TW202012619A - 獲得腫瘤特異性ｔ細胞受體之方法 - Google Patents

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向軍 周
韓研妍
梁小玲
陳錫和
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中國大陸商深圳源正細胞醫療技術有限公司
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Abstract

本申請案提供獲得複數種特異性辨識來自個體之目標腫瘤抗原肽之T細胞受體的方法，該個體已在臨床上受益於免疫療法，諸如多抗原特異性細胞療法。亦提供腫瘤特異性TCR、表現該等TCR之經工程改造之免疫細胞、及使用該等經工程改造之免疫細胞治療疾病的方法。

Description

獲得腫瘤特異性T細胞受體之方法 【以ASCII文字檔提交序列表】
以下以ASCII文字檔提交的內容之全文係以引用方式併入本文中：序列表的電腦可讀取形式(CRF)(檔案名稱：776902000342SEQLIST.TXT，記錄日期：2019年4月11日，大小：426KB)。
本發明係關於癌症免疫療法之領域。具體而言，本發明提供獲得TCR之方法、腫瘤特異性TCR、經工程改造之免疫細胞、醫藥組成物、及用於治療癌症之套組。
與血液性癌症不同，實體腫瘤缺乏由一般嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor,CAR)辨識的細胞表面抗原。來自實體腫瘤的細胞內抗原必須藉由HLA分子以HLA-抗原表位複合物呈現在細胞表面上，該等HLA-抗原表位複合物係由腫瘤特異性T細胞表面上的T細胞受體(T cell receptor,TCR)特異性辨識，從而由腫瘤特異性T細胞引發抗腫瘤細胞毒性。
在2018年2月前，有75項關於過繼(adoptive)免疫細胞的臨床試驗，該等過繼免疫細胞經工程改造而具有腫瘤特異性TCR， 以用於治療癌症。標靶包括腫瘤相關抗原、腫瘤相關病毒抗原、及新抗原。適應症包括許多常見類型的實體腫瘤。目前在臨床試驗中的TCR-T細胞之實例包括靶向WT1/HLA-A*0201複合物之TCR-T(Juno Therapeutics)，其係用於治療急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)及非小細胞肺癌；靶向MAGE-A3/A6/HLA-DPB1*0401複合物之TCR-T(Kite)，其係用於治療惡性實體腫瘤；及靶向MAGE-A4/HLA-A*0201之TCR-T(Adaptimmune)，其係用於治療惡性實體腫瘤。
在本文中所參照之所有出版物、專利、專利申請案、及已公開專利申請案之揭露全文特此以引用方式併入本文中。
本發明提供方法、組成物、及套組以用於獲得一或多種特異性辨識來自個體之腫瘤抗原肽的T細胞受體(TCR)，該個體已在臨床上受益於免疫療法，諸如多抗原特異性細胞療法(Multiple Antigen Specific Cell Therapy，「MASCT」)。
本申請案之一個態樣提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之T細胞受體(TCR)的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一樹突細胞(dendritic cell,DC)群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群， 其中至少約10%的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(MASCT)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群之間的比率不大於約30：1(諸如約10：1至約20：1、或約15：1、或約20：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(例如，IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，該第一共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該第一共培養基包含IL-2及抗PD-1抗體。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(antigen presenting cell,APC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素。在一些實施例中，該細胞激素為IFNγ。在一些實施例 中，該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，IL-2或複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)及可選地一或多種細胞激素(例如，IL-2或複數種細胞激素)添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該抗CD3抗體係OKT3。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該一或多種細胞激素添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該一種或細胞激素包含IL-2。在一些實施例中，該免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體(例如，SHR-1210)。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該方法進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(APC)之群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。在一些實施例中，該等 APC係PBMC、DC、或細胞系APC。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群之間的比率係約1：1至約20：1。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群共培養約5至9天。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及抗CD3抗體。在一些實施例中，該第三共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及OKT3。在一些實施例中，該第三共培養基包含IL-2及OKT3。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次、兩次、或三次)。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該複數種腫瘤抗原肽係複數種合成腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該複數種腫瘤抗原肽不是獲自細胞樣本。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該複數種腫瘤抗原肽包含(多種)一般腫瘤抗原肽、(多種)癌症類型特異性抗原肽、及/或新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種新抗原肽。在一些實施例中，該複數種腫瘤抗原肽包含新抗原肽(例如，由新抗原肽組成)。在一些實施例中，該複數種腫瘤抗原肽包含至少約5種(例如，至少約10、20、30、40、或更多種)不同腫瘤抗原肽。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該目標腫瘤抗原肽係衍生自選自由下列所組成之群組的腫瘤抗原：hTERT、p53、 存活素(Survivin)、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該方法進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該次世代定序係單細胞定序。在一些實施例中，該次世代定序係批量定序(bulk sequencing)。在一些實施例中，該定序步驟包含對該等腫瘤抗原特異性T細胞的批量樣本進行定序、及對複數個腫瘤抗原特異性T細胞進行單細胞定序。在一些實施例中，該定序步驟包含該等腫瘤抗原特異性T細胞之第一部分的批量定序，以提供複數個編碼TCRα及TCRβ之基因；及該等腫瘤抗原特異性T細胞之第二部分的單細胞定序，其提供該複數個編碼TCRα及TCRβ之基因的同源配對資訊，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供複數種TCR。在一些實施例中，在該次世代定序之前，將該等腫瘤抗原特異性T細胞用載有該目標腫瘤抗原肽之APC刺激。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有部分反應(partial response,PR)、完全反應 (complete response,CR)、或疾病穩定(stable disease,SD)。在一些實施例中，該MASCT包含：將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該MASCT包含：(i)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽，該初始共培養基包含一或多種(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及(ii)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。在一些實施例中，該MASCT包含：(i)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；及(ii)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。在一些實施例中，該個體先前已接受該MASCT至少三次。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，同時獲得特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽之TCR。
在一些根據上述方法中任一者之實施例中，該方法進一步包含：在宿主免疫細胞中表現各對編碼TCRα及TCRβ之基因，以提供表現TCR之經工程改造之免疫細胞；及評估該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的反應。進一步提供的是一種使用上述方法 獲得特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其中基於表現該TCR之該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的該反應來選擇該TCR。在一些實施例中，該方法進一步包含判定該TCR的HLA限制。在一些實施例中，該TCR具有亞洲人中主要的HLA單倍型(haplotype)限制。在一些實施例中，該方法進一步包含該TCR之親和力成熟。在一些實施例中，該方法進一步包含增強該TCR中之TCRα鏈及TCRβ鏈之配對。在一些實施例中，該方法進一步包含增強該TCR之該表現。在一些實施例中，該目標腫瘤抗原肽係衍生自CEA、RSG-5、或HPV18-E7。
亦提供的是一種腫瘤特異性TCR，其係使用上述方法中任一者獲得。
本申請案之另一個態樣提供一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：4、10、及16之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、及19之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列；(b)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：22、28、34、40、46、及52之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、19、25、31、37、43、49、及55之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列；或(c)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：58、64、70、76、87、及93之胺 基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：61、67、73、79、90、及96之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該腫瘤特異性TCR包含：(a)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；(b)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(c)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(d)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；(e)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；(f)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列；(g)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列；(h)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；(i)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列；及 包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；(j)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列；(k)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；(l)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(m)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(n)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；或(o)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列。
進一步提供的是一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：5、11、及17之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：8、14、及20之胺基酸序列中任一者之CDR；(b)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：23、29、35、41、47、及53之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：26、32、38、44、50、及56之胺基酸序列中任一者之CDR；或(c)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：59、65、71、77、88、及 94之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者之CDR。
在一些根據上述腫瘤特異性TCR中任一者之實施例中，該腫瘤特異性TCR係人類TCR。在一些實施例中，該腫瘤特異性TCR係嵌合TCR，諸如鼠源化(murinized)TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。
在一些根據上述腫瘤特異性TCR中任一者之實施例中，該腫瘤特異性TCR包含：(a)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：5、11、及17之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：8、14、及20之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；(b)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：23、29、35、41、47、及53之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：26、32、38、44、50、及56之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；或(c)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：59、65、71、77、88、及94之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列。
亦提供的是一種單離核酸，其編碼根據上述腫瘤特異性TCR中任一者之腫瘤特異性TCR之該TCRα鏈及/或該TCRβ鏈；一種載體，其包含該(等)單離核酸。
本申請案之一個態樣提供一種經工程改造之免疫細胞，其包含上述根據腫瘤特異性TCR中任一者之腫瘤特異性TCR、單離核酸、或載體。
在一些實施例中，該免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，提供一種醫藥組成物，其包含根據上述經工程改造之免疫細胞中任一者之經工程改造之免疫細胞、及醫藥上可接受之載劑。
在一些實施例中，提供一種治療個體中癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的根據上述醫藥組成物中任一者之醫藥組成物。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR之庫，該等腫瘤特異性TCR係使用根據上述方法中任一者之方法獲得。
進一步提供的是套組、藥物、及製品，其包含如上所述的組成物(諸如單離核酸、載體、及經工程改造之免疫細胞)中任一者。
由隨後的實施方式及隨附申請專利範圍，本發明之此等及其他態樣及優點將變得顯而易見。應了解的是，本文所述的各種實施例之一項、一些、或所有性質可經組合以形成本發明之其他實施例。
圖1顯示用於選殖複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的例示性方法概述。
圖2顯示經MASCT治療之轉移性子宮頸癌患者的臨床數據。下圖顯示患者於2013年12月(進行任何MASCT治療之前)、 2016年11月(進行MASCT而達到疾病穩定狀態之後)、及2017年11月進行的ECT結果。箭頭及圓圈指出右骶髂關節骨上的轉移部位，其顯示回應於MASCT治療而轉移性腫瘤減少且沒有額外轉移。
圖3A至圖3B顯示如ELISPOT所判定，在經過客製化MASCT治療之後，患者之PBMC對子宮頸癌抗原肽池(肽池)、及該池中各腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。W/O=未經過任何抗原肽刺激下的反應。ENV係指用不相關肽的實驗。虛線指示無升高免疫反應的臨限，如由每200,000個細胞之斑點數(反映IFNγ分泌水平)測量。圖3B顯示患者之PBMC對HPV18-E7、RGS-5、及CEA肽的一致強烈免疫反應。
圖4顯示如實例2所述的用於製備腫瘤抗原特異性T細胞之例示性方法(「方法2」)。圖5顯示在腫瘤抗原特異性T細胞之製備中各種時間點的細胞增生。圖6A至圖6B顯示在各種共培養樣本中的IFNγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。
圖7顯示如實例2所述的用於製備腫瘤抗原特異性T細胞之圖4例示性方法的最佳化(「方法2m」)。圖8顯示在腫瘤抗原特異性T細胞之製備中各種時間點的細胞增生。圖9A至圖9B顯示在各種共培養樣本中的IFNγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。圖9C顯示在各種共培養樣本中的IFNγ+TNFα+腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。
圖10顯示經腫瘤抗原肽之各者刺激的腫瘤抗原特異性細胞中之IFNγ+CD4+細胞及IFNγ+CD8+細胞的百分比。使用來自已在 臨床上受益於MASCT的患者之PBMC、及衍生自CEA、RGS5、及HPV18-E7之腫瘤抗原肽之池，製備腫瘤抗原特異性細胞。圖11顯示在各種T細胞樣本中的獨特TCR殖株型(clonotype)之頻率，其係藉由次世代定序判定。
圖12彙總來自腫瘤抗原特異性T細胞製備(使用來自已臨床上受益於MASCT的患者之不同PBMC樣本)的可能分別對CEA、RGS5、及HPV18-E7肽具特異性的獨特TCRα及TCRβ序列殖株型之數目。基於如圖11所示的各種樣本中表現頻率模式，選擇殖株型。藉由批量T細胞樣本的次世代定序獲得結果。
圖13顯示HPV18-E7、RGS-5、及CEA肽之片段的子池，將其針對腫瘤抗原特異性T細胞的特異性免疫反應篩選。顯示RGS5-OLP5肽會引發腫瘤抗原特異性T細胞的最強烈特異性反應，該等腫瘤抗原特異性T細胞係使用方法2及方法2m製備。圖14A顯示在使用方法2m製備的腫瘤抗原特異性T細胞經過抗原肽片段子池之各者刺激之後，IFNγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞的百分比。圖14B顯示在使用方法2製備的腫瘤抗原特異性T細胞經過抗原肽片段子池之各者刺激之後，IFNγ+TNFα+腫瘤抗原特異性T細胞的百分比。
圖15A至圖15B顯示自藉由如實例3所述之方法2或方法2m製備的腫瘤抗原特異性T細胞的冷凍儲備液製備腫瘤抗原特異性T細胞的例示性方法。圖16顯示在腫瘤抗原特異性T細胞之製備中各種時間點的細胞增生。圖17A顯示在各種共培養樣本中的IFNγ+CD3+ 腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。圖17B顯示在各種共培養樣本中的IFNγ+TNFα+腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。
圖18A至圖18B顯示在各種T細胞樣本中的獨特TCRα及TCRβ殖株型之頻率，其係藉由次世代定序判定。
圖19顯示使用iPair分析儀藉由單細胞定序判定的TCRα及TCRβ配對結果。在96孔盤中產生成功配對的TCRα及TCRβ序列之孔係以灰色顯示，並標有孔位置編號。只有產生TCRβ序列的孔係以淺灰色顯示，且只有產生TCRα序列的孔係以深灰色顯示。
圖20顯示如實例2所述的用於製備腫瘤抗原特異性T細胞之例示性方法。
圖21A顯示在腫瘤抗原特異性T細胞之製備中各種時間點的細胞增生。圖21B顯示在富集步驟之前及之後的IFNγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞之百分比。
圖22A至圖22B顯示在各種共培養樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞群之細胞增生及百分比。
圖23顯示用於腫瘤特異性TCR的例示性驗證步驟。
圖24顯示例示性TCR構築體。
圖25A至圖25B顯示例示性TCR構築體之組成及序列。
圖26A至圖26D顯示09B03及相關TCR構築體的驗證結果。
圖27A至圖27D顯示P09E06及相關TCR構築體的驗證結果。
圖28A至圖28C顯示09B12及相關TCR構築體的驗證結果。
圖29A至圖29C顯示09E01及相關TCR構築體的驗證結果。
圖30A至圖30D顯示10F04及相關TCR構築體的驗證結果。
圖31A至圖31C顯示33D05及相關TCR構築體的驗證結果。
圖32A至圖32D顯示P09B08及相關TCR構築體的驗證結果。
圖33A至圖33G顯示09H05及相關TCR構築體的驗證結果。
圖34A至圖34G顯示09D01及相關TCR構築體的驗證結果。
圖35A至圖35G顯示33A02及相關TCR構築體的驗證結果。
圖36顯示如ELISPOT檢定所判定，在經過MASCT治療之後，患者之PBMC對腫瘤抗原肽池、及該池中各腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。百分比指示減少的肽濃度。例如，1/20基本肽指示在20倍稀釋下的一般腫瘤抗原肽池。
圖37顯示用於使用來自患者SMZ之PBMC製備腫瘤抗原特異性T細胞之例示性兩輪式方法之第1輪規程。
圖38A顯示在第1輪中各種時間點的細胞增生。圖38B顯示在富集步驟之後的IFNγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞群之百分比。
圖39A至圖39E顯示在第1輪之各種共培養樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞群之百分比。圖39F顯示在第1輪結束時所獲得之IFNγ+CD4+腫瘤抗原特異性T細胞中的效應T細胞群。
圖40顯示用於使用來自患者SMZ之PBMC製備腫瘤抗原特異性T細胞之例示性兩輪式方法之第2輪規程。
圖41A顯示在第2輪中各種時間點的T細胞及腫瘤特異性T細胞數目。圖41B至圖41C顯示在第2輪之各種共培養樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞群之百分比。
圖42顯示在第1輪及第2輪之各種時間點的T細胞及腫瘤特異性T細胞數目。
本申請案提供使用PBMC或T細胞選殖複數種特異性辨識一或多種腫瘤抗原肽之T細胞受體(TCR)的平台，該等PBMC或T細胞係來自已在臨床上受益於免疫療法的個體，免疫療法諸如多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)。本文所述方法包含富集來自T細胞與抗原負載樹突細胞(「DC」)之共培養物的活化T細胞，隨後將該等經富集之活化T細胞與抗原負載DC共培養，以提供用於批量及/或單細胞定序的腫瘤抗原特異性T細胞，以獲得複數種成對TCRα及TCRβ基因。T細胞之來源、以及本文所述方法中的富集及共培養步驟有助於特異性反應於目標腫瘤抗原肽的腫瘤抗原特異性T細胞達高百分比 (例如，至少約1%或更高以用於T細胞樣本之批量定序、或至少10%或更高以用於單個T細胞定序)，其對於藉由次世代定序獲得主要TCR殖株型之TCRα及TCRβ基因的同源配對資訊係必要的。亦提供腫瘤特異性TCR、表現該等TCR之經工程改造之免疫細胞、及使用該等經工程改造之免疫細胞治療癌症的方法。
目前正在開發中及在所屬技術領域在臨床試驗中的TCR一般係選殖自健康人類捐贈者的PBMC，該等PBMC經預定的腫瘤抗原表位肽刺激。因此，用表現此類TCR之T細胞治療的患者之臨床反應並無法預測。相比之下，本申請案之TCR係獲自已在臨床上受益於MASCT治療的個體，其指示靶向目標腫瘤抗原肽中所含之(多種)腫瘤抗原表位的TCR之抗腫瘤潛能。
另外，目前已知選殖自健康人類捐贈者的PBMC之TCR與其目標腫瘤抗原表位-HLA複合物具有低親和性。需要最佳化TCRα及TCRβ鏈的胺基酸序列以改善TCR的親和性，其增加TCR交叉反應、偏離目標(off-target)副作用、及嚴重毒性的風險。相比之下，由於本申請案的TCR係用已展示臨床反應的癌症患者進行選殖，本文所述的TCR可能不需要進行親和性最佳化，且因此確保改善臨床上的安全性。
在一些實施例中，TCR係選殖自屬於一種族群體的個體，以提供具有反映該種族群體主要HLA單倍型的HLA限制之TCR。目前臨床試驗中大多數TCR為單倍型的HLA限制性，諸如高加索族群中主要的HLA-DPB1*0401及HLA-A*0201。本文所述方法可用於獲 得針對任何所關注種族群體的HLA限制性TCR，其包括例如可更有效治療亞洲患者的HLA-A*1101或HLA-A*2402限制性TCR。
因此，本申請案之一個態樣提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之T細胞受體(TCR)的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一樹突細胞(DC)群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，在該方法中同時獲得特異性辨識複數種目標腫瘤抗原之TCR。
本申請案主張於2018年4月13日申請之國際專利申請案第PCT/CN2018/082947號之優先權權益，其揭露全文以引用方式併入本文中。
I.定義
除非另有定義如下，否則用語在本文中係如所屬技術領域中所通常使用般使用。
如本文中所使用，「複數種腫瘤抗原肽(a plurality of tumor antigen peptides)」、「多種腫瘤抗原肽(multiple tumor antigen peptides)」、「腫瘤抗原肽之池(a pool of tumor antigen peptides)」、及「腫瘤抗原肽池(a tumor antigen peptides pool)」可互換使用，以指二或更多種腫瘤抗原肽之組合。
如本文中所使用，「載有複數種腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(antigen presenting cells loaded with a plurality of tumor antigen peptides)」及「載有一或多種腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(antigen presenting cells loaded with one or more tumor antigen peptides)」亦稱為「抗原負載抗原呈現細胞(antigen-loaded antigen presenting cells)」。載有複數種腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(「APC」)係在複數種腫瘤抗原肽中具有增強的一或多種腫瘤抗原肽或其片段呈現之APC。在一些實施例中，抗原負載APC係抗原負載DC。在一些實施例中，抗原負載APC係抗原負載PBMC。
如本文中所使用，「活化T細胞(activated T cells)」係指具有辨識至少一種腫瘤抗原肽之T細胞受體的單株(例如，編碼相同TCR)或多株(例如，具有編碼不同TCR之殖株)T細胞之群。活化T細胞可含有一或多種T細胞亞型，其包括但不限於細胞毒性T細胞、 輔助T細胞、自然殺手T細胞、γδ T細胞、調節性T細胞、及記憶T細胞。
「腫瘤抗原特異性T細胞(tumor antigen-specific T cells)」及「腫瘤特異性T細胞(tumor specific T cells)」在本文中可互換使用。
如本文中所使用，「T細胞受體(T cell receptor)」或「TCR」係指內源性或經工程改造之T細胞受體，其包含胞外抗原結合域，該胞外抗原結合域結合至結合在MHC分子中的特異性抗原表位。TCR可包含TCRα多肽鏈及TCRβ多肽鏈。「腫瘤特異性TCR(tumor-specific TCR)」係指特異性辨識腫瘤細胞所表現之腫瘤抗原的TCR。「TCR-T」係指表現重組TCR之T細胞。
如本文中所使用，「免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor)」係指抑制或阻斷在免疫細胞(諸如T細胞)或腫瘤細胞上之抑制性免疫檢查點分子的藥劑(包括抗體)。「免疫檢查點分子(immune checkpoint molecules)」包括提升對腫瘤細胞之免疫信號的分子(即，「共刺激分子(co-stimulatory molecules)」)、或降低對腫瘤細胞之免疫信號的分子(即，「抑制性免疫檢查點分子(inhibitory immune checkpoint molecules)」)。
如本文中所使用，「治療(treatment/treating)」係獲得有益或所欲結果(包括臨床結果)的方式。針對本發明之目的，有益或所欲臨床結果包括但不限於下列中之一或多者：減少又一種疾病所導致的症狀、消減疾病的程度、穩定疾病(例如，預防或延遲疾病的惡 化)、預防或延遲疾病的擴散(例如，轉移)、預防或延遲疾病的發生或復發、延遲或減緩疾病的進展、改善疾病狀態、提供疾病的(部分或完全)緩解、降低一或多種治療疾病所需之其他藥物的劑量、延遲疾病的進展、增加生活品質、及/或延長存活。「治療(treatment)」亦涵蓋的是癌症病理結果的減少。本發明之方法設想到此等治療態樣中之任一或多者。
如本文中所使用，「延遲(delaying)」癌症的發展意指推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定、及/或延後疾病的發展。此延遲可為不同時間長度，其取決於疾病史及/或正接受治療之個體。如對於所屬技術領域中具有通常知識者而言為明顯的，足夠或顯著的延遲實際上可涵蓋預防，因為個體不會發展疾病。「延遲」癌症發展的方法當與未使用該方法比較時，是降低給定時段中疾病發展的可能性且/或降低給定時段中疾病程度的方法。此類比較一般是基於臨床研究、使用統計上顯著的個體數。可使用標準方法偵測癌症發展，標準方法包括但不限於電腦斷層掃描(CAT掃描)、磁共振造影(MRI)、腹部超音波、凝血測試、動脈攝影、或活檢。發展亦可指最初可能為不可偵測的癌症進展，且包括發生、復發及、發作。
用語「個體(individual)」、「對象(subject)」、及「患者(patient)」在本文中可互換使用，以描述哺乳動物，包括人類。個體包括但不限於人類、牛、馬、貓、犬、嚙齒動物、或靈長類動物。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體罹患諸如癌症之疾病。在一些實施例中，個體需要治療。
如所屬技術領域中所了解，「有效量(effective amount)」係指足以產生所欲治療成果(例如，降低一或多種癌症症狀之嚴重性或減少其持續時間、穩定一或多種癌症症狀之嚴重性、或消除一或多種癌症症狀)的組成物(例如抗原負載DC、活化T細胞、或表現TCR之經工程改造之免疫細胞)之量。就治療用途而言，有益或所欲結果包括例如減少一或多種疾病導致的症狀(生物化學、組織學、及/或行為方面)，該症狀包括在疾病發展期間呈現的併發症及中間病理表型；增加罹患疾病者的生活品質；降低其他治療疾病所需藥物之劑量；增強另一種藥物之效果；延遲疾病的進展；及/或延長患者的存活。
「輔助性治療(adjuvant setting)」係指其中個體已具有癌症病史且通常(但不一定)已對療法有反應的臨床環境，療法包括但不限於手術(例如，手術切除)、放射療法、及化療。然而，由於其癌症病史，將此等個體視為處於疾病發展的風險。「輔助性治療(adjuvant setting)」中的治療或投予係指後續治療模式。風險程度(例如，在輔助性治療中的個體係視為「高風險」或「低風險」時)係取決於數個因素，最常見的是首次治療時的疾病程度。
「新輔助性治療(neoadjuvant setting)」係指其中方法係在主要/決定性療法之前進行的臨床環境。
如本文中所使用，「組合療法(combination therapy)」意指第一藥劑係與另一種藥劑配合投予。「與...配合(in conjunction with)」係指一種治療型態在除了另一種治療型態之外下投予，諸如本文所述的組成物(例如抗原負載DC、活化T細胞、或表現TCR之經工程改 造之免疫細胞)在除了另一種藥劑(諸如免疫檢查點抑制劑)之投予外投予至相同個體。因此，「與...配合」係指一種治療型態在另一種治療型態遞送至個體之前、期間、或之後投予。將此類組合視為屬於單一治療方案(regimen或regime)之部分。
如本文中所使用，用語「同時投予(simultaneous administration)」意指在組合療法中的第一療法及第二療法係以不多於約15分鐘(諸如不多於約10、5、或1分鐘中之任一者)的時間間隔投予。當第一療法及第二療法係同時投予時，第一療法及第二療法可含在相同組成物(例如，包含第一療法及第二療法兩者之組成物)中或不同組成物(例如，第一療法在一種組成物中，而第二療法係含在另一種組成物中)中。
如本文中所使用，用語「依序投予(sequential administration)」意指在組合療法中的第一療法及第二療法係以多於約15分鐘(諸如多於約20、30、40、50、60、或更多分鐘中之任一者)的時間間隔投予。可先投予第一療法或第二療法。第一療法及第二療法可含在不同組成物中，該等不同組成物可含在相同或不同包裝或套組中。
如本文中所使用，用語「並行投予(concurrent administration)」意指組合療法中的第一療法之投予與第二療法之投予彼此重疊。
如本文中所使用，以「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」或「藥理上相容(pharmacologically compatible)」意指不 是在生物或其他方面上非所欲的材料，例如，可將該材料併入投予至個體的醫藥組成物中，而不會造成任何顯著非所欲的生物作用，或以有害方式與含有其之組成物中的任何其他組分相互作用。醫藥上可接受之載劑或賦形劑較佳地已符合所需毒物測試標準及製造測試標準，且/或係包括於美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug administration)所製作的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)。
以下定義可用於評估基於目標病變的反應：「完全反應(complete response)」或「CR」係指所有目標病變消失；「部分反應(partial response)」或「PR」係指目標病變之最長直徑總和(SLD)減少至少30%，其係以基線SLD作為參考；「疾病穩定(stable disease)」或「SD」係指目標病變之縮小不足以符合PR的條件，其增加亦不足以符合PD的條件，其係以自治療開始以來的最低點(nadir)SLD作為參考；且「疾病進展(progressive disease)」或「PD」係指目標病變之SLD增加至少20%(其係以自治療開始以來所記錄的最低點SLD作為參考)，或是存在一或多個新病變。
以下反應評估之定義可用於評估非目標病變：「完全反應(complete response)」或「CR」係指所有非目標病變消失；「疾病穩定(stable disease)」或「SD」係指不符合CR或PD的條件之一或多個非目標病變持續存在；且「疾病進展(progressive disease)」或「PD」係指現有(多個)非目標病變的「明確進展(unequivocal progression)」，或者將一或多個新病變的出現視為疾病進展(如果完 全基於(多個)非目標病變的進展針對一時間點來評估個體的PD，則需要符合額外的標準)。
如本文中所使用，用語「細胞(cell)」、「細胞系(cell line)」、及「細胞培養物(cell culture)」可互換使用，且所有此類名稱皆包括子代。據了解，由於人為或意外的突變，所有子代之DNA含量可能不完全相同。具有與原始細胞相同的功能或生物活性之變體子代係包括在內。
用語「肽(peptide)」係指不多於約100個胺基酸之胺基酸聚合物(包括蛋白質之片段)，其可係直鏈或支鏈，包含經修飾胺基酸，且/或以非胺基酸間隔。該用語亦涵蓋經過自然修飾或介入修飾的胺基酸聚合物，其包括例如雙硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾。亦包括在此用語內的是(例如)含有一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)之肽、以及所屬技術領域中已知的其他修飾。本文所述的肽可天然存在，即，獲自或衍生自天然來源(例如血液)，或經過合成(例如，經化學合成、或藉由重組DNA技術合成)。
本文中所使用的用語「抗體(antibody)」係以最廣泛的意義使用，且具體涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其等展現所欲生物活性。
「抗體片段(antibody fragment)」包含完整抗體之部分，較佳地包含其抗原結合區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、 及Fv片段；雙價抗體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文中所使用，用語「特異性結合至(specifically binds to)」、「辨識(recognizes)」、「特異性辨識(specifically recognizes)」、「靶向(targets)」、或「對...具特異性(specific for)」係指可測量且可再現的相互作用，諸如目標與抗體之間、或受體與配體之間、或受體與表位/MHC複合物之間的結合，其判定在分子(包括生物分子)的異質群體存在下目標的存在。例如，結合至或特異性結合至目標表位的TCR係以較大親合性、結合性、更加容易地、且/或以更長持續時間結合目標表位/MHC複合物(相較於其結合至其他表位/MHC複合物)的TCR。在一個實施例中，如所測量(例如藉由放射免疫檢定法(RIA))，TCR與不相關表位/MHC複合物的結合程度小於TCR與目標表位/MHC複合物的結合之約10%。在某些實施例中，特異性結合至目標表位(即，目標表位/MHC複合物)的TCR具有
Figure 108112961-A0202-12-0027-1
1μM、
Figure 108112961-A0202-12-0027-5
100nM、
Figure 108112961-A0202-12-0027-4
10nM、
Figure 108112961-A0202-12-0027-3
1nM、或
Figure 108112961-A0202-12-0027-2
0.1nM之解離常數(Kd)。在某些實施例中，TCR特異性結合至來自不同物種之蛋白質中保守的蛋白質上之表位。在另一實施例中，特異性結合可包括但不需要排他性結合。
如本文中所使用的用語「單離核酸(isolated nucleic acid)」旨在意指基因組、cDNA、或合成來源或其一些組合之核酸，由於其來源，該「單離核酸」(1)與其中在自然界發現之「單離核酸」 的多核苷酸之全部或部分不相關聯，(2)係可操作地連接至其在自然界中不會連接的多核苷酸，或(3)不會以更大序列之部分存在於自然界中。
據了解，本文所述的本發明之態樣及實施例包括「由...所組成(consisting)」及/或「基本上由...所組成(consisting essentially of)」態樣及實施例。
本文中所提及之「約(about)」一值或參數包括(並描述)關於該值或參數本身的變動。例如，提及「約X」的描述包括「X」的描述。
本文所使用的用語「約X至Y(about X-Y)」具有與「約X至約Y(about X to about Y)」相同的意義。
如本文中所使用，提及「不/非(not)」為一值或參數通常意指並描述一值或參數「以外(other than)」。例如，該方法不用於治療X類型之癌症意指該方法係用於治療X以外的類型之癌症。
如本文及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
II.獲得腫瘤特異性TCR之方法
本申請案提供獲得複數種特異性辨識一或多種來自個體的PBMC或T細胞之目標腫瘤抗原肽之T細胞受體(TCR)的方法，該個體已在臨床上受益於免疫療法。在一些實施例中，免疫療法係過繼性T細胞療法，其包含向個體投予有效量的特異性辨識目標腫瘤抗原肽或其片段的活化T細胞。在一些實施例中，免疫療法係多抗原特異 性細胞療法(「MASCT」)，其包含向個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含一或多種目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，獲得特異性辨識單一目標腫瘤抗原肽或其片段(例如，目標腫瘤表位)的TCR。在一些實施例中，使用該方法同時獲得特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽之TCR。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含使腫瘤抗原特異性T細胞群經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；其中該腫瘤抗原特異性T細胞群係藉由下列製備：i)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；ii)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；及iii)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群；且其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)將經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及b)使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該經富集之活化T細胞群係藉由下列製備：i)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；及ii)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；且其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)使第一共培養物經受富集程序以獲得經富集之活化T細胞，該第一共培養物包含載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群及來自個體之T細胞群；b)將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及 c)使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；且其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一 些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該第一共培養基包含IL-2及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)達至少約6個月(例如，至少約1年、2年、或更多年)。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素或細胞表面分子；c)第二共培養步 驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識IFNγ。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含複數種細胞激素(例如，IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第 二DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；並將抗CD3(例如，OKT-3)抗體及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目 標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載 有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群；d)第三共培養步驟，其包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)之群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及e)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素， 例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群 與載有該目標腫瘤抗原肽之該APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC或DC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)；c)第二共培養步驟，其包含在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群；d)第三共培養步驟，其包含：將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有目標腫瘤抗原肽之第一APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養約5至9天(例如，7天)；向該第三共培養物添加載有目標腫瘤抗原肽之第二APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群並培 養約5至9天(例如，7天)；及向該共培養物添加載有目標腫瘤抗原肽之第三APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群並培養約5至9天(例如，7天)，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及e)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該 目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第一APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該等APC係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群；d)篩選步驟，其包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC群；e)第三共培養步驟，其包含：將該等腫瘤抗原特異性T細 胞之群與載有目標腫瘤抗原肽之該APC群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及f)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與載有 該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)。
本文所述方法中任一者可用於同時獲得特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽之TCR，其係藉由在第一共培養步驟、富集步驟、及第二共培養步驟中使用載有複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC或DC)。在一些實施例中，載有個別目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)係用於第三共培養步驟中，以製備個別腫瘤抗原特異性T細胞群以用於定序。在一些實施例中，載有複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)係用於第三共培養步驟中，以製備匯集腫瘤抗原特異性T細胞群以用於定序。在一些實施例中，使用該方法獲得特異性辨識至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、或更多種目標腫瘤抗原肽中任一者之TCR。
因此，在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該複數種目標腫瘤抗原肽之第一DC群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該複數種目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對來自該複數種目標腫瘤抗原肽之一或多種目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基 因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(「MASCT」)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該等目標腫瘤抗原肽。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二 共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，該方法進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，該一或多種目標腫瘤抗原肽係來自該複數種腫瘤抗原肽，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，該方法進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤 抗原肽之APC之該群。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)。
TCR可選殖自已在臨床上受益於MASCT的任何個體，該MASCT包括「MASCT」小節中所述之MASCT方法中之任一者或組合。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有部分反應(PR)達至少約6個月(例如，至少約1年、2年、或更多年)。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有完全反應(CR)達至少約6個月(例如，至少約1年、2年、或更多年)。在一些實施例中，在接受該MASCT後，該個體具有疾病穩定(SD)。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)可選地向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之DC，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；b)將載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群與第一T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群；c)向該個體投予有效量的該等活化T細胞；d)在投予該等活化T細胞後達到PR、CR、或SD後，自該個體獲得第二T細胞群；e)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與該第二T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；f)富集步驟，其包含使該共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；g)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及h)定序步驟，其 包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該第二T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該第二T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞 激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，該方法進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，該一或多種目標腫瘤抗原肽係來自該複數種腫瘤抗原肽，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，該方法進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)可選地向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC；d)將載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群與第一T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群；e)向該個體投予有效量的該等活化T細胞；f)在投予該等活化T細胞後達到PR、CR、或SD後，自該個體獲得第二T細胞群；g)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與該第二T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；h)富集步驟，其包含使該共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；i)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及j)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或 10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該第二T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該第二T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群之間的比率係約1：1 至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，該方法進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，該一或多種目標腫瘤抗原肽係來自該複數種腫瘤抗原肽，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，該方法進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)可選地向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群與第一T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑；及在該共培養開始後約3至7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培 養物，從而獲得該活化T細胞群；c)向該個體投予有效量的該等活化T細胞；d)在投予該等活化T細胞後達到PR、CR、或SD後，自該個體獲得第二T細胞群；e)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與該第二T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；f)富集步驟，其包含使該共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；g)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及h)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該第二T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該第二T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如， IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，該方法進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，該一或多種目標腫瘤抗原肽係來自該複數種腫瘤抗原肽，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群係在第三共培養基中共培 養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，該方法進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
在一些實施例中，提供一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含：a)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)可選地向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC；d)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群與第一T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及在該共培養開始後約3至7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群；e)向該個體投予有效量的該等活化T細胞；f)在投予該等活化T細胞後達到PR、CR、或SD後，自該個體獲得第二T細胞群；g)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群與該第二T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；h)富集步驟，其包含使該共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；i)第二共培養 步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%(例如，至少約20%、或至少約50%)的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及j)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序(例如，單細胞定序)，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該第二T細胞群存在於PBMC中。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該第二T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體，諸如SHR-1210)。在一些實施例中，該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該複數種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，DC或PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(例如，IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、2：1、或4：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負 載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約4：1)。在一些實施例中，該方法進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，該一或多種目標腫瘤抗原肽係來自該複數種腫瘤抗原肽，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群共培養約5至9天(例如，約7天)。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟(例如，一次或兩次)。在一些實施例中，該方法進一步包含：識別來 自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
