CN112534045A - 获得肿瘤特异性t细胞受体的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利申请提供获得多种特异性识别来自个体的目标肿瘤抗原肽的T细胞受体的方法，该个体已在临床上受益于免疫疗法，诸如多抗原特异性细胞疗法。还提供肿瘤特异性TCR、表达此类TCR的经工程改造的免疫细胞、以及使用此类经工程改造的免疫细胞治疗疾病的方法。
Description
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2018年4月13日提交的国际专利申请号PCT/CN2018/082947的优先权权益，其公开内容全文以引用方式并入本文中。
以ASCII文本文件提交序列表
以下以ASCII文本文件提交的内容的全文以引用方式并入本文中：序列表的计算机可读取形式(CRF)(文件名：776902000342SEQLIST.TXT，记录日期：2019年4月11日，大小：426KB)。
技术领域
本发明涉及癌症免疫疗法的领域。具体而言，本发明提供获得TCR的方法、肿瘤特异性TCR、经工程改造的免疫细胞、药物组合物、以及用于治疗癌症的试剂盒。
背景技术
与血液性癌症不同，实体肿瘤缺乏由一般嵌合抗原受体(Chimeric AntigenReceptor,CAR)识别的细胞表面抗原。来自实体肿瘤的细胞内抗原必须通过HLA分子以HLA-抗原表位复合物呈现在细胞表面上，此类HLA-抗原表位复合物是由肿瘤特异性T细胞表面上的T细胞受体(T cell receptor,TCR)特异性识别，从而由肿瘤特异性T细胞引发抗肿瘤细胞毒性。
在2018年2月前，有75项关于过继(adoptive)免疫细胞的临床试验，此类过继免疫细胞经工程改造而具有肿瘤特异性TCR，以用于治疗癌症。靶标包括肿瘤相关抗原、肿瘤相关病毒抗原、以及新抗原。适应症包括许多常见类型的实体肿瘤。目前在临床试验中的TCR-T细胞的示例包括靶向WT1/HLA-A*0201复合物的TCR-T(Juno Therapeutics)，其是用于治疗急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和非小细胞肺癌；靶向MAGE-A3/A6/HLA-DPB1*0401复合物的TCR-T(Kite)，其是用于治疗恶性实体肿瘤；以及靶向MAGE-A4/HLA-A*0201的TCR-T(Adaptimmune)，其是用于治疗恶性实体肿瘤。
在本文中所参照的所有出版物、专利、专利申请案、以及已公开专利申请案的公开内容全文特此以引用方式并入本文中。
发明内容
本发明提供方法、组合物、以及试剂盒以用于获得一种或多种特异性识别来自个体的肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)，该个体已在临床上受益于免疫疗法，诸如多抗原特异性细胞疗法(Multiple Antigen Specific Cell Therapy，“MASCT”)。
本专利申请的一个方面提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(dendritic cell,DC)群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群之间的比率不大于约30:1(诸如约10:1至约20:1、或约15:1、或约20:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该第一共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该第一共培养基包含IL-2和抗PD-1抗体。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子。在一些实施方案中，该细胞因子为IFNγ。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该抗CD3抗体是OKT3。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该一种或细胞因子包括IL-2。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体(例如，SHR-1210)。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)的群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，此类APC是PBMC、DC、或细胞系APC。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群之间的比率为约1:1至约20:1。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群共培养约5至9天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)和抗CD3抗体。在一些实施方案中，该第三共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及OKT3。在一些实施方案中，该第三共培养基包含IL-2和OKT3。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次、两次、或三次)。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括(多种)一般肿瘤抗原肽、(多种)癌症类型特异性抗原肽、和/或新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽(例如，由新抗原肽组成)。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括至少约5种(例如，至少约10、20、30、40、或更多种)不同肿瘤抗原肽。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该目标肿瘤抗原肽是衍生自选自下列的肿瘤抗原：hTERT、p53、存活素(Survivin)、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、以及AFP。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该下一代测序是单细胞测序。在一些实施方案中，该下一代测序是批量测序(bulk sequencing)。在一些实施方案中，该测序步骤包括对此类肿瘤抗原特异性T细胞的批量样本进行测序、以及对多个肿瘤抗原特异性T细胞进行单细胞测序。在一些实施方案中，该测序步骤包括此类肿瘤抗原特异性T细胞的第一部分的批量测序，以提供多个编码TCRα和TCRβ的基因；以及此类肿瘤抗原特异性T细胞的第二部分的单细胞测序，其提供该多个编码TCRα和TCRβ的基因的同源配对信息，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供多种TCR。在一些实施方案中，在该下一代测序之前，将此类肿瘤抗原特异性T细胞用载有该目标肿瘤抗原肽的APC刺激。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有部分反应(partial response,PR)、完全反应(complete response,CR)、或疾病稳定(stabledisease,SD)。在一些实施方案中，该MASCT包括：将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以获得活化T细胞群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该MASCT包括：(i)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽，该初始共培养基包含一种或多种(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及(ii)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。在一些实施方案中，该MASCT包括：(i)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；以及(ii)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，该MASCT包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。在一些实施方案中，该个体先前已接受该MASCT至少三次。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，同时获得特异性识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR。
在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括：在宿主免疫细胞中表达各对编码TCRα和TCRβ的基因，以提供表达TCR的经工程改造的免疫细胞；以及评估该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的反应。进一步提供的是一种使用上述方法获得特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其中基于表达该TCR的该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的该反应来选择该TCR。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定该TCR的HLA限制。在一些实施方案中，该TCR具有亚洲人中主要的HLA单倍型(haplotype)限制。在一些实施方案中，该方法进一步包括该TCR的亲和力成熟。在一些实施方案中，该方法进一步包括增强该TCR中的TCRα链和TCRβ链的配对。在一些实施方案中，该方法进一步包括增强该TCR的该表达。在一些实施方案中，该目标肿瘤抗原肽是衍生自CEA、RSG-5、或HPV18-E7。
还提供的是一种肿瘤特异性TCR，其是使用上述方法中任一者获得。
本专利申请的另一个方面提供一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:4、10、以及16的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:7、13、以及19的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；(b)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:22、28、34、40、46、以及52的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:7、13、19、25、31、37、43、49、以及55的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；或(c)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:58、64、70、76、87、以及93的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:61、67、73、79、90、以及96的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该肿瘤特异性TCR包括：(a)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(b)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(c)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ IDNO:16的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；(d)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列；(e)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列；(f)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；(g)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；(h)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ IDNO:49的氨基酸序列；(i)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列；(j)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列；(k)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:67的氨基酸序列；(l)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列；(m)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列；(n)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQID NO:87的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或(o)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
进一步提供的是一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)TCRα链，其包括SEQ ID NO:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者的CDR；(b)TCRα链，其包括SEQ ID NO:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者的CDR；或(c)TCRα链，其包括SEQ ID NO:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的CDR。
在一些根据上述肿瘤特异性TCR中任一者的实施方案中，该肿瘤特异性TCR是人类TCR。在一些实施方案中，该肿瘤特异性TCR是嵌合TCR，诸如鼠源化(murinized)TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。
在一些根据上述肿瘤特异性TCR中任一者的实施方案中，该肿瘤特异性TCR包括：(a)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；(b)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQID NO:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；或(c)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
还提供的是一种分离核酸，其编码根据上述肿瘤特异性TCR中任一者的肿瘤特异性TCR的该TCRα链和/或该TCRβ链；一种载体，其包括该(等)分离核酸。
本专利申请的一个方面提供一种经工程改造的免疫细胞，其包括上述根据肿瘤特异性TCR中任一者的肿瘤特异性TCR、分离核酸、或载体。
在一些实施方案中，该免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，提供一种药物组合物，其包括根据上述经工程改造的免疫细胞中任一者的经工程改造的免疫细胞、以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的根据上述药物组合物中任一者的药物组合物。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR的库，此类肿瘤特异性TCR是使用根据上述方法中任一者的方法获得。
进一步提供的是试剂盒、药物、以及制品，其包括如上所述的组合物(诸如分离核酸、载体、以及经工程改造的免疫细胞)中任一者。
由随后的具体实施方式和随附权利要求书，本发明的这些及其他方面及优点将变得显而易见。应了解的是，本文所述的各种实施方案的一项、一些、或所有性质可经组合以形成本发明的其他实施方案。
附图说明
图1显示用于克隆多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的示例性方法概述。
图2显示经MASCT治疗的转移性子宫颈癌患者的临床数据。下图显示患者于2013年12月(进行任何MASCT治疗之前)、2016年11月(进行MASCT而达到疾病稳定状态之后)、以及2017年11月进行的ECT结果。箭头和圆圈指出右骶髂关节骨上的转移部位，其显示响应于MASCT治疗而转移性肿瘤减少且没有附加转移。
图3A至图3B显示如ELISPOT所确定，在经过定制MASCT治疗之后，患者的PBMC对子宫颈癌抗原肽池(肽池)、以及该池中各肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。W/O＝未经过任何抗原肽刺激下的反应。ENV是指用不相关肽的实验。虚线指示无升高免疫反应的临限，如由每200,000个细胞的斑点数(反映IFNγ分泌水平)测量。图3B显示患者的PBMC对HPV18-E7、RGS-5、以及CEA肽的一致强烈免疫反应。
图4显示如实施例2所述的用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的示例性方法(“方法2”)。图5显示在肿瘤抗原特异性T细胞的制备中各种时间点的细胞增殖。图6A至图6B显示在各种共培养样本中的IFNγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。
图7显示如实施例2所述的用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的图4示例性方法的优化(“方法2m”)。图8显示在肿瘤抗原特异性T细胞的制备中各种时间点的细胞增殖。图9A至图9B显示在各种共培养样本中的IFNγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。图9C显示在各种共培养样本中的IFNγ+TNFα+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。
图10显示经肿瘤抗原肽的各自刺激的肿瘤抗原特异性细胞中的IFNγ+CD4+细胞和IFNγ+CD8+细胞的百分比。使用来自已在临床上受益于MASCT的患者的PBMC、以及衍生自CEA、RGS5、以及HPV18-E7的肿瘤抗原肽的池，制备肿瘤抗原特异性细胞。图11显示在各种T细胞样本中的独特TCR克隆体型(clonotype)的频率，其是通过下一代测序确定。
图12汇总来自肿瘤抗原特异性T细胞制备(使用来自已临床上受益于MASCT的患者的不同PBMC样本)的可能分别对CEA、RGS5、以及HPV18-E7肽具特异性的独特TCRα和TCRβ序列克隆体型的数目。基于如图11所示的各种样本中表达频率模式，选择克隆体型。通过批量T细胞样本的下一代测序获得结果。
图13显示HPV18-E7、RGS-5、以及CEA肽的片段的子池，将其针对肿瘤抗原特异性T细胞的特异性免疫反应筛选。显示RGS5-OLP5肽会引发肿瘤抗原特异性T细胞的最强烈特异性反应，此类肿瘤抗原特异性T细胞是使用方法2和方法2m制备。图14A显示在使用方法2m制备的肿瘤抗原特异性T细胞经过抗原肽片段子池的各自刺激之后，IFNγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。图14B显示在使用方法2制备的肿瘤抗原特异性T细胞经过抗原肽片段子池的各自刺激之后，IFNγ+TNFα+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。
图15A至图15B显示自通过如实施例3所述的方法2或方法2m制备的肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液制备肿瘤抗原特异性T细胞的示例性方法。图16显示在肿瘤抗原特异性T细胞的制备中各种时间点的细胞增殖。图17A显示在各种共培养样本中的IFNγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。图17B显示在各种共培养样本中的IFNγ+TNFα+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。
图18A至图18B显示在各种T细胞样本中的独特TCRα和TCRβ克隆体型的频率，其是通过下一代测序确定。
图19显示使用iPair分析仪通过单细胞测序确定的TCRα和TCRβ配对结果。在96孔盘中产生成功配对的TCRα和TCRβ序列的孔是以灰色显示，并标有孔位置编号。只有产生TCRβ序列的孔是以浅灰色显示，且只有产生TCRα序列的孔是以深灰色显示。
图20显示如实施例2所述的用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的示例性方法。
图21A显示在肿瘤抗原特异性T细胞的制备中各种时间点的细胞增殖。图21B显示在富集步骤之前和之后的IFNγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞的百分比。
图22A至图22B显示在各种共培养样本中的肿瘤抗原特异性T细胞群的细胞增殖和百分比。
图23显示用于肿瘤特异性TCR的示例性验证步骤。
图24显示示例性TCR构建体。
图25A至图25B显示示例性TCR构建体的组成和序列。
图26A至图26D显示09B03及相关TCR构建体的验证结果。
图27A至图27D显示P09E06及相关TCR构建体的验证结果。
图28A至图28C显示09B12及相关TCR构建体的验证结果。
图29A至图29C显示09E01及相关TCR构建体的验证结果。
图30A至图30D显示10F04及相关TCR构建体的验证结果。
图31A至图31C显示33D05及相关TCR构建体的验证结果。
图32A至图32D显示P09B08及相关TCR构建体的验证结果。
图33A至图33G显示09H05及相关TCR构建体的验证结果。
图34A至图34G显示09D01及相关TCR构建体的验证结果。
图35A至图35G显示33A02及相关TCR构建体的验证结果。
图36显示如ELISPOT测定所确定，在经过MASCT治疗之后，患者的PBMC对肿瘤抗原肽池、以及该池中各肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。百分比指示减少的肽浓度。例如，1/20基本肽指示在20倍稀释下的一般肿瘤抗原肽池。
图37显示用于使用来自患者SMZ的PBMC制备肿瘤抗原特异性T细胞的示例性两轮式方法的第1轮规程。
图38A显示在第1轮中各种时间点的细胞增殖。图38B显示在富集步骤之后的IFNγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞群的百分比。
图39A至图39E显示在第1轮的各种共培养样本中的肿瘤抗原特异性T细胞群的百分比。图39F显示在第1轮结束时所获得的IFNγ+CD4+肿瘤抗原特异性T细胞中的效应T细胞群。
图40显示用于使用来自患者SMZ的PBMC制备肿瘤抗原特异性T细胞的示例性两轮式方法的第2轮规程。
图41A显示在第2轮中各种时间点的T细胞和肿瘤特异性T细胞数目。图41B至图41C显示在第2轮的各种共培养样本中的肿瘤抗原特异性T细胞群的百分比。
图42显示在第1轮和第2轮的各种时间点的T细胞和肿瘤特异性T细胞数目。
具体实施方式
本专利申请提供使用PBMC或T细胞克隆多种特异性识别一种或多种肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)的平台，此类PBMC或T细胞是来自已在临床上受益于免疫疗法的个体，免疫疗法诸如多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)。本文所述方法包括富集来自T细胞与抗原负载树突细胞(“DC”)的共培养物的活化T细胞，随后将此类经富集的活化T细胞与抗原负载DC共培养，以提供用于批量和/或单细胞测序的肿瘤抗原特异性T细胞，以获得多种成对TCRα和TCRβ基因。T细胞的来源、以及本文所述方法中的富集和共培养步骤有助于特异性反应于目标肿瘤抗原肽的肿瘤抗原特异性T细胞达高百分比(例如，至少约1％或更高以用于T细胞样本的批量测序、或至少10％或更高以用于单个T细胞测序)，其对于通过下一代测序获得主要TCR克隆体型的TCRα和TCRβ基因的同源配对信息是必要的。还提供肿瘤特异性TCR、表达此类TCR的经工程改造的免疫细胞、以及使用此类经工程改造的免疫细胞治疗癌症的方法。
目前正在开发中和在所属技术领域在临床试验中的TCR一般是克隆自健康人类供体的PBMC，此类PBMC经预定的肿瘤抗原表位肽刺激。因此，用表达此类TCR的T细胞治疗的患者的临床反应并无法预测。相比的下，本专利申请的TCR是获自已在临床上受益于MASCT治疗的个体，其指示靶向目标肿瘤抗原肽中所含的(多种)肿瘤抗原表位的TCR的抗肿瘤潜能。
另外，目前已知克隆自健康人类供体的PBMC的TCR与其目标肿瘤抗原表位-HLA复合物具有低亲和性。需要优化TCRα和TCRβ链的氨基酸序列以改善TCR的亲和性，其增加TCR交叉反应、偏离目标(off-target)副作用、以及严重毒性的风险。相比的下，由于本专利申请的TCR是用已展示临床反应的癌症患者进行克隆，本文所述的TCR可能不需要进行亲和性优化，且因此确保改善临床上的安全性。
在一些实施方案中，TCR是克隆自属于一种族群体的个体，以提供具有反映该种族群体主要HLA单倍型的HLA限制的TCR。目前临床试验中大多数TCR为单倍型的HLA限制性，诸如高加索族群中主要的HLA-DPB1*0401和HLA-A*0201。本文所述方法可用于获得针对任何所关注种族群体的HLA限制性TCR，其包括例如可更有效治疗亚洲患者的HLA-A*1101或HLA-A*2402限制性TCR。
因此，本专利申请的一个方面提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(DC)群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，在该方法中同时获得特异性识别多种目标肿瘤抗原的TCR。
定义
除非另有定义如下，否则用语在本文中是如所属技术领域中所通常使用般使用。
如本文中所使用，“多种肿瘤抗原肽(a plurality of tumor antigenpeptides)”、“多种肿瘤抗原肽(multiple tumor antigen peptides)”、“肿瘤抗原肽的池(a pool of tumor antigen peptides)”、以及“肿瘤抗原肽池(a tumor antigenpeptides pool)”可互换使用，以指二或更多种肿瘤抗原肽的组合。
如本文中所使用，“载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigen presentingcells loaded with a plurality of tumor antigen peptides)”和“载有一种或多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigen presenting cells loaded with one or more tumorantigen peptides)”还称为“抗原负载抗原递呈细胞(antigen-loaded antigenpresenting cells)”。载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(“APC”)是在多种肿瘤抗原肽中具有增强的一种或多种肿瘤抗原肽或其片段呈现的APC。在一些实施方案中，抗原负载APC是抗原负载DC。在一些实施方案中，抗原负载APC是抗原负载PBMC。
如本文中所使用，“活化T细胞(activated T cells)”是指具有识别至少一种肿瘤抗原肽的T细胞受体的单株(例如，编码相同TCR)或多株(例如，具有编码不同TCR的克隆体)T细胞的群。活化T细胞可含有一种或多种T细胞亚型，其包括但不限于细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、以及记忆T细胞。
“肿瘤抗原特异性T细胞(tumor antigen-specific T cells)”和“肿瘤特异性T细胞(tumor specific T cells)”在本文中可互换使用。
如本文中所使用，“T细胞受体(T cell receptor)”或“TCR”是指内源性或经工程改造的T细胞受体，其包括胞外抗原结合域，该胞外抗原结合域结合至结合在MHC分子中的特异性抗原表位。TCR可包括TCRα多肽链和TCRβ多肽链。“肿瘤特异性TCR(tumor-specificTCR)”是指特异性识别肿瘤细胞所表达的肿瘤抗原的TCR。“TCR-T”是指表达重组TCR的T细胞。
如本文中所使用，“免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor)”是指抑制或阻断在免疫细胞(诸如T细胞)或肿瘤细胞上的抑制性免疫检查点分子的药剂(包括抗体)。“免疫检查点分子(immune checkpoint molecules)”包括提升对肿瘤细胞的免疫信号的分子(即，“共刺激分子(co-stimulatory molecules)”)、或降低对肿瘤细胞的免疫信号的分子(即，“抑制性免疫检查点分子(inhibitory immune checkpoint molecules)”)。
如本文中所使用，“治疗(treatment/treating)”是获得有益或所期望结果(包括临床结果)的方式。针对本发明的目的，有益或所期望临床结果包括但不限于下列中的一者或多者：减少又一种疾病所导致的症状、消减疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的发生或复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的(部分或完全)缓解、降低一种或多种治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加生活质量、和/或延长存活。“治疗(treatment)”还涵盖的是癌症病理结果的减少。本发明的方法设想到这些治疗方面中的任一者或多者。
如本文中所使用，“延迟(delaying)”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、推迟、稳定、和/或延后疾病的发展。此延迟可为不同时间长度，其取决于疾病史和/或正接受治疗的个体。如对于所属领域技术人员而言为明显的，足够或显著的延迟实际上可涵盖预防，因为个体不会发展疾病。“延迟”癌症发展的方法当与未使用该方法比较时，是降低给定时段中疾病发展的可能性和/或降低给定时段中疾病程度的方法。此模拟较一般是基于临床研究、使用统计上显著的个体数。可使用标准方法检测癌症发展，标准方法包括但不限于计算机断层扫描(CAT扫描)、磁共振造影(MRI)、腹部超音波、凝血测试、动脉摄影、或活检。发展也可指最初可能为不可检测的癌症进展，且包括发生、复发和发作。
用语“个体(individual)”、“受试者(subject)”、以及“患者(patient)”在本文中可互换使用，以描述哺乳动物，包括人类。个体包括但不限于人类、牛、马、猫、犬、啮齿动物、或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，个体罹患诸如癌症的疾病。在一些实施方案中，个体需要治疗。
如所属技术领域中所了解，“有效量(effective amount)”是指足以产生所期望治疗成果(例如，降低一种或多种癌症症状的严重性或减少其持续时间、稳定一种或多种癌症症状的严重性、或消除一种或多种癌症症状)的组合物(例如抗原负载DC、活化T细胞、或表达TCR的经工程改造的免疫细胞)的量。就治疗用途而言，有益或所期望结果包括例如减少一种或多种疾病导致的症状(生物化学、组织学、和/或行为方面)，该症状包括在疾病发展期间呈现的并发症和中间病理表型；增加罹患疾病者的生活质量；降低其他治疗疾病所需药物的剂量；增强另一种药物的效果；延迟疾病的进展；和/或延长患者的存活。
“辅助性治疗(adjuvant setting)”是指其中个体已具有癌症病史且通常(但不一定)已对疗法有反应的临床环境，疗法包括但不限于手术(例如，手术切除)、放射疗法、以及化疗。然而，由于其癌症病史，将这些个体视为处于疾病发展的风险。“辅助性治疗(adjuvant setting)”中的治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如，在辅助性治疗中的个体被视为“高风险”或“低风险”时)是取决于多个因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。
“新辅助性治疗(neoadjuvant setting)”是指其中方法是在主要/决定性疗法之前进行的临床环境。
如本文中所使用，“组合疗法(combination therapy)”意指第一药剂是与另一种药剂配合施用。“与……配合(in conjunction with)”是指一种治疗型态在除了另一种治疗型态之外下施用，诸如本文所述的组合物(例如抗原负载DC、活化T细胞、或表达TCR的经工程改造的免疫细胞)在除了另一种药剂(诸如免疫检查点抑制剂)的施用外施用至相同个体。因此，“与……配合”是指一种治疗型态在另一种治疗型态递送至个体之前、期间、或之后施用。将此类组合视为属于单一治疗方案(regimen或regime)的部分。
如本文中所使用，用语“同时施用(simultaneous administration)”意指在组合疗法中的第一疗法和第二疗法是以不多于约15分钟(诸如不多于约10、5、或1分钟中的任一者)的时间间隔施用。当第一疗法和第二疗法是同时施用时，第一疗法和第二疗法可含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或不同组合物(例如，第一疗法在一种组合物中，而第二疗法是含在另一种组合物中)中。
如本文中所使用，用语“依序施用(sequential administration)”意指在组合疗法中的第一疗法和第二疗法是以多于约15分钟(诸如多于约20、30、40、50、60、或更多分钟中的任一者)的时间间隔施用。可先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法可含在不同组合物中，此类不同组合物可含在相同或不同包装或试剂盒中。
如本文中所使用，用语“并行施用(concurrent administration)”意指组合疗法中的第一疗法的施用与第二疗法的施用彼此重迭。
如本文中所使用，以“药学上可接受(pharmaceutically acceptable)”或“药理上相容(pharmacologically compatible)”意指不是在生物或其他方面上非所期望的材料，例如，可将该材料并入施用至个体的药物组合物中，而不会造成任何显著非所期望的生物作用，或以有害方式与含有其的组合物中的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地已符合所需毒物测试标准和制造测试标准，和/或包括于美国食品药物管理局(U.S.Food and Drug administration)所制作的非活性成分指南(InactiveIngredient Guide)。
以下定义可用于评估基于目标病变的反应：“完全反应(complete response)”或“CR”是指所有目标病变消失；“部分反应(partial response)”或“PR”是指目标病变的最长直径总和(SLD)减少至少30％，其是以基线SLD作为参考；“疾病稳定(stable disease)”或“SD”是指目标病变的缩小不足以符合PR的条件，其增加还不足以符合PD的条件，其是以自治疗开始以来的最低点(nadir)SLD作为参考；且“疾病进展(progressive disease)”或“PD”是指目标病变的SLD增加至少20％(其是以自治疗开始以来所记录的最低点SLD作为参考)，或是存在一个或多个新病变。
以下反应评估的定义可用于评估非目标病变：“完全反应(complete response)”或“CR”是指所有非目标病变消失；“疾病稳定(stable disease)”或“SD”是指不符合CR或PD的条件的一个或多个非目标病变持续存在；且“疾病进展(progressive disease)”或“PD”是指现有(多个)非目标病变的“明确进展(unequivocal progression)”，或者将一个或多个新病变的出现视为疾病进展(如果完全基于(多个)非目标病变的进展针对一时间点来评估个体的PD，则需要符合附加的标准)。
如本文中所使用，用语“细胞(cell)”、“细胞系(cell line)”、以及“细胞培养物(cell culture)”可互换使用，且所有此类名称皆包括子代。据了解，由于人为或意外的突变，所有子代的DNA含量可能不完全相同。具有与原始细胞相同的功能或生物活性的变体子代包括在内。
用语“肽(peptide)”是指不多于约100个氨基酸的氨基酸聚合物(包括蛋白质的片段)，其可为直链或支链，包括经修饰氨基酸，和/或以非氨基酸间隔。该用语还涵盖经过自然修饰或介入修饰的氨基酸聚合物，其包括例如双硫键形成、醣基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰。还包括在此用语内的是(例如)含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的肽、以及所属技术领域中已知的其他修饰。本文所述的肽可天然存在，即，获自或衍生自天然来源(例如血液)，或经过合成(例如，经化学合成、或通过重组DNA技术合成)。
本文中所使用的用语“抗体(antibody)”是以最广泛的意义使用，且具体涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要其展现所期望生物活性。
“抗体片段(antibody fragment)”包括完整抗体的部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段；双价抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；以及自抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所使用，用语“特异性结合至(specifically binds to)”、“识别(recognizes)”、“特异性识别(specifically recognizes)”、“靶向(targets)”、或“对……具特异性(specific for)”是指可测量且可再现的相互作用，诸如目标与抗体之间、或受体与配体之间、或受体与表位/MHC复合物之间的结合，其确定在分子(包括生物分子)的异质群体存在下目标的存在。例如，结合至或特异性结合至目标表位的TCR是以较大亲合性、结合性、更加容易地、和/或以更长持续时间结合目标表位/MHC复合物(相较于其结合至其他表位/MHC复合物)的TCR。在一个实施方案中，如所测量(例如通过放射免疫测定法(RIA))，TCR与不相关表位/MHC复合物的结合程度小于TCR与目标表位/MHC复合物的结合的约10％。在某些实施方案中，特异性结合至目标表位(即，目标表位/MHC复合物)的TCR具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，TCR特异性结合至来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在另一实施方案中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。
如本文中所使用的用语“分离核酸(isolated nucleic acid)”旨在意指基因组、cDNA、或合成来源或其一些组合的核酸，由于其来源，该“分离核酸”(1)与其中在自然界发现的“分离核酸”的多核苷酸的全部或部分不相关联，(2)是可操作地连接至其在自然界中不会连接的多核苷酸，或(3)不会以更大序列的部分存在于自然界中。
据了解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“由……所组成(consisting)”和/或“基本上由……所组成(consisting essentially of)”方面和实施方案。
本文中所提及的“约(about)”一值或参数包括(并描述)关于该值或参数本身的变动。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
本文所使用的用语“约X至Y(about X-Y)”具有与“约X至约Y(about X to aboutY)”相同的意义。
如本文中所使用，提及“不/非(not)”为一值或参数通常意指并描述一值或参数“以外(other than)”。例如，该方法不用于治疗X类型的癌症意指该方法是用于治疗X以外的类型的癌症。
如本文和随附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“该(the)”皆包括复数指称，除非上下文另有明确说明。
II.获得肿瘤特异性TCR的方法
本专利申请提供获得多种特异性识别一种或多种来自个体的PBMC或T细胞的目标肿瘤抗原肽的T细胞受体(TCR)的方法，该个体已在临床上受益于免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法是过继性T细胞疗法，其包括向个体施用有效量的特异性识别目标肿瘤抗原肽或其片段的活化T细胞。在一些实施方案中，免疫疗法是多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，其包括向个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括一种或多种目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，获得特异性识别单一目标肿瘤抗原肽或其片段(例如，目标肿瘤表位)的TCR。在一些实施方案中，使用该方法同时获得特异性识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括使肿瘤抗原特异性T细胞群经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；其中该肿瘤抗原特异性T细胞群是通过下列制备：i)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；ii)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；以及iii)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群；且其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)将经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及b)使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该经富集的活化T细胞群是通过下列制备：i)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；以及ii)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；且其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)使第一共培养物经受富集过程以获得经富集的活化T细胞，该第一共培养物包括载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群和来自个体的T细胞群；b)将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及c)使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；且其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该第一共培养基包含IL-2和抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)达至少约6个月(例如，至少约1年、2年、或更多年)。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子或细胞表面分子；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别IFNγ。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含多种细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；并将抗CD3(例如，OKT-3)抗体和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群；d)第三共培养步骤，其包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)的群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及e)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC或DC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)；c)第二共培养步骤，其包括在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群；d)第三共培养步骤，其包括：将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有目标肿瘤抗原肽的第一APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养约5至9天(例如，7天)；向该第三共培养物添加载有目标肿瘤抗原肽的第二APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群并培养约5至9天(例如，7天)；以及向该共培养物添加载有目标肿瘤抗原肽的第三APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群并培养约5至9天(例如，7天)，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及e)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第一APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的此类APC是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群；d)筛选步骤，其包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群；e)第三共培养步骤，其包括：将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有目标肿瘤抗原肽的该APC群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及f)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)。
本文所述方法中任一者可用于同时获得特异性识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR，其是通过在第一共培养步骤、富集步骤、以及第二共培养步骤中使用载有多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC或DC)。在一些实施方案中，载有个别目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)是用于第三共培养步骤中，以制备个别肿瘤抗原特异性T细胞群以用于测序。在一些实施方案中，载有多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)是用于第三共培养步骤中，以制备汇集肿瘤抗原特异性T细胞群以用于测序。在一些实施方案中，使用该方法获得特异性识别至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、或更多种目标肿瘤抗原肽中任一者的TCR。
因此，在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有该多种目标肿瘤抗原肽的第一DC群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该多种目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对来自该多种目标肿瘤抗原肽的一种或多种目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(“MASCT”)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括此类目标肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，该一种或多种目标肿瘤抗原肽是来自该多种肿瘤抗原肽，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)。
TCR可克隆自已在临床上受益于MASCT的任何个体，该MASCT包括“MASCT”小节中所述的MASCT方法中的任一者或组合。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有部分反应(PR)达至少约6个月(例如，至少约1年、2年、或更多年)。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有完全反应(CR)达至少约6个月(例如，至少约1年、2年、或更多年)。在一些实施方案中，在接受该MASCT后，该个体具有疾病稳定(SD)。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)可选地向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的DC，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；b)将载有该多种肿瘤抗原肽的DC群与第一T细胞群共培养，以获得活化T细胞群；c)向该个体施用有效量的此类活化T细胞；d)在施用此类活化T细胞后达到PR、CR、或SD后，自该个体获得第二T细胞群；e)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与该第二T细胞群共培养，以获得第一共培养物；f)富集步骤，其包括使该共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；g)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及h)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该第二T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该第二T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，该一种或多种目标肿瘤抗原肽是来自该多种肿瘤抗原肽，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)可选地向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC；d)将载有该多种肿瘤抗原肽的DC群与第一T细胞群共培养，以获得活化T细胞群；e)向该个体施用有效量的此类活化T细胞；f)在施用此类活化T细胞后达到PR、CR、或SD后，自该个体获得第二T细胞群；g)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与该第二T细胞群共培养，以获得第一共培养物；h)富集步骤，其包括使该共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；i)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及j)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该第二T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该第二T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，该一种或多种目标肿瘤抗原肽是来自该多种肿瘤抗原肽，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)可选地向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的DC群与第一T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂；以及在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群；c)向该个体施用有效量的此类活化T细胞；d)在施用此类活化T细胞后达到PR、CR、或SD后，自该个体获得第二T细胞群；e)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与该第二T细胞群共培养，以获得第一共培养物；f)富集步骤，其包括使该共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；g)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及h)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该第二T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该第二T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，该一种或多种目标肿瘤抗原肽是来自该多种肿瘤抗原肽，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。
在一些实施方案中，提供一种获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括：a)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)可选地向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC；d)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的DC群与第一T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群；e)向该个体施用有效量的此类活化T细胞；f)在施用此类活化T细胞后达到PR、CR、或SD后，自该个体获得第二T细胞群；g)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群与该第二T细胞群共培养，以获得第一共培养物；h)富集步骤，其包括使该共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；i)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％(例如，至少约20％、或至少约50％)的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及j)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序(例如，单细胞测序)，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该第二T细胞群存在于PBMC中。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该第二T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，诸如SHR-1210)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，DC或PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、2:1、或4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约4:1)。在一些实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞的群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，该一种或多种目标肿瘤抗原肽是来自该多种肿瘤抗原肽，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群共培养约5至9天(例如，约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤(例如，一次或两次)。在一些实施方案中，该方法进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。
在一些实施方案中，TCR是克隆自对MASCT方法有反应的个体，例如在该MASCT后CTC数量减少或CTC数量低的个体；具有疾病稳定(SD)、完全反应(CR)、或部分反应(PR)的临床评估的个体。在一些实施方案中，该个体保持PR、CR、或SD达至少约6个月(例如，至少约1年、2年、或更多年)。在一些实施方案中，该个体对该目标肿瘤抗原肽具有强烈的特异性免疫反应。可使用所属技术领域中任何已知的方法，例如通过测量经过目标肿瘤抗原肽刺激后来自T细胞(或PBMC)的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)、或细胞因子释放(诸如IFNγ或TNFα)的水平，确定对目标肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用基于抗体的测定法(诸如ELISPOT)来定量细胞毒性因子、或细胞因子(诸如IFNγ)水平。在一些实施方案中，将响应于目标肿瘤抗原肽的来自T细胞(或PBMC)的细胞因子(诸如IFNγ)释放水平标准化至参考物(诸如基线细胞因子释放水平、或响应于不相关肽的来自T细胞(或PBMC)的非特异性细胞因子释放水平)，以提供细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值。在一些实施方案中，在ELISPOT测定中，大于约1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中的任一者的细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值指示对目标肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫反应。在一些实施方案中，克隆TCR的方法进一步包括确定个体中(诸如在该个体的PBMC样本中)的多种肿瘤抗原肽中各自的特异性免疫反应。
