CN109803674A - Calr和jak2疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及作为预防和治疗骨髓增生性疾病的新的T细胞靶标的CALR和JAK2。

Description

CALR和JAK2疫苗组合物
技术领域
本发明涉及疾病(例如骨髓增生性疾病，特别是骨髓增生性肿瘤(MPN))的预防和治疗的领域。特别地，提供了来自突变的JAK2-和CALR基因的肽片段，其能够引起针对这些血液癌症的免疫应答。具体地，本发明涉及衍生自JAK2-突变和CALR-突变的肽，及其CALR-特异性或JAK2特异性-T细胞用于治疗MPN的用途。因此，本发明涉及疫苗，其任选地可与其他免疫疗法联合使用。本发明还可用于特异性针对JAK2突变和CALR突变的T细胞的过继转移，或用于通过疫苗接种来诱导对JAK2和CALR突变肽的体内免疫作为对MPN的治疗。本文提供的疫苗策略可以与癌症化疗法联合使用是本发明的一个方面。其他方面涉及骨髓增生性疾病(例如原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化或真性红细胞增多症)的预防和治疗。
还提供了衍生自CALR和JAK2突变体的免疫原性活性肽片段用于治疗、诊断和预后增殖性疾病的的用途。
背景技术
超过50％的MPN患者携带JAK2V617F突变。此外，在约60％的患有JAK2野生型原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化(PMF)的患者中发现了钙网蛋白(CALR)基因外显子9中的突变。
CALR外显子9突变导致1-bp移码突变，其改变CALR蛋白的C末端(Klampfl et al.，2013；Nangalia et al.，2013)。迄今为止，已经描述了超过50种突变，它们在C末端都共有长度为36个氨基酸的共有序列：在80％的所有患者中发现这两种最突出的CALR外显子9突变。这种新的C末端是潜在的肿瘤相关抗原。这些抗原被认为对免疫系统获得肿瘤控制很重要，因为据称免疫系统靶向肿瘤相关抗原(Schumacher et al.，2015)。
CALR外显子9突变和JAK2V617F突变仅在骨髓恶性肿瘤中发现。因此，它们是癌症特异性抗原。因此，外显子9 CALR突变体和JAK2V617F是癌症免疫治疗的有吸引力的靶标。
需要治疗和预防骨髓增生性疾病(例如MPN)的方法。
发明内容
本发明如权利要求所限定。
本发明解决了提供这种治疗和预防增生性疾病(例如骨髓增生性疾病)的方法的问题，其提供了CALR和JAK2作为新的T细胞靶标。本发明令人惊奇地发现，衍生自如下定义的突变CALR和JAK2的肽具有免疫原性并且可以引起针对表达突变CALR和/或突变JAK2的细胞的免疫应答。因此，这些肽可用于治疗和预防骨髓增生性疾病(例如MPN)的方法。本文公开的肽可引起T细胞应答并可用于制备可用于治疗和预防骨髓增生性疾病的方法的T细胞疫苗。
因此，本发明提供了通过诱导直接靶向表达突变CALR或突变JAK2的细胞的免疫应答，从而杀伤这些细胞来治疗MPN的材料和方法。
这通过使T细胞识别表达突变CALR或突变JAK2的细胞来完成。有趣的是，本发明公开了可以在健康的受试者中产生针对表达突变JAK2或CALR的细胞的细胞毒性免疫应答，并且在健康供体中鉴定针对突变CALR的T细胞应答。这提供了用于治疗和/或预防骨髓增生性疾病(例如MPN)的新机制。
在本文，本发明人公开了T细胞能够杀伤呈递突变JAK2的抗原呈递细胞(APC)，并且当暴露于CALR突变肽时，T细胞被大量激活。
因此，本发明通过刺激针对表达突变的JAK2和/或CALR的靶细胞的免疫系统来利用MPN细胞中突变CALR和/或JAK2的表达。
本发明的一方面是提供令人惊奇地可产生针对突变JAK2和/或突变CALR的免疫应答的疫苗组合物。
附图说明
图1：(A)具有针对来自患者P37的CALR Long1的应答的一式三份的ELISPOT的实例。(B)描绘了用CALR Long1刺激的细胞和对照孔之间的平均斑点数量的差异的条形图。(C)具有针对来自患者C39的CALR Long2的应答的一式三份的ELISPOT的实例。(D)描绘了用CALR Long2刺激的细胞和对照孔之间的平均斑点数量的差异的条形图。＊表示p≤0.05。
图2：(A)对来自患者C42的已用CALR Long1肽脉冲一周的PBMC的细胞内细胞因子染色示出了针对所述肽的强的CD8 T细胞应答和更适度的CD4 T细胞应答。(B)对由来自患者C42的PBMC产生的T细胞的细胞内细胞因子染色，所述PBMC用已用CALR Long 1肽脉冲的自体树突细胞刺激三次。该实验证明了针对CALR Long1肽的增加的CD4 T细胞的反应性和略低的CD8 T细胞的反应性。
图3：TNF-α ELISPOT中针对CALR Long1和CALR Long2的应答。(A)具有针对CALRLong2的应答的一式三份孔的实例。(B)示出了用CALR Long1刺激的细胞和对照细胞之间的斑点差异的条形图。(C)示出了用CALR Long2刺激的细胞和对照细胞之间的斑点差异的条形图。＊表示p≤0.05。
图4：通过IFN-γ ELISPOT分析的健康供体中针对来自突变的CALR序列的九聚体肽的应答。CALR Long1和CALR Long2肽中的九聚体肽在健康供体中引起强烈的自发免疫应答。＊表示p≤0.05。
图5：对用CALR Long1肽刺激的PBMC的细胞内细胞因子染色。两名健康供体在用CALR Long 1肽刺激时显示出CD4 T细胞应答。
图6：T细胞应答需要JAK2突变多肽的表达。
图7：CALRLong1-大量培养物中CD4+T细胞对突变CALR C-末端中表位的特异性。用CALRLong1刺激的细胞(上部，左图)、用CALRLong3刺激(中部，左图)、用CALRLong2刺激(下部，左图)、用CALRLong4刺激(上部，右图)、用CALRLong5(中部，右图)和加扰肽(scrambledpeptide)刺激。
图8：特异性针对CALRLong1肽(RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARP)的CD4+T细胞培养物的建立。A.顶行示出了在用树突细胞进行三次刺激后大量培养物的特异性。中间一行示出了大量培养物的IFN-γ富集后的特异性。底行示出了CD4+CALRLong1特异性T细胞的特异性。B.对CD4+CALRLong 1特异性T细胞的表型分析。
图9：CD4+CALRLong1特异性T细胞识别自体CALRmut细胞。A.用自体CALRmut CD14+单核细胞以1：1的效应物：靶标比刺激特异性T细胞。B.用自体CALRmut CD14+单核细胞以3：1的效应物：靶标比刺激特异性T细胞。C.用自体EBV转化的B细胞以1∶1的效应物：靶标比刺激特异性T细胞。D.对CD14+富集的纯度分析。
图10：对自体CALRmut靶细胞的识别可通过用IFN-γ刺激靶细胞来增强，并在用CALR siRNA转染靶细胞时降低。A.用自体CD14+单核细胞或自体EBV转化的B细胞(BCL)刺激CALRLong1特异性T细胞。为增强抗原呈递，在测定之前将靶细胞用IFN-γ 300U/ml培养物刺激靶细胞24h。在所有实验中，效应物：靶标比为1∶1。B.用阴性对照RNA转染或用CALRsiRNA转染自体骨髓细胞，然后将其在细胞内细胞因子染色中用作靶细胞，以CD4+CALRLong1特异性T细胞作为效应细胞。C.对于转染对照，使用与B中靶细胞相同的电穿孔参数，用FITC-缀合的siRNA(左)转染自体骨髓细胞。将用阴性对照(右)转染的细胞用于设门。
图11：CALRLong1特异性应答是HLA II类限制性的，以HLA-DR作为限制元件。A.以1∶1的效应物：靶标比用自体CD14+单核细胞刺激CD4+ CALRLong1特异性T细胞。单核细胞未经处理(A，上图)或已经用HLA II类阻断单克隆抗体处理30分钟(A，下图)。B.用CALRLong1肽刺激CD4+ CALRLong1特异性T细胞，然后不处理(B，上图)，用HLA-DQ特异性抗体处理15分钟(B，中图)或HLA-DR特异性抗体处理15分钟(B，下图)。
图12：CALRLong1特异性T细胞识别来自骨髓和血液的自体CD34+细胞。A.以3∶1的效应物：靶标比用分离自新鲜吸取的骨髓抽吸物的自体CD34+单核细胞、或用加扰(scrambled)阴性对照肽刺激CALRLong1特异性T细胞。由于靶细胞的数量有限，实验一式两份进行。B.对来自骨髓抽吸物的CD34+富集细胞的纯度分析。C.用分离自冷冻保存的PBMC的自体CD34+细胞(上图)和加扰阴性对照(下图)刺激CALRLong1特异性T细胞。两个实验均以5∶1的效应物：靶标比运行。在测定之前，将分离的CD34+细胞在含有5％人血清的X-VIVO中静置48h。由于缺乏靶细胞，将实验在一个孔中运行。D.对来自冷冻保存的PBMC的CD34+富集的细胞的纯度分析。
图13：CD4+ CALRLong1特异性T细胞对用CALRLong 1肽脉冲的自体细胞具有细胞毒性。A.用已用CALRLong1肽(上图)或加扰肽(下图)脉冲的自体EBV转化的B细胞(BCL)刺激CALRLong 1特异性T细胞。B.来自标准Cr51细胞毒性测定的杀伤曲线，其中将CALRLong1特异性T细胞用用CALRLong1脉冲的BCL或用加扰肽脉冲的BCL孵育。C.用用CALRLong1(上图)或加扰肽(下图)脉冲的BCL刺激CD4+ CALRLong1特异性T细胞，然后用PE-缀合的CD107a抗体染色。D.用CALRLong1(上图)或加扰肽(下图)刺激来自CALRLong1大量培养物的细胞，然后用PE缀合的CD107a抗体染色。
图14：在健康供体中针对肽CALRLong1的自发免疫应答(实施例3)。在21名所分析的患者中，17名(81％)显示出针对所述肽的显著应答。
图15：在健康供体中针对肽CALRLong2的自发免疫应答(实施例3)。在23名所分析的患者中，18名(78％)显示出针对所述肽的显著应答。
图16：在健康供体中针对肽CALRLong4的自发免疫应答(实施例3)。在9名所分析的患者中，9名(100％)显示出针对所述肽的显著应答。
图17：在健康供体中针对肽CALRLong5的自发免疫应答(实施例3)。在7名所分析的患者中，7名(100％)显示出针对所述肽的显著应答。
图18：通过TNF-α ELISPOT所分析的在健康供体中针对肽CALRLong1和CALRLong2的自发免疫应答。A.分析10名健康对照的针对CALRLong1的TNF-α应答，并且3名具有显著应答。所有这3名应答者也都具有针对CALRLong1的IFN-γ应答。分析10名健康对照的针对CALRLong2的TNF-α应答。五名具有显著应答，所有这5位个体也都具有针对CALRLong2的IFN-γ应答。B.分析10名健康对照的针对CALRLong2的TNFα应答。五名都具有显著应答，所有这5位个体也都具有针对CALRLong2的IFN-γ应答。
图19：使用针对突变CALR C-末端中的九聚体肽的体外IFN-γ ELISPOT筛选十名健康对照的自发免疫应答。肽B1是突变C末端中的第一个九聚体肽，B2是第二个，以此类推。我们鉴定到针对突变CALR C-末端的所有部分中的九聚体表位的免疫应答，然而大多数在序列的前半部分被鉴定到，其中肽B11是最具免疫原性的九聚体表位。
图20：将细胞内细胞因子染色用于对在上述CALR突变的九聚体文库的ELISPOT分析中鉴定的IFN-γ分泌细胞进行表型分析。在用CALR突变肽刺激时分泌细胞因子的细胞是CD4+T细胞(A)或大多数为CD4+T细胞(B)。然而，在用肽B11刺激时鉴定出供体BC342中的一种CD8+T细胞应答。供体BC348在用肽C2(B)刺激时显示出非常强的CD4+应答。总共分析了五个供体，并且我们在四个供体中鉴定出针对至少一种肽的应答。
图21：JAK201特异性T细胞的特异性。(a)ELISPOT测定，其证明了与HIV对照相比，在用JAK201肽刺激时IFN-γ(左)和TNF-α(右)从JAK201特异性T细胞的释放。(b)ELISPOT测定，其证明了与JAK201wt肽相比，在用JAK201肽刺激时IFN-γ(左)和TNF-α(右)从JAK201特异性T细胞的释放。将Moodie et al.描述的自由分布重采样方法用于一式三份的统计学分析。P≤0.05被认为具有统计学显著性。(c)标准Cr51细胞毒性测定，使用JAK201和JAK201wt肽的浓度进行滴定。(d)标准Cr51细胞毒性测定，其中将JAK201特异性T细胞用作效应细胞，将用JAK201肽脉冲的用HLA-A2或HLA-A3转染的K562细胞或将不含任何肽的经HLA-A2转染的K562细胞用作靶细胞。
图22：JAK201特异性T细胞的细胞溶解能力。(a)IFN-γ ELISPOT测定，其检查了JAK201特异性T细胞针对JAK2V617F突变癌细胞UKE-1和经JAK2wt、HLA-A2转染的K562细胞、用IFN-γ预处理2天的UKE-1细胞、和用IFN-γ预处理2天的经HLA-A2转染的K562细胞的反应性。实验一式三份或一式两份进行。将Moodie et al.描述的自由分布重采样方法用于一式三份的统计学分析。P≤0.05被认为具有统计学显著性。(b)标准Cr51细胞毒性测定，其中将JAK201特异性T细胞用作效应细胞，将用或未用IFN-γ预处理2天的携带JAK2V617F突变的HLA-A2阳性急性髓细胞白血病癌细胞系UKE-1用作靶细胞。UKE-1细胞是JAK2V617F突变纯合的。此外，将T2细胞用作靶细胞作为对照。(c)标准Cr51细胞毒性测定，其中将JAK201特异性T细胞用作效应细胞，将用JAK2V617F siRNA转染或空白转染的UKE-1细胞用作靶细胞。(d)ELISPOT测定，其检查了JAK201特异性T细胞针对HLA-A2阳性、JAK2wt急性髓系白血病癌细胞系THP-1的反应性。用编码JAK2V617F的mRNA或用作为对照的编码NGFR的mRNA转染细胞。与对照相比，在用JAK2V617F突变的THP-1细胞刺激时T细胞分泌更多的IFN-γ(左)、TNF-α(中)和颗粒酶B(右)。将Moodie et al.描述的自由分布重采样方法用于一式三份的统计学分析。P≤0.05被认为具有统计学显著性。
定义
佐剂：其与所给药的免疫原性活性肽/抗原/核酸构建体的混合物可增加或改变对所述肽/抗原的免疫应答的任何物质。
抗原：可与同源分布的免疫受体(T细胞或B细胞受体)结合的任何物质。通常是肽、多肽或多聚体多肽。抗原优选能够引起免疫应答。
APC：抗原呈递细胞。APC是在其表面上显示与MHC复合的抗原的细胞。T细胞可使用它们的T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC分为两类：专职(其中有三种类型：树突细胞、巨噬细胞和B细胞)或非专职(非组成型地表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合蛋白；这些蛋白仅在通过某些细胞因子(如IFN-γ)刺激所述非专职APC时表达)。
增强：通过加强注射或加强剂量来增强是给药额外剂量的免疫剂(例如疫苗)，其在初始剂量后的一个时间进行给药以维持由先前剂量的相同试剂引起的免疫应答。
载体：抗原与之偶联以有助于诱导免疫应答的实体或化合物。
CALR：CALR基因在人类中编码钙网蛋白。钙网蛋白也被称为钙调蛋白、CRP55、CaBP3、肌集钙蛋白样蛋白和内质网常驻蛋白60(ERp60)。术语“外显子9突变CALR”在整个本公开内容中是指在CALR的外显子9中包含至少一个非沉默突变的突变钙调蛋白。例如，外显子9突变CALR可包含氨基酸序列SEQ ID NO：16。外显子9突变体的实例是L367fs＊46(SEQID NO：10中所示的全长)、E370fs＊43、E370fs＊48、L367fs＊48、L367fs＊44、K368fs＊51、L367fs＊52、R366fs＊53、E371fs＊49、K368fs＊43、E370fs＊37、D373fs＊47、K374fs＊53、E371fs＊49、K385fs＊47、K385fs＊47、R376fs＊55、K385fs＊47、E381fs＊48(Nangalia etal.，2013；以上突变的序列列于Nangalia et al.的p.2400，图3，A部分中)。通常，所述外显子9突变CALR将包含与野生型钙网蛋白共有的N末端序列。因此，除了SEQ ID NO：1的序列之外，外显子9突变CALR还可包含SEQ ID NO：10的第1至360位氨基酸。因此，外显子9突变CALR可以是如SEQ ID NO：10中所示的多肽。换言之，外显子9突变CALR可以包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
CALRxx-yy：如本文所使用的，该命名法是指CALR的多肽片段，其由所述称为——即SEQ ID NO：9的全长序列的氨基酸xx-yy组成。
外显子9突变CALRxx-yy：如本文所使用的，该命名法是指由序列SEQ ID NO：10的氨基酸xx-yy组成的CALR的多肽片段。
嵌合蛋白：一种基因工程蛋白，其由两个或更多个完整或部分基因或一系列(非)随机核酸拼接在一起而制备的核苷酸序列编码。
临床病症：需要医学治疗的病症，在本文特别是与CALR或JAK2(特别是CALR或JAK2的突变形式)表达相关的病症。这些病症的实例包括：增殖性疾病，例如骨髓增生性疾病，例如癌症。
CTL：细胞毒性T淋巴细胞。表达CD8以及T细胞受体并因此能够对I类分子呈递的抗原作出应答的T细胞亚群。
递送载体：凭借其核苷酸序列或多肽或两者可从至少一种介质转运到另一种介质的实体。
DC：树突细胞。(DC)是免疫细胞，并且是哺乳动物免疫系统的一部分。它们的主要功能是加工抗原物质并将表面的抗原物质呈递给免疫系统的其他细胞，从而作为抗原呈递细胞(APC)发挥作用。
片段：用于表示核酸或多肽的非全长部分。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。
功能同系物：功能同系物可以是表现出与参照多肽的至少一些序列同一性并且保留了原始功能的至少一方面的任何多肽。在本文，CALR或JAK2的功能同系物或其免疫原性活性肽片段是与CALR或JAK2或其片段具有至少一些序列同一性并且具有诱导针对表达CALR或JAK2的细胞的免疫应答的能力的多肽。外显子9突变CALR或JAK2V617F突变体或其免疫原性活性肽片段的功能同系物是与SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其片段具有至少一些序列同一性并且其具有诱导针对表达外显子9突变CALR或JAK2V617F的细胞的免疫应答的能力的多肽。通常，JAK2V617F的功能同系物至少包含SEQID NO：6的第617位氨基酸。外显子9突变CALR的功能同系物通常至少包含SEQ ID NO：16的部分。
免疫原性活性肽：在给药至个体后能够在至少一个所述个体中引起免疫应答(优选T细胞应答)的肽。使用任何合适的方法(包括体外)可将肽鉴定为具有免疫原性。例如，如果肽具有至少一种以下特征，则可以将其鉴定为具有免疫原性活性：
(i)能够以至少1/104PBL的频率在至少一个癌症患者的PBL群体中引起产INF-γ的细胞，如通过ELISPOT测定所确定的，和/或
(ii)能够在肿瘤组织的样品中原位检测与表位肽具有反应性的CTL；和/或
(iii)能够在体外诱导特异性T细胞的生长。