在一些實施例中，TCR係選殖自對MASCT方法有反應的個體，例如在該MASCT後CTC數量減少或CTC數量低的個體；具有疾病穩定(SD)、完全反應(CR)、或部分反應(PR)之臨床評估的個體。在一些實施例中，該個體保持PR、CR、或SD達至少約6個月(例如，至少約1年、2年、或更多年)。在一些實施例中，該個體對該目標腫瘤抗原肽具有強烈的特異性免疫反應。可使用所屬技術領域中任何已知的方法，例如藉由測量經過目標腫瘤抗原肽刺激後來自T細胞(或PBMC)的細胞毒性因子(諸如穿孔素或顆粒酶B)、或細胞激素釋放(諸如IFNγ或TNFα)之水平，判定對目標腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。可使用基於抗體的檢定法(諸如ELISPOT)來定量細胞毒性因子、或細胞激素(諸如IFNγ)水平。在一些實施例中，將回應於目標腫瘤抗原肽之來自T細胞(或PBMC)的細胞激素(諸如IFNγ)釋放水平標準化至參考物(諸如基線細胞激素釋放水平、或回應於不相關肽之來自T細胞(或PBMC)的非特異性細胞激素釋放水平)，以提供細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值。在一些實施例中，在ELISPOT檢定中，大於約1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中之任一者的細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值指示對目標腫瘤抗原肽的強烈特異性免疫反應。在一些實施例中，選殖TCR之方法進一步包含 判定個體中(諸如在該個體的PBMC樣本中)的複數種腫瘤抗原肽中各者之特異性免疫反應。
可自生物樣本單離T細胞，該生物樣本係來自接受MASCT後的個體。在一些實施例中，生物樣本係獲自經過一個週期的MASCT後之個體。在一些實施例中，生物樣本係獲自經過至少2、3、4、5、或更多個週期中之任一者的MASCT後之個體。在一些實施例中，在接受MASCT後至少約1週、2週、3週、4週、5週、6週、2個月、或3個月中之任一者後，自個體獲得生物樣本。在一些實施例中，在接受MASCT後不多於約6個月、3個月、2個月、1個月、或更少中任一者後，自個體獲得生物樣本。在一些實施例中，生物樣本係血液樣本。在一些實施例中，生物樣本係PBMC樣本。在一些實施例中，生物樣本係T細胞樣本。在一些實施例中，生物樣本係含有CTL的腫瘤樣本。可使用所屬技術領域中任何已知的方法，例如藉由流動式細胞測量術或離心方法，自生物樣本單離T細胞。在一些實施例中，對自生物樣本獲得的複數個T細胞就其對複數種腫瘤抗原肽的特異性免疫反應進行篩選，其係例如藉由用多聚體(諸如五聚體或dextramer)染色，或藉由判定細胞的細胞毒性因子(諸如穿孔素或顆粒酶B)、或細胞激素釋放(諸如IFNγ或TNFα)之水平。
T細胞特異性辨識的目標腫瘤抗原肽可係來自用於MASCT之(多個)腫瘤抗原肽池的任何腫瘤抗原肽或其片段。在一些實施例中，目標腫瘤抗原肽包含MHC-I限制性表位。在一些實施例中，目標腫瘤抗原肽包含MHC-II限制性表位。在一些實施例中，目標腫 瘤抗原肽係一般癌症腫瘤抗原肽。在一些實施例中，目標腫瘤抗原肽係癌症類型特異性腫瘤抗原肽。在一些實施例中，目標腫瘤抗原肽係新抗原肽。在一些實施例中，目標腫瘤抗原肽係衍生自選自由下列所組成之群組的腫瘤抗原：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。在一些實施例中，目標腫瘤抗原肽包含衍生自CEA、RGS5、或HPV18-E7的表位。
可使用任何已知的次世代定序方法對腫瘤抗原特異性T細胞進行定序，以提供複數對編碼TCRα及TCRβ的基因。在一些實施例中，次世代定序係單細胞次世代定序。在一些實施例中，次世代定序係批量次世代定序。在一些實施例中，定序步驟包含腫瘤抗原特異性T細胞之TCR之免疫組庫的次世代定序。在一些實施例中，定序步驟包含：擴增來自腫瘤抗原特異性T細胞(例如，單細胞或細胞群)之編碼TCRα及TCRβ的基因，以提供擴增核酸的樣本；及使該等擴增核酸經受次世代定序。在一些實施例中，使用PCR方法以特異性黏合至已知TCR可變域的引子，擴增編碼TCRα及TCRβ的基因。在一些實施例中，使用擴增子拯救多重PCR(amplicon rescued multiplex PCR，或arm-PCR)來擴增編碼TCRα及TCRβ的基因。參見例如美國專利第7,999,092號。在一些實施例中，使腫瘤抗原特異性T細胞經 受批量次世代定序數據及單細胞次世代定序，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ的基因。在一些實施例中，該定序步驟包含該等腫瘤抗原特異性T細胞之第一部分的批量定序，以提供複數個編碼TCRα及TCRβ之基因；及該等腫瘤抗原特異性T細胞之第二部分的單細胞定序，其提供該複數個編碼TCRα及TCRβ之基因的同源配對資訊，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供複數種TCR。
市售套組及服務可用於TCR的單細胞次世代定序，包括但不限於IPAR®(iReportoire)、IMMUNOSEQTM(Adaptive Biotech)、SMARTER® Human TCRa/b Profiling Kit(Clontech)、ION AMPLISEQ® Immune Repertoire and Assay Plus(Thermofisher)。例如，IPAR®方法包括兩個PCR擴增步驟，隨後進行次世代定序。簡言之，使腫瘤抗原特異性T細胞樣本在一或多個96孔盤中經受單細胞接種。在第一PCR步驟中，在96孔盤之各孔中執行RT-PCR，其採用巢式多重引子，該等引子覆蓋TCR之α及β基因座(locus)兩者，且在內部引子的5’端上包括共用(communal)正向及反向結合位。包括在C區基因引子上的是內嵌條碼(in-line barcode)，其作為盤識別符，使得多個96孔盤可在定序晶片(sequencing flow cell)上多工進行。在RT-PCR後，產物經拯救。使用雙索引引子執行第二PCR，該等雙索引引子完成在第一PCR期間引入的轉接子(adaptor)並提供盤位置資訊。在此步驟中，各孔(且因此各單細胞)係以獨特性條碼表示。在一些情況下，亦對來自其餘細胞(未經受單細胞接種者)的RNA執行各鏈的批量次世代定序。使用IPAR® Analyzer軟體分析定序數據，該軟體亦有利於單細 胞定序數據與批量定序數據之簡易比較。如IPAR® Analyzer所判定，基於各孔中的數據來獲得編碼TCRα及TCRβδ的基因之同源配對資訊。另外，參見例如iPair Analyzer User’s Guide,iRepertoire Inc.(docs.wixstatic.com/ugd/c9f231_3c322d131c084e908eea039c42304ff7.pdf)，其內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，在該次世代定序之前，該等腫瘤抗原特異性T細胞經載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)刺激(即，經刺激腫瘤抗原特異性T細胞)。在一些實施例中，將經載有目標腫瘤抗原肽之APC刺激的腫瘤抗原特異性T細胞分類，以單離IFNγ+ T細胞以用於次世代定序。在一些實施例中，使對照T細胞群經受次世代定序，以提供基線TCRα及TCRβ殖株型概況。在一些實施例中，對照T細胞群係來自個體的未經刺激PBMC。在一些實施例中，對照T細胞群係經一或多種不相關肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞。在一些實施例中，選擇僅在經刺激腫瘤抗原特異性T細胞之定序數據中識別出(但在對照T細胞群之定序數據中未識別出)的TCRα及TCRβ基因，以提供腫瘤特異性TCR。在一些實施例中，選擇在經刺激腫瘤抗原特異性T細胞之定序數據中(相較於在對照T細胞群之定序數據中)以至少約2x、5x、10x、20x、50x、100x、1000x、或更多中任一者的頻率存在之TCRα及TCRβ基因，以提供腫瘤特異性TCR。
在一些實施例中，在MASCT治療後不同時間，獲得來自個體的複數個T細胞群(例如，PBMC)。選擇自使用各T細胞群製 備的腫瘤抗原特異性T細胞所一致識別之TCRα及TCRβ基因，以提供腫瘤特異性TCR。在一些實施例中，如果在二或更多(諸如2、3、4、5、6、或更多)個腫瘤抗原特異性T細胞群的定序數據中發現TCRα及TCRβ基因，該等腫瘤抗原特異性T細胞群係使用來自個體的不同T細胞樣本製備，且該等TCRα及TCRβ基因係藉由單細胞定序配對，則選擇該對TCRα及TCRβ基因以提供腫瘤特異性TCR。
本文所述方法中任一者可包含下列步驟中之一或多者：(i)在宿主免疫細胞中表現各對編碼TCRα及TCRβ之基因，以提供表現TCR之經工程改造之免疫細胞；及評估該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的反應；(ii)判定各TCR辨識的抗原表位；(iii)判定各TCR的HLA限制(包括MHC I或MHC II限制、及可選地HLA單倍型限制)；(iv)判定各TCR的結合性及交叉反應性；(v)各TCR的親和力成熟；(vi)增強各TCR中TCRα及TCRβ鏈的配對；及(vii)增強各TCR的表現。獲得複數種特異性辨識來自個體之目標腫瘤抗原肽之TCR的例示性方法概述係顯示於圖1，該個體已在臨床上受益於MASCT。
在一些實施例中，合成包含各對TCRα及TCRβ基因之單離核酸。在一些實施例中，針對各對TCRα及TCRβ基因，合成編碼該TCRα基因之第一單離核酸、及編碼該TCRβ基因之第二單離核酸。在一些實施例中，TCRα及TCRβ基因經密碼子最佳化(例如，用於在人類細胞中表現)。在一些實施例中，TCRα及TCRβ基因之各者係可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，TCRα及TCRβ基因係可 操作地連接至相同啟動子。在一些實施例中，TCRα及TCRβ基因係可操作地連接至不同啟動子。在一些實施例中，將單離核酸併入載體中，諸如病毒載體，例如慢病毒載體(lentiviral vector)。
在一些實施例中，將單離核酸轉導(諸如藉由病毒載體、或藉由物理或化學方法)至宿主免疫細胞(諸如T細胞)中，以表現由TCRα及TCRβ基因編碼的TCR。在一些實施例中，宿主免疫細胞係CD3+細胞。在一些實施例中，宿主免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，宿主免疫細胞係選自由下列所組成之群組：PBMC、細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞、及調節性T細胞。在一些實施例中，檢定表現TCR的宿主免疫細胞對目標腫瘤抗原肽的特異性免疫反應，以用於驗證。在一些實施例中，宿主免疫細胞係衍生自細胞系。在一些實施例中，宿主免疫細胞係初代細胞。在一些實施例中，宿主免疫細胞係衍生自癌症患者。在一些實施例中，宿主免疫細胞係衍生自健康捐贈者。
進一步提供的是一種獲得特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其係使用如本文所述之獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法中之任一者，其中基於表現該TCR之經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的反應來選擇該TCR。
可使用所屬技術領域中任何已知的方法，判定TCR的HLA限制。參見例如Larche M.Methods Mol.Med.(2008),138：57-72。在一些實施例中，TCR為MHC I類限制性。在一些實施例中，TCR為MHC II類限制性。在一些實施例中，在一些實施例中，腫瘤特異性 TCR具有某些種族群體中主要的HLA單倍型限制，該等種族群體包括但不限於非洲人、非洲裔美國人、亞洲人、高加索人、歐洲人、西班牙裔、太平洋島民等。在一些實施例中，該TCR具有亞洲人中主要的HLA單倍型限制，例如HLA-A*1101或HLA-A*2402限制性TCR。在一些實施例中，該TCR具有高加索人中主要的HLA單倍型限制，例如HLA-DPB1*0401或HLA-A*0201限制性TCR。
可將在本文中所獲得之TCR進一步工程改造，以改善TCR的物理/化學性質及/或功能。例如，經工程改造之腫瘤特異性TCR可具有增強的表現水平、改善的穩定性、增強的與MHC目標腫瘤特異性抗原肽複合物之結合親和力、及/或增強的傳訊。在一些實施例中，基於使用TCR來接受免疫療法治療之個體的MHC亞型，將TCR工程改造。在一些實施例中，工程改造包含使TCR可變區中的一或多個位置突變。在一些實施例中，工程改造包含提供融合蛋白，該融合蛋白包含TCR的一或多個域或片段。在一些實施例中，可將TCR之TCRα及TCRβ鏈工程改造以具有增強的配對。可使用所屬技術領域中任何已知的方法，以用於表位判定、親和力成熟、結合性及交叉反應性判定、表現增強、及配對增強。
所意欲的是，可將本文所述之用於製備抗原負載APC、第一、第二、及第三共培養步驟、富集步驟、定序步驟、MASCT等之任何步驟及參數彼此組合，猶如每一個組合經個別描述。
用於製備腫瘤抗原特異性T細胞之方法
本申請案提供製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：將經富集之活化T細胞群或儲備腫瘤抗原特異性T細胞群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(APC)(本文稱為「抗原負載APC」)群共培養，其中自已在臨床上受益於MASCT的個體獲得該經富集之活化T細胞群或該儲備腫瘤抗原特異性T細胞群，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係使用國際專利申請案第PCT/CN2018/082945號中所述之方法中任一者獲得，其全文以引用方式併入本文中
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：將經富集之活化T細胞群與載有目標腫瘤抗原肽之DC群共培養，其中藉由使第一共培養物經受富集程序來製備該經富集之活化T細胞群，且其中該第一共培養物包含T細胞群及載有該腫瘤抗原肽之第一DC群，其中該第一共培養物中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該方法包含：在初始共培養基中將該抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細 胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT-3)及可選地一或多種細胞激素添加至該共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)使第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞群，其中該第一共培養物包含載有目標腫瘤抗原肽之第一DC群及T細胞群；及b)將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得用於TCR選殖之T細胞群，其中步驟a)中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，該富集程序包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該方法包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素 (諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有目標腫瘤抗原肽之第一DC群與T細胞群共培養，以獲得包含活化T細胞之第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞群；及c)第二共培養步驟，其包含將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行不多於約7天(諸如約1至3天，例如約3天)。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群 之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該方法包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有目標腫瘤抗原肽之第一DC群與T細胞群共培養，以獲得包含活化T細胞之第一共培養物；b)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)或細胞表面分子；及c)第二共培養步驟，其包含將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行不多於約7天(諸如約1至3天， 例如約3天)。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該方法包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC群中。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有目標腫瘤抗原肽之第一DC群與T細胞群共培養，以獲得包含活化T細胞之第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞群；及c)第二共培養步驟，其包含：在初始 第二共培養基中將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以獲得用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行不多於約7天(諸如約1至3天，例如約3天)。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)。在一些實施例中，該富集程序包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該 經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC群中。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)使第一DC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群；b)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與T細胞群共培養，以獲得包含活化T細胞之第一共培養物；c)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞群；d)使第二樹突細胞群與該目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群；及e)第二共培養步驟，其包含：在初始第二共培養基中將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養，以獲得第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以獲得用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行不多於約7天(諸如約1至3天，例如約3天)。在一些實施例中，該T細胞群與 該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)。在一些實施例中，該富集程序包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC群中。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)使第一DC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之第一DC群；b)在DC成熟培養基中培養載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(toll-like receptor,TLR)促效劑；c)第一共培養步驟，其包含：在第一共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群共培養，以獲得包含活化T細胞之第一共培養物，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)、免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；d)富集 步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)或細胞表面分子；e)使第二DC群與該目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得第二抗原負載DC群；f)在DC成熟培養基中培養該第二抗原負載DC群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑；及g)第二共培養步驟，其包含：在第二初始共培養基中將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養，以獲得第二共培養物，該第二初始共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以提供用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行不多於約7天(諸如約1至3天，例如約3天)。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑 (例如，抗PD-1抗體)。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，藉由誘導來自PBMC之單核球群分化來獲得第一DC群及/或第二DC群。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：將腫瘤抗原特異性T細胞群與載有一或多種目標腫瘤抗原肽之APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群係使用上述製備用於選殖TCR之T細胞的方法中之任一者獲得。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體之PBMC。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、1：2、或1：4)。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群共培養約5至9(例如，約7)天。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞群與該抗原負載APC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複共培養，例如一次或兩次。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞群係獲自腫瘤抗原特異性T細胞的冷凍儲備液。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有目標腫瘤抗原肽之第一DC群與T細胞群共培養，以獲得包含活化T細胞之第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞群；c)第二共培養步驟，其包含將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得第一腫瘤、抗原特異性T細胞群；d)第三共培養步驟，其包含將來自該第一腫瘤抗原特異性T細胞群的腫瘤抗原特異性T細胞亞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第三APC(例如，DC、PBMC、或細胞系APC，諸如LCL)群共培養，從而提供用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞亞群與該第三抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1、1：2、或1：4)。在一些實施例中，將該腫瘤抗原特異性T細胞亞群與該第三抗原負載DC群共培養約5至9(例如，約7)天。在一些實施例中，該腫瘤抗原特異性T細胞亞群與該第三抗原負載DC群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15)及抗CD3抗體(例如，OKT3)。在一些實施例中，重複該第三共培養步驟，例如一次、兩次、或三次。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞亞群係獲自第一腫瘤抗原特異性T細胞群的冷凍儲備 液。在一些實施例中，該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行不多於約7天(諸如約1至3天，例如約3天)。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1(例如，約20：1、15：1、或10：1)。在一些實施例中，該第一抗原負載DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2、或複數種細胞激素，例如IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1(例如，約1：1或約2：1)。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約12至25天。在一些實施例中，該方法包含：在初始第二共培養基中將該第二抗原負載DC群與該T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。在一些實施例中，在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC群中。
製備用於TCR選殖之T細胞或用於製備腫瘤抗原特異性T細胞的例示性方法係繪示於圖4、圖7、及圖15A至圖15B中，並描述於實例2至實例3中。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：(a)使衍生自來自個體的PBMC群之DC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC；(b)第一共培養步驟，其包含：在初始第一共培養基中將T細胞群(例如，存在於PBMC中)與第一抗原負載DC群共培養，該初始第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；(c)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，以獲得經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)；(d)第二共培養步驟，其包含：在初始第二共培養基中將該經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群共培養，以獲得第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及在該第二共培養開始後約1天至約3天(例如，約2天)，將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，從而提供用於TCR選殖之T細胞群，其中該第一共培養步驟中的該T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，在DC成熟培養基中培養該等抗原負載DC，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，將該等抗原負載DC在該DC成熟培養基 中培養約8至約12天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率係約20：1。在一些實施例中，將該T細胞群與該抗原負載DC群共培養約2至3天。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約15至20天(例如，約16天)。例示性方法係顯示於圖4及圖7中。
在一些實施例中，提供一種製備用於TCR選殖之T細胞群的方法，其包含：(a)在共培養基中將腫瘤抗原特異性T細胞群與載有目標腫瘤抗原肽之第一APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)群共培養約5至9天(例如，約7天)，以獲得第一腫瘤抗原特異性T細胞群，該共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及抗CD3抗體；及(b)將該第一腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二APC群共培養約5至9天(例如，約7天)，從而提供用於TCR選殖之第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中該腫瘤抗原特異性T細胞群係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體，且其中至少約10%(例如，至少20%或50%)的用於TCR選殖之該T細胞群對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應。在一些實施例中，重複刺激步驟一次或兩次。在一些實施例中，該方法進一步包含：將該第二腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該等腫瘤抗原特異性T細胞之第三APC群共培養約5至9天(例如，約7天)，從而提供第三腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，APC係LCL細胞，其具有或不具有餵養細胞(feeder cell)。在一些實施例中，APC係DC。在一些實施例中， 該共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及OKT3。在一些實施例中，抗原負載APC與第一、第二、或第三腫瘤抗原特異性T細胞群之間的比率係約1：1至約1：10(例如，約1：4)。例示性方法係顯示於圖15A至圖15B中。
用於定序步驟的腫瘤抗原特異性T細胞具有高百分比的對目標腫瘤抗原肽或其表位有特異性反應之T細胞。例如，至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更高中任一者的用於定序步驟的腫瘤抗原特異性T細胞對目標腫瘤抗原肽或其表位有特異性反應。在一些實施例中，約20至90%、20至50%、50至95%、20至80%、50至70%、40至60%、或40%至80%中任一者的用於定序步驟的腫瘤抗原特異性T細胞對目標腫瘤抗原肽或其表位有特異性反應。由於T細胞表現大量的TCRα及TCRβ殖株型，故高百分比的可對腫瘤抗原肽有特異性反應之T細胞對於獲得TCRα及TCRβ基因的成功同源配對資訊是重要的。
在一些實施例中，單離細胞群之任何實施例中的腫瘤抗原特異性T細胞能夠在體內或離體引發對一或多種腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞能夠在人類個體中增加對多於一種腫瘤抗原肽的細胞毒性T細胞活性。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞之特徵在於經一或多種腫瘤抗原肽刺激後，促發炎信號分子的高表現或分泌水平。在一些實施例中，藉由以下判定表現或分泌水平：將腫瘤抗原特異性T細胞經一或多種腫瘤抗原肽刺激後的分子(諸如促發炎信號分子)之表現或分泌水平與經不 相關肽刺激後的表現或分泌水平進行比較。在一些實施例中，分子的對照表現或分泌水平係在相同檢定條件下測量的對照T細胞群中分子之表現或分泌水平。在一些實施例中，對照T細胞群係經一或多種不相關肽(諸如未對應於T細胞受體抗原的肽、或隨機肽)誘導的T細胞群。在一些實施例中，分子的對照表現或分泌水平係複數個對照T細胞群中分子之平均或中位數表現或分泌水平。在一些實施例中，在腫瘤抗原特異性T細胞中分子的高表現或分泌水平係對照表現或分泌水平的至少約1.5、2、2.5、3、4、5、10、20、50、100、1000、或更多倍中任一者。
在一些實施例中，經目標腫瘤抗原肽刺激後，腫瘤抗原特異性T細胞表現複數種促發炎分子，諸如IFNγ、TNFα、顆粒酶B、穿孔素、或其任何組合。在一些實施例中，經目標腫瘤抗原肽刺激後，至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更高百分比中任一者的腫瘤抗原特異性T細胞分泌INF-γ。在一些實施例中，經目標腫瘤抗原肽刺激後，至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或更高百分比中任一者的腫瘤抗原特異性T細胞分泌TNF-α。
在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係藉由包含下列之步驟製備：(a)使衍生自來自個體的PBMC群之DC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得第一抗原負載DC群；(b)第一共培養步驟，其包含：在初始第一共培養基中將T細胞群(例如，存在於PBMC中)與該第一抗原負載DC群共培養，該初始第一共培養基包含一或多種細 胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及在該第一共培養開始後不多於約7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該第一共培養物，以獲得第一共培養物；(c)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，以獲得經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)；(d)第二共培養步驟，其包含：在共培養基中將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，從而提供該等腫瘤抗原特異性T細胞，該共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)、免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)、及抗CD3抗體。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率係約20：1。在一些實施例中，將該T細胞群與該抗原負載DC群共培養約13至14天。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約2：1。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約9至13天。
在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係藉由包含下列之步驟製備：(a)使衍生自來自個體的PBMC群之DC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC；(b)第一共培養步驟，其包含：在初始第一共培養基中將T細胞群(例如，存在於PBMC中)與第一抗原負載DC群共培養，該初始第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗 體)；(c)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，以獲得經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)；(d)第二共培養步驟，其包含：在共培養基中將該經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群共培養，從而提供該等腫瘤抗原特異性T細胞，該共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)、免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)、及抗CD3抗體。在一些實施例中，在DC成熟培養基中培養該等抗原負載DC，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，將該等抗原負載DC在該DC成熟培養基中培養約8至約12天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率係約15：1。在一些實施例中，將該T細胞群與該抗原負載DC群共培養約3至4天。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約2：1。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約13至23天。
在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係藉由包含下列之步驟製備：(a)使衍生自來自個體的PBMC群之DC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC；(b)第一共培養步驟，其包含：在初始第一共培養基中將T細胞群(例如，存在於PBMC中)與第一抗原負載樹突細胞群共培養，該初始第一共培養基包含一或多種細胞激 素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；(c)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，以獲得經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)；(d)第二共培養步驟，其包含：在初始第二共培養基中將該經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群共培養，以獲得第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及在該第二共培養開始後約1天至約3天(例如，約2天)，將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，從而提供該等腫瘤抗原特異性T細胞。在一些實施例中，在DC成熟培養基中培養該等抗原負載DC，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，將該等抗原負載DC在該DC成熟培養基中培養約8至約12天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率係約20：1。在一些實施例中，將該T細胞群與該抗原負載DC群共培養約2至3天。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約15至20天(例如，約16天)。
在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係藉由包含下列之步驟製備：(a)使衍生自來自個體的PBMC群之DC群與目標腫瘤 抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC；(b)第一共培養步驟，其包含：在初始第一共培養基中將T細胞群(例如，存在於PBMC中)與第一抗原負載DC群共培養，該初始第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；(c)富集步驟，其包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，以獲得經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)；(d)第二共培養步驟，其包含：在初始第二共培養基中將該經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群共培養，以獲得第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及在該第二共培養開始後約1天至約3天(例如，約2天)，將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第二共培養物，從而提供該等腫瘤抗原特異性T細胞。在一些實施例中，在DC成熟培養基中培養該等抗原負載DC，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，將該等抗原負載DC在該DC成熟培養基中培養約8至約12天。在一些實施例中，該T細胞群與該第一抗原負載DC群之間的比率係約20：1。在一些實施例中，將該T細胞群與該抗原負載DC群共培養約2至3天。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1。在一些實施例中， 將該經富集之活化T細胞群與該第二抗原負載DC群共培養約15至20天(例如，約16天)。
在一些實施例中，該方法使用自先前已接受免疫療法(例如，MASCT)的個體獲得之PBMC，以製備用於定序步驟中的腫瘤抗原特異性T細胞。
在一些實施例中，該方法包含：a)使來自該個體的第一PBMC群與該目標腫瘤抗原肽接觸，以提供載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC群；b)使載有該目標腫瘤抗原肽之該PBMC群經受富集程序，以提供經富集之活化T細胞群；c)可選地使APC(例如，PBMC或DC)群與該目標腫瘤抗原肽接觸，以提供抗原負載APC群；d)共培養步驟，其包含將該經富集之活化T細胞群與該抗原負載APC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，在該富集程序之前，該等PBMC係與該目標腫瘤抗原肽接觸不多於約5、4、3、2、或1天。在一些實施例中，該富集程序包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)或細胞表面分子。在一些實施例中，該共培養步驟包含：在共培養基中將該經富集之活化T細胞群與該抗原負載APC群共培養，該共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)、免疫檢查點抑制劑、及抗CD3抗體。在一些實施例中，該共培養步驟包含：在初始共培養基中將該經富集之活化T細胞群與該抗原負載APC群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多 種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，在該共培養開始後約1至3天，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該抗原負載APC群共培養總共約12至25天。
在一些實施例中，PBMC係新鮮獲得。在一些實施例中，PBMC係藉由將PBMC的冷凍儲備液解凍而獲得。在一些實施例中，PBMC係自體的，即獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，使PBMC與細胞激素(諸如IL-2、GM-CSF、或類似者)接觸，以同時或於該接觸步驟之後在該等PBMC中誘導某些細胞(諸如DC、T細胞、或其組合)之分化、成熟、或增生。
在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞係藉由包含下列之步驟製備：(a)使PBMC群與目標腫瘤抗原肽接觸，以獲得經刺激PBMC群；(b)使用配體自該經刺激PBMC群單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素(諸如IFNγ)，以獲得經富集之活化T細胞群；及(c)共培養步驟，其包含：在初始共培養基中將該經富集之活化T細胞群與載有目標腫瘤抗原肽之DC群共培養，以獲得第一共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(諸如IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)；及在該第一共培養開始後約1天至約3天(例如，約1天或2天)，將抗CD3抗體(例如，OKT3)添加至該第一共培養物，從而提供該等腫瘤抗原特異性T細胞。在一些實施例中，PBMC係來自冷凍儲備液。在一些實施 例中，PBMC係自個體新鮮獲得。在一些實施例中，藉由使PBMC群與目標腫瘤抗原肽接觸，製備抗原負載DC。在一些實施例中，該經富集之活化T細胞群與該抗原負載DC群之間的比率係約1：1。在一些實施例中，將該經富集之活化T細胞群與該抗原負載DC群共培養約7至約21天。
共培養
本文所述的方法及MASCT方法包含一或多個(諸如1、2、3、或更多個)共培養步驟。在一些實施例中，該方法包含第一共培養步驟，該第一共培養步驟包含將T細胞群與載有目標腫瘤抗原肽之DC群共培養。在一些實施例中，在第一共培養步驟中，將T細胞群與第一抗原負載DC群共培養不多於約7天，諸如約1、2、3、4、5、6、或7天中任一者。在一些實施例中，將T細胞群與第一抗原負載DC群共培養約1至3天，諸如約2至3天。
在一些實施例中，第一共培養步驟包含在第一共培養基中將第一抗原負載DC群與T細胞群共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(諸如複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，第一共培養基包含抗CD3抗體。在一些實施例中，第一共培養基不包含抗CD3抗體。在一些實施例中，第一共培養步驟包含：在第一初始共培養基中將第一抗原負載DC群與T細胞群共培養，以提供第一共培養物，該第一初始共培養基包含一或多種細胞激素(諸 如複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該第一共培養物。
在一些實施例中，該方法包含第二共培養步驟，該第二共培養步驟包含將經富集之活化T細胞群與載有目標腫瘤抗原肽之DC群共培養。在一些實施例中，在第二共培養步驟中，將經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群共培養總共至少約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30天中任一者。在一些實施例中，將經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群共培養約12天至約25天，諸如約12至15、15至18、18至21、15至20、20至25、15、18、19、20、21、或22天中任一者。
在一些實施例中，將經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群在抗CD3抗體存在下共培養至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、或更多天中任一者。在一些實施例中，將經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群在抗CD3抗體存在下共培養約8至18、10至20、1至25、或12至25天中任一者。在一些實施例中，經富集之活化T細胞群與第二抗原負載DC群最初係在不具有抗CD3抗體下共培養約1至5天，諸如約1、2、或3天。
在一些實施例中，第二共培養步驟包含在第二共培養基中將第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，該第二共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)、免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，第二共培養基包含抗CD3抗體。在一些實施例中，第二共培養基不包含抗CD3抗體。在一些實施例中，第二 共培養步驟包含：在第二初始共培養基中將第二抗原負載DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該第二初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該第二共培養物。
在一些實施例中，製備腫瘤抗原特異性T細胞之方法包含：(1)第一共培養步驟，其包含將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之第一DC群共培養；及(2)第二共培養步驟，其包含將經富集之活化T細胞群與載有來自該複數種腫瘤抗原肽之一或多種腫瘤抗原肽之第二DC群共培養。
在一些實施例中，該方法包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽(或其表位)之APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群共培養。在一些實施例中，重複第三共培養步驟一或多次(諸如1、2、3、4、5、6、或更多次)，以獲得進一步的腫瘤抗原特異性T細胞群。在一些實施例中，重複第三共培養步驟包含：將自第三共培養步驟獲得的腫瘤抗原特異性T細胞之部分與第二抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群共培養。在一些實施例中，重複第三共培養步驟包含：以每隔約5至9天(例如，約7天)之間隔，向第三共培養物添加新鮮的抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群。
在一些實施例中，在第三共培養步驟中，將腫瘤抗原特異性T細胞群與抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群共培養至少約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或14天中任一者。在一些實施例中，將腫瘤抗原特異性T細胞群與抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群共培養約5天至約15天，諸如約5至9、7至10、10至12、12至15、7、8、9、10、11、12、13、或15天中任一者。
在一些實施例中，第三共培養步驟包含在第三共培養基中將抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群與腫瘤抗原特異性T細胞群共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，第三共培養基不包含抗CD3抗體。在一些實施例中，第三共培養基包含抗CD3抗體。在一些實施例中，第三共培養步驟包含：在第三初始共培養基中將抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC(諸如LCL))群與腫瘤抗原特異性T細胞群共培養，以提供第三共培養物，該第三初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該第三共培養物。
用於各培養步驟的共培養基或初始共培養基可相同或不同。除非另有指示，否則如「共培養」小節中所論述的「共培養基」包括第一、第二、及第三共培養基；如本小節中所論述的「初始共培 養基」包括第一、第二、及第三初始共培養基。在一些實施例中，共培養基(包括初始共培養基)包含一或多種(例如1、2、3、4、5、或更多種)細胞激素。在一些實施例中，共培養基(包括初始共培養基)包含複數種細胞激素(在本文中亦稱為「細胞激素混合物」)。例示性細胞激素包括但不限於IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、及類似者。在一些實施例中，共培養基(包括初始共培養基)包含IL-2。在一些實施例中，共培養基(包括初始共培養基)包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2係以至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、6000、或更高IU/ml中任一者的濃度存在於共培養基(包括初始共培養基)中。在一些實施例中，IL-2係以不大於約1000、500、200、100、50、20、或更低IU/ml中任一者的濃度存在於共培養基(包括初始共培養基)中。在一些實施例中，第一共培養基以不大於約200IU/mL(諸如約150、100、或50IU/ml)的濃度包含IL-2。在一些實施例中，第二共培養基以至少約2000IU/mL(諸如約3000、5000、或6000IU/mL)的濃度包含IL-2。在一些實施例中，IL-7係以至少約1、2、5、10、20、50、或100ng/mL中任一者的濃度存在於共培養基(包括初始共培養基)中。在一些實施例中，IL-15係以至少約1、2、5、10、20、50、或100ng/mL中任一者的濃度存在於共培養基(包括初始共培養基)中。細胞激素可促進T細胞的活化、成熟、及/或增生，以為T細胞稍後分化為記憶T細胞作準備，且/或抑制共培養物中TREG的百分比。
在一些實施例中，共培養基(包含初始共培養基)包含一或多種(諸如1、2、3、或更多種中任一者)免疫檢查點抑制劑。可使用任何已知的免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抑制性免疫檢查點分子的天然或經工程改造之配體，其包括例如CTLA-4的配體(例如，B7.1、B7.2)、TIM-3的配體(例如，半乳糖凝集素-9)、A2a受體的配體(例如，腺苷、瑞加德松(Regadenoson))、LAG-3的配體(例如，MHC I類或MHC II類分子)、BTLA的配體(例如，HVEM、B7-H4)、KIR的配體(例如，MHC I類或MHC II類分子)、PD-1的配體(例如，PD-L1、PD-L2)、IDO的配體(例如，NKTR-218、因多莫得(Indoximod)、NLG919)、及CD47的配體(例如，SIRPα受體)。免疫檢查點抑制劑可屬於任何合適的分子型態，包括但不限於小分子、核酸(諸如DNA、RNAi、或適體)、肽、或蛋白質(諸如抗體)。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係靶向抑制性免疫檢查點蛋白的抗體(諸如拮抗劑抗體)，其係選自由下列所組成之群組：抗CTLA-4(例如，伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、KAHR-102)、抗TIM-3(例如，F38-2E2、ENUM005)、抗LAG-3(例如，BMS-986016、IMP701、IMP321、C9B7W)、抗KIR(例如，利利單抗(lirilumab)及IPH2101)、抗PD-1(例如，尼沃魯單抗(nivolumab)、匹利珠單抗(pidilizumab)、派姆單抗(pembrolizuma)、BMS-936559、阿替珠單抗(atezolizumab)、派姆單抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、 SHR1210)、抗PD-L1(例如，KY-1003(EP20120194977)、MCLA-145、RG7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB0010718C、AUR-012、STI-A1010、PCT/US2001/020964、MPDL3280A、AMP-224、聚乙二醇化達匹珠單抗(dapirolizumab pegol)(CDP-7657)、MEDI-4920)、抗CD73(例如，AR-42(OSU-HDAC42,HDAC-42,AR42,AR 42,OSU-HDAC 42,OSU-HDAC-42,NSC D736012,HDAC-42,HDAC 42,HDAC42,NSCD736012,NSC-D736012)、MEDI-9447)、抗B7-H3(例如，MGA271、DS-5573a、8H9)、抗CD47(例如，CC-90002、TTI-621、VLST-007)、抗BTLA、抗VISTA、抗A2aR、抗B7-1、抗B7-H4、抗CD52(諸如阿侖單抗(alemtuzumab))、抗IL-10、抗IL-35、及抗TGF-β(諸如夫蘇木單抗(fresolumimab))。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係全長抗體。在一些實施例中，抗體係選自由下列所組成之群組的抗原結合片段：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、BiTE、奈米抗體(nanobody)、及全長抗體之其他抗原結合子序列或其經工程改造之組合。在一些實施例中，抗體係人類抗體、人源化抗體、或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體係雙特異性抗體或多特異性抗體。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係PD-1的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。例示性抗PD-1抗體包括但不限於尼沃魯單抗、派姆單抗、匹利珠單抗、BMS-936559、及阿替珠單抗、派姆單抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、及SHR-1210。在一些實施例中，免疫檢查點 抑制劑係尼沃魯單抗(例如OPDIVO®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係派姆單抗(例如，KEYTRUDA®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係SHR-1210。在一些實施例中，初始共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體(例如，SHR-1210)。
在共培養基(包括初始共培養基)中之免疫檢查點抑制劑(例如抗PD-1抗體)的合適濃度包括但不限於至少約1、2、5、10、15、20、25、或更大μg/mL中任一者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)係以約1μg/mL至約10μg/mL、約10μg/mL至約20μg/mL、約1μg/mL至約25μg/mL、或約5μg/mL至約20μg/mL中任一者存在於共培養基(包括初始共培養基)中。
抗CD3抗體可在共培養開始時存在於共培養物中，或者在抗原負載DC與T細胞、經富集之活化T細胞、或腫瘤抗原特異性T細胞群的共培養開始之後被添加至共培養物。在一些實施例中，抗CD3抗體係包括於共培養基(包括初始共培養基)中。在一些實施例中，初始共培養基不包含抗CD3抗體。
在一些實施例中，在第二共培養開始後不多於約5、4、3、2、或1天中任一者，將抗CD3抗體添加至第二共培養物，該第二共培養物包含經富集之活化T細胞群及第二抗原負載DC群。在一些實施例中，在第二共培養開始後約1、2、或3天，將抗CD3抗體添加至第二共培養物，該第二共培養物包含經富集之活化T細胞群及第二抗原負載DC群。可使用任何合適的抗CD3抗體，包括但不限於OKT3。
在細胞數目方面，T細胞(例如，T細胞、經富集之活化T細胞群、或腫瘤抗原特異性T細胞)及抗原負載APC(諸如PBMC、DC、或細胞系APC)可以適當比率存在於共培養物中。在一些實施例中，在第一共培養步驟中的T細胞群與第一抗原負載DC群之間的比率不大於約30：1、25：1、20：1、15：1、10：1、8：1、或5：1中任一者。在一些實施例中，在第一共培養步驟中的T細胞群與第一抗原負載DC群之間的比率係至少約5：1、8：1、10：1、15：1、20：1、25：1、或更大中任一者。在一些實施例中，在第一共培養步驟中的T細胞群與第一抗原負載DC群之間的比率係約5：1至約10：1、約5：1至約20：1、約10：1至約20：1、約20：1至約30：1、或約5：1至約30：1中任一者。在一些實施例中，經富集之T細胞群與第二抗原負載DC群之間的比率係至少約1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、或10：1中任一者。在一些實施例中，經富集之T細胞群與第二抗原負載DC群之間的比率不大於約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、或1：1中任一者。在一些實施例中，經富集之T細胞群與第二抗原負載DC群之間的比率係約1：1至約20：1、約1：1至約10：1、約1：1至約5：1、約5：1至約10：1、約10：1至約15：1、約15：1至約20：1、約10：1至約20：1、約1：1至約1：3、約1：1至約2：1、或約2：1至約5：1中任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞群與抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC)群之間的比率係至少約1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、或10：1中任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞群與抗原負載APC (例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC)群之間的比率不大於約10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、或1：1中任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞群與抗原負載APC(例如，PBMC(諸如固定PBMC)、DC、或細胞系APC)群之間的比率係約1：1至約20：1、約1：1至約10：1、約1：1至約5：1、約5：1至約10：1、約10：1至約15：1、約15：1至約20：1、約10：1至約20：1、約1：3至約3：1、約1：1至約3：1、約1：1至約2：1、或約2：1至約5：1中任一者。
在一些實施例中，T細胞及APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)係衍生自相同個體，例如已在臨床上受益於MASCT的個體。在一些實施例中，APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)並非衍生自已在臨床上受益於MASCT的個體。在一些實施例中，T細胞、APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)、或兩者係衍生自自體來源，例如衍生自接受表現TCR之經工程改造之免疫細胞的個體。在一些實施例中，T細胞、APC(例如，PBMC、DC、或細胞系APC)、或兩者係衍生自同種異體來源。