可自生物样本分离T细胞，该生物样本是来自接受MASCT后的个体。在一些实施方案中，生物样本是获自经过一个周期的MASCT后的个体。在一些实施方案中，生物样本是获自经过至少2、3、4、5、或更多个周期中的任一者的MASCT后的个体。在一些实施方案中，在接受MASCT后至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、或3个月中的任一者后，自个体获得生物样本。在一些实施方案中，在接受MASCT后不多于约6个月、3个月、2个月、1个月、或更少中任一者后，自个体获得生物样本。在一些实施方案中，生物样本是血液样本。在一些实施方案中，生物样本是PBMC样本。在一些实施方案中，生物样本是T细胞样本。在一些实施方案中，生物样本是含有CTL的肿瘤样本。可使用所属技术领域中任何已知的方法，例如通过流动式细胞测量术或离心方法，自生物样本分离T细胞。在一些实施方案中，对自生物样本获得的多个T细胞就其对多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应进行筛选，其是例如通过用多聚体(诸如五聚体或dextramer)染色，或通过确定细胞的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)、或细胞因子释放(诸如IFNγ或TNFα)的水平。
T细胞特异性识别的目标肿瘤抗原肽可为来自用于MASCT的(多个)肿瘤抗原肽池的任何肿瘤抗原肽或其片段。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽包括MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽包括MHC-II限制性表位。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽是一般癌症肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽是癌症类型特异性肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽是新抗原肽。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽是衍生自选自下列的肿瘤抗原：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、以及AFP。在一些实施方案中，目标肿瘤抗原肽包括衍生自CEA、RGS5、或HPV18-E7的表位。
可使用任何已知的下一代测序方法对肿瘤抗原特异性T细胞进行测序，以提供多对编码TCRα和TCRβ的基因。在一些实施方案中，下一代测序是单细胞下一代测序。在一些实施方案中，下一代测序是批量下一代测序。在一些实施方案中，测序步骤包括肿瘤抗原特异性T细胞的TCR的免疫组库的下一代测序。在一些实施方案中，测序步骤包括：扩增来自肿瘤抗原特异性T细胞(例如，单细胞或细胞群)的编码TCRα和TCRβ的基因，以提供扩增核酸的样本；以及使此类扩增核酸经受下一代测序。在一些实施方案中，使用PCR方法以特异性黏合至已知TCR可变域的引子，扩增编码TCRα和TCRβ的基因。在一些实施方案中，使用扩增子拯救多重PCR(amplicon rescued multiplex PCR，或arm-PCR)来扩增编码TCRα和TCRβ的基因。参见例如美国专利号7,999,092。在一些实施方案中，使肿瘤抗原特异性T细胞经受批量下一代测序数据和单细胞下一代测序，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因。在一些实施方案中，该测序步骤包括此类肿瘤抗原特异性T细胞的第一部分的批量测序，以提供多个编码TCRα和TCRβ的基因；以及此类肿瘤抗原特异性T细胞的第二部分的单细胞测序，其提供该多个编码TCRα和TCRβ的基因的同源配对信息，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供多种TCR。
市售试剂盒和服务可用于TCR的单细胞下一代测序，包括但不限于
(iReportoire)、
(Adaptive Biotech)、
Human TCRa/b ProfilingKit(Clontech)、ION
Immune Repertoire and Assay Plus(Thermofisher)。例如，
方法包括两个PCR扩增步骤，随后进行下一代测序。简而言之，使肿瘤抗原特异性T细胞样本在一个或多个96孔盘中经受单细胞接种。在第一PCR步骤中，在96孔盘的各孔中执行RT-PCR，其采用巢式多重引子，此类引子覆盖TCR的α和β基因座(locus)两者，且在内部引子的5’端上包括共享(communal)正向和反向结合位。包括在C区基因引子上的是内嵌条形码(in-line barcode)，其作为盘识别符，使得多个96孔盘可在测序芯片(sequencing flowcell)上多任务进行。在RT-PCR后，产物经拯救。使用双索引引子执行第二PCR，此类双索引引子完成在第一PCR期间引入的转接子(adaptor)并提供盘位置信息。在此步骤中，各孔(且因此各单细胞)是以独特性条形码表示。在一些情况下，还对来自其余细胞(未经受单细胞接种者)的RNA执行各链的批量下一代测序。使用
Analyzer软件分析测序数据，该软件还有利于单细胞测序数据与批量测序数据的简易比较。如
Analyzer所确定，基于各孔中的数据来获得编码TCRα和TCRβδ的基因的同源配对信息。另外，参见例如iPair AnalyzerUser’s Guide,iRepertoire Inc.(docs.wixstatic.com/ugd/c9f231_3c322d131c084e908eea039c42304ff7.pdf)，其内容以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，在该下一代测序之前，此类肿瘤抗原特异性T细胞经载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)刺激(即，经刺激肿瘤抗原特异性T细胞)。在一些实施方案中，将经载有目标肿瘤抗原肽的APC刺激的肿瘤抗原特异性T细胞分类，以分离IFNγ+T细胞以用于下一代测序。在一些实施方案中，使对照T细胞群经受下一代测序，以提供基线TCRα和TCRβ克隆体型概况。在一些实施方案中，对照T细胞群是来自个体的未经刺激PBMC。在一些实施方案中，对照T细胞群是经一种或多种不相关肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，选择仅在经刺激肿瘤抗原特异性T细胞的测序数据中识别出(但在对照T细胞群的测序数据中未识别出)的TCRα和TCRβ基因，以提供肿瘤特异性TCR。在一些实施方案中，选择在经刺激肿瘤抗原特异性T细胞的测序数据中(相较于在对照T细胞群的测序数据中)以至少约2x、5x、10x、20x、50x、100x、1000x、或更多中任一者的频率存在的TCRα和TCRβ基因，以提供肿瘤特异性TCR。
在一些实施方案中，在MASCT治疗后不同时间，获得来自个体的多个T细胞群(例如，PBMC)。选择自使用各T细胞群制备的肿瘤抗原特异性T细胞所一致识别的TCRα和TCRβ基因，以提供肿瘤特异性TCR。在一些实施方案中，如果在二或更多(诸如2、3、4、5、6、或更多)个肿瘤抗原特异性T细胞群的测序数据中发现TCRα和TCRβ基因，此类肿瘤抗原特异性T细胞群是使用来自个体的不同T细胞样本制备，且此类TCRα和TCRβ基因是通过单细胞测序配对，则选择该对TCRα和TCRβ基因以提供肿瘤特异性TCR。
本文所述方法中任一者可包括下列步骤中的一者或多者：(i)在宿主免疫细胞中表达各对编码TCRα和TCRβ的基因，以提供表达TCR的经工程改造的免疫细胞；以及评估该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的反应；(ii)确定各TCR识别的抗原表位；(iii)确定各TCR的HLA限制(包括MHC I或MHC II限制、以及可选地HLA单倍型限制)；(iv)确定各TCR的结合性和交叉反应性；(v)各TCR的亲和力成熟；(vi)增强各TCR中TCRα和TCRβ链的配对；以及(vii)增强各TCR的表达。获得多种特异性识别来自个体的目标肿瘤抗原肽的TCR的示例性方法概述是显示于图1，该个体已在临床上受益于MASCT。
在一些实施方案中，合成包括各对TCRα和TCRβ基因的分离核酸。在一些实施方案中，针对各对TCRα和TCRβ基因，合成编码该TCRα基因的第一分离核酸、以及编码该TCRβ基因的第二分离核酸。在一些实施方案中，TCRα和TCRβ基因经密码子优化(例如，用于在人类细胞中表达)。在一些实施方案中，TCRα和TCRβ基因的各自可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，TCRα和TCRβ基因可操作地连接至相同启动子。在一些实施方案中，TCRα和TCRβ基因可操作地连接至不同启动子。在一些实施方案中，将分离核酸并入载体中，诸如病毒载体，例如慢病毒载体(lentiviral vector)。
在一些实施方案中，将分离核酸转导(诸如通过病毒载体、或通过物理或化学方法)至宿主免疫细胞(诸如T细胞)中，以表达由TCRα和TCRβ基因编码的TCR。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是CD3+细胞。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是选自：PBMC、细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞、以及调节性T细胞。在一些实施方案中，测定表达TCR的宿主免疫细胞对目标肿瘤抗原肽的特异性免疫反应，以用于验证。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是衍生自细胞系。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是初代细胞。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是衍生自癌症患者。在一些实施方案中，宿主免疫细胞是衍生自健康供体。
进一步提供的是一种获得特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其是使用如本文所述的获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法中的任一者，其中基于表达该TCR的经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的反应来选择该TCR。
可使用所属技术领域中任何已知的方法，确定TCR的HLA限制。参见例如LarcheM.Methods Mol.Med.(2008),138:57-72。在一些实施方案中，TCR为MHC I类限制性。在一些实施方案中，TCR为MHC II类限制性。在一些实施方案中，在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR具有某些种族群体中主要的HLA单倍型限制，此类种族群体包括但不限于非洲人、非洲裔美国人、亚洲人、高加索人、欧洲人、西班牙裔、太平洋岛民等。在一些实施方案中，该TCR具有亚洲人中主要的HLA单倍型限制，例如HLA-A*1101或HLA-A*2402限制性TCR。在一些实施方案中，该TCR具有高加索人中主要的HLA单倍型限制，例如HLA-DPB1*0401或HLA-A*0201限制性TCR。
可将在本文中所获得的TCR进一步工程改造，以改善TCR的物理/化学性质和/或功能。例如，经工程改造的肿瘤特异性TCR可具有增强的表达水平、改善的稳定性、增强的与MHC目标肿瘤特异性抗原肽复合物的结合亲和力、和/或增强的传讯。在一些实施方案中，基于使用TCR来接受免疫疗法治疗的个体的MHC亚型，将TCR工程改造。在一些实施方案中，工程改造包括使TCR可变区中的一个或多个位置突变。在一些实施方案中，工程改造包括提供融合蛋白，该融合蛋白包括TCR的一个或多个域或片段。在一些实施方案中，可将TCR的TCRα和TCRβ链工程改造以具有增强的配对。可使用所属技术领域中任何已知的方法，以用于表位确定、亲和力成熟、结合性和交叉反应性确定、表达增强、以及配对增强。
所期望的是，可将本文所述的用于制备抗原负载APC、第一、第二、以及第三共培养步骤、富集步骤、测序步骤、MASCT等的任何步骤和参数彼此组合，犹如每一个组合经个别描述。
用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法
本专利申请提供制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：将经富集的活化T细胞群或储备肿瘤抗原特异性T细胞群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)(本文称为“抗原负载APC”)群共培养，其中自已在临床上受益于MASCT的个体获得该经富集的活化T细胞群或该储备肿瘤抗原特异性T细胞群，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是使用国际专利申请号PCT/CN2018/082945中所述的方法中任一者获得，其全文以引用方式并入本文中
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：将经富集的活化T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的DC群共培养，其中通过使第一共培养物经受富集过程来制备该经富集的活化T细胞群，且其中该第一共培养物包括T细胞群和载有该肿瘤抗原肽的第一DC群，其中该第一共培养物中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始共培养基中将该抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT-3)和可选地一种或多种细胞因子添加至该共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)使第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞群，其中该第一共培养物包括载有目标肿瘤抗原肽的第一DC群和T细胞群；以及b)将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得用于TCR克隆的T细胞群，其中步骤a)中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有目标肿瘤抗原肽的第一DC群与T细胞群共培养，以获得包括活化T细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有目标肿瘤抗原肽的第一DC群与T细胞群共培养，以获得包括活化T细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)或细胞表面分子；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC群中。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有目标肿瘤抗原肽的第一DC群与T细胞群共培养，以获得包括活化T细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以获得用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC群中。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)使第一DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群；b)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与T细胞群共培养，以获得包括活化T细胞的第一共培养物；c)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞群；d)使第二树突细胞群与该目标肿瘤抗原肽接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群；以及e)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养，以获得第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以获得用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC群中。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)使第一DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的第一DC群；b)在DC成熟培养基中培养载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群，该DC成熟培养基包含toll样受体(toll-like receptor,TLR)激动剂；c)第一共培养步骤，其包括：在第一共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群共培养，以获得包括活化T细胞的第一共培养物，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)、免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；d)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)或细胞表面分子；e)使第二DC群与该目标肿瘤抗原肽接触，以获得第二抗原负载DC群；f)在DC成熟培养基中培养该第二抗原负载DC群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂；以及g)第二共培养步骤，其包括：在第二初始共培养基中将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养，以获得第二共培养物，该第二初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以提供用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，通过诱导来自PBMC的单核球群分化来获得第一DC群和/或第二DC群。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：将肿瘤抗原特异性T细胞群与载有一种或多种目标肿瘤抗原肽的APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群是使用上述制备用于克隆TCR的T细胞的方法中的任一者获得。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞获自已在临床上受益于MASCT的个体的PBMC。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、1:2、或1:4)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群共培养约5至9(例如，约7)天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞群与该抗原负载APC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复共培养，例如一次或两次。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞群是获自肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有目标肿瘤抗原肽的第一DC群与T细胞群共培养，以获得包括活化T细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞群；c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得第一肿瘤抗原特异性T细胞群；d)第三共培养步骤，其包括将来自该第一肿瘤抗原特异性T细胞群的肿瘤抗原特异性T细胞亚群与载有该目标肿瘤抗原肽的第三APC(例如，DC、PBMC、或细胞系APC，诸如LCL)群共培养，从而提供用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞亚群与该第三抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、1:2、或1:4)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性T细胞亚群与该第三抗原负载DC群共培养约5至9(例如，约7)天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性T细胞亚群与该第三抗原负载DC群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15)和抗CD3抗体(例如，OKT3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤，例如一次、两次、或三次。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞亚群是获自第一肿瘤抗原特异性T细胞群的冷冻储备液。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2、或多种细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载DC群与该T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC群中。
制备用于TCR克隆的T细胞或用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的示例性方法示出于图4、图7、以及图15A至图15B中，并描述于实施例2至实施例3中。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：(a)使衍生自来自个体的PBMC群的DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将T细胞群(例如，存在于PBMC中)与第一抗原负载DC群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，以获得经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群共培养，以获得第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及在该第二共培养开始后约1天至约3天(例如，约2天)，将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，从而提供用于TCR克隆的T细胞群，其中该第一共培养步骤中的该T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，在DC成熟培养基中培养此类抗原负载DC，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，将此类抗原负载DC在该DC成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该T细胞群与该抗原负载DC群共培养约2至3天。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约15至20天(例如，约16天)。示例性方法显示于图4和图7中。
在一些实施方案中，提供一种制备用于TCR克隆的T细胞群的方法，其包括：(a)在共培养基中将肿瘤抗原特异性T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的第一APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)群共培养约5至9天(例如，约7天)，以获得第一肿瘤抗原特异性T细胞群，该共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)和抗CD3抗体；以及(b)将该第一肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二APC群共培养约5至9天(例如，约7天)，从而提供用于TCR克隆的第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中该肿瘤抗原特异性T细胞群是获自已在临床上受益于MASCT的个体，且其中至少约10％(例如，至少20％或50％)的用于TCR克隆的该T细胞群对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应。在一些实施方案中，重复刺激步骤一次或两次。在一些实施方案中，该方法进一步包括：将该第二肿瘤抗原特异性T细胞群与载有此类肿瘤抗原特异性T细胞的第三APC群共培养约5至9天(例如，约7天)，从而提供第三肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，APC是LCL细胞，其具有或不具有喂养细胞(feeder cell)。在一些实施方案中，APC是DC。在一些实施方案中，该共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及OKT3。在一些实施方案中，抗原负载APC与第一、第二、或第三肿瘤抗原特异性T细胞群之间的比率为约1:1至约1:10(例如，约1:4)。示例性方法显示于图15A至图15B中。
用于测序步骤的肿瘤抗原特异性T细胞具有高百分比的对目标肿瘤抗原肽或其表位有特异性反应的T细胞。例如，至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高中任一者的用于测序步骤的肿瘤抗原特异性T细胞对目标肿瘤抗原肽或其表位有特异性反应。在一些实施方案中，约20至90％、20至50％、50至95％、20至80％、50至70％、40至60％、或40％至80％中任一者的用于测序步骤的肿瘤抗原特异性T细胞对目标肿瘤抗原肽或其表位有特异性反应。由于T细胞表达大量的TCRα和TCRβ克隆体型，故高百分比的可对肿瘤抗原肽有特异性反应的T细胞对于获得TCRα和TCRβ基因的成功同源配对信息是重要的。
在一些实施方案中，分离细胞群的任何实施方案中的肿瘤抗原特异性T细胞能够在体内或体外引发对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞能够在人类个体中增加对多于一种肿瘤抗原肽的细胞毒性T细胞活性。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞的特征在于经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后，促发炎信号分子的高表达或分泌水平。在一些实施方案中，通过以下确定表达或分泌水平：将肿瘤抗原特异性T细胞经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后的分子(诸如促发炎信号分子)的表达或分泌水平与经不相关肽刺激后的表达或分泌水平进行比较。在一些实施方案中，分子的对照表达或分泌水平是在相同测定条件下测量的对照T细胞群中分子的表达或分泌水平。在一些实施方案中，对照T细胞群是经一种或多种不相关肽(诸如未对应于T细胞受体抗原的肽、或随机肽)诱导的T细胞群。在一些实施方案中，分子的对照表达或分泌水平是多个对照T细胞群中分子的平均或中位数表达或分泌水平。在一些实施方案中，在肿瘤抗原特异性T细胞中分子的高表达或分泌水平是对照表达或分泌水平的至少约1.5、2、2.5、3、4、5、10、20、50、100、1000、或更多倍中任一者。
在一些实施方案中，经目标肿瘤抗原肽刺激后，肿瘤抗原特异性T细胞表达多种促发炎分子，诸如IFNγ、TNFα、颗粒酶B、穿孔素、或其任何组合。在一些实施方案中，经目标肿瘤抗原肽刺激后，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原特异性T细胞分泌INF-γ。在一些实施方案中，经目标肿瘤抗原肽刺激后，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原特异性T细胞分泌TNF-α。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是通过包括下列的步骤制备：(a)使衍生自来自个体的PBMC群的DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得第一抗原负载DC群；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将T细胞群(例如，存在于PBMC中)与该第一抗原负载DC群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及在该第一共培养开始后不多于约7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该第一共培养物，以获得第一共培养物；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，以获得经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在共培养基中将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，从而提供此类肿瘤抗原特异性T细胞，该共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)、以及抗CD3抗体。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该T细胞群与该抗原负载DC群共培养约13至14天。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约2:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约9至13天。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是通过包括下列的步骤制备：(a)使衍生自来自个体的PBMC群的DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将T细胞群(例如，存在于PBMC中)与第一抗原负载DC群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，以获得经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在共培养基中将该经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群共培养，从而提供此类肿瘤抗原特异性T细胞，该共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)、以及抗CD3抗体。在一些实施方案中，在DC成熟培养基中培养此类抗原负载DC，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，将此类抗原负载DC在该DC成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率为约15:1。在一些实施方案中，将该T细胞群与该抗原负载DC群共培养约3至4天。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约2:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约13至23天。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是通过包括下列的步骤制备：(a)使衍生自来自个体的PBMC群的DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将T细胞群(例如，存在于PBMC中)与第一抗原负载树突细胞群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，以获得经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群共培养，以获得第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及在该第二共培养开始后约1天至约3天(例如，约2天)，将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，从而提供此类肿瘤抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，在DC成熟培养基中培养此类抗原负载DC，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，将此类抗原负载DC在该DC成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该T细胞群与该抗原负载DC群共培养约2至3天。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约15至20天(例如，约16天)。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是通过包括下列的步骤制备：(a)使衍生自来自个体的PBMC群的DC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将T细胞群(例如，存在于PBMC中)与第一抗原负载DC群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，以获得经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群共培养，以获得第二共培养物，该初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及在该第二共培养开始后约1天至约3天(例如，约2天)，将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第二共培养物，从而提供此类肿瘤抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，在DC成熟培养基中培养此类抗原负载DC，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，将此类抗原负载DC在该DC成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该T细胞群与该第一抗原负载DC群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该T细胞群与该抗原负载DC群共培养约2至3天。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该第二抗原负载DC群共培养约15至20天(例如，约16天)。
在一些实施方案中，该方法使用自先前已接受免疫疗法(例如，MASCT)的个体获得的PBMC，以制备用于测序步骤中的肿瘤抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，该方法包括：a)使来自该个体的第一PBMC群与该目标肿瘤抗原肽接触，以提供载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC群；b)使载有该目标肿瘤抗原肽的该PBMC群经受富集过程，以提供经富集的活化T细胞群；c)可选地使APC(例如，PBMC或DC)群与该目标肿瘤抗原肽接触，以提供抗原负载APC群；d)共培养步骤，其包括将该经富集的活化T细胞群与该抗原负载APC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，在该富集过程之前，此类PBMC与该目标肿瘤抗原肽接触不多于约5、4、3、2、或1天。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该共培养步骤包括：在共培养基中将该经富集的活化T细胞群与该抗原负载APC群共培养，该共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂、以及抗CD3抗体。在一些实施方案中，该共培养步骤包括：在初始共培养基中将该经富集的活化T细胞群与该抗原负载APC群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，在该共培养开始后约1至3天，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该抗原负载APC群共培养总共约12至25天。
在一些实施方案中，PBMC是新鲜获得。在一些实施方案中，PBMC是通过将PBMC的冷冻储备液解冻而获得。在一些实施方案中，PBMC是自体的，即获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，使PBMC与细胞因子(诸如IL-2、GM-CSF、或类似者)接触，以同时或于该接触步骤之后在此类PBMC中诱导某些细胞(诸如DC、T细胞、或其组合)的分化、成熟、或增殖。
在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞是通过包括下列的步骤制备：(a)使PBMC群与目标肿瘤抗原肽接触，以获得经刺激PBMC群；(b)使用配体自该经刺激PBMC群分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如IFNγ)，以获得经富集的活化T细胞群；以及(c)共培养步骤，其包括：在初始共培养基中将该经富集的活化T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的DC群共培养，以获得第一共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)；以及在该第一共培养开始后约1天至约3天(例如，约1天或2天)，将抗CD3抗体(例如，OKT3)添加至该第一共培养物，从而提供此类肿瘤抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，PBMC是来自冷冻储备液。在一些实施方案中，PBMC是自个体新鲜获得。在一些实施方案中，通过使PBMC群与目标肿瘤抗原肽接触，制备抗原负载DC。在一些实施方案中，该经富集的活化T细胞群与该抗原负载DC群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化T细胞群与该抗原负载DC群共培养约7至约21天。
共培养
本文所述的方法和MASCT方法包括一个或多个(诸如1、2、3、或更多个)共培养步骤。在一些实施方案中，该方法包括第一共培养步骤，该第一共培养步骤包括将T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的DC群共培养。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中，将T细胞群与第一抗原负载DC群共培养不多于约7天，诸如约1、2、3、4、5、6、或7天中任一者。在一些实施方案中，将T细胞群与第一抗原负载DC群共培养约1至3天，诸如约2至3天。
在一些实施方案中，第一共培养步骤包括在第一共培养基中将第一抗原负载DC群与T细胞群共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第一共培养基包含抗CD3抗体。在一些实施方案中，第一共培养基不包括抗CD3抗体。在一些实施方案中，第一共培养步骤包括：在第一初始共培养基中将第一抗原负载DC群与T细胞群共培养，以提供第一共培养物，该第一初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加至该第一共培养物。
在一些实施方案中，该方法包括第二共培养步骤，该第二共培养步骤包括将经富集的活化T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的DC群共培养。在一些实施方案中，在第二共培养步骤中，将经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群共培养总共至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30天中任一者。在一些实施方案中，将经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群共培养约12天至约25天，诸如约12至15、15至18、18至21、15至20、20至25、15、18、19、20、21、或22天中任一者。
在一些实施方案中，将经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群在抗CD3抗体存在下共培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、或更多天中任一者。在一些实施方案中，将经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群在抗CD3抗体存在下共培养约8至18、10至20、1至25、或12至25天中任一者。在一些实施方案中，经富集的活化T细胞群与第二抗原负载DC群最初是在不具有抗CD3抗体下共培养约1至5天，诸如约1、2、或3天。
在一些实施方案中，第二共培养步骤包括在第二共培养基中将第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，该第二共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第二共培养基包含抗CD3抗体。在一些实施方案中，第二共培养基不包括抗CD3抗体。在一些实施方案中，第二共培养步骤包括：在第二初始共培养基中将第二抗原负载DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该第二初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加至该第二共培养物。
在一些实施方案中，制备肿瘤抗原特异性T细胞的方法包括：(1)第一共培养步骤，其包括将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的第一DC群共培养；以及(2)第二共培养步骤，其包括将经富集的活化T细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二DC群共培养。
在一些实施方案中，该方法包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽(或其表位)的APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群共培养。在一些实施方案中，重复第三共培养步骤一或多次(诸如1、2、3、4、5、6、或更多次)，以获得进一步的肿瘤抗原特异性T细胞群。在一些实施方案中，重复第三共培养步骤包括：将自第三共培养步骤获得的肿瘤抗原特异性T细胞的部分与第二抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群共培养。在一些实施方案中，重复第三共培养步骤包括：以每隔约5至9天(例如，约7天)之间隔，向第三共培养物添加新鲜的抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群。
在一些实施方案中，在第三共培养步骤中，将肿瘤抗原特异性T细胞群与抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群共培养至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或14天中任一者。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性T细胞群与抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群共培养约5天至约15天，诸如约5至9、7至10、10至12、12至15、7、8、9、10、11、12、13、或15天中任一者。
在一些实施方案中，第三共培养步骤包括在第三共培养基中将抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群与肿瘤抗原特异性T细胞群共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第三共培养基不包括抗CD3抗体。在一些实施方案中，第三共培养基包含抗CD3抗体。在一些实施方案中，第三共培养步骤包括：在第三初始共培养基中将抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC(诸如LCL))群与肿瘤抗原特异性T细胞群共培养，以提供第三共培养物，该第三初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加至该第三共培养物。
用于各培养步骤的共培养基或初始共培养基可相同或不同。除非另有指示，否则如“共培养”小节中所论述的“共培养基”包括第一、第二、以及第三共培养基；如本小节中所论述的“初始共培养基”包括第一、第二、以及第三初始共培养基。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包括一种或多种(例如1、2、3、4、5、或更多种)细胞因子。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包括多种细胞因子(在本文中还称为“细胞因子混合物”)。示例性细胞因子包括但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、以及类似者。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包括IL-2。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包括IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21。在一些实施方案中，IL-2是以至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、6000、或更高IU/ml中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，IL-2是以不大于约1000、500、200、100、50、20、或更低IU/ml中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，第一共培养基以不大于约200IU/mL(诸如约150、100、或50IU/ml)的浓度包括IL-2。在一些实施方案中，第二共培养基以至少约2000IU/mL(诸如约3000、5000、或6000IU/mL)的浓度包括IL-2。在一些实施方案中，IL-7是以至少约1、2、5、10、20、50、或100ng/mL中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，IL-15是以至少约1、2、5、10、20、50、或100ng/mL中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。细胞因子可促进T细胞的活化、成熟、和/或增殖，以为T细胞稍后分化为记忆T细胞作准备，和/或抑制共培养物中TREG的百分比。
在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包括一种或多种(诸如1、2、3、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂。可使用任何已知的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制性免疫检查点分子的天然或经工程改造的配体，其包括例如CTLA-4的配体(例如，B7.1、B7.2)、TIM-3的配体(例如，半乳糖凝集素-9)、A2a受体的配体(例如，腺苷、瑞加德松(Regadenoson))、LAG-3的配体(例如，MHC I类或MHC II类分子)、BTLA的配体(例如，HVEM、B7-H4)、KIR的配体(例如，MHC I类或MHC II类分子)、PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2)、IDO的配体(例如，NKTR-218、因多莫得(Indoximod)、NLG919)、以及CD47的配体(例如，SIRPα受体)。免疫检查点抑制剂可属于任何合适的分子型态，包括但不限于小分子、核酸(诸如DNA、RNAi、或适体)、肽、或蛋白质(诸如抗体)。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是靶向抑制性免疫检查点蛋白的抗体(诸如拮抗剂抗体)，其选自：抗CTLA-4(例如，伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、KAHR-102)、抗TIM-3(例如，F38-2E2、ENUM005)、抗LAG-3(例如，BMS-986016、IMP701、IMP321、C9B7W)、抗KIR(例如，利利单抗(lirilumab)和IPH2101)、抗PD-1(例如，尼沃鲁单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、派姆单抗(pembrolizuma)、BMS-936559、阿替珠单抗(atezolizumab)、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、SHR1210)、抗PD-L1(例如，KY-1003(EP20120194977)、MCLA-145、RG7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB0010718C、AUR-012、STI-A1010、PCT/US2001/020964、MPDL3280A、AMP-224、聚乙二醇化达匹珠单抗(dapirolizumab pegol)(CDP-7657)、MEDI-4920)、抗CD73(例如，AR-42(OSU-HDAC42,HDAC-42,AR42,AR 42,OSU-HDAC 42,OSU-HDAC-42,NSC D736012,HDAC-42,HDAC 42,HDAC42,NSCD736012,NSC-D736012)、MEDI-9447)、抗B7-H3(例如，MGA271、DS-5573a、8H9)、抗CD47(例如，CC-90002、TTI-621、VLST-007)、抗BTLA、抗VISTA、抗A2aR、抗B7-1、抗B7-H4、抗CD52(诸如阿仑单抗(alemtuzumab))、抗IL-10、抗IL-35、以及抗TGF-β(诸如夫苏木单抗(fresolumimab))。在一些实施方案中，抗体是单株抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体选自下列的抗原结合片段：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、BiTE、纳米抗体(nanobody)、以及全长抗体的其他抗原结合子序列或其经工程改造的组合。在一些实施方案中，抗体是人类抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、BMS-936559、以及阿替珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、以及SHR-1210。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是SHR-1210。在一些实施方案中，初始共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体(例如，SHR-1210)。
在共培养基(包括初始共培养基)中的免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体)的合适浓度包括但不限于至少约1、2、5、10、15、20、25、或更大μg/mL中任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体)是以约1μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、或约5μg/mL至约20μg/mL中任一者存在于共培养基(包括初始共培养基)中。
抗CD3抗体可在共培养开始时存在于共培养物中，或者在抗原负载DC与T细胞、经富集的活化T细胞、或肿瘤抗原特异性T细胞群的共培养开始之后被添加至共培养物。在一些实施方案中，抗CD3抗体是包括于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，初始共培养基不包括抗CD3抗体。
在一些实施方案中，在第二共培养开始后不多于约5、4、3、2、或1天中任一者，将抗CD3抗体添加至第二共培养物，该第二共培养物包括经富集的活化T细胞群和第二抗原负载DC群。在一些实施方案中，在第二共培养开始后约1、2、或3天，将抗CD3抗体添加至第二共培养物，该第二共培养物包括经富集的活化T细胞群和第二抗原负载DC群。可使用任何合适的抗CD3抗体，包括但不限于OKT3。
在细胞数目方面，T细胞(例如，T细胞、经富集的活化T细胞群、或肿瘤抗原特异性T细胞)和抗原负载APC(诸如PBMC、DC、或细胞系APC)可以适当比率存在于共培养物中。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中的T细胞群与第一抗原负载DC群之间的比率不大于约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、或5:1中任一者。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中的T细胞群与第一抗原负载DC群之间的比率为至少约5:1、8:1、10:1、15:1、20:1、25:1、或更大中任一者。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中的T细胞群与第一抗原负载DC群之间的比率为约5:1至约10:1、约5:1至约20:1、约10:1至约20:1、约20:1至约30:1、或约5:1至约30:1中任一者。在一些实施方案中，经富集的T细胞群与第二抗原负载DC群之间的比率为至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1中任一者。在一些实施方案中，经富集的T细胞群与第二抗原负载DC群之间的比率不大于约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、或1:1中任一者。在一些实施方案中，经富集的T细胞群与第二抗原负载DC群之间的比率为约1:1至约20:1、约1:1至约10:1、约1:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约10:1至约20:1、约1:1至约1:3、约1:1至约2:1、或约2:1至约5:1中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞群与抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC)群之间的比率为至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞群与抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC)群之间的比率不大于约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、或1:1中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性T细胞群与抗原负载APC(例如，PBMC(诸如固定PBMC)、DC、或细胞系APC)群之间的比率为约1:1至约20:1、约1:1至约10:1、约1:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约10:1至约20:1、约1:3至约3:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1、或约2:1至约5:1中任一者。
在一些实施方案中，T细胞和APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)是衍生自相同个体，例如已在临床上受益于MASCT的个体。在一些实施方案中，APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)并非衍生自已在临床上受益于MASCT的个体。在一些实施方案中，T细胞、APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)、或两者是衍生自自体来源，例如衍生自接受表达TCR的经工程改造的免疫细胞的个体。在一些实施方案中，T细胞、APC(例如，PBMC、DC、或细胞系APC)、或两者是衍生自同种异体来源。
在一些实施方案中，T细胞和/或APC(例如，PBMC或DC)是获自先前已接受免疫疗法的个体。在一些实施方案中，个体对免疫疗法有免疫反应。对免疫疗法“有免疫反应(immunologically responsive)”意指个体响应于免疫疗法而对一种或多种肿瘤抗原已发展出特异性免疫反应。在一些实施方案中，T细胞和/或APC(例如，PBMC或DC)是获自已在临床上受益于免疫疗法的个体。“临床上受益(clinically benefitted)”于疗法的个体已展示对该疗法的临床反应(如医师所评估)。示例性临床反应包括但不限于完全反应(“CR”)、部分反应(“PR”)、以及疾病稳定(“SD”)。免疫疗法包括但不限于免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法(例如，过继性T细胞疗法、CIK、TIL、CAR-T、和TCR-T疗法)、癌症疫苗、溶瘤病毒、以及其组合。在一些实施方案中，T细胞和/或APC(例如，PBMC或DC)是获自先前已接受MASCT的个体。在一些实施方案中，该个体能够在MASCT中发展出对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用所属技术领域中已知的测定法(诸如ELISPOT测定)来确定对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于MASCT。在一些实施方案中，个体具有(多种)肿瘤抗原特异性免疫反应。在一些实施方案中，个体具有肿瘤抗原特异性免疫反应且已在临床上受益于MASCT。
用于本文所述方法的任何实施方案中的T细胞群可衍生自各种来源。方便的T细胞来源是来自人类周边血液的PBMC。T细胞群可自PBMC分离，或者替代地，富含T细胞的PBMC群(诸如通过添加T细胞特异性抗体和细胞因子)可用于共培养物中。在一些实施方案中，用于第一共培养步骤中的T细胞群是获自周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC)。在一些实施方案中，通过周边血液样本的密度梯度离心来获得PBMC。在一些实施方案中，用于第一共培养步骤中的T细胞群存在于PBMC中。
活化T细胞的富集
本文所述方法包括富集步骤，该富集步骤包括富集来自共培养物的活化T细胞，该共培养物包括第一抗原负载DC群和T细胞群。在一些实施方案中，该方法包括富集步骤，该富集步骤包括富集活化T细胞，此类活化T细胞是来自经目标肿瘤抗原肽或其片段刺激的PBMC。
在一些实施方案中，富集过程包括：基于响应于目标肿瘤抗原肽或其片段刺激的共培养物的一种或多种(诸如1、2、3、或更多种中的任一者)T细胞活化生物标记来选择活化T细胞。在一些实施方案中，在共培养物中，使用载有目标肿瘤抗原肽的APC(诸如PBMC)来刺激活化T细胞。在一些实施方案中，富集过程包括：自共培养物分离表达一种或多种生物标记(诸如细胞表面分子或分泌分子)的活化T细胞。
在一些实施方案中，富集过程包括自共培养物分离表达或分泌一种或多种细胞因子的活化T细胞，该共培养物已经过目标肿瘤抗原肽或其片段刺激。在一些实施方案中，富集步骤包括：使第一共培养物与抗原负载PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子。示例性细胞因子包括但不限于IFNγ和TNFα。可使用特异性识别细胞因子的配体(诸如该细胞因子的抗体或受体)来分离经富集的活化T细胞群。在一些实施方案中，富集步骤包括：使第一共培养物与抗原负载PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞表面分子，诸如4-1BB(还称为CD137)。