适用于确定肽是否具有免疫原性活性的方法也在下文的“实施例”部分中提供。
个体：通常是鸟类、哺乳动物、鱼类、两栖动物或爬行动物(优选哺乳动物，最优选人类)的任何物种或亚种。
感染：在本文，术语“感染”涉及包括通过致病因子侵入宿主生物的任何类型的临床病症。特别地，感染是指包括通过病原体侵入个体的临床病症。
分离的：与本文公开的核酸、多肽和抗体一起使用的“分离的”是指已经从其天然的、通常是细胞环境的组分中鉴定和分离和/或回收的这些。优选分离本发明的核酸、多肽和抗体，并且本发明的疫苗和其他组合物优选包含分离的核酸、多肽或分离的抗体。
JAK2：JAK2基因编码非受体酪氨酸激酶Janus激酶2，其是Janus激酶家族的成员，并且与通过II型细胞因子受体家族(例如干扰素受体)、GM-CSF受体家族(IL-3R、IL-5R和GM-CSF-R)、gp130受体家族(例如IL-6R)和单链受体(如Epo-R、Tpo-R、GH-R、PRL-R)的成员的信号转导有关。JAK2信号转导在催乳素受体下游被激活。JAK2的其他名称是JTK10和THCYT3。
JAK2xx-yy：如本文所使用的，该命名法是指由SEQ ID NO：5的氨基酸xx-yy组成的JAK2的多肽片段。
JAK2V617Fxx-yy：如本文所使用的，该命名法是指由SEQ ID NO：6的氨基酸xx-yy组成的JAK2的多肽片段。
骨髓增生性肿瘤(MPN)：MPN是由造血干细胞引起的获得性血液系统癌症，其以血细胞(原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、骨髓纤维化)的过量产生为表征，伴有导致骨髓衰竭(骨髓纤维化)和最终急性髓性白血病的进行性骨髓纤维化。该术语包括费城阴性的骨髓增生性肿瘤。原发性血小板增多症、真性红细胞增多症和原发性骨髓纤维化可能演变为骨髓增生异常综合征或急性髓性白血病。从早期癌症阶段(ET/PV)到晚期癌症阶段(具有巨大脾肿大的骨髓纤维化)的生物连续体的这种演变通过增加基因组不稳定性、具有额外突变的亚克隆形成和最终对常规疗法的抗性来确定。MHC：主要组织相容性复合物，存在MHC的两个主要亚类，I类和II类。
核酸：传递遗传信息的核苷酸的链或序列。关于本发明，核酸通常是脱氧核糖核酸(DNA)。
核酸构建体：基因工程核酸。通常包含几种元件，例如基因或其片段、cDNA、启动子、增强子、终止子、多聚A尾、接头、多接头、可操作的接头、多克隆位点(MCS)、标志物、终止密码子、其他调控元件、内部核糖体进入位点(IRES)等。
可操作的接头：以确保核酸或多肽的生物学加工的方式将核酸构建体或(嵌合)多肽的两部分结合在一起的核苷酸或氨基酸残基的序列。
PBL：外周血细胞是血液的细胞组分，由红细胞、白细胞和血小板组成，它们存在于血液循环池中并且不会被隔离在免疫系统、脾脏、肝脏或骨髓内。
PBMC：外周血单核细胞(PBMC)是具有圆形细胞核的血细胞，例如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是免疫系统中抵抗感染和适应入侵者的关键组分。淋巴细胞群由T细胞(CD4和CD8阳性约75％)、B细胞和NK细胞(合并约25％)组成。
多肽：多个共价连接的氨基酸残基，其定义序列并通过酰胺键连接。该术语与寡肽和肽类似地使用。如本领域中已知的，术语多肽还包括通过化学或酶催化反应引入的翻译后修饰。该术语可以指多肽的变体或片段。
可药用载体：也称为赋形剂或稳定剂，其对于以所用剂量和浓度暴露于其中的细胞或个体是无毒的。所述可药用载体通常是含水pH缓冲溶液。可药用载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸类；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；成盐的反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN.TM.、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS.TM。
多个：至少两个。
增生性疾病：在本文为任何良性或恶性的肿瘤发生前或肿瘤疾病，其中“肿瘤”是指细胞的异常增殖。增生性疾病的非限制性实例是癌症。
启动子：DNA链中的结合位点，RNA聚合酶结合该位点以通过一个或多个附近的结构基因启动信使RNA的转录。
表面活性剂：表面活性试剂，其能够降低溶解在其中的液体的表面张力。表面活性剂是含有亲水性的极性基团和疏水性的并且通常由脂肪链组成的非极性基团的化合物。
Treg：调节性T细胞/T淋巴细胞
治疗：本文使用的术语“治疗”可以指治愈性治疗和/或改善性治疗和/或减少疾病症状的治疗和/或延迟疾病进展的治疗。
疫苗：能够在个体中，特别是在哺乳动物中，优选在人类中诱导免疫应答的物质或组合物。在本文中也称为免疫原性组合物。本发明的疫苗通常可以是包含至少一种佐剂和一种免疫原性活性肽的组合物。针对药剂的免疫应答是在生物体中诱导记忆的体液、抗体和/或细胞应答，导致所述药剂与次级而非初级应答相遇，从而减少其对宿主生物体的影响。所述药剂可以是病原体。在本发明的上下文中，所述药剂优选是与增生性疾病相关的细胞，例如，癌症细胞。本发明的疫苗可被给药作为预防剂，以降低遇到临床病症的风险和/或作为治疗药物用于治疗临床病症。所述组合物可包含以下中的一种或多种：抗原、编码一种或多种抗原的核酸构建体、载体、佐剂和可药用载体。
变体：给定的参照核酸或多肽的“变体”是指显示与所述参照核酸或多肽一定程度的序列同源性/同一性但与所述参照核酸或多肽不同的核酸或多肽。
具体实施方式
本公开内容涉及用于治疗或预防骨髓增生性疾病的方法的疫苗组合物。
在另一方面，本公开内容涉及一种疫苗组合物，其包含：
a)以下中的一种或多种：
(i)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：16的CALR的外显子9突变体，例如SEQ ID NO：10中示出的CALR的外显子9突变体；
(ii)如SEQ ID NO：10所示的外显子9突变CALR的免疫原性活性肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：10的第361至411位氨基酸中的至少一些；
(iii)由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1组成的免疫原性活性肽或其片段；
(iv)(i)、(ii)或(iii)中的多肽的功能同系物，其中所述功能同系物与SEQ IDNO：10具有至少70％的序列同一性，和/或所述功能同系物是由与SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：10的氨基酸的连续序列相同的序列组成的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸(例如最多两个氨基酸，例如最多一个氨基酸)已被置换；
(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任意多肽的多肽；
(vi)编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中的任意多肽的核酸；
或
a)以下中的一种或多种：
(vii)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体；
(viii)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体的免疫原性活性多肽片段，所述片段包含至少第617位氨基酸；
(ix)(vii)或(viii)中的多肽的功能同系物，其中所述功能同系物与SEQ ID NO：6具有至少70％的序列同一性，和/或所述功能同系物是由与SEQ ID NO：6的氨基酸的连续序列相同的序列组成的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸(例如最多两个氨基酸，例如最多一个氨基酸)已被置换，其中所述功能同系物包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸；
(x)包含(vii)、(viii)或(ix)中的任意多肽的多肽；
(xi)编码(vii)、(viii)、(ix)或(x)中的任意多肽的核酸，
所述疫苗组合物任选地还包含佐剂。
本公开内容还涉及如本文所述的疫苗组合物，其用作药物。
本公开内容还涉及包含本文所述的疫苗组合物和第二活性成分的试剂盒。
在另一方面，本公开内容涉及如本文所定义的肽片段和I类HLA或II类HLA分子或此类分子的片段的复合物。
在另一个方面，本公开涉及在患有临床病症的个体中检测CALR反应性T细胞或JAK2反应性T细胞的存在的方法，该方法包括使肿瘤组织或血液样品与本公开内容的复合物接触，并检测所述复合物与所述组织或血细胞的结合。
在另一方面，公开了能够与如本文所定义的肽片段特异性结合的分子。
在另一方面，公开了能够阻断能够与本文定义的肽片段特异性结合的分子的结合的分子。
在另一方面，公开了一种治疗或预防以外显子9突变CALR的表达和/或JAK2V617F的表达为表征的临床病症的方法，该方法包括向患有所述临床病症的个体给药有效量的本文所述的组合物、分子或肽。
在另一方面，本公开内容涉及本文所述的疫苗组合物、试剂盒、分子或肽用于制备治疗或预防临床病症的药物的用途。
在另一方面，本公开内容涉及监测免疫的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供来自个体的血液样本；
b)提供：
(i)包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的CALR的外显子9突变体，例如SEQ ID NO：10中示出的CALR的外显子9突变体；
(ii)如SEQ ID NO：10所示的外显子9突变CALR的免疫原性活性肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：10的第361至411位氨基酸中的至少一些；
(iii)由SEQ ID NO：1组成的免疫原性活性肽或其片段；
(iv)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体；
(v)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体的免疫原性活性多肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸；或
(vi)上述中任一项的功能同系物；和
c)确定所述血液样品是否包含抗体或包含特异性结合蛋白或肽的T细胞受体的T细胞，从而确定在所述个体中是否已经产生针对所述蛋白或肽的免疫应答。
在另一方面，本公开内容涉及免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段——其包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1或其功能同系物的连续序列的至少一部分，涉及免疫原性活性突变JAK2肽片段——其包含SEQ ID NO：7或其功能同系物的的连续序列的至少一部分，或涉及编码所述外显子9突变CALR肽片段或突变JAK2肽片段的核酸，其用于治疗或预防与突变CALR或突变JAK2的表达相关的临床病症(例如骨髓增生性疾病)。在这种实施方案中，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换。
还公开了包含特异性识别外显子9突变CALR或JAK2V617F的细胞的组合物，其中优选所述外显子9突变CALR包含SEQ ID NO：16的连续序列或其中JAK2V617F包含SEQ ID NO：6的连续序列，其中最多3个氨基酸被置换。
在另一方面，提供了包含或由CALR(SEQ ID NO：9)的序列或包含SEQ ID NO：1的序列的CALR的外显子9突变体的序列的最多达50个连续氨基酸组成的肽，其中所述突变体任选具有SEQ ID NO：10的序列，其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO：1、2、3、15、16或17中任一个的序列，更优选其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO：1、SEQ NO：2、SEQ ID NO：3或SEQNO：17，任选地其中最多1至10个连续氨基酸被置换，例如保守性置换。
在另一方面，提供了包含特异性识别外显子9突变CALR的细胞的组合物，其中优选所述外显子9突变CALR包含SEQ ID NO：16的连续序列，其中最多3个氨基酸被置换。
在另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含特异性识别JAK2V617F的细胞，其中优选JAK2V617F包含SEQ ID NO：6的连续序列，其中最多3个氨基酸被置换。
在另一方面，提供了一种肽，所述肽包含或由CALR(SEQ ID NO：9)的序列或包含SEQ ID NO：1的序列的CALR的外显子9突变体的序列的最多达50个连续氨基酸组成，其中所述突变体任选具有SEQ ID NO：10的序列，其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO：1、2、3、15、16或17中任一个的序列，更优选其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO：1、SEQ NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ NO：17，任选地其中最多1至10个连续氨基酸被置换，例如保守性置换。
在另一方面，提供了一种肽，所述肽包含或由JAK2(SEQ ID NO：5)的序列或包含SEQ ID NO：6的序列的JAK2V617F的序列的最多达50个连续氨基酸组成，其中所述突变体具有SEQ ID NO：7的序列，任选地其中最多1至10个连续氨基酸被置换，例如保守性置换。
在另一方面，提供了包含本文公开的肽和任选的防腐剂和/或佐剂的药物组合物。
在另一方面，提供了治疗需要其的个体的方法，包括给药本文公开的肽。
疫苗组合物
本公开内容涉及用于治疗或预防增生性疾病，特别是骨髓增生性疾病的方法的疫苗组合物。
在本发明的一方面，本公开内容涉及一种疫苗组合物，其包含：
a)以下中的一种或多种：
(i)包含SEQ ID NO：1的CALR的外显子9突变体，例如SEQ ID NO：10中所示的CALR的外显子9突变体；
(ii)如SEQ ID NO：10所示的外显子9突变CALR的免疫原性活性肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的氨基酸的连续序列的至少一部分；
(iii)由SEQ ID NO：1组成的免疫原性活性肽或其片段；
(iv)(i)、(ii)或(iii)中的多肽的功能同系物，其中所述功能同系物与SEQ IDNO：10具有至少70％的序列同一性，和/或所述功能同系物是由与SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：10的氨基酸的连续序列相同的序列组成的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸(例如最多两个氨基酸，例如最多一个氨基酸)已被置换；
(V)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任意多肽的多肽；
(vi)编码(i)、(ii)、(iii)、(iV)或(v)中的任意多肽的核酸；
或
b)以下中的一种或多种：
(vii)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体；
(viii)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体的免疫原性活性多肽片段，所述片段包含至少第617位氨基酸；
(ix)(i)和(ii)中的多肽的功能同系物，其中所述功能同系物与SEQ ID NO：6具有至少70％的序列同一性，和/或所述功能同系物是由与SEQ ID NO：6的氨基酸的连续序列相同的序列组成的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸(例如最多两个氨基酸，例如最多一个氨基酸)已被置换；
(x)包含(vii)、(viii)或(ix)中的任意多肽的多肽；
(xi)编码(vii)、(viii)、(ix)或(x)中的任意多肽的核酸。
除了上述之外，所述疫苗组合物优选还包含佐剂，其例如可以是下文“佐剂”部分中描述的任何佐剂。
可用于本发明疫苗组合物的功能同系物在下文“钙网蛋白(CALR)”；“Janus激酶2(JAK2)”；“外显子9突变CALR和JAK2V671F的免疫原性活性肽片段”；“功能同系物”和“包含外显子9突变CALR和JAK2V671F的多肽或其片段”的部分中描述。
钙网蛋白(CALR)
钙网蛋白是一种蛋白(SEQ ID NO：9)，其在人体中由CALR基因编码。本公开内容的CALR可以是任何有用的CALR。通常，优选CALR与本公开内容的疫苗组合物来自相同的其旨在治疗的物种。在本公开内容的优选实施方案中，所述疫苗组合物意欲用于给药至人类，因此CALR可以是人CALR。野生型人CALR的氨基酸序列如本文SEQ ID NO：9所示。CALR的外显子9突变体L367fs＊46的全长氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO：10。
因此，CALR可以是SEQ ID NO：9的CALR或其与SEQ ID NO：9的CALR具有至少70％的序列同一性的功能同系物，所述功能同系物优选与SEQ ID NO：9的人CALR具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少89％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明涉及疫苗组合物、方法、细胞、肽或肽片段，其包含或识别SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或其与SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR具有至少70％的序列同一性的功能同系物，例如优选与SEQ ID NO：10的人外显子9突变CALR具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少89％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性的功能同系物。
CALR、外显子9突变CALR的功能同系物和用于确定序列同一性的方法在下文“功能同系物”部分中更详细地描述。