在一些實施例中，T細胞及/或APC(例如，PBMC或DC)係獲自先前已接受免疫療法的個體。在一些實施例中，個體對免疫療法有免疫反應。對免疫療法「有免疫反應(immunologically responsive)」意指個體回應於免疫療法而對一或多種腫瘤抗原已發展出特異性免疫反應。在一些實施例中，T細胞及/或APC(例如，PBMC或DC)係獲自已在臨床上受益於免疫療法的個體。「臨床上受 益(clinically benefitted)」於療法的個體已展示對該療法的臨床反應(如醫師所評估)。例示性臨床反應包括但不限於完全反應(「CR」)、部分反應(「PR」)、及疾病穩定(「SD」)。免疫療法包括但不限於免疫檢查點抑制劑、過繼免疫細胞療法(例如，過繼性T細胞療法、CIK、TIL、CAR-T、及TCR-T療法)、癌症疫苗、溶瘤病毒、及其組合。在一些實施例中，T細胞及/或APC(例如，PBMC或DC)係獲自先前已接受MASCT的個體。在一些實施例中，該個體能夠在MASCT中發展出對腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。可使用所屬技術領域中已知的檢定法(諸如ELISPOT檢定)來判定對腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。在一些實施例中，個體已在臨床上受益於MASCT。在一些實施例中，個體具有(多種)腫瘤抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，個體具有腫瘤抗原特異性免疫反應且已在臨床上受益於MASCT。
用於本文所述方法之任何實施例中的T細胞群可衍生自各種來源。方便的T細胞來源係來自人類周邊血液的PBMC。T細胞群可自PBMC單離，或者替代地，富含T細胞的PBMC群(諸如藉由添加T細胞特異性抗體及細胞激素)可用於共培養物中。在一些實施例中，用於第一共培養步驟中的T細胞群係獲自周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。在一些實施例中，藉由周邊血液樣本的密度梯度離心來獲得PBMC。在一些實施例中，用於第一共培養步驟中的T細胞群存在於PBMC中。
活化T細胞之富集
本文所述方法包含富集步驟，該富集步驟包含富集來自共培養物的活化T細胞，該共培養物包含第一抗原負載DC群及T細胞群。在一些實施例中，該方法包含富集步驟，該富集步驟包含富集活化T細胞，該等活化T細胞係來自經目標腫瘤抗原肽或其片段刺激的PBMC。
在一些實施例中，富集程序包含：基於回應於目標腫瘤抗原肽或其片段刺激之共培養物的一或多種(諸如1、2、3、或更多種中之任一者)T細胞活化生物標記來選擇活化T細胞。在一些實施例中，在共培養物中，使用載有目標腫瘤抗原肽之APC(諸如PBMC)來刺激活化T細胞。在一些實施例中，富集程序包含：自共培養物單離表現一或多種生物標記(諸如細胞表面分子或分泌分子)的活化T細胞。
在一些實施例中，富集程序包含自共培養物單離表現或分泌一或多種細胞激素的活化T細胞，該共培養物已經過目標腫瘤抗原肽或其片段刺激。在一些實施例中，富集步驟包含：使第一共培養物與抗原負載PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素。例示性細胞激素包括但不限於IFNγ及TNFα。可使用特異性辨識細胞激素的配體(諸如該細胞激素的抗體或受體)來單離經富集之活化T細胞群。在一些實施例中，富集步驟包含：使第一共培養物與抗原負載PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺 激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞表面分子，諸如4-1BB(亦稱為CD137)。
在一些實施例中，該方法包含：使共培養物與載有目標腫瘤抗原肽或其片段之PBMC接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素或細胞表面分子。在一些實施例中，細胞激素係IFNγ。在一些實施例中，細胞表面分子係4-1BB。
在一些實施例中，富集程序包含在藉由目標腫瘤抗原肽或其片段刺激後，自共培養物單離分泌IFNγδ的活化T細胞。在一些實施例中，富集程序包含在藉由目標腫瘤抗原肽或其片段刺激後，自共培養物單離CD3+IFNγ+細胞。在一些實施例中，富集程序包含：(1)使包含載有目標腫瘤抗原肽或其片段之第一DC群及T細胞群的共培養物，與載有目標腫瘤抗原肽或其片段之PBMC接觸約10至24小時(諸如約1天)，以獲得經刺激共培養物；及(2)使用特異性辨識IFNγ的配體自該經刺激共培養物單離活化T細胞。在一些實施例中，在與抗原負載PBMC接觸之前，已將第一抗原負載DC群與T細胞群共培養約1至7天(諸如約2至3天)。在一些實施例中，在單離之前，使共培養物及抗原負載PBMC接觸至少約2、4、6、12、18、24、或更多小時中任一者。
可使用所屬技術領域中任何已知的方法，自經刺激共培養物單離或富集表現細胞激素(諸如IFNγ)的活化T細胞。例如，市售套組可用於單離分泌IFNγ的T細胞，該等市售套組包括來自 Miltenyi Biotec的IFNγ Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit。在一些實施例中，藉由下列單離分泌IFNγ的活化T細胞：(1)使共培養物與特異性結合至T細胞上之細胞表面抗原及IFNγ的IFNγ捕獲試劑接觸；(2)使經IFNγ捕獲試劑處理的共培養物與抗IFNγ抗體(例如，共軛至R-藻紅蛋白(R-phycoerthrin)或PE的抗IFNγ抗體)接觸；(3)使經抗IFNγ抗體處理的共培養物與磁珠接觸，該磁珠包含辨識抗IFNγ抗體的二級抗體(例如，抗PE抗體)；及(4)使用磁場(例如，使用MACSTM分離柱)單離磁珠，從而獲得經富集之活化T細胞群。
在一些實施例中，藉由下列單離表現細胞表面生物標記的活化T細胞：(1)使共培養物與針對細胞表面生物標記的螢光標示抗體接觸；及(2)藉由流動式細胞測量術自共培養物單離結合至螢光標示抗體的細胞。
APC之抗原負載
本文所述方法及MASCT方法使用載有一或多種腫瘤抗原肽之APC(諸如PBMC、樹突細胞、或細胞系APC)。在一些實施例中，抗原負載APC(例如，抗原負載DC)係新鮮製備，以用於一或多個共培養步驟。在一些實施例中，抗原負載APC(例如，抗原負載DC)係新鮮製備，以用於各共培養步驟。在一些實施例中，抗原負載APC(例如，抗原負載DC)經製備、培養於DC成熟培養基中、並用於一或多個共培養或刺激步驟。用於第一、第二、及第三共培養步 驟中的抗原負載DC可自單批次或分開批次的抗原負載DC獲得。除非另有指示，否則本節中針對APC(例如，DC)所述之特徵適用於各共培養步驟中使用的所有APC(例如，DC)；且本節中針對抗原負載APC(例如，DC)所述之方法及特徵適用於第一群、第二群、及第三群的抗原負載APC及其他類型的APC。APC包括但不限於PBMC、DC、B細胞、或巨噬細胞。本文所述之APC可係初代細胞，或係衍生自細胞系。在一些實施例中，APC係PBMC。在一些實施例中，APC係固定PBMC。固定PBMC可破壞PBMC的增生能力，同時維持PBMC的抗原呈現能力。
用於各共培養步驟中的抗原負載DC可載有相同腫瘤抗原肽池或不同腫瘤抗原肽池。在一些實施例中，第一共培養步驟中第一DC群所載有的腫瘤抗原肽池與第二共培養步驟中用來負載第二DC群的腫瘤抗原肽池相同。在一些實施例中，第二共培養步驟中第二DC群載有第一共培養步驟中用來負載第一DC群的腫瘤抗原肽池之子集。在一些實施例中，第三共培養步驟中第三DC群載有第一共培養步驟中用來負載第一DC群的腫瘤抗原肽池之子集及/或第二共培養步驟中用來負載第二DC群的腫瘤抗原肽池之子集。在一些實施例中，腫瘤抗原肽池之子集包括腫瘤抗原肽之片段及其組合。在一些實施例中，使用單一腫瘤抗原肽(即，目標腫瘤抗原肽)或其片段，以負載用於第二共培養步驟及第三共培養步驟中的APC(諸如DC)。
在一些實施例中，使用個體於先前MASCT中使用的複數種腫瘤抗原肽，製備用於第一共培養步驟的第一抗原負載DC群。 在一些實施例中，使用個體於先前MASCT中對其有特異性免疫反應的一或多種腫瘤抗原肽，製備用於第一共培養步驟的第一抗原負載DC群。在一些實施例中，針對衍生自個體的PBMC、活化T細胞、或腫瘤抗原特異性T細胞的特異性免疫反應，篩選(例如，藉由ELISPOT)來自一或多種目標腫瘤抗原肽或其片段之個別腫瘤抗原肽、及其組合，以識別用於後續製備腫瘤抗原特異性T細胞的一或多種目標腫瘤抗原肽(包括其片段)。
在一些實施例中，在各共培養步驟之前，該方法包含下列步驟中之一或多者：(1)自個體獲得PBMC；(2)自PBMC獲得單核球群；(3)誘導該單核球群分化為未成熟DC；(4)使該等未成熟DC與一或多種腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC群；及(5)在DC成熟培養基中培養該抗原負載DC群，該DC成熟培養基包含TLR促效劑(諸如MPLA)。
在一些實施例中，抗原負載DC係藉由下列製備：(a)使DC群與一或多種腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC群；及(b)在DC成熟培養基中培養抗原負載DC群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。例示性TLR促效劑包括但不限於MPLA(單磷醯脂A)、Poly I：C、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、及CL075。可將細胞激素及其他適當分子(諸如INFγ及PGE2(前列腺素E2))進一步包括於成熟步驟中的培養基中。
在一些實施例中，抗原負載DC係藉由下列製備：(a)使DC群與一或多種腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC群；及(b)在 DC成熟培養基中培養抗原負載DC群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2。
在一些實施例中，抗原負載DC係藉由下列製備：(a)誘導單核球群分化為未成熟DC；(b)使未成熟DC群與一或多種腫瘤抗原肽接觸，以獲得抗原負載DC群；及(c)在DC成熟培養基中培養該抗原負載DC群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2。在一些實施例中，單核球群係獲自PBMC。
在一些實施例中，藉由使PBMC群與一或多種腫瘤抗原肽接觸，製備抗原負載PBMC。在一些實施例中，藉由使細胞系APC(例如，LCL)群與一或多種腫瘤抗原肽接觸，製備抗原負載細胞系APC。
DC成熟培養基可包含合適濃度的MPLA、INFγ、及/或PGE2。在一些實施例中，DC成熟培養基以至少約0.5μg/mL的濃度包含MPLA，諸如至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更大μg/mL中任一者。在一些實施例中，DC成熟培養基以約0.5至10、1至5、5至10、或2.5至7.5μg/mL中任一者的濃度包含MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基以至少約100IU/mL的濃度包含INFγ，諸如至少約150、200、250、300、400、500、600、800、1000、或更大IU/mL中任一者。在一些實施例中，DC成熟培養基以約100至1000、100至250、250至500、500至1000、或250至750IU/mL中任一者的濃度包含INFγ。在一些實施例中，DC成熟培養基以至少約0.1μg/mL的濃度包含PGE2，諸如至少約0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、 0.5、或更大μg/mL中任一者。在一些實施例中，DC成熟培養基以約0.1至0.5、0.1至0.3、0.25至0.5、或0.2至0.4μg/mL中任一者的濃度包含PGE2。
可藉由TLR促效劑誘導載有一或多種腫瘤抗原肽之未成熟DC成熟至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20天中任一者。在一些實施例中，誘導載有一或多種腫瘤抗原肽之DC成熟約8、9、10、11、或12天。
在一些實施例中，抗原負載DC係呈現一或多種腫瘤抗原肽的成熟DC。由本文所述之任何方法製備的成熟DC可呈現至少約1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、或更多種中任一者的腫瘤抗原肽。相較於純真(naïve)DC、或尚未載有複數種腫瘤抗原肽之DC，多抗原負載DC可具有增強的至少約1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、或更多種中任一者的腫瘤抗原肽之呈現水平。在一些實施例中，成熟DC具有增強的多於10種腫瘤抗原肽之呈現水平。在一些實施例中，成熟DC具有增強的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多種中任一者的腫瘤抗原肽的呈現水平，該腫瘤抗原肽係衍生自選自由下列所組成之群組的蛋白質：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。
在一些實施例中，藉由將一或多種腫瘤抗原肽脈衝至APC群中，製備抗原負載APC(例如，DC、PBMC、或細胞系APC)。在一些實施例中，藉由將一或多種腫瘤抗原肽脈衝至DC群中，製備抗原負載DC，該等DC諸如未成熟DC、或含在或衍生(諸如經分化)自PBMC的DC。如所屬技術領域中已知的，脈衝(pulsing)係指將細胞(諸如APC(例如，PBMC或DC、或細胞系APC))與含有抗原肽的溶液混合、及可選地隨後自混合物移除抗原肽的程序。可使DC群與一或多種腫瘤抗原肽接觸數秒、數分鐘、數幾小時，諸如約下列中之至少任一者：30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、5小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一週、10天、或更長。用於接觸步驟中之各腫瘤抗原肽的濃度可係至少約0.1、0.5、1、2、3、5、或10μg/mL中任一者。在一些實施例中，腫瘤抗原肽的濃度係約0.1至200μg/mL，包括例如約0.1至0.5、0.5至1、1至10、10至50、50至100、100至150、或150至200μg/mL中任一者。
在一些實施例中，APC(例如，DC或PBMC、或細胞系APC)群與一或多種腫瘤抗原肽係在組成物存在下接觸，該組成物促進APC(例如，DC或PBMC、或細胞系APC)攝取該一或多種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，化合物、材料、或組成物可包括於一或多種腫瘤抗原肽的溶液中，以促進APC(例如，DC或PBMC、或細胞系APC)攝取肽。促進APC(例如，DC或PBMC、或細胞系APC) 攝取一或多種腫瘤抗原肽的化合物、材料、或組成物包括但不限於脂質分子及具有多個帶正電胺基酸的肽。在一些實施例中，APC(例如，DC或PBMC、或細胞系APC)群攝取多於約50%、60%、70%、80%、90%、或95%中任一者的腫瘤抗原肽。在一些實施例中，群中多於約50%、60%、70%、80%、90%、或95%中任一者的APC(例如，DC或PBMC、或細胞系APC)攝取至少一種腫瘤抗原肽。
樹突細胞(諸如未成熟DC)可獲自各種來源，包括自體來源，即來自接受TCR治療的個體。方便的DC細胞來源係來自周邊血液的PBMC。例如，單核球(一種白血球)係大量存在於PBMC中，其構成約5至30%的總PBMC。可使用細胞激素誘導單核球分化為DC，諸如未成熟DC。在一些實施例中，未成熟DC係藉由下列製備：獲得PBMC群；自PBMC群獲得單核球群；及使單核球群與一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)接觸，以獲得未成熟DC群。可用於誘導單核球分化的例示性細胞激素包括但不限於GM-CSF及IL-4，其中誘導係在所屬技術領域中已知的條件(諸如濃度、溫度、CO2水平等)下進行。
PBMC的黏附部分含有PBMC中大多數的單核球。在一些實施例中，使來自PBMC黏附部分的單核球與細胞激素接觸，以獲得未成熟DC群。可藉由將周邊血液樣本離心、或使用血球分離(apheresis)方法自個體收集，方便地獲得PBMC。在一些實施例中，藉由人類周邊血液樣本的密度梯度離心來獲得PBMC群。在一些實施例中，樣本係來自接受下列者的個體：多抗原負載DC、活化T細胞、 表現TCR之經工程改造之免疫細胞、或其他使用多抗原負載DC製備的免疫治療組成物。
腫瘤抗原肽
本文所述方法及MASCT方法使用一或多種腫瘤抗原肽(包括目標腫瘤抗原肽)，以製備抗原負載APC(諸如抗原負載DC)、活化T細胞、及腫瘤抗原特異性T細胞(可離體及在體內觸發特異性免疫反應)。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係複數種合成腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽不是獲自細胞樣本(諸如裂解細胞組成物)。如本文中所使用，「來自複數種腫瘤抗原肽之一或多種腫瘤抗原肽(one or more tumor antigen peptides from a plurality of tumor antigen peptides)」係指該複數種腫瘤抗原肽中之子選擇或所有腫瘤抗原肽，其包括腫瘤抗原肽之片段及其組合。本小節中所述之特徵及參數可適用於(多種)目標腫瘤抗原肽。
在一些實施例中，各腫瘤抗原肽包含至少約1、2、3、4、5、或10種中任一者的表位，該表位係來自單一蛋白質抗原(包括新抗原)。在一些實施例中，在複數種腫瘤抗原肽中的各腫瘤抗原肽包含至少一種可由T細胞受體辨識的表位。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種包含來自單一蛋白質抗原之至少2個表位的腫瘤抗原肽。腫瘤抗原肽可係來自含有一或多個表位之蛋白質抗原的自然衍生肽片段、或具有一或多個天然表位序列之人工設計肽，其中連 接肽可選地可置於相鄰表位序列之間。在一些較佳實施例中，含在相同腫瘤抗原肽中的表位係衍生自相同的蛋白質抗原。
腫瘤抗原肽可含有至少一種MHC-I表位、至少一種MHC-II表位、或(多種)MHC-I表位及(多種)MHC-II表位兩者。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種包含MHC-I表位之肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種包含MHC-II表位之肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽中的至少一種腫瘤抗原肽包含MHC-I表位及MHC-II表位兩者。
可將特殊設計策略應用於腫瘤抗原肽(包括新抗原肽)之序列，以最佳化對載有腫瘤抗原肽之DC的免疫反應。一般而言，較確切表位肽為長的肽可增加肽至DC中的攝取。在一些實施例中，根據具有表位的蛋白質之天然序列，將MHC-I或MHC-II表位序列在N端或C端或兩端延伸，以獲得延伸序列，其中該延伸序列係適於由I類及II類兩者MHC分子呈現、及由不同個體中不同亞型之MHC分子呈現。在一些實施例中，將表位序列在一端或兩端延伸至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20個中任一者的胺基酸殘基，以產生延伸表位。在一些實施例中，包含MHC-I或MHC-II表位的肽進一步包含在N端、C端、或兩端之側接表位的額外胺基酸。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽中的各腫瘤抗原肽係至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100個中任一者的胺基酸長。複數種腫瘤抗原肽中的不同腫瘤抗原肽可具有相同長度或不 同長度。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係各自約20至40個胺基酸長。
在一些實施例中，本申請案中用於設計腫瘤抗原肽的一或多個表位肽之胺基酸序列係基於所屬技術領域中已知的序列或可得自公共資料庫的序列，公共資料庫諸如Peptide Database(Vigneron N.et al.Cancer Immunity,13：15(2013))。
在一些實施例中，使用用於T細胞表位預測的生物資訊工具，基於抗原蛋白的序列，預測一或多個表位肽的胺基酸序列。用於T細胞表位預測的例示性生物資訊工具係所屬技術領域中已知的，例如參見Yang X.及Yu X.(2009)的「An introduction to epitope prediction methods and software」Rev.Med.Virol.19(2)：77-96。在一些實施例中，抗原蛋白之序列為所屬技術領域中已知的或可得自公共資料庫。在一些實施例中，藉由對正接受治療之個體的樣本(諸如腫瘤樣本)進行定序，判定抗原蛋白的序列。
本申請案設想到衍生自所屬技術領域中已知的任何腫瘤抗原及表位(包括新抗原及新表位(neoepitope))之腫瘤抗原肽、或由發明人使用生物資訊工具特別開發或預測之腫瘤抗原肽。
在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含第一核心組之一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽進一步包含第二組之癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種新抗原肽。在一些實施例中，新抗原肽係癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一 般腫瘤抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽、及第二組之癌症類型特異性抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽僅由新抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含第一核心組之一般腫瘤抗原肽、及一或多種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽、第二組之癌症類型特異性抗原肽、及一或多種新抗原肽組成。
在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含第一核心組之一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽進一步包含第二組之癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種新抗原肽。在一些實施例中，新抗原肽係癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽、及第二組之癌症類型特異性抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽僅由新抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含第一核心組之一般腫瘤抗原肽、及一或多種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由第一核心組之一般腫瘤抗原肽、第二組之癌症類型特異性抗原肽、及一或多種新抗原肽組成。
第一核心組之一般腫瘤抗原肽係衍生自常由各種不同類型癌症過度表現的腫瘤抗原。因此，第一核心組之一般腫瘤抗原肽係有用於製備樹突細胞及/或活化T細胞，以用於治療患有不同癌症類型 的個體。例如，在一些實施例中，第一核心組之一般腫瘤抗原肽係有用於本文所述之用於治療各種癌症之方法，該等癌症諸如肺癌、結腸癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰臟癌、卵巢癌、乳癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、子宮頸癌、腎癌、或肝細胞癌。第一核心組之例示性腫瘤抗原肽包括但不限於衍生自下列之肽：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、MET、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、MMP7、VEGFR(諸如VEGFR1及VEGFR2)、及CDCA1。第一核心組可包含衍生自至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多種中任一者的腫瘤抗原之肽。第一核心組可包含至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多種中任一者的一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，第一核心組包含多於一種一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，第一核心組包含約10至約20種一般腫瘤抗原肽。
第二組之癌症類型特異性抗原肽係衍生自僅在一種或有限數目的癌症類型中過度表現的腫瘤抗原。因此，第二組之癌症類型特異性抗原肽係有用於製備樹突細胞及/或活化T細胞，以用於治療患有特定癌症類型的個體。用於治療肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)之例示性癌症類型特異性抗原肽包括但不限於衍生自SSX、AFP、及GPC3之肽。在一些實施例中，一或多種癌症特異性抗原肽係衍生自病毒的病毒特異性抗原肽，該病毒可誘導癌症，或者在感染個體時涉及個體內之癌症發展。在一些實施例中，病毒特異性抗原肽對感染個體的病毒亞型具特異性。用於治療合併HBV感染的HCC患者之例 示性病毒特異性抗原肽包括但不限於衍生自HBV核心抗原(HBcAg)、及HBV DNA聚合酶之肽。在一些實施例中，第二組包含衍生自HBV抗原之病毒特異性抗原肽，其中該方法係用以治療個體中的肝細胞癌。在一些實施例中，第二組包含衍生自HPV抗原之病毒特異性抗原肽，其中該方法係用以治療個體中的子宮頸癌。在一些實施例中，第二組包含衍生自EBV抗原之病毒特異性抗原肽，其中該方法係用以治療個體中的鼻咽癌。第二組之癌症類型特異性抗原肽可包含衍生自至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多種中任一者的癌症類型特異性抗原之肽。第二組癌症類型特異性抗原肽可包含至少約1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多種中任一者的癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，第二組包含多於一種癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，第二組包含約1至約10種癌症類型特異性抗原肽。在一些實施例中，癌症類型特異性抗原肽所靶向的癌症類型係選自基本上由下列所組成之群組：肝細胞癌、子宮頸癌、鼻咽癌、子宮內膜癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮內膜癌、及淋巴瘤。
在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種(諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多種中任一者)新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽係由新抗原肽組成。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含新抗原肽，且未包含一般腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種一般腫瘤抗原肽、及一或多種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含一或多種一般腫瘤抗原肽、一或多種癌症類型特異性抗原肽、及一或多種 新抗原肽。新抗原肽係衍生自新抗原。新抗原係存在於個體(諸如正接受癌症治療之個體)之腫瘤細胞中的最新取得並表現的抗原。在一些實施例中，新抗原係衍生自突變蛋白質抗原，該等突變蛋白質抗原僅存在於癌細胞中但不存在於正常細胞中。新抗原可獨特地存在於經癌症治療的個體之腫瘤細胞(諸如所有腫瘤細胞或部分腫瘤細胞)中，或者在患有類似的癌症類型之個體接受治療時存在於該個體中。在一些實施例中，新抗原係殖株性(clonal)新抗原。在一些實施例中，新抗原係次殖株性(subclonal)新抗原。在一些實施例中，新抗原存在於個體中至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的腫瘤細胞中。在一些實施例中，新抗原肽包含MHC-I限制性新表位。在一些實施例中，新抗原肽包含MHC-II限制性新表位。在一些實施例中，新抗原肽經設計以促進I類及II類兩者MHC分子呈現新表位，例如藉由在N端及C端兩者延伸新表位。例示性新抗原肽包括但不限於衍生自下列之新表位：突變體KRAS(例如，KRASG12A)、PARP4(例如，PARP4T1170I)、MLL3(例如，MLL3C988F)、及MTHFR(例如，MTHFRA222V)。
可基於正接受治療之個體之一或多個腫瘤部位的基因輪廓(genetic profile)選擇新抗原肽，且新抗原在正常組織中不會表現。在一些實施例中，腫瘤樣本的基因輪廓包含全長基因組的序列資訊。在一些實施例中，腫瘤樣本的基因輪廓包含外顯子的序列資訊。在一些實施例中，腫瘤樣本的基因輪廓包含癌症相關基因的序列資訊。
適用於本申請案的的新抗原肽可衍生自腫瘤細胞中的任何突變蛋白，諸如由突變癌症相關基因編碼的突變蛋白。在一些實施例中，新抗原肽包含衍生自癌症相關基因的單一新表位。在一些實施例中，新抗原肽包含衍生自癌症相關基因的多於一種(諸如2、3、或更多種)新表位。在一些實施例中，新抗原肽包含衍生自多於一種(諸如2、3、或更多種)癌症相關基因的多於一種(諸如2、3、或更多種)新表位。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原包含衍生自單一癌症相關基因的複數種新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原包含衍生自多於一種(諸如2、3、4、5、或更多種中任一者)癌症相關基因的複數種新抗原肽。
癌症相關基因係過度表現於癌細胞中的基因，但該等基因係以低水平表現於正常細胞中。例示性癌症相關基因包括但不限於ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AURKA、AURKB、AXL、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L12、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BUB1B、CADM2、CARD11、CBL、CBLB、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD58、CD79B、CDC73、CDH1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK9、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CIITA、CREBBP、CRKL、CRLF2、CRTC1、CRTC2、CSF1R、CSF3R、CTNNB1、CUX1、CYLD、 DDB2、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMD、DNMT3A、EED、EGFR、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FKBP9、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FUS、GATA3、GATA4、GATA6、GLI1、GLI2、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GNB2L1、GPC3、GSTM5、H3F3A、HNF1A、HRAS、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IKZF3、INSIG1、JAK2、JAK3、KCNIP1、KDM5C、KDM6A、KDM6B、KDR、KEAP1、KIT、KRAS、LINC00894、LMO1、LMO2、LMO3、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL(KMT2A)、MLL2(KTM2D)、MPL、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL1(MYCL)、MYCN、MYD88、NBN、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFKBIZ、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2、NPRL3、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PARK2、PAX5、PBRM1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PMS1、PMS2、PNRC1、PRAME、PRDM1、PRF1、PRKAR1A、PRKCI、PRKCZ、PRKDC、PRPF40B、PRPF8、PSMD13、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、 PTPRD、QKI、RAD21、RAF1、RARA、RB1、RBL2、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHPN2、ROS1、RPL26、RUNX1、SBDS、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SH2B3、SLITRK6、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOCS1、SOX2、SOX9、SQSTM1、SRC、SRSF2、STAG1、STAG2、STAT3、STAT6、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TCF7L1、TCF7L2、TERC、TERT、TET2、TLR4、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WRN、WT1、XPA、XPC、XPO1、ZNF217、ZNF708、及ZRSR2。
在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少一種(諸如至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多種中任一者)腫瘤抗原肽，其各包含由癌症相關基因編碼的一或多個表位，該癌症相關基因係選自由下列所組成之群組：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含至少10種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含衍生自下列的腫瘤抗原肽：hTERT、p53、存活素、 NY-ESO-1、CEA、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1、RGS5、VEGFR1、VEGFR2、及CDCA1。
在一些實施例中，一或多種腫瘤抗原肽存在於組成物中，該組成物具有至少約95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、或更高百分比中任一者的腫瘤抗原肽。在一些實施例中，一或多種腫瘤抗原肽的純度係至少約98%。在一些實施例中，為了將腫瘤抗原肽脈衝至DC中，一或多種腫瘤抗原肽於培養基中的溶解度係至少約80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.9%、或更高中任一者。在一些實施例中，為了將腫瘤抗原肽脈衝至APC中，一或多種腫瘤抗原肽係約100%可溶於培養基中。
MASCT
本文所述之TCR係獲自已在臨床上受益於MASCT的個體之PBMC或T細胞。在一些實施例中，例如如ELISPOT所判定，個體已對用於本文所述方法中之(多種)目標腫瘤抗原肽或其片段發展出特異性反應。
如本文中所使用，「MASCT」或「多抗原特異性細胞療法(Multiple Antigen Specific Cell Therapy)」係指過繼性T細胞療法的方法，其包含向個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養而製備。MASCT方法已描述於例如國際專利申請公開案第WO2016145578A1號、國際專利申請案第PCT/CN2018/081338號及第 PCT/CN2019/080535號中，其內容全文以引用方式併入本文中。第一代MASCT、精準MASCT(precision MASCT)、基於PBMC之MASCT、客製化MASCT、基於新抗原之MASCT、改良MASCT、及與MASCT之組合療法(例如，免疫檢查點抑制劑及MASCT)均在本申請案之MASCT的範疇內。本申請案或國際專利申請案第WO2016145578A1號、第PCT/CN2018/081338號、及第PCT/CN2019/080535號中所述之用於抗原負載DC製備、活化T細胞製備、富集步驟、及共培養步驟的任何合適特徵及參數可在MASCT治療中組合。
個體可能已接受單一類型的MASCT、或不同類型的MASCT之組合，例如客製化MASCT及改良MASCT。個體可能已接受一或多個週期的MASCT。在一些實施例中，個體已接受至少約2、5、10、15、20、或更多個週期中任一者的MASCT。在一些實施例中，個體已接受經過至少約3個月、6個月、9個月、12個月、2年、3年、或更長中任一者的MASCT。
在一些實施例中，該MASCT包含：(i)將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群，該複數種腫瘤抗原肽包含該(等)目標腫瘤抗原肽；及(ii)向個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。
在一些實施例中，該MASCT包含：(i)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以提供共培 養物，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；(ii)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，以獲得該活化T細胞群；及(iii)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。
在一些實施例中，該MASCT包含：(i)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；(ii)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA；(iii)將該載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群；及(iv)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。
在一些實施例中，該MASCT包含：(i)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；(ii)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA；(iii)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；(iv)在該共培養開始 後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，以獲得該活化T細胞群；及(V)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。在一些實施例中，該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。
在一些實施例中，該MASCT包含：向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(諸如DC)群共培養而製備。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，先前已對個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞。在一些實施例中，該方法包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(諸如DC)。在一些實施例中，在投予活化T細胞之前約7天至約21天(諸如約7天至約14天、或約14天至約21天)，投予抗原呈現細胞。在一些實施例中，投予抗原呈現細胞至少三次。在一些實施例中，抗原呈現細胞經皮下、皮內、或靜脈內投予。在一些實施例中，活化T細胞及抗原呈現細胞群係來自相同個體。在一些實施例中，活化T細胞及/或抗原呈現細胞群係來自正接受治療之個體。在一些實施例中，抗原呈現細胞群係DC、B細胞、或巨噬細胞之群。在一些實施例中，抗原呈現細胞係DC。在一些實施例中，MASCT進一步包含向個體投予有效量的免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係同時投予，諸如以相同組成物投予。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係依序投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：(a)向該個體投予有效量的載有複數種腫瘤抗原肽之DC；(b)將載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群；及(c)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，DC投予與活化T細胞投予之間的間隔係約7天至約21天(諸如約7天至約14天、約14天至約21天、約10天、或約14天)。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下投予。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之DC群共培養約7天至約21天(諸如約7天至約10天、約10天至約15天、約15天至約21天、約14天至約21天、或約10天)。在一些實施例中，T細胞群係衍生自周邊血液單核細胞(PBMC)群之非黏附部分。在一些實施例中，共培養進一步包含使活化T細胞與複數種細胞激素(諸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、或其任何組合)及可選地抗CD3抗體接觸。在一些實施例中，在共培養之前及/或期間，使T細胞群與免疫檢查點抑制劑(諸如PD-1、PD-L1、或CTLA-4的抑制劑)接觸。在一些實施例中，藉由使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，製備載有複數種腫瘤抗原肽之DC群。在一些實施例中，T細胞群及DC群係衍生自相同個體。在一些實施例中，T細胞群、DC群、PBMC群、或其任何組合係衍生自正接受治療之個體。在一些實施例中，MASCT進一步包含向個體投予有效量的免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係同 時投予，諸如以相同組成物投予。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係依序投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：(a)誘導單核球群分化為DC群；(b)使該DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群；(c)向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC；(d)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與非黏附PBMC群共培養，以獲得活化T細胞群；及(e)向該個體投予有效量的該等活化T細胞，其中該單核球群及該非黏附PBMC群係獲自PBMC群。在一些實施例中，DC投予與活化T細胞投予之間的間隔係約7天至約21天(諸如約7天至約14天、約14天至約21天、約10天、或約14天)。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下投予。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，共培養歷時約7天至約21天(諸如約7天至約14天、約14天至約21天、或約10天)。在一些實施例中，共培養進一步包含使活化T細胞與複數種細胞激素(諸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、或其任何組合)及可選地抗CD3抗體接觸。在一些實施例中，在共培養之前及/或期間，使非黏附PBMC群與免疫檢查點抑制劑(諸如PD-1、PD-L1、或CTLA-4的抑制劑)接觸。在一些實施例中，PBMC群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，MASCT進一步包含向個體投予有效量的免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係同時投予，諸如以相同組 成物投予。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係依序投予。
在一些實施例中，MASCT包含：使周邊血液單核細胞(PBMC)群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得活化PBMC群；及向個體投予有效量的活化PBMC。在一些實施例中，PBMC群與複數種腫瘤抗原肽係在組成物存在下接觸，該組成物促進PBMC中抗原呈現細胞(諸如DC)攝取複數種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，PBMC群與複數種腫瘤抗原肽係在免疫檢查點抑制劑存在下接觸，該免疫檢查點抑制劑諸如PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、及LAG-3的抑制劑。在一些實施例中，使活化PBMC群與IL-2接觸。在一些實施例中，投予活化PBMC至少三次。在一些實施例中，各活化PBMC投予之間的間隔係約2週至約5個月(諸如約3個月)。在一些實施例中，活化PBMC經靜脈內投予。在一些實施例中，PBMC群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，MASCT進一步包含向個體投予有效量的免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係同時投予，諸如以相同組成物投予。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係依序投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：(a)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；b)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群；及(c)向該個體投 予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，DC群及T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下、皮內、或靜脈內投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：a)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與T細胞群共培養，從而獲得該活化T細胞群；及d)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，步驟c)包含在共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與T細胞群共培養，該共培養基包含介白素混合物、免疫檢查點抑制劑、及抗CD3抗體。在一些實施例中， 將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於共培養基中。在一些實施例中，將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，T細胞群存在於PBMC群中。在一些實施例中，DC群及T細胞群獲係自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下、皮內、或靜脈內投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：a)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群；b)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與T細胞群共培 養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；c)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群；及d)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，步驟(a)進一步包含在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施例中，TLR促效劑係選自由MPLA、Poly I：C、雷西莫特、嘎德莫特、及CL075所組成之群組。在一些實施例中，DC成熟培養基包含PGE2。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，在共培養開始後約5天，將抗CD3抗體添加至共培養物。在一些實施例中，將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，DC群及T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下、皮內、或靜脈內投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：a)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；d)將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群；及e)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，在該共培養開始時，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，在該共培養開始後，將該抗CD3抗體添加至該共培養物。在一些實施例中，DC成熟培養基包含INFγ及MPLA。在一些實施例中，DC成熟培養基進一步包含PGE2。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，DC群及T細胞群係獲自正接受治療之個體。在一些實施例中，向個體投予活化T細胞 至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下、皮內、或靜脈內投予。
在一些實施例中，該MASCT包含：a)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群；b)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA、INFγ、及PGE2；c)在初始共培養基中將載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該初始共培養基包含複數種細胞激素及抗PD-1抗體，該複數種細胞激素包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21；d)在該共培養開始後約3至7天(例如，約5天)，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群；及e)向該個體投予有效量的該等活化T細胞。在一些實施例中，MPLA以至少約0.5μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，INFγ以至少約100IU/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，PGE2以至少約0.1μg/mL的濃度存在於DC成熟培養基中。在一些實施例中，IL-2以至少約500IU/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，抗PD-1抗體以至少約10μg/mL的濃度存在於初始共培養基中。在一些實施例中，將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群在抗CD3抗體存在下共培養至少約10天。在一些實施例中，DC群及T細胞群係獲自正接受治療之個體。 在一些實施例中，向個體投予活化T細胞至少三次。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC。在一些實施例中，投予載有複數種腫瘤抗原肽之DC至少三次。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下、皮內、或靜脈內投予。
大致上，可根據個體的大小及狀況，並根據標準醫藥實務，判定本文所述之活化T細胞及載有複數種腫瘤抗原肽之DC群的劑量、時程、及投予途徑。例示性投予途徑包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肺內、膀胱內(intravesicular)、肌內、氣管內、皮下、眼內、鞘內(intrathecal)、或經皮。在一些實施例中，載有複數種腫瘤抗原肽之DC經皮下投予。在一些實施例中，活化T細胞經靜脈內投予。
投予至個體的細胞劑量可根據下列而變化：例如所投予之細胞的具體類型、投予途徑、及所治療之癌症的具體類型及階段。該量應足以產生所欲反應，諸如對癌症的治療反應，但沒有嚴重毒性或不良事件。在一些實施例中，待投予的活化T細胞或DC的量係治療有效量。在一些實施例中，細胞(諸如多抗原負載DC、或活化T細胞)的量係足以減小腫瘤大小、減少癌細胞數目、或降低腫瘤生長速率的量，其差異係至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%中任一者，此係相較於相同個體在治療前的對應腫瘤大小、癌細胞數目、或腫瘤生長速率，或相較於未接受治療的其他個體之對應活性。可使用標準方法來測量此效應的量值，諸 如採用純化酶的體外檢定法、基於細胞的檢定法、動物模型、或人體試驗。
在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×105、5×105、1×106、1.5×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、或5×107個細胞/個體。在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以約下列中任一者的劑量投予：1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至2×106、2×106至3×106、3×106至4×106、4×106至5×106、5×106至6×106、6×106至7×106、7×106至8×106、8×106至1×108、1×106至3×106、3×106至5×106、5×106至7×106、2×106至2×107、5×106至2×107、或1×106至2×107個細胞/個體。在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以至少約1×106個細胞/個體的劑量投予。在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以約1.5×106至約1.5×107個細胞/個體的劑量投予。
在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×104、2.5×104、5×104、1×105、2×105、2.5×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106、或1×107個細胞/kg。在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以約下列中任一者的劑量投予：1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至2×105、2×105至4×105、4×105至6×105、6×105至8×105、8×105至1×106、1×106至2×106、2×106至1×107、1×104至1×105、1×105至1×106、1×106至1×107、1×104至1×106、或1×105至1×107個細胞/kg。在一些實施例中，抗原負載樹突細胞係以至少約2×105個細胞/kg的劑量投予。在一些實施 例中，抗原負載樹突細胞係以約2.5×104至約2.5×105個細胞/kg的劑量投予。
在一些實施例中，活化T細胞係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、或5×1010個細胞/個體。在一些實施例中，活化T細胞係以約下列中任一者的劑量投予：1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、3×109至7×109、1×1010至2×1010、或1×109至1×1010個細胞/個體。在一些實施例中，活化T細胞係以至少約3×109個細胞/個體的劑量投予。在一些實施例中，活化T細胞係以約1×109至約1×1010個細胞/個體的劑量投予。
在一些實施例中，活化T細胞係以至少約下列中任一者的劑量投予：1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109個細胞/kg。在一些實施例中，活化T細胞係以約下列中任一者的劑量投予：1×107至1×108、1×107至5×107、2×107至4×107、5×107至1×108、1×108至2×108、5×107至1×108、1×108至2×108、2×108至5×108、1×108至1×109、或1×107至1×109個細胞/kg。在一些實施例中，活化T細胞係以至少約6×107個細胞/kg的劑量投予。在一些實施例中，活化T細胞係以約1.5×107至約2×108個細胞/kg的劑量投予。
MASCT可用於單一療法、以及與另一種藥劑的組合療法。例如，可將任何本文所述之治療方法與一或多種(諸如1、2、3、 4、或更多種中任一者)免疫檢查點抑制劑之投予組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係選自由下列所組成之群組：PD-1、PD-L1、CTLA-4、IDO、TIM-3、BTLA、VISTA、及LAG-3的抑制劑。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係PD-1的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-1抗體。例示性抗PD-1抗體包括但不限於尼沃魯單抗、派姆單抗、匹利珠單抗、BMS-936559、及阿替珠單抗、派姆單抗、MK-3475、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、及TSR-042。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係尼沃魯單抗(例如OPDIVO®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係派姆單抗(例如，KEYTRUDA®)。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係SHR-1210。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係PD-L1的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗PD-L1抗體。例示性抗PD-L1抗體包括但不限於KY-1003、MCLA-145、RG7446、BMS935559、MPDL3280A、MEDI4736、阿維魯單抗(avelumab)、或STI-A1010。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係CTLA-4的抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗CTLA-4抗體。例示性抗CTLA-4抗體包括但不限於伊匹單抗、曲美木單抗、及KAHR-102。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係伊匹單抗(例如，YERVOY®)。
在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係同時投予。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係以單一組成物投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑存在於第一、第二、 或第三共培養物中。在一些實施例中，在投予前(諸如緊接在投予前)將活化T細胞及免疫檢查點抑制劑混合。在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係經由不同組成物同時投予。
在一些實施例中，活化T細胞及免疫檢查點抑制劑係依序投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在投予活化T細胞之前投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在投予活化T細胞之後投予。
免疫檢查點抑制劑的例示性投予途徑包括但不限於腫瘤內、膀胱內、肌內、腹膜內、靜脈內、動脈內、顱內、胸膜內、皮下、及表皮途徑，或經遞送至已知含有此類活癌細胞的淋巴腺、身體空間、器官、或組織中。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑經靜脈內投予在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係藉由輸注投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在至少約10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、或更長中任一者內輸注。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係經由與活化T細胞相同的投予途徑投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係經由與活化T細胞不同的投予途徑投予。
