CN114555785A - 制备v-t细胞衍生的外泌体以治疗epstein-barr病毒相关癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于杀伤或抑制EBV感染的细胞的衍生自Vδ2‑T细胞的外泌体(Vδ2‑T‑Exos)。还提供了用于杀伤或抑制EBV感染的细胞生长的方法，其包括使EBV感染的细胞与有效杀伤或抑制细胞生长的量的来自Vδ2+T细胞的外泌体接触。优选地，EBV感染的细胞是已成为肿瘤性的EBV感染的细胞，例如EBV感染的肿瘤性B细胞或EBV感染的肿瘤性上皮细胞。还提供了通过向受试者施用治疗有效量的Vδ2‑T‑Exos来治疗受试者中EBV诱导的癌症的方法。Vδ2‑T‑Exos可以衍生自获自受试者或同种异体健康个体的Vδ2‑T细胞。还提供了用于从Vδ2‑T细胞分离Vδ2‑T‑Exos的方法。
Description
发明背景
Epstein-Barr病毒(EBV)以无症状的方式持续感染大多数成年人；然而，其也与多种淋巴癌有关。在免疫功能低下的患者中，EBV可能会导致危及生命的EBV诱导的B细胞淋巴增生性疾病(EBV-LPD)和弥漫性大B细胞淋巴瘤。目前针对EBV相关肿瘤的治疗选择非常有限，且具有显著的脱靶毒性，并且对复发或难治性疾病不完全有效。通过体外产生的EBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的过继转移恢复对EBV的免疫力成功治疗了一些造血细胞移植患者的EBV相关肿瘤。然而，该方法对实体器官移植患者的EBV相关肿瘤无效，并且还受到在体外产生足够数量的EBV特异性CTL的困难的限制。
γδ-T细胞作为对不同肿瘤细胞具有不受MHC限制的裂解活性的类先天性T细胞，在癌症免疫治疗中具有巨大潜力。人γδ-T细胞根据其T细胞受体(TCR)中引入Vδ1或Vδ2链而分为两个主要亚群。Vδ1+T细胞在黏膜和上皮组织中占优势，而大部分Vδ2+T细胞存在于外周血和淋巴器官中，并且通常共表达Vγ9。Vδ2+T细胞可以通过磷酸抗原以MHC非依赖性方式被激活和扩增，所述磷酸抗原为哺乳动物细胞中甲羟戊酸途径的小型非肽磷酸化中间体。帕米膦酸盐(PAM)是常用于治疗骨质疏松症的药理学氨基双膦酸盐，其还可以在体外和体内选择性地激活和扩增人Vδ2+T细胞。最近，使用免疫缺陷Rag2-/-γc-/-和人源化小鼠EBV-LPD模型显示，过继转移离体PAM扩增的Vδ2+T细胞或直接施用PAM在体内扩增Vδ2+T细胞可以控制EBV-LPD，这表明基于Vδ2-T细胞的免疫疗法可用于治疗EBV诱导的B细胞癌。然而，由于一些癌症患者的Vδ2-T细胞难以被磷酸抗原扩增，并且重复施用磷酸抗原可能导致Vδ2-T细胞耗尽，其临床应用受到限制。此外，由于患者体内的免疫抑制性肿瘤微环境，基于细胞的免疫疗法的抗肿瘤功效可能会受到严重阻碍。
发明概述
本公开提供不仅直接杀伤EBV诱导的B细胞淋巴瘤，而且通过增强T细胞介导的抗肿瘤活性间接抑制淋巴瘤的发展和进展的人Vδ2-T细胞衍生的外泌体(Vδ2-T-Exos)。因此，本发明的某些实施方案提供了通过使细胞与Vδ2-T-Exos接触来杀伤EBV感染的细胞或抑制其生长的方法。本发明进一步的实施方案还提供了通过向受试者施用Vδ2-T-Exos来治疗例如EBV诱导的B细胞淋巴瘤的EBV诱导的癌症的方法。甚至本发明进一步的实施方案提供了分离Vδ2-T-Exos的方法。
附图说明
图1A.Vδ2-T-Exos的表征。通过动态光散射分析测量的Vδ2-T-Exos的尺寸分布。
图1B.Vδ2-T-Exos的表征。通过透射电子显微镜确定的Vδ2-T-Exos的形态。比例尺，50nm。
图1C.Vδ2-T-Exos的表征。通过蛋白质印迹分析测量Vδ2-T细胞和Vδ2-T-Exos中外泌体标志物CD63、TSG101、CD81、Alix和内质网标志物GRP94。
图1D.Vδ2-T-Exos的表征。通过流式细胞术测定Vδ2-T-Exos上功能分子的表面表达，灰色直方图代表同种型对照。每个实验独立进行四次。
图1E.Vδ2-T-Exos的表征。通过流式细胞术测定Vδ2-T-Exos上功能分子的表面表达，灰色直方图代表同种型对照。每个实验独立进行四次。
图1F.Vδ2-T-Exos的表征。通过流式细胞术测定Vδ2-T-Exos上功能分子的表面表达，灰色直方图代表同种型对照。每个实验独立进行四次。
图2A.Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。Vδ2-T-Exos用Dil标记并且随后与EBV-LCL共培养。18小时后，通过共聚焦显微镜分析EBV-LCL中的Dil信号。DAPI用于对细胞核进行染色(Dil＝红色，DAPI＝蓝色；比例尺＝10μm)。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图2B.Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。将DiR标记的Vδ2-T-Exos腹腔注射到携带EBV诱导的B细胞淋巴瘤的小鼠中。3小时或24小时后收获肿瘤组织。使用体内成像系统测定DiR标记的Vδ2-T-Exos的荧光强度。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图2C.Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。将CFSE标记的Vδ2-T-Exos与EBV-LCL和自体正常B细胞共培养18小时。通过流式细胞仪检测细胞中的CFSE信号。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图2D.Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。将CFSE标记的Vδ2-T-脂质体与EBV-LCL和自体正常B细胞共培养18小时。通过流式细胞仪检测细胞中的CFSE信号。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图2E.Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。将CFSE标记的Vδ2-T-Exos与中和抗NKG2D抗体或同种型对照预孵育，然后与EBV-LCL共同培养。18小时后测定EBV-LCL上的CFSE信号。分离自不含Vδ2-T细胞组分的非条件无Exos培养基中的沉淀用作对照。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图2F.Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。CFSE标记的Vδ2-T-Exos与中和抗TCR-γδ抗体或同种型对照预孵育，然后与EBV-LCL共同培养。18小时后测定EBV-LCL上的CFSE信号。分离自不含Vδ2-T细胞组分的非条件无Exos培养基中的沉淀用作对照。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图3A.Vδ2-T-Exos诱导EBV-LCL的凋亡。与不同量的Vδ2-T-Exos共培养18小时后测定EBV-LCL和自体正常B细胞的凋亡。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图3B.Vδ2-T-Exos诱导EBV-LCL的凋亡。与Vδ2-T-Exos或PBS共培养4小时后，在EBV-LCL中测量活性胱天蛋白酶-3。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图3C.Vδ2-T-Exos诱导EBV-LCL的凋亡。通过流式细胞术测定Fas和DR5在EBV-LCL和自体正常B细胞上的表面表达。显示了代表性图像，灰色直方图代表同种型对照。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图3D.Vδ2-T-Exos诱导EBV-LCL的凋亡。用或未用中和抗FasL、抗TRAIL抗体或相应同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos与EBV-LCL共培养。凋亡计算为相对于未经预处理的Vδ2-T-Exos的抑制百分比。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4A.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。通过在Rag2-/-γc-/-小鼠中皮下注射表达EGFP的EBV-LCL建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型。在指定时间将Vδ2-T-Exos腹腔注射到Rag2-/-γc-/-小鼠中。等体积的PBS用作对照。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4B.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在用EBV-LCL(n＝6)或PBS(n＝6)皮下接种后30天，使用体内成像系统测定小鼠的全身荧光图像。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4C.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。用Vδ2-T-Exos或PBS处理后的指定时间测量肿瘤发生率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4D.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。来自接受Vδ2-T-Exos或PBS的小鼠的肿瘤切片的代表性组织学、EBER-1/2的原位杂交和人Ki-67的组织化学分析(比例尺＝100μm)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4E.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点测量肿瘤体积。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4F.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在指定时间确定小鼠存活率(每组6只小鼠)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4G.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。表达EGFP的EBV-LCL皮下注射到Rag2-/-γc-/-小鼠中。十四天后，将通过体内成像系统确定的已发展出皮下肿瘤的小鼠随机分为两组，然后在指定时间用Vδ2-T-Exos或PBS处理(每组8只小鼠)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4H.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。用Vδ2-T-Exos或PBS处理前小鼠的全身荧光图像。数据表示为平均值±SE M。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4I.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在指定时间确定小鼠存活率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4J.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在指定时间测定肿瘤体积。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图4K.Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。来自接受Vδ2-T-Exos或PBS的小鼠的肿瘤切片的代表性组织学、EBER-1/2的原位杂交和人Ki-67的组织化学分析(比例尺＝100μm)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5A.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。通过在人源化小鼠中皮下注射表达EGFP的自体EBV-LCL建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型。将与重构的huPBMC同种异体的Vδ2-T-Exos在指定时间腹腔注射到人源化小鼠中。等体积的PBS用作对照(每组8只小鼠)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5B.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点或指定时间确定肿瘤发生率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5C.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点或指定时间测量肿瘤体积。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5D.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点或指定时间测量小鼠存活率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5E.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。来自接受Vδ2-T-Exos或PBS的小鼠的肿瘤切片的代表性组织学、EBER-1/2的原位杂交和人Ki-67的组织化学分析(比例尺＝100μm)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5F.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。通过皮下注射EBV-LCL在Rag2-/-γc-/-小鼠和人源化小鼠中建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型，并在指定时间在Rag2-/-γc-/-或人源化小鼠中用自体或同种异体Vδ2-T-Exos处理。等体积的PBS用作对照(每组8只小鼠)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5G.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点或指定时间测量肿瘤发生率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5H.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点或指定时间测量肿瘤体积。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5I.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。在终点或指定时间测量小鼠存活率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5J.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。来自接受自体Vδ2-T-Exos、同种异体Vδ2-T-Exos或PBS的人源化小鼠的肿瘤切片的代表性组织学、EBER-1/2的原位杂交和人Ki-67的组织化学分析(比例尺＝100μm)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图5K.Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤。来自接受自体Vδ2-T-Exos、同种异体Vδ2-T-Exos或PBS的人源化小鼠的肿瘤切片中人CD3 T细胞的代表性免疫荧光分析(CD3＝红色，DAPI＝蓝色；比例尺＝20μm)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。NS，不显著。
图6A.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。Vδ2-T-Exos用CFSE标记并且随后与CD3 T细胞共培养。18小时后，通过流式细胞术测定CD4或CD8 T细胞上的CFSE信号。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6B.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。Vδ2-T-Exos用CFSE标记并且随后与CD3 T细胞共培养。18小时后，通过流式细胞术测定CD4或CD8 T细胞上的CFSE信号。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6C.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。CD3 T细胞与同种异体Vδ2-T-Exos或PBS共培养48小时后CD4 T细胞和CD8 T细胞上CCR5的表达。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6D.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。CD3 T细胞与同种异体Vδ2-T-Exos或PBS共培养48小时后CD4 T细胞和CD8 T细胞上CCR5的表达。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6E.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。将Vδ2-T-Exos预处理的CD3 T细胞与中和抗CCR5抗体或同种型对照共同孵育30分钟并添加到上室中。将PBS预处理的CD3 T细胞用作对照。将来自EBV-LCL的上清液添加到下室中。显示了4小时后从上室迁移的细胞的相对百分比。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6F.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。用不同量的自体或同种异体Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞7天后，CD4或CD8T细胞的增殖和IFN-γ的细胞内表达。左侧为流式细胞术的代表性图像。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6G.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。用不同量的自体或同种异体Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞7天后，CD4或CD8T细胞的增殖和IFN-γ的细胞内表达。左侧为流式细胞术的代表性图像。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6H.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。用不同量的自体或同种异体Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞7天后，CD4或CD8T细胞的增殖和IFN-γ的细胞内表达。左侧为流式细胞术的代表性图像。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6I.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。用不同量的自体或同种异体Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞7天后，CD4或CD8T细胞的增殖和IFN-γ的细胞内表达。左侧为流式细胞术的代表性图像。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6J.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)选自EBV血清阳性huPBMC，并在IL-2存在下与同种异体Vδ2-T-Exos或PBS共培养。