优选地，外显子9突变CALR的肽片段包含如SEQ ID NO：16所示的突变外显子9序列的连续氨基酸序列的至少一部分。在一些实施方案中，所述外显子9突变CALR的肽片段包含或由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17组成。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR的功能同系物是其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或已被缺失的突变体。所述外显子9突变CALR的肽片段的功能同系物也可以是SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQID NO：1或SEQ ID NO：17的片段，其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或缺失。在本发明的上下文中，外显子9突变CALR的“功能同系物”可能缺少野生型CALR的催化活性，但保留了诱导对表达外显子9突变CALR的细胞的免疫应答的能力。
Januw激酶2(JAK2)
Janus激酶是一种蛋白(SEQ ID NO：5)，其在人体中由JAK2基因编码。本公开内容的JAK2可以是任何有用的JAK2。通常，优选JAK2与本公开内容的疫苗组合物来自相同的其旨在治疗的物种。在本公开内容的优选实施方案中，所述疫苗组合物意欲用于给药至人类，因此JAK2可以是人JAK2。野生型人JAK2的氨基酸序列如本文SEQ ID NO：5所示。JAK2V617F突变体的全长氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO：6。
因此，JAK2可以是SEQ ID NO：5的JAK2或其与SEQ ID NO：5的JAK2具有至少70％的序列同一性的功能同系物，并且因此，所述功能同系物优选与SEQ ID NO：5的人JAK2具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少89％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明涉及疫苗组合物、方法、细胞、肽或肽片段，其包含或识别SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体或其与SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体具有至少70％的序列同一性的功能同系物，所述功能同系物优选与SEQ ID NO：6的人外显子9突变JAK2具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少89％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
JAK2、JAK2V617F的功能同系物和用于确定序列同一性的方法在下文“功能同系物”部分中更详细地描述。
优选地，JAK2V617F片段包含SEQ ID NO：16的至少第617位氨基酸。还可优选JAK2V617F片段包含如SEQ ID NO：7所示的JAK2V617F序列的连续氨基酸序列的一部分。在一些实施方案中，JAK2V617F片段是SEQ ID NO：7。
在一些实施方案中，SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体是其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或已被缺失的突变体。所述突变的JAK2V617F也可以是突变的JAK2V617F片段，例如SEQ ID NO：6的片段，其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或缺失。在本发明的上下文中，JAK2V617F的“功能同系物”可能缺少野生型JAK2的催化活性，但保留了诱导对表达JAK2V617F的细胞的免疫应答的能力。
外显子9突变CALR和JAK2 V617F的免疫原性活性肽片段
野生型人CALR——即蛋白的天然存在的、全长的非突变形式——在SEQ ID NO：9中鉴定；野生型人JAK2——即蛋白的天然存在的、全长的非突变形式——在SEQ ID NO：5中鉴定。本发明包括包含CALR；CALR的免疫活性肽片段；CALR的肽片段，其中最多三个，例如最多两个，例如最多一个氨基酸已被置换；和/或与SEQ ID NO：9包含至少70％的序列同一性的CALR的功能同系物的疫苗组合物。
优选地，本发明包括包含外显子9突变CALR；外显子9突变CALR的免疫原性活性肽片段；外显子9突变CALR的肽片段及其功能同系物，其中最多三个，例如最多两个，例如最多一个氨基酸已被置换；和/或与SEQ ID NO：10包含至少70％的序列同一性的外显子9突变CALR的功能同系物的疫苗组合物。优选地，所述外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的连续氨基酸序列。SEQ ID NO：16示出了在这两种最突出的外显子9突变CALR——1型和2型——中存在的共有氨基酸序列。换言之，SEQ ID NO：16对应于SEQ ID NO：10的CALR376-411。
本发明还包括包含JAK2；JAK2的免疫活性肽片段；JAK2的肽片段及其功能同系物，其中最多三个，例如最多两个，例如最多一个氨基酸已被置换；和/或与SEQ ID NO：5包含至少70％的序列同一性的JAK2的功能同系物的疫苗组合物。本发明还包括包含JAK2V617F；JAK2V617F的免疫活性肽片段；JAK2V617F的肽片段及其功能同系物，其中最多三个，例如最多两个，例如最多一个氨基酸已被置换；和/或与SEQ ID NO：6包含至少70％的序列同一性的JAK2V617F的功能同系物的疫苗组合物。优选地，所述JAK2肽片段或其功能同系物包含SEQ ID NO：7的连续氨基酸序列。SEQ ID NO：7示出了对应于SEQ ID NO：6的JAK2610-618的氨基酸序列。优选地，JAK2肽片段或其功能同系物包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
术语多肽片段在本文中用于定义氨基酸残基的任何非全长(与SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6相比)连续序列，所述序列直接衍生自或被合成为与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：6的至少一部分相同。所述肽片段可以例如是SEQ ID NO：10的范围为8至50、例如范围为8至40、例如范围为8至29个氨基酸、例如SEQ ID NO：10的8至27个氨基酸、例如SEQ ID NO：10的8至25个氨基酸的连续序列，例如所述肽片段可包含或由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，或SEQID NO：10的20至44个氨基酸组成，例如，所述肽片段可包含或由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17组成。例如，所述肽片段可以是SEQ ID NO：1的8至50、例如范围为8至34、例如范围为8至33、例如8至29个氨基酸的连续序列。例如，所述肽片段可以是SEQ ID：10的范围为8至50、例如范围为8至44、例如范围为8至40、例如范围为8至29个氨基酸、例如SEQID NO：10的8至27个氨基酸、例如SEQ ID NO：10的8至25个氨基酸的连续序列，例如所述肽片段可包含由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17组成。所述肽片段可以是例如以下任一个的8至50、例如范围为8至44、例如范围为8至34、例如范围为8至33、例如8至29个氨基酸的连续序列：外显子9CALR突变体L367fs＊46(SEQ ID NO：10中所示的全长)，E370fs＊43、E370fs＊48、L367fs＊48、L367fs＊44、K368fs＊51、L367fs＊52、R366fs＊53、E371fs＊49、K368fs＊43、E370fs＊37、D373fs＊47、K374fs＊53、E371fs＊49、K385fs＊47、K385fs＊47、R376fs＊55、K385fs＊47、E381fs＊48(Nangalia et al.，2013；以上突变的序列列于Nangalia et al.的p.2400，图3，A部分中)。
例如，所述肽片段可以是例如SEQ ID NO：6的范围为8至50、例如范围为8至40、例如范围为8至29个氨基酸、例如SEQ ID NO：6的8至27个氨基酸、例如SEQ ID NO：6的8至25个氨基酸的连续序列，例如，所述肽片段可包含或由SEQ ID NO：7组成。
野生型CALR的功能同系物可被定义为CALR的全长或片段，其序列与野生型CALR(例如SEQ ID NO：9的野生型人CALR)不同，但仍然能够诱导针对表达突变CALR的细胞(例如增殖性肿瘤细胞和DC)的免疫应答。在一些实施方案中，在这些细胞中表达的CALR是CALR的外显子9突变体，例如如SEQ ID NO：10中所示。
外显子9 CALR突变体的功能同系物可被定义为外显子9 CALR突变体的全长或片段，其序列与SEQ ID NO：10的外显子9 CALR突变体不同，但仍然能够诱导针对表达突变CALR的细胞(例如增殖性肿瘤细胞和DC)的免疫应答。在一些实施方案中，在这些细胞中表达的外显子9 CALR突变体是如SEQ ID NO：10所示的CALR的外显子9突变体。在一些实施方案中，能够诱导针对表达突变CALR的细胞(例如增殖性肿瘤细胞和DC)的免疫应答的外显子9 CALR突变体的片段包含或由SEQ ID NO：16所示的片段组成。在另一个实施方案中，所述片段包含或由SEQ ID NO：2所示的片段组成。在另一个实施方案中，所述片段包含或由SEQID NO：3所示的片段组成。在另一个实施方案中，所述片段包含或由SEQ ID NO：5所示的片段组成。在另一个实施方案中，所述片段包含或由SEQ ID NO：1所示的片段组成。在另一个实施方案中，所述片段包含或由SEQ ID NO：17所示的片段组成。
野生型JAK2的功能同系物可被定义为野生型JAK2的全长或片段，其序列与野生型JAK2(例如SEQ ID NO：5的野生型人JAK2)不同，但仍然能够诱导针对表达SEQ ID NO：6的JAK2V617F的细胞(例如增殖性肿瘤细胞和DC)的免疫应答。
JAK2V617F突变体的功能同系物可被定义为JAK2V617F的全长或片段，其序列与SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F不同，但仍然能够诱导针对表达SEQ ID NO：6的JAK2V617F的细胞(例如增殖性肿瘤细胞和DC)的免疫应答。优选地，所述功能同系物包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
功能同系物可以是野生型CALR或JAK2的突变形式或可变剪接变体。在另一方面，CALR或JAK2的功能同系物如下文所述定义。功能同系物可以是，但不限于，全长或片段化的CALR、外显子9 CALR突变体、JAK2或具有一个或多个突变和/或一个或多个序列缺失和/或离体引入的添加的JAK2V617F突变体的重组形式。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：SEQ ID NO：10中鉴定的外显子9突变CALR或其功能同系物的最多90个连续氨基酸残基，例如最多80个连续氨基酸残基，例如最多70个连续氨基酸残基，例如最多60个连续氨基酸残基，例如最多50个连续氨基酸残基，例如最多45个连续氨基酸残基，例如最多40个连续氨基酸残基，例如最多35个连续氨基酸残基，例如最多30个连续氨基酸残基，例如最多29个连续氨基酸残基，例如最多24个连续氨基酸残基，例如最多22个连续氨基酸残基，例如最多20个连续氨基酸残基，例如最多15个连续氨基酸残基，例如最多10个连续氨基酸残基，例如最多9个连续氨基酸残基，例如最多8个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。所述置换可以是保守性置换。
所述免疫原性活性肽外显子9突变CALR片段也可由以下组成：SEQ ID NO：10中鉴定的外显子9突变CALR的最多80个连续氨基酸残基，例如最多70个连续氨基酸残基，例如最多60个连续氨基酸残基，例如最多50个连续氨基酸残基，例如最多45个连续氨基酸残基，例如最多40个连续氨基酸残基，例如最多35个连续氨基酸残基，例如最多30个连续氨基酸残基，例如最多29个连续氨基酸残基，例如最多24个连续氨基酸残基，例如最多22个连续氨基酸残基，例如最多20个连续氨基酸残基，例如如SEQ ID NO：10中所鉴定的外显子9突变CALR的24至32个连续氨基酸残基，例如26至29个连续氨基酸残基，其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或被缺失。
在本发明的一个优选实施方案中，所述免疫原性活性肽片段由SEQ ID NO：16、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17或其功能同系物的范围为20至29个氨基酸、优选29个连续氨基酸组成；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
因此，在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：16或其功能同系物的最多34个氨基酸残基、例如最多33个氨基酸残基、例如最多32个氨基酸残基、例如最多31个氨基酸残基、例如最多30个氨基酸残基、例如最多29个氨基酸残基、例如最多28个氨基酸残基、例如最多27个氨基酸残基、例如最多26个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如最多24个氨基酸残基、例如最多23个氨基酸残基、例如最多22个氨基酸残基、例如最多21个氨基酸残基、例如最多20个氨基酸残基、例如最多19个氨基酸残基、例如最多18个氨基酸残基、例如最多17个氨基酸残基、例如最多16个氨基酸残基、例如最多15个氨基酸残基、例如最多14个氨基酸残基、例如最多13个氨基酸残基、例如最多12个氨基酸残基、例如最多11个氨基酸残基、例如8至10个氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个具体实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：2或其功能同系物的最多29个氨基酸残基、例如最多28个氨基酸残基、例如最多27个氨基酸残基、例如最多26个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如最多24个氨基酸残基、例如最多23个氨基酸残基、例如最多22个氨基酸残基、例如最多21个氨基酸残基、例如最多20个氨基酸残基、例如最多19个氨基酸残基、例如最多18个氨基酸残基、例如最多17个氨基酸残基、例如最多16个氨基酸残基、例如最多15个氨基酸残基、例如最多14个氨基酸残基、例如最多13个氨基酸残基、例如最多12个氨基酸残基、例如最多11个氨基酸残基、例如8至10个氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个具体实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：3或其功能同系物的最多29个氨基酸残基、例如最多28个氨基酸残基、例如最多27个氨基酸残基、例如最多26个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如最多24个氨基酸残基、例如最多23个氨基酸残基、例如最多22个氨基酸残基、例如最多21个氨基酸残基、例如最多20个氨基酸残基、例如最多19个氨基酸残基、例如最多18个氨基酸残基、例如最多17个氨基酸残基、例如最多16个氨基酸残基、例如最多15个氨基酸残基、例如最多14个氨基酸残基、例如最多13个氨基酸残基、例如最多12个氨基酸残基、例如最多11个氨基酸残基、例如8至10个氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个具体实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：15或其功能同系物的最多20个氨基酸残基、例如最多19个氨基酸残基、例如最多18个氨基酸残基、例如最多17个氨基酸残基、例如最多16个氨基酸残基、例如最多15个氨基酸残基、例如最多14个氨基酸残基、例如最多13个氨基酸残基、例如最多12个氨基酸残基、例如最多11个氨基酸残基、例如8至10个氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
因此，在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：1或其功能同系物的最多36个氨基酸残基、例如最多35个氨基酸残基、例如最多34个氨基酸残基、例如最多33个氨基酸残基、例如最多32个氨基酸残基、例如最多31个氨基酸残基、例如最多30个氨基酸残基、例如最多29个氨基酸残基、例如最多28个氨基酸残基、例如最多27个氨基酸残基、例如最多26个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如最多24个氨基酸残基、例如最多23个氨基酸残基、例如最多22个氨基酸残基、例如最多21个氨基酸残基、例如最多20个氨基酸残基、例如最多19个氨基酸残基、例如最多18个氨基酸残基、例如最多17个氨基酸残基、例如最多16个氨基酸残基、例如最多15个氨基酸残基、例如最多14个氨基酸残基、例如最多13个氨基酸残基、例如最多12个氨基酸残基、例如最多11个氨基酸残基、例如8至10个氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
