KR102028340B1 - 항원-특이적 t 세포의 증식 방법 - Google Patents

항원-특이적 t 세포의 증식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양이 있는 환자에게 투여하기에 적합한 유전자 변형된 T 세포를 프라이밍하기 위한 생체외 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 획득되는 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항원-특이적 T 세포의 증식 방법 {METHOD FOR PROLIFERATION OF ANTIGEN-SPECIFIC T CELLS}
본 발명은 면역학 분야 및 암의 치료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 유전자 변형된 항원 특이적 T 세포의 활성화 방법 및 상기 방법에 의하여 생성된 유전자 변형된 T 세포에 관한 것이다.
T 세포는 감염된 세포를 인식하고 이들 표적 세포를 사멸시킴으로써 질병의 시작을 방지한다. 그러나, 종양 또는 병원균과 면역 체계의 상호작용은 특이적 T 세포의 존재 하에 발전되는 암 또는 만성 감염에 의하여 증명되는 바와 같이 복잡하므로, 병원균 또는 종양은 분명 T-세포의 감시를 피할 수 있었다.
어떠한 병원균의 침입이라도 거의 탐지하는 T 세포의 능력은 그의 월등히 다양한 수용체 레퍼토리에 의하여 부여되는 것으로, 이는 T-세포 풀(pool)로 하여금 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의한 제시에 따라 방대한 수의 펩티드를 인식하도록 허용한다. 그럼에도, 공동자극 분자가 증식, 생존, 및 분화(신호 2)에 필수불가결한 신호를 제공하기 때문에, T-세포 수용체(TCR)(신호 1)를 통한 신호는 적절한 T-세포 활성화에 충분하지 않다. 사실상, 신호 2가 없이 신호 1만을 수신하는 미접촉 T 세포는 무력화(무반응성)되거나 또는 세포 사멸을 통하여 죽게 된다. 완전한 T-세포 활성화를 위해서는 신호 1 및 2의 통합이 요구되며, 이들 신호의 강도는 그에 따른 T-세포 풀의 크기를 형성한다. 더욱이, 효과기 T 세포로의 완전한 분화는 일반적으로 제 3 신호에 의존하며, 이는 항원-제시 세포(APC)에 의하여 가용성 형태로 공급되고 요구되는 효과기 T 세포 유형에 대하여 유익한 신호를 제공한다. 이러한 '3개-신호' 개념은 미접촉 T 세포의 활성화 및 이어지는 효과기 T 세포의 형성에 대한 모델을 제시한다. 그러나, 상기 면역 체계는 과다한 다양한 공동자극 분자를 제공하며, 이들 다양한 유형의 신호 2 및 3은 모두 그들 자신의 독특한 방식으로 상기 T-세포 반응의 질에 기여한다.
공동자극 신호 및 신호 3의 가용성 형태는 생존, 세포 주기 연쇄, 개발될 효과기 세포의 유형, 및 효과기 또는 기억 세포로의 분화와 같은 T-세포 활성화의 특정 양상에 대하여 작용가능하다.
현재, 장기 지속 기억 CD8+ T 세포를 유도하기 위해서는, 성숙한 항원-제시 수지상 세포(DCs)가, CD4+ T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함하여 기타 림프구에 의하여 “도움(help)”을 받아야 한다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 이러한 “도움”은 성숙한 DCs가 더욱 분화됨, 라이센싱(licensing)으로 주지된 공정을 유도한다. "헬퍼(helper)" 신호는 공동자극 분자의 상향조절, 사이토카인의 분비, 및 여러 항세포자멸 분자의 상향조절을 포함하여 DCs에 대한 많은 효과를 가지며, 이들 효과는 모두 관련이 있는 T 세포, 특히 CD8+ T 세포를 최적으로 활성화하기 위하여 DCs의 능력을 점증적으로 강화한다. 더욱이, "헬퍼" 림프구 또한 T 세포의 생존, 세포 주기 연쇄, 발전될 효과기 세포의 유형, 및 효과기 또는 기억 세포로의 분화에 직접적으로 영향을 미치는 발현 또는 분비 인자가 될 수 있다.
바이러스 감염 또는 공격적인 암과 싸우기 위한 전략의 하나는 입양 T-세포 치료가 될 수 있는데, 이는 숙주 내에서 효과기 T 세포의 전달로 하여금 특이적 T-세포 반응을 회복되게 한다. 입양 세포 전달 치료는 생체 외 활성화되고 확대된 자가 바이러스-반응성 T 세포를 투여하는 것이다. 원하는 특이성 T 세포를 얻기 위한 최근의 기술 개발은 상이한 임상 환경에서 입양 T-세포 치료의 사용에 대한 관심을 증가시켰다. 입양 세포 전달 치료는 생체 외 활성화되고 확대된 자가유래 종양-반응성 T 세포를 투여하는 것이다. 암 치료에 있어서 입양 세포 전달 치료의 사용에는 몇 가지 잠재적 이점이 있다. 종양 특이적 T 세포는 종양의 면역성 특성과는 별도로, 생체 외에서 다수로 활성화 및 팽창될 수 있고, T 세포의 기능적 및 표현형 특질은 입양 전달(adoptive transfer)에 우선하여 선택될 수 있다.
입양 전달 이후에, 진행된 종양의 소멸을 유발시키기 위해 T 세포에 대해 몇 가지 이벤트가 발생되어야 한다. 보다 구체적으로: - T 세포가 항원 특이적 재자극을 통해 생체 내 활성화되어야 하고, - 그 후 T 세포가 심각한 종양적하(tumor burdens)의 파괴를 유발시킬 수 있는 레벨로 확대되어야 하며, - 항종양 세포가 모든 종양 세포의 박멸을 완료하기에 충분할 정도로 장기간 생존하여야 한다.
이전에는, 고형 종양이 있는 환자에게 입양 전달을 위한 세포를 선택하는 데에 사용했던 기준이 공동배양에 따라 IFN-γ를 분비하고 종양 세포를 사멸시키는 항종양 T 세포의 능력이었다. 그러나, 현재 이러한 기준만으로는 생체 내 효험을 예측하지 못한다는 것이 확실하다. Gattinoni 등, J. Clin. Invest. 115:1616-1626(2005)는 완전한 효과기 특질을 획득하고 생체 외 증가된 항종양 반응도를 보이는 CD8+ T 세포가 생체 내 종양 소멸 및 치료 시 덜 효과적이라는 것을 발견했다.
종래기술에 따른 방법은 임상적으로 종양 특이적 세포독성 T 세포의 적절한 수준에 도달하기 위해 1회 이상의 재자극을 필요로 한다. 예를 들어, Ho 등(Journal of Immunological Methods, 310(2006), 40-50) 및 Gritzapis 등(J. Immunol., 2008: 181;146-154)을 참조하면, 약 19%의 종양 특이적 CD8+ T 세포 수준에 도달하기 위해서 1 내지 2회의 재자극이 필요했다. 재자극은 상기 세포로 하여금 덜 활성화되게 하고 세포사멸에 더 가깝게 한다.
1차 인간 림프구로 유전자를 전달하는 것은 항종양 특이성을 갖는(유전)공학 세포(engineered cell)를 부여할 수 있는 종양 항원 수용체 분자의 도입을 허용한다(Vera et al ., Curr Gene Ther . 2009;9:396-408.; Sadelain et al ., Nat Rev Cancer. 2003;3:35-45; Murphy et al ., Immunity . 2005;22:403-414). 자가유래인 말초혈액 림프구(PBLs)는 종양 항원-반응성 T-세포 수용체(TCR)를 발현하도록 변형될 수 있다. Yang 등(J. Immunother., 2010, vol. 33;648-658)은 생체 외 형질도입에 의하여 항종양 T 세포를 발생시키는 방법을 개시한다. 이들은 항종양 T-세포 항원 수용체(TCRs)를 발현하기 위하여 CD8+ T 세포를 유전적으로 변형시키는 티바이러스 매개된 시스템을 이용한다. CD8+ T 세포를 효율적으로 확대하기 위하여, 동종이계 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)로부터 조사된 지지 세포(feeder cell) 플러스 항-CD3 항체로 이루어지는 급속한 확대 프로토콜(Ridell et al, US patent No 5,827,642; 1998)이 이용되었다. 그러나, T 세포의 생체 외 확대에 있어서 효율이 매우 높더라도, 상기 REP 프로토콜은 보통 재주입 이후의 생존 및 확대를 위한 차선의 능력을 갖는 T 세포를 유도한다(Robbins et al, Journal of Immunology, 2004, 173:7125-30).
그러므로, 재주입 이후 항원-특이적 T 세포의 증식 및 생존을 증가시키는 입양 면역치료에서 사용하기 위한 T 세포 집단의 생성 방법에 대한 요구가 크다.
개요
본 발명은 종양이 있는 환자에게 투여하기에 적합한 유전자 변형된 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 프라이밍을 위한 생체 외 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료받을 환자로부터의 항원 수용체 발현 표적 T 세포, 수지상 세포, 항-CD3 항체 및 항원 제시 세포(APCs) 상에서 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 항원에 대항하여 감작된 림프구를 공-배양하는 것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 획득가능한 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 및 그의 용도에 관한 것이다.
도 1은 종래의 MLR(= allo-sensitized allogeneic lymphocytes: 이하 ASAL)에서 조사된 동종이계 말초혈액 단핵구 세포(PBMCs) 상에 발현되는 MHC 항원에 대해 감작된 림프구가 ASAL의 프라이밍에 사용되었던 조사된 PBMC에 대해 자가유래인 공-배양된 성숙한 단핵구-유래 DCs 상에 CD70의 발현을 현저하게 향상시키는 것을 도시한다.