在一些实施方案中，该方法包括：使共培养物与载有目标肿瘤抗原肽或其片段的PBMC接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子或细胞表面分子。在一些实施方案中，细胞因子是IFNγ。在一些实施方案中，细胞表面分子是4-1BB。
在一些实施方案中，富集过程包括在通过目标肿瘤抗原肽或其片段刺激后，自共培养物分离分泌IFNγ的活化T细胞。在一些实施方案中，富集过程包括在通过目标肿瘤抗原肽或其片段刺激后，自共培养物分离CD3+IFNγ+细胞。在一些实施方案中，富集过程包括：(1)使包括载有目标肿瘤抗原肽或其片段的第一DC群和T细胞群的共培养物，与载有目标肿瘤抗原肽或其片段的PBMC接触约10至24小时(诸如约1天)，以获得经刺激的共培养物；以及(2)使用特异性识别IFNγ的配体自该经刺激的共培养物分离活化T细胞。在一些实施方案中，在与抗原负载PBMC接触之前，已将第一抗原负载DC群与T细胞群共培养约1至7天(诸如约2至3天)。在一些实施方案中，在分离之前，使共培养物和抗原负载PBMC接触至少约2、4、6、12、18、24、或更多小时中任一者。
可使用所属技术领域中任何已知的方法，自经刺激的共培养物分离或富集表达细胞因子(诸如IFNγ)的活化T细胞。例如，市售试剂盒可用于分离分泌IFNγ的T细胞，此类市售试剂盒包括来自Miltenyi Biotec的IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment andDetection Kit。在一些实施方案中，通过下列分离分泌IFNγ的活化T细胞：(1)使共培养物与特异性结合至T细胞上的细胞表面抗原和IFNγ的IFNγ捕获试剂接触；(2)使经IFNγ捕获试剂处理的共培养物与抗IFNγ抗体(例如，共轭至R-藻红蛋白(R-phycoerthrin)或PE的抗IFNγ抗体)接触；(3)使经抗IFNγ抗体处理的共培养物与磁珠接触，该磁珠包括识别抗IFNγ抗体的二级抗体(例如，抗PE抗体)；以及(4)使用磁场(例如，使用MACSTM分离柱)分离磁珠，从而获得经富集的活化T细胞群。
在一些实施方案中，通过下列分离表达细胞表面生物标记的活化T细胞：(1)使共培养物与针对细胞表面生物标记的荧光标示抗体接触；以及(2)通过流动式细胞测量术自共培养物分离结合至荧光标示抗体的细胞。
APC的抗原负载
本文所述方法和MASCT方法使用载有一种或多种肿瘤抗原肽的APC(诸如PBMC、树突细胞、或细胞系APC)。在一些实施方案中，抗原负载APC(例如，抗原负载DC)是新鲜制备，以用于一个或多个共培养步骤。在一些实施方案中，抗原负载APC(例如，抗原负载DC)是新鲜制备，以用于各共培养步骤。在一些实施方案中，抗原负载APC(例如，抗原负载DC)经制备、培养于DC成熟培养基中、并用于一个或多个共培养或刺激步骤。用于第一、第二、以及第三共培养步骤中的抗原负载DC可自单批次或分开批次的抗原负载DC获得。除非另有指示，否则本节中针对APC(例如，DC)所述的特征适用于各共培养步骤中使用的所有APC(例如，DC)；且本节中针对抗原负载APC(例如，DC)所述的方法和特征适用于第一群、第二群、以及第三群的抗原负载APC和其他类型的APC。APC包括但不限于PBMC、DC、B细胞、或巨噬细胞。本文所述的APC可为初代细胞，或衍生自细胞系。在一些实施方案中，APC是PBMC。在一些实施方案中，APC是固定PBMC。固定PBMC可破坏PBMC的增殖能力，同时维持PBMC的抗原呈现能力。
用于各共培养步骤中的抗原负载DC可载有相同肿瘤抗原肽池或不同肿瘤抗原肽池。在一些实施方案中，第一共培养步骤中第一DC群所载有的肿瘤抗原肽池与第二共培养步骤中用来负载第二DC群的肿瘤抗原肽池相同。在一些实施方案中，第二共培养步骤中第二DC群载有第一共培养步骤中用来负载第一DC群的肿瘤抗原肽池的子集。在一些实施方案中，第三共培养步骤中第三DC群载有第一共培养步骤中用来负载第一DC群的肿瘤抗原肽池的子集和/或第二共培养步骤中用来负载第二DC群的肿瘤抗原肽池的子集。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽池的子集包括肿瘤抗原肽的片段及其组合。在一些实施方案中，使用单一肿瘤抗原肽(即，目标肿瘤抗原肽)或其片段，以负载用于第二共培养步骤和第三共培养步骤中的APC(诸如DC)。
在一些实施方案中，使用个体于先前MASCT中使用的多种肿瘤抗原肽，制备用于第一共培养步骤的第一抗原负载DC群。在一些实施方案中，使用个体于先前MASCT中对其有特异性免疫反应的一种或多种肿瘤抗原肽，制备用于第一共培养步骤的第一抗原负载DC群。在一些实施方案中，针对衍生自个体的PBMC、活化T细胞、或肿瘤抗原特异性T细胞的特异性免疫反应，筛选(例如，通过ELISPOT)来自一种或多种目标肿瘤抗原肽或其片段的个别肿瘤抗原肽、以及其组合，以识别用于后续制备肿瘤抗原特异性T细胞的一种或多种目标肿瘤抗原肽(包括其片段)。
在一些实施方案中，在各共培养步骤之前，该方法包括下列步骤中的一者或多者：(1)自个体获得PBMC；(2)自PBMC获得单核球群；(3)诱导该单核球群分化为未成熟DC；(4)使此类未成熟DC与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC群；以及(5)在DC成熟培养基中培养该抗原负载DC群，该DC成熟培养基包含TLR激动剂(诸如MPLA)。
在一些实施方案中，抗原负载DC是通过下列制备：(a)使DC群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC群；以及(b)在DC成熟培养基中培养抗原负载DC群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。示例性TLR激动剂包括但不限于MPLA(单磷酰脂A)、聚肌胞苷酸、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、以及CL075。可将细胞因子和其他适当分子(诸如INFγ和PGE2(前列腺素E2))进一步包括于成熟步骤中的培养基中。
在一些实施方案中，抗原负载DC是通过下列制备：(a)使DC群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC群；以及(b)在DC成熟培养基中培养抗原负载DC群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、以及PGE2。
在一些实施方案中，抗原负载DC是通过下列制备：(a)诱导单核球群分化为未成熟DC；(b)使未成熟DC群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载DC群；以及(c)在DC成熟培养基中培养该抗原负载DC群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、以及PGE2。在一些实施方案中，单核球群是获自PBMC。
在一些实施方案中，通过使PBMC群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，制备抗原负载PBMC。在一些实施方案中，通过使细胞系APC(例如，LCL)群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，制备抗原负载细胞系APC。
DC成熟培养基可包括合适浓度的MPLA、INFγ、和/或PGE2。在一些实施方案中，DC成熟培养基以至少约0.5μg/mL的浓度包括MPLA，诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更大μg/mL中任一者。在一些实施方案中，DC成熟培养基以约0.5至10、1至5、5至10、或2.5至7.5μg/mL中任一者的浓度包括MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基以至少约100IU/mL的浓度包括INFγ，诸如至少约150、200、250、300、400、500、600、800、1000、或更大IU/mL中任一者。在一些实施方案中，DC成熟培养基以约100至1000、100至250、250至500、500至1000、或250至750IU/mL中任一者的浓度包括INFγ。在一些实施方案中，DC成熟培养基以至少约0.1μg/mL的浓度包括PGE2，诸如至少约0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、或更大μg/mL中任一者。在一些实施方案中，DC成熟培养基以约0.1至0.5、0.1至0.3、0.25至0.5、或0.2至0.4μg/mL中任一者的浓度包括PGE2。
可通过TLR激动剂诱导载有一种或多种肿瘤抗原肽的未成熟DC成熟至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20天中任一者。在一些实施方案中，诱导载有一种或多种肿瘤抗原肽的DC成熟约8、9、10、11、或12天。
在一些实施方案中，抗原负载DC是呈现一种或多种肿瘤抗原肽的成熟DC。由本文所述的任何方法制备的成熟DC可呈现至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽。相较于纯真
DC、或尚未载有多种肿瘤抗原肽的DC，多抗原负载DC可具有增强的至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽的呈现水平。在一些实施方案中，成熟DC具有增强的多于10种肿瘤抗原肽的呈现水平。在一些实施方案中，成熟DC具有增强的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽的呈现水平，该肿瘤抗原肽是衍生自选自下列的蛋白质：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、以及AFP。
在一些实施方案中，通过将一种或多种肿瘤抗原肽脉冲至APC群中，制备抗原负载APC(例如，DC、PBMC、或细胞系APC)。在一些实施方案中，通过将一种或多种肿瘤抗原肽脉冲至DC群中，制备抗原负载DC，此类DC诸如未成熟DC、或含在或衍生(诸如经分化)自PBMC的DC。如所属技术领域中已知的，脉冲(pulsing)是指将细胞(诸如APC(例如，PBMC或DC、或细胞系APC))与含有抗原肽的溶液混合、以及可选地随后自混合物移除抗原肽的程序。可使DC群与一种或多种肿瘤抗原肽接触数秒、数分钟、数几小时，诸如约下列中的至少任一者：30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、5小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、10天、或更长。用于接触步骤中的各肿瘤抗原肽的浓度可为至少约0.1、0.5、1、2、3、5、或10μg/mL中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽的浓度为约0.1至200μg/mL，包括例如约0.1至0.5、0.5至1、1至10、10至50、50至100、100至150、或150至200μg/mL中任一者。
在一些实施方案中，APC(例如，DC或PBMC、或细胞系APC)群与一种或多种肿瘤抗原肽是在组合物存在下接触，该组合物促进APC(例如，DC或PBMC、或细胞系APC)摄取该一种或多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，化合物、材料、或组合物可包括于一种或多种肿瘤抗原肽的溶液中，以促进APC(例如，DC或PBMC、或细胞系APC)摄取肽。促进APC(例如，DC或PBMC、或细胞系APC)摄取一种或多种肿瘤抗原肽的化合物、材料、或组合物包括但不限于脂质分子并具有多个带正电氨基酸的肽。在一些实施方案中，APC(例如，DC或PBMC、或细胞系APC)群摄取多于约50％、60％、70％、80％、90％、或95％中任一者的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，群中多于约50％、60％、70％、80％、90％、或95％中任一者的APC(例如，DC或PBMC、或细胞系APC)摄取至少一种肿瘤抗原肽。
树突细胞(诸如未成熟DC)可获自各种来源，包括自体来源，即来自接受TCR治疗的个体。方便的DC细胞来源是来自周边血液的PBMC。例如，单核球(一种白血球)是大量存在于PBMC中，其构成约5至30％的总PBMC。可使用细胞因子诱导单核球分化为DC，诸如未成熟DC。在一些实施方案中，未成熟DC是通过下列制备：获得PBMC群；自PBMC群获得单核球群；以及使单核球群与一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)接触，以获得未成熟DC群。可用于诱导单核球分化的示例性细胞因子包括但不限于GM-CSF和IL-4，其中诱导是在所属技术领域中已知的条件(诸如浓度、温度、CO2水平等)下进行。
PBMC的粘附部分含有PBMC中大多数的单核球。在一些实施方案中，使来自PBMC粘附部分的单核球与细胞因子接触，以获得未成熟DC群。可通过将周边血液样本离心、或使用血球分离(apheresis)方法自个体收集，方便地获得PBMC。在一些实施方案中，通过人类周边血液样本的密度梯度离心来获得PBMC群。在一些实施方案中，样本是来自接受下列者的个体：多抗原负载DC、活化T细胞、表达TCR的经工程改造的免疫细胞、或其他使用多抗原负载DC制备的免疫治疗组合物。
肿瘤抗原肽
本文所述方法和MASCT方法使用一种或多种肿瘤抗原肽(包括目标肿瘤抗原肽)，以制备抗原负载APC(诸如抗原负载DC)、活化T细胞、以及肿瘤抗原特异性T细胞(可体外和在体内触发特异性免疫反应)。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本(诸如裂解细胞组合物)。如本文中所使用，“来自多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽(one or more tumor antigenpeptides from a plurality of tumor antigen peptides)”是指该多种肿瘤抗原肽中的子选择或所有肿瘤抗原肽，其包括肿瘤抗原肽的片段及其组合。本小节中所述的特征和参数可适用于(多种)目标肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，各肿瘤抗原肽包括至少约1、2、3、4、5、或10种中任一者的表位，该表位是来自单一蛋白质抗原(包括新抗原)。在一些实施方案中，在多种肿瘤抗原肽中的各肿瘤抗原肽包括至少一种可由T细胞受体识别的表位。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括来自单一蛋白质抗原的至少2个表位的肿瘤抗原肽。肿瘤抗原肽可为来自含有一个或多个表位的蛋白质抗原的自然衍生肽片段、或具有一个或多个天然表位序列的人工设计肽，其中连接肽可选地可置于相邻表位序列之间。在一些优选实施方案中，含在相同肿瘤抗原肽中的表位是衍生自相同的蛋白质抗原。
肿瘤抗原肽可含有至少一种MHC-I表位、至少一种MHC-II表位、或(多种)MHC-I表位和(多种)MHC-II表位两者。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括MHC-I表位的肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括MHC-II表位的肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽中的至少一种肿瘤抗原肽包括MHC-I表位和MHC-II表位两者。
可将特殊设计策略应用于肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)的序列，以优化对载有肿瘤抗原肽的DC的免疫反应。一般而言，较确切表位肽为长的肽可增加肽至DC中的摄取。在一些实施方案中，根据具有表位的蛋白质的天然序列，将MHC-I或MHC-II表位序列在N端或C端或两端延伸，以获得延伸序列，其中该延伸序列适于由I类和II类两者MHC分子呈现、以及由不同个体中不同亚型的MHC分子呈现。在一些实施方案中，将表位序列在一端或两端延伸至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个中任一者的氨基酸残基，以产生延伸表位。在一些实施方案中，包括MHC-I或MHC-II表位的肽进一步包括在N端、C端、或两端的侧接表位的附加氨基酸。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽中的各肿瘤抗原肽是至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个中任一者的氨基酸长。多种肿瘤抗原肽中的不同肿瘤抗原肽可具有相同长度或不同长度。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是各自约20至40个氨基酸长。
在一些实施方案中，本专利申请中用于设计肿瘤抗原肽的一个或多个表位肽的氨基酸序列是基于所属技术领域中已知的序列或可得自公共数据库的序列，公共数据库诸如Peptide Database(Vigneron N.et al.Cancer Immunity,13:15(2013))。
在一些实施方案中，使用用于T细胞表位预测的生物信息工具，基于抗原蛋白的序列，预测一个或多个表位肽的氨基酸序列。用于T细胞表位预测的示例性生物信息工具是所属技术领域中已知的，例如参见Yang X.和Yu X.(2009)的“An introduction to epitopeprediction methods and software”Rev.Med.Virol.19(2):77-96。在一些实施方案中，抗原蛋白的序列为所属技术领域中已知的或可得自公共数据库。在一些实施方案中，通过对正接受治疗的个体的样本(诸如肿瘤样本)进行测序，确定抗原蛋白的序列。
本专利申请设想到衍生自所属技术领域中已知的任何肿瘤抗原和表位(包括新抗原和新表位(neoepitope))的肿瘤抗原肽、或由发明人使用生物信息工具特别开发或预测的肿瘤抗原肽。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽进一步包括第二组的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，新抗原肽是癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、以及第二组的癌症类型特异性抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽仅由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽、以及一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、第二组的癌症类型特异性抗原肽、以及一种或多种新抗原肽组成。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽进一步包括第二组的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，新抗原肽是癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、以及第二组的癌症类型特异性抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽仅由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽、以及一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、第二组的癌症类型特异性抗原肽、以及一种或多种新抗原肽组成。
第一核心组的一般肿瘤抗原肽是衍生自常由各种不同类型癌症过度表达的肿瘤抗原。因此，第一核心组的一般肿瘤抗原肽是有用于制备树突细胞和/或活化T细胞，以用于治疗患有不同癌症类型的个体。例如，在一些实施方案中，第一核心组的一般肿瘤抗原肽是有用于本文所述的用于治疗各种癌症的方法，此类癌症诸如肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰脏癌、卵巢癌、乳癌、神经胶质瘤、食道癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肾癌、或肝细胞癌。第一核心组的示例性肿瘤抗原肽包括但不限于衍生自下列的肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、MMP7、VEGFR(诸如VEGFR1和VEGFR2)、以及CDCA1。第一核心组可包括衍生自至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的肿瘤抗原的肽。第一核心组可包括至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包括多于一种一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包括约10至约20种一般肿瘤抗原肽。
第二组的癌症类型特异性抗原肽是衍生自仅在一种或有限数目的癌症类型中过度表达的肿瘤抗原。因此，第二组的癌症类型特异性抗原肽是有用于制备树突细胞和/或活化T细胞，以用于治疗患有特定癌症类型的个体。用于治疗肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的示例性癌症类型特异性抗原肽包括但不限于衍生自SSX、AFP、以及GPC3的肽。在一些实施方案中，一种或多种癌症特异性抗原肽是衍生自病毒的病毒特异性抗原肽，该病毒可诱导癌症，或者在感染个体时涉及个体内的癌症发展。在一些实施方案中，病毒特异性抗原肽对感染个体的病毒亚型具特异性。用于治疗合并HBV感染的HCC患者的示例性病毒特异性抗原肽包括但不限于衍生自HBV核心抗原(HBcAg)、以及HBV DNA聚合酶的肽。在一些实施方案中，第二组包括衍生自HBV抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法用于治疗个体中的肝细胞癌。在一些实施方案中，第二组包括衍生自HPV抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法用于治疗个体中的子宫颈癌。在一些实施方案中，第二组包括衍生自EBV抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法用于治疗个体中的鼻咽癌。第二组的癌症类型特异性抗原肽可包括衍生自至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多种中任一者的癌症类型特异性抗原的肽。第二组癌症类型特异性抗原肽可包括至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多种中任一者的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包括多于一种癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包括约1至约10种癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，癌症类型特异性抗原肽所靶向的癌症类型选自：肝细胞癌、子宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、乳癌、子宫内膜癌、以及淋巴瘤。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中任一者)新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽，且未包括一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种一般肿瘤抗原肽、以及一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种一般肿瘤抗原肽、一种或多种癌症类型特异性抗原肽、以及一种或多种新抗原肽。新抗原肽是衍生自新抗原。新抗原是存在于个体(诸如正接受癌症治疗的个体)的肿瘤细胞中的最新取得并表达的抗原。在一些实施方案中，新抗原是衍生自突变蛋白质抗原，此类突变蛋白质抗原仅存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中。新抗原可独特地存在于经癌症治疗的个体的肿瘤细胞(诸如所有肿瘤细胞或部分肿瘤细胞)中，或者在患有类似的癌症类型的个体接受治疗时存在于该个体中。在一些实施方案中，新抗原是克隆体性(clonal)新抗原。在一些实施方案中，新抗原是次克隆体性(subclonal)新抗原。在一些实施方案中，新抗原存在于个体中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的肿瘤细胞中。在一些实施方案中，新抗原肽包括MHC-I限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括MHC-II限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽经设计以促进I类和II类两者MHC分子呈现新表位，例如通过在N端和C端两者延伸新表位。示例性新抗原肽包括但不限于衍生自下列的新表位：突变体KRAS(例如，KRASG12A)、PARP4(例如，PARP4T1170I)、MLL3(例如，MLL3C988F)、以及MTHFR(例如，MTHFRA222V)。
可基于正接受治疗的个体的一个或多个肿瘤部位的基因轮廓(genetic profile)选择新抗原肽，且新抗原在正常组织中不会表达。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括全长基因组的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括外显子的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括癌症相关基因的序列信息。
适用于本专利申请的新抗原肽可衍生自肿瘤细胞中的任何突变蛋白，诸如由突变癌症相关基因编码的突变蛋白。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自癌症相关基因的单一新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自癌症相关基因的多于一种(诸如2、3、或更多种)新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自多于一种(诸如2、3、或更多种)癌症相关基因的多于一种(诸如2、3、或更多种)新表位。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原包括衍生自单一癌症相关基因的多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原包括衍生自多于一种(诸如2、3、4、5、或更多种中任一者)癌症相关基因的多种新抗原肽。
癌症相关基因是过度表达于癌细胞中的基因，但此类基因是以低水平表达于正常细胞中。示例性癌症相关基因包括但不限于ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AURKA、AURKB、AXL、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L12、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BUB1B、CADM2、CARD11、CBL、CBLB、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD58、CD79B、CDC73、CDH1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK9、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CIITA、CREBBP、CRKL、CRLF2、CRTC1、CRTC2、CSF1R、CSF3R、CTNNB1、CUX1、CYLD、DDB2、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMD、DNMT3A、EED、EGFR、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FKBP9、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FUS、GATA3、GATA4、GATA6、GLI1、GLI2、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GNB2L1、GPC3、GSTM5、H3F3A、HNF1A、HRAS、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IKZF3、INSIG1、JAK2、JAK3、KCNIP1、KDM5C、KDM6A、KDM6B、KDR、KEAP1、KIT、KRAS、LINC00894、LMO1、LMO2、LMO3、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL(KMT2A)、MLL2(KTM2D)、MPL、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL1(MYCL)、MYCN、MYD88、NBN、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFKBIZ、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2、NPRL3、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PARK2、PAX5、PBRM1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PMS1、PMS2、PNRC1、PRAME、PRDM1、PRF1、PRKAR1A、PRKCI、PRKCZ、PRKDC、PRPF40B、PRPF8、PSMD13、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPRD、QKI、RAD21、RAF1、RARA、RB1、RBL2、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHPN2、ROS1、RPL26、RUNX1、SBDS、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SH2B3、SLITRK6、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOCS1、SOX2、SOX9、SQSTM1、SRC、SRSF2、STAG1、STAG2、STAT3、STAT6、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TCF7L1、TCF7L2、TERC、TERT、TET2、TLR4、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WRN、WT1、XPA、XPC、XPO1、ZNF217、ZNF708、以及ZRSR2。
在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种(诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多种中任一者)肿瘤抗原肽，其各包括由癌症相关基因编码的一个或多个表位，该癌症相关基因选自：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、以及AFP。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、以及CDCA1。
在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原肽存在于组合物中，该组合物具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原肽的纯度是至少约98％。在一些实施方案中，为了将肿瘤抗原肽脉冲至DC中，一种或多种肿瘤抗原肽于培养基中的溶解度是至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％、或更高中任一者。在一些实施方案中，为了将肿瘤抗原肽脉冲至APC中，一种或多种肿瘤抗原肽为约100％可溶于培养基中。
MASCT
本文所述的TCR是获自已在临床上受益于MASCT的个体的PBMC或T细胞。在一些实施方案中，例如如ELISPOT所确定，个体已对用于本文所述方法中的(多种)目标肿瘤抗原肽或其片段发展出特异性反应。
如本文中所使用，“MASCT”或“多抗原特异性细胞疗法(Multiple AntigenSpecific Cell Therapy)”是指过继性T细胞疗法的方法，其包括向个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养而制备。MASCT方法已描述于例如国际专利申请公开号WO2016145578A1、国际专利申请号PCT/CN2018/081338和PCT/CN2019/080535中，其内容全文以引用方式并入本文中。第一代MASCT、精准MASCT(precision MASCT)、基于PBMC的MASCT、定制MASCT、基于新抗原的MASCT、改良MASCT、以及与MASCT的组合疗法(例如，免疫检查点抑制剂和MASCT)均在本专利申请的MASCT的范围内。本专利申请或国际专利申请号WO2016145578A1、PCT/CN2018/081338、以及PCT/CN2019/080535中所述的用于抗原负载DC制备、活化T细胞制备、富集步骤、以及共培养步骤的任何合适特征和参数可在MASCT治疗中组合。
个体可能已接受单一类型的MASCT、或不同类型的MASCT的组合，例如定制MASCT和改良MASCT。个体可能已接受一个或多个周期的MASCT。在一些实施方案中，个体已接受至少约2、5、10、15、20、或更多个周期中任一者的MASCT。在一些实施方案中，个体已接受经过至少约3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、或更长中任一者的MASCT。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(i)将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以获得活化T细胞群，该多种肿瘤抗原肽包括该(等)目标肿瘤抗原肽；以及(ii)向个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，该MASCT包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(i)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；(ii)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，以获得该活化T细胞群；以及(iii)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，该MASCT包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(i)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；(ii)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA；(iii)将该载有该多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以获得活化T细胞群；以及(iv)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，该MASCT包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(i)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；(ii)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA；(iii)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；(iv)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，以获得该活化T细胞群；以及(V)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。在一些实施方案中，该MASCT包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。
在一些实施方案中，该MASCT包括：向该个体施用有效量的活化T细胞，其中此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如DC)群共培养而制备。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，先前已对个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如DC)。在一些实施方案中，在施用活化T细胞之前约7天至约21天(诸如约7天至约14天、或约14天至约21天)，施用抗原递呈细胞。在一些实施方案中，施用抗原递呈细胞至少三次。在一些实施方案中，抗原递呈细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，活化T细胞和抗原递呈细胞群是来自相同个体。在一些实施方案中，活化T细胞和/或抗原递呈细胞群是来自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞群是DC、B细胞、或巨噬细胞的群。在一些实施方案中，抗原递呈细胞是DC。在一些实施方案中，MASCT进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(a)向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的DC；(b)将载有该多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以获得活化T细胞群；以及(c)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，DC施用与活化T细胞施用之间之间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天、或约14天)。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下施用。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的DC群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约10天、约10天至约15天、约15天至约21天、约14天至约21天、或约10天)。在一些实施方案中，T细胞群是衍生自周边血液单核细胞(PBMC)群的非粘附部分。在一些实施方案中，共培养进一步包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、或其任何组合)和可选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间，使T细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，制备载有多种肿瘤抗原肽的DC群。在一些实施方案中，T细胞群和DC群是衍生自相同个体。在一些实施方案中，T细胞群、DC群、PBMC群、或其任何组合是衍生自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，MASCT进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(a)诱导单核球群分化为DC群；(b)使该DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群；(c)向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC；(d)将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与非粘附PBMC群共培养，以获得活化T细胞群；以及(e)向该个体施用有效量的此类活化T细胞，其中该单核球群及该非粘附PBMC群是获自PBMC群。在一些实施方案中，DC施用与活化T细胞施用之间之间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天、或约14天)。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下施用。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，共培养历时约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、或约10天)。在一些实施方案中，共培养进一步包括使活化T细胞与多种细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、或其任何组合)和可选地抗CD3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间，使非粘附PBMC群与免疫检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1、或CTLA-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，PBMC群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，MASCT进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。
在一些实施方案中，MASCT包括：使周边血液单核细胞(PBMC)群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得活化PBMC群；以及向个体施用有效量的活化PBMC。在一些实施方案中，PBMC群与多种肿瘤抗原肽是在组合物存在下接触，该组合物促进PBMC中抗原递呈细胞(诸如DC)摄取多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，PBMC群与多种肿瘤抗原肽是在免疫检查点抑制剂存在下接触，该免疫检查点抑制剂诸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、以及LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，使活化PBMC群与IL-2接触。在一些实施方案中，施用活化PBMC至少三次。在一些实施方案中，各活化PBMC施用之间之间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化PBMC经静脉内施用。在一些实施方案中，PBMC群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，MASCT进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(a)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；b)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群；以及(c)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，DC群和T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下、皮内、或静脉内施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：a)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与T细胞群共培养，从而获得该活化T细胞群；以及d)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，步骤c)包括在共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与T细胞群共培养，该共培养基包含介白素混合物、免疫检查点抑制剂、以及抗CD3抗体。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包括PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，T细胞群存在于PBMC群中。在一些实施方案中，DC群和T细胞群获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下、皮内、或静脉内施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：a)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；c)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群；以及d)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，步骤(a)进一步包括在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含toll样受体(TLR)激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂选自：MPLA、聚肌胞苷酸、雷西莫特、嘎德莫特、以及CL075。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含PGE2。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗CD3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，DC群和T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下、皮内、或静脉内施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：a)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；d)将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群；以及e)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，在该共培养开始时，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，在该共培养开始后，将该抗CD3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，DC成熟培养基包含INFγ和MPLA。在一些实施方案中，DC成熟培养基进一步包括PGE2。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，DC群和T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下、皮内、或静脉内施用。
在一些实施方案中，该MASCT包括：a)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群；b)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA、INFγ、以及PGE2；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含多种细胞因子和抗PD-1抗体，该多种细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21；d)在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群；以及e)向该个体施用有效量的此类活化T细胞。在一些实施方案中，MPLA以至少约0.5μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，INFγ以至少约100IU/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，PGE2以至少约0.1μg/mL的浓度存在于DC成熟培养基中。在一些实施方案中，IL-2以至少约500IU/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，抗PD-1抗体以至少约10μg/mL的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在抗CD3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，DC群和T细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化T细胞至少三次。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的DC至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下、皮内、或静脉内施用。
大致上，可根据个体的大小和状况，并根据标准医药实务，确定本文所述的活化T细胞和载有多种肿瘤抗原肽的DC群的剂量、时程、以及施用途径。示例性施用途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、膀胱内(intravesicular)、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内(intrathecal)、或经皮。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的DC经皮下施用。在一些实施方案中，活化T细胞经静脉内施用。
施用至个体的细胞剂量可根据下列而变化：例如所施用的细胞的具体类型、施用途径、以及所治疗的癌症的具体类型和阶段。该量应足以产生所期望反应，诸如对癌症的治疗反应，但没有严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，待施用的活化T细胞或DC的量是治疗有效量。在一些实施方案中，细胞(诸如多抗原负载DC、或活化T细胞)的量是足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数目、或降低肿瘤生长速率的量，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应肿瘤大小、癌细胞数目、或肿瘤生长速率，或相较于未接受治疗的其他个体的对应活性。可使用标准方法来测量此效应的量值，诸如采用纯化酶的体外测定法、基于细胞的测定法、动物模型、或人体试验。
在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×105、5×105、1×106、1.5×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、或5×107个细胞/个体。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至2×106、2×106至3×106、3×106至4×106、4×106至5×106、5×106至6×106、6×106至7×106、7×106至8×106、8×106至1×108、1×106至3×106、3×106至5×106、5×106至7×106、2×106至2×107、5×106至2×107、或1×106至2×107个细胞/个体。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约1×106个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约1.5×106至约1.5×107个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×104、2.5×104、5×104、1×105、2×105、2.5×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106、或1×107个细胞/kg。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至2×105、2×105至4×105、4×105至6×105、6×105至8×105、8×105至1×106、1×106至2×106、2×106至1×107、1×104至1×105、1×105至1×106、1×106至1×107、1×104至1×106、或1×105至1×107个细胞/kg。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约2×105个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约2.5×104至约2.5×105个细胞/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、或5×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，活化T细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、3×109至7×109、1×1010至2×1010、或1×109至1×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞是以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。
在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，活化T细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×107至1×108、1×107至5×107、2×107至4×107、5×107至1×108、1×108至2×108、5×107至1×108、1×108至2×108、2×108至5×108、1×108至1×109、或1×107至1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，活化T细胞是以至少约6×107个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，活化T细胞是以约1.5×107至约2×108个细胞/kg的剂量施用。
MASCT可用于单一疗法、以及与另一种药剂的组合疗法。例如，可将任何本文所述的治疗方法与一种或多种(诸如1、2、3、4、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂的施用组合。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自：PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、以及LAG-3的抑制剂。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、BMS-936559、以及阿替珠单抗、派姆单抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、以及TSR-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，
)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是SHR-1210。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。示例性抗PD-L1抗体包括但不限于KY-1003、MCLA-145、RG7446、BMS935559、MPDL3280A、MEDI4736、阿维鲁单抗(avelumab)、或STI-A1010。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA-4抗体包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗、以及KAHR-102。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(例如，
)。
在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是同时施用。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是以单一组合物施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂存在于第一、第二、或第三共培养物中。在一些实施方案中，在施用前(诸如紧接在施用前)将活化T细胞和免疫检查点抑制剂混合。在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是经由不同组合物同时施用。
在一些实施方案中，活化T细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用活化T细胞之前施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用活化T细胞之后施用。
免疫检查点抑制剂的示例性施用途径包括但不限于肿瘤内、膀胱内、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、颅内、胸膜内、皮下、以及表皮途径，或经递送至已知含有此类活癌细胞的淋巴腺、身体空间、器官、或组织中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经静脉内施用在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是通过输注施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、或更长中任一者内输注。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与活化T细胞相同的施用途径施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与活化T细胞不同的施用途径施用。
