CN104593325A - 诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法 - Google Patents
诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104593325A CN104593325A CN201410750830.6A CN201410750830A CN104593325A CN 104593325 A CN104593325 A CN 104593325A CN 201410750830 A CN201410750830 A CN 201410750830A CN 104593325 A CN104593325 A CN 104593325A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- ripe
- consumption
- tlr
- induce
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其步骤为：将前体单核细胞用新鲜的无血清树突状细胞培养液悬浮，使细胞密度为2x105-1x106/ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养5-6天，然后加入IL-1β与TLR刺激，并于37℃，5％CO2培养箱培养24-48小时后收获成熟的树突状细胞。本发明的方法能够诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子，方法简单，成本低。所制备得到的成熟DC细胞具有制备临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗药物或疫苗的用途。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。
背景技术
DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)。近年来，以树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临床应用前景。目前，从外周血单个核细胞(PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12，致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
DC在肿瘤、感染、器官移植等领域已显示出其免疫治疗的安全性及有效性，但体内DC数量极少，故目前临床所用DC多是采集DC前体细胞经体外培养得到。DC前体细胞经不同细胞因子作用，诱导出未成熟DC(immature DC,iDC)摄取和加工抗原；然后再经不同的促成熟因子作用，生成成熟DC(mature DC,mDC)，其成熟状态决定机体免疫调节的方向。只有成熟DC才能有效呈递抗原，表达各种表面分子和共刺激分子，分泌多种细胞因子，提供三种信号活化T淋巴细胞，激活特异性细胞免疫反应，诱导Th1型免疫反应。在抗肿瘤免疫反应中，Th1免疫反应被认为在抗肿瘤免疫中发挥重要作用；而Th2以及Treg反应则被认为引起免疫耐受。在这个过程中，DC细胞分泌的促炎因子IL-12水平起了关键性的作用。高水平的IL-12被证实可有效极化Th1细胞的产生，从而辅助诱导抗原特异性的CD8+CTL细胞生成。此外，IL-12还可直接作用CD8+T细胞使其增殖，增强细胞免疫效应以及形成长久记忆性T淋巴细胞。因此，能够分泌高水平的IL-12是DC细胞生物活性高的标志之一。
现有的DC培养技术未能足够重视DC促成熟过程，同时考虑成本因素，往往仅用干扰素a作为促成熟因子。实验研究表明干扰素a促成熟DC细胞成熟度不足，表面标记表达低，促炎因子分泌低，活化免疫功能差。因此有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法。根据本发明的实施例，该方法的步骤为：将前体单核细胞用新鲜的无血清树突状细胞培养液悬浮，使细胞密度为2x105-1x106/ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养5-6天，然后加入IL-1β与TLR刺激，并于37℃，5％CO2培养箱培养24-48小时后收获成熟的树突状细胞。
根据本发明的实施例，所述IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。
根据本发明的实施例，所述IL-1β的用量为1000U/ml，TLR的用量为5ng/ml。
根据本发明的实施例，所述前体单核细胞是外周血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述的无血清树突状细胞培养液是含有500U/ml的GM-CSF和400U/ml的IL-4的无血清培养液。
根据本发明的实施例，所述的无血清培养液是Life Technology公司的AIM-V，或者Lonza公司的X-VIVO。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述方法制备得到的成熟DC细胞用于制备临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗药物或疫苗的用途。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种组合物，由IL-1β与TLR组成，在树突状细胞培养液中，IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。
根据本发明的实施例，所述IL-1β的用量是1000U/ml；TLR的用量是5ng/ml。