因此，在另一个具体的实施方案中，本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：17或其功能同系物的最多44个氨基酸残基、例如最多43个氨基酸残基、例如最多42个氨基酸残基、例如最多41个氨基酸残基、例如最多40个氨基酸残基、例如最多39个氨基酸残基、例如最多38个氨基酸残基、例如最多37个氨基酸残基、例如最多36个氨基酸残基、例如最多35个氨基酸残基、例如最多34个氨基酸残基、例如最多33个氨基酸残基、例如最多32个氨基酸残基、例如最多31个氨基酸残基、例如最多30个氨基酸残基、例如最多29个氨基酸残基、例如最多28个氨基酸残基、例如最多27个氨基酸残基、例如最多26个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如最多24个氨基酸残基、例如最多23个氨基酸残基、例如最多22个氨基酸残基、例如最多21个氨基酸残基、例如最多20个氨基酸残基、例如最多19个氨基酸残基、例如最多18个氨基酸残基、例如最多17个氨基酸残基、例如最多16个氨基酸残基、例如最多15个氨基酸残基、例如最多14个氨基酸残基、例如最多13个氨基酸残基、例如最多12个氨基酸残基、例如最多11个氨基酸残基、例如8至10个氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽包含来自外显子9突变CALR的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，其来自包含SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR或来自SEQID NO：16、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在另一个实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽包含来自外显子9突变CALR的最多44个连续氨基酸残基，例如最多36个连续氨基酸残基，例如20个连续氨基酸残基，其来自包含SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR或来自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，所述本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：16或其功能同系物的至少8个氨基酸残基、例如至少9个氨基酸残基、例如至少10个氨基酸残基、例如至少11个氨基酸残基、例如至少12个氨基酸残基、例如至少13个氨基酸残基、例如至少14个氨基酸残基、例如至少15个氨基酸残基、例如至少16个氨基酸残基、例如至少17个氨基酸残基、例如至少18个氨基酸残基、例如至少19个氨基酸残基、例如至少20个氨基酸残基、例如至少21个氨基酸残基、例如至少22个氨基酸残基、例如至少23个氨基酸残基、例如至少24个氨基酸残基、例如至少25个氨基酸残基、例如至少26个氨基酸残基、例如至少27个氨基酸残基、例如至少28个氨基酸残基、例如至少29个氨基酸残基、例如至少30个氨基酸残基、例如至少31个氨基酸残基、例如至少32个氨基酸残基、例如至少33个氨基酸残基、例如至少34个氨基酸残基、例如至少35个氨基酸残基、例如至少36个氨基酸残基、例如至少37个氨基酸残基、例如至少38个氨基酸残基、例如至少39个氨基酸残基、例如至少40个氨基酸残基、例如至少40个氨基酸残基、例如至少41个氨基酸残基、例如至少42个氨基酸残基、例如至少43个氨基酸残基、例如至少44个氨基酸残基、例如25至35个氨基酸残基、例如20至36个连续氨基酸残基、例如29至44个氨基酸残基、例如26至32个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，所述本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：2或其功能同系物的至少8个氨基酸残基、例如至少9个氨基酸残基、例如至少10个氨基酸残基、例如至少11个氨基酸残基、例如至少12个氨基酸残基、例如至少13个氨基酸残基、例如至少14个氨基酸残基、例如至少15个氨基酸残基、例如至少16个氨基酸残基、例如至少17个氨基酸残基、例如至少18个氨基酸残基、例如至少19个氨基酸残基、例如至少20个氨基酸残基、例如至少21个氨基酸残基、例如至少22个氨基酸残基、例如至少23个氨基酸残基、例如至少24个氨基酸残基、例如至少25个氨基酸残基、例如至少26个氨基酸残基、例如至少27个氨基酸残基、例如至少28个氨基酸残基、例如至少29个氨基酸残基、例如25至29个氨基酸残基、例如26至29个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，所述本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：3或其功能同系物的至少8个氨基酸残基、例如至少9个氨基酸残基、例如至少10个氨基酸残基、例如至少11个氨基酸残基、例如至少12个氨基酸残基、例如至少13个氨基酸残基、例如至少14个氨基酸残基、例如至少15个氨基酸残基、例如至少16个氨基酸残基、例如至少17个氨基酸残基、例如至少18个氨基酸残基、例如至少19个氨基酸残基、例如至少20个氨基酸残基、例如至少21个氨基酸残基、例如至少22个氨基酸残基、例如至少23个氨基酸残基、例如至少24个氨基酸残基、例如至少25个氨基酸残基、例如至少26个氨基酸残基、例如至少27个氨基酸残基、例如至少28个氨基酸残基、例如至少29个氨基酸残基、例如25至29个氨基酸残基、例如26至29个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，所述本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：15或其功能同系物的至少8个氨基酸残基、例如至少9个氨基酸残基、例如至少10个氨基酸残基、例如至少11个氨基酸残基、例如至少12个氨基酸残基、例如至少13个氨基酸残基、例如至少14个氨基酸残基、例如至少15个氨基酸残基、例如至少16个氨基酸残基、例如至少17个氨基酸残基、例如至少18个氨基酸残基、例如至少19个氨基酸残基、例如20个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，所述本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：1或其功能同系物的至少8个氨基酸残基、例如至少9个氨基酸残基、例如至少10个氨基酸残基、例如至少11个氨基酸残基、例如至少12个氨基酸残基、例如至少13个氨基酸残基、例如至少14个氨基酸残基、例如至少15个氨基酸残基、例如至少16个氨基酸残基、例如至少17个氨基酸残基、例如至少18个氨基酸残基、例如至少19个氨基酸残基、例如至少20个氨基酸残基、例如至少21个氨基酸残基、例如至少22个氨基酸残基、例如至少23个氨基酸残基、例如至少24个氨基酸残基、例如至少25个氨基酸残基、例如至少26个氨基酸残基、例如至少27个氨基酸残基、例如至少28个氨基酸残基、例如至少29个氨基酸残基、例如至少30个氨基酸残基、例如至少31个氨基酸残基、例如至少32个氨基酸残基、例如至少33个氨基酸残基、例如至少34个氨基酸残基、例如至少35个氨基酸残基、例如至少36个氨基酸残基、例如20至36个连续氨基酸残基、例如29至36个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，所述本发明的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：17或其功能同系物的至少8个氨基酸残基、例如至少9个氨基酸残基、例如至少10个氨基酸残基、例如至少11个氨基酸残基、例如至少12个氨基酸残基、例如至少13个氨基酸残基、例如至少14个氨基酸残基、例如至少15个氨基酸残基、例如至少16个氨基酸残基、例如至少17个氨基酸残基、例如至少18个氨基酸残基、例如至少19个氨基酸残基、例如至少20个氨基酸残基、例如至少21个氨基酸残基、例如至少22个氨基酸残基、例如至少23个氨基酸残基、例如至少24个氨基酸残基、例如至少25个氨基酸残基、例如至少26个氨基酸残基、例如至少27个氨基酸残基、例如至少28个氨基酸残基、例如至少29个氨基酸残基、例如至少30个氨基酸残基、例如至少31个氨基酸残基、例如至少32个氨基酸残基、例如至少33个氨基酸残基、例如至少34个氨基酸残基、例如至少35个氨基酸残基、例如至少36个氨基酸残基、例如至少37个氨基酸残基、例如至少38个氨基酸残基、例如至少39个氨基酸残基、例如至少40个氨基酸残基、例如至少40个氨基酸残基、例如至少41个氨基酸残基、例如至少42个氨基酸残基、例如至少43个氨基酸残基、例如44个氨基酸残基、例如20至44个氨基酸残基、例如29至44个连续氨基酸残基、例如36至44个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽包含来自外显子9突变CALR的至少25个连续氨基酸残基，例如至少26个连续氨基酸残基，例如至少27个连续氨基酸残基，例如至少28个连续氨基酸残基，例如至少29个连续氨基酸残基，其来自包含SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR或来自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
具体地，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段可由来自SEQ ID NO：16的范围为8至34，例如范围为8至30，例如范围为8至29个连续氨基酸残基组成，或者，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：16的外显子9突变CALR肽片段的28个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的片段的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如最多27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：16中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在其他实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的至少28个连续氨基酸残基，例如至少29个连续氨基酸残基，例如至少30个连续氨基酸残基，例如31个连续氨基酸残基，例如32个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：16中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：16的外显子9突变CALR片段的29个连续氨基酸残基组成，或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：16的外显子9突变CALR片段的28个连续氨基酸残基组成。
在另一个实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：2的外显子9突变CALR片段的范围为8至29个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：2的外显子9突变CALR片段的范围为25至29个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，其来自SEQ IDNO：2中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在其他实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的至少25个连续氨基酸残基，例如至少26个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如28个连续氨基酸残基，例如29个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：2中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：2的CALR片段的29个连续氨基酸残基组成，或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：2的CALR片段的28个连续氨基酸残基组成。
在另一个实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：3的外显子9突变CALR片段的范围为8至29个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：3的外显子9突变CALR片段的范围为25至29个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，其来自SEQ IDNO：3中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在其他实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的至少25个连续氨基酸残基，例如至少26个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如28个连续氨基酸残基，例如29个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：3中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：3的CALR片段的29个连续氨基酸残基组成，或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：3的CALR片段的28个连续氨基酸残基组成。
在另一个实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：15的外显子9突变CALR片段的范围为8至20个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：15的外显子9突变CALR片段的范围为15至20个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的最多20个连续氨基酸残基，例如最多19个连续氨基酸残基，例如18个连续氨基酸残基，例如17个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：15中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在其他实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的至少16个连续氨基酸残基，例如至少17个连续氨基酸残基，例如18个连续氨基酸残基，例如19个连续氨基酸残基，例如20个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：15中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：15的CALR片段的20个连续氨基酸残基组成，或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：15的CALR片段的15个连续氨基酸残基组成。
在另一个实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR片段的范围为30至36个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR片段的范围为15至20个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的片段的最多36个连续氨基酸残基，例如最多35个连续氨基酸残基，例如34个连续氨基酸残基，例如33个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：1中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在其他实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的至少30个连续氨基酸残基，例如至少33个连续氨基酸残基，例如18个连续氨基酸残基，例如19个连续氨基酸残基，例如34个连续氨基酸残基，例如35个连续氨基酸残基，例如36个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：1中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：1的CALR片段的36个连续氨基酸残基组成，或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：1的CALR片段的30个连续氨基酸残基组成。
在另一个实施方案中，所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：17的外显子9突变CALR片段的范围为37至44个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性CALR肽可由来自SEQ ID NO：17的外显子9突变CALR片段的范围为30至35个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的最多44个连续氨基酸残基，例如最多43个连续氨基酸残基，例如42个连续氨基酸残基，例如41个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：17中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。在其他实施方案中，所述免疫原性肽包含来自外显子9突变CALR的至少37个连续氨基酸残基，例如至少38个连续氨基酸残基，例如39个连续氨基酸残基，例如40个连续氨基酸残基，例如41个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：17中鉴定的外显子9突变CALR片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：17的CALR片段的44个连续氨基酸残基组成，或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：17的CALR片段的36个连续氨基酸残基组成。