合适的免疫检查点抑制剂剂量包括但不限于约下列中任一者：1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、20mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、750mg/m2、1000mg/m2、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1至约5mg/m2、约5至约10mg/m2、约10至约20mg/m2、约20至约50mg/m2、约50至约100mg/m2、约100mg/m2至约200mg/m2、约200至约300mg/m2、约300至约400mg/m2、约400至约500mg/m2、约500至约750mg/m2、或约750至约1000mg/m2。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量为约下列中任一者：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每日施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以一周至少约1x、2x、3x、4x、5x、6x、或7x(即每日)中任一者施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用且没有中断；每周(三周中有两周)；每周(四周中有三周)；每两周一次；每3周一次；每4周一次；每6周一次；每8周、每月、或每二至12个月一次。在一些实施方案中，各施用之间之间隔少于约下列中任一者：6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天。在一些实施方案中，各施用之间之间隔多于约下列中任一者：1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、或12个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每3个月施用一次。在一些实施方案中，给药时程没有中断。在一些实施方案中，各施用之间之间隔不多于约一周。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与活化T细胞相同的给药时程施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与活化T细胞不同的给药时程施用。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在每个MASCT治疗周期中施用。例如，每个MASCT治疗周期可施用免疫检查点抑制剂约1、2、3、4、5、6、或更多次中的任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂并未在每个MASCT治疗周期中施用。例如，免疫检查点抑制剂可约每1、2、3、4、5、或更多个MASCT治疗周期施用一次。
可在延长时段(诸如约一个月到至多约七年)内施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在至少约下列中任一者的期间内施用免疫检查点抑制剂：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是单次施用。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂直到疾病进展。
在一些实施方案中，MASCT特别适用于在个体癌症中具有低总突变负荷的个体。在一些实施方案中，MASCT特别适用于在个体癌症中具有癌症相关基因中低突变负荷的个体。在一些实施方案中，MASCT特别适用于在个体癌症中具有T细胞反应相关免疫基因中低突变负荷的个体。在一些实施方案中，MASCT特别适用于在个体癌症中具有MHC基因中低突变负荷的个体。突变负荷可为在下列中的突变负荷：所有癌细胞、或癌细胞的子集，诸如原发性或转移性肿瘤部位，例如肿瘤活检样本中的细胞。
在一些实施方案中，一个或多个基因的低突变负荷是在该一个或多个基因上累积的突变数量少。在一些实施方案中，不多于约500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、或更少中任一者的突变的总数指示低突变负荷。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因中不多于约50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个中任一者的突变指示该一个或多个MHC基因的低突变负荷。在一些实施方案中，一个或多个基因的低突变负荷是在该一个或多个基因(诸如MHC基因)上累积的突变数量与在所选基因集(诸如癌症相关基因)或全基因组中的突变总数之间的低比率。
在一些实施方案中，一个或多个MHC基因包括MHC I类基因(或基因座)。在一些实施方案中，一个或多个MHC基因包括MHC II类基因(或基因座)。在一些实施方案中，其中个体是人类个体，一个或多个MHC基因选自：HLA-A、HLA-B、HLA-C、以及B2M。
示例性突变包括但不限于缺失、移码、插入、插入或缺失(indel)、误义突变、无意义突变、点突变、拷贝数变异、单一核苷酸变异(single nucleotide variation,SNV)、缄默突变、剪接位突变、剪接变体、基因融合、以及易位。在一些实施方案中，MHC基因的拷贝数变异是由基因组的结构性重排造成，其包括染色体或其片段的缺失、重复、倒位、以及易位。在一些实施方案中，一个或多个MHC基因中的突变选自点突变、移码突变、基因融合、以及拷贝数变异。在一些实施方案中，突变是在MHC基因的蛋白质编码区中。在一些实施方案中，突变是非同义突变。在一些实施方案中，突变不具多型性。在一些实施方案中，突变存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变不存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变影响由受影响基因编码的MHC分子的生理化学或功能性质，诸如稳定性或结合亲和力。在一些实施方案中，突变导致MHC分子中不可逆的缺陷。在一些实施方案中，突变降低MHC分子对T细胞表位和/或T细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是功能丧失型突变。在一些实施方案中，突变导致MHC分子中可逆的缺陷。在一些实施方案中，突变不影响MHC分子对T细胞表位和/或T细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是体细胞突变。在一些实施方案中，突变是生殖系突变。
计入突变负荷的突变可存在于所有癌细胞中或癌细胞的子集中。在一些实施方案中，突变存在于个体的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变存在于肿瘤部位的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变为克隆体性。在一些实施方案中，突变为次克隆体性。在一些实施方案中，突变存在于个体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的癌细胞中。
某些MHC基因中和/或一个或多个MHC基因的某些域或位置中的突变可能对个体对本文所述治疗方法的临床反应具有更深远的影响。例如，功能丧失型突变可发生在HLA分子之前导肽序列、a3域(其结合T细胞的CD8辅受体)、a1肽结合域、或a2肽结合域中；参见例如Shukla S.et al.Nature Biotechnology 33,1152-1158(2015)，其以引用方式并入本文中。B2M(β2-巨球蛋白)基因中的突变也可启动肿瘤逃脱表型。参见例如Monica B etal.Cancer Immunol.Immu.,(2012)61:1359-1371。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因的功能区中存在任何数量(诸如1、2、3、4、5、或更多个)的突变指示高突变负荷，此类功能区诸如前导肽序列、a1域、a2域、或a3域。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因(诸如人类个体中的HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)中存在任何数量(诸如1、2、3、4、5、或更多个)的功能丧失型突变指示高突变负荷。在一些实施方案中，一个或多个MHC基因中的低突变负荷在功能区中不包括突变，此类功能区包括该一个或多个MHC基因(诸如HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)之前导肽序列、a1域(例如，与CD8辅受体直接接触的残基)、a2域、以及a3域(例如，与表位直接接触的残基)。在一些实施方案中，在B2M基因中存在任何数量的突变(诸如功能丧失型突变)指示高突变负荷。在一些实施方案中，在一个或多个MHC基因中的低突变负荷在B2M基因中不包括突变。
可通过所属技术领域中任何已知的方法来确定一个或多个基因(诸如MHC基因)的突变负荷，此类方法包括但不限于基因组DNA测序、外显子测序、或其他使用桑格测序或下一代测序平台的基于DNA测序的方法；聚合酶连锁反应测定；原位杂交测定；以及DNA微数组。
在一些实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本测序，确定一个或多个MHC基因的突变负荷。在一些实施方案中，测序是下一代测序。在一些实施方案中，测序是全基因组测序。在一些实施方案中，测序是外显子测序，诸如全外显子测序(whole exome sequencing,“WES”)。在一些实施方案中，测序是RNA测序。在一些实施方案中，测序是候选基因(诸如癌症相关基因加上HLA基因)的靶向测序。例如，ONCOGXONETMPlus(Admera Health)可用于对癌症相关基因和HLA基因座测序，且具有高测序深度。在一些实施方案中，可使用相同的测序数据来确定一个或多个MHC基因的突变负荷并识别个体中的新抗原。
在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如细针穿刺的肿瘤细胞、或由腹腔镜术获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤基质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得。在一些实施方案中，肿瘤样本经冷冻。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包括循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过将来自血液的循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)分类，获得肿瘤样本。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取核酸(诸如DNA和/或RNA)，以用于测序分析。在一些实施方案中，将肿瘤样本的测序数据与参考样本(诸如来自相同个体的健康组织样本、或健康个体的样本)的测序数据比较，以识别突变并确定肿瘤细胞中的突变负荷。在一些实施方案中，将肿瘤样本的测序数据与来自基因组数据库的参考序列比较，以识别突变并确定肿瘤细胞中的突变负荷。
任何MASCT方法可包括使用在多种肿瘤抗原肽中的一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该MASCT进一步包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原而选择用于治疗方法的个体的步骤、和/或下列步骤：(i)识别该个体的新抗原；以及(ii)将衍生自该新抗原的新抗原肽并入该多种肿瘤抗原肽，以用于该治疗方法。
在一些实施方案中，该MASCT包括：(a)识别该个体的新抗原；(b)将新抗原肽并入多种肿瘤抗原肽，其中该新抗原肽包括该新抗原中的新表位；(c)可选地施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的DC；(d)通过将抗原负载DC与T细胞群共培养来制备活化T细胞群；以及(e)向该个体施用有效量的活化T细胞，其中该个体具有一种或多种新抗原。
个体可具有任何数量(诸如至少约1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、100、或更多种中任一者)的新抗原，以受益于MASCT方法，该方法使用包括新抗原肽的多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多种中任一者的新抗原的个体。在一些实施方案中，新抗原包括一个或多个新表位。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多个中任一者的新表位的个体。在一些实施方案中，T细胞表位是MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，相较于对应的野生型T细胞表位，新表位对个体的MHC分子具有较高的亲和性。在一些实施方案中，相较于对应的野生型T细胞表位，新表位对模型T细胞受体具有较高的亲和性。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是克隆体性新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是次克隆体性新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)存在于个体中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的肿瘤细胞中。
新抗原的数量可与其他生物标记或选择标准组合，以为本文所述MASCT方法中任一者选择个体。在一些实施方案中，MASCT方法特别适用于以下的个体：在癌细胞中具有低突变负荷(诸如在一个或多个MHC基因中)，和/或具有至少约4、5、6、7、8、10、或更多种中任一者的新抗原(诸如具有高亲和性MHC-I限制性新表位的新抗原)。
可基于个体的新抗原设计任何数量(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中任一者)的新抗原肽，并将其并入用于任何本文所述的治疗方法的多种肿瘤抗原肽中。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括单一新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。各新抗原肽可包括一个或多个新表位，该新表位是来自个体的新抗原。在一些实施方案中，新表位是T细胞表位。基于新抗原设计新抗原肽的方法描述于“多种肿瘤抗原肽”一节中。
可使用所属技术领域中任何已知的方法，识别个体中的新抗原。在一些实施方案中，基于来自个体的肿瘤样本的基因轮廓识别新抗原。各新抗原包括一个或多个新表位。在一些实施方案中，基于肿瘤样本的基因轮廓，识别新抗原中的一个或多个新表位。可使用任何已知的基因解析方法(诸如下一代测序(NGS)方法、微数组、或蛋白质体方法)来提供肿瘤样本的基因轮廓。
在一些实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本测序，识别新抗原。在一些实施方案中，测序是下一代测序。在一些实施方案中，测序是全基因组测序。在一些实施方案中，测序是外显子测序，诸如全外显子测序(whole exome sequencing,“WES”)。在一些实施方案中，测序是RNA测序。在一些实施方案中，测序是候选基因(诸如癌症相关基因)的靶向测序。许多市售NGS癌症组(例如ONCOGXONETMPlus(Admera Health))可用于对癌症相关基因测序，且具有高测序深度。
在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如细针穿刺的肿瘤细胞、或由腹腔镜术获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤基质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得。在一些实施方案中，肿瘤样本经冷冻。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包括循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过将来自血液的循环肿瘤细胞(circulating tumorcell,CTC)分类，获得肿瘤样本。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取核酸(诸如DNA和/或RNA)，以用于测序分析。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取蛋白质，以用于测序分析。
在一些实施方案中，将肿瘤样本的基因轮廓与参考样本(诸如来自相同个体的健康组织样本、或健康个体的样本)的基因轮廓比较，以识别肿瘤细胞中的候选突变基因。在一些实施方案中，将肿瘤样本的基因轮廓与来自基因组数据库的参考序列比较，以识别肿瘤细胞中的候选突变基因。在一些实施方案中，候选突变基因是癌症相关基因。在一些实施方案中，各候选突变基因包括：一个或多个突变，诸如非同义取代、插入或缺失(indel/insertion or deletion)、或基因融合，其可产生新抗原。常见的单核苷酸多型性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP)排除在候选突变之外。
在一些实施方案中，自候选突变蛋白识别新抗原中的新表位。在一些实施方案中，以计算机仿真预测新表位。用于T细胞表位预测的示例性生物信息工具是所属技术领域中已知的，例如参见Yang X.和Yu X.(2009)的“An introduction to epitope predictionmethods and software”Rev.Med.Virol.19(2):77-96。T细胞表位预测算法中所考虑的因素包括但不限于个体的MHC亚型、T细胞表位的序列衍生的生理化学性质、MHC结合模体、蛋白酶体裂解模式、抗原处理相关转运蛋白(transporter associated with antigenprocessing,TAP)转运效率、MHC结合亲和力、肽-MHC稳定性、以及T细胞受体结合亲和力。在一些实施方案中，新表位是MHC-I限制性表位。在一些实施方案中，新表位是MHC-II限制性表位。
在一些实施方案中，新表位对个体的MHC分子具有高亲和性。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定个体的MHC亚型(例如，自测序数据确定)，以识别个体的一种或多种MHC分子。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定新表位对MHC分子(诸如MHC I类分子)的亲和性。在一些实施方案中，该方法包括确定新表位对个体的一种或多种MHC(诸如MHCI类)分子的亲和性。在一些实施方案中，将新表位对个体的一种或多种MHC分子的亲和性，与对应野生型表位对个体的一种或多种MHC分子的亲和性比较。在一些实施方案中，选择相较于对应野生型表位，对个体的一种或多种MHC分子(诸如MHC-I分子)具有较高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)亲和性的新表位。在一些实施方案中，使用所属技术领域中任何已知的工具或方法，以计算机仿真预测MHC结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验确定MHC结合亲和力，诸如使用体外结合测定。
在一些实施方案中，该MASCT进一步包括确定复合物对T细胞受体的亲和性，该复合物包括新表位和MHC分子(诸如个体的MHC I类分子)。在一些实施方案中，将包括新表位和MHC分子的复合物对T细胞受体的亲和性，与包括对应野生型表位和MHC分子的复合物的亲和性比较。在一些实施方案中，MHC分子是来自个体。在一些实施方案中，T细胞受体是在个体的一个或多个T细胞的表面上。在一些实施方案中，选择相较于对应野生型表位，在复合物中对T细胞受体模型具有较高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)亲和性的新表位，该复合物包括新表位和MHC分子。在一些实施方案中，使用所属技术领域中任何已知的任何工具或方法，以计算机仿真预测TCR结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验确定TCR结合亲和力，例如通过确定T细胞对新表位的反应。
在一些实施方案中，进一步基于肿瘤样本中新抗原(或新表位)的表达水平，识别该新抗原(或新表位)。可使用所属技术领域中任何已知的mRNA或蛋白质水平定量方法，诸如RT-PCR、基于抗体的测定法、以及质谱术，确定新抗原(或新表位)的表达水平。在一些实施方案中，自肿瘤样本的测序数据，确定新抗原(或新表位)的表达水平。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是以至少约10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、或更多个中任一者拷贝/细胞的水平表达于肿瘤细胞中。在一些实施方案中，相较于对应野生型蛋白质(或对应野生型表位)，新抗原(或新表位)是以多于约1.5、2、5、10、20、50、100、或更多倍中任一者的水平表达于肿瘤细胞中。
在一些实施方案中，通过包括下列的步骤选择或识别新抗原肽：(a)对来自个体的肿瘤样本测序以识别新抗原；(b)识别新抗原中的新表位；可选地(c)确定该个体的MHC亚型(例如，使用测序数据确定)，以识别该个体的MHC分子；可选地(d)确定该新表位对该个体的该MHC分子的亲和性；可选地(e)确定复合物对T细胞受体的亲和性，该复合物包括该新表位和该MHC分子；以及(f)获得包括该新表位的肽，以提供该新抗原肽。在一些实施方案中，相较于包括对应野生型T细胞表位和MHC分子的复合物，新表位对个体的MHC分子(诸如MHC-I分子)具有较高亲和性，和/或在包括该新表位和该MHC分子的复合物中对TCR具有较高亲和性。在一些实施方案中，根据具有表位的新抗原的天然序列，将新表位在N端或C端或两端延伸，以获得延伸序列，其中该延伸序列适于由I类和II类两者MHC分子呈现。使用一种或多种新抗原肽的任何本文所述的治疗方法可进一步包括任一个或多个新抗原选择/识别步骤。
任何本文所述的治疗方法和MASCT方法可进一步包括在个体接受治疗之后的监测步骤。治疗后监测可有利于调整个体的治疗方案，以优化治疗成果。
例如，可基于个体对多种肿瘤抗原肽中各自的特异性免疫反应、和/或个体对活化T细胞的临床反应，调整或定制本文所述的多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽，其可用于重复治疗。在一些实施方案中，可自用于未来制备经脉冲DC或活化T细胞的抗原肽池，移除不会引发强烈特异性免疫反应的肿瘤抗原肽。
可使用所属技术领域中任何已知的方法，例如通过测量经过个体肿瘤抗原肽刺激后来自T细胞(或PBMC)的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶B)、或细胞因子释放(诸如IFNγ或TNFα)的水平，确定对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用基于抗体的测定法(诸如ELISPOT)来定量细胞毒性因子、或细胞因子(诸如IFNγ)水平。在一些实施方案中，将响应于肿瘤抗原肽的来自T细胞(或PBMC)的细胞因子(诸如IFNγ)释放水平标准化至参考物(诸如基线细胞因子释放水平、或响应于不相关肽的来自T细胞(或PBMC)的非特异性细胞因子释放水平)，以提供细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值。在一些实施方案中，在ELISPOT测定中，大于约1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中任一者的细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值指示对肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫反应。在一些实施方案中，将在ELISPOT测定中细胞因子(诸如IFNγ)倍数变化值小于约10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.2、或更小中任一者的肿瘤抗原肽自该多种肿瘤抗原肽移除，以提供多种用于未来治疗的定制肿瘤抗原肽。
可由医师利用所属技术领域中已知的方法，诸如利用造影方法、血液测试、生物标记评估、以及活检，评估个体对本文所述治疗方法的临床反应。在一些实施方案中，通过确定个体在接受活化T细胞之前和之后的循环肿瘤细胞(CTC)数目，监测临床反应。在一些实施方案中，CTC已自原发性肿瘤剥离并在体液中循环。在一些实施方案中，CTC已自原发性肿瘤剥离并在血流中循环。在一些实施方案中，CTC是转移的指示。CTC数目可通过所属技术领域中已知的各种方法确定，此类方法包括但不限于CellSearch方法、Epic Science方法、IsoFlux、以及maintrac。在一些实施方案中，确定在个体血液样本中的单CTC(包括CTC的特异性亚型)数目。在一些实施方案中，当个体在接受治疗后每mL血液样本的单CTC数目多于约10、20、50、100、150、200、300、或更多中任一者时，其指示转移的风险增加、和/或对治疗方法的临床反应不佳。在一些实施方案中，相较于接受治疗之前，个体在接受治疗后的单CTC数目增加(诸如增加至少约1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示对治疗方法的临床反应不佳。在一些实施方案中，确定在个体血液样本中的CTC团簇数目。在一些实施方案中，当个体在接受治疗后的血液样本中检测到至少约1、5、10、50、100、或更多个中任一者的CTC团簇时，其指示转移的风险增加、和/或对治疗的临床反应不佳。在一些实施方案中，相较于接受治疗之前，个体在接受治疗后的CTC团簇数目增加(诸如增加至少约1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示对治疗的临床反应不佳。
III.肿瘤特异性TCR
本文还提供的是肿瘤特异性TCR，其是使用第II节所述方法中的任一者获得。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR特异性识别CEA、RSG-5、或HPV18-E7。编码肿瘤特异性TCR的核酸和载体、表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞还在本专利申请的范围内。
示例性肿瘤特异性TCR
使用本文所述的方法识别的示例性TCR显示于下表1中。V、J、C区段是根据IMGT数据库命名。可使用所属技术领域中已知的其他命名法和区段划分(delineation)算法。例如，根据IMGT，TCR链包括：自氨基酸位置1至26的FR1、自氨基酸位置27至38的CDR1、自氨基酸位置39至55的FR2、自氨基酸位置56至65的CDR2、自氨基酸位置66至104的FR3、以及自氨基酸位置105至117的CDR3(针对重排的V-J基因和V-D-J基因)、以及自氨基酸位置118至129的FR4。参见例如Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)、以及world wideweb.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html。示例性TCR的CDR1、CDR2、以及CDR3显示于“序列表”一节和表5中。
表1：示例性肿瘤特异性TCR
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CEA肽的表位。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至RGS5的表位，诸如人类RGS5，例如人类RGS5的氨基酸1-30或氨基酸16-30。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGS5肽的表位。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的RGS5的表位。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列的RGS5的表位。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至HPV18-E7的表位，诸如人类HPV18-E7，例如人类HPV18-E7的氨基酸80-94、76-105、或84-102。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQID NO:3的氨基酸序列的HPV18-E7肽的表位。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列的HPV18-E7的表位。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的HPV18-E7的表位。在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列的HPV18-E7的表位。
还提供的是分离肿瘤表位，其包括SEQ ID NO:82至86的氨基酸序列中任一者。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)，其包括SEQ ID NO:4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、87、90、93、以及96中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)，其包括：(a)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:4、10、以及16的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:7、13、以及19的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(b)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:22、28、34、40、46、以及52的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:7、13、19、25、31、37、43、49、以及55的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；或(c)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:58、64、70、76、87、以及93的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:61、67、73、79、90、以及96的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)，其包括：(a)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:4具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:7具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(b)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:10具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:13具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(c)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:16具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:19具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(d)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:22具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:25具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(e)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:28具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:31具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(f)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:34具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:37具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(g)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:40具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:43具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(h)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:46具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:49具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(i)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:52具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:55具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(j)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:58具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:61具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(k)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:64具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:67具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(l)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:70具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:73具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(m)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:76具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:79具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；(n)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:87具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ ID NO:90具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；或(o)第一氨基酸序列，其与SEQ ID NO:93具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及第二氨基酸序列，其与SEQ IDNO:96具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)。在一些实施方案中，(a)至(c)中任一者的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CEA肽的表位。在一些实施方案中，(d)至(i)中任一者的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGS-5肽的表位。在一些实施方案中，(e)至(g)和(i)中任一者的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的RGS-5表位。在一些实施方案中，(h)的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列的RGS-5表位。在一些实施方案中，(j)至(o)中任一者的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HPV18-E7肽的表位。在一些实施方案中，(n)的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQID NO:84的氨基酸序列的HPV18-E7表位。在一些实施方案中，(j)、(l)、以及(m)中任一者的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的HPV18-E7表位。在一些实施方案中，(o)的抗原结合构建体特异性结合至包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列的HPV18-E7表位。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)，其包括CDR3，该CDR3包括SEQ ID NO:4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、87、90、93、以及96中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:4、10、以及16的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:7、13、以及19的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(b)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:22、28、34、40、46、以及52的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:7、13、19、25、31、37、43、49、以及55的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；或(c)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:58、64、70、76、87、以及93的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:61、67、73、79、90、以及96的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:4具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:7具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(b)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:10具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:13具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(c)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:16具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:19具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(d)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQID NO:22具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:25具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(e)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:28具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:31具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(f)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:34具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:37具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(g)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:40具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:43具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(h)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:46具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:49具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(i)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQID NO:52具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:55具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(j)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:58具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:61具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(k)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:64具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:67具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(l)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:70具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:73具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(m)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:76具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:79具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；(n)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQID NO:87具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:90具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；或(o)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括与SEQ ID NO:93具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:96具有至少约90％序列同一性(例如，100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)至(c)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CEA肽的表位。在一些实施方案中，(d)至(i)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ IDNO:2的氨基酸序列的RGS-5肽的表位。在一些实施方案中，(e)至(g)和(i)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的RGS-5表位。在一些实施方案中，(h)的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列的RGS-5表位。在一些实施方案中，(j)至(o)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HPV18-E7肽的表位。在一些实施方案中，(n)的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列的HPV18-E7表位。在一些实施方案中，(j)、(l)、以及(m)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的HPV18-E7表位。在一些实施方案中，(o)的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列的HPV18-E7表位。
任何本文所述的肿瘤特异性TCR可包括V部分和/或J部分。任何合适的V部分和J部分皆可适用，参见例如IMGT数据库。表1显示V部分和J部分的示例性组合。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、88、以及94中任一者的TRAV部分、或其变体；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:8、14、20、26、32、38、44、56、62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的TRBV部分、或其变体。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、88、以及94中任一者的TRAJ部分、或其变体；和TCRβ链，其包括SEQID NO:8、14、20、26、32、38、44、56、62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的TRBJ部分、或其变体。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)TCRα链，其包括SEQ IDNO:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者的CDR；(b)TCRα链，其包括SEQ ID NO:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者的CDR；或(c)TCRα链，其包括SEQ ID NO:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的CDR。
本文所述的肿瘤特异性TCR还包括TCR恒定域。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、88、以及94中任一者的TCRα恒定域(TRAC)、或其变体；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:8、14、20、26、32、38、44、56、62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的TCRβ恒定域(TRBC)、或其变体。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：人类TRAC和人类TRBC，诸如人类Cα和人类Cβ1、或人类Cα和人类Cβ2。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：包括TRAC或其变体的TCRα链，该TRAC包括SEQ ID NO:198的氨基酸序列；以及包括TRBC的TCRβ链，该TRBC包括SEQ ID NO:202或204的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：鼠类TRAC和鼠类TRBC，诸如鼠类Cα和鼠类Cβ1。在一些实施方案中，鼠类TRAC包括位置117处的修饰(例如，S117L)和/或110处的修饰(例如，G110V)。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括：包括TRAC或其变体的TCRα链，该TRAC包括SEQ ID NO:200的氨基酸序列；以及包括TRBC的TCRβ链，该TRBC包括SEQ ID NO:206的氨基酸序列。
在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR是人类TCR。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR包括人类TCR可变区、以及来自非人类物种(诸如小鼠)的TCR恒定区。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)TCRα链，其包括与SEQID NO:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(b)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；或(c)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:62、68、74、80、以及91、以及97的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR，其包括：(a)TCRα链，其包括与SEQID NO:5具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:8具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(b)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:11具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:14具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(c)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:17具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:20具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(d)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:23具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:26具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(e)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:29具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:32具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(f)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:35具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:38具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(g)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:41具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:44具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(h)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:47具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:50具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(i)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:53具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:56具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(j)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:59具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:62具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(k)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:65具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:68具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(l)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:71具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:74具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(m)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:77具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:80具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；(n)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:88具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:91具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；或(o)TCRα链，其包括与SEQ IDNO:94具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:97具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)至(c)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CEA肽的表位。在一些实施方案中，(d)至(i)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的RGS-5肽的表位。在一些实施方案中，(e)至(g)和(i)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列的RGS-5表位。在一些实施方案中，(h)的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列的RGS-5表位。在一些实施方案中，(j)至(o)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HPV18-E7肽的表位。在一些实施方案中，(n)的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列的HPV18-E7表位。在一些实施方案中，(j)、(l)、以及(m)中任一者的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列的HPV18-E7表位。在一些实施方案中，(o)的肿瘤特异性TCR特异性结合至包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列的HPV18-E7表位。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/RGS5表位复合物，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DPA1*02:02/DPB1*05:01。