其中，IL-1β是重要的促DC活化的炎性因子，能够促进DC细胞IL-12的分泌。TLR(Toll-like receptor，Toll样受体)是近年来DC活化新的研究热点，能使DC上调炎性因子的分泌，下调抑制因子IL-10的表达，促进DC诱导Th1型的免疫反应。本发明的发明人经过大量创造性的劳动，惊奇的发现，当在树突状细胞培养液里，IL-1β的用量是500-10000U/ml，优选1000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml，优选5ng/ml时，所制备的成熟DC细胞具有完全的成熟表型，能够高水平表达细胞表面分子，同时高水平分泌IL-12。进而能更有效地诱导Thl的抗肿瘤免疫及抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。本发明将在临床肿瘤免疫治疗的应用研究领域发挥重要作用。同时发明人发现，当IL-1β与TLR的用量低于用量范围时活化效果降低，高于用量范围时DC活性受到影响。
根据本发明的实施例，在本发明的组合物中，所述的树突状细胞培养液是无血清细胞培养液，例如，美国Life Technologies公司的无血清细胞培养液(Serum-freeMedium)。其他常用于树突状细胞的必需培养基液可用于本发明。
根据本发明的实施例，本发明采用的未成熟树突状细胞是采用外周血贴壁的单核细胞在Life Technologies公司的树突状细胞专用的无血清培养液中进行常规培养至第5天而收集的悬浮生长的未成熟树突状细胞。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前述组合物在促进树突状细胞成熟中的用途。
附图说明
图1为培养第6天DC细胞形态图(显微镜400X)；
图2为DC表面分子表达图；
图3为成熟DC分泌高水平促炎因子IL-12，低水平抑制因子IL-10图；
图4为抗原负载并促成熟DC能有效诱导自体、异体T细胞增殖图；
图5为抗原负载并促成熟DC能有效诱导自体T细胞分泌高水平IFN，高表达CD107a图；
图6为抗原负载并促成熟DC能有效诱导HBcAg抗原特异性CTL图。
图7为HBVc特异性五聚体流式检测图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：DC细胞培养及其效果验证试验
1、DC细胞培养试验
1.1志愿者2名，知情告知并签署知情同意书，用肝素钠抗凝管分别抽取外周静脉血50ml。淋巴细胞分离液(Fresenius Kabi Norge AS、LymphoprepTM)分离PBMC后，用新鲜的无血清树突状细胞培养液(Life Technology公司的AIM-V)悬浮，细胞密度在2x105-1x106/ml，37℃，5％CO2培养箱中培养。
1.2培养5-6天后加入IL-1β 1000U/ml，TLR 5ng/ml刺激，再在37℃，5％CO2培养箱中培养24-48小时后收获成熟的树突状细胞。在第6天IL-1β和TLR刺激前观察细胞形态，如图1。从图1可以看出，两位志愿者的细胞均表现为半贴壁状态，细胞圆而透亮，表面有细小轴突，大部分为单个，少数聚集成簇，即为未成熟的DC典型形态。
2、效果验证试验
2.1研究DC表面marker的表达
将上述1.1步骤中的细胞在培养第5天，用2ug/ml HBVcore抗原(深圳市菲鹏生物，HBcAg-1#)负载DC。24小时后，加入IL-1β 1000U/ml，TLR 5ng/ml，加入量均为每毫升培养液。37℃，5％CO2培养箱中培养24h后用BD CANTOII流式细胞仪检测HLA-DR(MHC-II类分子，含有2个分子量分别为36kD和27kD的亚基(α亚基和β亚基))、CD86、CD80、CD83、CCR7(CC chemokine receptor 7)和CD14的表达。结果见图2。其中灰色表示阴性对照组，黑色表示实验组。数值表示阳性百分含量。横坐标分别是HLA-DR、CD86、CD80、CCR7、CD14的表达强度，纵坐标是细胞数。结果表明，CD14为阴性显示DC均已从单核成功分化(阳性表示分化不完全)。促成熟后DC的表面markerCD80、CD83、CD86和CCR7分子显著上调，HLA-DR分子高表达；显示IL-1β和TLR的组合物能有效促进DC表面marker高表达。
2.2研究DC炎性细胞因子的分泌
将上述1.2步骤中在加入IL-1β和TLR后48小时，收获成熟的树突状细胞时，收集促成熟后的DC上清进行ELISA检测(ebioscience，88-7126-88，88-7106-88)。检测上清中促炎性因子IL-12和抑制型因子IL-10的分泌情况。结果见图3，纵坐标为pg/ml。从图中可以看出，两个志愿者IL-12表达均远远高于各自IL-10，具有促成熟DC分泌高水平促炎因子IL-12和低水平抑制型因子IL-10的能力。
表明IL-1β和TLR的组合物具有促成熟DC分泌高水平促炎因子IL-12和低水平抑制型因子IL-10的能力。
2.3检测培养并促成熟DC诱导T细胞增殖的能力
DC作为抗原呈递细胞的一个重要的功能是刺激T细胞增殖。
将按照2.1步骤进行2ug/ml HBVcore抗原(同上)负载并促成熟后的DC分别与自体T细胞(来源于志愿者自体PBMC)或异体T细胞(来源于另外一个志愿者的PBMC)以细胞数1：10的比率共培养。37℃，5％CO2培养箱中共培养后的3-5天后，用CFSE的方法对T细胞的增殖情况进行检测(如图4)其中，横坐标为CFSE荧光强度；纵坐标为细胞数。结果表明，T细胞本底增殖低于10％，而加入自体或异体成熟DC后，T细胞增殖率显著上调(自体34.95％和37.4％；异体65.89％和66.59％)。结果显示本实施例诱导培养并促成熟的DC能有效地诱导自体或异体T细胞增殖。2.4检验DC功能
DC是否有效激活细胞毒性T淋巴细胞是检验DC功能的关键问题。因此用CD107a迁移实验来研究CD8+T细胞的脱粒化的情况，同时还检测了IFN的表达来研究CD8+T细胞的活化。
将2ug/ml HBVcore抗原(同上)负载并促成熟后的DC与自体T细胞(来源于志愿者自体PBMC)以细胞数1：10的比率于37℃，5％CO2培养箱中共培养。在共培养后的3-5天后，在各孔中加入0.6ug/ml可溶性的anti-CD3和anti-CD28(均购自R&D，MAB100，MAB342)抗体刺激剂以及10ug/ml brefeldin A(BFA)(ebioscience，00-4506)蛋白转运抑制剂。37℃，5％CO2培养箱中刺激培养5h后收集共培养细胞进行CD107a/IFN/CD8(BD，555800，554702，347314)三抗体染色，用流式细胞仪gate出CD8阳性T淋巴细胞群进行分析(如图5和图6)。图5横坐标为CD8分子荧光强度，纵坐标为CD107a分子荧光强度。图6横坐标为CD8分子荧光强度，纵坐标IFNg分子荧光强度。结果显示DC-PBMC组CD107a的表达及IFN的表达均高于PBMC组。表明抗原负载并促成熟DC能有效诱导自体T细胞分泌高水平IFN，高表达CD107a；即能有效激活细胞毒性T淋巴细胞。