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：16的CALR肽片段的最多15个连续氨基酸残基，例如最多12个连续氨基酸残基，例如最多11个连续氨基酸残基，例如最多10个连续氨基酸残基，例如最多9个连续氨基酸残基，例如8个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：16中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：16的CALR肽片段的至少25个连续氨基酸残基，例如至少26个连续氨基酸残基，例如至少27个连续氨基酸残基，例如至少28个连续氨基酸残基，例如至少29个连续氨基酸残基，例如至少30个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：16中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：2的最多15个连续氨基酸残基，例如最多12个连续氨基酸残基，例如最多11个连续氨基酸残基，例如最多10个连续氨基酸残基，例如最多9个连续氨基酸残基，例如8个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：2或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：2的CALR肽片段的至少25个连续氨基酸残基，例如至少26个连续氨基酸残基，例如至少27个连续氨基酸残基，例如至少28个连续氨基酸残基，例如29个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：2中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：3的最多15个连续氨基酸残基，例如最多12个连续氨基酸残基，例如最多11个连续氨基酸残基，例如最多10个连续氨基酸残基，例如最多9个连续氨基酸残基，例如8个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：3或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：3的CALR肽片段的至少25个连续氨基酸残基，例如至少26个连续氨基酸残基，例如至少27个连续氨基酸残基，例如至少28个连续氨基酸残基，例如29个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：3中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：15的CALR肽片段的最多15个连续氨基酸残基，例如最多12个连续氨基酸残基，例如最多11个连续氨基酸残基，例如最多10个连续氨基酸残基，例如最多9个连续氨基酸残基，例如8个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：15中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：15的CALR肽片段的至少15个连续氨基酸残基，例如至少16个连续氨基酸残基，例如至少17个连续氨基酸残基，例如至少18个连续氨基酸残基，例如至少19个连续氨基酸残基，例如至少20个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：15中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：1的CALR肽片段的最多30个连续氨基酸残基，例如最多29个连续氨基酸残基，例如最多30个连续氨基酸残基，例如最多31个连续氨基酸残基，例如最多32个连续氨基酸残基，例如33个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：1中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：1的CALR肽片段的至少32个连续氨基酸残基，例如至少33个连续氨基酸残基，例如至少34个连续氨基酸残基，例如至少35个连续氨基酸残基，例如36个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：1中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：17的CALR肽片段的最多35个连续氨基酸残基，例如最多36个连续氨基酸残基，例如最多37个连续氨基酸残基，例如最多38个连续氨基酸残基，例如最多39个连续氨基酸残基，例如40个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：17中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽包含来自SEQ ID NO：17的CALR肽片段的至少39个连续氨基酸残基，例如至少40个连续氨基酸残基，例如至少41个连续氨基酸残基，例如至少42个连续氨基酸残基，例如至少43个连续氨基酸残基，例如至少44个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：17中鉴定的外显子9突变CALR肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽可选自SEQID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的肽或其功能同系物。在一个具体的实施方案中，所述肽如SEQ ID NO：16所示或是其功能同系物。在另一个实施方案中，所述肽如SEQ ID NO：2所示或是其功能同系物。在另一个实施方案中，所述肽如SEQ ID NO：3所示或是其功能同系物。在另一个实施方案中，所述肽如SEQ IDNO：15所示或是其功能同系物。在另一个实施方案中，所述肽如SEQ ID NO：1所示或是其功能同系物。在另一个实施方案中，所述肽如SEQ ID NO：17所示或是其功能同系物。所述功能同系物可以是与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的肽具有至少70％的序列同一性、例如与其至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如至少99％的序列同一性的多肽。优选地，序列与SEQ ID NO：16、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17之间的序列同一性百分比通过测量SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的全长的序列同一性来确定。
因此，在一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性外显子9突变CALR肽可以是SEQ ID NO：16的CALR肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是具有与其至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
在另一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽可以是SEQ ID NO：2的CALR肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是具有与其至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
在另一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽可以是SEQ ID NO：3的CALR肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是具有与其至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
因此，在一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽可以是SEQ ID NO：15的CALR肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是具有与其至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
在另一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽可以是SEQ ID NO：1的CALR肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是具有与其至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
在另一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽可以是SEQ ID NO：17的CALR肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是具有与其至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽选自：
a)SEQ ID NO：16(CALR378-411)；
b)SEQ ID NO：2(CALR367-396)；
c)SEQ ID NO：3(CALR383-411)；和
d)a)至c)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽选自：
a)SEQ ID NO：16(CALR378-411)；
b)SEQ ID NO：2(CALR367-396)；
c)SEQ ID NO：3(CALR383-411)；
d)SEQ ID NO：15(CALR373-393)；
e)SEQ ID NO：1(CALR376-411)；
f)SEQ ID NO：17(CALR367-411)；和
g)a)至f)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在一些实施方案中，所述免疫原性活性肽由最多达50个，例如最多达40个，例如最多达30个，例如最多达25个，例如最多20达氨基酸组成，并且包含选自以下的序列：：
a)SEQ ID NO：16(CALR378-411)；
b)SEQ ID NO：2(CALR367-396)；
c)SEQ ID NO：3(CALR383-411)；
d)SEQ ID NO：15(CALR373-393)；
e)SEQ ID NO：1(CALR376-411)；
f)SEQ ID NO：17(CALR367-411)；和
g)a)至f)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
所述肽的最多达50、40、30、25或20个氨基酸可优选由CalR蛋白的连续氨基酸序列组成，在所述连续氨基酸中包含选自a)至g)中任一项的序列。
不受理论束缚，在一些情况下，所述肽的稳定性可以通过在N末端、C末端或两个末端纳入额外的末端残基(例如亲水性氨基酸残基)来增加。
本发明的其他CALR肽包含SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或其功能同系物的8至90、优选8至80、更优选8至70、还更优选8至60、甚至更优选8至40、例如18至25个连续氨基酸(或更优选由其组成)，所述功能同系物与SEQ ID NO：10具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还更优选至少98％、例如至少99％的序列同一性。
在一个具体的实施方案中，本发明的免疫原性活性JAK2V617F肽片段由以下组成：如SEQ ID NO：6中鉴定的JAK2V617F或其功能同系物的最多90个连续氨基酸残基，例如最多80个连续氨基酸残基，例如最多70个连续氨基酸残基，例如最多60个连续氨基酸残基，例如最多50个连续氨基酸残基，例如最多45个连续氨基酸残基，例如最多40个连续氨基酸残基，例如最多35个连续氨基酸残基，例如最多30个连续氨基酸残基，例如最多29个连续氨基酸残基，例如最多24个连续氨基酸残基，例如最多22个连续氨基酸残基，例如最多20个连续氨基酸残基，例如最多15个连续氨基酸残基，例如最多10个连续氨基酸残基，例如最多9个连续氨基酸残基，例如最多8个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。所述置换可以是保守性置换。
所述免疫原性活性肽JAK2V617F片段也可由以下组成：如SEQ ID NO：6中鉴定的JAK2V617F的最多80个连续氨基酸残基，例如最多70个连续氨基酸残基，例如最多60个连续氨基酸残基，例如最多50个连续氨基酸残基，例如最多45个连续氨基酸残基，例如最多40个连续氨基酸残基，例如最多35个连续氨基酸残基，例如最多30个连续氨基酸残基，例如最多29个连续氨基酸残基，例如最多24个连续氨基酸残基，例如最多22个连续氨基酸残基，例如最多20个连续氨基酸残基，例如如SEQ ID NO：6中鉴定的JAK2V617F的15至25个连续氨基酸残基、例如8至10个连续氨基酸残基，其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或被缺失。
所述免疫原性活性肽JAK2V617F片段也可由以下组成：如SEQ ID NO：6中鉴定的JAK2V617F的至少5个连续氨基酸残基，例如至少6个连续氨基酸残基，例如至少7个连续氨基酸残基，例如至少8个连续氨基酸残基，例如至少9个连续氨基酸残基，例如至少10个连续氨基酸残基，例如至少15个连续氨基酸残基，例如至少20个连续氨基酸残基，例如至少25个连续氨基酸残基，例如至少30个连续氨基酸残基，例如至少35个连续氨基酸残基，例如至少40个连续氨基酸残基，例如如SEQ ID NO：6中鉴定的JAK2V617F的8至15个连续氨基酸残基、例如9至10个连续氨基酸残基，其中一个或多个氨基酸已被突变为另一个氨基酸或被缺失。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽片段由以下组成：如SEQID NO：7中鉴定的JAK2V617F或其功能同系物的范围为8至9氨基酸，优选9个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
因此，在另一个实施方案中，本发明的免疫原性活性JAK2V617F肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物的最多35个可能是连续的氨基酸残基，例如最多34个氨基酸残基，例如最多33个氨基酸残基，例如最多32个氨基酸残基，例如最多31个氨基酸残基，例如最多30个氨基酸残基，例如最多29个氨基酸残基，例如最多28个氨基酸残基，例如最多27个氨基酸残基，例如最多26个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，例如最多24个氨基酸残基，例如最多23个氨基酸残基，例如最多22个氨基酸残基，例如最多21个氨基酸残基，例如最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，例如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，例如最多16个氨基酸残基，例如最多15个氨基酸残基，例如最多14个氨基酸残基，例如最多13个氨基酸残基，例如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，例如8至10个氨基酸残基，例如9至10个氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，本发明的免疫原性活性JAK2V617F肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物的最多35个可能是连续的氨基酸残基，例如最多34个氨基酸残基，例如最多33个氨基酸残基，例如最多32个氨基酸残基，例如最多31个氨基酸残基，例如最多30个氨基酸残基，例如最多29个氨基酸残基，例如最多28个氨基酸残基，例如最多27个氨基酸残基，例如最多26个氨基酸残基，例如最多25个氨基酸残基，例如最多24个氨基酸残基，例如最多23个氨基酸残基，例如最多22个氨基酸残基，例如最多21个氨基酸残基，例如最多20个氨基酸残基，例如最多19个氨基酸残基，例如最多18个氨基酸残基，例如最多17个氨基酸残基，例如最多16个氨基酸残基，例如最多15个氨基酸残基，例如最多14个氨基酸残基，例如最多13个氨基酸残基，例如最多12个氨基酸残基，例如最多11个氨基酸残基，例如8至10个氨基酸残基，例如9至10个氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，本发明的免疫原性活性JAK2V617F肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物的至少8个氨基酸残基，例如至少9个氨基酸残基，例如至少10个氨基酸残基，例如至少11个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸残基，例如至少13个氨基酸残基，例如至少14个氨基酸残基，例如至少15个氨基酸残基，例如至少16个氨基酸残基，例如至少17个氨基酸残基，例如至少18个氨基酸残基，例如至少19个氨基酸残基，例如至少20个氨基酸残基，例如至少24个氨基酸残基，例如至少25个氨基酸残基，例如至少26个氨基酸残基，例如至少27个氨基酸残基，例如至少28个氨基酸残基，例如至少29个氨基酸残基，例如25至35个氨基酸残基，例如26至32个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性JAK2V617F肽包含来自JAK2V617F的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸，其来自包含SEQ ID NO：7的SEQ ID NO：6或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性JAK2V617F肽包含来自SEQ IDNO：7的JAK2V617F肽片段的至少5个连续氨基酸残基，例如至少6个连续氨基酸残基，例如至少7个连续氨基酸残基，例如至少8个连续氨基酸，例如9个连续氨基酸残基，其来自如SEQID NO：7中鉴定的JAK2V617F肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸己被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
具体地，所述免疫原性活性JAK2V617F肽可由SEQ ID NO：6的JAK2V617F的范围为8至29个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含或由以下组成：来自JAK2V617F的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，其来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ IDNO：6的JAK2V617F突变体的29个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性肽可由来自SEQID NO：6的JAK2V617F的28个连续氨基酸残基组成。
在另一个实施方案中，所述免疫原性活性JAK2V617F肽可由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体的范围为8至29个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体的范围为25至29个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自JAK2V617F突变体的最多29个连续氨基酸残基，例如最多28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，其来自如SEQ IDNO：6中鉴定的JAK2V617F突变体的片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了至少三个氨基酸已被置换，例如至少两个氨基酸已被置换，例如至少一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体的29个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体的28个连续氨基酸残基组成。