两周后，通过IFN-γ的细胞内染色测定EBV-CTL的细胞数，并通过计数珠进行计数。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)选自EBV血清阳性huPBMC，并在IL-2存在下与同种异体Vδ2-T-Exos或PBS共培养。两周后，通过IFN-γ的细胞内染色测定EBV-CTL的细胞数，并通过计数珠进行计数。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图6K.Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤应答。EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)选自EBV血清阳性huPBMC，并在IL-2存在下与同种异体Vδ2-T-Exos或PBS共培养。两周后，通过IFN-γ的细胞内染色测定EBV-CTL的细胞数，并通过计数珠进行计数。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)选自EBV血清阳性huPBMC，并在IL-2存在下与同种异体Vδ2-T-Exos或PBS共培养。两周后，通过IFN-γ的细胞内染色测定EBV-CTL的细胞数，并通过计数珠进行计数。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图7A.CD4 T细胞和CD8 T细胞参与人源化小鼠中Vδ2-T-Exos诱导的抗肿瘤免疫。通过在用来自相同供体的全huPBMC、CD4-T细胞耗尽的huPBMC或CD8-T细胞耗尽的huPBMC重构的人源化小鼠中注射自体EBV-LCL来建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型。将同种异体Vδ2-T-Exos在指定时间腹腔注射到人源化小鼠中(每组8只小鼠)。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，NS，不显著。
图7B.CD4 T细胞和CD8 T细胞参与人源化小鼠中Vδ2-T-Exos诱导的抗肿瘤免疫。在终点或指定时间测量肿瘤发生率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，NS，不显著。
图7C.CD4 T细胞和CD8 T细胞参与人源化小鼠中Vδ2-T-Exos诱导的抗肿瘤免疫。在终点或指定时间测量肿瘤体积。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，NS，不显著。
图7D.CD4 T细胞和CD8 T细胞参与人源化小鼠中Vδ2-T-Exos诱导的抗肿瘤免疫。在终点或指定时间测量小鼠存活率。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，NS，不显著。
图8A.Vδ2-T-Exos的表征。将衍生自Vδ2-T细胞的细胞外囊泡通过碘克沙醇梯度分离为12个亚级分。代表性数据显示为平均值±SEM四次独立实验。**p<0.01。
图8B.Vδ2-T-Exos的表征。碘克沙醇梯度分离后的亚级分中外泌体标志物CD81、TSG101、CD63和Alix的蛋白质印迹分析。代表性数据显示为平均值±SEM四次独立实验。**p<0.01。
图8C.Vδ2-T-Exos的表征。梯度亚级分培养18小时后EBV-LCL的凋亡。代表性数据显示为平均值±SEM四次独立实验。**p<0.01。
图9.Vδ2-T细胞的激活和功能标志物。所示的细胞表面标志物通过对静息Vδ2-T细胞(第0天)或PAM扩增的Vδ2-T细胞(第16天)进行流式细胞术来测定。灰色直方图代表同种型对照。数据显示为四次独立实验的代表。
图10A.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗HLA-DR/DP/DQ抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞后CD4 T细胞的增殖。所有显示为平均值±SE M的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10B.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗HLA-DR/DP/DQ抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞后CD4 T细胞中IFN-γ的细胞内表达。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10C.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗HLA-A/B/C抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞后CD8 T细胞的增殖。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10D.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗HLA-A/B/C抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞后CD8 T细胞中IFN-γ的细胞内表达。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10E.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗CD86抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞后CD4 T细胞的增殖。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10F.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗CD86抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exos培养CD3 T细胞后CD4 T细胞中IFN-γ的细胞内表达。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10G.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗CD86抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exo s培养CD3 T细胞后CD8 T细胞的增殖。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图10H.HLA和CD86在Vδ2-T-Exos诱导的T细胞应答中的作用。用同种异体Vδ2-T-Exos、中和抗CD86抗体或同种型对照预处理的Vδ2-T-Exo s培养CD3 T细胞后CD8 T细胞中IFN-γ的细胞内表达。所有显示为平均值±SEM的数据代表四次独立实验。*p<0.05,**p<0.01。NS，不显著。
图11.EBV-LCL和自体正常B细胞上MICA/B的表面表达。通过流式细胞术测定EBV-LCL和自体正常B细胞上MICA/B的表达，灰色直方图代表同种型对照。数据代表四次独立实验。
图12A-12E.根据实施例8中公开的方法分离的Vδ2-T-Exos。
发明详述
如本文所用，除非上下文另有明确指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括”、“含有”、“含”、“有”、“具有”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式表示包括性的。过渡术语/短语(及其任何语法变体)“包括”、“包含”、“含有”、“基本上由……组成”、“基本上组成为”、“由……组成”和“组成为”可以互换使用。
短语“基本上由……组成”或“基本上组成为”表示权利要求涵盖包含指定材料或步骤的实施方案以及不实质影响权利要求的基本特征和新颖特征的实施方案。
术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或测定该值，即测量系统的限制。通常，“约”可以表示给定值的最高0-10％的范围。
在本公开中，范围以简写形式陈述以避免必须冗长地列出并描述范围内的每个值。在适当的情况下，可以选择范围内的任何合适的值作为范围的上限值、下限值或终点。例如，0.1-1.0的范围代表0.1和1.0的端值，以及0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的中间值，以及0.1-1.0范围内的所有中间值，例如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。预期为在范围内的值具有至少两位有效数字，例如，5-10的范围表示5.0和10.0之间以及5.00和10.00之间包括端值的所有值。
如本文所用，“治疗”或“处理”(以及这些术语的语法变体)可互换使用。这些术语是指获得包括但不限于治疗益处的有益或期望结果的方法。治疗益处通过根除或改善与潜在癌症相关的一种或多种生理症状从而在患者中观察到改善来实现，尽管患者可能仍患有潜在癌症。
术语外泌体的“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现包括但不限于癌症治疗的预期应用的本文所述的外泌体的量。治疗有效量可以根据受试者和所治疗的疾病状况而变化，例如受试者的体重和年龄、癌症的严重程度、施用方式等，这些可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语也适用于将在靶细胞中诱导例如杀伤靶细胞或减少靶细胞的增殖的特定反应的剂量。具体剂量也将根据要遵循的给药方案、是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用的组织以及携带外泌体的物理递送系统而变化。
“受试者”是指动物，如哺乳动物，例如人。本文所述的方法可用于临床前人类治疗和兽医应用。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(例如疾病的动物模型)，并且在一些实施方案中，受试者是人。术语“受试者”和“患者”可互换使用。
外泌体是内体来源的小细胞外囊泡(20-200nm)，其可在细胞间通讯中运输脂质、蛋白质和核酸。外泌体具有高生物利用度、生物稳定性、生物相容性和货物装载能力。可以对外泌体进行工程改造以实现靶向特异性，使其成为可以递送抗肿瘤剂并诱导抗原特异性抗肿瘤免疫的强力纳米载体。
Vδ2+T细胞属于T淋巴细胞的子集。Vδ2+T细胞存在于外周血和淋巴器官中，并且通常共表达Vγ9。Vδ2+T细胞可以通过磷酸抗原以MHC非依赖性方式被激活和扩增，所述磷酸抗原为哺乳动物细胞中甲羟戊酸途径的小型非肽磷酸化中间体。PAM是常用于治疗骨质疏松症的药理学氨基双膦酸盐，其还可以在体外和体内选择性地激活和扩增人Vδ2+T细胞。
通常，EBV感染是无症状的，因为感染为宿主的免疫系统所控制。然而，一些个体可能会患上自限性感染性单核细胞增多症，而其他个体可能会患上与EBV相关的淋巴癌或上皮癌。EBV生命周期包括导致新病毒颗粒产生的溶解期以及病毒在宿主的一生中在记忆B细胞中基本上保持沉默的潜伏期。因此，EBV感染的细胞可以在溶解期或潜伏期中具有EBV病毒。
出于本发明的目的，短语“来自Vδ2+T细胞的外泌体”是指从Vδ2+T细胞分离的外泌体。这些外泌体可以分离自从有待治疗EBV诱导的癌症的受试者获得的Vδ2+T细胞，该EBV诱导的癌症例如为EBV诱导的B细胞癌。这些外泌体也可以分离自健康的个体。可以在体外激活Vδ2+T细胞之前或之后从获自受试者的Vδ2+T细胞分离外泌体。通常，Vδ2+T细胞在磷酸抗原存在的情况下在体外被激活，所述磷酸抗原例如为异戊烯焦磷酸(IPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸(HMB-PP)、溴醇焦磷酸(BrHPP)和PAM。可以激活Vδ2+T细胞的磷酸抗原的其他实例是本领域已知的并且这些实施方案在本发明的范围内。
用于分离外泌体的某些方法是本领域已知的并且可用于从Vδ2+T细胞分离外泌体。通常，来自培养的Vδ2+T细胞的上清液用作外泌体的来源。
基于树突状细胞(DC)衍生的外泌体(DC-Exos)或自然杀伤细胞衍生的外泌体(NK-Exos)的免疫疗法已显示出用于癌症治疗的前景，但该免疫疗法在某些癌症患者中的抗肿瘤功效有限。离体扩增DC的异质性可能部分解释了基于DC-Exos的治疗效果不佳。来自未成熟DC的外泌体可能具有免疫耐受活性。常规方法难以生成高度同质的人DC，并且其成熟通常是不完全的和不同步的。因此，致耐受性DC-Exos通常与免疫刺激性DC-Exos共同分离并恶化其治疗结果。此外，在体外大规模扩增DC或NK细胞仍然是一个挑战。相比之下，通过使用磷酸抗原在临床规模上体外扩增同质人Vδ2-T细胞的优化方案是已知的，其允许产生大量的Vδ2-T-Exos。最重要的是，Vδ2-T细胞对肿瘤细胞的溶细胞活性和免疫刺激特性即使在长期扩增后也可以得到保持。
虽然测试了某些其他外泌体如DC-Exos或NK-Exos靶向和杀伤癌细胞的能力，但Vδ2-T细胞衍生的外泌体(Vδ2-T-Exos)的抗肿瘤活性仍然未知。本公开内容提供了保留了Vδ2-T细胞的抗肿瘤活性同时避免了基于细胞的癌症免疫疗法的限制的Vδ2-T-Exos。特别是，人Vδ2-T-Exos在体外有效诱导EBV-LCL的凋亡，并在Rag2-/-γc-/-和人源化小鼠中抑制EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展。同种异体Vδ2-T-Exos比自体Vδ2-T-Exos具有更强的抗肿瘤活性，可能是因为其可以诱导更强大的CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫。
与衍生自其他细胞的外泌体类似，Vδ2-T-Exos的表面装饰有来自其亲代细胞的完整功能分子。由于人Vδ2-T细胞具有NK和DC的特征，Vδ2-T-Exos可具有双重抗肿瘤活性。与衍生自NK细胞的外泌体类似，已发现Vδ2-T-Exos携带FasL和TRAIL(图1)，它们可以分别与EBV-LCL上表达的Fas和DR5相互作用(图3)，然后诱导EBV-LCL凋亡(图3)，从而通过Fas/FasL和TRAIL/DR5通路有效抑制Rag2-/-γc-/-(图4)和人源化小鼠(图5)中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展和进展。与衍生自DC的外泌体类似，Vδ2-T-Exos还保留了抗原呈递和T细胞引发所需的基本免疫刺激分子和MHC-I/II分子，例如CD80、CD86、HLA-A/B/C和HLA/DR/DP/DQ(图1)。实际上，Vδ2-T-Exos可以通过识别HLA-DR/DP/DQ和CD86来增强CD4细胞的细胞增殖和IFN-γ的产生(图6、图10)。此外，CD4 T细胞和CD8 T细胞都参与了Vδ2-T-Exos介导的针对人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的抗肿瘤免疫(图7)。因此，Vδ2-T-Exos具有多种抗肿瘤活性，并具有NK-Exos和DCs-Exos的抗肿瘤特性。
本公开表明，Vδ2-T-Exos可以通过Vδ2-T-Exos携带的NKG2D与在EBV-LCL上组成型表达的其配体MICA/B的相互作用靶向EBV-LCL(图2E和图11)。该靶向作用不依赖于Vδ2-T-Exos携带的TCR-γδ(图2F)。由于低pH条件可以改善肿瘤细胞对外泌体的摄取，因此作为肿瘤恶性标志的肿瘤微环境中的酸性条件也可能是Vδ2-T-Exos在肿瘤部位积累的原因。
重要的是，同种异体Vδ2-T-Exos可以通过上调T细胞上的CCR5来增加T细胞在EBV诱导的肿瘤组织中的浸润，因为EBV诱导的淋巴瘤细胞可以分泌丰富的CCR5配体。此外，同种异体Vδ2-T-Exos比自体Vδ2-T-Exos更有效地诱导CD4和CD8 T细胞的细胞增殖和IFN-γ的产生(图6H-6K)，因此针对人源化小鼠中的EBV诱导的B细胞淋巴瘤，同种异体Vδ2-T-Exos具有优于自体Vδ2-T-Exos的治疗效果(图5F-5J)。实际上，一旦阻断同种异体Vδ2-T-Exos上携带的HLA-DR/DP/DQ分子，由Vδ2-T-Exos诱导的CD4 T细胞应答就可被显著消除(图10)，这表明同种异体Vδ2-T-Exos上HLA-DR/DP/DQ分子的同种识别在诱导T细胞应答中起重要作用。
因此，本公开提供了使用Vδ2-T-Exos来治疗EBV诱导的B细胞淋巴瘤的新治疗策略。作为无细胞疗法，Vδ2-T-Exos通过继承来自Vδ2-T细胞的细胞毒性和免疫刺激特性兼具NK-Exos和DC-Exos的优点，使其能够有效控制EBV诱导的B细胞淋巴瘤。基于Vδ2-T-Exos的疗法，特别是基于同种异体Vδ2-T-Exos的疗法，具有克服EBV诱导的B细胞淋巴瘤的常规免疫疗法的缺点的巨大潜力。
因此，本发明的某些实施方案提供了杀伤或抑制EBV感染的细胞的生长的方法，其包括使EBV感染的细胞与有效杀伤或抑制细胞生长的量的来自Vδ2+T细胞的外泌体接触。在某些实施方案中，EBV感染的细胞是EBV感染的淋巴细胞，例如B淋巴细胞。在其他实施方案中，EBV感染的细胞是EBV感染的上皮细胞。在优选的实施方案中，EBV感染的细胞已成为肿瘤性(neoplastic)，例如EBV感染的肿瘤性B淋巴细胞(neoplastic B-lymphocyte)或EBV感染的肿瘤性上皮细胞(neoplastic epithelial cell)。
在某些实施方案中，外泌体分离自与EBV感染的细胞自体同源的Vδ2+T细胞。优选地，外泌体分离自与EBV感染的细胞同种异体的Vδ2+T细胞。
本发明进一步的实施方案提供了治疗EBV诱导的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的来自Vδ2+T细胞的外泌体。
出于本发明的目的，短语“EBV诱导的癌症”是指由已成为肿瘤性的EBV感染细胞产生的癌症。EBV通常感染淋巴细胞或上皮细胞。因此，本公开提供了治疗淋巴细胞起源或上皮起源的癌症的方法。
EBV通常感染的淋巴细胞是B细胞。因此，本公开提供了治疗EBV诱导的肿瘤(neoplasm)的方法，例如EBV诱导的B细胞肿瘤，包括EBV诱导的：伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和淋巴组织增生性疾病。
本公开还提供了治疗EBV诱导的上皮癌的方法，例如EBV诱导的鼻咽癌(NPC)或EBV诱导的胃癌(cancer)/上皮癌(carcinoma)。
由于大多数癌症患者免疫功能低下，很难在体外大规模扩增其Vδ2-T细胞并制备自体Vδ2-T-Exos。此外，来自不同患者的Vδ2-T-Exos的组分也不同，这可能导致其治疗效果的差异。相比之下，通过当前可用的方案从健康个体中大规模地扩增和制备同种异体Vδ2-T-Exos是很方便的。同种异体Vδ2-T细胞可以在胆管癌患者中无副作用的控制肿瘤生长。由于磷酸抗原扩增的Vδ2-T细胞显示出同质的抗肿瘤特性，因此将来自大量健康个体的同种异体Vδ2-T-Exos汇集在一起可能有利于质量控制、标准化和集中化。因此，基于同种异体而非自体Vδ2-T-Exos的癌症治疗在未来的临床实践中可能更有效和可行。
个体中约1-10％的T淋巴细胞可以通过直接的T细胞同种异体识别对外来MHC分子产生应答。这些高频前体还对自身MHC分子呈递的抗原具有特异性，这些前体已在针对病毒肽的多个场合发现并包含CD4 T细胞和CD8T细胞。此外，同种异体应答可以促进对自身HLA限制性肿瘤抗原的有效T细胞应答，并逆转预先存在的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的耗尽，从而促进肿瘤细胞的免疫清除。因此，可以提出这种交叉反应用于治疗病毒感染和癌症。本公开内容还表明，同种异体Vδ2-T-Exos可以促进预先存在的EBV特异性CD4 T细胞和CD8 T细胞的扩增，这可有利于Vδ2-T-Exos对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的抗肿瘤功效。
因此，虽然可以从患有癌症的受试者的Vδ2-T细胞分离外泌体，但在优选的实施方案中，本发明提供了通过施用从个体的Vδ2+T细胞获得的外泌体来治疗受试者中EBV诱导的癌症的方法，所述个体优选地为与受试者同种异体的健康个体。
或者，当已知受试者没有癌症时，可以从来自受试者的Vδ2+T细胞获得外泌体。因此，可以从来自受试者的Vδ2+T细胞获得外泌体，并在例如冷冻的适当条件下储存，如果受试者发展为EBV诱导的癌症，则将其施用于受试者。
外泌体可以通过任何方便和有效的施用途径施用于受试者，所述施用途径例如为口服、直肠、鼻腔、局部(包括颊部和舌下)、经皮、阴道、肠胃外(包括肌肉内、皮下和静脉内)、脊柱(硬膜外、鞘内)和中枢(脑室内)施用。
本发明的进一步实施方案提供了用于分离Vδ2-T-Exos的方法。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：
a)提供外周单核细胞(PBMC)，
b)在存在磷酸抗原和IL-2的培养基中培养PBMC第一时间段，
c)在第一时间段后，在存在PAM和IL-2的无外泌体培养基中培养PBMC第二时间段，
d)在第二时间段后从培养上清液中分离外泌体。
在优选的实施方案中，PBMC是人PBMC。通常，人PMBC在磷酸抗原和IL-2的存在下培养14至20天的时间段。在该培养时间段之后，细胞在同样存在磷酸抗原和IL-2的不含外泌体的新鲜培养基中再培养24小时至72小时的时间段，优选约48小时。
可以在第二个培养时间段结束时通过本领域已知的各种分离外泌体的步骤来分离外泌体。这样的步骤可以包括过滤、离心、超速离心及其组合。
可用于分离Vδ2-T-Exos的方法中的磷酸抗原包括异戊烯焦磷酸(IPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸(HMB-PP)、溴醇焦磷酸(BrHPP)、帕米膦酸盐(PAM)或其任何组合。刺激Vδ2-T细胞的磷酸抗原的其他实例在本领域中是已知的并且此类实施方案在本发明的范围内。
本发明进一步的实施方案提供了药物组合物，其包含根据包括以下步骤的方法分离的Vδ2-T-Exos：
a)提供外周单核细胞(PBMC)，
b)在存在磷酸抗原和IL-2的培养基中培养PBMC第一时间段，
c)在第一时间段后，在存在PAM和IL-2的无外泌体培养基中培养PBMC第二时间段，
d)在第二时间段后从培养上清液中分离外泌体。
以上提供的关于分离Vδ2-T-Exos的方法的细节也适用于本发明的药物组合物。
除了根据本文公开的方法分离的Vδ2-T-Exos之外，药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指稀释剂、佐剂或赋形剂，其与根据本文公开的方法分离的Vδ2-T-Exos共同配制。通常，“药学上可接受的载体”是无毒的、生物学上可耐受的并且在生物学上适合施用于受试者的物质，例如惰性物质，其添加到药理学组合物中或以其他方式用作稀释剂、佐剂、或赋形剂以促进根据本文公开的方法分离的并且与其相容的Vδ2-T-Exos的施用。赋形剂的实例包括各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。适用于药物组合物的载体的其他实例是本领域已知的，并且此类实施方案在本发明的范围内。
本发明的药物组合物可以配制用于通过任何方便和有效的途径施用于受试者，所述途径例如为口服、直肠、鼻、局部(包括颊部和舌下)、经皮、阴道、肠胃外(包括肌肉内、皮下和静脉内)、脊柱(硬膜外、鞘内)和中枢(脑室内)施用。
本发明的其他实施方案提供了杀伤或抑制EBV感染的细胞的生长的方法，其包括使EBV感染的细胞与有效杀伤或抑制细胞生长量的根据本文公开的Vδ2-T-Exos分离方法分离的Vδ2-T-Exos接触。
本发明进一步的实施方案还提供了治疗EBV诱导的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本文公开的Vδ2-T-Exos分离方法分离的Vδ2-T-Exos。
上文讨论了通过使细胞与Vδ2-T-Exos接触来杀伤或抑制EBV感染的细胞的生长的某些方面，例如EBV感染细胞的类型和Vδ2-T-Exos的来源Vδ2+T细胞。这些方面也适用于杀伤或抑制EBV感染的细胞的生长的方法，其包括使EBV感染的细胞与根据本文公开的Vδ2-T-Exos分离方法分离的Vδ2-T-Exos接触。
类似地，上文讨论了包括向有需要的受试者施用治疗有效量的Vδ2-T-Exos的治疗EBV诱导的癌症的方面，例如癌症的类型、Vδ2-T-Exos的来源Vδ2+T细胞、施用途径和受试者。这些方面也适用于治疗EBV诱导的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据本文公开的Vδ2-T-Exos分离方法分离的Vδ2-T-Exos。
材料和方法
研究设计
本研究的目的是确定Vδ2-T-Exos对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用。表征了Vδ2-T-Exos上具有抗肿瘤潜力的免疫分子，并确定了Vδ2-T-Exos与EBV-LCL的相互作用。然后在免疫缺陷小鼠和人源化小鼠中评估了Vδ2-T-Exos在体外对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用。考虑到临床应用的可行性，在人源化小鼠中比较了自体Vδ2-T-Exos与同种异体Vδ2-T-Exos的抗肿瘤作用。进一步研究了Vδ2-T-Exos对T细胞应答的影响及其潜在机制。最后比较了Vδ2-T-Exos在用全huPBMC、CD4耗尽的huPBMC和CD8耗尽的huPBMC重构的人源化小鼠中的抗肿瘤作用。小鼠是组间年龄和性别匹配的。样本大小由研究者根据以往经验确定。样本大小和重复在图例中说明。所有研究方案和动物工作均获得香港大学机构审查委员会/医院管理局香港西集群和香港大学活体动物教研使用委员会的批准。
Vδ2-T-Exos的分离和表征
将PAM扩增的Vδ2-T细胞在不含外泌体的培养基中培养48小时以产生Vδ2-T-Exos。然后收集条件培养基并进行差速超速离心。动态光散射显示，超速离心的沉淀显示出代表同质群体的钟形尺寸分布曲线，其在80nm处具有峰值(图1A)。电子显微镜分析显示，超速离心的沉淀含有类似于杯形外泌体的囊泡(图1B)。蛋白质印迹分析表明，这些小囊泡对外泌体标志物CD63、TSG101、CD81、Alix呈阳性，而对内质网蛋白GRP94呈阴性(图1C)。这些小囊泡的密度梯度超速离心进一步证明其主要由外泌体组成，如外泌体标志物主要在级分6、7和8中表达所证明(图8A和8B)。TCR-γδ的表达证实，这些小囊泡来源于Vδ2-T细胞，CD4、CD8和CD19表达的缺失排除了来自其他免疫细胞的囊泡的潜在污染(图1D)。与其亲代PAM扩增的Vδ2-T细胞相似(图9)，Vδ2-T-Exos表达可观水平的溶细胞分子(FasL、TRAIL)、激活受体(NKG2D)、趋化因子受体(CCR5)、抗原呈递分子(HLA-A/B/C；HLA-DR/DP/DQ)和共刺激分子(CD80、CD86)(图1E-1F)，表明其在癌症免疫治疗中的巨大潜力。
EBV-LCL的体外建立
在知情同意后获得EBV血清阳性健康受试者的血沉棕黄层(Buffy coat)，并通过Ficoll-Hypaque梯度离心进行huPBMC分离。如Xiang等人(2014)所述建立EBV-LCL。简而言之，将huPBMC与源自B95-8或B95.8EBfaV-GFP细胞系的包含EBV的上清液共同孵育，并在存在环孢菌素-A的情况下在补充有15％FBS的RPMI-1640培养基中培养。
Vδ2的扩增和Vδ2-T-Exos的产生
Vδ2-T细胞按照Xiang等人(2014)和Tu等人描述的方案进行扩增。简而言之，将huPBMC在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养，并在第0天和第3天用9μg/ml PAM刺激。从第3天开始，每三天添加终浓度为200IU/ml的人重组白细胞介素2(IL-2；Invitrogen)。14至20天后，在9μg/ml PAM和500IU/ml IL-2存在下，将Vδ2-T细胞(纯度>95％)转移到不含外泌体的10％FBS-RPMI培养基中。48小时后收集条件培养基并进行外泌体分离。
Vδ2-T-Exos的分离和表征
在4℃下通过差速超速离心分离外泌体。条件培养基首先以300x g离心10分钟以沉淀整个细胞，2,000x g 10分钟以去除死细胞，10,000x g 30分钟以弃去细胞碎片。然后将上清液通过0.22-μm注射器过滤，然后以100,000x g超速离心70分钟(SW32Ti转子，Beckman)。将沉淀重悬于PBS中并以100,000x g再次洗涤70分钟。最后，将包含外泌体的沉淀溶解在PBS中。对于透射电子显微镜分析，外泌体用2％多聚甲醛固定并放置在formvar碳涂层铜网格上。然后将网格用2％磷钨酸染色并使用飞利浦CM100透射电子显微镜(飞利浦，Eindhoven，荷兰)成像。使用DynaPro Plate Reader(Wyatt Technology,加利福尼亚,美国)通过动态光散射(DLS)分析确定外泌体的尺寸分布。对于蛋白质印迹分析，通过在蛋白酶抑制剂Cocktail存在下在RIPA缓冲液中裂解获得来自细胞裂解物或外泌体的蛋白质，并通过8-12％凝胶上的SDS电泳分离。随后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并用5％脱脂牛奶封闭。然后将膜分别与抗CD63、抗CD81、抗TSG101、抗Alix和抗GRP94抗体孵育过夜(Abcam，剑桥，英国)。在与相应的HRP偶联二抗孵育后，使用Immobilon Classico WesternHRP底物(Millipore，MA，美国)检测化学发光信号。对于FACS分析，外泌体通过过夜孵育与4-μm醛/硫酸盐乳胶珠缀合。将外泌体结合的珠子与甘氨酸共同孵育以阻断剩余的结合位点，并用以下荧光标记的抗体和相应的匹配同种型对照进行染色：CD63、TCR-γδ、CD4、CD8、CD19、NKG2D、FasL、TRAIL、CCR5、HLA-A/B/C、HLA-DR/DP/DQ、CD80、CD86(Biolegend，加利福尼亚，美国)。数据采集在BD LSR II流式细胞仪(BD Biosciences，加利福尼亚，美国)上进行。此外，如Lobb等人所述，使用碘克沙醇梯度离心进一步表征包含外泌体的沉淀。对于细胞处理，基于通过Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定的蛋白质浓度，使用10μg(除非另有说明)外泌体。在一些实验中，将Vδ2-T-Exos与以下抗体或相应的匹配同种型对照预孵育30分钟：抗FasL、抗TRAIL、抗NKG2D、抗TCR-γδ、抗HLA-DR/DP/DQ、抗HLA-A/B/C、抗CD86(Biolegend)并通过超速离心洗涤以去除未结合的抗体。
Vδ2-T-Exos与受体细胞的相互作用