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:28；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:254的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:255的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:256的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:257的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:214的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:212的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:214具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:212具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:29具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:32具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:103具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:105具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:147或149的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/RGS5表位复合物，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:34；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:258的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:259的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ IDNO:260的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:261的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:242的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:240的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:242具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:240具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:35具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQID NO:38具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:107具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:109具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:151、153、155、以及157中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/RGS5表位复合物，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:40；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:262的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:263的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ IDNO:264的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:265的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:238的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:236的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:238具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:236具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:41具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQID NO:44具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括与SEQ ID NO:111具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:113具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:159、161、163、以及165中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/RGS5表位复合物，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:46；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:49。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:266的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:267的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ IDNO:268的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:269的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:222的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:220的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:222具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:220具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:47具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:50具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:115具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:117具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:167和169中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/RGS5表位复合物，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DPA1*02:02/DPB1*05:01。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:52；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:270的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:271的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:272的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:273的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:210的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:208的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:210具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:208具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:53具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:56具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:119具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:121具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:143和145中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:58；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:274的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:275的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:276的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:277的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:234的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:232的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:234具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:232具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:59具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:62具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ IDNO:123具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:125具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:179和181中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:70；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ IDNO:73。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:278的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:279的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQID NO:280的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:281的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ IDNO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:226的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:224的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:226具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:224具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:71具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQID NO:74具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:127具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:129具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:183和185中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-II。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQID NO:76；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:282的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:283的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:284的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:285的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:218的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:216的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:218具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQID NO:216具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:77具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:80具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:131具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:133具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:187和189中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:87；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:286的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:287的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:288的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:289的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:246的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:244的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:246具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:244具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:88具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:91具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ IDNO:135具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:137具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:171、173、175、以及177中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种抗原识别构建体(例如，TCR)，其特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:86的氨基酸序列，且其中该MHC是HLA-DPA1*02:02/DPB1*05:01、HLA-DPA1*01:03/DPB1*02:01、或HLA-DPA1*01:03/DPB1*05:01。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ IDNO:93；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:290的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:291的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:292的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:293的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括：TCRα链，其包括SEQ ID NO:230的CDR1、CDR2、以及CDR3；TCRβ链，其包括SEQ ID NO:228的CDR1、CDR2、以及CDR3。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:230具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQID NO:228具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体是人类TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体是嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:94具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:97具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括TCRα链，其包括与SEQ ID NO:139具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列；TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:141具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别构建体包括SEQ ID NO:191和193中任一者的氨基酸序列。
天然存在的TCR是由αβ或γδ链组成的异二聚体受体，此类αβ或γδ链在T细胞表面上配对。各α、β、γ、以及δ链是由两个Ig样域组成：可变域(V)，其透过互补决定区(CDR)而赋予抗原识别；接着是恒定域(C)，其通过连接肽和跨膜(TM)区锚定至细胞膜。TM区域与CD3传讯构造的不变次单元相关联。V域的各自具有三个CDR。这些CDR与复合物(其为结合至由主要组织兼容性复合体编码的蛋白质的抗原肽之间的复合物，pMHC)相互作用(Davis andBjorkman(1988)Nature,334,395-402；Davis et al.(1998)Annu Rev Immunol,16,523-544；Murphy(2012),xix,868p.)。
“同源性(homology)”是指在两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个经比较序列中的位置是由相同的碱基或氨基酸单体次单元占据时，例如，如果两个DNA分子的各自中的位置是由腺嘌呤占据，则此类分子在该位置是“同源”。两个序列之间的“同源性百分比(percent of homology)”或“序列同一性百分比(percentsequence identity)”是两个序列所共有的匹配或同源位置的数目除以经比较位置的数目再乘以100的函数，并将任何保守型取代视为序列同一性的一部分。例如，如果两个序列的10个位置中有6个为匹配或同源，则该两个序列是60％同源。举实例而言，DNA序列ATTGCC与TATGGC共有50％同源性。通常，当比对两个序列时进行比较，以提供最大同源性。可采用所属技术领域中通常知识内的各种方式，例如使用公开可用计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件，来达成以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对。所属领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为了在经比较序列全长上达到最大比对而需要的任何算法。然而，出于本文的目的，使用于下序列比较计算机软件程序来产生氨基酸序列同一性值％：MUSCLE(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113,2004)。
还提供的是本文所述的TCR中任一者识别的表位、以及MHC/表位复合物。进一步提供的是与本文所述的TCR中任一者竞争结合至相同MHC/表位复合物的TCR。
HLA限制
本文所述的肿瘤特异性TCR为MHC I类或MHC II类限制性。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR限于HLA单倍型。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR具有亚洲人中主要的HLA单倍型限制。图25A至图25B显示示例性TCR的HLA限制。
MHC I类蛋白是两种主要类型的主要组织兼容性复合体(MHC)分子中的一种(另一种是MHC II类)，且见于体内几乎每个有核细胞上。彼等的功能是向T细胞呈现来自细胞内的蛋白质片段；健康细胞将受到忽略，而含有外来或突变蛋白质的细胞将受到免疫系统的攻击。由于MHC I类蛋白呈现衍生自胞质蛋白的肽，因此MHC I类呈现途径常称为胞质或内源性途径。I类MHC分子会结合主要由蛋白酶体分解胞质蛋白而产生的肽。然后，MHC I：肽复合物经插入细胞的质膜。该肽结合至I类MHC分子的胞外部分。因此，I类MHC的功能是向细胞毒性T细胞(CTL)呈现细胞内蛋白质。然而，在一种称为交叉呈递的程序中，I类MHC也可呈现自外源性蛋白质产生的肽。
MHC I类蛋白质是由两个多肽链组成，即α和β2微球蛋白(β2M)。两个链是经由β2M和α3域的相互作用非共价连接。仅α链具多型性且是由HLA基因编码，而β2M次单元不具多型性且是由β-2微球蛋白基因编码。α3域跨越质膜且与T细胞的CD8辅受体相互作用。α3-CD8相互作用将MHC I分子固定就位，而细胞毒性T细胞表面上的T细胞受体(TCR)结合其α1-α2异二聚体配体，并检查耦合肽的抗原性。α1和α2域折迭以构成用于肽结合的沟槽。MHC I类蛋白会结合长度为8至10个氨基酸的肽。
MHC II类分子是通常仅在抗原递呈细胞上发现的分子家族，此类抗原递呈细胞诸如树突细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞、胸腺上皮细胞、以及B细胞。由II类肽呈现的抗原是衍生自胞外蛋白质(不同于I类中的胞质蛋白)；因此，抗原呈现的MHC II类依赖性途径称为胞吞或外源性途径。通过吞噬作用而发生MHC II类分子的负载；胞外蛋白质经胞吞，在溶酶体中消化，且所得表位肽片段是在其迁移至细胞表面之前负载于MHC II类分子上。
类似于MHC I类分子，II类分子还为异二聚体，但在此情况下是由两个同质肽组成，即α和β链。子名称α1、α2等是指HLA基因内的不同域；各域通常是由基因内不同外显子编码，且一些基因具有编码前导序列、跨膜序列等另外的域。由于MHC II类分子的抗原结合沟槽在两端为开放，而I类分子上的对应沟槽在各端为封闭，因此MHC II类分子所呈现的抗原较长，通常介于15与24个氨基酸残基长之间。
人类白血球抗原(HLA)基因是MHC基因的人类版本。人类的三种主要MHC I类蛋白是HLA-A、HLA-B、以及HLA-C，而3种次要的MHC I类蛋白是HLA-E、HLA-F、以及HLA-G。涉及人类抗原呈现的三种主要MHC II类蛋白是HLA-DP、HLDA-DQ、以及HLA-DR，而其他MHC II类蛋白HLA-DM和HLA-DO涉及抗原的内部处理和负载。将HLA-A评级为人类基因中具有演变最快速的编码序列。截至2013年12月，有2432个已知HLA-A等位基因，编码1740种活性蛋白质和117种无效蛋白质。HLA-A基因位于第6号染色体的短臂上，并编码HLA-A的较大α链成分。HLA-Aα链的变异是HLA功能的关键。此变异促进族群中的基因多样性。由于各HLA对某些结构的肽具有不同亲和性，因此愈多种的HLA意指细胞表面上将“呈现”愈多种的抗原，从而提高族群子集对抗任何给定外来侵入者的可能性。此会降低单一病原体能够消灭所有人口的可能性。各个体可表达至多两种类型的HLA-A，一种来自其父母的各自。一些个体将自双亲遗传到相同HLA-A，而减少其个别的HLA多样性；然而，大多数个体将接受两种不同的HLA-A拷贝。所有HLA组循此相同模式。换句话讲，一个人仅能表达2432个已知HLA-A等位基因中一或二者。
所有等位基因皆获得至少四位数分类，例如HLA-A*02:12。A表示此类位基因所属的HLA基因。有许多HLA-A等位基因，因此利用血清型分类来简化归类。下一对数字指示此分配。例如，HLA-A*02:02、HLA-A*02:04、以及HLA-A*02:324皆是A2血清型的成员(由前缀*02指定)。此组是负责HLA兼容性的主要因子。在此之后的所有数字无法通过血清分型确定，而是透过基因测序指定。第二组数字指示所产生的HLA蛋白。这些是按照发现顺序分配，且截至2013年12月，已知有456种不同HLA-A02蛋白(分配名称HLA-A*02:01至HLA-A*02:456)。最短可能的HLA名称包括这些细节两者。在此之后的各延伸表示核苷酸变化，该核苷酸变化可能或可能不改变该蛋白。
在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR特异性结合至包括目标肿瘤抗原肽和MHC I类蛋白的复合物，其中该MHC I类蛋白是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、或HLA-G。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A、HLA-B、或HLA-C。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-B。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-C。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A09、HLA-A10、HLA-A11、HLA-A19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74、或HLA-A80。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A02。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A*02:01至555中任一者，诸如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:08、HLA-A*02:09、HLA-A*02:10、HLA-A*02:11、HLA-A*02:12、HLA-A*02:13、HLA-A*02:14、HLA-A*02:15、HLA-A*02:16、HLA-A*02:17、HLA-A*02:18、HLA-A*02:19、HLA-A*02:20、HLA-A*02:21、HLA-A*02:22、或HLA-A*02:24。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A*02:01。在所有高加索人中，39至46％表达HLA-A*02:01。具有HLA-A*02:01限制的肿瘤特异性TCR可尤其适用于治疗高加索人患者。在一些实施方案中，MHC I类蛋白是HLA-A*1101。在所有华人中，约25至30％表达HLA-A*1101。具有HLA-A*1101限制的肿瘤特异性TCR可尤其适用于治疗华人患者。
在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR特异性结合至包括目标肿瘤抗原肽和MHC II类蛋白的复合物，其中该MHC II类蛋白是HLA-DP、HLA-DQ、或HLA-DR。在一些实施方案中，MHC II类蛋白是HLA-DP。在一些实施方案中，MHC II类蛋白是HLA-DQ。在一些实施方案中，MHC II类蛋白是HLA-DR。在一些实施方案中，MHC II类蛋白是HLA-DPB1*0401。在所有高加索人中，35至40％表达HLA-DPB1*0401。具有HLA-DPB1*0401限制的肿瘤特异性TCR可尤其适用于治疗高加索人患者。
变体
在一些实施方案中，设想到本文所提供的肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)的氨基酸序列变体。例如，可为所期望的是改善肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)的结合亲和力和/或其他生物性质。可通过将适当修饰引入编码肿瘤特异性TCR的TCRα或TCRβ链的(多个)核苷酸序列，或通过进行肽合成，制备肿瘤特异性TCR的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如肿瘤特异性TCR的氨基酸序列内的残基发生缺失、和/或插入、和/或取代。可做出缺失、插入、以及取代的任何组合以达到最终构建体，前提条件是该最终构建体具有所期望特征，例如抗原结合。
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的肿瘤特异性抗原结合构建体(例如，肿瘤特异性TCR)变体。取代性诱变的所关注位置包括CDR和FR。可将氨基酸取代引入所关注肿瘤特异性TCR中，并针对所期望活性(例如，保留/改善的抗原结合或降低的免疫原性)筛选产物。
保守型取代显示于下表2。
表2：保守型取代
| 原始残基 | 示例性取代 | 优选取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Asp、Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu；Asn | Glu |
| Cys(C) | Ser；Ala | Ser |
| Gln(Q) | Asn；Glu | Asn |
| Glu(E) | Asp；Gln | Asp |
| Gly(G) | Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 | Leu |
| Leu(L) | 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Tyr |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Val；Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 | Leu |
可根据共同侧链性质，将氨基酸分组成不同类别：
a.疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b.中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c.酸性：Asp、Glu；
d.碱性：His、Lys、Arg；
e.影响链取向的残基：Gly、Pro；
f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守型取代将需要将属于这些类别中一者的成员交换成为另一个类别。
示例性取代性变体是亲和力成熟的肿瘤特异性TCR，其可方便地产生，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术。简而言之，一个或多个CDR残基经突变，而变体肿瘤特异性TCR部分展示于噬菌体上并针对特定生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。可在CDR中进行改变(例如取代)，例如以改善肿瘤特异性TCR亲和性。
在亲和力成熟的一些实施方案中，将多样性引入所选择的可变基因，以通过各种方法(例如，易错PCR、链置换、或寡核苷酸定点诱变)中任一者进行成熟。然后，建立第二库。然后，筛选该库以识别任何具有所期望亲和性的肿瘤特异性TCR变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR导向方式，其中使数个CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。例如使用丙胺酸扫描诱变或仿真法，可特异性识别涉及抗原结合的CDR残基。
在一些实施方案中，可在一个或多个CDR内发生取代、插入、或缺失，只要此类改变不会实质上降低肿瘤特异性TCR结合抗原的能力。例如，可在CDR中进行不会实质上降低结合亲和力的保守型改变(例如，如本文所提供的保守型取代)。在上文所提供的变体TCRα或TCRβ序列的一些实施方案中，各CDR未改变，或含有不多于一、二、或三个氨基酸取代。
氨基酸序列插入包括：胺基和/或羧基末端融合，其长度范围是自一个残基至含有一百或更多个残基的多肽；以及单或多个氨基酸残基的序列内插入。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR构建体包括TCRα链或TCRβ链的N端处之前导序列。在一些实施方案中，前导序列包括SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供一种肿瘤特异性TCR构建体，其包括多肽，该多肽包括TCRα链多肽、可自切割(self-cleavable)的连接符、和TCRβ链多肽。在一些实施方案中，可自切割的连接符是P2A肽、T2A肽、E2A肽、或F2A肽。在一些实施方案中，可自切割的连接符包括SEQ ID NO:99、195、196、以及197的氨基酸序列中任一者。
还设想到本文所述的肿瘤特异性TCR的抗原结合片段及衍生物。
核酸
在一些实施方案中，根据任何本文所述的肿瘤特异性TCR，提供一种核酸(或一组核酸)，其编码该肿瘤特异性TCR。本发明还提供载体，其中并入了本发明的一种或多种核酸。
在一些实施方案中，提供一种分离核酸，其编码肿瘤特异性TCR、或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链、肿瘤特异性TCR、或肿瘤特异性TCR构建体)。在一些实施方案中，提供一种表达载体，其编码肿瘤特异性TCR、或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链、肿瘤特异性TCR、或肿瘤特异性TCR构建体)。在一些实施方案中，提供一种分离宿主细胞，其表达肿瘤特异性TCR、或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链、肿瘤特异性TCR、或肿瘤特异性TCR构建体)。
编码示例性肿瘤特异性TCR的核酸序列显示于表1和图25A至图25B中。在一些实施方案中，提供一种编码TCRα的分离核酸，其包括：与SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、89、以及95的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列。在一些实施方案中，提供一种编码TCRβ的分离核酸，其包括：与SEQ ID NO:9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、92、以及98的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列。
在一些实施方案中，提供一种或多种载体，其包括：(a)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:6、12、以及18的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；以及编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:9、15、以及21的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(b)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:24、30、36、42、48、以及54的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；以及编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:27、33、39、45、51、以及57的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；或(c)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:60、66、72、78、89、以及95的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；以及编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:63、69、75、81、92、以及98的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列。
在一些实施方案中，提供一种或多种载体，其包括：(a)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:6具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:9具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(b)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:12具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:15具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(c)编码TCRα链，其包括与SEQ ID NO:18具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:21具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(d)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQID NO:24具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:27具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(e)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:30具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:33具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(f)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:36具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:39具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(g)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:42具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:45具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(h)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:48具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:51具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(i)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:54具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:57具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(j)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:60具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ IDNO:63具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(k)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:66具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:69具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(l)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:72具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:75具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(m)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:78具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQID NO:81具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；(n)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:89具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:92具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；或(o)编码TCRα链的核酸，其包括与SEQ ID NO:95具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列；编码TCRβ链的核酸，其包括与SEQ ID NO:98具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列。
在一些实施方案中，提供一种分离核酸(诸如载体)，其包括肿瘤特异性TCR构建体，其中该核酸包括与选自由SEQ ID NO:144、146、148、150、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、以及194所组成的群组的核酸序列中任一者具有至少约80％同一性(例如，至少约85％、90％、95％、98％、或更高同一性中任一者，或具有100％同一性)的核酸序列。
简而言之，由编码肿瘤特异性TCR的核酸来表达肿瘤特异性TCR可通过以下达成：将该核酸插入适当的表达载体，使得该核酸可操作地连接至5’和3’调控因子，包括例如启动子(例如，淋巴球特异性启动子)和3’非转译区(UTR)。载体可适用于真核宿主细胞中的复制和整合。一般克隆和表达载体含有转录和转译终止子、起始序列和启动子，其有用于调控所期望核酸序列的表达。
通过使用标准基因递送规程，本发明的核酸也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是所属技术领域中已知的。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其全文以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，本发明提供一种基因疗法载体。
可将核酸克隆至多种类型的载体中。例如，可将核酸克隆至载体中，该载体包括但不限于质体、嗜菌质体(phagemid)、噬菌体衍生物、动物病毒，和粘粒。特别受到关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体(probe generation vector)、以及测序载体。
此外，可以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术是所属技术领域中熟知的，且描述于例如Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)、以及其他病毒学和分子生物学手册中。有用于作为载体的病毒包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、以及慢病毒。大致上，合适的载体含有在至少一种生物中作用的复制起始序列、启动子序列、方便的限制内核酸酶部位、以及一种或多种选择性标记(参见例如WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利号6,326,193)。
已开发许多基于病毒的系统，以用于基因转移进入哺乳动物细胞。例如，反转录病毒提供用于基因递送系统的方便平台。可使用所属技术领域中已知的技术，将所选基因插入载体并包装在反转录病毒颗粒中。然后，可在体内或体外，将重组病毒分离并递送至制品的细胞。许多反转录病毒系统是所属技术领域中已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是所属技术领域中已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。由于衍生自反转录病毒(诸如，慢病毒)的载体允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖，此类载体是达到长期基因转移的合适工具。相较于衍生自致癌反转录病毒(诸如鼠类白血病病毒)的载体，慢病毒载体具有附加优点，这是因为其可转导非增殖性细胞。其还具有低免疫原性的附加优点。
附加启动子组件(例如，增强子)调控转录起始的频率。一般而言，其位于起始部位上游30至110bp的区域中，但许多启动子最近也已显示含有起始部位下游功能组件。启动子组件之间之间隔经常是有弹性的，使得当组件相对于彼此倒置或移动时，会保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，可在活性开始下降之前，将启动子组件之间之间隔增加至相隔50bp。
合适启动子的一示例为立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为一种强力组成型启动子序列，其能够驱动任何有效连接至其上的多核苷酸序列的高表达水平。合适启动子的另一示例为延长生长因子1α(Elongation Growth Factor-1α,EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、鼠乳腺癌病毒(MMTV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、家禽白血病病毒启动子、艾司坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌凝蛋白启动子、血红素启动子、以及肌酸激酶启动子。
此外，本发明不应限于使用组成型启动子。还设想到可诱导型启动子作为本发明的一部分。使用可诱导型启动子会提供分子开关，该分子开关能够开启其有效连接的多核苷酸序列的表达(当此类表达为所期望时)，或者关闭该表达(当该表达为非所期望时)。用于真核细胞的示例性可诱导型启动子系统包括但不限于激素调控组件(例如，参见Mader,S.和White,J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607)、合成配体调控组件(参见例如Spencer,D.M.et al(1993)Science 262:1019-1024)、以及游离辐射调控组件(例如，参见Manome,Y.et al.(1993)Biochemistry 32:10607-10613；Datta,R.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1014-10153)。另外的示例性用于体外或体内哺乳动物系统的可诱导型启动子综述于Gingrich et al.(1998)Annual Rev.Neurosci 21:377-405。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体也可含有选择性标记基因、或报导子基因、或两者，以促进自试图透过病毒载体转染或感染的细胞群，识别并选择表达细胞。在其他方面中，选择性标记可载于单独DNA片段上，并用于共转染过程。选择性标记和报导子基因两者可以适当调控序列侧接，而得以在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗药性基因，诸如neo和类似者。
报导子基因用于识别潜在转染细胞和用于评估调控序列的功能性。大致上，报导子基因是一种不存在于受体生物或组织中或不由受体生物或组织表达的基因，且该基因编码以一些易于检测性质(例如，酶活性)显示其表达的多肽。在将DNA引入受体细胞之后，在合适时间对报导子基因的表达进行测定。合适的报导子基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因、或绿荧光蛋白基因(例如，Ui-Telet al.,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并可使用已知技术制备或在商业上获得。大致上，当具有最小5'侧区的构建体显示最高的报导子基因表达水平时，将其识别为启动子。此类启动子区可连接至报导子基因，并用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施方案中，提供核酸，其编码根据任何本文所述的肿瘤特异性TCR的肿瘤特异性TCR。在一些实施方案中，编码肿瘤特异性TCR的核酸包括：第一核酸序列，其编码该肿瘤特异性TCR的TCRα链；以及第二核酸序列，其编码该肿瘤特异性TCR的TCRβ链。在一些实施方案中，第一核酸序列位于第一载体上，且第二核酸序列位于第二载体上。在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列位于相同载体上。在一些实施方案中，第一核酸序列经由第三核酸序列融合至第二核酸序列，该第三核酸序列编码可自切割的连接符，诸如P2A、T2A、E2A、或F2A肽。载体可选自例如由下列所组成的群组：哺乳动物表达载体和病毒载体(诸如衍生自反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、以及慢病毒者)。在一些实施方案中，第一核酸序列受到第一启动子控制，且第二核酸序列受到第二启动子控制。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子具有相同序列。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子具有不同序列。在一些实施方案中，在受到多顺反子(诸如双顺反子)载体中的单一启动子的控制下，第一核酸序列和第二核酸序列以单一转录本表达。参见例如Kim,JH,etal.,PLoS One 6(4):e18556,2011。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子、和/或单一启动子为可诱导型。
经工程改造的免疫细胞
在一些实施方案中，提供一种经工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，其表达根据任何本文所述的肿瘤特异性TCR的肿瘤特异性TCR。在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞包括编码肿瘤特异性TCR的核酸，其中该肿瘤特异性TCR自该核酸表达，且位于该经工程改造的免疫细胞的表面。在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞是选自：PBMC、细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀手T细胞、以及调节性T细胞。在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞不表达内源性TCR。
在一些实施方案中，提供一种经工程改造的T细胞，其包括根据任何肿瘤特异性TCR的肿瘤特异性TCR、或其组分或衍生物(诸如TCRα链、TCRβ链、肿瘤特异性TCR、或肿瘤特异性TCR构建体)。在一些实施方案中，经工程改造的T细胞的内源性TCR经剔除。在一些实施方案中，经工程改造的T细胞是TCR-T细胞。在一些实施方案中，提供一种药物组合物，其包括经工程改造的T细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，经工程改造的T细胞是衍生自接受TCR-T治疗的个体。在一些实施方案中，经工程改造的T细胞是衍生自同种异体个体。
在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)表达多种(诸如约2、3、4、5、10、或更多种中任一者)肿瘤特异性TCR，此类肿瘤特异性TCR是使用本文所述方法中任一者获得。在一些实施方案中，经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)表达肿瘤特异性TCR，此类肿瘤特异性TCR特异性识别多种目标肿瘤抗原肽。
经工程改造的免疫细胞或其药物组合物可用于治疗自其获得肿瘤特异性TCR的个体(例如，作为维持疗法)，或用于疗法另一个个体(诸如，同种异体个体)、或具有相同MHC基因型、HLA单倍型、和/或在癌细胞上表达相同表位的个体。
使用肿瘤特异性TCR治疗的方法
本专利申请提供治疗个体中癌症的基于细胞的免疫治疗方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法用于作为个体先前所接受的MASCT的维持疗法。
本文所述方法适用于治疗各种癌症，包括液体和实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症是选自：肝细胞癌、子宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、以及脑癌。此类方法适用于所有期别的癌症，包括早期、晚期、以及转移性癌症。例如，本文所述的CEA特异性TCR、RGS5特异性TCR、以及HPV18-E7 TCR中任一者可用于治疗子宫颈癌。
在一些实施方案中，该方法降低与癌症相关联的一种或多种症状的严重性，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应症状，或相较于未接受该治疗方法的其他个体的对应症状。在一些实施方案中，该方法延迟癌症的进展。
在一些实施方案中，该方法用于治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，HCC是早期HCC、非转移性HCC、原发性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、转移性HCC、缓解中HCC、或复发性HCC。在一些实施方案中，HCC是局部可切除的(即，局限于肝脏的一部分而允许完全手术切除的肿瘤)、局部无法切除的(即，因为涉及至关重要的血管结构，或者因为肝脏受损，局部肿瘤可能无法切除)、或无法切除的(即，肿瘤涉及所有肝叶，和/或已扩散而涉及其他器官(例如肺部、淋巴结、骨骼))。在一些实施方案中，根据TNM分类，HCC是第I期肿瘤(单个肿瘤无血管侵犯)、第II期肿瘤(单个肿瘤有血管侵犯，或多个肿瘤皆未大于5cm)、第III期肿瘤(多个肿瘤且任一个大于5cm，或肿瘤涉和门静脉或肝静脉的主要分支)、第IV期肿瘤(肿瘤直接侵犯胆囊以外的邻近器官，或具有内脏腹膜穿孔)、N1肿瘤(区域淋巴结转移)、或M1肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，根据AJCC(美国癌症联合委员会(American JointCommission on Cancer))分期标准，HCC为Tl、T2、T3、或T4期HCC。在一些实施方案中，HCC是肝细胞癌、HCC的纤维板层变体、混合型肝细胞胆管癌(mixed hepatocellularcholangiocarcinoma)中任一者。在一些实施方案中，HCC是由B型肝炎病毒(HBV)感染引起。
在一些实施方案中，该方法用于治疗肺癌。在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NCSLC的示例包括但不限于大细胞癌(例如，大细胞神经内分泌癌、复合型大细胞神经内分泌癌、基底细胞样癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌、以及具类横纹肌表型的大细胞癌)、腺癌(例如，腺泡、乳突(例如，细支气管肺泡癌，非黏液性、黏液性、混合型黏液性及非黏液性、以及未定型细胞类型)、实体腺癌(具黏液素)、具混合亚型的腺癌、分化良好的胎儿型腺癌、黏液性(胶状)腺癌、黏液性囊腺癌、印环状腺癌、以及透明细胞腺癌)、神经内分泌肺部肿瘤、以及鳞状细胞癌(例如，乳突、透明细胞、小细胞、以及基底细胞样)。在一些实施方案中，根据TNM分类，NSCLC可为T期肿瘤(原发性肿瘤)、N期肿瘤(区域淋巴结)、或M期肿瘤(远处转移)。
在一些实施方案中，肺癌是类癌(典型或非典型)、腺鳞状细胞癌、圆柱瘤、或唾液腺的癌(例如，腺样囊状癌或黏液类上皮癌)。在一些实施方案中，肺癌是具有多形性、肉瘤状、或肉瘤部分的癌(例如，具有梭状细胞和/或巨细胞的癌、梭状细胞癌、巨细胞癌、癌肉瘤、或肺母细胞瘤)。在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC；还称为燕麦细胞癌)。小细胞肺癌可为局限期、扩散期、或复发性小细胞肺癌。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有怀疑或显示与肺癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、α1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、和/或AKT)，或者具有一个或多个附加拷贝的与肺癌相关联的基因。
在一些实施方案中，该方法用于治疗子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是早期子宫颈癌、非转移性子宫颈癌、局部晚期子宫颈癌、转移性子宫颈癌、缓解中子宫颈癌、无法切除的子宫颈癌、于辅助性治疗中的子宫颈癌、或于新辅助性治疗中的子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是由人类乳突病毒(HPV)感染引起。在一些实施方案中，根据TNM分类，子宫颈癌可为T期肿瘤(原发性肿瘤)、N期肿瘤(区域淋巴结)、或M期肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，子宫颈癌是下列中任一者：第0期、第I期(Tis、N0、M0)、第IA期(T1a、N0、M0)、第IB期(T1b、N0、M0)、第IIA期(T2a、N0、M0)、第IIB期(T2b、N0、M0)、第IIIA期(T3a、N0、M0)、第IIIB期(T3b、N0、M0，或T1至T3、N1、M0)、第IVA期(T4、N0、M0)、或第IVB期(T1至T3、N0至N1、M1)子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是子宫颈鳞状细胞癌、子宫颈腺癌、或腺鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，该方法用于治疗乳癌。在一些实施方案中，乳癌是早期乳癌、非转移性乳癌、局部晚期乳癌、转移性乳癌、激素受体阳性转移性乳癌、缓解中乳癌、于辅助性治疗中的乳癌、乳管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、侵袭性乳管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)、或于新辅助性治疗中的乳癌。在一些实施方案中，乳癌是激素受体阳性转移性乳癌。在一些实施方案中，乳癌(其可为HER2阳性或HER2阴性)是晚期乳癌。在一些实施方案中，乳癌是乳管原位癌。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有与乳癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD51、AR、DIRAS3、ERBB2、TP53、AKT、PTEN、和/或PI3K)，或者具有一个或多个附加拷贝的与乳癌相关联的基因(例如，一个或多个附加拷贝的HER2基因)。