合適的免疫檢查點抑制劑劑量包括但不限於約下列中任一者：1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、20mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、750mg/m2、1000mg/m2、或更大。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑劑量係下列中任一者：約1至約5mg/m2、約5至約10mg/m2、約10至約20mg/m2、約20至約50mg/m2、約50至約100mg/m2、約100 mg/m2至約200mg/m2、約200至約300mg/m2、約300至約400mg/m2、約400至約500mg/m2、約500至約750mg/m2、或約750至約1000mg/m2。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑劑量係約下列中任一者：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或更大。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑劑量係下列中任一者：約1μg/kg至約5μg/kg、約5μg/kg至約10μg/kg、約10μg/kg至約50μg/kg、約50μg/kg至約0.1mg/kg、約0.1mg/kg至約0.2mg/kg、約0.2mg/kg至約0.3mg/kg、約0.3mg/kg至約0.4mg/kg、約0.4mg/kg至約0.5mg/kg、約0.5mg/kg至約1mg/kg、約1mg/kg至約5mg/kg、約5mg/kg至約10mg/kg、約10mg/kg至約20mg/kg、約20mg/kg至約50mg/kg、約50mg/kg至約100mg/kg、或約1mg/kg至約100mg/kg。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每日投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以一週至少約1x、2x、3x、4x、5x、6x、或7x(即每日)中任一者投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每週投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每週投予且沒有中斷；每週(三週中有兩週)；每週(四週中有三週)；每兩週一次；每3週一次；每4週一次；每6週一次；每8週、每月、或每二至12個月一次。在一些實施例中，各投予之間的間隔少於約下列中任一者：6個月、3個月、1個月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、 7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天。在一些實施例中，各投予之間的間隔多於約下列中任一者：1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、或12個月。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係每3個月投予一次。在一些實施例中，給藥時程沒有中斷。在一些實施例中，各投予之間的間隔不多於約一週。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以與活化T細胞相同的給藥時程投予。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係以與活化T細胞不同的給藥時程投予。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係在每個MASCT治療週期中投予。例如，每個MASCT治療週期可投予免疫檢查點抑制劑約1、2、3、4、5、6、或更多次中之任一者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑並未在每個MASCT治療週期中投予。例如，免疫檢查點抑制劑可約每1、2、3、4、5、或更多個MASCT治療週期投予一次。
可在延長時段(諸如約一個月到至多約七年)內投予免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，在至少約下列中任一者的期間內投予免疫檢查點抑制劑：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84個月。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係單次投予。在一些實施例中，重複投予免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，重複投予免疫檢查點抑制劑直到疾病進展。
在一些實施例中，MASCT特別適用於在個體癌症中具有低總突變負荷的個體。在一些實施例中，MASCT特別適用於在個體癌症中具有癌症相關基因中低突變負荷的個體。在一些實施例中， MASCT特別適用於在個體癌症中具有T細胞反應相關免疫基因中低突變負荷的個體。在一些實施例中，MASCT特別適用於在個體癌症中具有MHC基因中低突變負荷的個體。突變負荷可係在下列中的突變負荷：所有癌細胞、或癌細胞之子集，諸如原發性或轉移性腫瘤部位，例如腫瘤活檢樣本中的細胞。
在一些實施例中，一或多個基因的低突變負荷係在該一或多個基因上累積的突變數量少。在一些實施例中，不多於約500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、或更少中任一者的突變之總數指示低突變負荷。在一些實施例中，在一或多個MHC基因中不多於約50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個中任一者的突變指示該一或多個MHC基因的低突變負荷。在一些實施例中，一或多個基因的低突變負荷係在該一或多個基因(諸如MHC基因)上累積的突變數量與在所選基因集(諸如癌症相關基因)或全基因組中的突變總數之間的低比率。
在一些實施例中，一或多個MHC基因包含MHC I類基因(或基因座)。在一些實施例中，一或多個MHC基因包含MHC II類基因(或基因座)。在一些實施例中，其中個體係人類個體，一或多個MHC基因係選自由HLA-A、HLA-B、HLA-C、及B2M所組成之群組。
例示性突變包括但不限於缺失、移碼、插入、插入或缺失(indel)、誤義突變、無意義突變、點突變、拷貝數變異、單一核苷酸變異(single nucleotide variation,SNV)、緘默突變、剪接位突變、剪 接變體、基因融合、及易位。在一些實施例中，MHC基因的拷貝數變異係由基因組的結構性重排造成，其包括染色體或其片段的缺失、重複、倒位、及易位。在一些實施例中，一或多個MHC基因中的突變係選自點突變、移碼突變、基因融合、及拷貝數變異。在一些實施例中，突變係在MHC基因的蛋白質編碼區中。在一些實施例中，突變是非同義突變。在一些實施例中，突變不具多型性。在一些實施例中，突變存在於個體的正常細胞中。在一些實施例中，突變不存在於個體的正常細胞中。在一些實施例中，突變影響由受影響基因編碼的MHC分子之生理化學或功能性質，諸如穩定性或結合親和力。在一些實施例中，突變導致MHC分子中不可逆的缺陷。在一些實施例中，突變降低MHC分子對T細胞表位及/或T細胞受體的結合親和力。在一些實施例中，突變係功能喪失型突變。在一些實施例中，突變導致MHC分子中可逆的缺陷。在一些實施例中，突變不影響MHC分子對T細胞表位及/或T細胞受體的結合親和力。在一些實施例中，突變係體細胞突變。在一些實施例中，突變係生殖系突變。
計入突變負荷之突變可存在於所有癌細胞中或癌細胞的子集中。在一些實施例中，突變存在於個體的所有癌細胞中。在一些實施例中，突變存在於腫瘤部位的所有癌細胞中。在一些實施例中，突變為殖株性。在一些實施例中，突變為次殖株性。在一些實施例中，突變存在於個體的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的癌細胞中。
某些MHC基因中及/或一或多個MHC基因之某些域或位置中的突變可能對個體對本文所述治療方法的臨床反應具有更深遠的影響。例如，功能喪失型突變可發生在HLA分子的前導肽序列、a3域(其結合T細胞的CD8輔受體)、a1肽結合域、或a2肽結合域中；參見例如Shukla S.et al.Nature Biotechnology 33,1152-1158(2015)，其以引用方式併入本文中。B2M(β2-巨球蛋白)基因中的突變亦可啟動腫瘤逃脫表型。參見例如Monica B et al.Cancer Immunol.Immu.,(2012)61：1359-1371。在一些實施例中，在一或多個MHC基因的功能區中存在任何數量(諸如1、2、3、4、5、或更多個)的突變指示高突變負荷，該等功能區諸如前導肽序列、a1域、a2域、或a3域。在一些實施例中，在一或多個MHC基因(諸如人類個體中的HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)中存在任何數量(諸如1、2、3、4、5、或更多個)的功能喪失型突變指示高突變負荷。在一些實施例中，一或多個MHC基因中的低突變負荷在功能區中不包含突變，該等功能區包括該一或多個MHC基因(諸如HLA-A、HLA-B、或HLA-C基因)的前導肽序列、a1域(例如，與CD8輔受體直接接觸的殘基)、a2域、及a3域(例如，與表位直接接觸的殘基)。在一些實施例中，在B2M基因中存在任何數量的突變(諸如功能喪失型突變)指示高突變負荷。在一些實施例中，在一或多個MHC基因中的低突變負荷在B2M基因中不包含突變。
可藉由所屬技術領域中任何已知的方法來判定一或多個基因(諸如MHC基因)的突變負荷，該等方法包括但不限於基因組 DNA定序、外顯子定序、或其他使用桑格定序或次世代定序平台之基於DNA定序的方法；聚合酶連鎖反應檢定；原位雜交檢定；及DNA微陣列。
在一些實施例中，藉由對來自個體的腫瘤樣本定序，判定一或多個MHC基因的突變負荷。在一些實施例中，定序係次世代定序。在一些實施例中，定序係全基因組定序。在一些實施例中，定序係外顯子定序，諸如全外顯子定序(whole exome sequencing,「WES」)。在一些實施例中，定序係RNA定序。在一些實施例中，定序係候選基因(諸如癌症相關基因加上HLA基因)的靶向定序。例如，ONCOGXONETM Plus(Admera Health)可用於對癌症相關基因及HLA基因座定序，且具有高定序深度。在一些實施例中，可使用相同的定序數據來判定一或多個MHC基因的突變負荷並識別個體中的新抗原。
在一些實施例中，腫瘤樣本係組織樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係腫瘤活檢樣本，諸如細針穿刺的腫瘤細胞、或由腹腔鏡術獲得的腫瘤細胞(諸如包括腫瘤基質)。在一些實施例中，腫瘤樣本係新鮮獲得。在一些實施例中，腫瘤樣本經冷凍。在一些實施例中，腫瘤樣本係甲醛固定石蠟包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係細胞樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本包含循環轉移性癌細胞。在一些實施例中，藉由將來自血液的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)分類，獲得腫瘤樣本。在一些實施例中，自腫瘤樣本萃取核酸(諸如DNA及/或RNA)，以用 於定序分析。在一些實施例中，將腫瘤樣本的定序數據與參考樣本(諸如來自相同個體的健康組織樣本、或健康個體的樣本)的定序數據比較，以識別突變並判定腫瘤細胞中的突變負荷。在一些實施例中，將腫瘤樣本的定序數據與來自基因組資料庫的參考序列比較，以識別突變並判定腫瘤細胞中的突變負荷。
任何MASCT方法可包含使用在複數種腫瘤抗原肽中的一或多種新抗原肽。在一些實施例中，該MASCT進一步包含基於個體中具有一或多種(諸如至少5種)新抗原而選擇用於治療方法之個體的步驟、及/或下列步驟：(i)識別該個體的新抗原；及(ii)將衍生自該新抗原的新抗原肽併入該複數種腫瘤抗原肽，以用於該治療方法。
在一些實施例中，該MASCT包含：(a)識別該個體的新抗原；(b)將新抗原肽併入複數種腫瘤抗原肽，其中該新抗原肽包含該新抗原中的新表位；(c)可選地投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之DC；(d)藉由將抗原負載DC與T細胞群共培養來製備活化T細胞群；及(e)向該個體投予有效量的活化T細胞，其中該個體具有一或多種新抗原。
個體可具有任何數量(諸如至少約1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、100、或更多種中任一者)的新抗原，以受益於MASCT方法，該方法使用包含新抗原肽的複數種腫瘤抗原肽。在一些實施例中，MASCT方法特別適用於具有至少約4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多種中任一者的新抗原之個體。在一些實施例中，新抗原包含一或多個新表位。在一些實施 例中，MASCT方法特別適用於具有至少約4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多個中任一者的新表位之個體。在一些實施例中，T細胞表位係MHC-I限制性表位。在一些實施例中，相較於對應的野生型T細胞表位，新表位對個體的MHC分子具有較高的親和性。在一些實施例中，相較於對應的野生型T細胞表位，新表位對模型T細胞受體具有較高的親和性。在一些實施例中，新抗原(或新表位)係殖株性新抗原。在一些實施例中，新抗原(或新表位)係次殖株性新抗原。在一些實施例中，新抗原(或新表位)存在於個體中至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中任一者的腫瘤細胞中。
新抗原之數量可與其他生物標記或選擇標準組合，以為本文所述MASCT方法中任一者選擇個體。在一些實施例中，MASCT方法特別適用於以下的個體：在癌細胞中具有低突變負荷(諸如在一或多個MHC基因中)，且/或具有至少約4、5、6、7、8、10、或更多種中任一者的新抗原(諸如具有高親和性MHC-I限制性新表位之新抗原)。
可基於個體的新抗原設計任何數量(諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多種中任一者)的新抗原肽，並將其併入用於任何本文所述之治療方法的複數種腫瘤抗原肽中。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含單一新抗原肽。在一些實施例中，複數種腫瘤抗原肽包含複數種新抗原肽。各新抗原肽可包含一或多個新表位，該新表位係來自個體的新抗原。在一些實施例中，新表位係T細胞表 位。基於新抗原設計新抗原肽的方法係描述於「複數種腫瘤抗原肽」一節中。
可使用所屬技術領域中任何已知的方法，識別個體中的新抗原。在一些實施例中，基於來自個體之腫瘤樣本的基因輪廓識別新抗原。各新抗原包含一或多個新表位。在一些實施例中，基於腫瘤樣本的基因輪廓，識別新抗原中的一或多個新表位。可使用任何已知的基因剖析方法(諸如次世代定序(NGS)方法、微陣列、或蛋白質體方法)來提供腫瘤樣本的基因輪廓。
在一些實施例中，藉由對來自個體的腫瘤樣本定序，識別新抗原。在一些實施例中，定序係次世代定序。在一些實施例中，定序係全基因組定序。在一些實施例中，定序係外顯子定序，諸如全外顯子定序(whole exome sequencing,「WES」)。在一些實施例中，定序係RNA定序。在一些實施例中，定序係候選基因(諸如癌症相關基因)的靶向定序。許多市售NGS癌症組(例如ONCOGXONETM Plus(Admera Health))可用於對癌症相關基因定序，且具有高定序深度。
在一些實施例中，腫瘤樣本係組織樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係腫瘤活檢樣本，諸如細針穿刺的腫瘤細胞、或由腹腔鏡術獲得的腫瘤細胞(諸如包括腫瘤基質)。在一些實施例中，腫瘤樣本係新鮮獲得。在一些實施例中，腫瘤樣本經冷凍。在一些實施例中，腫瘤樣本係甲醛固定石蠟包埋(Formaldehyde Fixed-Paraffin Embedded,FFPE)樣本。在一些實施例中，腫瘤樣本係細胞樣本。在一些實施例 中，腫瘤樣本包含循環轉移性癌細胞。在一些實施例中，藉由將來自血液的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)分類，獲得腫瘤樣本。在一些實施例中，自腫瘤樣本萃取核酸(諸如DNA及/或RNA)，以用於定序分析。在一些實施例中，自腫瘤樣本萃取蛋白質，以用於定序分析。
在一些實施例中，將腫瘤樣本的基因輪廓與參考樣本(諸如來自相同個體的健康組織樣本、或健康個體的樣本)的基因輪廓比較，以識別腫瘤細胞中的候選突變基因。在一些實施例中，將腫瘤樣本的基因輪廓與來自基因組資料庫的參考序列比較，以識別腫瘤細胞中的候選突變基因。在一些實施例中，候選突變基因係癌症相關基因。在一些實施例中，各候選突變基因包含：一或多個突變，諸如非同義取代、插入或缺失(indel/insertion or deletion)、或基因融合，其可產生新抗原。常見的單核苷酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)係排除在候選突變之外。
在一些實施例中，自候選突變蛋白識別新抗原中的新表位。在一些實施例中，以電腦模擬預測新表位。用於T細胞表位預測的例示性生物資訊工具係所屬技術領域中已知的，例如參見Yang X.及Yu X.(2009)的「An introduction to epitope prediction methods and software」Rev.Med.Virol.19(2)：77-96。T細胞表位預測演算法中所考慮的因素包括但不限於個體的MHC亞型、T細胞表位的序列衍生之生理化學性質、MHC結合模體、蛋白酶體裂解模式、抗原處理相關轉運蛋白(transporter associated with antigen processing,TAP)轉運效率、 MHC結合親和力、肽-MHC穩定性、及T細胞受體結合親和力。在一些實施例中，新表位係MHC-I限制性表位。在一些實施例中，新表位係MHC-II限制性表位。
在一些實施例中，新表位對個體的MHC分子具有高親和性。在一些實施例中，該方法進一步包含判定個體的MHC亞型(例如，自定序數據判定)，以識別個體的一或多種MHC分子。在一些實施例中，該方法進一步包含判定新表位對MHC分子(諸如MHC I類分子)的親和性。在一些實施例中，該方法包含判定新表位對個體之一或多種MHC(諸如MHC I類)分子的親和性。在一些實施例中，將新表位對個體之一或多種MHC分子的親和性，與對應野生型表位對個體之一或多種MHC分子的親和性比較。在一些實施例中，選擇相較於對應野生型表位，對個體之一或多種MHC分子(諸如MHC-I分子)具有較高(諸如至少約1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)親和性的新表位。在一些實施例中，使用所屬技術領域中任何已知的工具或方法，以電腦模擬預測MHC結合親和力。在一些實施例中，藉由實驗判定MHC結合親和力，諸如使用體外結合檢定。
在一些實施例中，該MASCT進一步包含判定複合物對T細胞受體的親和性，該複合物包含新表位及MHC分子(諸如個體的MHC I類分子)。在一些實施例中，將包含新表位及MHC分子之複合物對T細胞受體的親和性，與包含對應野生型表位及MHC分子之複合物的親和性比較。在一些實施例中，MHC分子係來自個體。在一些實施例中，T細胞受體係在個體之一或多個T細胞的表面上。在一些實 施例中，選擇相較於對應野生型表位，在複合物中對T細胞受體模型具有較高(諸如至少約1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)親和性的新表位，該複合物包含新表位及MHC分子。在一些實施例中，使用所屬技術領域中任何已知的任何工具或方法，以電腦模擬預測TCR結合親和力。在一些實施例中，藉由實驗判定TCR結合親和力，例如藉由判定T細胞對新表位的反應。
在一些實施例中，進一步基於腫瘤樣本中新抗原(或新表位)的表現水平，識別該新抗原(或新表位)。可使用所屬技術領域中任何已知的mRNA或蛋白質水平定量方法，諸如RT-PCR、基於抗體的檢定法、及質譜術，判定新抗原(或新表位)的表現水平。在一些實施例中，自腫瘤樣本的定序數據，判定新抗原(或新表位)的表現水平。在一些實施例中，新抗原(或新表位)係以至少約10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、或更多個中任一者拷貝/細胞的水平表現於腫瘤細胞中。在一些實施例中，相較於對應野生型蛋白質(或對應野生型表位)，新抗原(或新表位)係以多於約1.5、2、5、10、20、50、100、或更多倍中任一者的水平表現於腫瘤細胞中。
在一些實施例中，藉由包含下列之步驟選擇或識別新抗原肽：(a)對來自個體的腫瘤樣本定序以識別新抗原；(b)識別新抗原中的新表位；可選地(c)判定該個體的MHC亞型(例如，使用定序數據判定)，以識別該個體的MHC分子；可選地(d)判定該新表位對該個體之該MHC分子的親和性；可選地(e)判定複合物對T細胞受體的親和 性，該複合物包含該新表位及該MHC分子；及(f)獲得包含該新表位之肽，以提供該新抗原肽。在一些實施例中，相較於包含對應野生型T細胞表位及MHC分子的複合物，新表位對個體之MHC分子(諸如MHC-I分子)具有較高親和性，且/或在包含該新表位及該MHC分子之複合物中對TCR具有較高親和性。在一些實施例中，根據具有表位的新抗原之天然序列，將新表位在N端或C端或兩端延伸，以獲得延伸序列，其中該延伸序列係適於由I類及II類兩者MHC分子呈現。使用一或多種新抗原肽的任何本文所述之治療方法可進一步包含任一或多個新抗原選擇/識別步驟。
任何本文所述之治療方法及MASCT方法可進一步包含在個體接受治療之後的監測步驟。治療後監測可有利於調整個體的治療方案，以最佳化治療成果。
例如，可基於個體對複數種腫瘤抗原肽中各者的特異性免疫反應、及/或個體對活化T細胞的臨床反應，調整或客製化本文所述的複數種腫瘤抗原肽，以提供複數種客製化腫瘤抗原肽，其可用於重複治療。在一些實施例中，可自用於未來製備經脈衝DC或活化T細胞的抗原肽池，移除不會引發強烈特異性免疫反應的腫瘤抗原肽。
可使用所屬技術領域中任何已知的方法，例如藉由測量經過個體腫瘤抗原肽刺激後來自T細胞(或PBMC)的細胞毒性因子(諸如穿孔素或顆粒酶B)、或細胞激素釋放(諸如IFNγ或TNFα)之水平，判定對一或多種腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。可使用基於抗體的檢定法(諸如ELJSPOT)來定量細胞毒性因子、或細胞激素(諸 如IFNγ)水平。在一些實施例中，將回應於腫瘤抗原肽之來自T細胞(或PBMC)的細胞激素(諸如IFNγ)釋放水平標準化至參考物(諸如基線細胞激素釋放水平、或回應於不相關肽之來自T細胞(或PBMC)的非特異性細胞激素釋放水平)，以提供細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值。在一些實施例中，在ELISPOT檢定中，大於約1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中任一者的細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值指示對腫瘤抗原肽的強烈特異性免疫反應。在一些實施例中，將在ELISPOT檢定中細胞激素(諸如IFNγ)倍數變化值小於約10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.2、或更小中任一者的腫瘤抗原肽自該複數種腫瘤抗原肽移除，以提供複數種用於未來治療的客製化腫瘤抗原肽。
可由醫師利用所屬技術領域中已知的方法，諸如利用造影方法、血液測試、生物標記評估、及活檢，評估個體對本文所述治療方法的臨床反應。在一些實施例中，藉由判定個體在接受活化T細胞之前及之後的循環腫瘤細胞(CTC)數目，監測臨床反應。在一些實施例中，CTC已自原發性腫瘤剝離並在體液中循環。在一些實施例中，CTC已自原發性腫瘤剝離並在血流中循環。在一些實施例中，CTC係轉移的指示。CTC數目可藉由所屬技術領域中已知的各種方法判定，該等方法包括但不限於CellSearch方法、Epic Science方法、IsoFlux、及maintrac。在一些實施例中，判定在個體血液樣本中的單CTC(包括CTC的特異性亞型)數目。在一些實施例中，當個體在接受治療後每mL血液樣本的單CTC數目多於約10、20、50、100、150、200、 300、或更多中任一者時，其指示轉移的風險增加、及/或對治療方法的臨床反應不佳。在一些實施例中，相較於接受治療之前，個體在接受治療後的單CTC數目增加(諸如增加至少約1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示對治療方法的臨床反應不佳。在一些實施例中，判定在個體血液樣本中的CTC團簇數目。在一些實施例中，當個體在接受治療後的血液樣本中偵測到至少約1、5、10、50、100、或更多個中任一者的CTC團簇時，其指示轉移的風險增加、及/或對治療的臨床反應不佳。在一些實施例中，相較於接受治療之前，個體在接受治療後的CTC團簇數目增加(諸如增加至少約1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示對治療的臨床反應不佳。
III.腫瘤特異性TCR
本文亦提供的是腫瘤特異性TCR，其係使用第II節所述方法中之任一者獲得。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR特異性辨識CEA、RSG-5、或HPV18-E7。編碼腫瘤特異性TCR之核酸及載體、表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞亦在本申請案的範疇內。
例示性腫瘤特異性TCR
使用本文所述之方法識別的例示性TCR係顯示於下表1中。V、J、C區段係根據IMGT資料庫命名。可使用所屬技術領域中已知的其他命名法及區段劃分(delineation)演算法。例如，根據IMGT，TCR鏈包含：自胺基酸位置1至26之FR1、自胺基酸位置27至38之 CDR1、自胺基酸位置39至55之FR2、自胺基酸位置56至65之CDR2、自胺基酸位置66至104之FR3、及自胺基酸位置105至117之CDR3(針對重排的V-J基因及V-D-J基因)、及自胺基酸位置118至129之FR4。參見例如Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)、及world wide web.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html。例示性TCR之CDR1、CDR2、及CDR3係顯示於「序列表」一節及表5中。
表1.例示性腫瘤特異性TCR
Figure 108112961-A0202-12-0150-1042
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的CEA肽之表位。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至RGS5之表位，諸如人類RGS5，例如人類RGS5之胺基酸1-30或胺基酸16-30。在一些實施例中，提供一種抗原 辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的RGS5肽之表位。在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的RGS5之表位。在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的RGS5之表位。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至HPV18-E7之表位，諸如人類HPV18-E7，例如人類HPV18-E7之胺基酸80-94、76-105、或84-102。在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HPV18-E7肽之表位。在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HPV18-E7之表位。在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HPV18-E7之表位。在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HPV18-E7之表位。
亦提供的是單離腫瘤表位，其包含SEQ ID NO：82至86之胺基酸序列中任一者。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)，其包含SEQ ID NO：4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、 64、67、70、73、76、79、87、90、93、及96中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)，其包含：(a)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：4、10、及16之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：7、13、及19之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(b)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：22、28、34、40、46、及52之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：7、13、19、25、31、37、43、49、及55之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；或(c)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：58、64、70、76、87、及93之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：61、67、73、79、90、及96之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)，其包含：(a)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：4具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：7具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(b)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：10具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：13具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)； (c)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：16具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：19具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(d)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：22具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：25具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(e)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：28具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：31具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(f)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：34具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：37具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(g)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：40具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：43具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(h)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：46具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：49具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(i)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：52具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：55具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(j)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：58具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：61具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(k)第一胺基酸序 列，其與SEQ ID NO：64具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：67具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(l)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：70具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：73具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(m)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：76具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：79具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；(n)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：87具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：90具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；或(o)第一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：93具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及第二胺基酸序列，其與SEQ ID NO：96具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)。在一些實施例中，(a)至(c)中任一者之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的CEA肽之表位。在一些實施例中，(d)至(i)中任一者之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的RGS-5肽之表位。在一些實施例中，(e)至(g)及(i)中任一者之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的RGS-5表位。在一些實施例中，(h)之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的RGS-5表位。在一些實施例中，(j)至(o)中任一者之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HPV18-E7肽之表位。 在一些實施例中，(n)之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HPV18-E7表位。在一些實施例中，(j)、(l)、及(m)中任一者之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HPV18-E7表位。在一些實施例中，(o)之抗原結合構築體特異性結合至包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HPV18-E7表位。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)，其包含CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、87、90、93、及96中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：4、10、及16之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、及19之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(b)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：22、28、34、40、46、及52之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、19、25、31、37、43、49、及55之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；或(c)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：58、64、70、76、87、及93之胺基酸序列 中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：61、67、73、79、90、及96之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：4具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(b)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：10具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：13具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(c)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：16具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：19具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(d)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：22具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：25具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(e)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：28具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈， 該CDR3包含與SEQ ID NO：31具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(f)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：34具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：37具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(g)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：40具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：43具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(h)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：46具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：49具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(i)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：52具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：55具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(j)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：58具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：61具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(k)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：64具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈， 該CDR3包含與SEQ ID NO：67具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(l)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：70具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：73具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(m)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：76具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：79具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；(n)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：87具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：90具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；或(o)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：93具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：96具有至少約90%序列同一性(例如，100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，(a)至(c)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的CEA肽之表位。在一些實施例中，(d)至(i)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的RGS-5肽之表位。在一些實施例中，(e)至(g)及(i)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的RGS-5表位。在一些實施例中，(h)之腫瘤特異性TCR 特異性結合至包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的RGS-5表位。在一些實施例中，(j)至(o)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HPV18-E7肽之表位。在一些實施例中，(n)之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HPV18-E7表位。在一些實施例中，(j)、(l)、及(m)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HPV18-E7表位。在一些實施例中，(o)之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HPV18-E7表位。
任何本文所述的腫瘤特異性TCR可包含V部分及/或J部分。任何合適的V部分及J部分皆可適用，參見例如IMGT資料庫。表1顯示V部分及J部分的例示性組合。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、88、及94中任一者的TRAV部分、或其變體；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：8、14、20、26、32、38、44、56、62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者的TRBV部分、或其變體。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、88、及94中任一者的TRAJ部分、或其變體；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：8、14、20、26、32、38、44、56、62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者的TRBJ部分、或其變體。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：5、11、及17之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：8、14、及20之胺基酸序列中任一者之CDR；(b)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：23、29、35、41、47、及53之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：26、32、38、44、50、及56之胺基酸序列中任一者之CDR；或(c)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：59、65、71、77、88、及94之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者之CDR。
本文所述之腫瘤特異性TCR亦包含TCR恆定域。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、88、及94中任一者的TCRα恆定域(TRAC)、或其變體；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：8、14、20、26、32、38、44、56、62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者的TCRβ恆定域(TRBC)、或其變體。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：人類TRAC及人類TRBC，諸如人類Cα及人類Cβ1、或人類Cα及人類Cβ2。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：包含TRAC或其變體之TCRα鏈，該TRAC包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列；及包含TRBC之TCRβ鏈，該TRBC包含SEQ ID NO：202或204之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：鼠類TRAC及鼠類TRBC，諸如鼠類Cα及鼠類Cβ1。在一些實施例中，鼠類TRAC包含位置117處的修飾(例如， S117L)及/或110處的修飾(例如，G110V)。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含：包含TRAC或其變體之TCRα鏈，該TRAC包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列；及包含TRBC之TCRβ鏈，該TRBC包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列。
在一些實施例中，腫瘤特異性TCR係人類TCR。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR包含人類TCR可變區、及來自非人類物種(諸如小鼠)的TCR恆定區。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：5、11、及17之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：8、14、及20之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(b)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：23、29、35、41、47、及53之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：26、32、38、44、50、及56之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸 序列；或(c)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：59、65、71、77、88、及94之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：62、68、74、80、及91、及97之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：5具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：8具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(b)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：11具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：14具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(c)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：17具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：20具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具 有100%同一性)的胺基酸序列；(d)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：23具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：26具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(e)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：29具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：32具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(f)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：35具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：38具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(g)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：41具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：44具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(h)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：47具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一 性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：50具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(i)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：53具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：56具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(j)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：59具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：62具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(k)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：65具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：68具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(l)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：71具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：74具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(m) TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：77具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：80具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；(n)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：88具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：91具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；或(o)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：94具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：97具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，(a)至(c)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的CEA肽之表位。在一些實施例中，(d)至(i)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的RGS-5肽之表位。在一些實施例中，(e)至(g)及(i)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的RGS-5表位。在一些實施例中，(h)之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的RGS-5表位。在一些實施例中，(j)至(o)中任一者之腫 瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的HPV18-E7肽之表位。在一些實施例中，(n)之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的HPV18-E7表位。在一些實施例中，(j)、(l)、及(m)中任一者之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的HPV18-E7表位。在一些實施例中，(o)之腫瘤特異性TCR特異性結合至包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的HPV18-E7表位。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/RGS5表位複合物，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DPA1*02：02/DPB1*05：01。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：28；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：31。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：254之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：255之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：256之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：257之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：214之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：212之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與 SEQ ID NO：214具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：212具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：29具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：32具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：103具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：105具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：147或149之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/RGS5表位複合物，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA- DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：34；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：37。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：258之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：259之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：260之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：261之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：242之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：240之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：242具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：240具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：35具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的 胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：38具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：107具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：109具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：151、153、155、及157中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/RGS5表位複合物，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：40；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：43。