表明IL-1β和TLR的组合物具有促成熟的DC有效诱导自体T细胞分泌高水平IFN，高表达CD107a；即能有效激活细胞毒性T淋巴细胞的能力。
2.5检测DC诱导抗原特异性T淋巴细胞的功能。
用抗原特异性五聚体实验来研究特异性CTL的活化。发明人用2ug/ml HBVcore抗原负载并促成熟后的DC与自体T细胞(来源于志愿者自体PBMC)以细胞数1：10的比率共培养。37℃，5％CO2培养箱中共培养5-7天后，收集共培养细胞进行HBVcorepentamer/CD8(Proimmune，283；BD，347314)双染，用流式细胞仪gate出CD8阳性T淋巴细胞群进行分析(如图7)。横坐标为CD8分子荧光强度，纵坐标为HBVc特异性五聚体荧光强度；其中的HBVcore pentamer即为HBVcore抗原特异性五聚体。图7中各组分别为T细胞组(无DC)、无关肽负载DC活化的T细胞组和HBVc抗原负载DC活化的T细胞组。无关肽-负载-DC活化的T细胞(T细胞+无关肽负载的-DC组)作为对照组。结果显示HBVcore抗原负载并促成熟DC(T细胞+HBVc-DC组)诱导的HBVcore抗原特异性T淋巴细胞显著高于对照组和单独的T细胞组。
由此，表明IL-1β和TLR的组合物具有促成熟的DC能有效诱导抗原特异性T淋巴细胞的能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其特征在于，步骤为：将前体单核细胞用新鲜的无血清树突状细胞培养液悬浮，使细胞密度为2x105-1x106/ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养5-6天，然后加入IL-1β与TLR刺激，并于37℃，5％CO2培养箱培养24-48小时后收获成熟的树突状细胞。
2.权利要求1所述诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其特征在于，所述IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。
3.权利要求2所述诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其特征在于，所述IL-1β的用量为1000U/ml，TLR的用量为5ng/ml。
4.权利要求1所述诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其特征在于，所述前体单核细胞是外周血单个核细胞。
5.权利要求1所述诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其特征在于，所述的无血清树突状细胞培养液是含有500U/ml的GM-CSF和400U/ml的IL-4的无血清培养液。
6.权利要求5所述诱导DC成熟并分泌高浓度促炎因子的方法，其特征在于，所述的无血清培养液是Life Technology公司的AIM-V，或者Lonza公司的X-VIVO。
7.权利要求1-6任一项所述方法制备得到的成熟DC细胞用于制备临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗药物或疫苗的用途。
8.一种组合物，其特征在于，由IL-1β与TLR组成，在树突状细胞培养液中，IL-1β的用量是500-10000U/ml，TLR的用量是1-50ng/ml。
9.权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述IL-1β的用量是1000U/ml；TLR的用量是5ng/ml。
10.权利要求8或9所述的组合物在促进树突状细胞成熟中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410750830.6A CN104593325A (zh) | 2014-12-09 | 2014-12-09 | 诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410750830.6A CN104593325A (zh) | 2014-12-09 | 2014-12-09 | 诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104593325A true CN104593325A (zh) | 2015-05-06 |
Family
ID=53119382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410750830.6A Pending CN104593325A (zh) | 2014-12-09 | 2014-12-09 | 诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104593325A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112534045A (zh) * | 2018-04-13 | 2021-03-19 | 深圳源正细胞医疗技术有限公司 | 获得肿瘤特异性t细胞受体的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102851256A (zh) * | 2011-06-30 | 2013-01-02 | 北京大学第一医院 | 促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基 |
| CN103502439A (zh) * | 2011-04-13 | 2014-01-08 | 因缪尼卡姆股份公司 | 用于抗原特异性t细胞增殖的方法 |
-
2014
- 2014-12-09 CN CN201410750830.6A patent/CN104593325A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103502439A (zh) * | 2011-04-13 | 2014-01-08 | 因缪尼卡姆股份公司 | 用于抗原特异性t细胞增殖的方法 |