在一些实施方案中，该方法用于治疗胰脏癌。在一些实施方案中，胰脏癌包括但不限于浆液性微囊性腺瘤、胰管内乳突状黏液性肿瘤、黏液性囊性肿瘤、实体伪乳突状肿瘤、胰脏腺癌、胰管腺癌、或胰母细胞瘤。在一些实施方案中，胰脏癌是早期胰脏癌、非转移性胰脏癌、原发性胰脏癌、经切除的胰脏癌、晚期胰脏癌、局部晚期胰脏癌、转移性胰脏癌、无法切除的胰脏癌、缓解中胰脏癌、复发性胰脏癌、于辅助性治疗中的胰脏癌、或于新辅助性治疗中的胰脏癌中任一者。
在一些实施方案中，该方法用于治疗卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢上皮细胞癌。示例性卵巢上皮细胞癌组织学分类包括：浆液性囊瘤(例如，浆液性良性囊腺瘤、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的浆液性囊腺瘤、或浆液性囊腺癌)、黏液性囊瘤(例如，黏液性良性囊腺瘤、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的黏液性囊腺瘤、或黏液性囊腺癌)、子宫内膜样肿瘤(例如，子宫内膜样良性囊肿、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的子宫内膜样肿瘤、或子宫内膜样腺癌)、透明细胞(中肾样)肿瘤(例如，良性透明细胞肿瘤、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的透明细胞肿瘤、或透明细胞囊腺癌)、无法指派至上述群组中的一者的未分类肿瘤、或其他恶性肿瘤。在各种实施方案中，卵巢上皮细胞癌是第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有与卵巢癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，BRCA1或BRCA2)，或者具有一个或多个附加拷贝的与卵巢癌相关联的基因(例如，一个或多个附加拷贝的HER2基因)。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢生殖细胞肿瘤。示例性组织学亚型包括：恶性胚胎瘤或其他生殖细胞肿瘤(例如，内胚窦瘤(诸如肝样或肠肿瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、或混合型肿瘤)。示例性畸胎瘤是未成熟畸胎瘤、成熟畸胎瘤、实体畸胎瘤、以及囊性畸胎瘤(例如，皮样囊肿，诸如成熟囊性畸胎瘤、以及具恶性转化的皮样囊肿)。一些畸胎瘤是单胚层且高度特异性的，诸如甲状腺肿样卵巢瘤、类癌、甲状腺肿样卵巢瘤和类癌、或其他者(例如，恶性神经外胚层和室管膜瘤)。在一些实施方案中，卵巢生殖细胞肿瘤是第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。
数种病毒与人类的癌症有关。例如，B型肝炎病毒(HBV)可能引发慢性肝脏感染，而增加个体罹患肝癌、或肝细胞癌(HCC)的可能性。人类乳突病毒(HPV)是具有多于150种相关病毒的群组，当其感染并生长于皮肤或黏膜(诸如口腔、咽喉、或阴道)时，会引起乳突瘤、或疣。已知数种类型的HPV(包括第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、以及6型)会引起子宫颈癌。HPV还在诱导或引起其他生殖器癌症上扮演角色，并与口腔和咽喉的一些癌症相关。艾司坦-巴尔病毒(EBV)是一种疱疹病毒，其长期感染并保持潜伏于B淋巴球中。EBV感染增加个体发展鼻咽癌和某些类型快速生长淋巴瘤(诸如Burkitt氏淋巴瘤)的风险。EBV还与霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)和一些胃癌病例相关。除了引起癌症或增加发展癌症的风险之外，病毒感染(诸如HBV、HPV、以及EBV感染)可导致组织或器官损伤，其可能增加罹患癌症的个体的疾病负担，并促成癌症进展。所属技术领域中已知的是，可诱导人体发动有效且特异性免疫反应，此类免疫反应包括对数种癌症相关病毒的细胞毒性T细胞反应，此类病毒诸如HBV、HPV、以及EBV(包括其各种亚型)。因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中病毒相关癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者，其中目标肿瘤抗原是衍生自该病毒。在一些实施方案中，癌症是HBV相关的肝细胞癌、HPV相关的子宫颈癌、或EBV相关的鼻咽癌。
本文所述治疗方法可用于下列目的中任一者或多者：减轻癌症的一种或多种症状、延迟癌症的进展、缩小癌症肿瘤大小、扰乱(诸如破坏)癌症基质、抑制癌症肿瘤生长、延长整体存活、延长无疾病存活、延长至癌症疾病进展的时间、预防或延迟癌症肿瘤转移、减少(诸如根除)先前存在的癌症肿瘤转移、减少先前存在的癌症肿瘤转移的发生率或负担、预防癌症复发、和/或改善癌症的临床效益。
在一些实施方案中，提供一种抑制个体中癌细胞增殖(诸如肿瘤生长)的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载DC。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)的细胞增殖。
在一些实施方案中，提供一种抑制个体中肿瘤转移的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载DC。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)的转移。在一些实施方案中，提供抑制转移至淋巴结的方法。
在一些实施方案中，提供一种减小个体中肿瘤大小的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载DC。在一些实施方案中，肿瘤大小减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)。
在一些实施方案中，提供一种延长个体中癌症无进展存活的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载DC。在一些实施方案中，该方法将至疾病进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周中任一者。
在一些实施方案中，提供一种延长患有癌症的个体的存活的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载DC。在一些实施方案中，该方法将至疾病进展的时间延长至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周中任一者。在一些实施方案中，该方法延长个体存活至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、或24个月中任一者。
在一些实施方案中，提供一种在患有癌症的个体中减少不良效应(adverseeffect,AE)和严重不良效应(severe adverse effect,SAE)的方法，其包括向该个体施用有效量的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)，该经工程改造的免疫细胞表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的抗原负载DC。
在一些实施方案中，该方法可预测和/或导致客观反应(诸如部分反应或完全反应)。在一些实施方案中，该方法可预测和/或导致生活质量改善。
除了通常与其他癌症疗法相关联的常见不良事件之外，一些癌症免疫疗法与免疫相关不良事件(immune-related adverse event,irAE)相关联。irAE通常与命中目标(on-target)T细胞毒性或偏离目标(off-target)效应呈机械式相关，该命中目标T细胞毒性对抗表达于正常非肿瘤组织中的目标抗原，即所谓的命中目标偏离肿瘤(on-target off-tumor)效应，该偏离目标效应诸如自身耐受性破坏或表位交叉反应。irAE可导致在下列的严重症状和病况：皮肤、胃肠、内分泌、肝、眼、神经、以及其他组织或器官。所属技术领域中已知的针对癌症免疫治疗方法所报导的一般irAE包括：致命免疫媒介的皮肤炎、肺炎、结肠炎、淋巴球性垂体炎、胰脏炎、淋巴腺病、内分泌病症、CNS毒性、以及类似者。在一些实施方案中，治疗方法与不良事件(诸如irAE)的低发生率相关联。在一些实施方案中，少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％中任一者的个体经历irAE，诸如第2至5级irAE。
大致上，可根据个体的大小和状况，并根据标准医药实务，确定表达本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者的经工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)的剂量、时程、以及施用途径。示例性施用途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、膀胱内(intravesicular)、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内(intrathecal)、或经皮。在一些实施方案中，表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)经静脉内施用。
施用至个体的细胞剂量可根据下列而变化：例如所施用的细胞的具体类型、施用途径、以及所治疗的癌症的具体类型和阶段。该量应足以产生所期望反应，诸如对癌症的治疗反应，但没有严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，待施用的表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞(诸如T细胞)的量是治疗有效量。在一些实施方案中，细胞的量是足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数目、或降低肿瘤生长速率的量，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应肿瘤大小、癌细胞数目、或肿瘤生长速率，或相较于未接受治疗的其他个体的对应活性。可使用标准方法来测量此效应的量值，诸如采用纯化酶的体外测定法、基于细胞的测定法、动物模型、或人体试验。
在一些实施方案中，稳定剂或赋形剂(诸如人类白蛋白)是与表达(多种)肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞一起使用。
治疗方法可包括单一治疗或重复治疗。在一些实施方案中，施用表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10次中任一者。在一些实施方案中，施用表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞至少3次。在一些实施方案中，治疗方法每周重复一次、2周重复一次、3周重复一次、4周重复一次、每月重复一次、每2个月重复一次、每3个月重复一次、每4个月重复一次、每5个月重复一次、每6个月重复一次、每7个月重复一次、每8个月重复一次、每9个月重复一次、或每年重复一次。
本文提供的治疗方法可用于作为第一疗法、第二疗法、第三疗法、或与所属技术领域中已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，诸如化疗、手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶标治疗、冷疗、超音波疗法、光动力疗法、射频烧灼、或类似者，其用于辅助性疗法或新辅助性疗法中。在一些实施方案中，该治疗方法用于作为第一疗法。在一些实施方案中，不存在其他批准的用于个体的抗癌疗法。在一些实施方案中，该治疗方法用于作为第二疗法，其中该个体先前已接受切除、射频烧灼、化疗、辐射疗法、或其他类型的癌症疗法。在一些实施方案中，个体已发生进展或已无法耐受标准抗癌疗法。在一些实施方案中，个体在接受本文所述治疗方法之前、同时、或之后，接受其他类型的癌症疗法。例如，本文所述的治疗方法可以范围自数分钟、数天、数周至数个月之间隔，于其他癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)之前或之后进行。在一些实施方案中，第一疗法与第二疗法之间之间隔使得表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞(例如，T细胞)和其他癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)能够对个体发挥有利组合效应。此外，具有较大发展增殖性疾病的风险的人可接受治疗，以抑制和/或延迟疾病发展。
V.组合物、试剂盒以及制品
本专利申请进一步提供试剂盒、组合物(诸如药物组合物)、以及制品，其用于本文所述的获得多种特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法和治疗方法的任何实施方案中。
在一些实施方案中，提供一种用于癌症免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽。所属领域技术人员可使用来自第一核心组的肿瘤抗原肽的任何组合、以及可选地来自第二组的癌症类型特异性抗原肽的任何组合、和/或新抗原肽以负载DC群，其可进一步用于制备用于MASCT的活化T细胞、肿瘤抗原特异性T细胞、或分离肿瘤特异性TCR，以治疗个体中癌症。
在一些实施方案中，提供一种试剂盒，其包括本文所述的肿瘤特异性TCR中任一者、或编码其肿瘤特异性TCR的(多种)核酸或载体。在一些实施方案中，提供一种试剂盒，其包括：肿瘤特异性TCR的库，此类肿瘤特异性TCR是使用本文所述方法中任一者获得，其中T细胞或PBMC是来自多个已在临床上受益于MASCT的个体；核酸，其编码其肿瘤特异性TCR；或载体，其编码其肿瘤特异性TCR。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR特异性识别一种或多种选自下列的肿瘤抗原：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、以及AFP。在一些实施方案中，肿瘤特异性TCR具有某些种族群体中主要的HLA单倍型限制。
试剂盒可含有附加组分，诸如容器、试剂、培养基、细胞因子、免疫检查点抑制剂、TLR激动剂、缓冲液、抗体、以及类似者，以促进执行本文所述的治疗方法或细胞制备方法的任何实施方案。例如，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括周边血液收集和储存设备，其可用于收集个体的周边血液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括容器和试剂，其用于周边血液的密度梯度离心，其可用于自人类周边血液样本分离PBMC。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括培养基、细胞因子、或缓冲液，其用于自周边血液获得DC。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括培养基、TLR激动剂(例如，MPLA)、IFNγ、PGE2、试剂、以及缓冲液，其用于使多种肿瘤抗原肽负载至DC中。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21)、免疫检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)、抗CD3抗体(例如，OKT-3)、缓冲液、或培养基，其用于将T细胞、经富集的活化T细胞、或肿瘤抗原特异性T细胞与抗原负载APC(例如，DC)共培养。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括细胞系APC，诸如LCL细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括抗体、磁珠、以及管柱，其用于富集表达细胞因子(例如，IFNγ)的活化T细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括容器、缓冲液、以及试剂，其用于冷冻并储存PBMC或T细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括试剂，其用于确定癌细胞中的突变负荷(诸如在一个或多个MHC基因中)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括免疫检查点抑制剂，其用于与治疗方法的组合疗法。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括试剂，其用于识别肿瘤样本中的新抗原(诸如通过测序)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括ELISPOT测定，其用于评估对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括引子和试剂，其用于扩增TCR基因、和/或TCR基因的下一代测序。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括免疫细胞、培养基、以及试剂，其用于制备表达(多种)肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞。
本专利申请的试剂盒在合适包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，聚酯树脂(Mylar)或塑料袋)、以及类似者。试剂盒可选地提供附加组分，诸如缓冲液和解释性信息。因此，本专利申请还提供制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、软质包装、以及类似者。
说明书也可包括与使用肿瘤抗原肽(和上述可选地附加组分)有关的说明。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括说明手册，诸如描述下列的规程的手册：如本文所述的治疗方法的实施方案、或细胞制备方法的实施方案。说明书也可包括有关剂量、给药时程、以及施用途径的信息，其涉及使用试剂盒制备的DC、活化T细胞、或表达(多种)肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞，以用于预期治疗。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于针对治疗方法选择个体的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于施用与治疗方法组合的免疫检查点抑制剂的说明书，其包括例如有关免疫检查点抑制剂的剂量、给药时程、以及施用途径的信息。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于识别肿瘤样本中的新抗原(诸如通过测序)的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于在接受治疗后监测个体的说明书。
容器可为单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)、或次单位剂量。例如，可提供含有足够肿瘤抗原肽(如本文所公开)的试剂盒，以制备足够的肿瘤抗原特异性T细胞、抗原负载APC(诸如DC)、和/或表达(多种)肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞，以在延长时段内提供个体有效治疗，该延长时段诸如3周、6周、9周、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、1年、或更长中任一者。
试剂盒也可包括多单位剂量的肿瘤抗原肽或肿瘤特异性TCR(或编码肿瘤特异性TCR的核酸)、以及使用说明书，且以足以储存于和使用于药房(例如，医院药房、以及调制药房)的数量进行包装。
进一步提供的是本文所述的分离细胞群(诸如DC、活化T细胞、或表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞)中任一者的试剂盒、组合物(诸如药物组合物)、以及制品。
本文所述的分离细胞群(诸如DC、活化T细胞、或表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞)可用于药物组合物或制剂中，其通过组合所述分离细胞群与药学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、和/或其他药剂(其是所属技术领域中已知者)，以用于本文所述的治疗方法、施用方法、以及剂量方案。在一些实施方案中，人类白蛋白用于作为药学上可接受的载体。
合适的医药载体包括无菌水；盐水、右旋糖；于水或盐水中的右旋糖；蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物(每摩尔蓖麻油组合约30至约35摩尔环氧乙烷)；液体酸；低级烷醇；油，诸如玉米油；花生油、芝麻油、以及类似者，与乳化剂，诸如脂肪酸的单或二甘油酯、或磷脂质(例如，卵磷脂)、以及类似者；二醇；聚烯烃二醇；在悬浮剂存在下的水性介质，例如羧甲基纤维素钠；藻酸钠；聚(乙烯基吡咯烷酮)；以及类似者，其是单独使用、或与合适的分配剂(诸如卵磷脂)；聚氧乙烯硬脂酸酯；以及类似者。载体也可含有佐剂(诸如保持稳定剂、润湿剂、乳化剂、以及类似者)与渗透增强剂。最终形式可为无菌，且也可能够易于通过注射装置(诸如空心针)。可通过适当选择溶剂或赋形剂，达到并维持适当黏度。
本文所述的药物组合物可包括其他试剂、赋形剂、或稳定剂，以改善组合物的性质。合适的赋形剂和稀释剂的示例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、浆料、甲基纤维素、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、以及矿物油。在一些实施方案中，将药物组合物配制成其pH在约4.5至约9.0的范围内，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中任一者的pH范围。在一些实施方案中，也可通过添加合适的张力调节剂(诸如甘油)，使药物组合物与血液等渗。
在一些实施方案中，分离细胞组合物(诸如DC、活化T细胞、或表达肿瘤特异性TCR的经工程改造的免疫细胞)适用于向人类施用。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)适用于通过肠胃外施用向人类施用。适用于肠胃外施用的制剂包括：水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、以及使制剂与预期受体的血液相容的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、以及保存剂。制剂可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)呈现，并可储存在仅需要紧接在使用前添加无菌液体赋形剂(即，水)以用于注射的条件下，该无菌液体赋形剂用于本文所述的治疗方法、施用方法、以及剂量方案。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是含在单次使用小瓶中，诸如单次使用密封小瓶。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是含在多次使用小瓶中。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是以批量含在容器中。
还提供的是单位剂型，其包括本文所述的分离细胞组合物(诸如药物组合物)和制剂。这些单位剂型可以单一或多单位剂量储存于合适包装中，且也可经进一步灭菌和密封。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)还包括一种或多种有用于治疗癌症的其他化合物(或其药学上可接受的盐)。
本专利申请进一步提供试剂盒，其包括本文所述的分离细胞群、组合物(诸如药物组合物)、制剂、单位剂量、以及制品中任一者，以用于本文所述的治疗方法、施用方法、以及剂量方案。
VI.示例性实施方案
在本文所提供的实施方案中的是：
1.一种获得特异性地识别目标肿瘤抗原肽的多种T细胞受体(TCR)的方法，其包括：
a)第一共培养步骤，其包括将载有该目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(DC)群与来自个体的T细胞群共培养，以获得第一共培养物；
b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化T细胞；
c)第二共培养步骤，其包括将此类经富集的活化T细胞与载有该目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％的此类肿瘤抗原特异性T细胞对该目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及
d)测序步骤，其包括使此类肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序，以识别多对编码TCRα和TCRβ的基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供该多种T细胞受体；
其中该个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，该MASCT包括向该个体施用有效量的活化T细胞，此类活化T细胞是通过将T细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。
2.根据实施方案1所述的方法，其中该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行约1至约3天。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中该T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群之间的比率不大于约30:1。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中在该第一共培养步骤中的该T细胞群存在于PBMC中。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中载有该目标肿瘤抗原肽的该第一DC群与该T细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂。
6.根据实施方案5所述的方法，其中该第一共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。
7.根据实施方案5所述的方法，其中该第一共培养基包含IL-2和抗PD-1抗体。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中该富集步骤包括：
使该第一共培养物与载有该目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群，该配体特异性识别细胞因子。
9.根据实施方案8所述的方法，其中该细胞因子为IFNγ。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中将该经富集的活化T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群共培养约12至25天。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有该目标肿瘤抗原肽的该第二DC群与该经富集的活化T细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，IL-2或多种细胞因子)；以及将抗CD3抗体添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。
13.根据实施方案12所述的方法，其中在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，2天)，将该抗CD3抗体添加至该第二共培养物。
14.根据实施方案12或13所述的方法，其中该抗CD3抗体为OKT3。
15.根据实施方案12至14中任一项所述的方法，其中该初始第二共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及IL-21、以及抗PD-1抗体。
16.根据实施方案12至14中任一项所述的方法，其中该第二共培养步骤包括将一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。
17.根据实施方案16所述的方法，其中该一种或多种细胞因子包括IL-2。
18.根据实施方案16或17所述的方法，其中在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。
19.根据实施方案12至18中任一项所述的方法，其中该初始第二共培养基包含IL-2和抗PD-1抗体。
20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中使该第二肿瘤抗原特异性T细胞群在该测序步骤中经受下一代测序。
21.根据实施方案20所述的方法，其中此类APC为PBMC、DC、或细胞系APC。
22.根据实施方案20或21所述的方法，其中该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群之间的比率为约1:1至约20:1。
23.根据实施方案20至22中任一项所述的方法，其中将该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群共培养约5至9天。
24.根据实施方案20至23中任一项所述的方法，其中该肿瘤抗原特异性T细胞群与载有该目标肿瘤抗原肽的APC群在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和抗CD3抗体。
25.根据实施方案24所述的方法，其中该第三共培养基包含IL-2和OKT3。
26.根据实施方案24所述的方法，其中该第三共培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、以及OKT3。
27.根据实施方案20至26中任一项所述的方法，重复该第三共培养步骤。
28.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中该目标肿瘤抗原肽是衍生自选自下列的肿瘤抗原：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、以及AFP。
29.根据实施方案1至28所述的方法，其进一步包括：识别来自该目标肿瘤抗原肽的目标肿瘤表位，其中该目标肿瘤表位引发该经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与该目标肿瘤表位接触，以获得载有该目标肿瘤抗原肽的APC群。
30.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中该下一代测序为单细胞测序。
31.根据实施方案1至30中任一项所述的方法，其中在接受该MASCT后，该个体具有部分反应(PR)、完全反应(CR)、或疾病稳定(SD)；和/或其中该个体具有(多种)肿瘤抗原特异性免疫反应。
32.根据实施方案1至31中任一项所述的方法，其中该MASCT包括：将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以获得活化T细胞群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽。
33.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，其中该MASCT包括：
(i)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养，以提供共培养物，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)以及免疫检查点抑制剂；以及
(i)在该共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化T细胞群。
34.根据实施方案1至33中任一项所述的方法，其中该MASCT包括：
(i)使DC群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的DC群，该多种肿瘤抗原肽包括该目标肿瘤抗原肽；
以及
(i)在DC成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该DC群，该DC成熟培养基包含MPLA。
35.根据实施方案34所述的方法，其中该DC成熟培养基包含INFγ、MPLA、以及PGE2。
36.根据实施方案1至35中任一项所述的方法，其中该MASCT包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的此类DC。
37.根据实施方案1至36中任一项所述的方法，其中该个体先前已接受该MASCT至少三次。
38.根据实施方案1至37中任一项所述的方法，其中在该下一代测序之前，将此类肿瘤抗原特异性T细胞用载有该目标肿瘤抗原肽的APC刺激。
39.根据实施方案1至38中任一项所述的方法，其中同时获得特异性识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR。
40.根据实施方案1至39中任一项所述的方法，其进一步包括：在宿主免疫细胞中表达各对编码TCRα和TCRβ的基因，以提供表达TCR的经工程改造的免疫细胞；以及评估该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的反应。
41.一种获得特异性识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，其包括根据实施方案40所述的方法，其中基于表达该TCR的该经工程改造的免疫细胞对该目标肿瘤抗原肽的该反应来选择该TCR。
42.根据实施方案41所述的方法，其进一步包括确定该TCR的HLA限制。
43.根据实施方案42所述的方法，其中该TCR具有亚洲人中主要的HLA单倍型限制。
44.根据实施方案41至43中任一项所述的方法，其进一步包括该TCR的亲和力成熟。
45.根据实施方案41至44中任一项所述的方法，其进一步包括增强该TCR中该TCRα链和该TCRβ链的配对。
46.根据实施方案41至45中任一项所述的方法，其进一步包括增强该TCR的该表达。
47.根据实施方案41至46中任一项所述的方法，其中该目标肿瘤抗原肽衍生自CEA、RSG-5、或HPV18-E7。
48.一种肿瘤特异性TCR，其是使用根据实施方案1至47中任一项所述的方法获得。
49.一种肿瘤特异性TCR，其包括：
(a)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:4、10、以及16的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ IDNO:7、13、以及19的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:22、28、34、40、46、以及52的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:7、13、19、25、31、37、43、49、以及55的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)包括互补决定区(CDR)3的TCRα链，该CDR3与SEQ ID NO:58、64、70、76、87、以及93的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括与SEQ ID NO:61、67、73、79、90、以及96的氨基酸序列中任一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
50.根据实施方案49所述的肿瘤特异性TCR，其包括：
(a)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(b)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(d)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(e)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(f)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(g)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(h)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
(i)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(j)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列；
(k)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
(l)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列；
(m)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列；
(n)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或
(o)包括CDR3的TCRα链，该CDR3包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列；以及包括CDR3的TCRβ链，该CDR3包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
51.一种肿瘤特异性TCR，其包括：
(a)TCRα链，其包括SEQ ID NO:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者的CDR；
(b)TCRα链，其包括SEQ ID NO:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者的CDR；或
(c)TCRα链，其包括SEQ ID NO:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者的CDR；和TCRβ链，其包括SEQ ID NO:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者的CDR。
52.根据实施方案49至51中任一项所述的肿瘤特异性TCR，其包括：
(a)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:5、11、以及17的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:8、14、以及20的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；
(b)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:23、29、35、41、47、以及53的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:26、32、38、44、50、以及56的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；或
(c)TCRα链，其包括与SEQ ID NO:59、65、71、77、88、以及94的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列；和TCRβ链，其包括与SEQ ID NO:62、68、74、80、91、以及97的氨基酸序列中任一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列。
53.一种特异性结合至MHC/RGS5表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:254的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ IDNO:255的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:256的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:257的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
54.根据权利要求53所述的肿瘤特异性TCR，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
55.根据权利要求53或54所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC是HLA-DPA1*02:02/DPB1*05:01。
56.一种特异性结合至MHC/RGS5表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:258的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ IDNO:259的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:260的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:261的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
57.根据权利要求56所述的肿瘤特异性TCR，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
58.根据权利要求56或57所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC是HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。
59.一种特异性结合至MHC/RGS5表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:262的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ IDNO:263的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:264的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:265的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
60.根据权利要求59所述的肿瘤特异性TCR，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
61.根据权利要求59或60所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。
62.一种特异性结合至MHC/RGS5表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:266的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ IDNO:267的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:268的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:269的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
63.根据权利要求62所述的肿瘤特异性TCR，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
64.根据权利要求62或63所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。
65.一种特异性结合至MHC/RGS5表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:270的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ IDNO:271的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:272的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:273的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
66.根据权利要求65所述的肿瘤特异性TCR，其中该RGS5表位包括SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
67.根据权利要求65或66所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DPA1*02:02/DPB1*05:01。
68.一种特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:274的氨基酸序列，该CDR2包括SEQID NO:275的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:276的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:277的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
69.根据权利要求68所述的肿瘤特异性TCR，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
70.根据权利要求68或69所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DRA/DRB1*09:01。
71.一种特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:278的氨基酸序列，该CDR2包括SEQID NO:279的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:280的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:281的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
72.根据权利要求71所述的肿瘤特异性TCR，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
73.根据权利要求71或72所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DRA/DRB1*09:01或HLA-DRA/DRB4*01:03。
74.一种特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:282的氨基酸序列，该CDR2包括SEQID NO:283的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:284的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:285的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
75.根据权利要求74所述的肿瘤特异性TCR，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
76.根据权利要求74或75所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-II。
77.一种特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:286的氨基酸序列，该CDR2包括SEQID NO:287的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:87的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:288的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:289的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列。
78.根据权利要求77所述的肿瘤特异性TCR，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
79.根据权利要求77或78所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DRA/DRB1*09:01。
80.一种特异性结合至MHC/HPV18-E7表位复合物的肿瘤特异性TCR，其包括：包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRα链，该CDR1包括SEQ ID NO:290的氨基酸序列，该CDR2包括SEQID NO:291的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3的TCRβ链，该CDR1包括SEQ ID NO:292的氨基酸序列，该CDR2包括SEQ ID NO:293的氨基酸序列，该CDR3包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
81.根据权利要求80所述的肿瘤特异性TCR，其中该HPV18-E7表位包括SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
82.根据权利要求80或81所述的肿瘤特异性TCR，其中该MHC为HLA-DPA1*02:02/DPB1*05:01、HLA-DPA1*01:03/DPB1*02:01、或HLA-DPA1*01:03/DPB1*05:01
83.根据实施方案49至51和53至82中任一项所述的肿瘤特异性TCR，其中该TCR为人类TCR。
84.根据实施方案49至51和53至82中任一项所述的肿瘤特异性TCR，其中该TCR为嵌合TCR，诸如鼠源化TCR，例如包括TCRα链和β链的鼠类恒定区的TCR。
85.根据实施方案49至51和53至82中任一项所述的肿瘤特异性TCR，其中该TCR包括鼠类TCR恒定区。
86.一种分离核酸，其编码根据实施方案48至85中任一项所述的肿瘤特异性TCR的TCRα链和/或TCRβ链。
87.一种载体，其包括根据实施方案86所述的分离核酸。
88.一种经工程改造的免疫细胞，其包括根据实施方案48至85中任一项所述的肿瘤特异性TCR、根据实施方案86所述的分离核酸、或根据实施方案87所述的载体。
89.根据实施方案88所述的经工程改造的免疫细胞，其中该免疫细胞为T细胞。
90.一种药物组合物，其包括根据实施方案88或89所述的经工程改造的免疫细胞和药学上可接受的载体。
91.一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的根据实施方案90所述的药物组合物。
92.一种肿瘤特异性TCR的库，此类肿瘤特异性TCR是使用根据实施方案1至47中任一项所述的方法获得。
93.一种RGS-5的表位，其包括SEQ ID NO:82或83的氨基酸序列。
94.一种HPV18-E7的表位，其包括SEQ ID NO:84、85、或86的氨基酸序列。
95.一种MHC/表位复合物，其包括根据实施方案93或94所述的表位和MHC分子。
实施例
以下实施例旨在纯粹为本专利申请的示例，因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明是以说明方式而非限制方式提供。
实施例1：经MASCT治疗的患者对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应
患者WJ，女性，于41岁时经诊断出患有子宫颈癌并有血管侵犯，且人类乳突病毒(HPV)DNA测试结果呈阳性。她经历了根除性切除，以及五个月的放化疗。患者接受了第二次HPV DNA测试，且经确认血清HPV DNA呈阴性。将此患者的临床病史和反应汇总于图2中。
在根除性切除和放化疗后约两年，根据磁共振造影(MRI)和发射计算机断层扫描(ECT)，该患者经诊断出右骶髂关节骨上有转移肿瘤。然后，患者接受十次局部放射疗法治疗，随后进行三次MASCT治疗(每个月施用一次)。该MASCT治疗使用来自患者自身周边血液的PBMC，以制备经18种抗原肽的池脉冲的树突细胞，此类抗原肽包括核心组的12种肿瘤相关抗原肽、以及子宫颈癌特异性组的6种衍生自HPV的病毒蛋白的抗原肽。简而言之，将来自患者PBMC的单核球分化为未成熟DC，然后用多种合成肽抗原脉冲，此类合成肽抗原包括肿瘤相关抗原和HPV抗原。利用TLR配体进一步刺激未成熟DC以分化为成熟DC(mDC)。一半的mDC经皮下注射至患者。通过用抗CD3抗体(例如，OKT3)和IL2来培养非粘附PBMC，制备维持T细胞。将另一半的mDC在输注前与维持T细胞再共培养7至9天。该患者经确认具有HLA-A2血清型(HLA-A0201+)。
在四次MASCT治疗后，患者的ECT结果显示右骶髂关节骨转移减少，且未检测出新的转移，其指示MASCT的正向治疗成果。患者接受四次附加的MASCT治疗，以约1个月或2个月之间隔进行施用。在总共8次MASCT治疗之后，获得患者PBMC样本，并以ELISPOT测定对该样本进行测试，以确定患者是否具有对抗原肽池和该池内抗原肽的各自的治疗有效MHC限制性T细胞反应。ELISPOT结果展示对下列的增强T细胞反应：子宫颈癌抗原肽池；以及个别抗原肽，其是在核心组肿瘤特异性抗原肽(诸如hTERT、p53、CEA、以及RGS5)和子宫颈癌特异性组肿瘤抗原肽(诸如HPV-3和HPV-5)两者内。患者在总共8次MASCT后的ECT显示，右骶髂关节骨转移进一步减少，且无新转移部位，其指示MASCT治疗方案成功减少患者的肿瘤负担并预防肿瘤进展和进一步转移。
基于患者的特异性免疫反应，通过保存已诱导特异性反应的反应性肽，并移除未诱导特异性反应的非反应性肽，来定制抗原肽池以提供患者特异性抗原肽池。该患者进一步经四个周期的MASCT治疗，该MASCT是使用患者特异性抗原肽池制备(在本文中称为“精确MASCT”)。在四次精确MASCT之后，患者的ECT显示没有右骶髂关节骨转移的发展，且无新转移部位。
基于患者的特异性免疫反应，进一步调整抗原肽池，且患者经四个周期的第2次精确MASCT(使用经进一步调整的肽抗原池)治疗。在第二次四个周期的精确MASCT之后，患者经评估为具有疾病稳定(SD)。如ELISPOT测定所展示，患者特异性抗原肽池引发增强的特异性反应(图3A)。具体而言，HPV18-E7肽、CEA肽、以及RGS5肽一致产生最强烈的特异性反应(图3B)。
肿瘤特异性TCR经工程改造的T细胞的过继转移已对实体肿瘤显示很大的疗效。此患者的临床效益指示，肿瘤特异性T细胞在体内扩增，并对控制肿瘤进展扮演重要角色。这些T细胞是分离肿瘤特异性TCR的良好来源。
实施例2：来自肿瘤抗原特异性T细胞的成对肿瘤抗原肽特异性TCRα和TCRβ基因的
识别
获得来自实施例1患者的PBMC样本，并将其用于作为起始材料以制备此实施例中的肿瘤抗原特异性T细胞。通过对肿瘤抗原特异性T细胞样本进行下一代测序，识别十二对肿瘤抗原特异性TCRα和TCRβ基因(3对为CEA特异性TCR，3对为RGS5特异性TCR，且6对为HPV18-E7特异性TCR)。
方法2
细胞制备
图4提供示例性“方法2”的规程概述。简而言之，在第1天，通过以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(PBMC)。继续将粘附单核球培养于AIM-V培养基中以分化为未成熟树突细胞(DC)，该AIM-V培养基具有1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4。将所得未成熟DC以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自CEA、RGS5、以及HPV18-E7(1μg/mL/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于DC成熟培养基中以分化为成熟DC。在第8天，以约15:1的T细胞与成熟抗原负载DC之间的比率，将含有T细胞的PBMC与抗原负载成熟DC共培养，且共培养基含有细胞因子混合物和抗PD-1抗体。在第11天，利用经肽池脉冲的PBMC来刺激共培养物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以分离IFNγ+T细胞群。在第12天，在含有细胞因子混合物、抗PD-1抗体、以及抗CD3抗体的培养基中，以约2:1的T细胞与抗原负载成熟DC之间的比率，将IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养(自第12天至第25至35天)，以获得肿瘤抗原特异性T细胞。
增殖测定
使用来自第1天(PBMC)、第8天(共培养开始)、第11天(在IFNγ富集前和在IFNγ富集后)、以及第17、21、25、27、31、以及32天(IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。将各样本中的细胞数目计数。
如图5所示，抗原负载成熟DC与T细胞的初始共培养物产生少量IFNγ+T细胞(第11天)。在经富集的IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第31天为止，即该共培养物中的细胞总数在多于108而趋于稳定的时间点。
肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产
将各种共培养样本各自接种(T细胞：1×106个细胞/孔；PBMC：2.5×105个细胞/孔)于AIM-V培养基中，并用2μg/mL的肽池刺激4小时。利用细胞内细胞因子染色和FACS分析，检测各样本中的肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产水平。将与10μg/mL不相关肽培养的细胞样本用于作为阴性对照。
用于细胞表面(例如，抗人类CD3-FITC)或细胞内细胞因子(例如，抗人类IFNγ-APC)染色的抗体是获自BD Biosciences。利用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定并渗透细胞，来执行细胞内细胞因子染色。使用FACS CantoII(BD Biosciences)流动式细胞仪执行流动式细胞测量术，并利用Flowjo程序分析数据。
图6A至图6B显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性T细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的IFNγ+CD3+细胞而确定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性T细胞百分比达到83.5％。自第21天至第32天，共培养物含有约10％的回应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。在第25至32天的共培养物中，响应于不相关肽刺激而生产IFNγ的非特异性T细胞构成不到1％。
方法2的优化(“方法2m”)
细胞制备
图7提供示例性“方法2m”的规程概述。简而言之，在第1天，通过以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(PBMC)。继续将粘附单核球培养于AIM-V培养基中以分化为未成熟树突细胞(DC)，该AIM-V培养基具有1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4。将所得未成熟DC以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自CEA、RGS5、以及HPV18-E7(1μg/mL/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于DC成熟培养基中以分化为成熟DC。在第8天，以约20:1的T细胞与成熟抗原负载DC之间的比率，将含有T细胞的PBMC与抗原负载成熟DC共培养，且共培养基含有细胞因子混合物和抗PD-1抗体。在第11天，利用经肽池脉冲的PBMC来刺激共培养物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以分离IFNγ+T细胞群。同时，将抗原负载成熟DC培养于DC成熟培养基中。在第12天，以约1:1的T细胞与抗原负载成熟DC之间的比率，将IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养于培养基中，该培养基含有细胞因子混合物、以及抗PD-1抗体。在第13天或第14天，将抗CD3抗体(OKT3)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第30天，以获得肿瘤抗原特异性T细胞。
增殖测定
如上所述，使用来自第1天(PBMC)、第9天(共培养开始)、第12天(在IFNγ富集前)、第12天(在IFNγ富集后)、以及第22和30天(IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。
如图8所示，抗原负载成熟DC与T细胞的初始共培养物产生少量IFNγ+T细胞(第12天)。在经富集的IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第31天为止。在第14天添加抗CD3抗体的方法导致较高的细胞增殖水平。
肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产
如上所述，确定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产水平。图9A至图9B显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性T细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的IFNγ+CD3+细胞而确定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性T细胞百分比达到90.4％。自第22天至第30天，共培养物含有约6至10％的回应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。在第14天添加抗CD3抗体的方法产生较高百分比的IFNγ+CD3+细胞。通过评估IFNγ+TNFα+细胞，获得一致结果(图9C)。
肿瘤抗原肽池的子集的筛选
设计并合成三种初始肿瘤抗原肽CEA、RGS5、以及HPV18-E7的各自的五种片段。根据图13，制备初始肿瘤抗原肽及其片段的子池。利用肿瘤抗原肽子池的各自，刺激在第30天获得的肿瘤抗原特异性T细胞，并确定IFNγ+CD3+细胞的百分比。如图14A至图14B所示，池2和池8一致地产生最高百分比的IFNγ+CD3+细胞，其意味着RGS5-OLP5片段引发肿瘤抗原特异性T细胞的最强烈特异性反应。
肿瘤抗原特异性T细胞的下一代测序
获得使用方法2制备的四个肿瘤抗原特异性T细胞样本，并使其经受TCRα和TCRβ扩增连同下一代测序。四个样本是：(1)由CEA肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞；(2)由RGS5肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞；(3)由HPV18-E7肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞；以及(4)由经磁珠富集的CEA肽刺激的INFγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞。作为对照，还使来自相同患者的PBMC样本经受相同的下一代测序分析。
图10显示分别由CEA肽、RGS5肽、以及HPV18-E7肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞的流动式细胞测量术结果。各样本含有多于90％的肿瘤抗原特异性T细胞(CD8+和CD4+细胞的组合)。
图11显示在各种样本中独特的TCRα和TCRβ序列的克隆体型频率。相较于经不相关肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞，由特异性肿瘤抗原肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞的独特TCR克隆体型频率增加。由肿瘤抗原肽刺激的IFNγ分类肿瘤抗原特异性T细胞显示甚至更高频率的独特TCR克隆体型。
使在三个不同时间点(T1＝2016年6月，T2＝2016年9月，且T3＝2017年5月)自患者获得的冷冻PBMC样本经受相同的肿瘤抗原特异性T细胞制备和测序分析。图12显示自批量下一代测序结果识别的独特TCRα和TCRβ克隆体型频率。在衍生自两个或全部三个冷冻PBMC样本的对应肿瘤抗原特异性T细胞样本中，发现某些TCRα和TCRβ基因。
对肿瘤抗原特异性T细胞样本施加使用IPAIRTM技术(iRepertoire,Inc.)进行的单细胞TCRα和TCRβ扩增连同下一代测序，以获得TCRα和TCRβ基因的同源配对信息。识别并合成三对CEA特异性TCRα和TCRβ基因(克隆体1至3)、三对RGS5特异性TCRα和TCRβ基因(克隆体1至3)、以及六对HPV18-E7特异性TCRα和TCRβ基因(克隆体1至6)。示例性TCR克隆体的序列信息请参见表1。制备表达各对TCRα和TCRβ基因的经工程改造的T细胞，并通过使用ELISPOT测定评估经工程改造的T细胞的肿瘤抗原特异性免疫反应来验证此类TCR。
细胞因子混合物与IL-2以及抗原肽池与单一抗原肽的比较
细胞制备
图20提供比较下列的规程概述：添加细胞因子混合物与添加单独IL-2；以及经载有抗原肽池的DC刺激与经载有单一抗原肽的DC刺激。简而言之，在第1天，通过以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(PBMC)。继续将粘附单核球培养于AIM-V培养基中以分化为未成熟树突细胞(DC)，该AIM-V培养基具有1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4。将所得未成熟DC以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自CEA、RGS5、以及HPV18-E7(1μg/mL/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于DC成熟培养基中以分化为成熟DC。在第9天，以约15:1至约20:1的T细胞与成熟抗原负载DC之间的比率，将含有T细胞的PBMC与抗原负载成熟DC共培养，且共培养基含有细胞因子混合物或IL-2(不大于约200IU/mL)和抗PD-1抗体。在第11天，利用经肽池或各个个别肽脉冲的PBMC来刺激共培养物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment andDetection Kit(Miltenyi Biotec)，以分离IFNγ+T细胞群。同时，将抗原负载成熟DC培养于DC成熟培养基中。以约1:1至约3:1的T细胞与抗原负载成熟DC之间的比率，将IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养于培养基中，该培养基含有在第12天添加的细胞因子混合物或在第14天添加的单独IL-2(以至少约2000IU/mL)、以及抗PD-1抗体。在第14天，将抗CD3抗体(OKT3)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第29至30天，以获得肿瘤抗原特异性T细胞。
肿瘤抗原特异性T细胞的增殖测定和IFNγ生产
通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(PBMC)、第9天(共培养开始)、第12天(在IFNγ富集前)、第12天(在IFNγ富集后)、以及第19、24、以及29天(IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。
如图21A所示，抗原负载成熟DC与T细胞的初始共培养物产生少量IFNγ+T细胞(第12天)。在经富集的IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第29天为止。
通过实施例2所述的方法，确定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产水平。如图21B所示，在第9天将细胞因子混合物或仅IL-2添加至共培养物，并在第12天的富集步骤之后，获得类似百分比的IFNγ+T细胞。
下表3比较在第19天(测试1)和第29天(测试2)的细胞样本中的肿瘤特异性T细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池或个别抗原肽的刺激的IFNγ+CD3+细胞和IFNγ+TNFα+细胞而确定。在第9天添加细胞因子混合物或单独IL-2、以及与以肿瘤抗原池或单一肿瘤抗原脉冲的DC共培养的规程在T细胞增殖和肿瘤特异性T细胞百分比方面产生类似的结果。
表3：细胞样本中的肿瘤特异性T细胞的百分比。
a：刺激/测试条件
b：培养条件
图22A至图22B比较使用在第9天和第12天添加IL-2或细胞因子混合物的规程的各种共培养样本中的T细胞数目和肿瘤抗原特异性T细胞百分比。在第9天添加IL-2、与在第12天以肿瘤抗原肽池脉冲的DC共培养、以及在第14天添加IL-2的规程在第19和29天产生最高的肿瘤抗原特异性T细胞百分比。
实施例3：来自肿瘤抗原特异性T细胞的成对RGS5特异性TCRα和TCRβ基因的识别
使用方法2和方法2m制备的肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液用于此实施例中，以制备具有提高百分比(例如，至多50％)的RGS5特异性T细胞的肿瘤抗原特异性T细胞群。通过对肿瘤抗原特异性T细胞样本的单细胞测序，识别三对RGS5特异性TCRα和TCRβ基因。
细胞制备
图15A至图15B提供此实施例中所使用的规程的概述。简而言之，将含有下列的共培养物样本冷冻，以提供肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液：使用实施例2所述的方法2在第32天的肿瘤抗原特异性T细胞、或方法2m在第30天的肿瘤抗原特异性T细胞。在此实验的第1天，将肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液样本解冻，并将其与载有RGS5-OLP5(1μg/mL)的LCL细胞(APC细胞系)在具有或不具有喂养细胞下共培养于共培养基中直到第9天为止，该共培养基包含细胞因子(IL-2、IL-7、IL-15)的混合物、抗CD3抗体(OKT-3)、以及RGS5-OLP5。肿瘤抗原特异性T细胞与抗原负载LCL细胞之间的比率为约4:1。肿瘤抗原特异性T细胞、喂养细胞、以及抗原负载LCL细胞之间的比率为约4:4:1。在第9天和第16天，通过将肿瘤抗原特异性T细胞与抗原负载LCL细胞，在喂养细胞存在或不存在下共培养，以重复周期。
PBMC和树突细胞可用于代替LCL细胞，以提供抗原负载APC。APC可载有单一肿瘤抗原肽、单一肿瘤抗原肽的表位片段、肿瘤抗原肽池、或肿瘤抗原肽的表位片段池。
增殖测定
通过实施例2所述的方法，使用来自第1、9、16、以及23天的共培养物的细胞样本来评估细胞增殖。
如图16所示，当将经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性T细胞群与抗原负载LCL细胞在具有或不具有喂养细胞下共培养时，细胞持续增殖直到第16天为止。总细胞数在第23天减少。
肿瘤抗原特异性T细胞的细胞因子生产
通过实施例2所述的方法，确定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产水平。
图17A显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性T细胞百分比，如通过评估响应于RGS5-OLP5肽的刺激的IFNγ+CD3+细胞而确定。在第16天，自使用方法2m的肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液衍生的共培养物含有约38.6％的响应于RGS5-OLP5肽的刺激而生产IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。值得注意的是，在第23天，自使用方法2m的肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液衍生的共培养物含有约53.8％的响应于RGS5-OLP5肽的刺激而生产IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。自使用方法2的肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液衍生的共培养物产生较低百分比的回应于第16天和第23天RGS5-OLP5肽的刺激而生产IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。通过评估IFNγ+TNFα+细胞，获得一致结果(图17B)。这些结果意味着，利用载有肿瘤抗原肽的APC重复刺激肿瘤抗原特异性T细胞，可提高对肿瘤抗原肽有特异性反应的T细胞百分比。
肿瘤抗原特异性T细胞的下一代测序
制备自使用方法2m制备的肿瘤抗原特异性T细胞的冷冻储备液衍生的三个肿瘤抗原特异性T细胞样本，并使其经受使用IPAIRTM技术(iRepertoire,Inc.)的批量和单细胞TCRα和TCRβ扩增连同下一代测序。三个样本是：(1)由不相关肽刺激的肿瘤抗原特异性T细胞；(2)由RGS5-OLP5刺激的肿瘤抗原特异性T细胞；以及(3)由经磁珠富集的RGS5-OLP5刺激的INFγ+CD3+肿瘤抗原特异性T细胞。作为对照，还使来自相同患者的PBMC样本经受相同的下一代测序分析。
图18A和图18B显示在各种样本中独特的TCRα和TCRβ序列的克隆体型频率。相较于对照T细胞(即，由不相关肽刺激的PBMC和肿瘤抗原特异性T细胞)，由RGS5-OLP5刺激的肿瘤抗原特异性T细胞和由RG5-OLP5刺激的INFγ分类肿瘤抗原特异性T细胞具有高出许多的独特TCRα和TCRβ序列的克隆体型频率。
值得注意的是，使用IPAIRTMAnalyzer软件，在96个单细胞TCRα和TCRβ测序样本中，有69个达到同源TCRα和TCRβ配对(图19)。自图19中所示的96孔盘，识别一对RGS5特异性TCRα和TCRβ基因(克隆体4)。识别并合成来自最主要克隆体型的三对RGS5特异性TCRα和TCRβ基因(克隆体4至6)。示例性TCR克隆体的详细信息请参见表1。制备表达各对RGS5特异性TCRα和TCRβ基因的经工程改造的T细胞，并通过评估经工程改造的T细胞的RGS5特异性免疫反应来验证此类TCR。
实施例4：RGS5和HPV18 E7特异性TCR的验证
使用图23所示的测定，验证自实施例2和3识别的肿瘤抗原特异性TCR。验证五种RGS5特异性TCR和五种HPV18-E7特异性TCR。
制备对应于其的人类(即，野生型)TCR构建体和鼠源化TCR构建体(图24)。鼠源化TCR构建体具有鼠类恒定域(mCα和mCβ1)。发现3种具有N端19氨基酸前导序列(SEQ ID NO:101)的TCR变体，并制备其鼠源化版本。图25A至图25B显示经制备和验证的26种TCR构建体。发现多种识别相同表位的TCR，此类表位诸如RGS5的氨基酸16-30、以及HPV18-E7的氨基酸84-102。针对TCR构建体的验证测定结果显示于图26A至图35G中。
TCR表达测定
使用检测染色TCR Vβ链的FACS测定，评估TCR表达。简而言之，收集TCR转移T细胞并通过添加10mL PBS(含有2％胎牛血清)来洗涤，以350g离心5分钟，且将上清液完全吸出。通过添加PBS(含有2％胎牛血清)，将细胞团块再悬浮并调整至约2×106个细胞/mL。收集100μL/样本细胞悬浮液，并将其用于TCR Vβ链表面染色且由FACS进行检测。
LCL刺激测定
LCL刺激测定如下进行。首先，使LCL载有肽：将LCL收集于15mL试管中，通过添加10mL PBS来洗涤，以350g离心5分钟，且将上清液完全吸出。将细胞团块再悬浮于培养基(含有10％FBS的RPMI1640)中，并调整至1×106个细胞/mL。将肿瘤抗原肽添加于LCL至最终浓度5μg/mL，并在培养箱中培养8至24小时。然后，用肽负载LCL刺激TCR-T细胞如下：收集肽负载LCL并通过添加10mL PBS来洗涤，以350g离心5分钟，且将上清液完全吸出。通过添加AIM-V培养基(含有10％胎牛血清)，将LCL再悬浮并调整至1×106个细胞/mL或1×105个细胞/mL。收集TCR转导T细胞并通过添加10mL PBS来洗涤，以350g离心5分钟，且将上清液完全吸出。然后，通过添加AIM-V培养基(含有10％胎牛血清)，将TCR转导T细胞再悬浮，并调整至2×106个细胞/mL或5×105个细胞/mL。将100μL/孔的LCL(1×106个细胞/mL)和100μL/孔的TCR转导T细胞(2×106个细胞/mL)混合至96孔盘中。将布雷非德菌素A(brefeldin A)(最终浓度3μg/mL)添加至孔中，并培养4小时。4小时后，收集细胞，并将其用于细胞内IFN-γ和TNF-α染色且由FACS进行检测。针对IFN-γ的ELISA检测，将100μL/孔的LCL(1×105个细胞/mL)和100μL/孔的TCR转导T细胞(5×105个细胞/mL)混合至96孔盘中，并在培养箱中培养24小时。24小时后，在96盘中每孔收集175μL之上清液，并将其用于使用IFN-γELISA HRP试剂盒的IFN-γ的ELISA检测。
HLA阻断测定
HLA阻断测定如下进行。在LCL刺激之后收集肽负载LCL，通过添加10mL PBS来洗涤，以350g离心5分钟，且将上清液完全吸出。通过添加AIM-V培养基(含有10％胎牛血清)，将细胞团块再悬浮，调整至1×105个细胞/mL。将100μL/孔的细胞悬浮液添加至96孔盘，且将HLA阻断抗体添加(最终浓度50μg/mL)至适当孔，并在培养箱中培养2小时。收集TCR转移T细胞，通过添加10mL的PBS来洗涤，以350g离心5分钟，且将上清液完全吸出。通过添加AIM-V培养基(含有10％胎牛血清)，收集细胞团块并将其调整至5×105个细胞/mL。将100μL/孔的TCR转导细胞悬浮液添加至对应孔，与LCL混合，并在培养箱中培养24小时。24小时后，96盘的每孔收集175μL之上清液，并使其经受使用IFN-γELISA HRP试剂盒的IFN-γ的ELISA检测。
HLA限制测定
使来自具有各种HLA-II基因型的不同供体(表4)的LCL载有肽，以在HLA限制测定中刺激TCR-T。其余步骤与LCL刺激测定相同。
表4：具有不同HLA基因型的供体。
人类IFN-γELISA
在第1天，将高蛋白结合ELISA盘用于PBS(pH 7.4)中经稀释至2μg/mL的抗体1-D1K(IFN-γELISA HRP试剂盒)涂布(通过添加50μL/孔)，并在4℃下培养过夜。在第2天，将盘用PBS(200μL/孔)洗涤两次。将盘通过添加200μL/孔的培养基来阻断，并在室温(RT)下培养1小时。将人类IFN-γ标准品(IFN-γELISA HRP试剂盒)制备于2mL PBS(具有1％BSA)中至0.5μg/mL的浓度，并置于RT下15分钟，然后使试管漩涡震荡。将50μL/孔的样本或标准品稀释于培养基中并在RT下培养2小时。以二重复测试样本和标准探针。将盘用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤五次。以1μg/mL(于PBS中)添加50μL/孔的抗体7-B6-1-生物素(IFN-γELISA HRP试剂盒)，在RT下培养1小时，并洗涤。添加50μL/孔经1:1000稀释于PBS中的链霉亲和素-HRP(IFN-γELISA HRP试剂盒)，在RT下培养1小时，并洗涤。添加100μL/孔的TMB受质溶液，在RT下于暗处培养15至30分钟，直到孔中溶液转变成可见蓝色为止。添加50μL/孔的终止溶液以终止酶反应。溶液颜色从蓝色变成黄色。在450nm下以ELISA读取仪测量光密度。
实施例5：来自经MASCT治疗的患者的两轮式肿瘤特异性T细胞扩增
患者SMZ经诊断出患有转移性肺癌，并接受了5个周期以活化T细胞进行的改良MASCT治疗(参见PCT/CN2018/081338和PCT/CN2019/080535)，此类活化T细胞是使用载有下列的DC制备：一般肿瘤抗原肽(hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CDCA1、VEGFR1、VEGFR2、RGS5、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1)和新抗原肽(SMX-1、SMX-2、以及SMX-3)的池。图36之上图显示，在ELISPOT测定中，在经过第5个周期的改良MASCT之后，患者的PBMC样本的抗原特异性T细胞反应。具体而言，四种肿瘤抗原hTERT、CCND1、MAGE-A1、以及WT-1诱导强烈的免疫反应。该患者随后经附加周期(周期6)的改良MASCT治疗。图36的下图显示，在ELISPOT测定中，在经过第6个周期的改良MASCT之后，患者的PBMC样本的抗原特异性T细胞反应。在ELISPOT测定中，使用来自对应于抗原hTERT、CCND1、MAGE-A1、以及WT-1的肿瘤抗原肽子池的各自的单一肽，来检测抗原特异性免疫反应，并识别免疫优势肿瘤抗原肽。肽hTERT-1和hTERT-2显示特别强烈的免疫反应。
获得来自患者SMZ的PBMC样本，以使用两轮式规程制备肿瘤特异性T细胞。
第1轮
图37提供此实施例中所使用的第1轮肿瘤特异性T细胞制备的规程概述。简而言之，在第1天，通过以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(PBMC)。继续将粘附单核球培养于AIM-V培养基中以分化为未成熟树突细胞(DC)，该AIM-V培养基具有1000U/mL GM-CSF和500U/mL IL-4。将所得未成熟DC以肽池进行脉冲，该肽池包括两种衍生自hTERT(即，hTERT1和hTERT2，1μg/mL/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于DC成熟培养基中以分化为成熟DC。在第8天，用肽池刺激PBMC。在第9天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(MiltenyiBiotec)，以自经刺激PBMC分离IFNγ+T细胞群。在第9天，将IFNγ+T细胞与抗原负载成熟DC共培养于培养基中，该培养基含有IL-2和抗PD-1抗体。在第11天，利用经肽池或各个个别肽脉冲的PBMC来刺激共培养物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichmentand Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以分离IFNγ+T细胞群。同时，制备抗原负载成熟DC(“DC刺激”)或PBMC(“PBMC刺激”)，并将其与IFNγ+T细胞共培养。在第14天，将抗CD3抗体(OKT3)和IL-2(以至少约2000IU/mL)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第31天，以获得肿瘤抗原特异性T细胞。
通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(PBMC)、第9天(在IFNγ富集前)、第12天(在IFNγ富集后)、以及第23、29、以及30天(IFNγ+T细胞与抗原负载DC或PBMC共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图38A所示，使用抗原负载DC或PBMC的规程产生类似的T细胞增殖结果。
通过实施例2所述的方法，确定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产水平。图38B显示在富集步骤之后的各种T细胞群的百分比。图39A至图39E比较在第23和30天的细胞样本中的各种肿瘤特异性T细胞群的百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池或个别抗原肽的刺激的IFNγ+CD3+细胞、IFNγ+CD4+细胞、以及IFNγ+TNFα+细胞而确定。与抗原负载DC的共培养物产生最高的肿瘤特异性T细胞百分比。如图39F所示，在第30天的样本中，98.6％的IFNγ+CD4+细胞是CCR7-CD45RO-效应T细胞。
第2轮
图40提供此实施例中所使用的第2轮肿瘤特异性T细胞制备的规程概述。简而言之，在第1天，将来自第1轮的肿瘤特异性T细胞培养于培养基中，该培养基包含细胞因子混合物(IL-2、IL-7、以及IL-15)和抗PD-1抗体。制备载有hTERT-2肽的PBMC或成熟DC。以1:3、1:1、或3:1的T细胞与PBMC之间的比率，或者以3:1和1:1的T细胞与DC之间的比率，将肿瘤特异性T细胞与抗原负载DC或PBMC共培养。在第3天，将抗CD3抗体(OKT3)和IL-2添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第8天，以获得肿瘤抗原特异性T细胞。
通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(第1轮肿瘤特性T细胞)、以及第8天(IFNγ+T细胞与抗原负载DC或PBMC共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。通过实施例2所述的方法，确定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性T细胞的IFNγ生产水平。如图41A所示，与抗原负载DC的共培养物在第8天产生最高的T细胞数目和最高的肿瘤特异性T细胞百分比。
图41B至图41C比较在第8天的细胞样本中的各种肿瘤特异性T细胞群的百分比，如通过评估响应于hTERT2抗原肽刺激的IFNγ+CD3+细胞和IFNγ+TNFα+细胞而确定。以3:1的DC与T细胞之间的比率的与抗原负载DC的共培养物产生最高的肿瘤特异性T细胞百分比。
图42图显示在第1轮第1天和第30天、以及在第38天(即，第2轮第8天)的T细胞和肿瘤特异性T细胞数目。两轮式规程有效地扩增肿瘤特异性T细胞。相较于抗原负载PMBC的刺激，第2轮中抗原负载DC的刺激产生较高的T细胞数目和较高的肿瘤特异性T细胞百分比。在第1轮结束时获得的肿瘤特异性T细胞是效应T细胞。
序列表
TCRα或TCRβ链氨基酸序列中加底线的部分是CDR序列。
SEQ ID NO:1(CEA序列)
YGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKIQPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTS
SEQ ID NO:2(RGS-5序列)
MCKGLAALPHSCLERAKEIKIKLGILLQKPDSVGDLVIPYNEKPEKPAKT
SEQ ID NO:3(HPV18-E7序列)
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
SEQ ID NO:4(CEA克隆体1TCRαCDR3)
CIGPFGNEKLTF
SEQ ID NO:5(CEA克隆体1TCRα链氨基酸序列)
MRLVARVTVFLTFGTIIDAKTTQPPSMDCAEGRAANLPCNHSTISGNEYVYWYRQIHSQGPQYIIHGLKNNETNEMASLIITEDRKSSTLILPHATLRDTAVYYCIGPFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:6(CEA克隆体1TCRα链核酸序列)
ATGAGGCTGGTGGCAAGAGTAACTGTGTTTCTGACCTTTGGAACTATAATTGATGCTAAGACCACCCAGCCCCCCTCCATGGATTGCGCTGAAGGAAGAGCTGCAAACCTGCCTTGTAATCACTCTACCATCAGTGGAAATGAGTATGTGTATTGGTATCGACAGATTCACTCCCAGGGGCCACAGTATATCATTCATGGTCTAAAAAACAATGAAACCAATGAAATGGCCTCTCTGATCATCACAGAAGACAGAAAGTCCAGCACCTTGATCCTGCCCCACGCTACGCTGAGAGACACTGCTGTGTACTATTGCATCGGCCCCTTTGGAAATGAGAAATTAACCTTTGGGACTGGAACAAGACTCACCATCATACCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:7(CEA克隆体1TCRβCDR3)
CASSLDRTVYGYTF
SEQ ID NO:8(CEA克隆体1TCRβ链氨基酸序列)
MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLKFMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSLDRTVYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:9(CEA克隆体1TCRβ链核酸序列)
ATGGACACCAGAGTACTCTGCTGTGCGGTCATCTGTCTTCTGGGGGCAGGTCTCTCAAATGCCGGCGTCATGCAGAACCCAAGACACCTGGTCAGGAGGAGGGGACAGGAGGCAAGACTGAGATGCAGCCCAATGAAAGGACACAGTCATGTTTACTGGTATCGGCAGCTCCCAGAGGAAGGTCTGAAATTCATGGTTTATCTCCAGAAAGAAAATATCATAGATGAGTCAGGAATGCCAAAGGAACGATTTTCTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCCCCAGCATCCTGAGGATCCAGCAGGTAGTGCGAGGAGATTCGGCAGCTTATTTCTGTGCCAGCTCACTGGACAGGACCGTCTATGGCTACACCTTCGGTTCGGGGACCAGGTTAACCGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:10(CEA克隆体2TCRαCDR3)
CALSGGANAGKSTF
SEQ ID NO:11(CEA克隆体2TCRα链氨基酸序列)
MKPTLISVLVIIFILRGTRAQRVTQPEKLLSVFKGAPVELKCNYSYSGSPELFWYVQYSR
QRLQLLLRHISRESIKGFTADLNKGETSFHLKKPFAQEEDSAMYYCALSGGANAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:12(CEA克隆体2TCRα链核酸序列)
ATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTGCTTGTGATAATATTTATACTCAGAGGAACAAGAGCCCAGAGAGTGACTCAGCCCGAGAAGCTCCTCTCTGTCTTTAAAGGGGCCCCAGTGGAGCTGAAGTGCAACTATTCCTATTCTGGGAGTCCTGAACTCTTCTGGTATGTCCAGTACTCCAGACAACGCCTCCAGTTACTCTTGAGACACATCTCTAGAGAGAGCATCAAAGGCTTCACTGCTGACCTTAACAAAGGCGAGACATCTTTCCACCTGAAGAAACCATTTGCTCAAGAGGAAGACTCAGCCATGTATTACTGTGCTCTAAGTGGCGGAGCCAATGCAGGCAAATCAACCTTTGGGGATGGGACTACGCTCACTGTGAAGCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:13(CEA克隆体2TCRβCDR3)
CASSELGNTIYF
SEQ ID NO:14(CEA克隆体2TCRβ链氨基酸序列)
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCASSELGNTI
YFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:15(CEA克隆体2TCRβ链核酸序列)
ATGGATACCTGGCTCGTATGCTGGGCAATTTTTAGTCTCTTGAAAGCAGGACTCACAGAACCTGAAGTCACCCAGACTCCCAGCCATCAGGTCACACAGATGGGACAGGAAGTGATCTTGCGCTGTGTCCCCATCTCTAATCACTTATACTTCTATTGGTACAGACAAATCTTGGGGCAGAAAGTCGAGTTTCTGGTTTCCTTTTATAATAATGAAATCTCAGAGAAGTCTGAAATATTCGATGATCAATTCTCAGTTGAAAGGCCTGATGGATCAAATTTCACTCTGAAGATCCGGTCCACAAAGCTGGAGGACTCAGCCATGTACTTCTGTGCCAGCAGTGAACTAGGAAACACCATATATTTTGGAGAGGGAAGTTGGCTCACTGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:16(CEA克隆体3TCRαCDR3)
CAAHADYKLSF
SEQ ID NO:17(CEA克隆体3TCRα链氨基酸序列)
MDKILGASFLVLWLQLCWVSGQQKEKSDQQQVKQSPQSLIVQKGGISIINCAYENTAFDYFPWYQQFPGKGPALLIAIRPDVSEKKEGRFTISFNKSAKQFSLHIMDSQPGDSATYFCAAHADYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:18(CEA克隆体3TCRα链核酸序列)
ATGGACAAGATCTTAGGAGCATCATTTTTAGTTCTGTGGCTTCAACTATGCTGGGTGAGTGGCCAACAGAAGGAGAAAAGTGACCAGCAGCAGGTGAAACAAAGTCCTCAATCTTTGATAGTCCAGAAAGGAGGGATTTCAATTATAAACTGTGCTTATGAGAACACTGCGTTTGACTACTTTCCATGGTACCAACAATTCCCTGGGAAAGGCCCTGCATTATTGATAGCCATACGTCCAGATGTGAGTGAAAAGAAAGAAGGAAGATTCACAATCTCCTTCAATAAAAGTGCCAAGCAGTTCTCATTGCATATCATGGATTCCCAGCCTGGAGACTCAGCCACCTACTTCTGTGCAGCACACGCCGACTACAAGCTCAGCTTTGGAGCCGGAACCACAGTAACTGTAAGAGCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:19(CEA克隆体3TCRβCDR3)
CASSLDRATNEKLFF
SEQ ID NO:20(CEA克隆体3TCRβ链氨基酸序列)
MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLKFMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSLDRATNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:21(CEA克隆体3TCRβ链核酸序列)
ATGGACACCAGAGTACTCTGCTGTGCGGTCATCTGTCTTCTGGGGGCAGGTCTCTCAAATGCCGGCGTCATGCAGAACCCAAGACACCTGGTCAGGAGGAGGGGACAGGAGGCAAGACTGAGATGCAGCCCAATGAAAGGACACAGTCATGTTTACTGGTATCGGCAGCTCCCAGAGGAAGGTCTGAAATTCATGGTTTATCTCCAGAAAGAAAATATCATAGATGAGTCAGGAATGCCAAAGGAACGATTTTCTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCCCCAGCATCCTGAGGATCCAGCAGGTAGTGCGAGGAGATTCGGCAGCTTATTTCTGTGCCAGCTCTCTTGACAGGGCGACAAATGAAAAACTGTTTTTTGGCAGTGGAACCCAGCTCTCTGTCTTGGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:22(RSG5克隆体1TCRαCDR3)
CALNNDYKLSF
SEQ ID NO:23(RSG5克隆体1TCRα链氨基酸序列)
MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCALNNDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:24(RSG5克隆体1TCRα链核酸序列)
ATGGCATGCCCTGGCTTCCTGTGGGCACTTGTGATCTCCACCTGTCTTGAATTTAGCATGGCTCAGACAGTCACTCAGTCTCAACCAGAGATGTCTGTGCAGGAGGCAGAGACCGTGACCCTGAGCTGCACATATGACACCAGTGAGAGTGATTATTATTTATTCTGGTACAAGCAGCCTCCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTTATTCGCCAAGAAGCTTATAAGCAACAGAATGCAACAGAGAATCGTTTCTCTGTGAACTTCCAGAAAGCAGCCAAATCCTTCAGTCTCAAGATCTCAGACTCACAGCTGGGGGATGCCGCGATGTATTTCTGTGCCCTTAATAACGACTACAAGCTCAGCTTTGGAGCCGGAACCACAGTAACTGTAAGAGCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:25(RSG5克隆体1TCRβCDR3)
CASSDKGFDEQFF
SEQ ID NO:26(RSG5克隆体1TCRβ链氨基酸序列)
MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSDKGFDEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:27(RSG5克隆体1TCRβ链核酸序列)
ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTAGTGATAAGGGGTTTGATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:28(RSG5克隆体2TCRαCDR3)
CIVRAWYNNNDMRF
SEQ ID NO:29(RSG5克隆体2TCRα链氨基酸序列)
MRLVARVTVFLTFGTIIDAKTTQPPSMDCAEGRAANLPCNHSTISGNEYVYWYRQIHSQGPQYIIHGLK NNETNEMASLIITEDRKSSTLILPHATLRDTAVYYCIVRAWYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:30(RSG5克隆体2TCRα链核酸序列)
ATGAGGCTGGTGGCAAGAGTAACTGTGTTTCTGACCTTTGGAACTATAATTGATGCTAAGACCACCCAGCCCCCCTCCATGGATTGCGCTGAAGGAAGAGCTGCAAACCTGCCTTGTAATCACTCTACCATCAGTGGAAATGAGTATGTGTATTGGTATCGACAGATTCACTCCCAGGGGCCACAGTATATCATTCATGGTCTAAAAAACAATGAAACCAATGAAATGGCCTCTCTGATCATCACAGAAGACAGAAAGTCCAGCACCTTGATCCTGCCCCACGCTACGCTGAGAGACACTGCTGTGTACTATTGCATCGTCAGAGCTTGGTACAATAACAATGACATGCGCTTTGGAGCAGGGACCAGACTGACAGTAAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:31(RSG5克隆体2TCRβCDR3)
CASRDTEAFF
SEQ ID NO:32(RSG5克隆体2TCRβ链氨基酸序列)
MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQ NNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASRDTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:33(RSG5克隆体2TCRβ链核酸序列)
ATGGGCACCAGGCTCCTCTGCTGGGCGGCCCTCTGTCTCCTGGGAGCAGAACTCACAGAAGCTGGAGTTGCCCAGTCTCCCAGATATAAGATTATAGAGAAAAGGCAGAGTGTGGCTTTTTGGTGCAATCCTATATCTGGCCATGCTACCCTTTACTGGTACCAGCAGATCCTGGGACAGGGCCCAAAGCTTCTGATTCAGTTTCAGAATAACGGTGTAGTGGATGATTCACAGTTGCCTAAGGATCGATTTTCTGCAGAGAGGCTCAAAGGAGTAGACTCCACTCTCAAGATCCAGCCTGCAAAGCTTGAGGACTCGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCAGGGACACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:34(RSG5克隆体3TCRαCDR3)
CVVNMRDSSYKLIF
SEQ ID NO:35(RSG5克隆体3TCRα链氨基酸序列)
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNMRDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:36(RSG5克隆体3TCRα链核酸序列)
ATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACGGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCCTTCAATGTTCCAGAGGGAGCCACTGTCGCTTTCAACTGTACTTACAGCAACAGTGCTTCTCAGTCTTTCTTCTGGTACAGACAGGATTGCAGGAAAGAACCTAAGTTGCTGATGTCCGTATACTCCAGTGGTAATGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAGAGCCAGCCAGTATATTTCCCTGCTCATCAGAGACTCCAAGCTCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGTGGTGAACATGAGGGATAGCAGCTATAAATTGATCTTCGGGAGTGGGACCAGACTGCTGGTCAGGCCTGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:37(RSG5克隆体3TCRβCDR3)
CSAHERITDTQYF
SEQ ID NO:38(RSG5克隆体3TCRβ链氨基酸序列)
MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGS KATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAHERITDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:39(RSG5克隆体3TCRβ链核酸序列)
ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATCCGAGCAGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAAAAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGAGGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTGCCCATGAGCGGATCACAGATACGCAGTATTTTGGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:40(RSG5克隆体4TCRαCDR3)
CVVNMKDSSYKLIF
SEQ ID NO:41(RSG5克隆体4TCRα链氨基酸序列)
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNMKDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:42(RSG5克隆体4TCRα链核酸序列)
ATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACGGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCCTTCAATGTTCCAGAGGGAGCCACTGTCGCTTTCAACTGTACTTACAGCAACAGTGCTTCTCAGTCTTTCTTCTGGTACAGACAGGATTGCAGGAAAGAACCTAAGTTGCTGATGTCCGTATACTCCAGTGGTAATGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAGAGCCAGCCAGTATATTTCCCTGCTCATCAGAGACTCCAAGCTCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGTGGTGAACATGAAGGATAGCAGCTATAAATTGATCTTCGGGAGTGGGACCAGACTGCTGGTCAGGCCTGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:43(RSG5克隆体4TCRβCDR3)
CSALEGTSGKETQYF
SEQ ID NO:44(RSG5克隆体4TCRβ链氨基酸序列)
MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGS KATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSALEGTSGKETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:45(RSG5克隆体4TCRβ链核酸序列)
ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATCCGAGCAGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAAAAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGAGGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTGCTTTAGAGGGGACTAGCGGGAAAGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:46(RSG5克隆体5TCRαCDR3)
CAGPGNQFYF
SEQ ID NO:47(RSG5克隆体5TCRα链氨基酸序列)
MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVK SGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGPGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:48(RSG5克隆体5TCRα链核酸序列)
ATGCTACTCATCACATCAATGTTGGTCTTATGGATGCAATTGTCACAGGTGAATGGACAACAGGTAATGCAAATTCCTCAGTACCAGCATGTACAAGAAGGAGAGGACTTCACCACGTACTGCAATTCCTCAACTACTTTAAGCAATATACAGTGGTATAAGCAAAGGCCTGGTGGACATCCCGTTTTTTTGATACAGTTAGTGAAGAGTGGAGAAGTGAAGAAGCAGAAAAGACTGACATTTCAGTTTGGAGAAGCAAAAAAGAACAGCTCCCTGCACATCACAGCCACCCAGACTACAGATGTAGGAACCTACTTCTGTGCAGGGCCCGGTAACCAGTTCTATTTTGGGACAGGGACAAGTTTGACGGTCATTCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:49(RSG5克隆体5TCRβCDR3)
CASSSWDRDQPQHF
SEQ ID NO:50(RSG5克隆体5TCRβ链氨基酸序列)
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSV GAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSSWDRDQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:51(RSG5克隆体5TCRβ链核酸序列)
ATGAGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTCATGGGACAGGGATCAGCCCCAGCATTTTGGTGATGGGACTCGACTCTCCATCCTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:52(RSG5克隆体6TCRαCDR3)
CALSALPYNQGGKLIF
SEQ ID NO:53(RSG5克隆体6TCRα链氨基酸序列)
MKPTLISVLVIIFILRGTRAQRVTQPEKLLSVFKGAPVELKCNYSYSGSPELFWYVQYSR
QRLQLLLRHISRESIKGFTADLNKGETSFHLKKPFAQEEDSAMYYCALSALPYNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:54(RSG5克隆体6TCRα链核酸序列)
ATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTGCTTGTGATAATATTTATACTCAGAGGAACAAGAGCCCAGAGAGTGACTCAGCCCGAGAAGCTCCTCTCTGTCTTTAAAGGGGCCCCAGTGGAGCTGAAGTGCAACTATTCCTATTCTGGGAGTCCTGAACTCTTCTGGTATGTCCAGTACTCCAGACAACGCCTCCAGTTACTCTTGAGACACATCTCTAGAGAGAGCATCAAAGGCTTCACTGCTGACCTTAACAAAGGCGAGACATCTTTCCACCTGAAGAAACCATTTGCTCAAGAGGAAGACTCAGCCATGTATTACTGTGCTCTAAGTGCCCTCCCCTATAACCAGGGAGGAAAGCTTATCTTCGGACAGGGAACGGAGTTATCTGTGAAACCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:55(RSG5克隆体6TCRβCDR3)
CAWARSRELFF
SEQ ID NO:56(RSG5克隆体6TCRβ链氨基酸序列)
MLCSLLALLLGTFFGVRSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRGLQLLFYSVG IGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWARSRELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:57(RSG5克隆体6TCRβ链核酸序列)
ATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCCTTCTCCTGGGCACTTTCTTTGGGGTCAGATCTCAGACTATTCATCAATGGCCAGCGACCCTGGTGCAGCCTGTGGGCAGCCCGCTCTCTCTGGAGTGCACTGTGGAGGGAACATCAAACCCCAACCTATACTGGTACCGACAGGCTGCAGGCAGGGGCCTCCAGCTGCTCTTCTACTCCGTTGGTATTGGCCAGATCAGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCAGACCCCAGGACCGGCAGTTCATCCTGAGTTCTAAGAAGCTCCTTCTCAGTGACTCTGGCTTCTATCTCTGTGCCTGGGCGAGGAGCAGGGAGCTGTTTTTTGGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTGGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:58(HPV18-E7克隆体1TCRαCDR3)
CAFYAGNNRKLIW
SEQ ID NO:59(HPV18-E7克隆体1TCRα链氨基酸序列)
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAFYAGNNRKLIWGLGTSLAVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:60(HPV18-E7克隆体1TCRα链核酸序列)
ATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCACTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGTTTCTCTCAACTGCACTTACAGCAACAGTGCTTTTCAATACTTCATGTGGTACAGACAGTATTCCAGAAAAGGCCCTGAGTTGCTGATGTACACATACTCCAGTGGTAACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGGTCGATAAATCCAGCAAGTATATCTCCTTGTTCATCAGAGACTCACAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCATTCTATGCTGGCAACAACCGTAAGCTGATTTGGGGATTGGGAACAAGCCTGGCAGTAAATCCGAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:61(HPV18-E7克隆体1TCRβCDR3)
CASSIDPATSHEQFF
SEQ ID NO:62(HPV18-E7克隆体1TCRβ链氨基酸序列)
MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQ IVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSIDPATSHEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:63(HPV18-E7克隆体1TCRβ链核酸序列)
ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTAGTATAGATCCGGCGACTAGTCATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:64(HPV18-E7克隆体2TCRαCDR3)
CALSGRRDDMRF
SEQ ID NO:65(HPV18-E7克隆体2TCRα链氨基酸序列)
MKPTLISVLVIIFILRGTRAQRVTQPEKLLSVFKGAPVELKCNYSYSGSPELFWYVQYSR
QRLQLLLRHISRESIKGFTADLNKGETSFHLKKPFAQEEDSAMYYCALSGRRDDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:66(HPV18-E7克隆体2TCRα链核酸序列)
ATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTGCTTGTGATAATATTTATACTCAGAGGAACAAGAGCCCAGAGAGTGACTCAGCCCGAGAAGCTCCTCTCTGTCTTTAAAGGGGCCCCAGTGGAGCTGAAGTGCAACTATTCCTATTCTGGGAGTCCTGAACTCTTCTGGTATGTCCAGTACTCCAGACAACGCCTCCAGTTACTCTTGAGACACATCTCTAGAGAGAGCATCAAAGGCTTCACTGCTGACCTTAACAAAGGCGAGACATCTTTCCACCTGAAGAAACCATTTGCTCAAGAGGAAGACTCAGCCATGTATTACTGTGCTCTAAGTGGCCGTCGGGATGACATGCGCTTTGGAGCAGGGACCAGACTGACAGTAAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:67(HPV18-E7克隆体2TCRβCDR3)
CASSFRGDEQFF
SEQ ID NO:68(HPV18-E7克隆体2TCRβ链氨基酸序列)
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSFRGDEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:69(HPV18-E7克隆体2TCRβ链核酸序列)
ATGGGCACCAGCCTCCTCTGCTGGATGGCCCTGTGTCTCCTGGGGGCAGATCACGCAGATACTGGAGTCTCCCAGAACCCCAGACACAAGATCACAAAGAGGGGACAGAATGTAACTTTCAGGTGTGATCCAATTTCTGAACACAACCGCCTTTATTGGTACCGACAGACCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTCTGACTTACTTCCAGAATGAAGCTCAACTAGAAAAATCAAGGCTGCTCAGTGATCGGTTCTCTGCAGAGAGGCCTAAGGGATCTTTCTCCACCTTGGAGATCCAGCGCACAGAGCAGGGGGACTCGGCCATGTATCTCTGTGCCAGCAGCTTCAGGGGAGACGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:70(HPV18-E7克隆体3TCRαCDR3)
CAMSPRSGYALNF
SEQ ID NO:71(HPV18-E7克隆体3TCRα链氨基酸序列)
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSPRSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:72(HPV18-E7克隆体3TCRα链核酸序列)
ATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCACTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGTTTCTCTCAACTGCACTTACAGCAACAGTGCTTTTCAATACTTCATGTGGTACAGACAGTATTCCAGAAAAGGCCCTGAGTTGCTGATGTACACATACTCCAGTGGTAACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGGTCGATAAATCCAGCAAGTATATCTCCTTGTTCATCAGAGACTCACAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCAATGAGCCCTCGGAGCGGGTATGCACTCAACTTCGGCAAAGGCACCTCGCTGTTGGTCACACCCCATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:73(HPV18-E7克隆体3TCRβCDR3)
CASSMDAALGEKLFF
SEQ ID NO:74(HPV18-E7克隆体3TCRβ链氨基酸序列)
MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQ IVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSMDAALGEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:75(HPV18-E7克隆体3TCRβ链核酸序列)
ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTAGTATGGACGCCGCCTTGGGTGAAAAACTGTTTTTTGGCAGTGGAACCCAGCTCTCTGTCTTGGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:76(HPV18-E7克隆体4TCRαCDR3)
CALRSGGSNYKLTF
SEQ ID NO:77(HPV18-E7克隆体4TCRα链氨基酸序列)
MNYSPGLVSLILLLLGRTRGNSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFWYVQYPGEGLQLLLKA TKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALRSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:78(HPV18-E7克隆体4TCRα链核酸序列)
ATGAACTATTCTCCAGGCTTAGTATCTCTGATACTCTTACTGCTTGGAAGAACCCGTGGAAATTCAGTGACCCAGATGGAAGGGCCAGTGACTCTCTCAGAAGAGGCCTTCCTGACTATAAACTGCACGTACACAGCCACAGGATACCCTTCCCTTTTCTGGTATGTCCAATATCCTGGAGAAGGTCTACAGCTCCTCCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGACAAGGGAAGCAACAAAGGTTTTGAAGCCACATACCGTAAAGAAACCACTTCTTTCCACTTGGAGAAAGGCTCAGTTCAAGTGTCAGACTCAGCGGTGTACTTCTGTGCTCTGAGGAGTGGAGGTAGCAACTATAAACTGACATTTGGAAAAGGAACTCTCTTAACCGTGAATCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:79(HPV18-E7克隆体4TCRβCDR3)
CASSVEWGTYEQYF
SEQ ID NO:80(HPV18-E7克隆体4TCRβ链氨基酸序列)
MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYY NGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVEWGTYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:81(HPV18-E7克隆体4TCRβ链核酸序列)
ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGAATGGGGTACCTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:82(RGS5表位1)
AKEIKIKLGILLQKP
SEQ ID NO:83(RGS5表位2)
MCKGLAALPHSCLERAKEIKIKLGILLQKP
SEQ ID NO:84(HPV18 E7表位1)
ADDLRAFQQLFLNTL
SEQ ID NO:85(HPV18 E7表位2)
RAFQQLFLNTLSFVCPWCA
SEQ ID NO:86(HPV18 E7表位3)
VESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
SEQ ID NO:87(HPV18-E7克隆体5TCRαCDR3)
CAVYQGAQKLVF
SEQ ID NO:88(HPV18-E7克隆体5TCRα链氨基酸序列)
MLLELIPLLGIHFVLRTARAQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYLFWYVQSPGQGLQLLLKY FSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCAVYQGAQKLVFGQGTRLTINPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:89(HPV18-E7克隆体5TCRα链核酸序列)
ATGCTCCTGGAGCTTATCCCACTGCTGGGGATACATTTTGTCCTGAGAACTGCCAGAGCCCAGTCAGTGACCCAGCCTGACATCCACATCACTGTCTCTGAAGGAGCCTCACTGGAGTTGAGATGTAACTATTCCTATGGGGCAACACCTTATCTCTTCTGGTATGTCCAGTCCCCCGGCCAAGGCCTCCAGCTGCTCCTGAAGTACTTTTCAGGAGACACTCTGGTTCAAGGCATTAAAGGCTTTGAGGCTGAATTTAAGAGGAGTCAATCTTCCTTCAACCTGAGGAAACCCTCTGTGCATTGGAGTGATGCTGCTGAGTACTTCTGTGCTGTGTATCAGGGAGCCCAGAAGCTGGTATTTGGCCAAGGAACCAGGCTGACTATCAACCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:90(HPV18-E7克隆体5TCRβCDR3)
CSAPWLAGLYNEQFF
SEQ ID NO:91(HPV18-E7克隆体5TCRβ链氨基酸序列)
MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSK ATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAPWLAGLYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:92(HPV18-E7克隆体5TCRβ链核酸序列)
ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATCCGAGCTGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAACAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGAGGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTGCTCCGTGGCTAGCGGGGTTGTACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:93(HPV18-E7克隆体6TCRαCDR3)
CVVSAIGYSSASKIIF
SEQ ID NO:94(HPV18-E7克隆体6TCRα链氨基酸序列)
MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSHVSVSEGTPVLLRCNYSSSYSPSLFWYVQHPNKGLQLLLKY TSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCVVSAIGYSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:95(HPV18-E7克隆体6TCRα链核酸序列)
ATGCTCCTGCTGCTCGTCCCAGTGCTCGAGGTGATTTTTACTCTGGGAGGAACCAGAGCCCAGTCGGTGACCCAGCTTGACAGCCACGTCTCTGTCTCTGAAGGAACCCCGGTGCTGCTGAGGTGCAACTACTCATCTTCTTATTCACCATCTCTCTTCTGGTATGTGCAACACCCCAACAAAGGACTCCAGCTTCTCCTGAAGTACACATCAGCGGCCACCCTGGTTAAAGGCATCAACGGTTTTGAGGCTGAATTTAAGAAGAGTGAAACCTCCTTCCACCTGACGAAACCCTCAGCCCATATGAGCGACGCGGCTGAGTACTTCTGTGTTGTGAGTGCCATTGGGTACAGCAGTGCTTCCAAGATAATCTTTGGATCAGGGACCAGACTCAGCATCCGGCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC
SEQ ID NO:96(HPV18-E7克隆体6TCRβCDR3)
CASSLVAGGPAETQYF
SEQ ID NO:97(HPV18-E7克隆体6TCRβ链氨基酸序列)
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQ NEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLVAGGPAETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:98(HPV18-E7克隆体6TCRβ链核酸序列)
ATGGGCACCAGCCTCCTCTGCTGGATGGCCCTGTGTCTCCTGGGGGCAGATCACGCAGATACTGGAGTCTCCCAGAACCCCAGACACAAGATCACAAAGAGGGGACAGAATGTAACTTTCAGGTGTGATCCAATTTCTGAACACAACCGCCTTTATTGGTACCGACAGACCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTCTGACTTACTTCCAGAATGAAGCTCAACTAGAAAAATCAAGGCTGCTCAGTGATCGGTTCTCTGCAGAGAGGCCTAAGGGATCTTTCTCCACCTTGGAGATCCAGCGCACAGAGCAGGGGGACTCGGCCATGTATCTCTGTGCCAGCAGCTTAGTTGCGGGAGGGCCCGCAGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:99(P2A氨基酸序列)
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:100(P2A核酸序列)
GGAAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCC
SEQ ID NO:101(前导氨基酸序列)
MEAVVTTLPREGGVRPSRK
SEQ ID NO:102(前导核酸序列)
ATGGAGGCAGTGGTCACAACTCTCCCCAGAGAAGGTGGTGTGAGGCCATCACGGAAG
SEQ ID NO:103(鼠源化RSG5克隆体2TCRα链氨基酸序列)
MRLVARVTVFLTFGTIIDAKTTQPPSMDCAEGRAANLPCNHSTISGNEYVYWYRQIHSQGPQYIIHGLK NNETNEMASLIITEDRKSSTLILPHATLRDTAVYYCIVRAWYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:104(鼠源化RSG5克隆体2TCRα链核酸序列)
ATGAGGCTGGTGGCAAGAGTAACTGTGTTTCTGACCTTTGGAACTATAATTGATGCTAAGACCACCCAGCCCCCCTCCATGGATTGCGCTGAAGGAAGAGCTGCAAACCTGCCTTGTAATCACTCTACCATCAGTGGAAATGAGTATGTGTATTGGTATCGACAGATTCACTCCCAGGGGCCACAGTATATCATTCATGGTCTAAAAAACAATGAAACCAATGAAATGGCCTCTCTGATCATCACAGAAGACAGAAAGTCCAGCACCTTGATCCTGCCCCACGCTACGCTGAGAGACACTGCTGTGTACTATTGCATCGTCAGAGCTTGGTACAATAACAATGACATGCGCTTTGGAGCAGGGACCAGACTGACAGTAAAACCAAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:105(鼠源化RSG5克隆体2TCRβ链氨基酸序列)
MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQ NNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASRDTEAFFGQGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:106(鼠源化RSG5克隆体2TCRβ链核酸序列)
ATGGGCACCAGGCTCCTCTGCTGGGCGGCCCTCTGTCTCCTGGGAGCAGAACTCACAGAAGCTGGAGTTGCCCAGTCTCCCAGATATAAGATTATAGAGAAAAGGCAGAGTGTGGCTTTTTGGTGCAATCCTATATCTGGCCATGCTACCCTTTACTGGTACCAGCAGATCCTGGGACAGGGCCCAAAGCTTCTGATTCAGTTTCAGAATAACGGTGTAGTGGATGATTCACAGTTGCCTAAGGATCGATTTTCTGCAGAGAGGCTCAAAGGAGTAGACTCCACTCTCAAGATCCAGCCTGCAAAGCTTGAGGACTCGGCCGTGTATCTCTGTGCCAGCAGGGACACTGAAGCTTTCTTTGGACAAGGCACCAGACTCACAGTTGTAGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCASEQ ID NO:107(鼠源化RSG5克隆体3TCRα链氨基酸序列)
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNMRDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:108(鼠源化RSG5克隆体3TCRα链核酸序列)
ATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACGGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCCTTCAATGTTCCAGAGGGAGCCACTGTCGCTTTCAACTGTACTTACAGCAACAGTGCTTCTCAGTCTTTCTTCTGGTACAGACAGGATTGCAGGAAAGAACCTAAGTTGCTGATGTCCGTATACTCCAGTGGTAATGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAGAGCCAGCCAGTATATTTCCCTGCTCATCAGAGACTCCAAGCTCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGTGGTGAACATGAGGGATAGCAGCTATAAATTGATCTTCGGGAGTGGGACCAGACTGCTGGTCAGGCCTGATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:109(鼠源化RSG5克隆体3TCRβ链氨基酸序列)
MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGS KATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAHERITDTQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:110(鼠源化RSG5克隆体3TCRβ链核酸序列)
ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATCCGAGCAGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAAAAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGAGGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTGCCCATGAGCGGATCACAGATACGCAGTATTTTGGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:111(鼠源化RSG5克隆体4TCRα链氨基酸序列)
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNMKDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:112(鼠源化RSG5克隆体4TCRα链核酸序列)
ATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACGGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCCTTCAATGTTCCAGAGGGAGCCACTGTCGCTTTCAACTGTACTTACAGCAACAGTGCTTCTCAGTCTTTCTTCTGGTACAGACAGGATTGCAGGAAAGAACCTAAGTTGCTGATGTCCGTATACTCCAGTGGTAATGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGCTCAATAGAGCCAGCCAGTATATTTCCCTGCTCATCAGAGACTCCAAGCTCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGTGGTGAACATGAAGGATAGCAGCTATAAATTGATCTTCGGGAGTGGGACCAGACTGCTGGTCAGGCCTGATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:113(鼠源化RSG5克隆体4TCRβ链氨基酸序列)
MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGS KATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSALEGTSGKETQYFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:114(鼠源化RSG5克隆体4TCRβ链核酸序列)
ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATCCGAGCAGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAAAAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGAGGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTGCTTTAGAGGGGACTAGCGGGAAAGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTCGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:115(鼠源化RSG5克隆体5TCRα链氨基酸序列)
MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVK SGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGPGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:116(鼠源化RSG5克隆体5TCRα链核酸序列)
ATGCTACTCATCACATCAATGTTGGTCTTATGGATGCAATTGTCACAGGTGAATGGACAACAGGTAATGCAAATTCCTCAGTACCAGCATGTACAAGAAGGAGAGGACTTCACCACGTACTGCAATTCCTCAACTACTTTAAGCAATATACAGTGGTATAAGCAAAGGCCTGGTGGACATCCCGTTTTTTTGATACAGTTAGTGAAGAGTGGAGAAGTGAAGAAGCAGAAAAGACTGACATTTCAGTTTGGAGAAGCAAAAAAGAACAGCTCCCTGCACATCACAGCCACCCAGACTACAGATGTAGGAACCTACTTCTGTGCAGGGCCCGGTAACCAGTTCTATTTTGGGACAGGGACAAGTTTGACGGTCATTCCAAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:117(鼠源化RSG5克隆体5TCRβ链氨基酸序列)
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSV GAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSSWDRDQPQHFGDGTRLSILEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:118(鼠源化RSG5克隆体5TCRβ链核酸序列)
ATGAGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTCATGGGACAGGGATCAGCCCCAGCATTTTGGTGATGGGACTCGACTCTCCATCCTAGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:119(鼠源化RSG5克隆体6TCRα链氨基酸序列)
MKPTLISVLVIIFILRGTRAQRVTQPEKLLSVFKGAPVELKCNYSYSGSPELFWYVQYSRQRLQLLLRH ISRESIKGFTADLNKGETSFHLKKPFAQEEDSAMYYCALSALPYNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:120(鼠源化RSG5克隆体6TCRα链核酸序列)
ATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTGCTTGTGATAATATTTATACTCAGAGGAACAAGAGCCCAGAGAGTGACTCAGCCCGAGAAGCTCCTCTCTGTCTTTAAAGGGGCCCCAGTGGAGCTGAAGTGCAACTATTCCTATTCTGGGAGTCCTGAACTCTTCTGGTATGTCCAGTACTCCAGACAACGCCTCCAGTTACTCTTGAGACACATCTCTAGAGAGAGCATCAAAGGCTTCACTGCTGACCTTAACAAAGGCGAGACATCTTTCCACCTGAAGAAACCATTTGCTCAAGAGGAAGACTCAGCCATGTATTACTGTGCTCTAAGTGCCCTCCCCTATAACCAGGGAGGAAAGCTTATCTTCGGACAGGGAACGGAGTTATCTGTGAAACCCAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:121(鼠源化RSG5克隆体6TCRβ链氨基酸序列)
MLCSLLALLLGTFFGVRSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRGLQLLFYSVG IGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWARSRELFFGEGSRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:122(鼠源化RSG5克隆体6TCRβ链核酸序列)
ATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCCTTCTCCTGGGCACTTTCTTTGGGGTCAGATCTCAGACTATTCATCAATGGCCAGCGACCCTGGTGCAGCCTGTGGGCAGCCCGCTCTCTCTGGAGTGCACTGTGGAGGGAACATCAAACCCCAACCTATACTGGTACCGACAGGCTGCAGGCAGGGGCCTCCAGCTGCTCTTCTACTCCGTTGGTATTGGCCAGATCAGCTCTGAGGTGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCAGACCCCAGGACCGGCAGTTCATCCTGAGTTCTAAGAAGCTCCTTCTCAGTGACTCTGGCTTCTATCTCTGTGCCTGGGCGAGGAGCAGGGAGCTGTTTTTTGGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTGGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:123(鼠源化HPV18 E7克隆体1TCRα链氨基酸序列)
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAFYAGNNRKLIWGLGTSLAVNPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:124(鼠源化HPV18 E7克隆体1TCRα链核酸序列)
ATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCACTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGTTTCTCTCAACTGCACTTACAGCAACAGTGCTTTTCAATACTTCATGTGGTACAGACAGTATTCCAGAAAAGGCCCTGAGTTGCTGATGTACACATACTCCAGTGGTAACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGGTCGATAAATCCAGCAAGTATATCTCCTTGTTCATCAGAGACTCACAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCATTCTATGCTGGCAACAACCGTAAGCTGATTTGGGGATTGGGAACAAGCCTGGCAGTAAATCCGAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:125(鼠源化HPV18 E7克隆体1TCRβ链氨基酸序列)
MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQ IVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSIDPATSHEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:126(鼠源化HPV18 E7克隆体1TCRβ链核酸序列)
ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTAGTATAGATCCGGCGACTAGTCATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:127(鼠源化HPV18 E7克隆体3TCRα链氨基酸序列)
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSPRSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:128(鼠源化HPV18 E7克隆体3TCRα链核酸序列)
ATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCCTGTGGCTTCAGTTAAGCTGGGTTTGGAGCCAACAGAAGGAGGTGGAGCAGGATCCTGGACCACTCAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGTTTCTCTCAACTGCACTTACAGCAACAGTGCTTTTCAATACTTCATGTGGTACAGACAGTATTCCAGAAAAGGCCCTGAGTTGCTGATGTACACATACTCCAGTGGTAACAAAGAAGATGGAAGGTTTACAGCACAGGTCGATAAATCCAGCAAGTATATCTCCTTGTTCATCAGAGACTCACAGCCCAGTGATTCAGCCACCTACCTCTGTGCAATGAGCCCTCGGAGCGGGTATGCACTCAACTTCGGCAAAGGCACCTCGCTGTTGGTCACACCCCATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:129(鼠源化HPV18 E7克隆体3TCRβ链氨基酸序列)
MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQ IVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSMDAALGEKLFFGSGTQLSVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:130(鼠源化HPV18 E7克隆体3TCRβ链核酸序列)
ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTAGTATGGACGCCGCCTTGGGTGAAAAACTGTTTTTTGGCAGTGGAACCCAGCTCTCTGTCTTGGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:131(鼠源化HPV18 E7克隆体4TCRα链氨基酸序列)
MNYSPGLVSLILLLLGRTRGNSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFWYVQYPGEGLQLLLKA TKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALRSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:132(鼠源化HPV18 E7克隆体4TCRα链核酸序列)
ATGAACTATTCTCCAGGCTTAGTATCTCTGATACTCTTACTGCTTGGAAGAACCCGTGGAAATTCAGTGACCCAGATGGAAGGGCCAGTGACTCTCTCAGAAGAGGCCTTCCTGACTATAAACTGCACGTACACAGCCACAGGATACCCTTCCCTTTTCTGGTATGTCCAATATCCTGGAGAAGGTCTACAGCTCCTCCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGACAAGGGAAGCAACAAAGGTTTTGAAGCCACATACCGTAAAGAAACCACTTCTTTCCACTTGGAGAAAGGCTCAGTTCAAGTGTCAGACTCAGCGGTGTACTTCTGTGCTCTGAGGAGTGGAGGTAGCAACTATAAACTGACATTTGGAAAAGGAACTCTCTTAACCGTGAATCCAAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:133(鼠源化HPV18 E7克隆体4TCRβ链氨基酸序列)
MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYY NGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVEWGTYEQYFGPGTRLTVTEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:134(鼠源化HPV18 E7克隆体4TCRβ链核酸序列)
ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTAGAATGGGGTACCTACGAGCAGTACTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:135(鼠源化HPV18 E7克隆体5TCRα链氨基酸序列)
MLLELIPLLGIHFVLRTARAQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYLFWYVQSPGQGLQLLLKY FSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCAVYQGAQKLVFGQGTRLTINPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:136(鼠源化HPV18 E7克隆体5TCRα链核酸序列)
ATGCTCCTGGAGCTTATCCCACTGCTGGGGATACATTTTGTCCTGAGAACTGCCAGAGCCCAGTCAGTGACCCAGCCTGACATCCACATCACTGTCTCTGAAGGAGCCTCACTGGAGTTGAGATGTAACTATTCCTATGGGGCAACACCTTATCTCTTCTGGTATGTCCAGTCCCCCGGCCAAGGCCTCCAGCTGCTCCTGAAGTACTTTTCAGGAGACACTCTGGTTCAAGGCATTAAAGGCTTTGAGGCTGAATTTAAGAGGAGTCAATCTTCCTTCAACCTGAGGAAACCCTCTGTGCATTGGAGTGATGCTGCTGAGTACTTCTGTGCTGTGTATCAGGGAGCCCAGAAGCTGGTATTTGGCCAAGGAACCAGGCTGACTATCAACCCAAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:137(鼠源化HPV18 E7克隆体5TCRβ链氨基酸序列)
MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSK ATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAPWLAGLYNEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:138(鼠源化HPV18 E7克隆体5TCRβ链核酸序列)
ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATCCGAGCTGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAACAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGAGGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTGCTCCGTGGCTAGCGGGGTTGTACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:139(鼠源化HPV18 E7克隆体6TCRα链氨基酸序列)
MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSHVSVSEGTPVLLRCNYSSSYSPSLFWYVQHPNKGLQLLLKY TSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCVVSAIGYSSASKIIFGSGTRLSIRPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:140(鼠源化HPV18 E7克隆体6TCRα链核酸序列)
ATGCTCCTGCTGCTCGTCCCAGTGCTCGAGGTGATTTTTACTCTGGGAGGAACCAGAGCCCAGTCGGTGACCCAGCTTGACAGCCACGTCTCTGTCTCTGAAGGAACCCCGGTGCTGCTGAGGTGCAACTACTCATCTTCTTATTCACCATCTCTCTTCTGGTATGTGCAACACCCCAACAAAGGACTCCAGCTTCTCCTGAAGTACACATCAGCGGCCACCCTGGTTAAAGGCATCAACGGTTTTGAGGCTGAATTTAAGAAGAGTGAAACCTCCTTCCACCTGACGAAACCCTCAGCCCATATGAGCGACGCGGCTGAGTACTTCTGTGTTGTGAGTGCCATTGGGTACAGCAGTGCTTCCAAGATAATCTTTGGATCAGGGACCAGACTCAGCATCCGGCCAAATATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT
SEQ ID NO:141(鼠源化HPV18 E7克隆体6TCRβ链氨基酸序列)
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQ NEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLVAGGPAETQYFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:142(鼠源化HPV18 E7克隆体6TCRβ链核酸序列)
ATGGGCACCAGCCTCCTCTGCTGGATGGCCCTGTGTCTCCTGGGGGCAGATCACGCAGATACTGGAGTCTCCCAGAACCCCAGACACAAGATCACAAAGAGGGGACAGAATGTAACTTTCAGGTGTGATCCAATTTCTGAACACAACCGCCTTTATTGGTACCGACAGACCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTCTGACTTACTTCCAGAATGAAGCTCAACTAGAAAAATCAAGGCTGCTCAGTGATCGGTTCTCTGCAGAGAGGCCTAAGGGATCTTTCTCCACCTTGGAGATCCAGCGCACAGAGCAGGGGGACTCGGCCATGTATCTCTGTGCCAGCAGCTTAGTTGCGGGAGGGCCCGCAGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCTGGTGCTCGAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
SEQ ID NO:195(T2A氨基酸序列)
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:196(E2A氨基酸序列)
GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:197(F2A氨基酸序列)
GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:198(Cα氨基酸序列)
IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:199(Cα核酸序列)
ATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGAC
TTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGG TCCAGCTGA
SEQ ID NO:200(mCα氨基酸序列)
IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVMVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:201(mCα核酸序列)
ATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACTGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGCTGGTTATGGTTCTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGTTGA
SEQ ID NO:202(Cβ氨基酸序列)
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:203(Cβ核酸序列)
AGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC
SEQ ID NO:204(Cβ氨基酸序列)
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO:205(Cβ核酸序列)
GACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCTGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGC
SEQ ID NO:206(mCβ氨基酸序列)
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVL SATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:207(mCβ核酸序列)
GATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAAAATTCA
表5：示例性TCR的CDR序列。
Claims (46)
1.一种获得特异性地识别目标肿瘤抗原肽的多种T细胞受体(TCR)的方法，所述方法包括：
a)第一共培养步骤，所述第一共培养步骤包括将载有所述目标肿瘤抗原肽的第一树突细胞(DC)群与来自个体的T细胞群共培养以获得第一共培养物；
b)富集步骤，所述富集步骤包括使所述第一共培养物经受富集过程以获得经富集的活化T细胞；
c)第二共培养步骤，所述第二共培养步骤包括将所述经富集的活化T细胞与载有所述目标肿瘤抗原肽的第二DC群共培养以获得肿瘤抗原特异性T细胞群，其中至少约10％的所述肿瘤抗原特异性T细胞对所述目标肿瘤抗原肽有特异性反应；以及
d)测序步骤，所述测序步骤包括使所述肿瘤抗原特异性T细胞经受下一代测序以识别编码TCRα和TCRβ的多对基因，从而基于编码TCRα和TCRβ的成对基因来提供所述多种T细胞受体；
其中所述个体已在临床上受益于多抗原特异性细胞疗法(MASCT)，所述MASCT包括向所述个体施用有效量的活化T细胞，所述活化T细胞通过将T细胞群与载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养而制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一共培养步骤在所述富集步骤之前进行约1至约3天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第一DC群之间的比率不超过约30:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第一DC群与所述T细胞群在第一共培养基中共培养，所述第一共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述富集步骤包括使所述第一共培养物与载有所述目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)接触以获得经刺激的共培养物，以及使用特异性地识别细胞因子的配体从所述经刺激的共培养物分离经富集的活化T细胞群。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞因子是IFNγ。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述经富集的活化T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第二DC群之间的比率为约1:1至约20:1。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述经富集的活化T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第二DC群共培养约12至25天。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二共培养步骤包括将载有所述目标肿瘤抗原肽的所述第二DC群与所述经富集的活化T细胞群在初始第二共培养基中共培养以提供第二共培养物，所述初始第二共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及将抗CD3抗体添加到所述第二共培养物以获得肿瘤抗原特异性T细胞群。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在所述第二共培养步骤开始后不超过约3天，将所述抗CD3抗体添加到所述第二共培养物。
11.据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法还包括第三共培养步骤，所述第三共培养步骤包括将所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有目标肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(APC)群共培养以获得第二肿瘤抗原特异性T细胞群，其中所述第二肿瘤抗原特异性T细胞群在所述测序步骤中经受下一代测序。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述APC是PBMC、DC或细胞系APC。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群之间的比率为约1:1至约20:1。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中将所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群共培养约5至9天。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中将所述肿瘤抗原特异性T细胞群与载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群在第三共培养基中共培养，所述第三共培养基包含一种或多种细胞因子和抗CD3抗体。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，重复所述第三共培养步骤。
17.根据权利要求1-16所述的方法，所述方法还包括从所述目标肿瘤抗原肽识别目标肿瘤表位，其中所述目标肿瘤表位引发所述经富集的活化T细胞群的特异性反应；以及使APC群与所述目标肿瘤表位接触以获得载有所述目标肿瘤抗原肽的所述APC群。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述下一代测序是单细胞测序。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述个体在接受所述MASCT之后具有部分反应(PR)、完全反应(CR)或稳定疾病(SD)。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括：将载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群共培养以获得活化T细胞群。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括：
(i)将载有包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的DC群与T细胞群在初始共培养基中共培养以提供共培养物，所述初始共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂；以及
(ii)在所述共培养开始后约3至7天，将抗CD3抗体添加到所述共培养物，从而获得所述活化T细胞群。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括：
(i)使DC群与包括所述目标肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽接触以获得载有所述多种肿瘤抗原肽的DC群；以及
(ii)在包含MPLA的DC成熟培养基中培养载有所述多种肿瘤抗原肽的所述DC群。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述DC成熟培养基包含INFγ、MPLA和PGE2。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述MASCT包括向所述个体施用有效量的载有所述多种肿瘤抗原肽的所述DC。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述个体先前已接受所述MASCT至少三次。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中在所述下一代测序之前用载有所述目标肿瘤抗原肽的APC刺激所述肿瘤抗原特异性T细胞。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中并行地获得特异性地识别多种目标肿瘤抗原肽的TCR。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，所述方法还包括在宿主免疫细胞中表达编码TCRα和TCRβ的每对基因以提供表达TCR的经工程化改造的免疫细胞；以及评估所述经工程化改造的免疫细胞对所述目标肿瘤抗原肽的反应。
29.一种获得特异性地识别目标肿瘤抗原肽的TCR的方法，所述方法包括根据权利要求28所述的方法，其中基于表达所述TCR的所述经工程化改造的免疫细胞对所述目标肿瘤抗原肽的所述反应来选择所述TCR。
30.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括确定所述TCR的HLA限制。
31.根据权利要求29或30所述的方法，所述方法还包括所述TCR的亲和力成熟。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，所述方法还包括增强所述TCR中的所述TCRα链和所述TCRβ链的配对。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，所述方法还包括增强所述TCR的表达。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述目标肿瘤抗原肽衍生自CEA、RSG-5或HPV18-E7。
35.一种使用根据权利要求1-34中任一项所述的方法获得的肿瘤特异性TCR。
36.一种肿瘤特异性TCR，所述肿瘤特异性TCR包含：
(a)包含互补决定区(CDR)3的TCRα链，所述CDR3与SEQ ID NO:4、10和16的氨基酸序列中的任何一者具有至少约90％序列同一性；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含与SEQ IDNO:7、13和19的氨基酸序列中的任何一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)包含互补决定区(CDR)3的TCRα链，所述CDR3与SEQ ID NO:22、28、34、40、46和52的氨基酸序列中的任何一者具有至少约90％序列同一性；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含与SEQ ID NO:7、13、19、25、31、37、43、49和55的氨基酸序列中的任何一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；
或
(c)包含互补决定区(CDR)3的TCRα链，所述CDR3与SEQ ID NO:58、64、70、76、87和93的氨基酸序列中的任何一者具有至少约90％序列同一性；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含与SEQ ID NO:61、67、73、79、90和96的氨基酸序列中的任何一者具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
37.根据权利要求36所述的肿瘤特异性TCR，所述肿瘤特异性TCR包含：
(a)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(b)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(d)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(e)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(f)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(g)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(h)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
(i)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(j)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；
(k)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列；
(l)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；
(m)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；
(n)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或
(o)包含CDR3的TCRα链，所述CDR3包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；和包含CDR3的TCRβ链，所述CDR3包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
38.一种肿瘤特异性TCR，所述肿瘤特异性TCR包含：
(a)包含SEQ ID NO:5、11和17的氨基酸序列中的任何一者的CDR的TCRα链；和包含SEQID NO:8、14和20的氨基酸序列中的任何一者的CDR的TCRβ链；
(b)包含SEQ ID NO:23、29、35、41、47和53的氨基酸序列中的任何一者的CDR的TCRα链；和包含SEQ ID NO:26、32、38、44、50和56的氨基酸序列中的任何一者的CDR的TCRβ链；或
(c)包含SEQ ID NO:59、65、71、77、88和94的氨基酸序列中的任何一者的CDR的TCRα链；和包含SEQ ID NO:62、68、74、80、91和97的氨基酸序列中的任何一者的CDR的TCRβ链。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的肿瘤特异性TCR，所述肿瘤特异性TCR包含：
(a)包含与SEQ ID NO:5、11和17的氨基酸序列中的任何一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列的TCRα链；和包含与SEQ IDNO:8、14和20的氨基酸序列中的任何一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列的TCRβ链；
(b)包含与SEQ ID NO:23、29、35、41、47和53的氨基酸序列中的任何一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列的TCRα链；和包含与SEQ ID NO:26、32、38、44、50和56的氨基酸序列中的任何一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列的TCRβ链；或
(c)包含与SEQ ID NO:59、65、71、77、88和94的氨基酸序列中的任何一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列的TCRα链；和包含与SEQ ID NO:62、68、74、80、91和97的氨基酸序列中的任何一者具有至少约80％同一性的氨基酸序列的TCRβ链。
40.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据权利要求35-39中任一项所述的肿瘤特异性TCR的所述TCRα链和/或所述TCRβ链。
41.一种载体，所述载体包含根据权利要求40所述的分离的核酸。
42.一种经工程化改造的免疫细胞，所述经工程化改造的免疫细胞包含根据权利要求35-39中任一项所述的肿瘤特异性TCR、根据权利要求40所述的分离的核酸或根据权利要求41所述的载体。
43.根据权利要求42所述的经工程化改造的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
44.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求42或43所述的经工程化改造的免疫细胞和药学上可接受的载体。
45.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求44所述的药物组合物。
46.一种使用根据权利要求1-35中任一项所述的方法获得的肿瘤特异性TCR的文库。
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