Vδ2-T-Exos按照制造商的说明用Dil或CFSE荧光标记以监测其与受体细胞的相互作用。用荧光染料染色后，外泌体用PBS洗涤两次，通过100,000g再离心70分钟以去除多余的染料。最后，将荧光标记的外泌体重悬于PBS中以供进一步使用。在一些实验中，使用差速超速离心从非条件无Exos培养基中分离沉淀，并如上所述标记Vδ2-T-Exos作为对照。为确定Vδ2-T-Exos在受体细胞中的细胞内化，将Dil标记的Exos与同种异体EBV-LCL细胞(1x105)共同孵育。18小时后，孵育的细胞用4％多聚甲醛固定并用DAPI染色。共聚焦图像由LSM710(蔡司,Oberkochen,德国)获得。为评估Vδ2-T-Exos的摄取效率，CFSE+细胞在暴露于CFSE标记的Exos 18小时后使用BD LSR II流式细胞仪进行测定。在一些实验中，CFSE标记的Exos与中和抗TCR-γδ、抗NKG2D抗体或相应的同种型对照(Biolegend)预孵育30分钟，然后与受体细胞孵育。为确定Vδ2-T-Exos是否可以在体内靶向肿瘤部位，将DiR标记的Vδ2-T-Exos腹腔注射(i.p.)到携带EBV诱导的B细胞淋巴瘤的Rag2-/-γc-/-小鼠中。使用IVISSpectrum体内成像系统(Caliper Life Sciences，Hopkinton，美国)检测肿瘤组织中DiR标记的Vδ2-T-Exos的积累。
细胞凋亡测定
为研究Vδ2-T-Exos的溶细胞活性，用递增量的Vδ2-T-Exos处理EBV-LCL(1x105)。接受相同处理的自体正常B细胞作为对照。在18小时后使用膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(BioLegend)测量经处理细胞的细胞凋亡。在一些实验中，在加入EBV-LCL之前，将Vδ2-T-Exos与中和抗FasL、抗TRAIL抗体或相应的同种型对照预孵育。凋亡抑制计算为相对于没有任何处理的组中的抑制百分比。在一些实验中，在暴露于Vδ2-T-Exos 4小时后，使用抗活性胱天蛋白酶-3单克隆抗体(BD Pharmingen，加利福尼亚，美国)在透化的EBV-LCL中检测活化的胱天蛋白酶-3。
趋化性测定
如Xiang等人所描述，使用Transwell系统(5.0μm-孔径；Corning Costar)测定CD3T细胞的趋化活性。纯化的CD3 T细胞用Vδ2-T-Exos或PBS处理48小时并收获。然后将Vδ2-T-Exos预处理的CD3 T细胞用中和抗CCR5抗体(20mg/ml；克隆2D7，BD)或相应的同种型对照预孵育30分钟并加入上室。未经任何预孵育的PBS预处理的CD3 T细胞用作对照。EBV-LCL衍生的上清液在无血清RPMI 1640培养基中培养24小时后收获并添加到下室中。4小时后，使用计数珠(Molecular Probes TM，美国)通过流式细胞仪检测对迁移到下室的CD3细胞进行计数。对照组CD3 T细胞的迁移率设定为100％，并将其他组的迁移率计算为相对于对照组的百分比。
T细胞增殖和细胞因子分泌测定
CD3 T细胞通过Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)进行阴性分离。2x105的CD3 T细胞用递增量的自体或同种异体Vδ2-T-Exos处理。对于增殖测定，根据制造商的说明用CFSE(Sigma-Aldrich)对T细胞进行预染色。培养7天后，通过流式细胞术测定T细胞增殖。在细胞内细胞因子染色之前，用100ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯(Sigma-Aldrich)、1μg/ml离子霉素(Sigma-Aldrich)和10μg/ml布雷菲德菌素A(BFA,Sigma-Aldrich)重新刺激细胞6小时。收集细胞并对CD4、CD8的表面标志物进行染色，并进行IFN-γ的细胞内染色。在一些实验中，在加入T细胞之前，将Vδ2-T-Exos与中和抗HLA-A/B/C、抗HLA-DR/DP/DQ和抗CD86抗体或相应的同种型对照预孵育。在一些实验中，在LMP2a或EBNA1肽池(MiltenyiBiotec，美国)刺激24小时后，使用CD137微珠试剂盒(MiltenyiBiotec，美国)从EBV血清阳性huPBMC中选择EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(EBV-CTL)。选择的细胞用同种异体Vδ2-T-Exos或PBS处理，并在100IU/ml IL-2存在下培养。每3天用含有IL-2以及Vδ2-T-Exos或PBS处理的新鲜培养基替换培养基。两周后，用EBNA1或LMP2a肽池攻击细胞6小时，2小时后加入BFA。通过表面标志物CD4、CD8的染色通过流式细胞术检测EBV-CTL，并进行IFN-γ的细胞内染色。细胞数使用计数珠(Molecular Probes TM，USA)共同计数。
Rag2-/-γc-/-和人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型的建立和EBV诱导的B细胞淋巴瘤的治疗
Rag2-/-γc-/-小鼠培养于香港大学实验动物部。使用之前构建的方法，从用EBV血清阳性全huPBMC、CD4耗尽的huPBMC或CD8耗尽的huPBMC重构的4至5周龄的Rag2-/-γc-/-小鼠建立人源化小鼠。在huPBMC重构4周后，这些嵌合的Rag2-/-γc-/-稳定地具有功能性人外周免疫系统，并被称为“人源化”小鼠。然后向人源化小鼠或6至8周龄的Rag2-/-γc-/-皮下(s.c.)植入表达EGFP的EBV-LCL或EBV-LCL(0.1x106/小鼠)以建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型。在接种EBV-LCL后的指定时间，向注射EBV-LCL的小鼠腹腔(i.p.)施用等体积的PBS或Vδ2-T-Exos(25μg/小鼠)。对于注射EBV-LCL的人源化小鼠，除非另有说明，否则施用的Vδ2-T-Exos相对于重构的huPBMC是自体同源的。每天监测疾病体征(毛发卷曲、体重减轻和活动减少)、肿瘤发生率、肿瘤体积和小鼠存活率。皮下肿瘤直径大于17mm的小鼠按照香港大学实验动物部的规定处死并计为死亡。否则，在处死前对小鼠进行100天的随访。保留肿瘤和器官并进行组织学和免疫组织化学评估。
组织学和免疫组织化学分析
肿瘤组织用10％福尔马林固定并包埋在石蜡中用于切片。对切片进行苏木精和伊红、原位杂交、免疫组织化学和免疫荧光染色。使用DIG-HRP REMBRANDT EBER ISH试剂盒(Panpath，荷兰)通过原位杂交检测EB编码的1型和2型小RNA(EBER-1/2)。使用抗人Ki67抗体(Abcam，英国)通过免疫组织化学检测Ki67，并通过二氨基联苯胺检测试剂盒(Maixin，中国)进行可视化。使用抗人CD3抗体通过免疫荧光测定人T细胞在肿瘤组织中的浸润，并通过LSM 710共聚焦显微镜(蔡司，德国)成像。
流式细胞术分析
使用以下抗体对细胞进行表面染色：抗CD63(H5C6)、抗CD3(HIT3a)、抗CD4(RPA-T4)、抗CD8(SK1)、抗CD19(HIB19)、抗TCR-γδ(B6)、抗HLA-DQ/DP/DQ(Tü39)、抗HLA-A/B/C(W6/32)、抗CD80(2D10)、抗CD86(GL-1)、抗CD69(FN50)、抗TRAIL(RIK-2)、抗FasL(NOK-1)、抗Fas(DX2)、抗DR5(DJR2-4)、抗MICA/B(6D4)、抗NKG2D(1D11)和抗CCR5(2D7)。对于细胞内染色，将细胞固定、透化，然后如前所述(18,64)用抗IFN-γ(B27)和抗活性胱天蛋白酶3(C92-605)抗体(BD，美国)或相应同种型对照进行染色。使用FACSLSR II流式细胞仪(BD，美国)检测所有样品，并通过FlowJo软件(Tree Star，美国)进行分析。
统计分析
数据表示为平均值±SEM。通过使用配对或非配对学生t检验比较荧光强度、细胞凋亡、增殖、细胞因子表达和肿瘤体积的差异。采用Kaplan-Meier对数秩检验比较不同组间的肿瘤发生率和小鼠存活率。双尾检验用于所有分析。p<0.05被认为是显著的。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，包括所有图和表以不与本说明书的明确教导相抵触的范围通过引用整体并入。
以下是说明实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有百分比均按重量计，所有溶剂混合物比例均按体积计。
实施例1–Vδ2-T-Exos靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤
为确定Vδ2-T-Exos与肿瘤细胞的相互作用，将Vδ2-T-Exos用Dil或CFSE标记，然后加入到EBV转化的B类淋巴母细胞系(EBV-LCL)的培养基中18小时。通过差速超速离心从非条件无外泌体培养基中分离的沉淀用作对照。共聚焦显微镜检查表明Vδ2-T-Exos可以被EBV-LCL摄取(图2A)。为检查Vδ2-T-Exos是否可以在体内的肿瘤部位积聚，如Xiang等人(2014)所述通过在Rag2-/-γc-/-免疫缺陷小鼠中皮下(s.c.)接种EGFP+EBV-LCL建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤。将DiR标记的Vδ2-T-Exos或其对照腹腔(i.p.)注射到携带EGFP+EBV诱导的B细胞淋巴瘤的小鼠中。3小时和24小时后，使用体内成像系统测试Vδ2-T-Exos在肿瘤组织中的积累，结果显示，与对照相比，Vδ2-T-Exos在体内肿瘤组织中特异性积累(图2B)。
为了进一步评估Vδ2-T-Exos与EBV诱导的B细胞淋巴瘤的相互作用，将EBV-LCL或自体正常B细胞与CFSE标记的Vδ2-T-Exos或对照共同孵育。流式细胞术分析发现，在用CFSE标记的Vδ2-T-Exos处理后，所有EBV-LCL都变为CFSE阳性(图2C)。重要的是，EBV-LCL对Vδ2-T-Exos的摄取效率显著高于自体正常B细胞(图2C)，这表明Vδ2-T-Exos可以靶向EBV-LCL。脂质体是一种具有纳米球膜型结构的纳米颗粒，其具有脂质生物层且与外泌体具有相似的物理特性。因此，脂质体用于处理EBV-LCL或自体正常B细胞，以确定EBV-LCL和自体正常B细胞之间对Vδ2-T-Exos的不同摄取效率是否是由于纳米颗粒的非特异性结合活性。有趣的是，在EBV-LCL和自体正常B细胞之间没有观察到脂质体摄取效率的显著差异(图2D)，这证实了Vδ2-T-Exos靶向EBV-LCL并非由于其非特异性结合。重要的是，Vδ2-T-Exos对EBV-LCL的靶向作用取决于Vδ2-T-Exos携带的NKG2D与其在EBV-LCL上组成型表达的配体MICA/B的相互作用(图11)，因为通过抗NKG2D中和mAb对Vδ2-T-Exos携带的NKG2D的阻断显著抑制了Vδ2-T-Exos对EBV-LCL的靶向(图2E)。相比之下，阻断Vδ2-T-Exos携带的TCR-γδ不能抑制Vδ2-T-Exos对EBV-LCL的靶向(图2F)，表明Vδ2-T-Exos对EBV-LCL的靶向并非依赖于Vδ2-T-Exos携带的TCR-γδ。总之，这些结果表明Vδ2-T-Exos可以靶向EBV诱导的B细胞淋巴瘤。
实施例2-Vδ2-T-Exos诱导EBV-LCL凋亡
为确定Vδ2-T-Exos是否可以诱导EBV-LCL凋亡，将EBV-LCL或自体正常B细胞用不同浓度的Vδ2-T-Exos处理18小时。如图3A所示，Vδ2-T-Exos以剂量依赖性方式诱导EBV-LCL凋亡，但其对自体正常B细胞没有这种作用。这种凋亡主要由外泌体级分6，7和8诱导(图8C)。Vδ2-T-Exos诱导的EBV-LCL凋亡是胱天蛋白酶依赖性的，如Vδ2-T-Exos处理的EBV-LCL中增加的活性胱天蛋白酶-3表达所证明(图3B)。EBV-LCL比自体正常B细胞具有更高水平的表面Fas和TRAIL受体2(死亡诱导受体，DR5)表达水平(图3C)。Vδ2-T-Exos也携带强大的死亡诱导配体(FasL、TRAIL)(图1E)。通过使用中和抗FasL或抗TRAIL单克隆抗体阻断Fas/FasL或TRAIL/DR5通路显著抑制Vδ2-T-Exos诱导的EBV-LCL凋亡(图3D)，这表明Vδ2-T-Exos诱导的EBV-LCL凋亡至少部分由Fas/FasL和TRAIL/DR5通路介导。
实施例3-Vδ2-T-Exos控制Rag2-/-γc-/-小鼠中的EBV诱导的B细胞淋巴瘤
EGFP+EBV-LCL用于监测EBV诱导的B细胞淋巴瘤的体内生长，并如Xiang等人(2014)所述在Rag2-/-γc-/-小鼠皮下接种EGFP+EBV-LCL进一步建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型(图4A)。然后从第0天开始每周将Vδ2-T-Exos腹腔施用到Rag2-/-γc-/-小鼠中，最多给药10次(图4A)。在接种EGFP+EBV-LCL后，通过体内成像在所有PBS处理的小鼠中检测到实体瘤的快速发展(图4B和4C)。这些肿瘤是免疫母细胞淋巴瘤且来源于人B细胞，如人CD20的阳性染色所证明。小EBV编码的1/2型RNA(EBER-1/2)的高表达表明这些肿瘤是EBV相关淋巴瘤(图4D)。与PBS处理组相比，Vδ2-T-Exos处理显著降低了肿瘤发生率(图4C)。如体内成像分析(图4B)和肿瘤体积(图4E)所证明，Vδ2-T-Exos处理的小鼠的肿瘤生长也受到显著抑制。最重要的是，Vδ2-T-Exos处理显著延长了EBV诱导的B细胞淋巴瘤移植的免疫缺陷小鼠的存活期(图4F)。残留肿瘤的组织学和免疫表型分析发现，Vδ2-T-Exos处理的小鼠比PBS处理的小鼠具有更少的EBV诱导的B细胞淋巴瘤内的Ki-67阳性细胞，表明Vδ2-T-Exos处理的小鼠中的残留肿瘤细胞比PBS处理的小鼠具有更低的增殖能力(图4D)。总之，这些数据表明Vδ2-T-Exos可以控制Rag2-/-γc-/-小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展。
为进一步确定Vδ2-T-Exos是否对EBV诱导的B细胞淋巴瘤具有治疗作用，将EGFP+EBV-LCL植入Rag2-/-γc-/-小鼠(图4G)。14天后，将通过体内成像检测到已发展出皮下肿瘤的小鼠随机分为两组(图4H)。两组之间肿瘤细胞的荧光强度没有显著差异(图4H)。一组荷瘤小鼠从第14天至第77天每周接受Vδ2-T-Exos处理，而另一组荷瘤小鼠接受PBS作为对照(图4G)。PBS处理的小鼠具有逐步生长的皮下肿瘤，并且在EBV-LCL植入后56天内全部死亡(图4I)。重要的是，Vδ2-T-Exos处理显著限制了肿瘤生长(图4J)并提高了小鼠存活率(图4I)。组织学和免疫组织化学分析表明，这些残余肿瘤与EBV相关，因为其表达EBER-1/2(图4K)。此外，PBS处理的小鼠的肿瘤组织中存在大量Ki-67阳性细胞，而Vδ2-T-Exos处理的小鼠的肿瘤组织中只有少数Ki-67阳性细胞(图4K)。这些结果表明，Vδ2-T-Exos可以抑制携带EBV诱导的B细胞淋巴瘤的免疫缺陷小鼠的肿瘤生长。
实施例4–Vδ2-T-Exos控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展
如Xiang等人(2014)和Tu等人所述，产生具有功能性人外周血单核细胞(huPBMC)的稳定重构的人源化小鼠。然后如Xiang等人(2014)所述，通过在人源化小鼠中皮下接种自体EBV-LCL建立EBV诱导的B细胞淋巴瘤模型。接种EBV-LCL后，从第0天至第63天每周将Vδ2-T-Exos腹腔注射到人源化小鼠中(图5A)。与Rag2-/-γc-/-小鼠中的情况相似，所有PBS处理的人源化小鼠在EBV-LCL接种后21天内均出现皮下实体瘤(图5B)。在100天观察期间，Vδ2-T-Exos处理的人源化小鼠的肿瘤发生率显著低于PBS处理的人源化小鼠(图5B)。Vδ2-T-Exos处理有效地抑制人源化小鼠的肿瘤生长(图5C)。最重要的是，Vδ2-T-Exos处理显著延长了人源化小鼠的存活期(图5D)。在PBS处理组中，所有人源化小鼠在EBV-LCL植入后56天内死亡。相比之下，在100天的观察期间，8只Vδ2-T-Exos处理的小鼠中只有3只死亡，其余小鼠仍然存活(图5D)。一致地，这些肿瘤对EBER1/2呈阳性(图5E)。Vδ2-T-Exos处理的人源化小鼠中残留的肿瘤组织中ki-67阳性细胞少于PBS处理的小鼠(图5E)，这表明Vδ2-T-Exos可以抑制体内肿瘤细胞的增殖能力。这些数据表明，Vδ2-T-Exos可以有效控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展。
实施例5-同种异体Vδ2-T-Exos比自体Vδ2-T-Exos对人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤具有更好的治疗效果
由于大多数癌症患者免疫功能低下，因此很难在体外扩增其自身的Vδ2-T细胞并制备足够的Vδ2-T-Exos用于临床。因此，在人源化小鼠中比较了自体和同种异体Vδ2-T-Exos对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的治疗效果(图5F)。如图5G所示，与对照相比，自体和同种异体Vδ2-T-Exos均可在人源化小鼠中控制EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展。重要的是，就肿瘤发生率(图5G)、肿瘤生长(图5H)和小鼠存活率(图5I)而言，同种异体Vδ2-T-Exos在控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展方面比自体Vδ2-T-Exos更有效。此外，同种异体Vδ2-T-Exos处理的人源化小鼠中的肿瘤细胞增殖能力显著低于自体Vδ2-T-Exos处理的小鼠，如同种异体Vδ2-T-Exos处理的小鼠的残留肿瘤中降低的Ki-67表达所证明(图5J)。
免疫荧光分析发现，与用自体Vδ2-T-Exos或PBS处理的那些相比，用同种异体Vδ2-T-Exos处理后更多的CD3 T细胞浸润到肿瘤组织中(图5K)，这表明同种异体Vδ2-T-Exos可增强宿主T细胞介导的抗肿瘤应答。为了证实这一点，在人源化小鼠和Rag2-/-γc-/-小鼠之间比较了同种异体Vδ2-T-Exos对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的治疗效果。用同种异体Vδ2-T-Exos处理在人源化小鼠中比在Rag2-/-γc-/-小鼠中更有效地减少肿瘤发生率(图5G)和肿瘤生长(图5H)，并延长小鼠存活期(图5I)。由于人源化小鼠和Rag2-/-γc-/-小鼠之间的唯一区别是人源化小鼠具有重构的功能性人类免疫细胞，这些结果表明人类免疫细胞，尤其是T细胞，可能参与了Vδ2-T-Exos在人源化小鼠中诱导的抗肿瘤活性。
实施例6-Vδ2-T-Exos诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫。
同种异体Vδ2-T-Exos处理增加了CD3 T细胞在人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤组织中的浸润(图5K)。测试了同种异体Vδ2-T-Exos是否可以诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞介导的针对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的抗肿瘤免疫。CD4 T细胞和CD8 T细胞都可以与Vδ2-T-Exos相互作用，如在暴露于CFSE标记的Vδ2-T-Exos后CD4 T细胞和CD8 T细胞中增加的CFSE信号所证明(图6A和6B)。有趣的是，与对照组相比，同种异体Vδ2-T-Exos显著增加了CD4 T细胞和CD8 T细胞中CCR5的表达(图6C和6D)。在transwell趋化系统中，Vδ2-T-Exos处理显著增加了T细胞向EBV-LCL的迁移，并且这种迁移可以被抗CCR5阻断抗体显著抑制(图5E)。这些结果表明，Vδ2-T-Exos可以通过上调T细胞上CCR5的表达来增加T细胞向EBV诱导的B细胞淋巴瘤组织的浸润。
为比较自体和同种异体Vδ2-T-Exos对T细胞应答的影响，测定了T细胞的增殖和IFN-γ产生。如图6F-6I所示，自体和同种异体Vδ2-T-Exos均可诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞中的细胞增殖和IFN-γ产生。用中和抗LA/DR/DP/DQ或抗CD86单克隆抗体阻断HLA-DR/DP/DQ或CD86通路显著抑制CD4 T细胞中Vδ2-T-Exos诱导的细胞增殖和IFN-γ产生(图10A、10B、10E和10F)，而用其中和单克隆抗体阻断HLA-A/B/C或CD86通路并没有显著影响CD8 T细胞中Vδ2-T-Exos诱导的细胞增殖和IFN-γ产生(图10C、10D、10G和10H)，表明HLA分子和CD86的识别对于Vδ2-T-Exos诱导的CD4细胞应答比Vδ2-T-Exos诱导的CD8细胞应答更重要。重要的是，同种异体Vδ2-T-Exos比自体Vδ2-T-Exos更有效地诱导CD4 T细胞和CD8 T细胞中的细胞增殖和IFN-γ产生(图6F-6I)。因此，同种异体Vδ2-T-Exos比自体Vδ2-T-Exos在体外诱导更强的T细胞应答。
EBV血清阳性的健康个体携带大量EBV特异性T细胞，这些T细胞在控制EBV诱导的淋巴瘤中发挥重要作用。测定了Vδ2-T-Exos对EBV特异性T细胞的影响。如图6J-6K所示，同种异体Vδ2-T-Exos与PBS相比显著促进了EBV EBNA1特异性CD4 T细胞和LMP2a特异性CD8 T细胞克隆的扩增，表明Vδ2-T-Exos还可以促进预先存在的肿瘤抗原特异性T细胞的扩增并增强其对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的治疗效果。
实施例7–CD4 T细胞和CD8 T细胞参与人源化小鼠中Vδ2-T-Exos诱导的抗肿瘤免疫
为进一步阐明CD4 T细胞和CD8 T细胞在同种异体Vδ2-T-Exos介导的体内抗肿瘤免疫中的作用，建立了用EBV血清阳性的全huPBMC、CD4-T细胞耗尽的huPBMC或CD8-T细胞耗尽的huPBMC重构的人源化小鼠。在接种EBV-LCL后，从第0天至第63天每周将同种异体Vδ2-T-Exos腹腔注射到人源化小鼠中(图7A)。与用全huPBMC重构的人源化小鼠相比，就肿瘤发生率(图7B)、肿瘤体积(图7C)和小鼠存活率(图7D)而言，在用CD4-T细胞耗尽的huPBMC或CD8-T细胞耗尽的huPBMC重构的人源化小鼠中，Vδ2-T-Exos介导的抗肿瘤功效显著降低。此外，在CD4-T细胞耗尽的huPBMC和CD8-T细胞耗尽的huPBMC重构的人源化小鼠之间，Vδ2-T-Exos介导的抗肿瘤功效没有差异(图7)。这些结果表明，Vδ2-T-Exos在人源化小鼠中诱导了针对EBV诱导的B细胞淋巴瘤的CD4 T细胞和CD8T细胞介导的抗肿瘤免疫。
实施例8–产生具有增强抗肿瘤活性的更多Vδ2-T-Exos的优化方案
将人外周血缓慢加载到Ficoll-Hypaque(Lymphoprep,Fresenius Kabi NorgeAS,奥斯陆,挪威)以1,000x g不间断梯度离心20分钟。离心后，从血浆层和Ficoll-Hypaque层之间的界面小心分离人外周血单核细胞(huPBMC)。分离的PBMC用PBS洗涤两次，并以300xg的速度离心10分钟以去除残留的Ficoll-Hypaque。huPMBC在补充有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)的RPMI-1640培养基中培养。在第0天和第3天添加PAM，使其浓度达到9μg/ml。从第3天开始，每3天添加重组人IL-2(rhIL-2，Invitrogen)至终浓度为200IU/ml。14-20天后，通过用在不含外泌体的10％FBS-RPMI培养基中的9μg/ml PAM加400IU/ml IL-2再刺激48小时来调理扩增的Vδ2-T细胞。调理后，收获含有外泌体的上清液，并以300x g离心10分钟以沉淀全细胞，以2,000x g离心10分钟以去除死细胞，并以10,000x g离心30分钟以弃去细胞碎片。然后将上清液通过0.22μm注射器过滤，然后以100,000x g超速离心70分钟。将沉淀重悬于PBS中并以100,000x g再次洗涤70分钟。最后，将含有外泌体的沉淀溶解在PBS中，并立即使用或在-80℃下储存。图12显示了来自在调节期间有或无再刺激的Vδ2-T细胞的外泌体的表型(A)、产生(B)和功能(C-E)。
应当理解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且本领域技术人员据此将提出各种修改或变化，上述修改或变化将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何元素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他元素或限制(单独或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案组合，并且所有此类组合均在本发明的范围内且不限于此。
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Claims (38)
1.杀伤或抑制EBV感染的细胞的生长的方法，其包括使所述EBV感染的细胞与有效杀伤或抑制所述细胞的生长的量的来自Vδ2+T细胞的外泌体接触。
2.权利要求1的方法，其中所述EBV感染的细胞是EBV感染的淋巴细胞或EBV感染的上皮细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中所述EBV感染的淋巴细胞是EBV感染的B淋巴细胞。
4.权利要求2的方法，其中所述EBV感染的淋巴细胞是EBV感染的肿瘤性B淋巴细胞。
5.权利要求2的方法，其中所述EBV感染的上皮细胞是EBV感染的肿瘤性上皮细胞。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述外泌体分离自与所述EBV感染的细胞自体同源的Vδ2+T细胞。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述外泌体分离自与所述EBV感染的细胞同种异体的Vδ2+T细胞。
8.治疗EBV诱导的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的来自Vδ2+T细胞的外泌体。
9.权利要求8的方法，其中所述癌症是淋巴细胞起源的或上皮起源的。
10.权利要求9的方法，其中所述淋巴细胞起源的EBV诱导的癌症是EBV诱导的：伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或淋巴组织增生性疾病。
11.权利要求9的方法，其中所述上皮起源的EBV诱导的癌症是EBV诱导的鼻咽癌(NPC)或EBV诱导的胃癌。
12.权利要求8至11中任一项的方法，其中所述外泌体获自所述受试者的Vδ2+T细胞。
13.权利要求8至12的方法，其中所述外泌体获自已知所述受试者没有癌症时所述受试者的Vδ2+T细胞。
14.权利要求8至11中任一项的方法，其中所述外泌体获自与所述受试者同种异体的个体的Vδ2+T细胞。
15.权利要求8至14中任一项的方法，其包括通过选自口服、直肠、鼻腔、局部、颊部、舌下、经皮、阴道、肌内、皮下、静脉内、硬膜外、鞘内和中枢的途径施用所述外泌体。
16.分离Vδ2-T-Exos的方法，其包括以下步骤：
a)提供外周单核细胞(PBMC)，
b)在磷酸抗原和IL-2存在下的培养基中培养所述PBMC第一时间段，
c)在所述第一时间段之后，在磷酸抗原和IL-2存在下的无外泌体培养基中培养所述PBMC第二时间段，
d)在所述第二时间段后从培养上清液中分离外泌体。
17.权利要求16的方法，其中所述PBMC是人PBMC。
18.权利要求16或17的方法，其中所述第一时间段为14至20天。
19.权利要求16至18中任一项的方法，其中所述第二时间段为24至72小时。
20.权利要求16至19中任一项的方法，其中所述分离步骤包括以下中的一种或多种：过滤、离心和超速离心。
21.权利要求16至20中任一项的方法，其中所述磷酸抗原是异戊烯焦磷酸(IPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基-焦磷酸(HMB-PP)、溴醇焦磷酸(BrHPP)、帕米膦酸盐(PAM)、或其任意组合。
22.杀伤或抑制EBV感染的细胞的生长的方法，其包括使所述EBV感染的细胞与有效杀伤或抑制所述细胞的生长的量的根据权利要求16的方法分离的来自Vδ2+T细胞的外泌体接触。
23.权利要求22的方法，其中所述EBV感染的细胞是EBV感染的淋巴细胞或EBV感染的上皮细胞。
24.权利要求22或23的方法，其中所述EBV感染的淋巴细胞是EBV感染的B淋巴细胞。
25.权利要求23的方法，其中所述EBV感染的淋巴细胞是EBV感染的肿瘤性B淋巴细胞。
26.权利要求23的方法，其中所述EBV感染的上皮细胞是EBV感染的肿瘤性上皮细胞。
27.权利要求22至26中任一项的方法，其中所述外泌体分离自与所述EBV感染的细胞自体同源的Vδ2+T细胞。
28.权利要求22至26中任一项的方法，其中所述外泌体分离自与所述EBV感染的细胞同种异体的Vδ2+T细胞。
29.治疗EBV诱导的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求16的方法分离的来自Vδ2+T细胞的外泌体。
30.权利要求29的方法，其中所述癌症是淋巴细胞起源的或上皮起源的。
31.权利要求30的方法，其中所述淋巴细胞起源的EBV诱导的癌症是EBV诱导的：伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或淋巴组织增生性疾病。
32.权利要求30的方法，其中所述上皮起源的EBV诱导的癌症是EBV诱导的鼻咽癌(NPC)或EBV诱导的胃癌。
33.权利要求29至32中任一项的方法，其中所述外泌体获自所述受试者的Vδ2+T细胞。
34.权利要求29至33的方法，其中所述外泌体获自已知所述受试者没有癌症时所述受试者的Vδ2+T细胞。
35.权利要求29至32中任一项的方法，其中所述外泌体获自与所述受试者同种异体的个体的Vδ2+T细胞。
36.权利要求29至35中任一项的方法，其包括通过选自口服、直肠、鼻腔、局部、颊部、舌下、经皮、阴道、肌内、皮下、静脉内、硬膜外、鞘内和中枢的途径施用所述外泌体。
37.组合物，其包含根据权利要求16的方法分离的来自Vδ2+T细胞的外泌体和药学上可接受的载体。
38.权利要求37的组合物，其被配制用于通过选自口服、直肠、鼻腔、局部、颊部、舌下、经皮、阴道、肌内、皮下、静脉内、硬膜外、鞘内和中枢的途径施用于受试者。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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