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：262之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：263之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：264之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：265之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在 一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：238之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：236之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：238具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：236具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：41具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：44具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：111具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：113具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。 在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：159、161、163、及165中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/RGS5表位複合物，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：46；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：49。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：266之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：267之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：268之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：269之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：222之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：220之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：222具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：220具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施 例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：47具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：50具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：115具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：117具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：167及169中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/RGS5表位複合物，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DPA1*02：02/DPB1*05：01。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：52；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：55。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：270之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO： 271之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：272之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：273之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：210之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：208之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：210具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：208具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：53具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：56具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：119具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的 胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：121具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：143及145中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：58；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：61。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：274之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：275之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：277之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：234之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：232之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：234具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：232具有至少約80%同一性 (例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：59具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：62具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：123具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：125具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：179及181中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：70；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：73。 在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：279之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：280之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：281之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：226之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：224之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：226具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：224具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：71具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：74具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識 構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：127具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：129具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：183及185中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-II。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：76；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：79。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：282之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：283之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：284之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：285之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：218之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：216之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：218具有至 少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：216具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：77具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：80具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：131具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：133具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：187及189中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA- DRA/DRB1*09：01。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：87；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：90。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：286之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：287之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：288之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：289之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：246之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：244之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：246具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：244具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：88具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈， 其包含與SEQ ID NO：91具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：135具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：137具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：171、173、175、及177中任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種抗原辨識構築體(例如，TCR)，其特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列，且其中該MHC係HLA-DPA1*02：02/DPB1*05：01、HLA-DPA1*01：03/DPB1*02：01、或HLA-DPA1*01：03/DPB1*05：01。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：93；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：96。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：290之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：291之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：292之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：293之胺基酸序列，該 CDR3包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含：TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：230之CDR1、CDR2、及CDR3；TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：228之CDR1、CDR2、及CDR3。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：230具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：228具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體係人類TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：94具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：97具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：139具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的胺基酸序列；TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：141具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一 者，或具有100%同一性)的胺基酸序列。在一些實施例中，抗原辨識構築體包含SEQ ID NO：191及193中任一者之胺基酸序列。
天然存在的TCR係由αβ或γδ鏈組成的異二聚體受體，該等αβ或γδ鏈在T細胞表面上配對。各α、β、γ、及δ鏈係由兩個Ig樣域組成：可變域(V)，其透過互補決定區(CDR)而賦予抗原辨識；接着是恆定域(C)，其藉由連接肽及跨膜(TM)區錨定至細胞膜。TM區域與CD3傳訊構造之不變次單元相關聯。V域之各者具有三個CDR。此等CDR與複合物(其係結合至由主要組織相容性複合體編碼之蛋白質的抗原肽之間的複合物，pMHC)相互作用(Davis and Bjorkman(1988)Nature,334,395-402；Davis et al.(1998)Annu Rev Immunol,16,523-544；Murphy(2012),xix,868 p.)。
「同源性(homology)」係指在兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當兩個經比較序列中的位置係由相同的鹼基或胺基酸單體次單元佔據時，例如，如果兩個DNA分子之各者中的位置係由腺嘌呤佔據，則該等分子在該位置係「同源」。兩個序列之間的「同源性百分比(percent of homology)」或「序列同一性百分比(percent sequence identity)」係兩個序列所共有的匹配或同源位置之數目除以經比較位置之數目再乘以100的函數，並將任何保守型取代視為序列同一性的一部分。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個為匹配或同源，則該兩個序列係60%同源。舉實例而言，DNA序列ATTGCC與TATGGC共有50%同源性。通常，當比對兩個序列時進行比較，以提供最大同源性。可採用所屬技術領域中通常知識內的 各種方式，例如使用公開可用電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE軟體，來達成以判定胺基酸序列同一性百分比為目的之比對。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於測量比對的適當參數，包括為了在經比較序列全長上達到最大比對而需要的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用以下序列比較電腦軟體程式來產生胺基酸序列同一性值%：MUSCLE(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5)：1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMC Bioinformatics 5(1)：113,2004)。
亦提供的是本文所述之TCR中任一者辨識的表位、及MHC/表位複合物。進一步提供的是與本文所述之TCR中任一者競爭結合至相同MHC/表位複合物的TCR。
HLA限制
本文所述的腫瘤特異性TCR為MHC I類或MHC II類限制性。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR係限於HLA單倍型。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR具有亞洲人中主要的HLA單倍型限制。圖25A至圖25B顯示例示性TCR的HLA限制。
MHC I類蛋白係兩種主要類型的主要組織相容性複合體(MHC)分子中之一種(另一種係MHC II類)，且係見於體內幾乎每個有核細胞上。彼等的功能是向T細胞呈現來自細胞內的蛋白質片段；健康細胞將受到忽略，而含有外來或突變蛋白質的細胞將受到免疫系統的攻擊。由於MHC I類蛋白呈現衍生自胞質蛋白的肽，因此MHC I 類呈現途徑常稱為胞質或內源性途徑。I類MHC分子會結合主要由蛋白酶體分解胞質蛋白而產生的肽。然後，MHC I：肽複合物經插入細胞之質膜。該肽結合至I類MHC分子的胞外部分。因此，I類MHC的功能是向細胞毒性T細胞(CTL)呈現細胞內蛋白質。然而，在一種稱為交叉呈遞的程序中，I類MHC亦可呈現自外源性蛋白質產生的肽。
MHC I類蛋白質係由兩個多肽鏈組成，即α及β2微球蛋白(β2M)。兩個鏈係經由β2M及α3域的相互作用非共價連接。僅α鏈具多型性且係由HLA基因編碼，而β2M次單元不具多型性且係由β-2微球蛋白基因編碼。α3域跨越質膜且與T細胞的CD8輔受體相互作用。α3-CD8相互作用將MHC I分子固定就位，而細胞毒性T細胞表面上的T細胞受體(TCR)結合其α1-α2異二聚體配體，並檢查耦合肽的抗原性。α1及α2域折疊以構成用於肽結合的溝槽。MHC I類蛋白會結合長度為8至10個胺基酸的肽。
MHC II類分子係通常僅在抗原呈現細胞上發現的分子家族，該等抗原呈現細胞諸如樹突細胞、單核吞噬細胞、一些內皮細胞、胸腺上皮細胞、及B細胞。由II類肽呈現的抗原係衍生自胞外蛋白質(不同於I類中的胞質蛋白)；因此，抗原呈現的MHC II類依賴性途徑稱為胞吞或外源性途徑。藉由吞噬作用而發生MHC II類分子之負載；胞外蛋白質經胞吞，在溶酶體中消化，且所得表位肽片段係在其遷移至細胞表面之前負載於MHC II類分子上。
類似於MHC I類分子，II類分子亦係異二聚體，但在此情況下係由兩個同質肽組成，即α及β鏈。子名稱α1、α2等係指HLA 基因內之不同域；各域通常係由基因內不同外顯子編碼，且一些基因具有編碼前導序列、跨膜序列等另外的域。由於MHC II類分子的抗原結合溝槽在兩端為開放，而I類分子上的對應溝槽在各端為封閉，因此MHC II類分子所呈現的抗原較長，通常介於15與24個胺基酸殘基長之間。
人類白血球抗原(HLA)基因係MHC基因的人類版本。人類的三種主要MHC I類蛋白係HLA-A、HLA-B、及HLA-C，而3種次要的MHC I類蛋白係HLA-E、HLA-F、及HLA-G。涉及人類抗原呈現的三種主要MHC II類蛋白係HLA-DP、HLDA-DQ、及HLA-DR，而其他MHC II類蛋白HLA-DM及HLA-DO涉及抗原的內部處理及負載。將HLA-A評級為人類基因中具有演變最快速的編碼序列。截至2013年12月，有2432個已知HLA-A等位基因，編碼1740種活性蛋白質及117種無效蛋白質。HLA-A基因位於第6號染色體的短臂上，並編碼HLA-A的較大α鏈成分。HLA-A α鏈的變異是HLA功能的關鍵。此變異促進族群中的基因多樣性。由於各HLA對某些結構的肽具有不同親和性，因此愈多種的HLA意指細胞表面上將「呈現」愈多種的抗原，從而提高族群子集對抗任何給定外來侵入者的可能性。此會降低單一病原體能夠消滅所有人口的可能性。各個體可表現至多兩種類型的HLA-A，一種來自其父母之各者。一些個體將自雙親遺傳到相同HLA-A，而減少其個別的HLA多樣性；不過，大多數個體將接受兩種不同的HLA-A拷貝。所有HLA組循此相同模式。換言之，一個人僅能表現2432個已知HLA-A等位基因中一或二者。
所有等位基因皆獲得至少四位數分類，例如HLA-A*02：12。A表示該等位基因所屬之HLA基因。有許多HLA-A等位基因，因此利用血清型分類來簡化歸類。下一對數字指示此分配。例如，HLA-A*02：02、HLA-A*02：04、及HLA-A*02：324皆係A2血清型的成員(由前綴*02指定)。此組係負責HLA相容性的主要因子。在此之後的所有數字無法藉由血清分型判定，而係透過基因定序指定。第二組數字指示所產生之HLA蛋白。此等係按照發現順序分配，且截至2013年12月，已知有456種不同HLA-A02蛋白(分配名稱HLA-A*02：01至HLA-A*02：456)。最短可能的HLA名稱包括此等細節兩者。在此之後的各延伸表示核苷酸變化，該核苷酸變化可能或可能不改變該蛋白。
在一些實施例中，腫瘤特異性TCR特異性結合至包含目標腫瘤抗原肽及MHC I類蛋白的複合物，其中該MHC I類蛋白係HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、或HLA-G。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-A、HLA-B、或HLA-C。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-A。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-B。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-C。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-A01、HLA-A02、HLA-A03、HLA-A09、HLA-A10、HLA-A11、HLA-A19、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-A36、HLA-A43、HLA-A66、HLA-A68、HLA-A69、HLA-A74、或HLA-A80。在一些實施例中，MHC I類蛋 白係HLA-A02。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-A*02：01至555中任一者，諸如HLA-A*02：01、HLA-A*02：02、HLA-A*02：03、HLA-A*02：04、HLA-A*02：05、HLA-A*02：06、HLA-A*02：07、HLA-A*02：08、HLA-A*02：09、HLA-A*02：10、HLA-A*02：11、HLA-A*02：12、HLA-A*02：13、HLA-A*02：14、HLA-A*02：15、HLA-A*02：16、HLA-A*02：17、HLA-A*02：18、HLA-A*02：19、HLA-A*02：20、HLA-A*02：21、HLA-A*02：22、或HLA-A*02：24。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-A*02：01。在所有高加索人中，39至46%表現HLA-A*02：01。具有HLA-A*02：01限制的腫瘤特異性TCR可尤其適用於治療高加索人患者。在一些實施例中，MHC I類蛋白係HLA-A*1101。在所有華人中，約25至30%表現HLA-A*1101。具有HLA-A*1101限制的腫瘤特異性TCR可尤其適用於治療華人患者。
在一些實施例中，腫瘤特異性TCR特異性結合至包含目標腫瘤抗原肽及MHC II類蛋白的複合物，其中該MHC II類蛋白係HLA-DP、HLA-DQ、或HLA-DR。在一些實施例中，MHC II類蛋白係HLA-DP。在一些實施例中，MHC II類蛋白係HLA-DQ。在一些實施例中，MHC II類蛋白係HLA-DR。在一些實施例中，MHC II類蛋白係HLA-DPB1*0401。在所有高加索人中，35至40%表現HLA-DPB1*0401。具有HLA-DPB1*0401限制的腫瘤特異性TCR可尤其適用於治療高加索人患者。
變體
在一些實施例中，設想到本文所提供的腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)之胺基酸序列變體。例如，可係所欲的是改善腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)的結合親和力及/或其他生物性質。可藉由將適當修飾引入編碼腫瘤特異性TCR之TCRα或TCRβ鏈的(多個)核苷酸序列，或藉由進行肽合成，製備腫瘤特異性TCR之胺基酸序列變體。此類修飾包括例如腫瘤特異性TCR之胺基酸序列內的殘基發生缺失、及/或插入、及/或取代。可做出缺失、插入、及取代的任何組合以達到最終構築體，前提條件是該最終構築體具有所欲特徵，例如抗原結合。
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代的腫瘤特異性抗原結合構築體(例如，腫瘤特異性TCR)變體。取代性誘變的所關注位置包括CDR及FR。可將胺基酸取代引入所關注腫瘤特異性TCR中，並針對所欲活性(例如，保留/改善的抗原結合或降低的免疫原性)篩選產物。
保守型取代係顯示於下表2。
Figure 108112961-A0202-12-0188-1043
Figure 108112961-A0202-12-0189-1044
可根據共同側鏈性質，將胺基酸分組成不同類別：a.疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；b.中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；c.酸性：Asp、Glu；d.鹼性：His、Lys、Arg；e.影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；f.芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守型取代將需要將屬於此等類別中一者之成員交換成為另一個類別。
例示性取代性變體係親和力成熟的腫瘤特異性TCR，其可方便地產生，例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術。簡言之，一或多個CDR殘基經突變，而變體腫瘤特異性TCR部分展示於噬菌 體上並針對特定生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。可在CDR中進行改變(例如取代)，例如以改善腫瘤特異性TCR親和性。
在親和力成熟的一些實施例中，將多樣性引入所選擇的可變基因，以藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈置換、或寡核苷酸定點誘變)中任一者進行成熟。然後，建立第二庫。然後，篩選該庫以識別任何具有所欲親和性的腫瘤特異性TCR變體。另一種引入多樣性的方法涉及CDR導向方式，其中使數個CDR殘基(例如，每次4至6個殘基)隨機化。例如使用丙胺酸掃描誘變或模擬法，可特異性識別涉及抗原結合的CDR殘基。
在一些實施例中，可在一或多個CDR內發生取代、插入、或缺失，只要此類改變不會實質上降低腫瘤特異性TCR結合抗原的能力。例如，可在CDR中進行不會實質上降低結合親和力的保守型改變(例如，如本文所提供的保守型取代)。在上文所提供之變體TCRα或TCRβ序列的一些實施例中，各CDR未改變，或含有不多於一、二、或三個胺基酸取代。
胺基酸序列插入包括：胺基及/或羧基末端融合，其長度範圍係自一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽；以及單或多個胺基酸殘基的序列內插入。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR構築體包含TCRα鏈或TCRβ鏈之N端處的前導序列。在一些實施例中，前導序列包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種腫瘤特異性TCR構築體，其包含多肽，該多肽包含TCRα鏈多肽、可自切割(self-cleavable)的連 接子、及TCRβ鏈多肽。在一些實施例中，可自切割的連接子係P2A肽、T2A肽、E2A肽、或F2A肽。在一些實施例中，可自切割的連接子包含SEQ ID NO：99、195、196、及197之胺基酸序列中任一者。
亦設想到本文所述的腫瘤特異性TCR之抗原結合片段及衍生物。
核酸
在一些實施例中，根據任何本文所述之腫瘤特異性TCR，提供一種核酸(或一組核酸)，其編碼該腫瘤特異性TCR。本發明亦提供載體，其中併入了本發明的一或多種核酸。
在一些實施例中，提供一種單離核酸，其編碼腫瘤特異性TCR、或其組分或衍生物(諸如TCRα鏈、TCRβ鏈、腫瘤特異性TCR、或腫瘤特異性TCR構築體)。在一些實施例中，提供一種表現載體，其編碼腫瘤特異性TCR、或其組分或衍生物(諸如TCRα鏈、TCRβ鏈、腫瘤特異性TCR、或腫瘤特異性TCR構築體)。在一些實施例中，提供一種單離宿主細胞，其表現腫瘤特異性TCR、或其組分或衍生物(諸如TCRα鏈、TCRβ鏈、腫瘤特異性TCR、或腫瘤特異性TCR構築體)。
編碼例示性腫瘤特異性TCR的核酸序列係顯示於表1及圖25A至圖25B中。在一些實施例中，提供一種編碼TCRα之單離核酸，其包含：與SEQ ID NO：6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、89、及95之核酸序列中任一者具有至少約80%同一 性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列。在一些實施例中，提供一種編碼TCRβ之單離核酸，其包含：與SEQ ID NO：9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、92、及98之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列。
在一些實施例中，提供一或多種載體，其包含：(a)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：6、12、及18之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；及編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：9、15、及21之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(b)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：24、30、36、42、48、及54之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；及編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：27、33、39、45、51、及57之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；或(c)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：60、66、72、78、89、及95之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同 一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；及編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：63、69、75、81、92、及98之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列。
在一些實施例中，提供一或多種載體，其包含：(a)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：6具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：9具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(b)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：12具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：15具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(c)編碼TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：18具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：21具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(d)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：24具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同 一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：27具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(e)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：30具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：33具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(f)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：36具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：39具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(g)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：42具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：45具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(h)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：48具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：51具有至少 約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(i)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：54具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：57具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(j)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：60具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：63具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(k)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：66具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：69具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(l)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：72具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：75具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的 核酸序列；(m)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：78具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：81具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；(n)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：89具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：92具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；或(o)編碼TCRα鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：95具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列；編碼TCRβ鏈之核酸，其包含與SEQ ID NO：98具有至少約80%同一性(例如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列。
在一些實施例中，提供一種單離核酸(諸如載體)，其包含腫瘤特異性TCR構築體，其中該核酸包含與選自由SEQ ID NO：144、146、148、150、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、及194所組成之群組之核酸序列中任一者具有至少約80%同一性(例 如，至少約85%、90%、95%、98%、或更高同一性中任一者，或具有100%同一性)的核酸序列。
簡言之，由編碼腫瘤特異性TCR的核酸來表現腫瘤特異性TCR可藉由以下達成：將該核酸插入適當的表現載體，使得該核酸可操作地連接至5’及3’調控因子，包括例如啟動子(例如，淋巴球特異性啟動子)及3’非轉譯區(UTR)。載體可適用於真核宿主細胞中的複製及整合。一般選殖及表現載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列，及啟動子，其有用於調控所欲核酸序列的表現。
藉由使用標準基因遞送規程，本發明之核酸亦可用於核酸免疫及基因療法。用於基因遞送的方法係所屬技術領域中已知的。參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，本發明提供一種基因療法載體。
可將核酸選殖至多種類型的載體中。例如，可將核酸選殖至載體中，該載體包括但不限於質體、嗜菌質體(phagemid)、噬菌體衍生物、動物病毒，及黏質體。特別受到關注的載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體(probe generation vector)、及定序載體。
此外，可以病毒載體的形式向細胞提供表現載體。病毒載體技術係所屬技術領域中熟知的，且係描述於例如Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)、及其他病毒學及分子生物學手冊中。有用於作為載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰 疹病毒、及慢病毒。大致上，合適的載體含有在至少一種生物中作用的複製起始序列、啟動子序列、方便的限制內核酸酶部位、及一或多種選擇性標記(參見例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已開發許多基於病毒的系統，以用於基因轉移進入哺乳動物細胞。例如，反轉錄病毒提供用於基因遞送系統的方便平台。可使用所屬技術領域中已知的技術，將所選基因插入載體並包裝在反轉錄病毒顆粒中。然後，可在體內或離體，將重組病毒單離並遞送至對象的細胞。許多反轉錄病毒系統係所屬技術領域中已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體係所屬技術領域中已知的。在一些實施例中，使用慢病毒載體。由於衍生自反轉錄病毒(諸如，慢病毒)的載體允許基因轉殖的長期穩定整合及其在子細胞中的增殖，該等載體係達到長期基因轉移的合適工具。相較於衍生自致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)的載體，慢病毒載體具有額外優點，這是因為其等可轉導非增生性細胞。其等亦具有低免疫原性的額外優點。
額外啟動子元件(例如，增強子)調控轉錄起始的頻率。一般而言，其等位於起始部位上遊30至110bp的區域中，但許多啟動子最近也已顯示含有起始部位下游功能元件。啟動子元件之間的間隔經常是有彈性的，使得當元件相對於彼此倒置或移動時，會保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，可在活性開始下降之前，將啟動子元件之間的間隔增加至相隔50bp。
合適啟動子之一實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係一種強力組成型啟動子序列，其能夠驅動任何有效連接至其上之多核苷酸序列的高表現水平。合適啟動子之另一實例係延長生長因子1α(Elongation Growth Factor-1α,EF-1α)。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，其包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、鼠乳腺癌病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、家禽白血病病毒啟動子、艾司坦-巴爾病毒立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、以及人類基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅素啟動子、及肌酸激酶啟動子。
此外，本發明不應限於使用組成型啟動子。亦設想到可誘導型啟動子作為本發明的一部分。使用可誘導型啟動子會提供分子開關，該分子開關能夠開啟其有效連接的多核苷酸序列的表現(當此類表現係所欲時)，或者關閉該表現(當該表現係非所欲時)。用於真核細胞的例示性可誘導型啟動子系統包括但不限於激素調控元件(例如，參見Mader,S.及White,J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5603-5607)、合成配體調控元件(參見例如Spencer,D.M.et al(1993)Science 262：1019-1024)、及游離輻射調控元件(例如，參見Manome,Y.et al.(1993)Biochemistry 32：10607-10613；Datta,R.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1014-10153)。另外的例示性用於體外或體內哺乳動物系統的可誘導型啟動子係綜述於Gingrich et al.(1998)Annual Rev.Neurosci 21：377-405。
為了評估多肽或其部分的表現，待引入細胞中的表現載體亦可含有選擇性標記基因、或報導子基因、或兩者，以促進自試圖透過病毒載體轉染或感染的細胞群，識別並選擇表現細胞。在其他態樣中，選擇性標記可載於單獨DNA片段上，並用於共轉染過程。選擇性標記及報導子基因兩者可以適當調控序列側接，而得以在宿主細胞中表現。有用的選擇性標記包括例如抗生素抗藥性基因，諸如neo及類似者。
報導子基因係用於識別潛在轉染細胞及用於評估調控序列的功能性。大致上，報導子基因係一種不存在於受體生物或組織中或不由受體生物或組織表現的基因，且該基因編碼以一些易於偵測性質(例如，酶活性)顯示其表現的多肽。在將DNA引入受體細胞之後，在合適時間對報導子基因的表現進行檢定。合適的報導子基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶的基因、或綠螢光蛋白基因(例如，Ui-Tel et al.,2000 FEBS Letters 479：79-82)。合適的表現系統係熟知的，並可使用已知技術製備或在商業上獲得。大致上，當具有最小5'側區的構築體顯示最高的報導子基因表現水平時，將其識別為啟動子。此類啟動子區可連接至報導子基因，並用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
在一些實施例中，提供核酸，其編碼根據任何本文所述之腫瘤特異性TCR的腫瘤特異性TCR。在一些實施例中，編碼腫瘤特異性TCR之核酸包含：第一核酸序列，其編碼該腫瘤特異性TCR之TCRα鏈；及第二核酸序列，其編碼該腫瘤特異性TCR之TCRβ鏈。 在一些實施例中，第一核酸序列位於第一載體上，且第二核酸序列位於第二載體上。在一些實施例中，第一核酸序列及第二核酸序列位於相同載體上。在一些實施例中，第一核酸序列係經由第三核酸序列融合至第二核酸序列，該第三核酸序列編碼可自切割的連接子，諸如P2A、T2A、E2A、或F2A肽。載體可選自例如由下列所組成之群組：哺乳動物表現載體及病毒載體(諸如衍生自反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、及慢病毒者)。在一些實施例中，第一核酸序列受到第一啟動子控制，且第二核酸序列受到第二啟動子控制。在一些實施例中，第一啟動子及第二啟動子具有相同序列。在一些實施例中，第一啟動子及第二啟動子具有不同序列。在一些實施例中，在受到多順反子(諸如雙順反子)載體中之單一啟動子的控制下，第一核酸序列及第二核酸序列係以單一轉錄本表現。參見例如Kim,JH,et al.,PLoS One 6(4)：e18556,2011。在一些實施例中，第一啟動子、第二啟動子、及/或單一啟動子為可誘導型。
經工程改造之免疫細胞
在一些實施例中，提供一種經工程改造之免疫細胞(諸如T細胞)，其表現根據任何本文所述之腫瘤特異性TCR的腫瘤特異性TCR。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞包含編碼腫瘤特異性TCR之核酸，其中該腫瘤特異性TCR係自該核酸表現，且位於該經工程改造之免疫細胞之表面。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞係選自由下列 所組成之群組：PBMC、細胞毒性T細胞、輔助T細胞、自然殺手T細胞、及調節性T細胞。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞不表現內源性TCR。
在一些實施例中，提供一種經工程改造之T細胞，其包含根據任何腫瘤特異性TCR之腫瘤特異性TCR、或其組分或衍生物(諸如TCRα鏈、TCRβ鏈、腫瘤特異性TCR、或腫瘤特異性TCR構築體)。在一些實施例中，經工程改造之T細胞之內源性TCR經剔除。在一些實施例中，經工程改造之T細胞係TCR-T細胞。在一些實施例中，提供一種醫藥組成物，其包含經工程改造之T細胞及醫藥上可接受之賦形劑。在一些實施例中，經工程改造之T細胞係衍生自接受TCR-T治療的個體。在一些實施例中，經工程改造之T細胞係衍生自同種異體個體。
在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)表現複數種(諸如約2、3、4、5、10、或更多種中任一者)腫瘤特異性TCR，該等腫瘤特異性TCR係使用本文所述方法中任一者獲得。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)表現腫瘤特異性TCR，該等腫瘤特異性TCR特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽。
經工程改造之免疫細胞或其醫藥組成物可用於治療自其獲得腫瘤特異性TCR的個體(例如，作為維持療法)，或用於療法另一個個體(諸如，同種異體個體)、或具有相同MHC基因型、HLA單倍型、及/或在癌細胞上表現相同表位的個體。
使用腫瘤特異性TCR治療之方法
本申請案提供治療個體中癌症之基於細胞的免疫治療方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法係用於作為個體先前所接受之MASCT的維持療法。
本文所述方法適用於治療各種癌症，包括液體及實體癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、結腸直腸癌、淋巴瘤、腎癌、乳癌、胰臟癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、子宮內膜癌、及腦癌。該等方法適用於所有期別的癌症，包括早期、晚期、及轉移性癌症。例如，本文所述之CEA特異性TCR、RGS5特異性TCR、及HPV18-E7 TCR中任一者可用於治療子宮頸癌。
在一些實施例中，該方法降低與癌症相關聯的一或多種症狀之嚴重性，其差異係至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%中任一者，此係相較於相同個體在治療前的對應症狀，或相較於未接受該治療方法的其他個體之對應症狀。在一些實施例中，該方法延遲癌症的進展。
在一些實施例中，該方法係用於治療肝細胞癌(HCC)。在一些實施例中，HCC係早期HCC、非轉移性HCC、原發性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、轉移性HCC、緩解中HCC、或復發性HCC。在一些實施例中，HCC係局部可切除的(即，侷限於肝臟之一 部分而允許完全手術切除的腫瘤)、局部無法切除的(即，因為涉及至關重要的血管結構，或者因為肝臟受損，局部腫瘤可能無法切除)、或無法切除的(即，腫瘤涉及所有肝葉，且/或已擴散而涉及其他器官(例如肺部、淋巴結、骨骼))。在一些實施例中，根據TNM分類，HCC係第I期腫瘤(單個腫瘤無血管侵犯)、第II期腫瘤(單個腫瘤有血管侵犯，或多個腫瘤皆未大於5cm)、第III期腫瘤(多個腫瘤且任一個大於5cm，或腫瘤涉及門靜脈或肝靜脈之主要分支)、第IV期腫瘤(腫瘤直接侵犯膽囊以外的鄰近器官，或具有內臟腹膜穿孔)、N1腫瘤(區域淋巴結轉移)、或M1腫瘤(遠處轉移)。在一些實施例中，根據AJCC(美國癌症聯合委員會(American Joint Commission on Cancer))分期標準，HCC為T1、T2、T3、或T4期HCC。在一些實施例中，HCC係肝細胞癌、HCC之纖維板層變體、混合型肝細胞膽管癌(mixed hepatocellularcholangiocarcinoma)中任一者。在一些實施例中，HCC係由B型肝炎病毒(HBV)感染引起。
在一些實施例中，該方法係用於治療肺癌。在一些實施例中，肺癌係非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NCSLC的實例包括但不限於大細胞癌(例如，大細胞神經內分泌癌、複合型大細胞神經內分泌癌、基底細胞樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、透明細胞癌、及具類橫紋肌表型之大細胞癌)、腺癌(例如，腺泡、乳突(例如，細支氣管肺泡癌，非黏液性、黏液性、混合型黏液性及非黏液性、及未定型細胞類型)、實體腺癌(具黏液素)、具混合亞型之腺癌、分化良好的胎兒型腺癌、黏液性(膠狀)腺癌、黏液性囊腺癌、 印環狀腺癌、及透明細胞腺癌)、神經內分泌肺部腫瘤、及鱗狀細胞癌(例如，乳突、透明細胞、小細胞、及基底細胞樣)。在一些實施例中，根據TNM分類，NSCLC可為T期腫瘤(原發性腫瘤)、N期腫瘤(區域淋巴結)、或M期腫瘤(遠處轉移)。
在一些實施例中，肺癌係類癌(典型或非典型)、腺鱗狀細胞癌、圓柱瘤、或唾液腺之癌(例如，腺樣囊狀癌或黏液類上皮癌)。在一些實施例中，肺癌係具有多形性、肉瘤狀、或肉瘤部分的癌(例如，具有梭狀細胞及/或巨細胞之癌、梭狀細胞癌、巨細胞癌、癌肉瘤、或肺母細胞瘤)。在一些實施例中，肺癌係小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC；亦稱為燕麥細胞癌)。小細胞肺癌可係局限期、擴散期、或復發性小細胞肺癌。在一些實施例中，個體可係符合以下條件的人類：具有懷疑或顯示與肺癌相關聯的基因、基因突變、或多型性(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、α1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、及/或AKT)，或者具有一或多個額外拷貝的與肺癌相關聯的基因。
在一些實施例中，該方法係用於治療子宮頸癌。在一些實施例中，子宮頸癌係早期子宮頸癌、非轉移性子宮頸癌、局部晚期子宮頸癌、轉移性子宮頸癌、緩解中子宮頸癌、無法切除的子宮頸癌、於輔助性治療中的子宮頸癌、或於新輔助性治療中的子宮頸癌。在一些實施例中，子宮頸癌係由人類乳突病毒(HPV)感染引起。在一些實施例中，根據TNM分類，子宮頸癌可為T期腫瘤(原發性腫瘤)、N 期腫瘤(區域淋巴結)、或M期腫瘤(遠處轉移)。在一些實施例中，子宮頸癌係下列中任一者：第0期、第I期(Tis、N0、M0)、第IA期(T1a、N0、M0)、第IB期(T1b、N0、M0)、第IIA期(T2a、N0、M0)、第IIB期(T2b、N0、M0)、第IIIA期(T3a、N0、M0)、第IIIB期(T3b、N0、M0，或T1至T3、N1、M0)、第IVA期(T4、N0、M0)、或第IVB期(T1至T3、N0至N1、M1)子宮頸癌。在一些實施例中，子宮頸癌係子宮頸鱗狀細胞癌、子宮頸腺癌、或腺鱗狀細胞癌。
在一些實施例中，該方法係用於治療乳癌。在一些實施例中，乳癌係早期乳癌、非轉移性乳癌、局部晚期乳癌、轉移性乳癌、激素受體陽性轉移性乳癌、緩解中乳癌、於輔助性治療中的乳癌、乳管原位癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、侵襲性乳管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)、或於新輔助性治療中的乳癌。在一些實施例中，乳癌係激素受體陽性轉移性乳癌。在一些實施例中，乳癌(其可係HER2陽性或HER2陰性)係晚期乳癌。在一些實施例中，乳癌係乳管原位癌。在一些實施例中，個體可係符合以下條件的人類：具有與乳癌相關聯的基因、基因突變、或多型性(例如，BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD51、AR、DIRAS3、ERBB2、TP53、AKT、PTEN、及/或PI3K)，或者具有一或多個額外拷貝的與乳癌相關聯的基因(例如，一或多個額外拷貝的HER2基因)。
在一些實施例中，該方法係用於治療胰臟癌。在一些實施例中，胰臟癌包括但不限於漿液性微囊性腺瘤、胰管內乳突狀黏液 性腫瘤、黏液性囊性腫瘤、實體偽乳突狀腫瘤、胰臟腺癌、胰管腺癌、或胰母細胞瘤。在一些實施例中，胰臟癌係早期胰臟癌、非轉移性胰臟癌、原發性胰臟癌、經切除的胰臟癌、晚期胰臟癌、局部晚期胰臟癌、轉移性胰臟癌、無法切除的胰臟癌、緩解中胰臟癌、復發性胰臟癌、於輔助性治療中的胰臟癌、或於新輔助性治療中的胰臟癌中任一者。
在一些實施例中，該方法係用於治療卵巢癌。在一些實施例中，卵巢癌係卵巢上皮細胞癌。例示性卵巢上皮細胞癌組織學分類包括：漿液性囊瘤(例如，漿液性良性囊腺瘤、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之漿液性囊腺瘤、或漿液性囊腺癌)、黏液性囊瘤(例如，黏液性良性囊腺瘤、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之黏液性囊腺瘤、或黏液性囊腺癌)、子宮內膜樣腫瘤(例如，子宮內膜樣良性囊腫、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之子宮內膜樣腫瘤、或子宮內膜樣腺癌)、透明細胞(中腎樣)腫瘤(例如，良性透明細胞腫瘤、具上皮細胞增生活性及核異常但無浸潤性破壞性生長之透明細胞腫瘤、或透明細胞囊腺癌)、無法指派至上述群組中之一者的未分類腫瘤、或其他惡性腫瘤。在各種實施例中，卵巢上皮細胞癌係第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。在一些實施例中，個體可係符合以下條件的人類：具有與卵巢癌相關聯的基因、基因突變、或多型性(例如，BRCA1或BRCA2)，或者具有一或多個額外拷貝的與卵巢 癌相關聯的基因(例如，一或多個額外拷貝的HER2基因)。在一些實施例中，卵巢癌係卵巢生殖細胞腫瘤。例示性組織學亞型包括：惡性胚胎瘤或其他生殖細胞腫瘤(例如，內胚竇瘤(諸如肝樣或腸腫瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、或混合型腫瘤)。例示性畸胎瘤係未成熟畸胎瘤、成熟畸胎瘤、實體畸胎瘤、及囊性畸胎瘤(例如，皮樣囊腫，諸如成熟囊性畸胎瘤、及具惡性轉化之皮樣囊腫)。一些畸胎瘤係單胚層且高度特異性的，諸如甲狀腺腫樣卵巢瘤、類癌、甲狀腺腫樣卵巢瘤和類癌、或其他者(例如，惡性神經外胚層及室管膜瘤)。在一些實施例中，卵巢生殖細胞腫瘤係第I期(例如，第IA、IB、或IC期)、第II期(例如，第IIA、IIB、或IIC期)、第III期(例如，第IIIA、IIIB、或IIIC期)、或第IV期。
數種病毒與人類的癌症有關。例如，B型肝炎病毒(HBV)可能引發慢性肝臟感染，而增加個體罹患肝癌、或肝細胞癌(HCC)的可能性。人類乳突病毒(HPV)係具有多於150種相關病毒的群組，當其感染並生長於皮膚或黏膜(諸如口腔、咽喉、或陰道)時，會引起乳突瘤、或疣。已知數種類型的HPV(包括第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、及6型)會引起子宮頸癌。HPV亦在誘導或引起其他生殖器癌症上扮演角色，並與口腔及咽喉的一些癌症相關。艾司坦-巴爾病毒(EBV)係一種皰疹病毒，其長期感染並保持潛伏於B淋巴球中。EBV感染增加個體發展鼻咽癌及某些類型快速生長淋巴瘤(諸如Burkitt氏淋巴瘤)的風險。EBV亦與霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)及一些胃癌病例相關。除了引起癌症或增加發 展癌症的風險之外，病毒感染(諸如HBV、HPV、及EBV感染)可導致組織或器官損傷，其可能增加罹患癌症之個體的疾病負擔，並促成癌症進展。所屬技術領域中已知的是，可誘導人體發動有效且特異性免疫反應，該等免疫反應包括對數種癌症相關病毒的細胞毒性T細胞反應，該等病毒諸如HBV、HPV、及EBV(包括其各種亞型)。因此，在一些實施例中，提供一種治療個體中病毒相關癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(諸如T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者，其中目標腫瘤抗原係衍生自該病毒。在一些實施例中，癌症係HBV相關的肝細胞癌、HPV相關的子宮頸癌、或EBV相關的鼻咽癌。
本文所述治療方法可用於下列目的中任一或多者：減輕癌症的一或多種症狀、延遲癌症的進展、縮小癌症腫瘤大小、擾亂(諸如破壞)癌症基質、抑制癌症腫瘤生長、延長整體存活、延長無疾病存活、延長至癌症疾病進展的時間、預防或延遲癌症腫瘤轉移、減少(諸如根除)先前存在的癌症腫瘤轉移、減少先前存在的癌症腫瘤轉移之發生率或負擔、預防癌症復發、及/或改善癌症的臨床效益。
在一些實施例中，提供一種抑制個體中癌細胞增生(諸如腫瘤生長)之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的有效量的抗原負載DC。在一些實施例中，抑制至少約 10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)的細胞增生。