| CN102851256A (zh) * | 2011-06-30 | 2013-01-02 | 北京大学第一医院 | 促树突状细胞成熟的体外培养方法及专用培养基 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MELISSA J. ET AL.: "Liposomal delivery of antigen to human dendritic cells", 《VACCINE》 * |
| 景志忠: "《TOLL样受体与天然免疫》", 30 June 2012 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112534045A (zh) * | 2018-04-13 | 2021-03-19 | 深圳源正细胞医疗技术有限公司 | 获得肿瘤特异性t细胞受体的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103756963B (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
| CN102600462B (zh) | 人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN102321581B (zh) | 腹水肿瘤细胞致敏dc-cik的制备方法 | |
| Lapteva et al. | Enhanced activation of human dendritic cells by inducible CD40 and Toll-like receptor-4 ligation | |
| CN105238754A (zh) | 一种高增殖力和高杀伤力nk细胞的体外培养方法 | |
| CN104593324A (zh) | 一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法 | |
| CN105112371A (zh) | 脐带血单个核细胞来源的dc-cik细胞制取方法及制剂 | |
| CN104371973B (zh) | 一种免疫细胞的无血清培养基 | |
| CN105861435A (zh) | 自然杀伤细胞的体外扩增方法 | |
| CN102676455A (zh) | 脐带血来源的树突状细胞及树突状细胞疫苗的制备方法 | |
| CN104498434A (zh) | 一种大量树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞 | |
| CN101514333A (zh) | 一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基 | |
| CN105219713A (zh) | 用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力nk细胞 | |
| CN109456940A (zh) | 得到nk细胞或树突细胞的方法 | |
| CN104711224A (zh) | 一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用 | |
| CN104480069A (zh) | 一种利用外周血分离培养免疫细胞的方法 | |
| CN102861107B (zh) | Dc-cik细胞治疗组合物 | |
| Sabado et al. | Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy | |
| CN109370987A (zh) | 外周血ctl细胞改良的培养方法 | |
| CN103173410B (zh) | 用于刺激树突状细胞成熟的组合物以及方法 | |
| CN103740643B (zh) | 一种mhc限制性杀伤t细胞的体外诱导培养方法 | |
| CN106701680A (zh) | 一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法 | |
| CN105441390A (zh) | Nk细胞的体外三维扩增培养方法 | |
| CN104593325A (zh) | 诱导dc成熟并分泌高浓度促炎因子的方法 | |
| CN104762261A (zh) | 一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170621 Address after: 200135, Shanghai, China (Shanghai) free trade zone, No. 29, Tai 2 Road, West floor, room D-01 Applicant after: Henry is the source of biological science and Technology Co Ltd (Shanghai) Applicant after: Henry is the source of biological science and Technology Co Ltd (Shenzhen) Address before: 518057 Guangdong Province, Shenzhen city Nanshan District District Science Park Song Ping Road No. 1 Lite Technology Building South 15 Floor Applicant before: SHENZHEN YUANZHENG CELL MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Applicant before: Shenzhen Yuanxing Bio-Pharm Co., Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150506 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |