含有6μg/ml polybrene的新鲜培养基替换原培养基，加入mir-138的慢病毒悬液；35-40℃孵育3-5小时后加入新鲜培养基，继续培养24小时后，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，连续培养12-15天，得到γδT细胞；
(2)分离外泌体
采用超速离心法提取γδT细胞培养液中的外泌体，生理盐水稀释获得的外泌体，获得富miR-138的γδT细胞外泌体。
4.根据权利要求1或者2所述γδT细胞外泌体的制备方法，其特征在于，γδT细胞在含100ng/ml的IL-2和5mM的唑来磷酸环境中培养。
5.根据权利要求1或者2所述γδT细胞外泌体的制备方法，其特征在于，在连续培养12-15天的过程中，每三天更换新鲜培养液。
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