在一些實施例中，提供一種抑制個體中腫瘤轉移之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的有效量的抗原負載DC。在一些實施例中，抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)的轉移。在一些實施例中，提供抑制轉移至淋巴結的方法。
在一些實施例中，提供一種減小個體中腫瘤大小之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的有效量的抗原負載DC。在一些實施例中，腫瘤大小減小至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、或100%中任一者)。
在一些實施例中，提供一種延長個體中癌症無進展存活之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的有效量的抗原負載DC。在一些實施例中，該方法將至疾病進展的時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12週中任一者。
在一些實施例中，提供一種延長患有癌症的個體的存活之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的有效量的抗原負載DC。在一些實施例中，該方法將至疾病進展的時間延長至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12週中任一者。在一些實施例中，該方法延長個體存活至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、或24個月中任一者。
在一些實施例中，提供一種在患有癌症的個體中減少不良效應(adverse effect,AE)及嚴重不良效應(severe adverse effect,SAE)之方法，其包含向該個體投予有效量的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)，該經工程改造之免疫細胞表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投予有效量的抗原負載DC。
在一些實施例中，該方法可預測且/或導致客觀反應(諸如部分反應或完全反應)。在一些實施例中，該方法可預測且/或導致生活品質改善。
除了通常與其他癌症療法相關聯的常見不良事件之外，一些癌症免疫療法與免疫相關不良事件(immune-related adverse event,irAE)相關聯。irAE通常與命中目標(on-target)T細胞毒性或偏離目標(off-target)效應呈機械式相關，該命中目標T細胞毒性對抗表現於正常非腫瘤組織中的目標抗原，即所謂的命中目標偏離腫瘤(on-target off-tumor)效應，該偏離目標效應諸如自身耐受性破壞或表位交叉反應。irAE可導致在下列的嚴重症狀及病況：皮膚、胃腸、內分泌、肝、眼、神經、及其他組織或器官。所屬技術領域中已知的針對癌症免疫治療方法所報導之一般irAE包括：致命免疫媒介之皮膚炎、肺炎、結腸炎、淋巴球性垂體炎、胰臟炎、淋巴腺病、內分泌病症、CNS毒性、及類似者。在一些實施例中，治療方法與不良事件(諸如irAE)的低發生率相關聯。在一些實施例中，少於約50%、40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%中任一者的個體經歷irAE，諸如第2至5級irAE。
大致上，可根據個體的大小及狀況，並根據標準醫藥實務，判定表現本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者之經工程改造之免疫細胞(諸如T細胞)的劑量、時程、及投予途徑。例示性投予途徑包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肺內、膀胱內(intravesicular)、肌內、氣管內、皮下、眼內、鞘內(intrathecal)、或經皮。在一些實施例中，表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞(諸如T細胞)經靜脈內投予。
投予至個體的細胞劑量可根據下列而變化：例如所投予之細胞的具體類型、投予途徑、及所治療之癌症的具體類型及階段。該量應足以產生所欲反應，諸如對癌症的治療反應，但沒有嚴重毒性或不良事件。在一些實施例中，待投予的表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞(諸如T細胞)的量係治療有效量。在一些實施例中，細胞的量係足以減小腫瘤大小、減少癌細胞數目、或降低腫瘤生 長速率的量，其差異係至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%中任一者，此係相較於相同個體在治療前的對應腫瘤大小、癌細胞數目、或腫瘤生長速率，或相較於未接受治療的其他個體之對應活性。可使用標準方法來測量此效應的量值，諸如採用純化酶的體外檢定法、基於細胞的檢定法、動物模型、或人體試驗。
在一些實施例中，穩定劑或賦形劑(諸如人類白蛋白)係與表現(多種)腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞一起使用。
治療方法可包含單一治療或重複治療。在一些實施例中，投予表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多於10次中任一者。在一些實施例中，投予表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞至少3次。在一些實施例中，治療方法係每週重複一次、2週重複一次、3週重複一次、4週重複一次、每月重複一次、每2個月重複一次、每3個月重複一次、每4個月重複一次、每5個月重複一次、每6個月重複一次、每7個月重複一次、每8個月重複一次、每9個月重複一次、或每年重複一次。
本文提供的治療方法可用於作為第一療法、第二療法、第三療法、或與所屬技術領域中已知的其他類型之癌症療法的組合療法，諸如化療、手術、輻射、基因療法、免疫療法、骨髓移植、幹細胞移植、標靶治療、冷療、超音波療法、光動力療法、射頻燒灼、或類似者，其係於輔助性療法或新輔助性療法中。在一些實施例中，該治療方法係用於作為第一療法。在一些實施例中，不存在其他批准的 用於個體之抗癌療法。在一些實施例中，該治療方法係用於作為第二療法，其中該個體先前已接受切除、射頻燒灼、化療、輻射療法、或其他類型的癌症療法。在一些實施例中，個體已發生進展或已無法耐受標準抗癌療法。在一些實施例中，個體在接受本文所述治療方法之前、同時、或之後，接受其他類型的癌症療法。例如，本文所述之治療方法可以範圍自數分鐘、數天、數週至數個月的間隔，於其他癌症療法(諸如化療、輻射、手術、或其組合)之前或之後進行。在一些實施例中，第一療法與第二療法之間的間隔使得表現腫瘤特異性TCR的經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞)及其他癌症療法(諸如化療、輻射、手術、或其組合)能夠對個體發揮有利組合效應。此外，具有較大發展增生性疾病之風險的人可接受治療，以抑制且/或延遲疾病發展。
V.組成物、套組、及製品
本申請案進一步提供套組、組成物(諸如醫藥組成物)、及製品，其係用於本文所述之獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法及治療方法之任何實施例中。
在一些實施例中，提供一種用於癌症免疫療法的套組，其包含至少10種腫瘤抗原肽。所屬技術領域中具有通常知識者可使用來自第一核心組的腫瘤抗原肽之任何組合、及可選地來自第二組的癌症類型特異性抗原肽之任何組合、及/或新抗原肽以負載DC群，其可 進一步用於製備用於MASCT的活化T細胞、腫瘤抗原特異性T細胞、或單離腫瘤特異性TCR，以治療個體中癌症。
在一些實施例中，提供一種套組，其包含本文所述之腫瘤特異性TCR中任一者、或編碼其腫瘤特異性TCR之(多種)核酸或載體。在一些實施例中，提供一種套組，其包含：腫瘤特異性TCR之庫，該等腫瘤特異性TCR係使用本文所述方法中任一者獲得，其中T細胞或PBMC係來自複數個已在臨床上受益於MASCT的個體；核酸，其編碼其腫瘤特異性TCR；或載體，其編碼其腫瘤特異性TCR。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR特異性辨識一或多種選自由下列所組成之群組的腫瘤抗原：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。在一些實施例中，腫瘤特異性TCR具有某些種族群體中主要的HLA單倍型限制。
套組可含有額外組分，諸如容器、試劑、培養基、細胞激素、免疫檢查點抑制劑、TLR促效劑、緩衝液、抗體、及類似者，以促進執行本文所述之治療方法或細胞製備方法的任何實施例。例如，在一些實施例中，套組進一步包含周邊血液收集及儲存設備，其可用於收集個體的周邊血液。在一些實施例中，套組進一步包含容器及試劑，其用於周邊血液的密度梯度離心，其可用於自人類周邊血液樣本 單離PBMC。在一些實施例中，套組進一步包含培養基、細胞激素、或緩衝液，其用於自周邊血液獲得DC。在一些實施例中，套組進一步包含培養基、TLR促效劑(例如，MPLA)、IFNγ、PGE2、試劑、及緩衝液，其用於使複數種腫瘤抗原肽負載至DC中。在一些實施例中，套組進一步包含細胞激素(例如，IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21)、免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD1抗體)、抗CD3抗體(例如，OKT-3)、緩衝液、或培養基，其用於將T細胞、經富集之活化T細胞、或腫瘤抗原特異性T細胞與抗原負載APC(例如，DC)共培養。在一些實施例中，套組進一步包含細胞系APC，諸如LCL細胞。在一些實施例中，套組進一步包含抗體、磁珠、及管柱，其用於富集表現細胞激素(例如，IFNγ)的活化T細胞。在一些實施例中，套組進一步包含容器、緩衝液、及試劑，其用於冷凍並儲存PBMC或T細胞。在一些實施例中，套組進一步包含試劑，其用於判定癌細胞中之突變負荷(諸如在一或多個MHC基因中)。在一些實施例中，套組進一步包含免疫檢查點抑制劑，其用於與治療方法的組合療法。在一些實施例中，套組進一步包含試劑，其用於識別腫瘤樣本中的新抗原(諸如藉由定序)。在一些實施例中，套組進一步包含ELISPOT檢定，其用於評估對一或多種腫瘤抗原肽的特異性免疫反應。在一些實施例中，套組進一步包含引子及試劑，其用於擴增TCR基因、及/或TCR基因的次世代定序。在一些實施例中，套組進一步包含免疫細胞、培養基、及試劑，其用於製備表現(多種)腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞。
本申請案之套組係合適包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、軟質包裝(例如，聚酯樹脂(Mylar)或塑膠袋)、及類似者。套組可選地提供額外組分，諸如緩衝液及解釋性資訊。因此，本申請案亦提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶、罐、軟質包裝、及類似者。
說明書亦可包含與使用腫瘤抗原肽(及上述可選地額外組分)有關的說明。在一些實施例中，套組進一步包含說明手冊，諸如描述下列的規程之手冊：如本文所述之治療方法的實施例、或細胞製備方法的實施例。說明書亦可包括有關劑量、給藥時程、及投予途徑的資訊，其係關於使用套組製備的DC、活化T細胞、或表現(多種)腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞，以用於預期治療。在一些實施例中，套組進一步包含關於針對治療方法選擇個體的說明書。在一些實施例中，套組進一步包含關於投予與治療方法組合之免疫檢查點抑制劑的說明書，其包括例如有關免疫檢查點抑制劑之劑量、給藥時程、及投予途徑的資訊。在一些實施例中，套組進一步包含關於識別腫瘤樣本中之新抗原(諸如藉由定序)的說明書。在一些實施例中，套組進一步包含關於在接受治療後監測個體的說明書。
容器可為單位劑量、批量包裝(例如，多劑量包裝)、或次單位劑量。例如，可提供含有足夠腫瘤抗原肽(如本文所揭示)的套組，以製備足夠的腫瘤抗原特異性T細胞、抗原負載APC(諸如DC)、及/或表現(多種)腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞，以在延長時段內提供個體有效治療，該延長時段諸如3週、6週、9週、 3個月、4個月、5個月、6個月、8個月、9個月、1年、或更長中任一者。
套組亦可包括多單位劑量的腫瘤抗原肽或腫瘤特異性TCR(或編碼腫瘤特異性TCR之核酸)、及使用說明書，且以足以儲存於及使用於藥局(例如，醫院藥局、及調製藥局)的數量進行包裝。
進一步提供的是本文所述之單離細胞群(諸如DC、活化T細胞、或表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞)中任一者的套組、組成物(諸如醫藥組成物)、及製品。
本文所述的單離細胞群(諸如DC、活化T細胞、或表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞)可用於醫藥組成物或配方中，其藉由組合所述單離細胞群與醫藥上可接受之載劑、賦形劑、穩定劑、及/或其他藥劑(其係所屬技術領域中已知者)，以用於本文所述之治療方法、投予方法、及劑量方案。在一些實施例中，人類白蛋白係用於作為醫藥上可接受之載劑。
合適的醫藥載劑包括無菌水；鹽水、右旋糖；於水或鹽水中的右旋糖；蓖麻油及環氧乙烷的縮合產物(每莫耳蓖麻油組合約30至約35莫耳環氧乙烷)；液體酸；低級烷醇；油，諸如玉米油；花生油、芝麻油、及類似者，與乳化劑，諸如脂肪酸之單或二甘油酯、或磷脂質(例如，卵磷脂)、及類似者；二醇；聚烯烴二醇；在懸浮劑存在下的水性介質，例如羧甲基纖維素鈉；藻酸鈉；聚(乙烯基吡咯烷酮)；及類似者，其係單獨使用、或與合適的分配劑(諸如卵磷脂)；聚氧乙烯硬脂酸酯；及類似者。載劑亦可含有佐劑(諸如保持穩定劑、 潤溼劑、乳化劑、及類似者)與滲透增強劑。最終形式可係無菌，且亦可能夠易於通過注射裝置(諸如空心針)。可藉由適當選擇溶劑或賦形劑，達到並維持適當黏度。
本文所述的醫藥組成物可包括其他試劑、賦形劑、或穩定劑，以改善組成物的性質。合適的賦形劑及稀釋劑的實例包括但不限於乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、鹽水溶液、漿料、甲基纖維素、羥苯甲酸甲酯及羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、及礦物油。在一些實施例中，將醫藥組成物配製成其pH在約4.5至約9.0的範圍內，包括例如約5.0至約8.0、約6.5至約7.5、或約6.5至約7.0中任一者的pH範圍。在一些實施例中，亦可藉由添加合適的張力調節劑(諸如甘油)，使醫藥組成物與血液等張。
在一些實施例中，單離細胞組成物(諸如DC、活化T細胞、或表現腫瘤特異性TCR之經工程改造之免疫細胞)適用於向人類投予。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)適用於藉由腸胃外投予向人類投予。適用於腸胃外投予的配方包括：水性及非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑、及使配方與預期受體之血液相容的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、及保存劑。配方可以單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿及小瓶)呈現，並可儲存在僅需要緊接在使用前添加無菌液體賦形劑(即，水)以用於注射的條件下，該無 菌液體賦形劑係用於本文所述之治療方法、投予方法、及劑量方案。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)係含在單次使用小瓶中，諸如單次使用密封小瓶。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)係含在多次使用小瓶中。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)係以批量含在容器中。
亦提供的是單位劑型，其包含本文所述之單離細胞組成物(諸如醫藥組成物)及配方。此等單位劑型可以單一或多單位劑量儲存於合適包裝中，且亦可經進一步滅菌及密封。在一些實施例中，組成物(諸如醫藥組成物)亦包括一或多種有用於治療癌症的其他化合物(或其醫藥上可接受之鹽)。
本申請案進一步提供套組，其包含本文所述之單離細胞群、組成物(諸如醫藥組成物)、配方、單位劑量、及製品中任一者，以用於本文所述之治療方法、投予方法、及劑量方案。
VI.例示性實施例
在本文所提供之實施例中的是：
1. 一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之T細胞受體(TCR)的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一樹突細胞(DC)群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞； c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(MASCT)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。
2. 實施例1之方法，其中該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天。
3. 實施例1或2之方法，其中該T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群之間的比率不大於約30：1。
4. 實施例1至3中任一者之方法，其中在該第一共培養步驟中的該T細胞群存在於PBMC中。
5. 實施例1至4中任一者之方法，其中載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素(例如，IL-2或複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑。
6. 實施例5之方法，其中該第一共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。
7. 實施例5之方法，其中該第一共培養基包含IL-2及抗PD-1抗體。
8. 實施例1至7中任一者之方法，其中該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(APC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素。
9. 實施例8之方法，其中該細胞激素係IFNγ。
10. 實施例1至9中任一者之方法，其中該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1。
11. 實施例1至10中任一項之方法，其中將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。
12. 實施例1至11中任一者之方法，其中該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含免疫檢查點抑制劑及可選地一或多種細胞激素(例如，IL-2或複數種細胞激素)；及將抗CD3抗體添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群。
13. 實施例12之方法，其中在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，2天)，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。
14. 實施例12或13之方法，其中該抗CD3抗體係OKT3。
15. 實施例12至14中任一者之方法，其中該初始第二共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及IL-21、及抗PD-1抗體。
16. 實施例12至14中任一者之方法，其中該第二共培養步驟包含將一或多種細胞激素添加至該第二共培養物。
17. 實施例16之方法，其中該一或多種細胞激素包含IL-2。
18. 實施例16或17之方法，其中在該第二共培養步驟開始後不多於約3天(例如，約2天)，將該一或多種細胞激素添加至該第二共培養物。
19. 實施例12至18中任一者之方法，其中該初始第二共培養基包含IL-2及抗PD-1抗體。
20. 實施例1至19中任一者之方法，其進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(APC)之群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序。
21. 實施例20之方法，其中該等APC係PBMC、DC、或細胞系APC。
22. 實施例20或21之方法，其中該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群之間的比率係約1：1至約20：1。
23. 實施例20至22中任一者之方法，其中將該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群共培養約5至9天。
24. 實施例20至23中任一者之方法，其中該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群係在第三共培養基中共 培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及抗CD3抗體。
25. 實施例24之方法，其中該第三共培養基包含IL-2及OKT3。
26. 實施例24之方法，其中該第三共培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、及OKT3。
27. 實施例20至26中任一者之方法，重複該第三共培養步驟。
28. 實施例1至27中任一者之方法，其中該目標腫瘤抗原肽係衍生自選自由下列所組成之群組的腫瘤抗原：hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CCND1、RGS5、MMP7、VEGFR1、VEGFR2、MUC1、HER2、MAGE-A1、MAGE-A3、CDCA1、WT1、KRAS、PARP4、MLL3、MTHFR、HPV16-E6、HPV16-E7、HPV18-E6、HPV18-E7、HPV58-E6、HPV58-E7、HBcAg、HBV聚合酶、GPC3、SSX、及AFP。
29. 實施例1至28之方法，其進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
30. 實施例1至29中任一者之方法，其中該次世代定序係單細胞定序。
31. 實施例1至30中任一者之方法，其中在接受該MASCT後，該個體具有部分反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)；且/或其中該個體具有(多種)腫瘤抗原特異性免疫反應。
32. 實施例1至31中任一者之方法，其中該MASCT包含：將載有複數種腫瘤抗原肽之DC之群與T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽。
33. 實施例1至32中任一者之方法，其中該MASCT包含：(i)在初始共培養基中將載有複數種腫瘤抗原肽之DC群與T細胞群共培養，以提供共培養物，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽，該初始共培養基包含一或多種細胞激素(例如，複數種細胞激素)及免疫檢查點抑制劑；及(ii)在該共培養開始後約3至7天，將抗CD3抗體添加至該共培養物，從而獲得該活化T細胞群。
34. 實施例1至33中任一者之方法，其中該MASCT包含：(i)使DC群與複數種腫瘤抗原肽接觸，以獲得載有該複數種腫瘤抗原肽之DC群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；及(ii)在DC成熟培養基中培養載有該複數種腫瘤抗原肽之該DC群，該DC成熟培養基包含MPLA。
35. 實施例34之方法，其中該DC成熟培養基包含INFγ、MPLA、及PGE2。
36. 實施例1至35中任一者之方法，其中該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之該等DC。
37. 實施例1至36中任一者之方法，其中該個體先前已接受該MASCT至少三次。
38. 實施例1至37中任一者之方法，其中在該次世代定序之前，將該等腫瘤抗原特異性T細胞用載有該目標腫瘤抗原肽之APC刺激。
39. 實施例1至38中任一者之方法，其中同時獲得特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽之TCR。
40. 實施例1至39中任一者之方法，其進一步包含：在宿主免疫細胞中表現各對編碼TCRα及TCRβ之基因，以提供表現TCR之經工程改造之免疫細胞；及評估該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的反應。
41. 一種獲得特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含實施例40之方法，其中基於表現該TCR之該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的該反應來選擇該TCR。
42. 實施例41之方法，其進一步包含判定該TCR的HLA限制。
43. 實施例42之方法，其中該TCR具有亞洲人中主要的HLA單倍型限制。
44. 實施例41至43中任一者之方法，其進一步包含該TCR之親和力成熟。
45. 實施例41至44中任一者之方法，其進一步包含增強該TCR中該TCRα鏈及該TCRβ鏈之配對。
46. 實施例41至45中任一者之方法，其進一步包含增強該TCR之該表現。
47. 實施例41至46中任一者之方法，其中該目標腫瘤抗原肽係衍生自CEA、RSG-5、或HPV18-E7。
48. 一種腫瘤特異性TCR，其係使用實施例1至47中任一者之方法獲得。
49. 一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：4、10、及16之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、及19之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列；(b)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：22、28、34、40、46、及52之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、19、25、31、37、43、49、及55之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列；或(c)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：58、64、70、76、87、及93之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：61、67、73、79、90、及96之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列。
50. 實施例49之腫瘤特異性TCR，其包含： (a)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；(b)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(c)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；(d)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；(e)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；(f)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列；(g)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列； (h)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；(i)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列；(j)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列；(k)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列；(l)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(m)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(n)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；或 (o)包含CDR3之TCRα鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列。
51. 一種腫瘤特異性TCR，其包含：(a)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：5、11、及17之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：8、14、及20之胺基酸序列中任一者之CDR；(b)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：23、29、35、41、47、及53之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：26、32、38、44、50、及56之胺基酸序列中任一者之CDR；或(c)TCRα鏈，其包含SEQ ID NO：59、65、71、77、88、及94之胺基酸序列中任一者之CDR；及TCRβ鏈，其包含SEQ ID NO：62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者之CDR。
52. 實施例49至51中任一者之腫瘤特異性TCR，其包含：(a)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：5、11、及17之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：8、14、及20之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；(b)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：23、29、35、41、47、及53之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序 列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：26、32、38、44、50、及56之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；或(c)TCRα鏈，其包含與SEQ ID NO：59、65、71、77、88、及94之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列；及TCRβ鏈，其包含與SEQ ID NO：62、68、74、80、91、及97之胺基酸序列中任一者具有至少約80%同一性的胺基酸序列。
53. 一種特異性結合至MHC/RGS5表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：254之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：255之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：256之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：257之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列。
54. 如請求項53之腫瘤特異性TCR，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列。
55. 如請求項53或54之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DPA1*02：02/DPB1*05：01。
56. 一種特異性結合至MHC/RGS5表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：258之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO： 259之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：260之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：261之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
57. 如請求項56之腫瘤特異性TCR，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列。
58. 如請求項56或57之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。
59. 一種特異性結合至MHC/RGS5表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：262之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：263之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：264之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：265之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。
60. 如請求項59之腫瘤特異性TCR，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列。
61. 如請求項59或60之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。
62. 一種特異性結合至MHC/RGS5表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：266之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO： 267之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：268之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：269之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列。
63. 如請求項62之腫瘤特異性TCR，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列。
64. 如請求項62或63之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。
65. 一種特異性結合至MHC/RGS5表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：270之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：271之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：272之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：273之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列。
66. 如請求項65之腫瘤特異性TCR，其中該RGS5表位包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列。
67. 如請求項65或66之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DPA1*02：02/DPB1*05：01。
68. 一種特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：274之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：275之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：276之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：277之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列。
69. 如請求項68之腫瘤特異性TCR，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。
70. 如請求項68或69之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01。
71. 一種特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：278之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：279之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：280之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：281之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列。
72. 如請求項71之腫瘤特異性TCR，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。
73. 如請求項71或72之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01或HLA-DRA/DRB4*01：03。
74. 一種特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：282之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：283之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：284之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：285之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列。
75. 如請求項74之腫瘤特異性TCR，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列。
76. 如請求項74或75之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-II。
77. 一種特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：286之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：287之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：288之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：289之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列。
78. 如請求項77之腫瘤特異性TCR，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。
79. 如請求項77或78之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DRA/DRB1*09：01。
80. 一種特異性結合至MHC/HPV18-E7表位複合物之腫瘤特異性TCR，其包含：包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRα鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：290之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：291之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列；及包含CDR1、CDR2、及CDR3之TCRβ鏈，該CDR1包含SEQ ID NO：292之胺基酸序列，該CDR2包含SEQ ID NO：293之胺基酸序列，該CDR3包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列。
81. 如請求項80之腫瘤特異性TCR，其中該HPV18-E7表位包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。
82. 如請求項80或81之腫瘤特異性TCR，其中該MHC係HLA-DPA1*02：02/DPB1*05：01、HLA-DPA1*01：03/DPB1*02：01、或HLA-DPA1*01：03/DPB1*05：01
83. 實施例49至51及53至82中任一者之腫瘤特異性TCR，其中該TCR係人類TCR。
84. 實施例49至51及53至82中任一者之腫瘤特異性TCR，其中該TCR係嵌合TCR，諸如鼠源化TCR，例如包含TCRα鏈及β鏈之鼠類恆定區的TCR。
85. 實施例49至51及53至82中任一者之腫瘤特異性TCR，其中該TCR包含鼠類TCR恆定區。
86. 一種單離核酸，其編碼實施例48至85中任一者之腫瘤特異性TCR之TCRα鏈及/或TCRβ鏈。
87. 一種載體，其包含實施例86之單離核酸。
88. 一種經工程改造之免疫細胞，其包含實施例48至85中任一者之腫瘤特異性TCR、實施例86之單離核酸、或實施例87之載體。
89. 實施例88之經工程改造之免疫細胞，其中該免疫細胞係T細胞。
90. 一種醫藥組成物，其包含實施例88或89之經工程改造之免疫細胞及醫藥上可接受之載劑。
91. 一種治療個體中癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的實施例90之醫藥組成物。
92. 一種腫瘤特異性TCR之庫，該等腫瘤特異性TCR係使用實施例1至47中任一者之方法獲得。
93. 一種RGS-5之表位，其包含SEQ ID NO：82或83之胺基酸序列。
94. 一種HPV18-E7之表位，其包含SEQ ID NO：84、85、或86之胺基酸序列。
95. 一種MHC/表位複合物，其包含實施例93或94之表位及MHC分子。
實例
以下實例旨在純粹為本申請案的示例，因此不應視為以任何方式限制本發明。以下實例及詳細說明係以說明方式而非限制方式提供。
實例1：經MASCT治療之患者對腫瘤抗原肽的特異性免疫反應
患者WJ，女性，於41歲時經診斷出患有子宮頸癌並有血管侵犯，且人類乳突病毒(HPV)DNA測試結果呈陽性。她經歷了根除性切除，及五個月的放化療。患者接受了第二次HPV DNA測試，且經確認血清HPV DNA呈陰性。將此患者的臨床病史及反應彙總於圖2中。
在根除性切除及放化療後約兩年，根據磁共振造影(MRI)及發射電腦斷層掃描(ECT)，該患者經診斷出右骶髂關節骨上有轉移腫瘤。然後，患者接受十次局部放射療法治療，隨後進行三次MASCT治療(每個月投予一次)。該MASCT治療使用來自患者自身周邊血液的PBMC，以製備經18種抗原肽之池脈衝的樹突細胞，該等抗原肽包括核心組的12種腫瘤相關抗原肽、以及子宮頸癌特異性組的6種衍生自HPV之病毒蛋白的抗原肽。簡言之，將來自患者PBMC的單核球分化為未成熟DC，然後用多種合成肽抗原脈衝，該等合成肽抗原包括腫瘤相關抗原及HPV抗原。利用TLR配體進一步刺激未成熟DC以分化為成熟DC(mDC)。一半的mDC經皮下注射至患者。藉由用抗CD3抗體(例如，OKT3)及IL2來培養非黏附PBMC，製備維持T細胞。將另一半的mDC在輸注前與維持T細胞再共培養7至9天。該患者經確認具有HLA-A2血清型(HLA-A0201+)。
在四次MASCT治療後，患者的ECT結果顯示右骶髂關節骨轉移減少，且未偵測出新的轉移，其指示MASCT的正向治療成 果。患者接受四次額外的MASCT治療，以約1個月或2個月的間隔進行投予。在總共8次MASCT治療之後，獲得患者PBMC樣本，並以ELISPOT檢定對該樣本進行測試，以判定患者是否具有對抗原肽池及該池內抗原肽之各者的治療有效MHC限制性T細胞反應。ELISPOT結果展示對下列的增強T細胞反應：子宮頸癌抗原肽池；及個別抗原肽，其係在核心組腫瘤特異性抗原肽(諸如hTERT、p53、CEA、及RGS5)及子宮頸癌特異性組腫瘤抗原肽(諸如HPV-3及HPV-5)兩者內。患者在總共8次MASCT後的ECT顯示，右骶髂關節骨轉移進一步減少，且無新轉移部位，其指示MASCT治療方案成功減少患者的腫瘤負擔並預防腫瘤進展及進一步轉移。
基於患者的特異性免疫反應，藉由保存已誘導特異性反應的反應性肽，並移除未誘導特異性反應的非反應性肽，來客製化抗原肽池以提供患者特異性抗原肽池。該患者進一步經四個週期的MASCT治療，該MASCT係使用患者特異性抗原肽池製備(在本文中稱為「精確MASCT」)。在四次精確MASCT之後，患者的ECT顯示沒有右骶髂關節骨轉移的發展，且無新轉移部位。
基於患者的特異性免疫反應，進一步調整抗原肽池，且患者經四個週期的第2次精確MASCT(使用經進一步調整的肽抗原池)治療。在第二次四個週期的精確MASCT之後，患者經評估為具有疾病穩定(SD)。如ELISPOT檢定所展示，患者特異性抗原肽池引發增強的特異性反應(圖3A)。具體而言，HPV18-E7肽、CEA肽、及RGS5肽一致產生最強烈的特異性反應(圖3B)。
腫瘤特異性TCR經工程改造之T細胞的過繼轉移已對實體腫瘤顯示很大的療效。此患者的臨床效益指示，腫瘤特異性T細胞在體內擴增，並對控制腫瘤進展扮演重要角色。此等T細胞係單離腫瘤特異性TCR的良好來源。
實例2：來自腫瘤抗原特異性T細胞的成對腫瘤抗原肽特異性TCRα及TCRβ基因的識別
獲得來自實例1患者的PBMC樣本，並將其用於作為起始材料以製備此實例中的腫瘤抗原特異性T細胞。藉由對腫瘤抗原特異性T細胞樣本進行次世代定序，識別十二對腫瘤抗原特異性TCRα及TCRβ基因(3對為CEA特異性TCR，3對為RGS5特異性TCR，且6對為HPV18-E7特異性TCR)。
方法2 細胞製備
圖4提供例示性「方法2」之規程概述。簡言之，在第1天，藉由以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行的密度梯度離心，獲得來自患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。繼續將黏附單核球培養於AIM-V培養基中以分化為未成熟樹突細胞(DC)，該AIM-V培養基具有1000U/mL GM-CSF及500U/mL IL-4。將所得未成熟DC以肽池進行脈衝，該肽池包含三種衍生自CEA、RGS5、及HPV18-E7(1μg/mL/肽)的腫瘤抗原肽，然後培養於DC成熟培養基 中以分化為成熟DC。在第8天，以約15：1的T細胞與成熟抗原負載DC之間的比率，將含有T細胞的PBMC與抗原負載成熟DC共培養，且共培養基含有細胞激素混合物及抗PD-1抗體。在第11天，利用經肽池脈衝的PBMC來刺激共培養物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以單離IFNγ+ T細胞群。在第12天，在含有細胞激素混合物、抗PD-1抗體、及抗CD3抗體的培養基中，以約2：1的T細胞與抗原負載成熟DC之間的比率，將IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養(自第12天至第25至35天)，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞。
增生檢定
使用來自第1天(PBMC)、第8天(共培養開始)、第11天(在IFNγ富集前及在IFNγ富集後)、及第17、21、25、27、31、及32天(IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養)的細胞樣本，評估細胞增生。將各樣本中的細胞數目計數。
如圖5所示，抗原負載成熟DC與T細胞的初始共培養物產生少量IFNγ+ T細胞(第11天)。在經富集之IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC的共培養物中，細胞數目持續快速增加直到第31天為止，即該共培養物中的細胞總數在多於108而趨於穩定的時間點。
腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產
將各種共培養樣本各自接種(T細胞：1×106個細胞/孔；PBMC：2.5×105個細胞/孔)於AIM-V培養基中，並用2μg/mL的肽池刺激4小時。利用細胞內細胞激素染色及FACS分析，偵測各樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞之IFNγ生產水平。將與10μg/mL不相關肽培養的細胞樣本用於作為陰性對照。
用於細胞表面(例如，抗人類CD3-FITC)或細胞內細胞激素(例如，抗人類IFNγ-APC)染色的抗體係獲自BD Biosciences。利用Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定並滲透細胞，來執行細胞內細胞激素染色。使用FACS CantoII(BD Biosciences)流動式細胞儀執行流動式細胞測量術，並利用Flowjo程式分析數據。
圖6A至圖6B顯示在細胞樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞百分比，如藉由評估回應於腫瘤抗原肽池之刺激的IFNγ+ CD3+細胞而判定。在富集步驟後，細胞樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞百分比達到83.5%。自第21天至第32天，共培養物含有約10%的回應於腫瘤抗原肽池之刺激而生產IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞。在第25至32天的共培養物中，回應於不相關肽刺激而生產IFNγ之非特異性T細胞構成不到1%。
方法2之最佳化(「方法2m」) 細胞製備
圖7提供例示性「方法2m」之規程概述。簡言之，在第1天，藉由以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行的 密度梯度離心，獲得來自患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。繼續將黏附單核球培養於AIM-V培養基中以分化為未成熟樹突細胞(DC)，該AIM-V培養基具有1000U/mL GM-CSF及500U/mL IL-4。將所得未成熟DC以肽池進行脈衝，該肽池包含三種衍生自CEA、RGS5、及HPV18-E7(1μg/mL/肽)的腫瘤抗原肽，然後培養於DC成熟培養基中以分化為成熟DC。在第8天，以約20：1的T細胞與成熟抗原負載DC之間的比率，將含有T細胞的PBMC與抗原負載成熟DC共培養，且共培養基含有細胞激素混合物及抗PD-1抗體。在第11天，利用經肽池脈衝的PBMC來刺激共培養物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以單離IFNγ+ T細胞群。同時，將抗原負載成熟DC培養於DC成熟培養基中。在第12天，以約1：1的T細胞與抗原負載成熟DC之間的比率，將IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養於培養基中，該培養基含有細胞激素混合物、及抗PD-1抗體。在第13天或第14天，將抗CD3抗體(OKT3)添加至共培養物，將該共培養物繼續培養至第30天，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞。
增生檢定
如上所述，使用來自第1天(PBMC)、第9天(共培養開始)、第12天(在IFNγ富集前)、第12天(在IFNγ富集後)、及第22及30天(IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養)的細胞樣本，評估細胞增生。
如圖8所示，抗原負載成熟DC與T細胞的初始共培養物產生少量IFNγ+ T細胞(第12天)。在經富集之IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC的共培養物中，細胞數目持續快速增加直到第31天為止。在第14天添加抗CD3抗體的方法導致較高的細胞增生水平。
腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產
如上所述，判定各種共培養樣本中腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產水平。圖9A至圖9B顯示在細胞樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞百分比，如藉由評估回應於腫瘤抗原肽池之刺激的IFNγ+ CD3+細胞而判定。在富集步驟後，細胞樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞百分比達到90.4%。自第22天至第30天，共培養物含有約6至10%的回應於腫瘤抗原肽池之刺激而生產IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞。在第14天添加抗CD3抗體的方法產生較高百分比的IFNγ+ CD3+細胞。藉由評估IFNγ+ TNFα+細胞，獲得一致結果(圖9C)。
腫瘤抗原肽池之子集的篩選
設計並合成三種初始腫瘤抗原肽CEA、RGS5、及HPV18-E7之各者的五種片段。根據圖13，製備初始腫瘤抗原肽及其片段之子池。利用腫瘤抗原肽子池之各者，刺激在第30天獲得的腫瘤抗原特異性T細胞，並判定IFNγ+ CD3+細胞的百分比。如圖14A至圖14B所示，池2及池8一致地產生最高百分比的IFNγ+ CD3+細胞，其 意味著RGS5-OLP5片段引發腫瘤抗原特異性T細胞的最強烈特異性反應。
腫瘤抗原特異性T細胞的次世代定序
獲得使用方法2製備的四個腫瘤抗原特異性T細胞樣本，並使其經受TCRα及TCRβ擴增連同次世代定序。四個樣本是：(1)由CEA肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞；(2)由RGS5肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞；(3)由HPV18-E7肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞；及(4)由經磁珠富集之CEA肽刺激的INFγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞。作為對照，亦使來自相同患者的PBMC樣本經受相同的次世代定序分析。
圖10顯示分別由CEA肽、RGS5肽、及HPV18-E7肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞之流動式細胞測量術結果。各樣本含有多於90%的腫瘤抗原特異性T細胞(CD8+及CD4+細胞之組合)。
圖11顯示在各種樣本中獨特的TCRα及TCRβ序列之殖株型頻率。相較於經不相關肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞，由特異性腫瘤抗原肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞之獨特TCR殖株型頻率增加。由腫瘤抗原肽刺激的IFNγ分類腫瘤抗原特異性T細胞顯示甚至更高頻率的獨特TCR殖株型。
使在三個不同時間點(T1=2016年6月，T2=2016年9月，且T3=2017年5月)自患者獲得的冷凍PBMC樣本經受相同的腫瘤抗原特異性T細胞製備及定序分析。圖12顯示自批量次世代定序結 果識別的獨特TCRα及TCRβ殖株型頻率。在衍生自兩個或全部三個冷凍PBMC樣本的對應腫瘤抗原特異性T細胞樣本中，發現某些TCRα及TCRβ基因。
對腫瘤抗原特異性T細胞樣本施加使用IPAIRTM技術(iRepertoire,Inc.)進行的單細胞TCRα及TCRβ擴增連同次世代定序，以獲得TCRα及TCRβ基因的同源配對資訊。識別並合成三對CEA特異性TCRα及TCRβ基因(殖株1至3)、三對RGS5特異性TCRα及TCRβ基因(殖株1至3)、及六對HPV18-E7特異性TCRα及TCRβ基因(殖株1至6)。例示性TCR殖株的序列資訊請參見表1。製備表現各對TCRα及TCRβ基因的經工程改造之T細胞，並藉由使用ELISPOT檢定評估經工程改造之T細胞的腫瘤抗原特異性免疫反應來驗證該等TCR。
細胞激素混合物與IL-2及抗原肽池與單一抗原肽的比較 細胞製備
圖20提供比較下列之規程概述：添加細胞激素混合物與添加單獨IL-2；及經載有抗原肽池之DC刺激與經載有單一抗原肽之DC刺激。簡言之，在第1天，藉由以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行的密度梯度離心，獲得來自患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。繼續將黏附單核球培養於AIM-V培養基中以分化為未成熟樹突細胞(DC)，該AIM-V培養基具有1000U/mL GM-CSF及500U/mL IL-4。將所得未成熟DC以肽池進行脈衝，該肽池包含三 種衍生自CEA、RGS5、及HPV18-E7(1μg/mL/肽)的腫瘤抗原肽，然後培養於DC成熟培養基中以分化為成熟DC。在第9天，以約15：1至約20：1的T細胞與成熟抗原負載DC之間的比率，將含有T細胞的PBMC與抗原負載成熟DC共培養，且共培養基含有細胞激素混合物或IL-2(不大於約200IU/mL)及抗PD-1抗體。在第11天，利用經肽池或各個個別肽脈衝的PBMC來刺激共培養物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以單離IFNγ+ T細胞群。同時，將抗原負載成熟DC培養於DC成熟培養基中。以約1：1至約3：1的T細胞與抗原負載成熟DC之間的比率，將IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養於培養基中，該培養基含有在第12天添加的細胞激素混合物或在第14天添加的單獨IL-2(以至少約2000IU/mL)、及抗PD-1抗體。在第14天，將抗CD3抗體(OKT3)添加至共培養物，將該共培養物繼續培養至第29至30天，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞。
腫瘤抗原特異性T細胞的增生檢定及IFNγ生產
藉由實例2所述之方法，使用來自第1天(PBMC)、第9天(共培養開始)、第12天(在IFNγ富集前)、第12天(在IFNγ富集後)、及第19、24、及29天(IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養)的細胞樣本，評估細胞增生。
如圖21A所示，抗原負載成熟DC與T細胞的初始共培養物產生少量IFNγ+ T細胞(第12天)。在經富集之IFNγ+ T細胞與抗 原負載成熟DC的共培養物中，細胞數目持續快速增加直到第29天為止。
藉由實例2所述之方法，判定各種共培養樣本中腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產水平。如圖21B所示，在第9天將細胞激素混合物或僅IL-2添加至共培養物，並在第12天的富集步驟之後，獲得類似百分比的IFNγ+ T細胞。
下表3比較在第19天(測試1)及第29天(測試2)之細胞樣本中的腫瘤特異性T細胞百分比，如藉由評估回應於腫瘤抗原肽池或個別抗原肽之刺激的IFNγ+ CD3+細胞及IFNγ+ TNFα+細胞而判定。在第9天添加細胞激素混合物或單獨IL-2、及與以腫瘤抗原池或單一腫瘤抗原脈衝之DC共培養的規程在T細胞增生及腫瘤特異性T細胞百分比方面產生類似的結果。
Figure 108112961-A0202-12-0248-1045
Figure 108112961-A0202-12-0249-1046
圖22A至圖22B比較使用在第9天及第12天添加IL-2或細胞激素混合物的規程之各種共培養樣本中的T細胞數目及腫瘤抗原特異性T細胞百分比。在第9天添加IL-2、與在第12天以腫瘤抗原肽池脈衝之DC共培養、及在第14天添加IL-2的規程在第19及29天產生最高的腫瘤抗原特異性T細胞百分比。
實例3：來自腫瘤抗原特異性T細胞的成對RGS5特異性TCRα及TCRβ基因的識別
使用方法2及方法2m製備的腫瘤抗原特異性T細胞之冷凍儲備液係用於此實例中，以製備具有提高百分比(例如，至多50%)的RGS5特異性T細胞之腫瘤抗原特異性T細胞群。藉由對腫瘤抗原特異性T細胞樣本的單細胞定序，識別三對RGS5特異性TCRα及TCRβ基因。
細胞製備
圖15A至圖15B提供此實例中所使用之規程的概述。簡言之，將含有下列的共培養物樣本冷凍，以提供腫瘤抗原特異性T細胞之冷凍儲備液：使用實例2所述之方法2在第32天之腫瘤抗原特異性T細胞、或方法2m在第30天之腫瘤抗原特異性T細胞。在此實驗的第1天，將腫瘤抗原特異性T細胞之冷凍儲備液樣本解凍，並將其與載有RGS5-OLP5(1μg/mL)的LCL細胞(APC細胞系)在具有或不具有餵養細胞下共培養於共培養基中直到第9天為止，該共培養基包含細胞激素(IL-2、IL-7、IL-15)之混合物、抗CD3抗體(OKT-3)、及RGS5-OLP5。腫瘤抗原特異性T細胞與抗原負載LCL細胞之間的比率係約4：1。腫瘤抗原特異性T細胞、餵養細胞、及抗原負載LCL細胞之間的比率係約4：4：1。在第9天及第16天，藉由將腫瘤抗原特異性T細胞與抗原負載LCL細胞，在餵養細胞存在或不存在下共培養，以重複週期。
PBMC及樹突細胞可用於代替LCL細胞，以提供抗原負載APC。APC可載有單一腫瘤抗原肽、單一腫瘤抗原肽之表位片段、腫瘤抗原肽池、或腫瘤抗原肽之表位片段池。
增生檢定
藉由實例2所述之方法，使用來自第1、9、16、及23天之共培養物的細胞樣本來評估細胞增生。
如圖16所示，當將經解凍的冷凍腫瘤抗原特異性T細胞群與抗原負載LCL細胞在具有或不具有餵養細胞下共培養時，細胞持續增生直到第16天為止。總細胞數在第23天減少。
腫瘤抗原特異性T細胞的細胞激素生產
藉由實例2所述之方法，判定各種共培養樣本中腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產水平。