具体地，所述免疫原性活性JAK2V617F肽可由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体的9个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F的最多达30个连续氨基酸残基组成。在一些实施方案中，所述免疫原性肽包含来自JAK2V617F的最多30个连续氨基酸残基，例如最多29个连续氨基酸残基，例如28个连续氨基酸残基，例如27个连续氨基酸残基，例如26个连续氨基酸残基，例如25个连续氨基酸残基，其来自SEQID NO：6中鉴定的JAK2V617F或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。具体地，所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：7的JAK2V617F突变体的9个连续氨基酸残基组成或所述免疫原性活性肽可由来自SEQ ID NO：7的JAK2V617F片段的8个连续氨基酸残基组成。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性活性JAK2V617F肽包含来自SEQ IDNO：7的JAK2V617F肽片段的最多9个连续氨基酸残基，例如最多8个连续氨基酸残基，例如最多7个连续氨基酸残基，例如最多6个连续氨基酸残基，例如最多5个连续氨基酸残基，其来自如SEQ ID NO：7中鉴定的JAK2V617F肽片段或其功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在另一个实施方案中，本发明的免疫原性活性JAK2V617F肽片段由以下组成：来自SEQ ID NO：7或其功能同系物的至少5个氨基酸残基，例如至少6个氨基酸残基，例如至少7个氨基酸残基，例如至少8个氨基酸残基，例如至少9个连续氨基酸残基；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在本发明的一些实施方案中，所述免疫原性活性JAK2V617F肽包含或由SEQ IDNO：7或其功能同系物组成。在一个具体的实施方案中，所述肽如SEQ ID NO：7所示或是其功能同系物。所述功能同系物可以是与SEQ ID NO 7的肽具有至少70％的序列同一性、例如与其至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如至少99％的序列同一性的多肽。优选地，序列与SEQ ID NO：7之间的序列同一性百分比通过测量SEQ ID NO：7的全长的序列同一性来确定。
因此，在一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性JAK2V617F肽可以是SEQ IDNO 7的JAK2V617F肽片段或其功能同系物，所述功能同系物是与其具有至少70％的序列同一性、例如至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如与其至少99％的序列同一性的多肽。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述免疫原性活性肽选自：
a)SEQ ID NO：7(JAK2610-618)或如本文所定义的包含SEQ ID NO：7的肽；和
b)a)的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
所述肽可由JAK2蛋白的最多达50、40、30、25或20个氨基酸组成，其中所述连续氨基酸包含选自a)或b)中任一项的序列。
不受理论束缚，在一些情况下，所述肽的稳定性可以通过在N末端、C末端或两个末端纳入额外的末端残基(例如亲水性氨基酸残基)来增加。
本发明的其他JAK2V617F肽包含SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体或其功能同系物的8至90、优选8至80、更优选8至70、还更优选8至60、甚至更优选8至40、例如18至25个连续氨基酸(或更优选由其组成)，所述功能同系物与SEQ ID NO：6具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、还更优选至少98％、例如至少99％的序列同一性。
表1.示例性的外显子9突变CALR和JAK2V617F肽
功能同系物
外显子9 CALR和JAK2V617F、或其免疫原性活性片段的功能同系物是多肽，其也具有免疫原性活性，并且分别与外显子9 CALR和JAK2V617F，特别是与SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或SEQ ID NO：6的JAK2V617F具有至少一定程度的序列同一性。外显子9 CALR和JAK2V617F、或其免疫原性活性片段的功能同系物也可以是多肽，其也具有免疫原性活性，并且分别与外显子9 CALR和JAK2V617F的多肽具有至少一定程度的序列同一性。特别地，所述外显子9突变CALR功能同系物可与SEQ ID NO：16中所示的片段具有至少一定程度的序列同一性。JAK2V617F功能同系物可与SEQ ID NO：7中所示的片段具有至少一定程度的序列同一性。外显子9突变CALR、或其免疫原性活性片段的功能同系物也可以是多肽，其也具有免疫原性活性，并且与外显子9突变CALR，特别是与SEQ ID NO：2中所示的片段具有至少一定程度的序列同一性。外显子9突变CALR、或其免疫原性活性片段的功能同系物也可以是多肽，其也具有免疫原性活性，并且与外显子9突变CALR，特别是与SEQ ID NO：3中所示的片段具有至少一定程度的序列同一性。
对于较短的多肽，例如对于短于50个氨基酸，例如短于25个氨基酸的多肽，功能同系物可以是具有相同序列的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
或者，功能同系物可以是免疫原性活性外显子9突变CALR多肽，其与SEQ ID NO：16的外显子9突变CALR片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：16的人外显子9突变CALR具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
功能同系物可以是免疫原性活性外显子9突变CALR多肽，其与SEQ ID NO：2的外显子9突变CALR片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：2的人CALR具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
功能同系物可以是免疫原性活性外显子9突变CALR多肽，其与SEQ ID NO：3的外显子9突变CALR片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：3的人外显子9突变CALR具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
功能同系物可以是免疫原性活性外显子9突变CALR多肽，其与SEQ ID NO：15的外显子9突变CALR片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：15的人外显子9突变CALR具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
功能同系物可以是免疫原性活性外显子9突变CALR多肽，其与SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：1的人外显子9突变CALR具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
功能同系物可以是免疫原性活性外显子9突变CALR多肽，其与SEQ ID NO：17的外显子9突变CALR片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：17的人外显子9突变CALR具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
或者，功能同系物可以是免疫原性活性多肽，其与SEQ ID NO：7的JAK2V617F片段具有至少70％的序列同一性，因此，功能同系物优选与SEQ ID NO：7的人JAK2V617F具有至少75％的序列同一性、例如至少80％的序列同一性、例如至少85％的序列同一性、例如至少90％的序列同一性、例如至少89％的序列同一性、例如至少91％的序列同一性、例如至少92％的序列同一性、例如至少93％的序列同一性、例如至少94％的序列同一性、例如至少95％的序列同一性、例如至少96％的序列同一性、例如至少97％的序列同一性、例如至少98％的序列同一性、例如99％的序列同一性。
优选地，所述JAK2V617F片段包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
可以使用许多公知的算法并应用许多不同的空位罚分来计算序列同一性。相对于全长参照序列(例如全长SEQ ID NO：6)计算序列同一性。可使用任何序列比对工具(例如但不限于FASTA、BLAST或LALIGN)来搜索同系物并计算序列同一性。此外，合适时，任何公知的置换矩阵(例如但不限于PAM、BLOSSUM或PSSM矩阵)可应用于搜索算法。例如，可以通过PSI-BLAST程序应用PSSM(位置特定评分矩阵)。此外，可以使用一系列用于空位开放和延伸的罚分来进行序列比对。例如，可以使用BLAST算法，使用5-12范围内的空位开放罚分，以及1-2范围内的空位延伸罚分。
功能同系物还可包含化学修饰，例如泛素化、标记(例如，用放射性核素、各种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)、或通过氨基酸(如鸟氨酸)的插入(或通过化学合成置换)，这些通常不会在人蛋白中发生，然而，优选功能等同物不含有化学修饰。
与SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR的氨基酸残基序列相比，或与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的外显子9突变CALR片段相比，或与SEQ ID NO：6的JAK2V617F的氨基酸残基序列相比，或与SEQ ID NO：7的JAK2V617F片段相比，对氨基酸残基序列进行的任何改变优选是保守性置换。本领域技术人员会知道如何制备和评估“保守性的”氨基酸置换，通过该置换，一个氨基酸被另一个具有一个或多个共有的化学和/或物理特征的氨基酸置换。保守性氨基酸置换不太可能影响蛋白的功能。氨基酸可根据共有特征分组。保守性氨基酸置换是预定氨基酸组中的一个氨基酸置换同一组中的另一个氨基酸，其中所述预定组内的氨基酸表现出相似或基本相似的特征。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR片段的范围为8至35个氨基酸、优选范围为25至31或27至30个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：16的外显子9突变CALR片段的范围为8至34个氨基酸、优选范围为25至31或27至30个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：2的外显子9突变CALR片段的范围为8至29个氨基酸、优选范围为20至29或27至29个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：3的外显子9突变CALR片段的范围为8至29个氨基酸、优选范围为20至29或27至29个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：15的外显子9突变CALR片段的范围为8至20个氨基酸、优选范围为15至20或17至20个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR片段的范围为8至36个氨基酸、优选范围为39至36或33至36个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：17的外显子9突变CALR片段的范围为8至44个氨基酸、优选范围为36至44或40至44个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：6的JAK2V617F的范围为8至15个氨基酸、优选范围为8至13或9至10个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含由SEQ ID NO：7的JAK2V617F的范围为8至9个氨基酸、优选9个氨基酸的连续序列组成的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换，并且其中所述置换优选是保守性的。
优选地，所述JAK2V617F多肽包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
包含外显子9突变CALR或JAK2V617F的多肽或其片段
本发明还包括：本发明的疫苗组合物可包含含有外显子9突变CALR、JAK2V617F或其片段的多肽。因此，外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段可以是包含外显子9突变CALR或JAK2V617F片段的多肽，例如本节中本文所述的任意多肽。
特别地，此类多肽可包含全长外显子9突变CALR，例如上文“钙网蛋白(CALR)”部分中所述的任意外显子9突变CALR。所述多肽可包含全长JAK2V617F，例如上文“Janus激酶2(JAK2)”部分中所述的任意JAK2V617F。
例如，所述多肽可包含SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或其功能同系物，所述功能同系物与其具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性。特别地，除了SEQ ID NO：10的CALR之外，这样的多肽还可包含最多90个、例如最多50个、例如最多29个、例如最多25个、例如最多10个氨基酸。例如，所述多肽可包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的外显子9突变片段CALR或其功能同系物，所述功能同系物与其具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性。特别地，除了SEQ ID NO：10的CALR之外，这样的多肽还可包含最多90个、例如最多50个、例如最多25个、例如最多10个氨基酸。
在一些实施方案中，所述多肽可包含SEQ ID NO：6的JAK2V617F突变体或其功能同系物，所述功能同系物与其具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性。特别地，除了SEQ ID NO：6的JAK2V617F之外，这样的多肽还可包含最多90个、例如最多50个、例如最多29个、例如最多25个、例如最多10个氨基酸。例如，所述多肽可包含SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物，所述功能同系物与其具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性。特别地，除了SEQ ID NO：6的JAK2V617F之外，这样的多肽还可包含最多90个、例如最多50个、例如最多25个、例如最多10个氨基酸。
优选地，所述包含在所述疫苗组合物中的JAK2V617F多肽包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
本发明还包括：所述疫苗组合物可包含含有外显子9突变CALR的片段(例如上文“外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段”部分中所述的任意片段)或JAK2V617F的片段(例如上文“外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段”部分中所述的任意片段)的多肽。
因此，所述多肽可以是包含SEQ ID NO：16的连续氨基酸序列、具有最多400个氨基酸、例如最多300个氨基酸、例如最多200个氨基酸、例如最多100个氨基酸、例如最多100个氨基酸、例如最多50个氨基酸的外显子9突变体CALR多肽，其中所述SEQ ID NO：1的连续氨基酸序列由SEQ ID NO：16或其功能同系物的最多50个氨基酸残基、例如最多45个氨基酸残基、例如最多40个氨基酸残基、例如最多35个氨基酸残基、例如最多30个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如范围为18至25、例如范围为5至10个连续氨基酸组成。因此，所述多肽可以是以下外显子9 CALR突变体中的任一个：L367fs＊46(SEQ ID NO：10中所示的全长)、E370fs＊43、E370fs＊48、L367fs＊48、L367fs＊44、K368fs＊51、L367fs＊52、R366fs＊53、E371fs＊49、K368fs＊43、E370fs＊37、D373fs＊47、K374fs＊53、E371fs＊49、K385fs＊47、K385fs＊47、R376fs＊55、K385fs＊47、E381fs＊48(Nangalia et al.，2013；上述突变的序列列于Nangalia et al.的p.2400，图3，A部分)。
特别地，所述外显子9 CALR多肽可以是如下的多肽：其具有最多100个氨基酸、例如最多90个氨基酸、例如最多80个氨基酸、例如最多70个氨基酸、例如最多60个氨基酸、例如最多50个氨基酸、例如最多45个氨基酸、例如最多40个氨基酸、例如最多35个氨基酸、例如最多30个氨基酸，其包含选自以下的免疫原性活性肽：
a)SEQ ID NO：16(CALR378-411)；
b)SEQ ID NO：2(CALR367-396)；
c)SEQ ID NO：3(CALR383-411)；和
d)a)至c)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
特别地，所述外显子9 CALR多肽可以是如下的多肽：其具有最多100个氨基酸、例如最多90个氨基酸、例如最多80个氨基酸、例如最多70个氨基酸、例如最多60个氨基酸、例如最多50个氨基酸、例如最多45个氨基酸、例如最多40个氨基酸、例如最多35个氨基酸、例如最多30个氨基酸，其包含选自以下的免疫原性活性肽：
a)SEQ ID NO：16(CALR378-411)；