도 2는 감마-조사된 ASALs이 상기 ASAL의 프라이밍에 이용되는 조사된 PBMCs에 대해 자가유래인 공-배양된 성숙한 단핵구-유래 DCs 상에 CD70의 발현을 향상시키는 것을 도시한다.
도 3은 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 이용되는 조사된 PBMCs에 대해 자가유래인 단핵구-유래 DCs와 공-배양 하는 것이 실질적인 IL-12의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 4는 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 이용되는 조사된 PBMCs에 대해 자가유래인 단핵구-유래 DCs와 공-배양 하는 것이 실질적인 IFN-감마의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 5는 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 이용되는 조사된 PBMCs에 대해 자가유래인 단핵구-유래 DCs와 공-배양 하는 것이 실질적인 IL-2의 생성을 유도하는 것을 도시한다.
도 6은 성숙한 단핵구-유래된 DCs를 CD4+, CD8+ 또는 CD56+ 림프구가 대폭 감소된 ASALs와 공-배양한 결과로서, IL-2, IL-12 및 IFN-감마의 생성을 도시한다.
도 7은 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 이용되는 조사된 PBMCs에 대해 자가유래인 단핵구-유래 DCs와 공-배양 하는 것이 비-감작된 동종이계 CD8+ T 세포의 증식 반응을 증가시키는 것을 도시한다.
도 8은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 1차 자극 동안, 조사된 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 단핵구-유래된 DCs에 추가하는 것이, 1차 표적 세포 자극 동안 사용된 상기 DCs에 자가유래되는 B-세포로써 CD27-발현 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 재-자극될 때, 상기 CD27-발현 동종반응성 CD8+ 표적 세포의 수를 증가시킨다는 것을 도시한다.

도 9는 동종이계 CD8+ 표적 세포의 1차 자극 동안, 조사된 상기 ASALs를 ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 상기 조사된 PBMCs에 추가하는 것이, 1차 표적 세포 자극 동안 사용된 상기 DCs에 자가유래되는 B-세포로써 세포자멸(아넥신-V-양성) 표적 세포가 재-자극될 때, 상기 세포자멸(아넥신-V-양성) 표적 세포의 수를 증가시킨다는 것을 도시한다.
도 10은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 1차 자극 동안, 조사된 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 조사된 단핵구-유래된 DCs에 추가하는 것이, 1차 표적 세포 자극 동안 사용된 상기 DCs에 자가유래되는 B-세포로써 이들 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 재-자극될 때, 더욱 강한(6-배) 2차 증식성 반응을 유도한다는 것을 도시한다.
도 11은 동종이계 CD8+ 표적 세포의 1차 자극 동안, 조사된 ASALs를 상기 ALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 조사된 단핵구-유래된 DCs에 추가하는 것이, 1차 표적 세포 자극 동안 사용된 상기 DCs에 자가유래되는 B-세포로써 이들 동종반응성 CD8+ 표적 세포가 재-자극될 때, IFN-감마 생성의 실질적인 증가를 유도한다는 것을 도시한다.
도 12는 조사된 ASALs를 상기 ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 성숙한 단핵구-유래된 DCs에 추가하는 것이, 항-CD3 항체에 대하여 Fc-감마 수용체인 DCs 발현 CD64의 수를 강화한다는 것을 도시한다.

도 13은 12일 동안 OKT3(항-CD3 항체) 및 IL-2로 배지보충된 성숙한 DCs 및 조사된 ASALs로써 CD3+ 표적 T 세포(비-감염됨)를 공-배양 및 확대시키는 ASAL 프로토콜이, REP 프로토콜로 확대된 T 세포에 비하여 세포사멸-유도 H2O2 처리에 대하여 저항성이 더욱 큰 T 세포를 유도한다는 것을 도시한다.
도 14는 12일 동안 OKT3(항-CD3 항체) 및 IL-2로 배지보충된 성숙한 DCs 및 조사된 ASALs로써 CD3+ 표적 T 세포(비-감염됨)를 공-배양 및 확대시키는 ASAL 프로토콜이, REP 프로토콜로 확대된 T 세포에 비하여 세포사멸-유도 독소루비신 처리에 대하여 저항성이 더욱 큰 T 세포를 유도한다는 것을 도시한다.
도 15는 교모세포종 암 세포 상에 발현된 GD2 항원에 대항하여 키메릭 항원 수용체(CAR)를 이용한 CD3+ T 세포(>40 % 감염된 세포)의 효율적인 렌티바이러스 형질주입을 도시한다.
도 16은 표준 REP 프로토콜에 비교하여 ASAL 프로토콜이 CAR-감염된 CD3+ T 세포의 유사한 확대를 유도함을 도시한다.
도 17은 표준 REP 프로토콜에 비교하여 ASAL 프로토콜이 CAR-감염된 CD3+ T 세포를 우선적으로 확대함을 도시한다.
도 18은 표준 REP 프로토콜에 비교하여 ASAL 프로토콜이 CD27-발현 CAR-감염된 CD3+ T 세포를 비슷한 수로 또는 더 큰 수로 유도함을 도시한다.
도 19는 REP 프로토콜로 확대된 CAR-감염된 T 세포의 특이적 사멸 능력에 유사한 GD2-발현 종양 세포의 특이적 사멸 능력으로 ASAL 프로토콜이 CAR-감염된 T 세포를 확대함을 도시한다. 무관한 T2 세포를 조절 표적으로서 사용하였다. 다이아몬드(◆) = REP 대 GD2-음성 표적; 사분면(■) = ASAL 대 GD2-음성 표적; 삼각형(▲) = REP 대 GD2-발현 적 세포; 엑스(X) = ASAL 대 GD2-발현 표적.
도 20은 CD107a(용해미립 엑소시토시스의 표지자)의 막 발현에 의하여 측정된 바, CAR-감염된 T 세포 내 종양-특이적 세포독성이, REP 프로토콜로 확대된 CAR-감염된 T 세포에 비하여 상기 CAR-감염된 T 세포가 상기 ASAL 프로토콜로 확대되었을 때, 강력한 종양-유래된 억제 인자(IL-10, TNF-베타 및/또는 H2O2)에 대하여 더욱 저항성이 크다는 것을 도시한다. 흑색 컬럼 = REP로 확대된 T 세포; 백색 컬럼 = ASAL 프로토콜로 확대된 CAR 감염된 T 세포.
도 21은 표적 세포의 상호작용 및 사멸 이후에, CAR-감염된 T 세포의 증식성 반응이, REP 프로토콜로 확대된 CAR-감염된 T 세포에 비하여, 상기 CAR-감염된 T 세포가 ASAL 프로토콜로 확대되었을 때, 강력한 종양-유래된 억제 인자에 대한 노출에 더욱 저항성이 크다는 것을 도시한다. A. 면역억제력 없음; B: IL-10/TGF-베타 처리; C. H202 처리; D: IL-10/TGF-베타 및 H202 처리.
정의
본 발명의 설명에 앞서, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위 및 그의 등가물에 의해서만 한정될 것이므로, 여기서 사용된 전문용어는 특정 실시예를 기술하기 위한 목적 이외에 제한적 의미로 의도되지 않은 것임을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바, 단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형도 포함하는 것임을 유념하여야 한다.
또한, "약"이라는 용어는 적용가능한 경우, 소정의 값의 +/- 2%의 편차, 바람직하게는 +/- 5%, 그리고 가장 바람직하게는 상기 수치 값의 +/- 10% 편차를 나타내기 위해 사용된다.
본 발명에서, "항원-특이적(antigen-specific)"이라는 용어는 자기의 MHC 분자 상에 제시되는 짧고 독특한 펩티드 서열의 독특한 T 세포 수용체(TCR)에 의한 특이적 인식/결합에 관한 것이다.
본 발명에서, "프라이밍(priming)" 및 "활성화(activation)"라는 용어는 "헬퍼(helper)" 세포의 동시 발생 유무에 따라 항원-제시세포에 의해 자극되는 미접촉 항원-특이적 T 세포에서 일어나는 프로그램된 활성화 과정에 관한 것이다.
본 발명에서, "응답(responder)세포 "라는 용어는 활성화 및/또는 증식에 의해 공-배양된 동종이계 PBMCs에 응답하는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함하지만 그에 한정되지 않는 상이한 림프구 아형 집단에 관한 것이다.
본 발명에서, "감작 세포(sensitized cell)"라는 용어는 PBMCs를 포함하여, 공-배양된 동종이계 세포에 의해 예비-활성화된 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함하는 상이한 림프구 아형 집단에 관한 것이다.
본 발명에서, "표적 세포(target cell)"라는 용어는 동종이계 또는 자가유래인 APCs에 의해 자극되는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 관한 것이다. 환자 림프구(표적 세포) 채집의 위치는, 예를 들면, 말초 혈액, 종양, 종양-배액림프절(TDLN) 또는 골수일 수 있다.
본 발명에서, 단핵구-유래된 DCs와 관련된 "성숙한(mature)"이라는 용어는 LPS와 같은 미생물제제 또는 TNF-알파 및/또는 IL-1 베타와 같은 또는 염증 매개체와 함께 미성숙한 DCs의 자극에 의해 유도되는 CD40, CD86, CD83 및 CCR7를 포함하지만 그에 한정되지 않는 "성숙기-표지자(maturity-marker)"의 발현에 관한 것이다.