圖17A顯示在細胞樣本中的腫瘤抗原特異性T細胞百分比，如藉由評估回應於RGS5-OLP5肽之刺激的IFNγ+ CD3+細胞而判定。在第16天，自使用方法2m的腫瘤抗原特異性T細胞之冷凍儲備液衍生的共培養物含有約38.6%的回應於RGS5-OLP5肽之刺激而生產IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞。值得注意的是，在第23天，自使用方法2m的腫瘤抗原特異性T細胞之冷凍儲備液衍生的共培養物含有約53.8%的回應於RGS5-OLP5肽之刺激而生產IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞。自使用方法2的腫瘤抗原特異性T細胞之冷凍儲備液衍生的共培養物產生較低百分比的回應於第16天及第23天RGS5-OLP5肽之刺激而生產IFNγ之腫瘤抗原特異性T細胞。藉由評估IFNγ+ TNFα+細胞，獲得一致結果(圖17B)。此等結果意味著，利用載有腫瘤抗原肽的APC重複刺激腫瘤抗原特異性T細胞，可提高對腫瘤抗原肽有特異性反應的T細胞百分比。
腫瘤抗原特異性T細胞的次世代定序
製備自使用方法2m製備之腫瘤抗原特異性T細胞的冷凍儲備液衍生的三個腫瘤抗原特異性T細胞樣本，並使其經受使用IPAIRTM技術(iRepertoire,Inc.)的批量及單細胞TCRα及TCRβ擴增連同次世代定序。三個樣本是：(1)由不相關肽刺激的腫瘤抗原特異性T細胞；(2)由RGS5-OLP5刺激的腫瘤抗原特異性T細胞；及(3)由經磁珠富集之RGS5-OLP5刺激的INFγ+CD3+腫瘤抗原特異性T細胞。作為對照，亦使來自相同患者的PBMC樣本經受相同的次世代定序分析。
圖18A及圖18B顯示在各種樣本中獨特的TCRα及TCRβ序列之殖株型頻率。相較於對照T細胞(即，由不相關肽刺激的PBMC及腫瘤抗原特異性T細胞)，由RGS5-OLP5刺激的腫瘤抗原特異性T細胞及由RG5-OLP5刺激的INFγ分類腫瘤抗原特異性T細胞具有高出許多的獨特TCRα及TCRβ序列之殖株型頻率。
值得注意的是，使用IPAIRTM Analyzer軟體，在96個單細胞TCRα及TCRβ定序樣本中，有69個達到同源TCRα及TCRβ配對(圖19)。自圖19中所示之96孔盤，識別一對RGS5特異性TCRα及TCRβ基因(殖株4)。識別並合成來自最主要殖株型的三對RGS5特異性TCRα及TCRβ基因(殖株4至6)。例示性TCR殖株的詳細資訊請參見表1。製備表現各對RGS5特異性TCRα及TCRβ基因的經工程改造之T細胞，並藉由評估經工程改造之T細胞的RGS5特異性免疫反應來驗證該等TCR。
實例4：RGS5及HPV18 E7特異性TCR之驗證
使用圖23所示之檢定，驗證自實例2及3識別的腫瘤抗原特異性TCR。驗證五種RGS5特異性TCR及五種HPV18-E7特異性TCR。
製備對應於其的人類(即，野生型)TCR構築體及鼠源化TCR構築體(圖24)。鼠源化TCR構築體具有鼠類恆定域(mCα及mCβ1)。發現3種具有N端19胺基酸前導序列(SEQ ID NO：101)的TCR變體，並製備其鼠源化版本。圖25A至圖25B顯示經製備及驗證的26種TCR構築體。發現多種辨識相同表位的TCR，該等表位諸如RGS5之胺基酸16-30、及HPV18-E7之胺基酸84-102。針對TCR構築體的驗證檢定結果係顯示於圖26A至圖35G中。
TCR表現檢定
使用偵測染色TCR Vβ鏈的FACS檢定，評估TCR表現。簡言之，收集TCR轉移T細胞並藉由添加10mL PBS(含有2%胎牛血清)來洗滌，以350g離心5分鐘，且將上清液完全吸出。藉由添加PBS(含有2%胎牛血清)，將細胞團塊再懸浮並調整至約2×106個細胞/mL。收集100μL/樣本細胞懸浮液，並將其用於TCR Vβ鏈表面染色且由FACS進行偵測。
LCL刺激檢定
LCL刺激檢定如下進行。首先，使LCL載有肽：將LCL收集於15mL試管中，藉由添加10mL PBS來洗滌，以350g離 心5分鐘，且將上清液完全吸出。將細胞團塊再懸浮於培養基(含有10% FBS的RPMI1640)中，並調整至1×106個細胞/mL。將腫瘤抗原肽添加於LCL至最終濃度5μg/mL，並在培養箱中培養8至24小時。然後，用肽負載LCL刺激TCR-T細胞如下：收集肽負載LCL並藉由添加10mL PBS來洗滌，以350g離心5分鐘，且將上清液完全吸出。藉由添加AIM-V培養基(含有10%胎牛血清)，將LCL再懸浮並調整至1×106個細胞/mL或1×105個細胞/mL。收集TCR轉導T細胞並藉由添加10mL PBS來洗滌，以350g離心5分鐘，且將上清液完全吸出。然後，藉由添加AIM-V培養基(含有10%胎牛血清)，將TCR轉導T細胞再懸浮，並調整至2×106個細胞/mL或5×105個細胞/mL。將100μL/孔的LCL(1×106個細胞/mL)及100μL/孔的TCR轉導T細胞(2×106個細胞/mL)混合至96孔盤中。將布雷非德菌素A(brefeldin A)(最終濃度3μg/mL)添加至孔中，並培養4小時。4小時後，收集細胞，並將其用於細胞內IFN-γ及TNF-α染色且由FACS進行偵測。針對IFN-γ的ELISA偵測，將100μL/孔的LCL(1×105個細胞/mL)及100μL/孔的TCR轉導T細胞(5×105個細胞/mL)混合至96孔盤中，並在培養箱中培養24小時。24小時後，在96盤中每孔收集175μL的上清液，並將其用於使用IFN-γ ELISA HRP套組之IFN-γ的ELISA偵測。
HLA阻斷檢定
HLA阻斷檢定如下進行。在LCL刺激之後收集肽負載LCL，藉由添加10mL PBS來洗滌，以350g離心5分鐘，且將上清液完全吸出。藉由添加AIM-V培養基(含有10%胎牛血清)，將細胞團塊再懸浮，調整至1×105個細胞/mL。將100μL/孔的細胞懸浮液添加至96孔盤，且將HLA阻斷抗體添加(最終濃度50μg/mL)至適當孔，並在培養箱中培養2小時。收集TCR轉移T細胞，藉由添加10mL的PBS來洗滌，以350g離心5分鐘，且將上清液完全吸出。藉由添加AIM-V培養基(含有10%胎牛血清)，收集細胞團塊並將其調整至5×105個細胞/mL。將100μL/孔的TCR轉導細胞懸浮液添加至對應孔，與LCL混合，並在培養箱中培養24小時。24小時後，96盤之每孔收集175μL的上清液，並使其經受使用IFN-γ ELISA HRP套組之IFN-γ的ELISA偵測。
HLA限制檢定
使來自具有各種HLA-II基因型的不同捐贈者(表4)之LCL載有肽，以在HLA限制檢定中刺激TCR-T。其餘步驟與LCL刺激檢定相同。
表4.具有不同HLA基因型的捐贈者。
Figure 108112961-A0202-12-0256-1047
人類IFN-γ ELISA
在第1天，將高蛋白結合ELISA盤用於PBS(pH 7.4)中經稀釋至2μg/mL的抗體1-D1K(IFN-γ ELISA HRP套組)塗佈(藉由添加50μL/孔)，並在4℃下培養過夜。在第2天，將盤用PBS(200μL/孔)洗滌兩次。將盤藉由添加200μL/孔的培養基來阻斷，並在室溫(RT)下培養1小時。將人類IFN-γ標準品(IFN-γ ELISA HRP套組)製備於2mL PBS(具有1% BSA)中至0.5μg/mL的濃度，並置於RT下15分鐘，然後使試管漩渦震盪。將50μL/孔的樣本或標準品稀釋於培養基中並在RT下培養2小時。以二重複測試樣本及標準探針。將盤用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌五次。以1μg/mL(於PBS中)添加50μL/孔的抗體7-B6-1-生物素(IFN-γ ELISA HRP套組)，在RT下培養1小時，並洗滌。添加50μL/孔經1：1000稀釋於PBS中的鏈黴親和素-HRP(IFN-γ ELISA HRP套組)，在RT下培養1小時，並洗滌。添加100μL/孔的TMB受質溶液，在RT下於暗處培養15至30分鐘，直到孔中溶液轉變成可見藍色為止。添加50μL/孔的終止溶液以終止酶反應。溶液顏色從藍色變成黃色。在450nm下以ELISA讀取儀測量光密度。
實例5：來自經MASCT治療之患者的兩輪式腫瘤特異性T細胞擴增
患者SMZ經診斷出患有轉移性肺癌，並接受了5個週期以活化T細胞進行的改良MASCT治療(參見PCT/CN2018/081338及PCT/CN2019/080535)，該等活化T細胞係使用載有下列之DC製備：一般腫瘤抗原肽(hTERT、p53、存活素、NY-ESO-1、CEA、CDCA1、VEGFR1、VEGFR2、RGS5、CCND1、MUC1、Her2、MAGEA1、MAGEA3、WT-1)及新抗原肽(SMX-1、SMX-2、及SMX-3)之池。圖36的上圖顯示，在ELISPOT檢定中，在經過第5個週期的改良MASCT之後，患者之PBMC樣本的抗原特異性T細胞反應。具體而言，四種腫瘤抗原hTERT、CCND1、MAGE-A1、及WT-1誘導強烈的免疫反應。該患者隨後經額外週期(週期6)的改良MASCT治療。圖36的下圖顯示，在ELISPOT檢定中，在經過第6個週期的改良MASCT之後，患者之PBMC樣本的抗原特異性T細胞反應。在ELISPOT檢定中，使用來自對應於抗原hTERT、CCND1、MAGE-A1、及WT-1之腫瘤抗原肽子池之各者的單一肽，來偵測抗原特異性免疫反應，並識別免疫優勢腫瘤抗原肽。肽hTERT-1及hTERT-2顯示特別強烈的免疫反應。
獲得來自患者SMZ之PBMC樣本，以使用兩輪式規程製備腫瘤特異性T細胞。
第1輪
圖37提供此實例中所使用之第1輪腫瘤特異性T細胞製備的規程概述。簡言之，在第1天，藉由以Lymphoprep(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)進行的密度梯度離心，獲得來自患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。繼續將黏附單核球培養於AIM-V培養基中以分化為未成熟樹突細胞(DC)，該AIM-V培養基具有1000U/mL GM-CSF及500U/mL IL-4。將所得未成熟DC以肽池進行脈衝，該肽池包含兩種衍生自hTERT(即，hTERT1及hTERT2，1μg/mL/肽)的腫瘤抗原肽，然後培養於DC成熟培養基中以分化為成熟DC。在第8天，用肽池刺激PBMC。在第9天，使用IFNγ Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以自經刺激PBMC單離IFNγ+ T細胞群。在第9天，將IFNγ+ T細胞與抗原負載成熟DC共培養於培養基中，該培養基含有IL-2及抗PD-1抗體。在第11天，利用經肽池或各個個別肽脈衝的PBMC來刺激共培養物。在第12天，使用IFNγSecretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec)，以單離IFNγ+ T細胞群。同時，製備抗原負載成熟DC(「DC刺激」)或PBMC(「PBMC刺激」)，並將其與IFNγ+ T細胞共培養。在第14天，將抗CD3抗體(OKT3)及IL-2(以至少約2000IU/mL)添加至共培養物，將該共培養物繼續培養至第31天，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞。
藉由實例2所述之方法，使用來自第1天(PBMC)、第9天(在IFNγ富集前)、第12天(在IFNγ富集後)、及第23、29、及30天(IFNγ+ T細胞與抗原負載DC或PBMC共培養)的細胞樣本， 評估細胞增生。如圖38A所示，使用抗原負載DC或PBMC的規程產生類似的T細胞增生結果。
藉由實例2所述之方法，判定各種共培養樣本中腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產水平。圖38B顯示在富集步驟之後的各種T細胞群之百分比。圖39A至圖39E比較在第23及30天之細胞樣本中的各種腫瘤特異性T細胞群之百分比，如藉由評估回應於腫瘤抗原肽池或個別抗原肽之刺激的IFNγ+ CD3+細胞、IFNγ+ CD4+細胞、及IFNγ+ TNFα+細胞而判定。與抗原負載DC的共培養物產生最高的腫瘤特異性T細胞百分比。如圖39F所示，在第30天之樣本中，98.6%的IFNγ+ CD4+細胞係CCR7- CD45RO-效應T細胞。
第2輪
圖40提供此實例中所使用之第2輪腫瘤特異性T細胞製備的規程概述。簡言之，在第1天，將來自第1輪的腫瘤特異性T細胞培養於培養基中，該培養基包含細胞激素混合物(IL-2、IL-7、及IL-15)及抗PD-1抗體。製備載有hTERT-2肽的PBMC或成熟DC。以1：3、1：1、或3：1的T細胞與PBMC之間的比率，或者以3：1及1：1的T細胞與DC之間的比率，將腫瘤特異性T細胞與抗原負載DC或PBMC共培養。在第3天，將抗CD3抗體(OKT3)及IL-2添加至共培養物，將該共培養物繼續培養至第8天，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞。
藉由實例2所述之方法，使用來自第1天(第1輪腫瘤特性T細胞)、及第8天(IFNγ+ T細胞與抗原負載DC或PBMC共培養)的細胞樣本，評估細胞增生。藉由實例2所述之方法，判定各種共培養樣本中腫瘤抗原特異性T細胞的IFNγ生產水平。如圖41A所示，與抗原負載DC的共培養物在第8天產生最高的T細胞數目及最高的腫瘤特異性T細胞百分比。
圖41B至圖41C比較在第8天之細胞樣本中的各種腫瘤特異性T細胞群之百分比，如藉由評估回應於hTERT2抗原肽刺激的IFNγ+ CD3+細胞及IFNγ+ TNFα+細胞而判定。以3：1的DC與T細胞之間的比率之與抗原負載DC的共培養物產生最高的腫瘤特異性T細胞百分比。
圖42圖顯示在第1輪第1天及第30天、及在第38天(即，第2輪第8天)的T細胞及腫瘤特異性T細胞數目。兩輪式規程有效地擴增腫瘤特異性T細胞。相較於抗原負載PMBC的刺激，第2輪中抗原負載DC的刺激產生較高的T細胞數目及較高的腫瘤特異性T細胞百分比。在第1輪結束時獲得的腫瘤特異性T細胞係效應T細胞。
序列表
TCRα或TCRβ鏈胺基酸序列中加底線的部分係CDR序列。
SEQ ID NO：1(CEA序列) YGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKIQPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTS
SEQ ID NO：2(RGS-5序列)MCKGLAALPHSCLERAKEIKIKLGILLQKPDSVGDLVIPYNEKPEKPAKT
SEQ ID NO：3(HPV18-E7序列)
Figure 108112961-A0202-12-0261-761
SEQ ID NO：4(CEA殖株1 TCRα CDR3)CIGPFGNEKLTF
SEQ ID NO：5(CEA殖株1 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0261-762
SEQ ID NO：6(CEA殖株1 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0262-763
SEQ ID NO：7(CEA殖株1 TCRβ CDR3)CASSLDRTVYGYTF
SEQ ID NO：8(CEA殖株1 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0263-764
SEQ ID NO：9(CEA殖株1 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0263-765
Figure 108112961-A0202-12-0264-766
SEQ ID NO：10(CEA殖株2 TCRα CDR3)CALSGGANAGKSTF
SEQ ID NO：11(CEA殖株2 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0264-767
SEQ ID NO：12(CEA殖株2 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0265-768
SEQ ID NO：13(CEA殖株2 TCRβ CDR3)CASSELGNTIYF
SEQ ID NO：14(CEA殖株2 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0266-769
SEQ ID NO：15(CEA殖株2 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0266-770
Figure 108112961-A0202-12-0267-771
SEQ ID NO：16(CEA殖株3 TCRα CDR3)CAAHADYKLSF
SEQ ID NO：17(CEA殖株3 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0267-772
SEQ ID NO：18(CEA殖株3 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0268-773
SEQ ID NO：19(CEA殖株3 TCRβ CDR3)CASSLDRATNEKLFF
SEQ ID NO：20(CEA殖株3 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0269-774
SEQ ID NO：21(CEA殖株3 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0269-775
Figure 108112961-A0202-12-0270-776
SEQ ID NO：22(RSG5殖株1 TCRα CDR3)CALNNDYKLSF
SEQ ID NO：23(RSG5殖株1 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0270-777
SEQ ID NO：24(RSG5殖株1 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0271-778
SEQ ID NO：25(RSG5殖株1 TCRβ CDR3)CASSDKGFDEQFF
SEQ ID NO：26(RSG5殖株1 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0272-779
SEQ ID NO：27(RSG5殖株1 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0272-780
Figure 108112961-A0202-12-0273-781
SEQ ID NO：28(RSG5殖株2 TCRα CDR3)CIVRAWYNNNDMRF
SEQ ID NO：29(RSG5殖株2 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0273-782
SEQ ID NO：30(RSG5殖株2 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0273-783
Figure 108112961-A0202-12-0274-784
SEQ ID NO：31(RSG5殖株2 TCRβ CDR3)CASRDTEAFF
SEQ ID NO：32(RSG5殖株2 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0274-785
Figure 108112961-A0202-12-0275-786
SEQ ID NO：33(RSG5殖株2 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0275-787
Figure 108112961-A0202-12-0276-788
SEQ ID NO：34(RSG5殖株3 TCRα CDR3)CVVNMRDSSYKLIF
SEQ ID NO：35(RSG5殖株3 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0276-789
SEQ ID NO：36(RSG5殖株3 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0276-790
Figure 108112961-A0202-12-0277-791
SEQ ID NO：37(RSG5殖株3 TCRβ CDR3)CSAHERITDTQYF
SEQ ID NO：38(RSG5殖株3 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0277-792
Figure 108112961-A0202-12-0278-793
SEQ ID NO：39(RSG5殖株3 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0278-794
Figure 108112961-A0202-12-0279-795
SEQ ID NO：40(RSG5殖株4 TCRα CDR3)CVVNMKDSSYKLIF
SEQ ID NO：41(RSG5殖株4 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0279-796
SEQ ID NO：42(RSG5殖株4 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0279-797
Figure 108112961-A0202-12-0280-798
SEQ ID NO：43(RSG5殖株4 TCRβ CDR3)CSALEGTSGKETQYF
SEQ ID NO：44(RSG5殖株4 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0280-799
SEQ ID NO：45(RSG5殖株4 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0281-800
SEQ ID NO：46(RSG5殖株5 TCRα CDR3)CAGPGNQFYF
SEQ ID NO：47(RSG5殖株5 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0282-801
SEQ ID NO：48(RSG5殖株5 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0282-802
Figure 108112961-A0202-12-0283-803
SEQ ID NO：49(RSG5殖株5 TCRβ CDR3)CASSSWDRDQPQHF
SEQ ID NO：50(RSG5殖株5 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0283-804
SEQ ID NO：51(RSG5殖株5 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0284-805
SEQ ID NO：52(RSG5殖株6 TCRα CDR3) CALSALPYNQGGKLIF
SEQ ID NO：53(RSG5殖株6 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0285-806
SEQ ID NO：54(RSG5殖株6 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0285-807
Figure 108112961-A0202-12-0286-808
SEQ ID NO：55(RSG5殖株6 TCRβ CDR3)CAWARSRELFF
SEQ ID NO：56(RSG5殖株6 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0286-809
SEQ ID NO：57(RSG5殖株6 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0286-810
Figure 108112961-A0202-12-0287-811
SEQ ID NO：58(HPV18-E7殖株1 TCRα CDR3)CAFYAGNNRKLIW
SEQ ID NO：59(HPV18-E7殖株1 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0288-812
SEQ ID NO：60(HPV18-E7殖株1 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0288-813
Figure 108112961-A0202-12-0289-814
SEQ ID NO：61(HPV18-E7殖株1 TCRβ CDR3)CASSIDPATSHEQFF
SEQ ID NO：62(HPV18-E7殖株1 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0289-815
SEQ ID NO：63(HPV18-E7殖株1 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0289-816
Figure 108112961-A0202-12-0290-817
SEQ ID NO：64(HPV18-E7殖株2 TCRα CDR3)CALSGRRDDMRF
SEQ ID NO：65(HPV18-E7殖株2 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0291-818
SEQ ID NO：66(HPV18-E7殖株2 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0291-819
Figure 108112961-A0202-12-0292-820
SEQ ID NO：67(HPV18-E7殖株2 TCRβ CDR3)CASSFRGDEQFF
SEQ ID NO：68(HPV18-E7殖株2 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0292-821
SEQ ID NO：69(HPV18-E7殖株2 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0292-822
Figure 108112961-A0202-12-0293-823
SEQ ID NO：70(HPV18-E7殖株3 TCRα CDR3)CAMSPRSGYALNF
SEQ ID NO：71(HPV18-E7殖株3 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0293-824
Figure 108112961-A0202-12-0294-825
SEQ ID NO：72(HPV18-E7殖株3 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0294-826
Figure 108112961-A0202-12-0295-827
SEQ ID NO：73(HPV18-E7殖株3 TCRβ CDR3)CASSMDAALGEKLFF
SEQ ID NO：74(HPV18-E7殖株3 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0295-828
SEQ ID NO：75(HPV18-E7殖株3 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0295-829
Figure 108112961-A0202-12-0296-830
SEQ ID NO：76(HPV18-E7殖株4 TCRα CDR3)CALRSGGSNYKLTF
SEQ ID NO：77(HPV18-E7殖株4 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0296-831
Figure 108112961-A0202-12-0297-832
SEQ ID NO：78(HPV18-E7殖株4 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0297-833
SEQ ID NO：79(HPV18-E7殖株4 TCRβ CDR3)CASSVEWGTYEQYF
SEQ ID NO：80(HPV18-E7殖株4 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0298-834
SEQ ID NO：81(HPV18-E7殖株4 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0298-835
Figure 108112961-A0202-12-0299-836
SEQ ID NO：82(RGS5表位1)AKEIKIKLGILLQKP
SEQ ID NO：83(RGS5表位2)MCKGLAALPHSCLERAKEIKIKLGILLQKP
SEQ ID NO：84(HPV18 E7表位1)ADDLRAFQQLFLNTL
SEQ ID NO：85(HPV18 E7表位2) RAFQQLFLNTLSFVCPWCA
SEQ ID NO：86(HPV18 E7表位3)VESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ
SEQ ID NO：87(HPV18-E7殖株5 TCRα CDR3)CAVYQGAQKLVF
SEQ ID NO：88(HPV18-E7殖株5 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0300-837
SEQ ID NO：89(HPV18-E7殖株5 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0300-838
Figure 108112961-A0202-12-0301-839
SEQ ID NO：90(HPV18-E7殖株5 TCRβ CDR3)CSAPWLAGLYNEQFF
SEQ ID NO：91(HPV18-E7殖株5 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0301-840
Figure 108112961-A0202-12-0302-841
SEQ ID NO：92(HPV18-E7殖株5 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0302-842
Figure 108112961-A0202-12-0303-843
SEQ ID NO：93(HPV18-E7殖株6 TCRα CDR3)CVVSAIGYSSASKIIF
SEQ ID NO：94(HPV18-E7殖株6 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0303-844
SEQ ID NO：95(HPV18-E7殖株6 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0303-845
Figure 108112961-A0202-12-0304-846
SEQ ID NO：96(HPV18-E7殖株6 TCRβ CDR3)CASSLVAGGPAETQYF
SEQ ID NO：97(HPV18-E7殖株6 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0304-847
SEQ ID NO：98(HPV18-E7殖株6 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0305-848
SEQ ID NO：99(P2A胺基酸序列)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO：100(P2A核酸序列)GGAAGCGGCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCC
SEQ ID NO：101(前導胺基酸序列)MEAVVTTLPREGGVRPSRK
SEQ ID NO：102(前導核酸序列)ATGGAGGCAGTGGTCACAACTCTCCCCAGAGAAGGTGGTGTGAGGCCATCACGGAAG
SEQ ID NO：103(鼠源化RSG5殖株2 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0306-849
SEQ ID NO：104(鼠源化RSG5殖株2 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0307-850
SEQ ID NO：105(鼠源化RSG5殖株2 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0307-851
Figure 108112961-A0202-12-0308-852
SEQ ID NO：106(鼠源化RSG5殖株2 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0308-853
Figure 108112961-A0202-12-0309-854
SEQ ID NO：107(鼠源化RSG5殖株3 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0309-855
SEQ ID NO：108(鼠源化RSG5殖株3 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0309-856
Figure 108112961-A0202-12-0310-857
SEQ ID NO：109(鼠源化RSG5殖株3 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0310-858
SEQ ID NO：110(鼠源化RSG5殖株3 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0310-859
Figure 108112961-A0202-12-0311-860
SEQ ID NO：111(鼠源化RSG5殖株4 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0311-861
SEQ ID NO：112(鼠源化RSG5殖株4 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0312-862
SEQ ID NO：113(鼠源化RSG5殖株4 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0313-863
SEQ ID NO：114(鼠源化RSG5殖株4 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0313-864
Figure 108112961-A0202-12-0314-865
SEQ ID NO：115(鼠源化RSG5殖株5 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0314-866
SEQ ID NO：116(鼠源化RSG5殖株5 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0314-867
Figure 108112961-A0202-12-0315-868
SEQ ID NO：117(鼠源化RSG5殖株5 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0315-869
SEQ ID NO：118(鼠源化RSG5殖株5 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0315-870
Figure 108112961-A0202-12-0316-871
SEQ ID NO：119(鼠源化RSG5殖株6 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0316-872
Figure 108112961-A0202-12-0317-873
SEQ ID NO：120(鼠源化RSG5殖株6 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0317-874
SEQ ID NO：121(鼠源化RSG5殖株6 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0318-875
SEQ ID NO：122(鼠源化RSG5殖株6 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0318-876
Figure 108112961-A0202-12-0319-877
SEQ ID NO：123(鼠源化HPV18 E7殖株1 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0319-878
SEQ ID NO：124(鼠源化HPV18 E7殖株1 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0319-879
Figure 108112961-A0202-12-0320-880
SEQ ID NO：125(鼠源化HPV18 E7殖株1 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0320-881
SEQ ID NO：126(鼠源化HPV18 E7殖株1 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0321-882
SEQ ID NO：127(鼠源化HPV18 E7殖株3 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0322-883
SEQ ID NO：128(鼠源化HPV18 E7殖株3 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0322-884
Figure 108112961-A0202-12-0323-885
SEQ ID NO：129(鼠源化HPV18 E7殖株3 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0323-886
SEQ ID NO：130(鼠源化HPV18 E7殖株3 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0323-887
Figure 108112961-A0202-12-0324-888
SEQ ID NO：131(鼠源化HPV18 E7殖株4 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0324-889
SEQ ID NO：132(鼠源化HPV18 E7殖株4 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0324-890
Figure 108112961-A0202-12-0325-891
SEQ ID NO：133(鼠源化HPV18 E7殖株4 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0325-892
Figure 108112961-A0202-12-0326-893
SEQ ID NO：134(鼠源化HPV18 E7殖株4 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0326-894
Figure 108112961-A0202-12-0327-895
SEQ ID NO：135(鼠源化HPV18 E7殖株5 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0327-896
SEQ ID NO：136(鼠源化HPV18 E7殖株5 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0327-897
Figure 108112961-A0202-12-0328-898
SEQ ID NO：137(鼠源化HPV18 E7殖株5 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0328-899
SEQ ID NO：138(鼠源化HPV18 E7殖株5 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0328-900
Figure 108112961-A0202-12-0329-901
SEQ ID NO：139(鼠源化HPV18 E7殖株6 TCRα鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0329-902
SEQ ID NO：140(鼠源化HPV18 E7殖株6 TCRα鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0330-903
SEQ ID NO：141(鼠源化HPV18 E7殖株6 TCRβ鏈胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0330-904
Figure 108112961-A0202-12-0331-905
SEQ ID NO：142(鼠源化HPV18 E7殖株6 TCRβ鏈核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0331-906
Figure 108112961-A0202-12-0332-907
SEQ ID NO：195(T2A胺基酸序列)GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：196(E2A胺基酸序列)GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：197(F2A胺基酸序列)GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：198(Cα胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0332-908
SEQ ID NO：199(Cα核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0333-909
SEQ ID NO：200(mCα胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0333-910
SEQ ID NO：201(mCα核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0333-911
Figure 108112961-A0202-12-0334-912
SEQ ID NO：202(Cβ1胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0334-913
SEQ ID NO：203(Cβ1核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0334-914
SEQ ID NO：204(Cβ2胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0335-915
SEQ ID NO：205(Cβ2核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0335-916
SEQ ID NO：206(mCβ1胺基酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0336-917
SEQ ID NO：207(mCβ1核酸序列)
Figure 108112961-A0202-12-0336-918
表5.例示性TCR之CDR序列。
Figure 108112961-A0202-12-0337-919
<110> 中國大陸商深圳源正細胞醫療技術有限公司 中國大陸商恒瑞源正(深圳)生物科技有限公司
<120> 獲得腫瘤特異性T細胞受體之方法
<130> 77690-20003.42
<140> 尚未分配
<141> 與此同時
<150> PCT/CN2018/082947
<151> 2018-04-13
<160> 293
<170> 用於Windows第4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 1
Figure 108112961-A0202-12-0338-920
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 2
Figure 108112961-A0202-12-0338-921
Figure 108112961-A0202-12-0339-922
<210> 3
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 3
Figure 108112961-A0202-12-0339-923
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4
Figure 108112961-A0202-12-0339-925
<210> 5
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 5
Figure 108112961-A0202-12-0339-924
Figure 108112961-A0202-12-0340-926
<210> 6
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 6
Figure 108112961-A0202-12-0340-927
Figure 108112961-A0202-12-0341-928
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 7
Figure 108112961-A0202-12-0341-929
<210> 8
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 8
Figure 108112961-A0202-12-0341-930
Figure 108112961-A0202-12-0342-931
<210> 9
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 9
Figure 108112961-A0202-12-0342-932
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 10
Figure 108112961-A0202-12-0342-933
<210> 11
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 11
Figure 108112961-A0202-12-0343-934
<210> 12
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
Figure 108112961-A0202-12-0343-935
Figure 108112961-A0202-12-0344-936
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 13
Figure 108112961-A0202-12-0344-938
<210> 14
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 14
Figure 108112961-A0202-12-0344-937
Figure 108112961-A0202-12-0345-939
<210> 15
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 15
Figure 108112961-A0202-12-0345-940
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 16
Figure 108112961-A0202-12-0346-941
<210> 17
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 17
Figure 108112961-A0202-12-0346-942
<210> 18
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 18
Figure 108112961-A0202-12-0347-943
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 19
Figure 108112961-A0202-12-0347-944
<210> 20
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 20
Figure 108112961-A0202-12-0347-945
Figure 108112961-A0202-12-0348-946
<210> 21
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 21
Figure 108112961-A0202-12-0348-947
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 22
Figure 108112961-A0202-12-0349-948
<210> 23
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 23
Figure 108112961-A0202-12-0349-949
Figure 108112961-A0202-12-0350-950
<210> 24
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 24
Figure 108112961-A0202-12-0350-951
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 25
Figure 108112961-A0202-12-0350-952
<210> 26
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 26
Figure 108112961-A0202-12-0350-953
Figure 108112961-A0202-12-0351-954
<210> 27
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 27
Figure 108112961-A0202-12-0351-955
Figure 108112961-A0202-12-0352-956
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 28
Figure 108112961-A0202-12-0352-958
<210> 29
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 29
Figure 108112961-A0202-12-0352-957
Figure 108112961-A0202-12-0353-959
<210> 30
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 30
Figure 108112961-A0202-12-0353-961
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 31
Figure 108112961-A0202-12-0353-960
<210> 32
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 32
Figure 108112961-A0202-12-0354-962
<210> 33
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 33
Figure 108112961-A0202-12-0354-963
Figure 108112961-A0202-12-0355-964
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 34
Figure 108112961-A0202-12-0355-966
<210> 35
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 35
Figure 108112961-A0202-12-0355-965
Figure 108112961-A0202-12-0356-967
<210> 36
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 36
Figure 108112961-A0202-12-0356-969
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 37
Figure 108112961-A0202-12-0356-968
Figure 108112961-A0202-12-0357-970
<210> 38
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 38
Figure 108112961-A0202-12-0357-971
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 39
Figure 108112961-A0202-12-0358-972
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 40
Figure 108112961-A0202-12-0358-974
<210> 41
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 41
Figure 108112961-A0202-12-0358-973
Figure 108112961-A0202-12-0359-975
<210> 42
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
Figure 108112961-A0202-12-0359-976
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 43
Figure 108112961-A0202-12-0360-977
<210> 44
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 44
Figure 108112961-A0202-12-0360-978
Figure 108112961-A0202-12-0361-979
<210> 45
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 45
Figure 108112961-A0202-12-0361-981
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 46
Figure 108112961-A0202-12-0361-980
<210> 47
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 47
Figure 108112961-A0202-12-0362-982
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
Figure 108112961-A0202-12-0362-983
Figure 108112961-A0202-12-0363-984
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 49
Figure 108112961-A0202-12-0363-985
<210> 50
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 50
Figure 108112961-A0202-12-0363-986
Figure 108112961-A0202-12-0364-987
<210> 51
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 51
Figure 108112961-A0202-12-0364-988
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 52
Figure 108112961-A0202-12-0364-989
<210> 53
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 53
Figure 108112961-A0202-12-0365-991
<210> 54
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 54
Figure 108112961-A0202-12-0365-990
Figure 108112961-A0202-12-0366-992
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 55
Figure 108112961-A0202-12-0366-994
<210> 56
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 56
Figure 108112961-A0202-12-0366-993
Figure 108112961-A0202-12-0367-995
<210> 57
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 57
Figure 108112961-A0202-12-0367-996
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 58
Figure 108112961-A0202-12-0368-997
<210> 59
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 59
Figure 108112961-A0202-12-0368-998
<210> 60
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 60
Figure 108112961-A0202-12-0369-999
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<212> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 61
Figure 108112961-A0202-12-0369-1000
<210> 62
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 62
Figure 108112961-A0202-12-0369-1001
Figure 108112961-A0202-12-0370-1002
<210> 63
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 63
Figure 108112961-A0202-12-0370-1003
Figure 108112961-A0202-12-0371-1004
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 64
Figure 108112961-A0202-12-0371-1005
<210> 65
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 65
Figure 108112961-A0202-12-0371-1006
Figure 108112961-A0202-12-0372-1007
<210> 66
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 66
Figure 108112961-A0202-12-0372-1008
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 67
Figure 108112961-A0202-12-0372-1009
<210> 68
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 68
Figure 108112961-A0202-12-0372-1010
Figure 108112961-A0202-12-0373-1011
<210> 69
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 69
Figure 108112961-A0202-12-0373-1012
Figure 108112961-A0202-12-0374-1013
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 70
Figure 108112961-A0202-12-0374-1014
<210> 71
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 71
Figure 108112961-A0202-12-0374-1015
Figure 108112961-A0202-12-0375-1016
<210> 72
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 72
Figure 108112961-A0202-12-0375-1017
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 73
Figure 108112961-A0202-12-0375-1018
<210> 74
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 74
Figure 108112961-A0202-12-0376-1019
<210> 75
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 75
Figure 108112961-A0202-12-0377-1020
<210> 76
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 76
Figure 108112961-A0202-12-0377-1022
<210> 77
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 77
Figure 108112961-A0202-12-0377-1021
Figure 108112961-A0202-12-0378-1023
<210> 78
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 78
Figure 108112961-A0202-12-0378-1024
<210> 79
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 79
Figure 108112961-A0202-12-0379-1025
<210> 80
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 80