b)SEQ ID NO：2(CALR367-396)；
c)SEQ ID NO：3(CALR383-411)；
d)SEQ ID NO：15(CALR373-393)；
e)SEQ ID NO：1(CALR376-411)；
f)SEQ ID NO：17(CALR367-411)；和
g)a)至f)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
所述外显子9 CALR多肽可以是如下的多肽：其包含SEQ ID NO：16的连续氨基酸序列、具有最多100个氨基酸、例如最多50个氨基酸、例如最多30个氨基酸、例如最多20个氨基酸、例如最多15个氨基酸，其中所述SEQ ID NO：16的连续氨基酸序列由来自SEQ ID NO：16的CALR或其功能同系物的范围为8至10个，例如9或10个连续氨基酸组成。因此，所述多肽可以是如下的多肽：其具有最多100个氨基酸、例如最多50个氨基酸、例如最多30个氨基酸、例如最多29个氨基酸，其包含选自以下的免疫原性活性肽：
a)SEQ ID NO：16(CALR378-411)；
b)SEQ ID NO：2(CALR367-396)；
c)SEQ ID NO：3(CALR383-411)；
d)SEQ ID NO：15(CALR373-393)；
e)SEQ ID NO：1(CALR376-411)；
f)SEQ ID NO：17(CALR367-411)；和
g)a)至f)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
在其他实施方案中，所述多肽可以是包含SEQ ID NO：6的连续氨基酸序列、具有最多400个氨基酸、例如最多300个氨基酸、例如最多200个氨基酸、例如最多100个氨基酸、例如最多100个氨基酸、例如最多50个氨基酸的JAK2V617F多肽，其中所述SEQ ID NO：6的连续氨基酸序列由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物的最多50个氨基酸残基、例如最多45个氨基酸残基、例如最多40个氨基酸残基、例如最多35个氨基酸残基、例如最多30个氨基酸残基、例如最多25个氨基酸残基、例如范围为18至25、例如范围为8至10个连续氨基酸组成。
特别地，所述JAK2V617F多肽可以是如下的多肽：其具有如SEQ ID NO：6中所鉴定的JAK2V617F或其功能同系物的最多100个连续氨基酸残基、例如最多90个连续氨基酸残基、例如最多80个连续氨基酸残基、例如最多70个连续氨基酸残基、例如最多60个连续氨基酸残基、例如最多50个连续氨基酸残基、例如最多45个连续氨基酸残基、例如最多40个连续氨基酸残基、例如最多35个连续氨基酸残基、例如最多30个连续氨基酸残基、例如最多29个连续氨基酸残基、例如最多25个连续氨基酸残基、例如18至25个连续氨基酸残基、例如20个连续氨基酸残基，并且包含选自以下的免疫原性活性肽：
a)SEQ ID NO：7(JAK2610-618)；和
b)a)至c)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
所述JAK2V617F多肽也可以是如下的多肽：其包含SEQ ID NO：6的连续氨基酸序列、具有最多100个连续氨基酸残基、例如最多30个连续氨基酸残基、例如最多20个连续氨基酸残基、例如最多15个连续氨基酸残基、例如最多10个连续氨基酸残基，其中所述SEQ IDNO：6的连续氨基酸序列由来自SEQ ID NO：6的JAK2或其功能同系物的范围为8至10个、例如9或10个连续氨基酸组成。因此，所述多肽可以是如下的多肽：其具有最多100个氨基酸、例如最多50个氨基酸、例如26个氨基酸、例如最多20个氨基酸、例如最多15个氨基酸，并包含选自以下的免疫原性活性肽：
a)SEQ ID NO：7(JAK2610-618)；和
b)a)至c)中任一项的多肽的功能同系物；所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，例如最多两个氨基酸已被置换，例如最多一个氨基酸已被置换。
优选地，所述JAK2V617F多肽包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
MHC
本发明包括：外显子9突变CALR或JAK2V617F突变体的免疫原性活性肽片段可以是MHC I类限制性肽片段或MHC II类限制性肽片段，例如本部分中描述的MHC I类限制性肽片段或MHC II类限制性肽片段中的任一个。
有两种类型的MHC分子；MHC I类分子和MHC II类分子。MHC I类分子被CD8 T细胞识别，所述CD8 T细胞是适应性免疫应答的主要效应细胞。MHC II类分子主要在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达，其中最重要的似乎是树突细胞。APC刺激初始T细胞，以及免疫系统中的其他细胞。它们刺激CD8 T细胞和CD4 T细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了免疫原性活性CALR肽(任选地包含在本文所述的更大的肽和/或疫苗组合物中)，其中所述免疫原性外显子9突变CALR肽是由来自SEQ IDNO：10的CALR的25-35个连续氨基酸组成的MHC I类限制性肽片段，例如SEQ ID NO：16、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的肽片段或其功能同系物，其中SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQID NO：1或SEQ ID NO：17的最多两个氨基酸已被置换。在另一个实施方案中，本发明提供了免疫原性活性JAK2V617F肽(任选地包含在本文所述的更大的肽和/或疫苗组合物中)，其中所述免疫原性活性JAK2V617F肽是由来自SEQ ID NO：6的JAK2V617F的5-15个连续氨基酸组成的MHC I类限制性肽片段，例如SEQ ID NO：7的肽片段或其功能同系物的8-9个肽，其中SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的最多两个氨基酸已被置换。这种MHC I类限制性肽片段的特征在于具有几个特征中的至少一个，其中之一是结合I类HLA分子的能力，其以如通过能够半数最大回收I类HLA分子的肽的量(C50值)所测量的亲和力受限于所述HLA分子，所述量为如通过本文所述的装配结合测定所测定的最多50μM。该装配测定基于在将肽加载到肽转运蛋白缺陷型细胞系T2后HLA分子的稳定性。随后，使用构象依赖性抗体对正确折叠的稳定HLA重链进行免疫沉淀，并定量肽结合。该实施方案的肽包含SEQ ID NO：10的外显子9 CALR突变体、或SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQID NO：17的片段或其功能同系物的最多100个、优选最多50个、更优选最多25个、更优选最多20个、甚至更优选最多15个、例如最多10个，例如范围为25至35个或8至12个连续氨基酸(或更优选由其组成)，其中SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的最多两个氨基酸已被置换。在一些实施方案中，所述肽可包含SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物的最多100个、优选最多50个、更优选最多25个、更优选最多20个、甚至更优选最多15个、例如最多10个，例如范围为8至15个或15至25个连续氨基酸(或更优选由其组成)，其中SEQ ID NO：6的最多两个氨基酸已被置换。优选地，所述JAK2V617F肽包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸。
所述装配结合测定提供了一种简单的筛选候选肽的以上述亲和力与给定HLA等位基因分子结合的能力的方法。在优选的实施方案中，本发明的肽片段具有最多为30μM的C50值，例如最多为20μM的C50值，包括最多为10μM、最多为5μM和最多为2μM的C50值。
在另一个优选的实施方案中，提供了新的外显子9突变CALR或JAK2V617F的MHC II类限制性肽片段。在一些实施方案中，所述MHC II类限制性肽片段(在本文也称为“肽”)是SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR，例如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的肽或其功能同系物，其中SEQ ID NO：10的最多两个氨基酸已被置换，其特征在于具有下文所述的几个特征中的至少一个。该实施方案的肽包含SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或其功能同系物的4至93，优选8至90，更优选10至75，更优选12至60，甚至更优选20至40，例如25至35个连续氨基酸(或更优选由其组成)，其中SEQ ID NO：10、的最多两个，优选最多一个氨基酸已被置换。在一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR的25至35，优选26至33，更优选27至32，更优选28至31，甚至更优选28至30，例如29个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：16的CALR肽片段的25至35，优选26至33，更优选27至32，更优选28至31，甚至更优选28至30，例如29个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：2的外显子9突变CALR肽片段的25至29，优选26至29，更优选27至29，例如28或29个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：3的外显子9突变CALR肽片段的25至29，优选26至29，更优选27至29，例如28或29个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：15的外显子9突变CALR肽片段的15至20，优选16至20，更优选17至20，例如18或29个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR肽片段的32至36，优选33至36，更优选34至36，例如35或36个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：17的外显子9突变CALR肽片段的40至44，优选41至44，更优选40至41，例如40、41、42、43或44个连续氨基酸(或更优选由其组成)。
在其他实施方案中，所述MHC II类限制性肽片段(在本文也称为“肽”)是SEQ IDNO：6的JAK2V617F，例如SEQ ID NO：7的肽或其功能同系物，其中SEQ ID NO：6的最多两个氨基酸已被置换，其特征在于具有下文所述的几个特征中的至少一个。该实施方案的肽包含SEQ ID NO：6的JAK2或其功能同系物的4至93，例如5至90，例如6至75，例如7至60，例如8至40，例如9至30，例如10至20个连续氨基酸(或更优选由其组成)，其中SEQ ID NO：6的最多两个、优选最多一个氨基酸已被置换。在一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：6的JAK2V617F的8至15，优选8至14，更优选8至13，更优选8至12，甚至更优选8至11，例如9个连续氨基酸(或更优选由其组成)。在另一个优选的实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO：7的JAK2V617F肽片段的8至9，例如9个氨基酸(或更优选由其组成)。
因此，提供了具有25-35个氨基酸的新的MHC I类限制性肽外显子9突变CALR片段或SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR的25-35个氨基酸的新的MHC II类限制性肽片段，或其功能同系物，其中SEQ ID NO：10的最多两个氨基酸已被置换，其特征在于具有下文所述的几个特征中的至少一个，其中之一是结合其所受限于之的I类或II类HLA分子的能力。还提供了新的具有8-15个氨基酸的MHC I类限制性肽JAK2V617F片段或新的SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其功能同系物的具有8-15个氨基酸的MHC II类限制性肽片段，其中SEQ IDNO：6的最多两个氨基酸已被置换，其特征在于具有下文所述的几个特征中的至少一个，其中之一是结合其所受限于之的I类或II类HLA分子的能力。
在具体的实施方案中，提供了一种肽片段，其是MHC I类限制性肽或MHC II类限制性肽，其具有以下特征中的至少一个：
(i)能够以至少1/104PBL的频率在至少一个癌症患者的PBL群体引起产INF-γ的细胞，如通过ELISPOT测定所确定的，和/或
(ii)能够在肿瘤组织中原位检测与表位肽具有反应性的CTL。
(iii)能够在体外诱导外显子9突变CALR特异性T细胞的生长和/或能够在体外诱导JAK2V617F特异性T细胞的生长。
本发明的更优选的肽是能够引起如通过ELISPOT测定(例如如下文实施例1中所述)所测定的特异性T细胞应答的肽。尽管一些肽不以高亲和力结合MHC I类或II类，但它们仍然可以产生如通过ELISPOT所测定的T细胞应答。能够以高亲和力结合MHC I类或II类的其他肽也产生如通过ELISPOT所测定的T细胞应答。这两种肽都是本发明的优选肽。
因此，本发明的优选肽是能够引起如通过ELISPOT测定所测定的特异性T细胞应答的肽，其中测量到每106个细胞，更优选每105个，甚至更优选每104个细胞超过50个肽特异性斑点。
本发明的最优选的肽是能够在患有以突变CALR(特别是外显子9突变CALR)的表达或突变JAK2(特别是突变JAK2V617F)的表达为表征的临床病症的个体中引起细胞免疫应答的肽，所述临床病症优选是增殖性病症，例如骨髓增生性病症，例如原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症、或急性或慢性髓性白血病，优选恶性骨髓增生性疾病，例如急性或慢性髓性白血病。
如上所述，HLA系统代表人类组织相容性(MHC)系统。通常，MHC系统控制一系列特征：移植抗原、胸腺依赖性免疫应答、某些补体因子以及某些疾病的易感性。更具体地，MHC编码三种不同类型的分子，即I、II和III类分子，它们决定了MHC的更一般性的特征。在这些分子中，I类分子是所谓的HLA-A、HLA-B和HLA-C分子，它们存在于大多数有核细胞和凝血细胞的表面。
本发明的肽的特征在于它们与特定MHC I类HLA分子结合(受其限制)的能力。因此，在一个实施方案中，所述肽是受MHC I类HLA-A分子限制的肽，所述分子包括HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-Aw19、HLA-A23(9)、HLA-A24(9)、HLA-A25(10)、HLA-A26(10)、HLA-A28、HLA-A29(w19)、HLA-A30(w19)、HLA-A31(w19)、HLA-A32(w19)、HLA-Aw33(w19)、HLA-Aw34(10)、HLA-Aw36、HLA-Aw43、HLAAw66(10)、HLA-Aw68(28)、HLA-A69(28)。在整篇文献中也使用更简单的标识，其中仅使用主要数字标识，例如HLA-A19或HLA-A24分别代替HLA-Aw19和HLA-A24(49)。在具体的实施方案中，本发明的肽受限于选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24的MHC I类HLA种类。在具体的实施方案中，本发明的肽受限于MHC I类HLA种类HLA-A2或HLA-A3。
在其他有用的实施方案中，本发明的肽是这样的肽——其受限于包括以下任一种的MHC I类HLA-B分子：HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLAB18、HLA-B21、HLA-Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-Bw46和HLA-Bw47。在本发明的具体实施方案中，本发明的肽能够与之结合的MHC I类HLA-B种类选自HLA-B7、HLA-B35、HLAB44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51。
在其他有用的实施方案中，本发明的肽是这样的肽——其受限于包括但不限于以下任一种的MHC I类HLA-C分子：HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7和HLA-Cw1。
在其他有用的实施方案中，本发明的肽是这样的肽——其受限于包括但不限于以下任一种的MHC II类HLA分子：HLA-DPA-1、HLA-DPB-1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB及这些组中的所有等位基因和HLA-DM、HLA-DO。
可通过对结合给定的特定HLA分子的已知序列的比对来对可能具有结合该特定HLA分子的能力的肽进行选择，由此来揭示肽中特定位置处少数相关氨基酸的优势。此类优势氨基酸残基在本文中也称为“锚定残基”或“锚定残基基序”。通过遵循基于可在可获得的数据库中找到的已知序列数据的这种相对简单的程序，可从可能与特定的HLA分子结合的外显子9 CALR或JAK2V6417获得肽。一系列HLA分子的此类分析的代表性实例在下表中给出：
表2
＊在一个实施方案中，该位置没有特定的锚定残基，但是在优选的实施方案中，锚定残基是R或A。
因此，例如，可能具有与HLA-A3结合的能力的九肽将具有以下序列之一：Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K、Xaa-LY-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Y；Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F或Xaa-V-Y-Xaa-XaaXaa-Xaa-Xaa-K(Xaa表示任意氨基酸残基)。以类似的方式，可设计可能具有与任何其他HLA分子结合的能力的序列。应理解，本领域普通技术人员将能够鉴定给定的HLA分子的其他“锚定残基基序”。
本发明的肽可以具有这样的序列——其是其所衍生自的外显子9突变CALR或JAK2V617F的天然序列，其中所述外显子9突变CALR或JAK2V617F可以是本文所述的任何外显子9突变CALR或JAK2V617F。然而，对任何给定的HLA分子具有更高亲和力的肽可通过置换、缺失或添加至少一个氨基酸残基对天然序列进行修饰(例如，基于上述程序)来从该序列衍生获得，由此鉴定出关于给定HLA分子的锚定残基基序。