미성숙한 DCs는 높은 식작용 활성 및 낮은 T-세포 활성화 포텐셜을 특징으로 하는 세포이다. 미성숙한 DCs는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원균에 대하여 주변환경을 끊임없이 조사한다. 미성숙한 DCs는 병원균을 식균하고 그들의 단백질을 작은 조각으로 분해하며 성숙에 따라 MHC 분자를 이용하여 그들의 세포 표면에 절편(fragments)을 제시한다. 동시에, 그들은 T-세포를 활성화하는 능력을 매우 강화시키는 CD80, CD86, 및 CD40과 같은 T-세포 활성화에 있어서 보조수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향조절한다. 그들은 또한 수지상 세포로 하여금 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 또는 림프계를 통해 림프절로 이동하도록 유도하는 화학주성 수용체인 CCR7을 상향조절한다. 여기에서, 그들은 항원-제시 세포로서의 역할을 하는데: 그들은 비-항원 특이적 공동자극 신호와 함께 병원균으로부터 유래된 항원을 그들에게 제시함으로써 헬퍼 T-세포 및 킬러 T-세포 뿐만 아니라 B-세포를 활성화시킨다. 성숙한 DCs는 단핵구, 체내에서 순환하는 백혈구로부터 유래될 수 있고, 바른 신호에 따라, DCs 또는 대식세포로 변할 수 있다. 단핵구는 결국 골수 내 줄기세포로부터 형성된다. 단핵구-유래 DCs는 말초혈액 단핵구로부터 체외 생성가능하다.
본 발명에서, 세포의 "비-증식성"(non-proliferative)"이라는 용어는 자손을 형성하기 위한 세포분열이 불가능해진 세포를 나타내는 데에 사용된다. 그럼에도 불구하고, 상기 세포는 자극, 또는 사이토카인(cytokine)과 같은 세포 생성물의 생합성 및/또는 분비에 반응할 수 있다. 세포를 비증식성으로 만들기 위한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 세포를 비-증식성으로 만들기 위한 바람직한 방법은 미토마이신 C(mitomycin C)와 같은 항-증식성 약물, 또는 감마선 조사(gamma irradiation)와 같은 방사선요법으로 치료하는 것이다. 고정되거나 침투가능하게 되었으며 분열이 불가능한 세포 또한 비-증식성 세포의 예이다.
본 발명에서, "혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)", "혼합 림프구 배양(mixed lymphocyte culture)", "MLR" 및 "MLC"라는 용어는 동종이형으로 상이한 최소 두 개의 상이한 세포 집단으로 이루어지는 혼합체를 언급하기 위해 통용된다. 적어도 하나 이상의 동종이형으로 다른 세포는 림프구이다. 상기 세포는 림프구의 자극을 유발시키기 위해 한동안 적절한 조건 하에서 함께 배양된다. MLR의 빈번한 목적은 림프구를 증식을 초기화시킬 수 있는 바와 같은 동종이계 자극(동종geneic stimulation)을 제공하는 것이다; 그러나, 달리 지시되지 않는 한, 배양 동안의 증식은 요구되지 않는다. 적당한 문맥에서, 이들 용어들은 양자택일적으로 이러한 배양으로부터 유래된 세포의 혼합체를 의미할 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "처리(treatment)"라는 용어는 치료받을 개인이나 세포의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도에 있어서 임상적 개입을 칭하며, 예방을 위하여 또는 임상병리학 과정 중에 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 질병의 발병 또는 재발 방지, 질병 증상의 완화, 및 질병의 직간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질병 진행률의 저하, 질병 상태의 개선이나 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다.
"항원-제시 세포(antigen-presenting cell(s))", "APC" 또는 "APCs" 라는 용어는 온전한 전체 세포뿐만 아니라, 바람직하기로는 클래스 I MHC 분자와 연합된, 하나 이상의 항원의 제시를 유도할 수 있는 기타 분자(모든 동종이계 유래) 및 동종이계 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 유형의 단핵구 세포 모두를 포함한다. 바람직하기로는 전체 생세포는 APCs로서 사용된다. 적절한 APCs의 예로는 단핵구, 대식세포, DCs, 단핵구-유래된 DCs, 대식세포-유래된 DCs, B 세포 및 골수성 백혈병 세포, 예를 들면, 세포주(cell lines) ΤHΡ-1, U937, HL-60 또는 CEM-CM3과 같은 전체 세포가 있으나 이에 한정되지 않는다. 골수성 백혈병 세포는 소위 예비-단핵구를 제공한다.
"암(cancer)", "신생물(neoplasm)" 및 "종양(tumor)"이라는 용어는 발명의 상세한 설명 및 특허청구의 범위에서 나타내는 바와 같이 단수형이나 복수형으로 통용될 수 있고, 숙주 개체에 대해 병리학적으로 되도록 하는 악성 변환을 겪는 세포를 칭한다. 1차 암세포(즉, 악성 변환 위치 근처에서 얻어진 세포)는, 잘 정착된 기술, 특히 조직학적 검사에 의하여 암화되지 않은 세포로부터 쉽게 구별될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 암세포의 정의는 1차 암세포 뿐만 아니라 암세포 조상으로부터 유래된 어떠한 세포도 포함한다. 이는 전이된 암세포 및 생체외 배양 및 암세포로부터 유래된 세포주를 포함한다. 보통 고형 종양으로 나타나는 암의 유형을 언급할 때, "임상적으로 감지할 수 있는" 종양은 종양덩어리를 기반으로 감지되는 것으로; 예를 들면, 씨티 촬영, 자기공명화상법(MRI), 엑스레이, 초음파검사 또는 촉지와 같은 과정에 의한 것이다. 본 발명에 관련된 종양/암의 비-제한적인 예로는 상피성 암(예를 들면, 유방암, 전립선암, 폐암, 직장암, 신장암, 위암 및 췌장암), 육종(예를 들면, 골암 및 활막암), 신경-내분비 종양(예를 들면, 교모세포종, 수모 세포종 및 신경모세포종), 백혈병, 림프종 및 편평상피 세포암(예를 들면, 자궁경부암, 질암 및 구강암)이 있다. 또한, 본 발명에 관련된 종양/암의 비-제한적인 예로는 신경교종, 섬유모세포종, 신경성 육종, 자궁암, 흑색종, 고환 종양, 성상세포종, 이소성 호르몬생산 종양, 난소암, 방광암, 빌름스 종양, 위장췌장 신경내분비 종양, 두경부 편평상피암, 식도암, 또는 전이암이 있다. 특히, 전립선암 및 유방암이 바람직하다.
본 발명에서 "배양(culturing)"이라는 용어는 다양한 종류의 배지에서의 세포 또는 유기체의 생체외 증식을 의미한다. 배양으로 성장된 세포의 후손은 친세포와(형태상으로, 유전적으로, 또는 표현형적으로) 완전히 동일하지 않을 수도 있다고 이해되고 있다. 적합한 배양 배지는 당업자에 의해 선택이 가능하며, 그러한 배지의 예로는 RPMI 배지 또는 이글의 최소 필수 배지(Eagles Minimal Essential Medium EMEM)가 있다.
"주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex)" 및 "MHC"라는 용어는 T 세포에 대한 항원 제시 및 급속한 이식편 거부반응에 요구되는 세포-표면 분자를 인코딩하는 유전자 복합체를 칭한다. 인간에 있어서, MHC 복합체는 또한 HLA 복합체라고도 공지되어 있다. MHC 복합체에 의해 인코딩되는 단백질은 "MHC 분자"라고 공지되어 있고, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 분류된다. 클래스 I MHC 분자는 베타2-마이크로글로불린(ß2-microglobulin)과 비-공유 결합으로 연관되는 MHC에서 인코딩되는 사슬로 구성되는 막 이종이량체 단백질을 포함한다. 클래스 I MHC 분자는 거의 모든 유핵세포에 의하여 발현되고 CD8+ T 세포에 대한 항원 제시에서 기능하는 것으로 나타났다. 클래스 I 분자는 인간에 있어서 HLA-A, -B, 및 -C를 포함한다. 클래스 I 분자는 일반적으로 길이에 있어서 펩티드 8-10 아미노산을 결합한다. 클래스 II MHC 분자 또한 막 이종이량체 단백질을 포함한다.
클래스 II MHCs는 CD4+ T 세포에 대한 항원 제시에 참여하는 것으로 알려져 있고, 인간에 있어서 HLA-DP, -DQ, 및 DR을 포함한다. 클래스 II 분자는 일반적으로 길이에 있어서 펩티드 12-20개의 아미노산 잔기를 결합한다. "MHC 제한(MHC restriction)"이라는 용어는 T 세포가 항원이 처리된 이후에만 항원을 인식하도록 하는 T 세포의 특성을 칭하고, 그 결과적인 항원성 펩티드는 자기 클래스 I 또는 자기 클래스 II MHC 분자와 연관되어 표시된다.
여기에서 "백신(vaccine)", "면역원(immunogen)", 또는 "면역성 조성물(immunogenic composition)"이라는 용어는 사람 또는 동물 대상에 투여될 때 어느 정도의 특이면역을 부여할 수 있는 화합물 또는 조성물을 칭하는 데에 사용된다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 "세포성 백신(cellular vaccine)"또는 "세포성 면역원(cellular immunogen)"은 적어도 하나의 세포 집단으로 이루어지는 조성물을 칭하며, 이는 유효성분으로서 선택적으로 비활성화된다. 본 발명의 면역원 및 면역성 조성물은 활성이고, 이는 면역원 및 면역원성 조성물이 숙주의 면역 체계에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 특이적 면역 반응(항-종양 항원 또는 항-암 세포 반응과 같은)을 자극할 수 있음을 의미한다. 상기 면역 반응은 항체,(헬퍼/유도물질 또는 세포독성 세포와 같은) 면역 반응성 세포, 또는 그의 조합으로 이루어질 수 있고, 바람직하기로는 치료가 행해지는 종양 상에 제시되는 항원에 대해 행해진다. 상기 반응은 일회 또는 반복 투여함으로써 대상에서 유도되거나 재자극될 수 있다.
화합물 또는 조성물은: a) 미접촉 개체에서(종양 항원과 같은) 항원에 대항하여 면역 반응을 생성하거나; 또는 b) 상기 화합물 또는 조성물이 투여되지 않았을 경우 일어날 수 있는 것 이상으로 개체에서 면역 반응을 재구성, 증진 또는 유지할 수 있는 경우에 "면역성(immunogenic)"이다. 조성물은 일회 또는 반복 투여될 때 이들 기준 중 어느 하나에 이를 수 있는 경우 면역성이다.
설명
본 발명은 항-CD3 항체와의 조합으로 수지상 세포(DCs)를 포함하며, 항원-제시 세포에 의한 활성화 동안 항원-특이적 T 세포의 증가된 증식 및 생존을 촉진하기 위하여 동종-감작된 동종이계 림프구(ASALs)의 생성에 관한 것이다.
본 발명은 항원 특이적 인간 CD8+ T 세포 반응의 유도에 있어서 ASALs에 대한 양성 조절 역할이 입증된 건강한 혈액 공여자로부터의 말초혈액 단핵구 세포(PBMCs) 및 그의 아형 집단을 사용하는 생체외 연구에 기초한다. 동종 체외 모델을 이용할 때, ASALs의 존재 하에서 동종반응성 CD8+ T 세포의 증식 및 생존을 지켜보면, 재-자극 이후 증식 능력은 5배 이상 증가했고 신경세포사(apoptotic cell death)는 10%에서 5%로 감소했다.
항원-특이적 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 종양 항원 수용체를 인코딩하는 유전자의 형질도입 또는 형질주입을 통하여 생체외 발생이 가능하다. 본 발명은 표적 항원을 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메릭 항원-수용체(CAR)를 발현하기 위하여 공학적으로 개발된 T 세포(바이러스 형질도입, 형질주입, 전기천공법 또는 기타 유전형질 도입 방법에 의하여)로 이루어지고; 감작된 동종이계 림프구 및 항-CD3 항체의 존재 하에 DCs로 이들 공학적으로 개발된 T 세포를 활성화하며; 배양에서 이들 세포를 확대하고; 그리고 이들 세포를 다시 환자에게 재도입하기 위한, 입양 면역치료에 사용하기 위한 T 세포 집단을 준비하기 위한 방법에 관한 것이다.
ASALs의 추가는 항원-제시 DCs 상에 강하게 상향 조절된 공동-자극기 분자 CD70의 발현을 이끌어내고, 유형 1 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 몰입된 T 세포 상에 주지의 양성적인 영향을 갖는 2개의 인자, IL-12 및 IFN-감마의 생성을 이끌어낸다. 더욱이, ASALs의 추가는 또한 T 세포에 대한 주지의 성장 인자인 IL-2의 생성을 이끌어냈다. 특히, CD70-매개된 상호작용은 수차례의 분할을 통하여 활성화된 T 세포의 생존을 도모하고, 그리하여 효과기 T 세포의 축적에 기여한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 종양이 있는 환자에게 투여하기에 적합한 유전자 변형된 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 프라이밍을 위한 생체외 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료받을 환자로부터의 종양 항원 수용체를 발현하는 표적 T 세포를 항원 제시 세포(APCs) 상에서 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 항원에 대항하여 감작된 림프구 및 항-DC3 항체와 공배양하는 것으로 이루어지며, 여기에서 상기 APCs는 바람직하기로는 상기 림프구에 대하여 동종이계이며, 상기 수지상 세포는 바람직하기로는 단핵구 유래된다. 항-CD3 항체의 추가는 항체-무장된 수지상 세포로 하여금 CD3-발현 T 세포와 직접적으로 상호작용하며 이를 활성화할 수 있도록 하는 Fc/Fc-수용체 상호작용에 의하여 상기 수지상 세포에 이들이 결합되도록 한다.
표적 T 세포는 T 세포 수용체(TCR) 코딩 유전자로써 또는 양자택일적으로 자극적 신호를 T 세포에 비-MHC-제한 방식으로 릴레이시킬 수 있는 키메릭 항원 수용체(CAR)의 사용을 통하여 변형될 수 있다. 세포내 T-세포 활성화 도메인에 융합된 세포외 항원 인식 도메인으로 구성되는 이들 잡종 단백질은, 그러므로, 이들의 인간 백혈구 항원 유전자형에 관계없이 환자에게 사용될 수 있다. 유전자 형질전환에 앞서, 상기 표적 T 세포는 바람직하기로는 후속적인 형질전환을 최적화하기 위하여 항-CD3 항체로 예비-자극된다. 임의의 적합한 CAR가 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 CAR 리간드는 상기 종양 세포에 의하여 발현되어야 한다. 적합한 CAR의 선택 및 준비는 당업자의 기술 범위 이내이다. CAR 리간드의 비-제한적인 예로는 VEGFR-2(혈관 내피 성장 인자 수용체-2), Her2/neu, CEA(암태아성 항원), CD19, CD20 및 GD2(강글리오사이드 항원)이 있다.
TCR- 또는 CAR-코딩 유전자를 T 세포 내로 유전자 형질 전환하는 것은 형질주입 또는 형질도입(예룰 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1 -3, Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 참조)과 같은 당업자에 주지된 임의의 적합한 방법을 사용함으로써 수행가능하다. 형질주입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어질 수 있다. 비-제한적인 바이러스 벡터의 예에는 레트로, 렌티, 아데노, 아데노-연관 바이러스 벡터가 포함된다. 형질도입에는 플라스미드 및 트랜스포존/트랜스포사제 시스템의 전기이동 및 마이크로-인젝션이 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
ASALs는 혼합 백혈구반응으로부터 얻어지는 응답 세포이며, 이어서 항-CD3 항체를 포함하는 배양 배지에서 수지상 세포 및 표적 세포와 함께 배양된다. 표적 T 세포가 유전적으로 조작될 때, 항-CD3 항체 또한 상기 배양에 추가된다. ASALs는 상기 환자에 대하여 그리고 상기 수지상 세포에 대하여 자가유래 또는 동종이계로 될 수 있다. 상기 수지상 세포는 치료받을 환자에 대하여 그리고 ASALs의 1차 MLR-유도된 활성화에 사용되는 자극기 세포에 대하여 자가유래 또는 동종이계로 될 수 있다. 상기 ASALs는 CD4+ T 세포를 포함하는 말초 혈액 림프구, CD8+ T 세포 및 자연적 자연적(NK) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 표적 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다.
본 발명 방법에서, 상기 CD3 항체는 상기 감염된 T 세포의 비특이적 자극기로서 작용한다(상기 T 세포는 상기 항-CD3 항체가 상기 T 세포 상에서 상기 CD3 분자에 결합될 때 활성화된다). 상기 감염된 T 세포 및 상기 수지상 세포는 자가유래 또는 동종이계이다. 상기 CD3 항체 또한 상기 ASALs를 재자극할 수 있고, 이는 상기 ASALs가 상기 수지상 세포에 대하여 자가유래 또는 동종이계로 될 수 있음을 의미한다. 바람직하기로는, 상기 수지상 세포 및 상기 ASALs는 동종이계이다. 상기 수지상 세포 및 상기 ASALs는 또한 바람직하기로는 감염된 환자 T 세포에 대하여 동종이계(즉, 건강한 혈액 공여자로부터)이나, 반드시 그러할 필요는 없다.
ASALs의 추가는 또한 높은 수준의 CD27을 발현하는 표적 CD8+ T 세포 집단을 강화하게 한다. CD27+ CD8+ T 세포는 입양 면역 요법에 대하여 잠재적으로 더욱 효과적인 CTLs(세포독성 T 세포)를 나타내는데, 이는 이들이 증식을 위한 항원-항원-구동 자가분비 신호를 제공하기 때문이다. 이러한 헬퍼-독립적인 CD8+ T 세포는 생존 및 확장을 위하여 IL-2 또는 CD4+ T 세포의 형태로 외인성의 도움을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명은 IL-2, 또는 CD4+ T 세포와 같은 추가의 사이토카인의 부재 또는 감소된 존재 하에서 강한 세포독성 활성을 위하여 프로그램된 CD8+ T 세포 집단을 갖는 대상을 제공함으로써 면역-매개되는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 세포용해, 항원-특이적 CD8+ T 세포의 생체외 확대를 위하여 특히 유용하지만, 종양-특이적 CD4+ T 세포의 확대에도 또한 사용될 수 있다.
CD8+ T 림프구의 전체의 백분율로서 발현된 세포용해 항원-특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 바람직하기로는 적어도 약 5%, 더욱 바람직하기로는 적어도 약 10%, 더욱 바람직하기로는 적어도 약 15%, 더욱 바람직하기로는 적어도 약 20%, 더 더욱 바람직하기로는 적어도 약 25%, 더 더욱 바람직하기로는 적어도 약 30%, 및 가장 바람직하기로는 적어도 약 35%이다.
CD8+ 및 CD4+ T 세포는 모두 효율적인 세포독성에 필요하다. 상기 CD8+ T 세포는 세포독성이 있고 반면에 상기 CD4+ T 세포는 IL-2와 같은 성장 증식 인자를 방출한다. CD8+ T 세포의 수는 바람직하기로는 CD4+ T 세포의 수를 초과하는데, 그 이유는 CD8+ T 세포에 비하여 CD4+ T 세포의 확대를 촉진하는 확대 프로토콜은 생체내 항-종양 효험을 제대로 발휘되지 못하도록 할 것으로 예상되기 때문이다(Yang et al. Journal of Immunotherapy 2010;33:648).
보다 구체적으로, 본 발명 방법은 종양이 있는 환자에게 투여하기에 적합한 TCR- 또는 CAR-형질전환된 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 프라이밍을 위한 생체외 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음의 단계로 이루어진다:
a) 상기 환자로부터의 또는 건강한 공여자로부터의 비-증식성 항원 제시 세포를 상기 항원 제시 세포에 대하여 동종이계인 말초혈액 단핵구 세포와 함께 배양하고,
b) 상기 환자로부터의 또는 건강한 공여자로부터의 단핵구를 상기 단핵구로 하여금 성숙한 DCs로 성숙하게 하는 조성물 내에서 배양하고(상기 조성물은 아래에 더욱 설명함), 그리고
c) CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및/또는 자연적 킬러(NK) 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는, 단계 a)로부터의 동종-감작된 림프구를, 단계 b)로부터의 성숙한 DCs와, CD4+T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는 TCR- 또는 CAR-형질전환된 표적 세포와 함께, 항-CD3 항체를 포함하는 배양 배지에서 배양함.
상기 단핵구-유래 DCs는, 미성숙한 DCs를 얻기 위하여 GM-CSF 및 IL-4로 이루어지는 조성물 내에서 단핵구를 약 2-7일 동안, 바람직하기로는 약 5일 동안 1차 배양하고, 이어서 상기 미성숙한 DCs가 성숙한 DCs가 될 수 있도록 하는 제 2 조성물을 추가하여 적어도 약 12 내지 72시간 및 바람직하기로는 약 24-48시간 동안 배양함으로써 얻어진다. 상기 제 2 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 활성화하는 데에 사용될 수 있는 성숙한 단핵구-유래 DCs로 상기 미성숙한 DCs가 변화되도록 하는 성분으로 이루어진다. 제 1 실시예에서, 상기 제 2 조성물은 TNF 알파, IL-1 베타, 인터페론 감마, 인터페론 베타, 및 폴리-I:C와 같은 TLR3 리간드로 이루어진다(Mailliard et al., Alpha-type-1 polarized DCs: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res. 2004;64:5934-5937). 또 다른 실시예에서, 상기 제 2 조성물은 인터페론 감마, TLR 3 및/또는 TLR 4 리간드 및 TLR7 및/또는 TLR 8 리간드 및/또는 TLR9 리간드로 이루어진다. TLR 3 리간드의 비-제한적인 예로는 폴리-I:C가 있고, TLR7/ 8 리간드의 비-제한적인 예로는 R848가 있으며, TLR9 리간드의 비-제한적인 예로는 CpG가 있다.
동종 림프구의 감작은 비활성화된 항원 제시 세포를 건강한 공여자로부터의 말초혈액 단핵구 세포(PBMCs)와 배양하는 것으로 이루어지는 전통적인 혼합 백혈구반응(MLR 또는 MLC - 혼합 백혈구배양)에 의하여 유도되며, 여기에서 상기 항원 제시 세포는 상기 림프구에 대하여 동종이계이다. MLR의 성능은 당업자에 주지되어 있다(Jordan WJ, Ritter MA. Optimal analysis of composite cytokine reactions during alloreactivity. J Immunol methods 2002;260: 1-14). 2명의 개인으로부터의 MLR PBMCs(주로, 림프구)는 며칠 동안 조직 배양에 함께 혼합된다. 불친화성 개인들로부터의 림프구는 서로 자극하여 크게 급증되며(예를 들면 삼중수소화 티미딘 섭취로 측정함), 반면에 친화성 개인들로부터의 림프구는 그렇지 않다. 일방향 MLC에서, 상기 개인들 중 한 명으로부터의 림프구는 미토마이신과 같은 항-증식성 약물로써 또는 조사로써 사전-처리됨으로써, 나머지 개인으로부터의 비처리된 림프구만이 외래 조직적합성 항원에 대응하여 급증되도록 허용된다.
상기 MLR에 사용되는 항원 제시 세포는 PBMCs 및 단핵구-유래 DCs로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명 방법에 있어서, 상기 세포(치료받을 환자로부터의 표적 T 세포, 수지상 세포, 항-CD3 항체 및 항원 제시 세포(APCs) 상에서 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 항원에 대항하여 감작된 림프구를 발현하는 종양 항원 수용체)는 약 20일, 바람직하기로는 약 4 내지 20일, 바람직하기로는 6 내지 20 일, 및 더욱 바람직하기로는 약 7 내지 14일, 그리고 가장 바람직하기로는 약 9 내지 14일 동안 공배양된다.
외인성의 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21은 세포 증식 및 생존을 최적화하기 위하여 상기 세포 배양에 추가된다.
새로운 DCs, 항-CD3 항체, 및 새롭게 감작된 림프구로서 상기 림프구에 대하여 동종이계인 비-증식성 항원 제시 세포에 의하여 활성화된 상기 새롭게 감작된 림프구와 함께 상기 세포를 배양하고, 외인성의 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21를 상기 세포 배양에 선택적으로 추가함으로써, 상기 프라이밍된 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 재작극하는 것 또한 가능하다.
본 발명은 또한 상술된 방법에 의하여 획득할 수 있는 면역성 조성물 뿐만 아니라 상술된 방법에 의하여 획득할 수 있는 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 관한 것이다.
상기 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 환자에게 투여하기에 적합하며, 바람직하기로는 다음의 특징 중 적어도 하나를 갖는다:
- 증식하는 능력
- 세포 사멸 표지자 아넥신-V를 낮은 수준으로 발현함(즉, FACS 결정을 위하여 아넥신-V에 대하여 세포의 불과 40%, 바람직하기로는 불과 20 %가 양성염색을 발휘해야함)
- 그들의 세포 표면에 CD27 및/또는 CD28를 발현함.
본 발명 방법에 의하여 획득가능한 상기 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 또 다른 능력은 생체 외 상기 항원 특이적 T 세포에 대하여 MHC-호환성인 종양 세포 또는 만성 종양의 항원-제시 세포에 의하여 활성화되는, 및/또는 이를 죽이는 능력이다. 본 발명 방법에 의하여 획득가능한 상기 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 또한 IL-10, TGF-베타 및/또는 H2O2와 같은 면역억제 인자와 함께 한 예비배양에도 불구하고 생체외 관련 종양 표적 세포를 죽이는 능력을 가지며, 생체외 관련 종양 표적 세포의 사멸 이후 증식하는 능력뿐만 아니라 IL-10, TGF-베타 및/또는 H2O2와 같은 면역억제 인자와 함께 한 예비배양에도 불구하고 생체외 관련 종양 표적 세포의 사멸 이후 증식하는 능력을 갖는다.
본 발명은 약제로서의 용도 및 상기 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 약제 제조를 위한 용도를 위한 본 발명 방법에 의하여 획득된 상기 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 본 발명 방법에 의하여 획득 가능한 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 용도, 또는 인간에게서 종양의 치료를 위하여 또는 항-종양 면역반응을 이끌어내기 위하여 뿐만 아니라 인간에게서 종양의 치료를 위한 또는 항-종양 면역반응을 이끌어내기 위한 약제의 제조를 위해서 위에서 정의된 바와 같은 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 용도에 관한 것이다. 상기 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 제 1 자극 이후 또는 양자택일적으로 재자극 이후에 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 치료적 암 백신과의 조합으로 투여된다.
인간 대상의 치료에 있어서 입양 세포 치료를 위한 T 세포 집단의 사용 방법은 당업계 임상의에게 주지되어 있다. 여기에 설명되고 당업계에 주지된 방법에 의하여 준비된 T 세포 집단은 이러한 방법에서 사용 가능하다. 예를 들면, MART-I 항원 특이적 T 세포로 종양 침윤 림프구를 이용하는 입양 세포 치료가 병원에서 시험되어 왔다(Powell et al., Blood 105:241 -250, 2005). 신장암이 있는 환자는 조사된 자가유래인 종양 세포로 접종되었다. 채취된 세포는 항-CD3 단일 클론 항체 및 IL-2로 2차 활성화되었고, 그 후 환자에게 재-투여되었다(Chang et al., J. Clinical Oncology 21 :884-890, 2003).
항원-프라이밍된 T 세포는, 시험관 내 최초 DC 매개된 프라이밍 동안에 ASAL에 노출될 때, 재자극에 따라 증가된 증식 및 감소된 세포사멸을 겪는다. 따라서, 접종 전 및/또는 접종 동안 환자에게 입양으로 전이될 경우 접종에 백신접종에 따른 이차적 T 세포 반응을 강화시키는 방법 또한 본 발명에 의해 고려된다.
본 발명은 또한 암 백신 치료를 개선하는 방법을 제공한다. 다수의 종양은 면역 체계에 의한 파괴에 대해 표적으로서 잠재적으로 작용할 수 있는 외래 항원을 발현한다. 암 백신은 체액 성분과 세포 성분 모두로 이루어지는 대상에서 침투성의 종양-특이적 면역 반응을 발생시킨다. 상기 반응은 종양으로부터 먼 위치 또는 국소성 종양의 위치에 백신 조성물을 투여함으로써 대상 자신의 면역 체계로부터 유도된다. 항체 또는 면역 세포는 종양 항원을 결합하고 종양 세포를 용해한다. 그러나, 암 환자의 백신접종에 따른 증가된 T 세포 대응성이 필요하다. 그러므로, 백신접종 이전 또는 백신접종 시에 높은 증식 가능성이 있는 예비활성화된 세포사멸-저항성 종양-특이적 T 세포의 입양전달은 생체 내 백신-매개된 면역 반응을 강화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 치료적 암 백신과의 조합으로 투여될 수 있고, 그러한 치료적 암 백신의 비제한적 예는 생체 외 번식되고 만성인 종양의 DCs, 종양 세포를 생성하는 사이토카인, DNA-백신접종 및 종양 항원과의 조합으로 TLR 리간드를 이용하는 백신이 있다.
본 발명의 방법으로 얻을 수 있는 세포는 항원 특이적 T 세포의 활성화 동안 이들의 증식 및 생존을 증가시키기 위해 인간과 같은 유기체에 직접적으로 투여될 수 있다. 종종 약학적으로 용인되는 담체와 함께 이들 세포의 투여는 세포를 궁극적으로 포유동물의 혈액이나 조직세포와 접촉하도록 도입하는 데에 통상 사용되는 임의의 경로에 의한다.
예를 들면, 정맥주사, 근육내, 피내, 복강내, 피하 및 종양내 경로에 의해서와 같은 비경구 투여에 적합한 제제 및 담체는 수성의 등삼투압 멸균 주사 용액을 포함하며, 이는 산화방지제, 완충제, 세균 발육 저지제, 예정된 수신자의 혈액과 함께 제제를 수성으로 만드는 용질, 및 현탄제, 용해제, 농후제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 멸균 현탁액 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 정맥주사 투여는 본 발명의 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 투여의 바람직한 방법이다.
환자에게 투여되는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 투여량은 본 발명에서 환자의 면역 반응을 강화시키기에 충분해야한다. 따라서, 세포는 종양 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 유도 및/또는 질병의 증상 및/또는 합병증을 완화, 경감, 치료하거나, 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이를 달성하기 위해 적합한 량은 "치료상으로 효과적인 투여량"으로 정의된다. 상기 투여량은 생성된 세포의 활동 및 환자의 상태에 의해서 뿐만 아니라 상기 치료받을 환자의 체중 또는 표면적에 의해서 결정될 것이다. 암과 같은 질병의 치료나 예방에서 효과적인 세포 투여량을 결정함에 있어서, 의사는 질병의 진행 및 임의의 관련 종양 항원에 대한 면역 반응 유도를 평가할 필요가 있다.
선행 기술의 방법에 비하여 본 발명에는 여러 중요한 이점이 있다. 본 발명은 재자극의 필요가 없는 높은 수준의 종양 특이적 CD8+ T 세포를 제공한다. 재자극은 세포를 덜 활성화하고 세포사멸에 이르게 한다. 따라서, 재자극의 필요가 없이 종양 특이적 T 세포를 효과적으로 팽창시키는 방법이 하나의 장점이다. 게다가, 세포를 재자극할 필요 없이, 종양 특이적 T 세포는 더 짧은 기간 내에 환자에게 되돌려질 수 있고, 비용면에서도 더욱 효율적이다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법의 이용함으로써, 억제세포를 소모하거나 또는 많은 비용이 드는 공정인 외인성 성장 인자의 추가가 필요하지 않다.
종양 침윤 림프구로부터 배양되는 자가유래인 종양 특이적 T 세포의 입양 전달은 인간에서 진행된 종양의 퇴행을 유발할 수 있으나, 대부분의 인간 종양으로부터 신뢰성있게 배양될 수가 없다. 그러므로, 종양-항원-특이적 T 세포 수용체를 인코딩하는 유전자를 발현하기 위하여 다수의 혈액-유래된 T 세포를 공학적으로 개발하기 위한 방법이 발전되어 왔다. 키메릭 항원 수용체(CAR)의 경우에는, 이들의 인간 백혈구 항원 유전자형에 관계없이 환자에게 사용될 수 있다.
비록 본 발명 방법의 확대 효험은 상기 REP 프로토콜과 유사하지만, 상기 제시 방법으로 확대된 ASALs는 상기 REP 확대된 세포에 비하여 생체 내에서 훨씬 더 높은 사멸 능력을 갖는다. 그의 주된 이유는 상기 REP 생성된 T 세포가 본 발명에 의한 방법으로 확대된 T 세포에 비해서 종양에 의하여 생성되는 면역억제 환경에 저항성이 덜하기 때문이다. 더욱이, CD4+ T 세포 확대를 촉진하는 프로토콜은 감소된 생체 내 항-종양 효험을 보이기 때문에, 본 발명 방법은 유익한 상기 REP 프로토콜에 비하여 더욱 높은 비율로 CD8+ T 세포를 확대한다.
본 발명은 상이한 양상 및 개시된 특징의 임의의 조합을 망라한다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 예에 의하여 더욱 예시된다.
예
예 1
재료 및 방법:
건강한 혈액 공여자로부터의 감마 조사된 PBMC를 동종이계 공여자(상기 건강한 혈액 공여자에 대하여)로부터의 비-조사된 PBMCs와 함께 1 : 1의 비율로 조직 배양 플라스크 내 무혈청 X-VIVO 15 배지에서 5-7일 동안 공배양함으로써 표준 일방향 혼합 백혈구반응(MLR)에서 동종감작된 동종이계 림프구(ASALs)를 생성하였다. 미성숙한 DCs의 증식을 위하여, 건강한 혈액 공여자로부터 얻은 말초혈액 단핵구 세포(PBMCs)를 밀도구배(density gradients)로 분리하였다(Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Norway). 분리된 PBMCs을 웰 당 2.5 χ 106 세포의 24-웰 플라스틱 배양판에 플레이팅된 AIM-V 배지(Invitrogen, Paisley, UK)에서 재부유시켰고, 2시간 동안 접착을 허용하였다. 비-접착성 세포를 제거하였고, 나머지 접착성 단핵구를, 재조합체 인간 GM-CSF 및 IL-4(R&D Systems, Abingdon, UK; 모두 1,000 U/mL)로 보충된 AIM-V 배지에서 4-6일 동안 배양하였다. 마지막 24시간의 인큐베이션 동안에, 상기 배양 배지를 IFN-α(3,000 U/mL), IFN-γ(1,000 U/mL), TNF-α(50 ng/mL), IL-1β(25 ng/mL)(모두 R&D Systems) 및 p-I:C(Sigma-Aldrich; 20 ㎍/mL)로 보충함으로써 미성숙한 DC의 성숙을 유도하였다.
성숙한 DC 집단은 FACS 분석에 의해 결정된 바와 같이 모두 CD83+ DCs를 70%를 초과하여 함유하였다.
세척 후, 성숙한 DCs를 24시간 동안 X-VIVO 15 배지에서 비-조사된 또는 감마-조사된(25 Grey) ASALs 와 공배양하였고, FACS에 의하여 분석하였다. 동종반응성 림프구의 감작은 자극기 세포로서의 감마-조사된 PBMCs와 응답 세포로서의 비-조사된 PBMCs와 함께 5-6일 동안 무혈청 배양 배지(X-VIVO 15)에서 1차 일방향 MLR을 수행함으로써 실시하였다. PE-복합 항-인간 CD70을 FACS 연구에 이용하였다.
결과: 도 1에 나타낸 바와 같이, ASALs는 상기 ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 성숙한 단핵구-유래 DCs 상에 CD70의 발현을 현저하게 강화한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 감마-조사된 ASALs도 마찬가지로 상기 ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 성숙한 단핵구-유래 DCs 상에 CD70의 발현을 강화한다.
도 3, 4 및 5에 나타낸 바와 같이, ASALs의 프라이밍에 사용된 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 성숙한 DCs와 상기 ASALs와의 공배양은 IL-12, IFN-감마 및 IL-2의 실질적인 생성을 유도한다.
예 2
재료 및 방법: 조사된 동종이계 PBMCs을 자극기로서 사용하여 7일 동안의 종래의 MLR 동안에 ASALs를 발생시켰다(예 1 참조). 채집 및 조사 이후에, 대부분의 ASALs("MLR") 집단 또는 CD4+, CD8+ 또는 CD56+(NK/NKT) 세포가 대폭 감소된 ASALs를 성숙한 동종이계 단핵구-유래된 DC(ASALs를 프라이밍 하는데 사용되는 상기 PBMC에 대하여 자가유래임)와 함께 공-배양하였다. 24시간 후에 공-배양 상청액을 수거하였고, 이어서 IL-2, IL-12 및 IFN-감마 생성을 분석하였다.
결과: IL-2의 생성은 절대적으로 CD-4 의존적임을 발견하였고(도 6A), 반면에 IL-12의 생성(도 6B)은 ASAL-의존성을 전혀 보이지 않았으며, IFN-감마의 생성(도 6C)은 상기 ASAL-집단 내에서 공-배양 및 동종 프라이밍된 CD4+, CD8+ 및 CD56+(NK/NKT)에 대해 부분적 의존성을 보였다.
예 3
재료 및 방법: 단핵구의 플라스틱 접착(plastic adherence)에 의해 미성숙한 DCs를 생성하였다. 단핵구는 각각 1,000U/mL의 IL-4 및 GM-CFS로 보충된 CellGro? DC에서 7일 동안 배양하였다. 마지막 2일의 인큐베이션 동안 50ng/mL의 TNF-알파, 25ng/mL의 IL-1베타, 50ng/mL의 IFN-감마, 3,000U/mL의 IFN-알파 및 20㎍/mL의 폴리-I:C를 추가함으로써 DC의 성숙을 유도하였다.
ASAL은, X-VIVO 15에서 1대1의 비율로, DC 공여자에 대하여, 감마선 조사된 동종 PBMC 및 비-조사된 자가유래인 PBMC를 7일 동안 공동배양함으로써 일방향 혼합림프구반응(MLR)에서 생성하였다.
최종 농도 0.5 x 106 림프구/mL로 50ng/mL IL-15가 보충된 X-VIVO 15에서 7일 동안 배양한 자가유래인 PBMC로부터 양성선택(positive selection)에 의하여 CD8+ T 림프구를 분리하였다. PBMC는 원심분리하였고, 최종 농도 1 x 107/80μL로 PBS-0.5% BSA-2M EDTA에서 재부유하였다. PBMC를 4℃에서 15분 동안 CD8+ MicroBeads(Miltenyi Biotec)과 함께 인큐베이팅하고, 세척하고, 재-부유하여, LS MACS 칼럼 상에 놓았다. 분류되지 않은 세포는 세척되었고 CD8+ 림프구를 포함하는 총 용출액을 수거하였다. 분리된 CD8+ T 림프구를 농도 1 x 106mL로 예열된 PBS-1% BSA에서 재부유하였고, 37℃에서 10분 동안 10μM CFSE(Molecular probes Invitrogen)로 염색하였다. 염색을 5mL의 아주 찬 X-VIVO 15 배지를 추가함으로써 종료하였고 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 세포는 배지에서 두 번 세척하였고, 최종 농도 1 x 106/mL로 재-부유하였다. 염색된 CD8+ T 림프구를 조사된 동종감작된 동종의 PBMC 및 성숙한 자가유래인 DC와 함께 4:4:1의 비율로 4 내지 7일 동안 공-배양하였다. 배양 후, 림프구를 채취하여 CD3-APC-H7, CD8-PerCP, CD27-APC 및 아넥신 V로 염색하였다. 증식하는 CD8+ T 림프구의 백분율은 유세포 분석기에 의해 결정하였고 전체 림프구의 백분율로서 표현하였다.
결과: 결과: 도 7에 나타낸 바와 같이, 방사선 조사된 "동종헬퍼"(=ASALs)의 추가는 CD8+ T 세포 분열을 강력하게 증가시킨다(저 형광 강도를 갖는 많은 세포 = 점그림에서 좌측에 더 많은 점들). 따라서, ASAL는 동종반응성 CD8+ T 세포에서 증식 반응을 유도하기 위한 단핵구-유래된 DCs의 능력을 증가시킨다.
예 4
재료 및 방법: 예 1에서 M&M 참조
림프구를 6일 동안 DC 및 방사선 조사된(DC에 대해 동종이계인) ASALs의 공-배양 이후 CD8+ 분리하였고(항체-코팅된 자성입자를 갖는 음성선택을 사용하여), 이어서 B-세포로 재자극 하였으며(1차 자극 동안 사용된 DC에 자가유래임), CD27 및 아넥신-V의 발현을 위해 염색하였다. 이어지는 분석은 FACS로 수행하였다.
결과: 도 8에 나타낸 바와 같이, 1차 자극 동안에 ASAL를 추가하는 것은 D8+ 세포가 B-세포로 재-자극될 때 CD27의 발현을 실질적으로 증가시켰다.
1차 자극 동안에 ASAL를 추가하는 것은 CD8+ 세포가 B-세포로 재-자극될 때 아넥신-V(세포사멸 표지자)의 발현을 실질적으로 감소시켜(도 9 참조), 상기 CD8+ T 세포로 하여금 세포사멸 도입에 대하여 보다 저항성이게 만들었다.
예 5
재료 및 방법: 예 4에서 M&M 참조
B-세포로 재자극 하기 이전에, 프라이밍되고 분리된 CD8+ 세포는 3H-티미딘(3H-Thymidine)으로 펄스되었다.
결과: 도 10에 나타낸 바와 같이, 1차 자극 동안에 ASAL를 추가하는 것은 재자극 이후 동종반응성 CD8+ 세포의 증식 반응(3H-티미딘에 의하여 측정됨, cpm/min, 3일째 날)을 강력하게 증가시켰다.
예 6
재료 및 방법: 예 4에서 M&M 참조
2일 동안 B-세포와 예비-활성화된 CD8+ 세포를 공동배양 한 후, 배양 상청액을 수거하였고 종래의 ELISA(R&D Systems)에 의하여 IFN-감마의 생성에 대해 분석하였다.
결과: 도 11은 1차 자극 동안에 ASAL를 추가하는 것이 재자극 이후 동종반응성 CD8+ 세포에 의한 IFN-감마의 생성을 증가시킨 것을 나타낸다.
예 7 - CAR -감염된 T 세포의 확대
재료 및 방법:
기초 배양 배지는 10%의 인간 혈청, 1%의 페니실린(100 U/ml), 1%의 헤페스(HEPES), 0.5%의 L-글루타민 및 160μl β의 메르캅토-에탄올이 보충된 RPMI Media 1640으로 구성하였다.
단핵구의 플라스틱 접착에 의하여 미성숙한 DCs를 발생하였다. 이어서, 각각 1,000U/mL의 IL-4 및 GM-CFS로 보충된 기초 배양 배지에서 7일 동안 단핵구를 배양하였다.
마지막 24시간의 인큐베이션 동안 20ug/mL의 폴리-I:C, 2,5ug/mL R848 및 50ng/mL IFN-감마를 추가함으로써 DC의 성숙을 유도하였다.
기초 배양 배지에서 1:1의 비율로 감마 조사된 PBMC 및 비-조사된 동종이계 PBMC를 7일 동안 공-배양함으로써 일방향 혼합 림프구 반응에서 ASALs를 발생하였다.
T 세포 형질주입: 상기 DC 배지에 IL-2(100 lU/mL) 및 항-CD3(OKT3)(50 ng/mL)를 추가함으로써, 분리된 PBMCs(5x10(5)/mL)를 3일 동안 초기 활성화하였다. 그 후, CAR-렌티바이러스(20 uL), Sequa-Brene(1 mg/mL) 및 IL-2(100 lU/mL)를 포함하는 배양 배지에서 인큐베이션에 의하여 GD2(신경모세포종 세포 상에 크게 발현되는 강글리오사이드 항원)에 대항하여 상기 비-접착성 세포(주로 활성화된 T 세포)를 CAR로 4시간 동안 감염시켰다. 세척 후, 상기 세포를 IL-2(100 lU/mL)가 보충된 배지에서 5일 동안 배양하였다. 그 후, 렌티바이러스-CAR에 대항하여 PE-A 복합 항체를 사용하는 유세포 분석기에 의하여 형질주입 레벨을 분석하였다.
T 세포 확대: 세척 후, 이어서 상기 CAR-감염된 T 세포를 성숙한 DCs + 조사된 ASALs + CAR-감염된 T 세포(1:4:1 비율), IL-2(100lU/mL) 및 OKT3(50ng/mL)로 이루어진 상기 ASAL 프로토콜, 또는 3명의 상이한 공여자로부터의 조사된 동종이계 PBMCs + CAR-감염된 T 세포(100:1 비율), IL-2(100 lU/mL) 및 OKT3(50ng/mL)으로 이루어지는 상기 표준 REP 프로토콜(Yang et al, Journal of 면역치료 2010;33:648) 중 어느 한 가지를 이용하여 T-25 플라스크에서 12일 동안 배양 배지에서 확대하였다. 3, 6 및 9일째 날에, 상기 배양 배지를 제거하였고, 확대 배양을 위하여 새로운 배지, 100 lU/mL IL-2 및 50 ng/mL OKT3으로 보충하였다.
유세포 분석기 분석: 상기 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 세포 표면 표지자(CD3, CD4, CD8, CD27 CD64 및 CAR(GD2))에 대항하여 특이적 형광체(플루오레세인이소티오시안산염(FITC), APC, 또는 피코에리트린(PE))-라벨된 항체(BD Biosciences, SanDiego, CA)를 이용함으로써 실온에서(빛을 피함) 15 분 동안 염색하였다. 유세포 분석기(BD FACS Canto II(BD Biosciences, USA)) 상에서 상기 FACS 분석을 수행하였고, 그 데이터를 유세포 분석기(BD FACS Canto II) 소프트웨어로써 분석하였다.
세포사멸 분석: 조절 배지 및 후속적으로 24시간 동안 세포사멸-유도제(H202 또는 독소루비신)를 추가하였던 배지에서 상이한 확대 프로토콜로써, 12일 동안의 확대 이후의 T 세포 생존력을 평가하기 위하여 상기 아넥신 V 세포자멸 분석(BD Biosciences)을 이용하였다. 간단히 말하자면, T 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 결합 완충제에 재-부유하였으며, 그리고 나서 실온에서 15분 동안 아넥신 V-플루오레세인이소티오시안산염(FITC) 및 프로피디움 요오드화물(PI)로 인큐베이션하고, 이어서 세척 및 유세포 분석기 분석을 수행하였다.
종양 세포 사멸 측정: CAR-감염되고 확대된(12일) T 세포를 둥근 바닥 96-웰 플레이트 각각의 웰에서 상이한 효과기: 표적 세포 비율(E:T 비율)로 GD2-발현 신경모세포종 세포주 IMR-3(루시페라아제 리포터 유전자를 공동-발현함)과 함께 48시간 동안 공-배양하였다. 관련 종양 세포를 용해시키는 상기 감염 및 확대된 T 세포의 능력을 루시페라아제 발현 분석(Fu et al, PloS 1, 2010,5,e11867)으로 평가하였다. 상대 세포 생존력(%)을 로라이트 유니트(raw light unit RLU))로서 계산하였고, 효과기 T 세포가 없는 표적 세포(IMR-3)로부터 루시페라아제 활성에 대해 정규화하였다.