Figure 108112961-A0202-12-0379-1026
<210> 81
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 81
Figure 108112961-A0202-12-0380-1027
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 82
Figure 108112961-A0202-12-0380-1028
<210> 83
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 83
Figure 108112961-A0202-12-0380-1029
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 84
Figure 108112961-A0202-12-0381-1030
<210> 85
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 85
Figure 108112961-A0202-12-0381-1031
<210> 86
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 86
Figure 108112961-A0202-12-0381-1032
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 87
Figure 108112961-A0202-12-0381-1033
<210> 88
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 88
Figure 108112961-A0202-12-0382-1034
<210> 89
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 89
Figure 108112961-A0202-12-0383-1035
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 90
Figure 108112961-A0202-12-0383-1036
<210> 91
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 91
Figure 108112961-A0202-12-0383-1037
Figure 108112961-A0202-12-0384-1038
<210> 92
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 92
Figure 108112961-A0202-12-0384-1039
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 93
Figure 108112961-A0202-12-0385-1040
<210> 94
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 94
Figure 108112961-A0202-12-0385-1041
<210> 95
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 95
Figure 108112961-A0202-12-0386-322
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 96
Figure 108112961-A0202-12-0386-325
<210> 97
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 97
Figure 108112961-A0202-12-0386-323
Figure 108112961-A0202-12-0387-326
<210> 98
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 98
Figure 108112961-A0202-12-0387-327
Figure 108112961-A0202-12-0388-328
<210> 99
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 99
Figure 108112961-A0202-12-0388-329
<210> 100
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 100
Figure 108112961-A0202-12-0388-330
<210> 101
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 101
Figure 108112961-A0202-12-0388-331
<210> 102
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 102
Figure 108112961-A0202-12-0389-332
<210> 103
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 103
Figure 108112961-A0202-12-0389-333
<210> 104
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 104
Figure 108112961-A0202-12-0390-335
<210> 105
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 105
Figure 108112961-A0202-12-0390-336
Figure 108112961-A0202-12-0391-337
<210> 106
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 106
Figure 108112961-A0202-12-0391-338
<210> 107
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 107
Figure 108112961-A0202-12-0391-339
Figure 108112961-A0202-12-0392-340
<210> 108
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 108
Figure 108112961-A0202-12-0392-341
<210> 109
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 109
Figure 108112961-A0202-12-0393-342
<210> 110
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 110
Figure 108112961-A0202-12-0393-343
Figure 108112961-A0202-12-0394-344
<210> 111
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 111
Figure 108112961-A0202-12-0394-345
Figure 108112961-A0202-12-0395-347
<210> 112
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 112
Figure 108112961-A0202-12-0395-348
<210> 113
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 113
Figure 108112961-A0202-12-0395-350
Figure 108112961-A0202-12-0396-351
<210> 114
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 114
Figure 108112961-A0202-12-0396-352
<210> 115
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 115
Figure 108112961-A0202-12-0397-353
<210> 116
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 116
Figure 108112961-A0202-12-0397-355
Figure 108112961-A0202-12-0398-356
<210> 117
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 117
Figure 108112961-A0202-12-0398-358
Figure 108112961-A0202-12-0399-359
<210> 118
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 118
Figure 108112961-A0202-12-0399-360
<210> 119
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 119
Figure 108112961-A0202-12-0399-361
Figure 108112961-A0202-12-0400-363
<210> 120
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 120
Figure 108112961-A0202-12-0400-364
<210> 121
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 121
Figure 108112961-A0202-12-0401-365
<210> 122
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 122
Figure 108112961-A0202-12-0401-367
Figure 108112961-A0202-12-0402-368
<210> 123
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 123
Figure 108112961-A0202-12-0402-369
<210> 124
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 124
Figure 108112961-A0202-12-0403-371
<210> 125
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 125
Figure 108112961-A0202-12-0403-373
Figure 108112961-A0202-12-0404-374
<210> 126
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 126
Figure 108112961-A0202-12-0404-375
<210> 127
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 127
Figure 108112961-A0202-12-0405-376
<210> 128
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 128
Figure 108112961-A0202-12-0405-377
Figure 108112961-A0202-12-0406-378
<210> 129
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 129
Figure 108112961-A0202-12-0406-379
<210> 130
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 130
Figure 108112961-A0202-12-0407-380
<210> 131
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 131
Figure 108112961-A0202-12-0407-381
Figure 108112961-A0202-12-0408-382
<210> 132
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 132
Figure 108112961-A0202-12-0408-383
<210> 133
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 133
Figure 108112961-A0202-12-0408-384
Figure 108112961-A0202-12-0409-385
<210> 134
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 134
Figure 108112961-A0202-12-0409-386
Figure 108112961-A0202-12-0410-387
<210> 135
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 135
Figure 108112961-A0202-12-0410-388
<210> 136
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 136
Figure 108112961-A0202-12-0411-389
<210> 137
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 137
Figure 108112961-A0202-12-0411-390
Figure 108112961-A0202-12-0412-391
<210> 138
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 138
Figure 108112961-A0202-12-0412-392
<210> 139
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 139
Figure 108112961-A0202-12-0412-394
Figure 108112961-A0202-12-0413-395
<210> 140
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 140
Figure 108112961-A0202-12-0413-396
Figure 108112961-A0202-12-0414-397
<210> 141
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 141
Figure 108112961-A0202-12-0414-398
<210> 142
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 142
Figure 108112961-A0202-12-0415-400
<210> 143
<211> 600
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 143
Figure 108112961-A0202-12-0415-401
Figure 108112961-A0202-12-0416-402
<210> 144
<211> 1803
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 144
Figure 108112961-A0202-12-0417-403
<210> 145
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 145
Figure 108112961-A0202-12-0417-404
Figure 108112961-A0202-12-0418-405
Figure 108112961-A0202-12-0419-406
<210> 146
<211> 1773
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 146
Figure 108112961-A0202-12-0419-407
Figure 108112961-A0202-12-0420-408
<210> 147
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 147
Figure 108112961-A0202-12-0420-410
Figure 108112961-A0202-12-0421-411
<210> 148
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 148
Figure 108112961-A0202-12-0421-413
Figure 108112961-A0202-12-0422-415
<210> 149
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 149
Figure 108112961-A0202-12-0422-416
Figure 108112961-A0202-12-0423-417
<210> 150
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 150
Figure 108112961-A0202-12-0424-418
<210> 151
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 151
Figure 108112961-A0202-12-0424-419
Figure 108112961-A0202-12-0425-420
Figure 108112961-A0202-12-0426-421
<210> 152
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 152
Figure 108112961-A0202-12-0426-422
<210> 153
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 153
Figure 108112961-A0202-12-0427-423
Figure 108112961-A0202-12-0428-424
<210> 154
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 154
Figure 108112961-A0202-12-0428-426
Figure 108112961-A0202-12-0429-427
<210> 155
<211> 622
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 155
Figure 108112961-A0202-12-0429-428
Figure 108112961-A0202-12-0430-429
<210> 156
<211> 1869
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 156
Figure 108112961-A0202-12-0431-430
<210> 157
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 157
Figure 108112961-A0202-12-0431-431
Figure 108112961-A0202-12-0432-432
Figure 108112961-A0202-12-0433-433
<210> 158
<211> 1839
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 158
Figure 108112961-A0202-12-0433-434
<210> 159
<211> 606
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 159
Figure 108112961-A0202-12-0434-435
Figure 108112961-A0202-12-0435-436
<210> 160
<211> 1821
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 160
Figure 108112961-A0202-12-0435-437
Figure 108112961-A0202-12-0436-438
<210> 161
<211> 596
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 161
Figure 108112961-A0202-12-0436-441
Figure 108112961-A0202-12-0437-442
<210> 162
<211> 1791
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 162
Figure 108112961-A0202-12-0438-443
<210> 163
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 163
Figure 108112961-A0202-12-0438-444
Figure 108112961-A0202-12-0439-445
Figure 108112961-A0202-12-0440-446
<210> 164
<211> 1875
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 164
Figure 108112961-A0202-12-0440-447
<210> 165
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 165
Figure 108112961-A0202-12-0441-450
Figure 108112961-A0202-12-0442-451
<210> 166
<211> 1845
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 166
Figure 108112961-A0202-12-0442-454
Figure 108112961-A0202-12-0443-455
<210> 167
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 167
Figure 108112961-A0202-12-0443-456
Figure 108112961-A0202-12-0444-457
<210> 168
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 168
Figure 108112961-A0202-12-0445-462
<210> 169
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 169
Figure 108112961-A0202-12-0445-460
Figure 108112961-A0202-12-0446-463
Figure 108112961-A0202-12-0447-464
<210> 170
<211> 1773
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 170
Figure 108112961-A0202-12-0447-466
<210> 171
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 171
Figure 108112961-A0202-12-0448-469
Figure 108112961-A0202-12-0449-470
<210> 172
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 172
Figure 108112961-A0202-12-0449-472
Figure 108112961-A0202-12-0450-473
<210> 173
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 173
Figure 108112961-A0202-12-0450-474
Figure 108112961-A0202-12-0451-475
<210> 174
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 174
Figure 108112961-A0202-12-0452-476
<210> 175
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 175
Figure 108112961-A0202-12-0452-760
Figure 108112961-A0202-12-0453-478
Figure 108112961-A0202-12-0454-479
<210> 176
<211> 1872
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 176
Figure 108112961-A0202-12-0454-480
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 177
Figure 108112961-A0202-12-0455-481
Figure 108112961-A0202-12-0456-482
<210> 178
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 178
Figure 108112961-A0202-12-0456-484
Figure 108112961-A0202-12-0457-485
<210> 179
<211> 608
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 179
Figure 108112961-A0202-12-0457-486
Figure 108112961-A0202-12-0458-487
<210> 180
<211> 1827
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 180
Figure 108112961-A0202-12-0459-491
<210> 181
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 181
Figure 108112961-A0202-12-0459-490
Figure 108112961-A0202-12-0460-492
Figure 108112961-A0202-12-0461-493
<210> 182
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 182
Figure 108112961-A0202-12-0461-494
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 183
Figure 108112961-A0202-12-0462-495
Figure 108112961-A0202-12-0463-496
<210> 184
<211> 1821
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 184
Figure 108112961-A0202-12-0463-497
Figure 108112961-A0202-12-0464-498
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<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 185
Figure 108112961-A0202-12-0464-499
Figure 108112961-A0202-12-0465-500
<210> 186
<211> 1797
<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 186
Figure 108112961-A0202-12-0466-503
<210> 187
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 187
Figure 108112961-A0202-12-0466-502
Figure 108112961-A0202-12-0467-504
Figure 108112961-A0202-12-0468-505
<210> 188
<211> 1821
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 188
Figure 108112961-A0202-12-0468-506
<210> 189
<211> 596
<212> PRT
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<223> 合成構築體
<400> 189
Figure 108112961-A0202-12-0469-509
Figure 108112961-A0202-12-0470-508
<210> 190
<211> 1791
<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 190
Figure 108112961-A0202-12-0470-511
Figure 108112961-A0202-12-0471-512
<210> 191
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 191
Figure 108112961-A0202-12-0471-513
Figure 108112961-A0202-12-0472-514
<210> 192
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 192
Figure 108112961-A0202-12-0473-515
<210> 193
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<212> PRT
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<223> 合成構築體
<400> 193
Figure 108112961-A0202-12-0473-516
Figure 108112961-A0202-12-0474-517
Figure 108112961-A0202-12-0475-518
<210> 194
<211> 1809
<212> DNA
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<223> 合成構築體
<400> 194
Figure 108112961-A0202-12-0475-519
<210> 195
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
<400> 195
Figure 108112961-A0202-12-0476-521
<210> 196
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 196
Figure 108112961-A0202-12-0476-524
<210> 197
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 197
Figure 108112961-A0202-12-0476-523
<210> 198
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 198
Figure 108112961-A0202-12-0476-525
Figure 108112961-A0202-12-0477-526
<210> 199
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 199
Figure 108112961-A0202-12-0477-527
<210> 200
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 200
Figure 108112961-A0202-12-0477-528
Figure 108112961-A0202-12-0478-529
<210> 201
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 201
Figure 108112961-A0202-12-0478-530
<210> 202
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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Figure 108112961-A0202-12-0478-531
Figure 108112961-A0202-12-0479-532
<210> 203
<211> 530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 203
Figure 108112961-A0202-12-0479-533
<210> 204
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 204
Figure 108112961-A0202-12-0479-535
Figure 108112961-A0202-12-0480-536
<210> 205
<211> 534
<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 205
Figure 108112961-A0202-12-0480-537
<210> 206
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 206
Figure 108112961-A0202-12-0480-538
<210> 207
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 207
Figure 108112961-A0202-12-0481-539
<210> 208
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 208
Figure 108112961-A0202-12-0481-540
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<211> 384
<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 209
Figure 108112961-A0202-12-0482-542
<210> 210
<211> 132
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 210
Figure 108112961-A0202-12-0482-545
<210> 211
<211> 396
<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 211
Figure 108112961-A0202-12-0482-547
<210> 212
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 212
Figure 108112961-A0202-12-0483-548
<210> 213
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 213
Figure 108112961-A0202-12-0483-550
<210> 214
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 214
Figure 108112961-A0202-12-0484-551
<210> 215
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 215
Figure 108112961-A0202-12-0484-552
<210> 216
<211> 133
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 216
Figure 108112961-A0202-12-0484-553
Figure 108112961-A0202-12-0485-554
<210> 217
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 217
Figure 108112961-A0202-12-0485-555
<210> 218
<211> 133
<212> PRT
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<223> 合成構築體
<400> 218
Figure 108112961-A0202-12-0485-557
<210> 219
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 219
Figure 108112961-A0202-12-0486-558
<210> 220
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 220
Figure 108112961-A0202-12-0486-559
<210> 221
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 221
Figure 108112961-A0202-12-0487-560
<210> 222
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 222
Figure 108112961-A0202-12-0487-561
<210> 223
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 223
Figure 108112961-A0202-12-0487-562
<210> 224
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 224
Figure 108112961-A0202-12-0488-563
<210> 225
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 225
Figure 108112961-A0202-12-0488-564
<210> 226
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 226
Figure 108112961-A0202-12-0488-566
Figure 108112961-A0202-12-0489-567
<210> 227
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 227
Figure 108112961-A0202-12-0489-568
<210> 228
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 228
Figure 108112961-A0202-12-0489-569
Figure 108112961-A0202-12-0490-570
<210> 229
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 229
Figure 108112961-A0202-12-0490-572
<210> 230
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 230
Figure 108112961-A0202-12-0490-574
<210> 231
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 231
Figure 108112961-A0202-12-0491-576
<210> 232
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 232
Figure 108112961-A0202-12-0491-577
<210> 233
<211> 398
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 233
Figure 108112961-A0202-12-0491-578
Figure 108112961-A0202-12-0492-579
<210> 234
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 234
Figure 108112961-A0202-12-0492-580
<210> 235
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 235
Figure 108112961-A0202-12-0492-581
<210> 236
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 236
Figure 108112961-A0202-12-0493-582
<210> 237
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 237
Figure 108112961-A0202-12-0493-583
<210> 238
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 238
Figure 108112961-A0202-12-0493-584
Figure 108112961-A0202-12-0494-585
<210> 239
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 239
Figure 108112961-A0202-12-0494-586
<210> 240
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 240
Figure 108112961-A0202-12-0494-587
Figure 108112961-A0202-12-0495-588
<210> 241
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 241
Figure 108112961-A0202-12-0495-590
<210> 242
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 242
Figure 108112961-A0202-12-0495-589
<210> 243
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 243
Figure 108112961-A0202-12-0496-591
<210> 244
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 244
Figure 108112961-A0202-12-0496-592
<210> 245
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 245
Figure 108112961-A0202-12-0497-593
<210> 246
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 246
Figure 108112961-A0202-12-0497-597
<210> 247
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 247
Figure 108112961-A0202-12-0497-594
Figure 108112961-A0202-12-0498-596
<210> 248
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 248
Figure 108112961-A0202-12-0498-598
<210> 249
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 249
Figure 108112961-A0202-12-0498-599
<210> 250
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 250
Figure 108112961-A0202-12-0498-600
<210> 251
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 251
Figure 108112961-A0202-12-0499-601
<210> 252
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 252
Figure 108112961-A0202-12-0499-603
<210> 253
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 253
Figure 108112961-A0202-12-0499-604
<210> 254
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 254
Figure 108112961-A0202-12-0499-605
<210> 255
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 255
Figure 108112961-A0202-12-0499-606
<210> 256
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 256
Figure 108112961-A0202-12-0500-607
<210> 257
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 257
Figure 108112961-A0202-12-0500-608
<210> 258
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 258
Figure 108112961-A0202-12-0500-611
<210> 259
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 259
Figure 108112961-A0202-12-0500-612
<210> 260
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 260
Figure 108112961-A0202-12-0501-613
<210> 261
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 261
Figure 108112961-A0202-12-0501-614
<210> 262
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 262
Figure 108112961-A0202-12-0501-615
<210> 263
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 263
Figure 108112961-A0202-12-0501-617
<210> 264
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 264
Figure 108112961-A0202-12-0502-618
<210> 265
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 265
Figure 108112961-A0202-12-0502-619
<210> 266
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 266
Figure 108112961-A0202-12-0502-621
<210> 267
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 267
Figure 108112961-A0202-12-0502-620
<210> 268
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 268
Figure 108112961-A0202-12-0503-622
<210> 269
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 269
Figure 108112961-A0202-12-0503-623
<210> 270
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 270
Figure 108112961-A0202-12-0503-624
<210> 271
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 271
Figure 108112961-A0202-12-0503-626
<210> 272
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 272
Figure 108112961-A0202-12-0503-625
<210> 273
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 273
Figure 108112961-A0202-12-0504-627
<210> 274
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 274
Figure 108112961-A0202-12-0504-628
<210> 275
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 275
Figure 108112961-A0202-12-0504-629
<210> 276
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 276
Figure 108112961-A0202-12-0504-630
<210> 277
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 277
Figure 108112961-A0202-12-0505-631
<210> 278
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 278
Figure 108112961-A0202-12-0505-632
<210> 279
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 279
Figure 108112961-A0202-12-0505-633
<210> 280
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 280
Figure 108112961-A0202-12-0505-634
<210> 281
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 281
Figure 108112961-A0202-12-0506-635
<210> 282
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 282
Figure 108112961-A0202-12-0506-637
<210> 283
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 283
Figure 108112961-A0202-12-0506-638
<210> 284
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 284
Figure 108112961-A0202-12-0506-756
<210> 285
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 285
Figure 108112961-A0202-12-0507-640
<210> 286
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 286
Figure 108112961-A0202-12-0507-641
<210> 287
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 287
Figure 108112961-A0202-12-0507-642
<210> 288
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 288
Figure 108112961-A0202-12-0507-645
<210> 289
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 289
Figure 108112961-A0202-12-0507-646
Figure 108112961-A0202-12-0508-647
<210> 290
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 290
Figure 108112961-A0202-12-0508-648
<210> 291
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 291
Figure 108112961-A0202-12-0508-649
<210> 292
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 292
Figure 108112961-A0202-12-0508-651
<210> 293
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 293
Figure 108112961-A0202-12-0508-652

Claims (15)

  1. 一種獲得複數種特異性辨識目標腫瘤抗原肽之T細胞受體(TCR)的方法，其包含：a)第一共培養步驟，其包含將載有該目標腫瘤抗原肽之第一樹突細胞(DC)群與來自個體之T細胞群共培養，以獲得第一共培養物；b)富集步驟，其包含使該第一共培養物經受富集程序，以獲得經富集之活化T細胞；c)第二共培養步驟，其包含將該等經富集之活化T細胞與載有該目標腫瘤抗原肽之第二DC群共培養，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，其中至少約10%的該等腫瘤抗原特異性T細胞對該目標腫瘤抗原肽有特異性反應；及d)定序步驟，其包含使該等腫瘤抗原特異性T細胞經受次世代定序，以識別複數對編碼TCRα及TCRβ之基因，從而基於編碼TCRα及TCRβ之成對基因來提供該複數種T細胞受體；其中該個體已在臨床上受益於多抗原特異性細胞療法(MASCT)，該MASCT包含向該個體投予有效量的活化T細胞，該等活化T細胞係藉由將T細胞群與載有複數種腫瘤抗原肽之樹突細胞群共培養而製備，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；其中可選地：(i)該次世代定序係單細胞定序；且/或(ii)同時獲得特異性辨識複數種目標腫瘤抗原肽之TCR。
  2. 如請求項1之方法，其中：(i)該第一共培養步驟係在該富集步驟之前進行約1至約3天；且/或 (ii)該T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群之間的比率不大於約30：1；且/或(iii)載有該目標腫瘤抗原肽之該第一DC群與該T細胞群係在第一共培養基中共培養，該第一共培養基包含一或多種細胞激素及免疫檢查點抑制劑。
  3. 如請求項1之方法，其中：(i)該富集步驟包含：使該第一共培養物與載有該目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(APC)接觸，以獲得經刺激共培養物；及使用配體自該經刺激共培養物單離經富集之活化T細胞群，該配體特異性辨識細胞激素，可選地其中該細胞激素係IFNγ；且/或(ii)該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群之間的比率係約1：1至約20：1；且/或(iii)將該經富集之活化T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群共培養約12至25天。
  4. 如請求項1之方法，其中該第二共培養步驟包含：在初始第二共培養基中將載有該目標腫瘤抗原肽之該第二DC群與該經富集之活化T細胞群共培養，以提供第二共培養物，該初始第二共培養基包含一或多種細胞激素及免疫檢查點抑制劑；及將抗CD3抗體添加至該第二共培養物，以獲得腫瘤抗原特異性T細胞群，可選地其中在該第二共培養步驟開始後不多於約3天，將該抗CD3抗體添加至該第二共培養物。
  5. 如請求項1之方法，其進一步包含第三共培養步驟，該第三共培養步驟包含將該等腫瘤抗原特異性T細胞之群與載有目標腫瘤抗原肽之抗原呈現細胞(APC)之群共培養，以獲得第二腫瘤抗原特異性T細胞群，其中使該第二腫瘤抗原特異性T細胞群在該定序步驟中經受次世代定序；可選地其中：(i)該等APC係PBMC、DC、或細胞系APC；且/或(ii)該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群之間的比率係約1：1至約20：1；且/或(iii)將該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群共培養約5至9天；且/或(iv)該腫瘤抗原特異性T細胞群與載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群係在第三共培養基中共培養，該第三共培養基包含一或多種細胞激素及抗CD3抗體；且/或(v)重複該第三共培養步驟；且/或(vi)該方法進一步包含：識別來自該目標腫瘤抗原肽之目標腫瘤表位，其中該目標腫瘤表位引發該經富集之活化T細胞群的特異性反應；及使APC群與該目標腫瘤表位接觸，以獲得載有該目標腫瘤抗原肽之APC之該群。
  6. 如請求項1之方法，其中：(i)在接受該MASCT後，該個體具有部分反應(PR)、完全反應(CR)、或疾病穩定(SD)；且/或 (ii)該MASCT包含：將載有複數種腫瘤抗原肽之DC之群與T細胞群共培養，以獲得活化T細胞群，該複數種腫瘤抗原肽包含該目標腫瘤抗原肽；且/或(iii)該MASCT包含向該個體投予有效量的載有該複數種腫瘤抗原肽之該等DC；且/或(iv)該個體先前已接受該MASCT至少三次；且/或(v)在該次世代定序之前，將該等腫瘤抗原特異性T細胞用載有該目標腫瘤抗原肽之APC刺激。
  7. 如請求項1之方法，其進一步包含：在宿主免疫細胞中表現各對編碼TCRα及TCRβ之基因，以提供表現TCR之經工程改造之免疫細胞；及評估該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的反應。
  8. 一種獲得特異性辨識目標腫瘤抗原肽之TCR的方法，其包含如請求項7之方法，其中基於表現該TCR之該經工程改造之免疫細胞對該目標腫瘤抗原肽的該反應來選擇該TCR，可選地其中：(i)該方法進一步包含判定該TCR的HLA限制；且/或(ii)該方法進一步包含該TCR之親和力成熟；且/或(iii)該方法進一步包含增強該TCR中之TCRα鏈及TCRβ鏈之配對；(iv)該方法進一步包含增強該TCR之表現；且/或(v)該目標腫瘤抗原肽係衍生自CEA、RSG-5、或HPV18-E7。
  9. 一種腫瘤特異性TCR，其係使用如請求項1之方法獲得。
  10. 一種腫瘤特異性TCR，其包含： (a)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：4、10、及16之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、及19之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列；(b)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：22、28、34、40、46、及52之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：7、13、19、25、31、37、43、49、及55之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列；或(c)包含互補決定區(CDR)3之TCRα鏈，該CDR3與SEQ ID NO：58、64、70、76、87、及93之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性；及包含CDR3之TCRβ鏈，該CDR3包含與SEQ ID NO：61、67、73、79、90、及96之胺基酸序列中任一者具有至少約90%序列同一性的胺基酸序列。
  11. 一種單離核酸，其編碼如請求項9或請求項10之腫瘤特異性TCR之該TCRα鏈及/或該TCRβ鏈。
  12. 一種經工程改造之免疫細胞，其包含如請求項9或請求項10中任一項之腫瘤特異性TCR，可選地其中該免疫細胞係T細胞。
  13. 一種醫藥組成物，其包含如請求項12之經工程改造之免疫細胞、及醫藥上可接受之載劑。
  14. 一種治療個體中癌症之方法，其包含向該個體投予有效量的如請求項13之醫藥組成物。
  15. 一種腫瘤特異性TCR之庫，該等腫瘤特異性TCR係使用如請求項1至8中任一項之方法獲得。
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