잠재적 종양-유래된 억제 인자에 노출된 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 효과기 T 세포 상의 용해미립 엑소시토시스 표지자인 막-결합성 CD107a에 대항하여 복합 항체를 사용하는 유세포 분석기에 의하여 추정하였다. T 세포를 IL-10(10ng/mL) 및 TGF-베타(2,5 ng/mL)로써 4시간 동안 노출하였고, H202(25uM)로써 24시간 동안 또는 표적 세포와의 공-배양 이전에 IL-10 및 H202(24시간)와의 조합으로 TGF-베타(모두 4시간)로써 노출하였다.
잠재적 종양-유래된 억제 인자에 대한 노출과 함께 또는 상기 노출 이전에 노출 없이 이루어지는 표적 항원-발현 종양 세포의 상호작용/사멸시킴 이후에, 4일의 T-세포 증식을 평가하는 데에 CellTrace™ CFSE 세포 증식 키트(Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 사용하였다. T 세포를 IL-10(10ng/mL) 및 TGF-베타(2,5 ng/mL)로써 4시간 동안, H202(25uM)로써 24시간, 또는 표적 세포와의 공-배양 이전에 H2O2(24시간)와의 조합으로 IL-10 및 TGF-베타(모두 4시간)로써 노출하였다.
결과:
도 12에 나타낸 바와 같이, ASALs의 프라이밍에 사용된 상기 조사된 PBMCs에 대하여 자가유래인 조사되고 성숙한 단핵구-유래된 DCs에 조사된 ASALs를 추가하는 것은 CD64(Fc-gammaR)-발현 DCs의 수를 향상시킨다. 이러한 수용체는 가용성 항-CD3 항체의 Fc-부분을 포착하는 것으로 되어있다. 이러한 항-CD3-"무장된" DCs는 그러므로 공배양된 자가유래 또는 동종이계 CD3 발현 T 세포와 직접적으로 상호작용할 수 있고, 이를 활성화할 수 있다.
도 13은 H2O2 처리 이후의 생존력을 나타낸다. 상기 REP 프로토콜로 확대된 T 세포에 비하여, 상기 ASAL 프로토콜은 세포사멸-유도 H2O2 처리에 대하여 더욱 저항성인 T 세포를 유도한다. H2O2는 종양 내의 주지의 면역억제 인자이므로, 상기 ASAL 프로토콜이 생체 내 종양-유래된 H2O2에 대하여 월등한 저항성을 갖는 T 세포를 확대할 것으로 예상할 수 있다.
도 14는 독소루비신 처리 이후의 생존력을 나타낸다. 상기 REP 프로토콜로 확대된 T 세포에 비하여, 상기 ASAL 프로토콜은 세포사멸-유도 독소루비신 처리에 대하여 더욱 저항성인 T 세포를 유도한다. 독소루비신은 빈번히 사용되는 항-암 약물이므로, 상기 ASAL 프로토콜이 생체 내 독소루비신과의 병행 항암 치료에 의하여 유도되는 세포 사멸에 대하여 월등한 저항성을 갖는 T 세포를 확대할 것으로 예상할 수 있다.
CD3+ T 세포는 상기 GD2 항원(교모세포종 암 세포 상에 발현된)에 대항하여 키메릭 항원 수용체(CAR)로 효율적으로 감염된다(> 40% 감염된 세포)(도 15 참조). 도면 좌측 = 형질주입 이전, 도면 우측 형질주입 이후. 상부 우측 사분면 내의 모든 점들은 CAR-감염된 T 세포를 나타낸다.
상기 ASAL 프로토콜은, 상기 표준 REP 프로토콜에 비하여, CAR-감염된 CD3+ T 세포의 유사한 확대를 유도하지만(도 16 참조), 상기 REP 프로토콜에 비하여 더 높은 비율로 CD8+ T 세포를 확대한다(도 17 참조). CD4+ T 세포의 확대를 촉진하는 확대 프로토콜은 생체내항-종양 효험이 제대로 발휘되지 못하게 할 것으로 예상되므로 이러한 발견은 임상적 의의가 있다(Yang et al. Journal of Immunotherapy 2010;33:648).
더욱이, 상기 ASAL 프로토콜은 상기 REP 프로토콜에 비하여 비슷하거나 더 높은 수의 CD27-발현 CD3+ T 세포를 유도한다(도 18 참조). T 세포의 잔류성은 재주입된 T 세포 상의 높은 레벨의 CD27 발현과 직접적으로 상관되는 것으로 나타났으므로, 이러한 발견은 임상적으로 적절하다. CD27+ CD8+ T 세포는 증식을 위하여 항원-구동 오토크라인 신호를 제공할 수 있으므로 입양 면역치료에 대하여 잠재적으로 보다 효율적인 CTLs(세포독성 T 세포)를 제시한다. 이러한 헬퍼-독립적인 CD8+ T 세포는 생존 및 확대를 위하여 IL-2 또는 CD4+ T 세포의 형태로 외인성의 도움을 요하지 않는다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 상기 ASAL 프로토콜은 상기 REP 프로토콜로 확대된 CAR-감염된 T 세포의 특이적 사멸 능력과 유사한 특이적 사멸 능력을 갖는 CAR-감염된 T 세포를 확대한다.
상기 REP 프로토콜로 확대된 CAR 감염된 T 세포에 비하여 상기 CAR-감염된 T 세포가 상기 ASAL-프로토콜로 확대될 때, CAR-감염된 T 세포 내에서 종양-특이적 세포독성 수용력(CD107a의 막 발현에 의하여 측정됨)은 잠재적 종양-유래된 억제 인자(IL-10, TNF-베타 및/또는 H2O2)의 노출에 대하여 더욱 저항성이다(도 20 참조).
상기 REP 프로토콜(T 세포의 확대에 빈번히 사용되는 프로토콜; see Yang et al, Journal of Immunotherapy 2010;33:648)로 확대된 CAR 감염된 T 세포에 비교할 때, CAR 감염된 T 세포의 증식성 반응은, 표적 세포의 상호작용 및 사멸 이후에, 잠재적 종양-유래된 억제 인자에 대하여 더욱 저항성이다. 그러므로, 표적 세포의 사멸 이후에, 본 발명 방법에 의하여 발생된 상기 T 세포는 재-자극되고, 그러므로 새로운 암 세포를 공격 및 사멸시킬 수 있다.
비록 여기에서는 특정 실시예들을 기술하였으나, 이는 단지 예시를 위한 목적으로 예로써 설명된 것이며 후술되는 첨부된 특허 청구의 범위의 범주를 제한하고자 의도된 것이 아니다. 특히, 본 발명자는 특허 청구의 범위에 정의된 바 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 대하여 다양한 대체, 변경 및 수정이 이루어질 수 있는 것으로 생각한다.

Claims (26)

  1. 종양 환자에게 투여하기에 적합한 유전자 변형된 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 중 하나 이상을 프라이밍하는 생체외 방법으로서,
    상기 방법은 치료받을 환자로부터의 종양 항원 수용체 발현 표적 T 세포, 성숙한 수지상 세포, 항-CD3 항체 및 항원 제시 세포(APCs) 상에서 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원 중 하나 이상에 대하여 감작된 림프구를 공-배양하는 것으로 이루어지고,
    상기 감작된 림프구는 건강한 제 2 혈액 공여자의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)를 갖는 건강한 제 1 혈액 공여자로부터의 비-증식 APCs를 배양함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 종양 항원 수용체는 T-세포 수용체(TCRs) 및 키메릭 항원 수용체(CARs)로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 비-증식 APCs는 PBMCs 및 단핵구 유래된 수지상 세포로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 성숙한 수지상 세포는 미성숙한 수지상 세포를 획득하기 위하여 1-7일 동안 GM-CSF 및 IL-4로 이루어지는 조성물에서 단핵구를 제 1 배양하고, 후속적으로 상기 미성숙한 수지상 세포를 적어도 12시간 동안 배양하여 성숙한 수지상 세포가 될 수 있도록 하는 제 2 조성물을 추가함으로써 획득됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 제 2 조성물은 TNF 알파, IL-1 베타, 인터페론 감마, 인터페론 알파 또는 인터페론 베타, 및 TLR3 리간드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 제 2 조성물은 TNF 알파, 인터페론 감마, TLR3 리간드 및/또는 TLR 4 리간드, 및 TLR7 작용제 및/또는 TLR 8 작용제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 TLR 3 리간드는 폴리-I:C이고 상기 TLR 8 작용제는 R848임을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 4 내지 20일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    외인성의 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21은 치료받을 환자로부터의 종양 항원 수용체 발현 표적 T 세포, 성숙한 수지상 세포, 항-CD3 항체 및 항원 제시 세포(APCs) 상에서 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원 중 하나 이상에 대하여 감작된 림프구로 이루어지는 세포 배양에 추가됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라이밍된 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 새로운 수지상 세포, 항-CD3 항체, 새로운 감작된 동종이계 림프구와 함께 상기 세포를 배양하고,
    외인성의 IL-2, IL-7, IL-15, 항-IL-4 및/또는 IL-21을 치료받을 환자로부터의 종양 항원 수용체 발현 표적 T 세포, 성숙한 수지상 세포, 항-CD3 항체 및 항원 제시 세포(APCs) 상에서 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원 중 하나 이상에 대하여 감작된 림프구로 이루어지는 세포 배양에 선택적으로 추가함으로써 재자극됨을 특징으로 하는 방법.
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  24. 청구항 7에 있어서, 상기 TLR3 리간드는 폴리-I:C로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 상기 비-증식 APCs는 상기 성숙한 수지상 세포에 대하여 자가유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 1에 있어서, 상기 비-증식 APCs는 조사된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)인 것을 특징으로 하는 방법.
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