因此，在有用的实施方案中，本发明的多肽包括肽，对于表2中列出的每种特异性HLA等位基因，其序列包含表中所示的任意氨基酸残基。
因此，本发明的肽可以是包含来自外显子9突变CALR的连续序列的任意上述肽，其中范围为1至10个，优选范围为1至5个，更优选范围为1至3个，甚至更优选范围为1至2个，更优选1个氨基酸已与另一个氨基酸交换，优选以使得所述肽包含如上表所示的给定的HLA-A特异性肽的一个或多个，优选所有锚定残基的方式。本发明的肽还可以是包含来自JAK2V617F的连续序列的任意上述肽，其中范围为1至10个，优选范围为1至5个，更优选范围为1至3个，甚至更优选范围为1至2个，更优选1个氨基酸已与另一个氨基酸交换，优选以使得所述肽包含如上表所示的给定的HLA-A特异性肽的一个或多个，优选所有锚定残基的方式。
本发明的优选肽受限于其的优选HLA种类的实例包括：选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24的MHC I类HLA种类，更优选所述肽受限于HLA-A3或HLA-A2。或者，优选的HLA种类包括选自HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27和HLA-B51的MHC I类HLA-B种类。
鉴定本发明多肽的方法包括以下步骤：选择特定的HLA分子，例如，在一个给定的群体中以高比率发生的HLA分子；进行如上所述的比对分析以鉴定外显子9突变CALR蛋白或JAK2V617F蛋白中的“锚定残基基序”；分离或构建包含一个或多个所鉴定的锚定残基的合适大小的肽以及测试如通过ELISPOT测定所确定的所得肽的以至少1个/104PBL的频率在癌症患者的PBL群体中引起产INF-γ的细胞的所述肽的能力，如实施例1中所述。例如，所述肽在癌症患者的PBMC群体中引起产INF-γ的细胞的能力具有至少1/104PBL的频率。
在本发明的一方面，提供了CALR衍生的肽，特别是外显子9突变CALR衍生的肽，和JAK2衍生的肽，特别是JAK2V617F衍生的肽，其长度超过8-10个氨基酸残基。通过蛋白酶体将长度超过8-10个氨基酸的多肽加工成较短的长度以结合HLA分子。因此，当给予长度超过8至10个氨基酸残基的多肽时，所述外显子9突变CALR或JAK2V617F的“长”多肽/蛋白/蛋白片段/变体可通过蛋白酶体在体内被加工成胞质溶胶中的一系列较小肽。使用可通过蛋白酶体加工成各种不同的较短肽的较长多肽的优势是可用一种受限于特定HLA类别的超过8-10个氨基酸的肽靶向更多的HLA类别。
a)令人惊讶的是，本发明的一些肽以足够高的亲和力与MHC分子结合以使置换变得不必要并且在本文被呈递时备用作抗原。优选地，本发明的疫苗组合物包含以下中的一种或多种：外显子9突变CALR蛋白(SEQ ID NO：10)、JAK2V617F突变蛋白(SEQ ID NO：6)，其多肽片段(SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：17)，以及全长和部分长度外显子9突变CALR或JAK2V617F的变体、功能同系物，外显子9突变CALR或JAK2V617F的连续肽和这些的功能同系物。更优选地，所述疫苗组合物包含表1中列出的任意序列。非常优选地，所述疫苗组合物包含肽SEQ ID NO：16(CALR378-411)、SEQ ID NO：2(CALR367-396)、SEQ ID NO：3(CALR383-411)、SE 10NO：14(CALR378-411)、SEQ ID NO：15(CALR373-393)、SEQ ID NO：1(CALR376-411)、SEQ ID NO：17(CALR367-411)或SEQ ID NO：7(JAK2610-618)。
本发明的肽的一个显著特征是其识别或引起产INF-γ的应答T细胞(即PBL群体中的特异性识别APC或患有癌症和/或感染的个体的肿瘤/瘤细胞(靶细胞)上的特定肽的细胞毒性T细胞(CTL))的能力。通过对来自个体的的PBL、PBMC、APC或肿瘤细胞进行ELISPOT测定，可容易地确定该活性。在所述测定之前，通过使细胞与待测试的肽接触来刺激待测细胞可能是有利的。优选地，所述肽能够以至少1个/104PBL的频率(例如以至少1个/104PBMC的频率)引起或识别产INF-γ的T细胞，如本文所用的ELISPOT测定法所确定的。更优选地，所述频率是至少5个/104PBL、最优选至少10个/104PBL，例如至少50或100个/104PBL。例如，所述频率是至少5个/104PBMC、最优选至少10个/104PBMC，例如至少50或100个/104PBMC。
所述ELISPOT测定代表了监测特异性针对外显子9突变CALR肽或JAK2V617F肽的T细胞应答的强有力工具。本文的发现的主要影响是本发明的肽被表达并与表达外显子9突变CALR或JAK2V617F的癌细胞上和/或APC上的HLA分子复合。这使得这些癌细胞易受CTL破坏，并强调CALR免疫对抗癌症和骨髓增生性疾病的有效性。来自黑色素瘤患者的PBL中的针对HLA限制性CALR衍生肽表位的自发性CTL应答的出现显示CALR免疫原性活性肽的免疫治疗潜力。
在本发明的一个实施方案中，本发明的肽能够在个体的PBL群体中引起产INF-γ的细胞，所述个体患有临床病症——其中表达突变的CALR，例如SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或其与SEQ ID NO：10具有至少70％的同一性的功能同系物，或患有临床病症——其中表达突变JAK2V617F，例如SEQ ID NO：6的JAK2V617F。所述临床病症优选是增生性病症，例如骨髓增生性病症，优选恶性骨髓增生性病症。
个体
待用本发明的疫苗组合物治疗的个体是患有临床病症的个体。所述个体优选为哺乳动物物种，最优选为人。所述个体可以是任何年龄，年轻或年老，并且可以是男性或女性。所述个体所患有的临床病症可能是肿瘤性疾病，例如骨髓增生性疾病或癌症。
本发明的一个实施方案提供了用于治疗癌症、降低癌症风险、稳定或预防癌症的疫苗。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗疾病、降低其风险、稳定或预防疾病的疫苗，所述疾病由感染(例如微生物或病毒感染)引起。
骨髓增生性疾病
本发明的疫苗组合物可用于预防临床病症、降低临床病症的风险或治疗临床病症。优选地，所述临床病症与外显子9突变CALR和/或突变JAK2V617F的表达相关或由其表征。所述外显子9突变CALR可以是如SEQ ID NO：10中所鉴定的外显子9突变CALR，或者可以是以其野生型形式与其具有至少70％的同一性的同系物，但是不是必须具有功能。所述外显子9突变体可以是Nangalia et al.，的p.2400，图3，A部分中所列的任意突变体。例如，所述外显子9CALR突变体可以是L367fs＊46(SEQ ID NO：10中所示的全长)，E370fs＊43、E370fs＊48、L367fs＊48、L367fs＊44、K368fs＊51、L367fs＊52、R366fs＊53、E371fs＊49、K368fs＊43、E370fs＊37、D373fs＊47、K374fs＊53、E371fs＊49、K385fs＊47、K385fs＊47、R376fs＊55、K385fs＊47或E381fs＊48。JAK2V617F可以是SEQ ID NO：6中所鉴定的JAK2V617F突变体，或者可以是以其野生型形式与其具有至少70％的同一性的同系物，但是不是必须具有功能。由此可理解，患有临床病症的个体中外显子9突变CALR或突变JAK2V617F的表达水平(所述表达为例如hnRNA、mRNA、前体蛋白、完全加工的蛋白的表达)与未患有临床病症的个体中的相同或比其高。
在本发明的一个实施方案中，所述临床病症是增生性疾病，例如骨髓增生性疾病，例如癌前病变或肿瘤疾病。在本发明的一个优选实施方案中，所述临床病症是癌症。癌症(恶性肿瘤)是一类疾病，其中一组细胞表现出不受控制的生长特征(生长和分裂超出正常极限)、侵入(入侵和破坏邻近组织)、以及有时转移(经由淋巴或血液扩散到体内其他部位)。癌症的这三种恶性特征将它们与良性肿瘤区分开来，所述良性肿瘤是自限性的，不会侵入或转移。大多数癌症形成肿瘤，但一些癌症，如白血病，则不会。
可被治疗或预防的骨髓增生性肿瘤的非限制性组包括原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化和急性或慢性髓性白血病。
在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物能够在受试者中引起临床反应，其中所述临床反应可以以稳定的疾病为表征，在优选的实施方案中，所述临床反应可以以部分反应为表征或优选所述临床反应可以以疾病(如癌症)的完全缓解为表征。
在本发明的一方面，所述疫苗组合物能够在个体中引起临床反应。在一个实施方案中，所述临床反应可以以稳定的疾病(没有进一步恶化或进展)为表征，在优选的实施方案中，所述临床反应可以以部分反应为表征或优选所述临床反应可以以疾病(如癌症)的完全缓解为表征。所述临床反应可以如下文所述确定。
在本发明的另一方面，所述疫苗组合物能够在受试者中引起临床反应，其中所述临床反应以最大定向瘤的最长直径之和的降低为表征。可以如下文所述确定降低。
欧洲白血病网MPN原发性血小板增多症反应标准：
临床-血液学反应：
-完全反应：
1.外周血中血小板浓度＜400×109/L
2.无疾病相关症状
3.通过计算机断层扫描或超声波检查评估的肝脏和脾脏的正常大小。
4.外周血中白细胞浓度＜10×109/L
-部分反应：未达到完全反应的标准，但外周血中的血小板浓度＜600×109/L或血小板计数减少了＞基线值的50％。
-无反应：未达到完全或部分反应的标准。
分子反应：
-完全反应：不可测量的特定的分子异常
-部分反应：(对于突变等位基因负荷＞10％的患者)。对于基线突变等位基因负荷＜50％的患者，突变等位基因负荷减少＞50％。对于基线突变等位基因负荷＞50％的患者，突变等位基因负荷减少＞25％。
-无反应：未达到完全或部分反应的标准。
组织学反应：被定义为无巨核细胞增生的骨髓中的缓解。
欧洲白血病网MPN真性红细胞增多症反应标准：
临床-血液学反应：
-完全反应：
1.血细胞比容＜45％，未使用静脉切开术
2.外周血中血小板浓度＜400×109/L
3.无疾病相关症状
4.通过计算机断层扫描或超声波检查评估的肝脏和脾脏的正常大小。
5.外周血中白细胞浓度＜10×109/L
-部分反应：未满足完全反应的标准的患者：
1.血细胞比容＜45％，未使用静脉切开术或
2.上述三个或更多个标准中的反应。
-无反应：未满足完全或部分反应的标准。
分子反应：
-完全反应：不可测量的特定的分子异常(例如，JAK2V617F突变等位基因负荷)
-部分反应：(对于突变等位基因负荷＞10％的患者)。对于基线突变等位基因负荷＜50％的患者，突变等位基因负荷减少＞50％。对于基线突变等位基因负荷＞50％的患者，突变等位基因负荷减少＞25％。
-无反应：未达到完全或部分反应的标准。
按照Tefferi et al.，在Blood，2013中所述的标准评估针对骨髓纤维化的反应(Tefferi et al.，修订的脊髓纤维化的反应标准：国际工作组-骨髓增生性肿瘤研究和治疗(IWG-MRT)和欧洲白血病网(ELN)共识报告。Blood.2013，122；(8)：1395-1398)。
预期本发明的疫苗组合物在被给药至患有与外显子9突变CALR和/或JAK2V617F的表达相关的疾病的个体时能够引起针对疾病的免疫应答，所述疾病与外显子9突变CALR(例如SEQ ID NO：10的突变CALR或其与SEQ ID NO：10具有至少70％的同一性的功能同系物)的表达相关，或与SEQ ID NO：6的突变JAK2V617F或其与SEQ ID NO：6具有至少70％的同一性的功能同系物的表达相关。本发明的疫苗组合物能够在经接种的个体中引起对表达外显子9突变CALR和/或突变JAK2V617F的肿瘤细胞、APC具有细胞毒性作用的效应T细胞的产生和/或在受试者的肿瘤基质中诱导抗原特异性T细胞的浸润。
除了它们在PBL群体中引起免疫应答的能力之外，还预期本发明的肽能够原位(即在实体瘤组织中)引起细胞溶解性免疫应答。例如，这可以通过提供HLA-肽复合物(例如被多聚化并提供有可检测的标记)，并使用这种复合物进行免疫组织化学染色以在肿瘤组织中检测与本发明的表位肽反应的CTL来证明。因此，本发明的肽的其他显著特征是其能够在肿瘤组织中原位检测与表位肽反应的CTL。
还考虑到，本发明的肽，除了它们结合HLA分子的能力——导致在细胞表面上呈递HLA和肽的复合物，该复合物转而充当表位或细胞溶解性T细胞的靶标，还可引起其他类型的免疫应答，例如导致产生针对复合物的抗体和/或延迟型超敏反应(OTH)的B细胞应答。后一种类型的免疫应答被定义为在注射本发明的肽的位点处的发红和明显的硬结。
本发明的一个目的是提供一种免疫组合物，其包含SEQ ID NO：10的CALR的外显子9突变体或SEQ ID NO：6的突变JAK2V617F、或与SEQ ID NO：10具有至少70％的同一性的外显子9突变CALR的功能同系物，或JAK2V617F的与SEQ ID NO：6具有至少70％的同一性的功能同系物，或包含所述外显子9突变CALR或JAK2V617F的连续序列的免疫原性活性肽片段或所述其功能同系物或编码所述外显子9突变CALR或JAK2V617F或所述肽片段的核酸；以及佐剂，其用于预防骨髓增生性疾病(特别是恶性骨髓增生性疾病)、降低其风险或治疗该疾病。
癌症组合治疗
在某些情况下，将本发明的治疗方法与其他癌症治疗(例如化疗、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗)组合是合适的。
本发明公开的基于CALR或JAK2的免疫疗法与细胞毒性化疗和/或另一种抗癌症免疫疗法治疗的组合是治疗癌症的有效方法。这些补救措施在本文中也称为“第二活性成分”。
与本发明的疫苗组合物共给药(按顺序或同时)相关的抗肿瘤剂或化疗剂的实例包括但不限于：全反式视黄酸、辅酶B12(Actimide)、阿那格雷(Anagrelide)、阿扎胞苷(Azacitidine)、白消安(Busulphan)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、柔红霉素(Daunorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊苷(Etoposide)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、亮丙瑞林(Leucovorin)、氮芥(Mechlorethamine)、马法兰(Melphalan)、巯基嘌吟(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、聚乙二醇化干扰素-α(Pegylated Interferon-alpha)、培美曲塞(Pemetrexed)、瑞复美(Revlimid)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、Valrubicin、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、伏立诺他(Vorinostat)和长春瑞滨(Vinorelbine)。在一个实施方案中，用于本发明药剂组合的化疗剂本身可以是不同化疗剂的组合。合适的组合包括FOLFOX和IFL。FOLFOX是一种组合，其包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和奥沙利铂。IFL治疗包括伊立替康、5-FU和甲酰四氢叶酸。
另一种第二活性成分可以是激酶抑制剂，用于分开、同时或组合用于肿瘤的治疗中。在这方面，酪氨酸激酶抑制剂-鲁索替尼-可能是一种选择。合适的激酶抑制剂包括已被证明具有抗肿瘤活性的那些(例如吉非替尼(易瑞沙)(gefitinib(Iressa))和厄洛替尼(特罗凯)(erlotinib(Tarceva)))，并且这些可以与肽联合使用。受体酪氨酸激酶抑制剂(例如已被证明可有效治疗肾细胞癌的苹果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)和索拉非尼(Sorafenib))也适合用作第二活性成分。
第二活性成分的其他实例是免疫刺激物质，例如，细胞因子和抗体。例如细胞因子可以选自但不限于：GM-CSF、I型IFN、白细胞介素21、白细胞介素2、白细胞介素12和白细胞介素15。所述抗体优选是免疫刺激性抗体，例如抗CD40、抗PD1抗体或抗CTLA-4抗体。所述免疫刺激物质也可以是能够耗尽免疫抑制细胞(例如调节性T细胞)或因子的物质，所述物质可以是例如E3泛素连接酶。E3泛素连接酶(HECT、RING和U-box蛋白)已经成为免疫细胞功能的关键分子调节剂，并且每一种都可能通过靶向特异性抑制分子进行蛋白水解破坏而参与感染期间免疫应答的调节。现在有几种HECT和RING E3蛋白还与免疫自身耐受的诱导和维持有关：c-Cbl、Cbl-b、GRAIL、Itch和Nedd4各自负调节T细胞生长因子产生和增殖。
在一个实施方案中，将包含CALR衍生的多肽或JAK2衍生的多肽的本发明的疫苗组合物——其中所述多肽衍生自CALR的外显子9突变体或衍生自JAK2V617F——与第二活性成分(例如免疫刺激物质)组合给药。所述免疫刺激物质优选为白细胞介素，例如聚乙二醇化干扰素-α、IL-21或IL-2或化疗剂。在一些实施方案中，在给药疫苗组合物之前，用IFN-γ处理靶细胞。在一些实施方案中，在给药疫苗组合物之前将IFN-γ给药至待治疗的受试者。
除了衍生自外显子9突变CALR或JAK2V617F的多肽之外，本发明的疫苗组合物还可包含一种或多种额外的抗原。所述抗原可以是例如衍生自癌相关蛋白的免疫原性活性肽。
因此，除了衍生自外显子9突变CALR或JAK2V617F的多肽和/或其免疫原性活性肽片段之外，本发明的疫苗组合物还可以包含以下中的一种或多种：
1)吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)
2)IDO的免疫原性活性肽片段
3)1)或2)的功能同系物
4)包含1)、2)或3)的多肽
5)编码1)、2)、3)或4)中任一项的核酸。
所述IDO尤其可以是WO 2009/143843中的SEQ ID NO：1的IDO、WO 2009/143843中的SEQ ID NO：13的IDO、WO 2009/143843中的SEQ ID NO：14的IDO、WO 2009/143843中的SEQID NO：15的IDO或WO 2009/143843中的SEQ ID NO：1的IDO。可以包含在本发明的疫苗组合物中的IDO的有用的免疫原性活性肽片段描述于WO 2009/143843中。
除了衍生自外显子9突变CALR或JAK2V617F的多肽和/或其免疫原性活性肽片段之外，本发明的疫苗组合物还可以包含以下中的一种或多种：
1)PD-L 1
2)PD-L1的免疫原性活性肽片段
3)1)或2)的功能同系物
4)包含1)、2)或3)的多肽
5)编码1)、2)、3)或4)中任一项的核酸。
所述PD-L1尤其可以是WO2013/056716中的SEQ ID NO：1的PD-L1。可以包含在本发明的疫苗组合物中的PD-L1的有用的免疫原性活性肽片段描述于WO2013/056716中。
除了衍生自外显子9突变CALR或JAK2V617F的多肽和/或其免疫原性活性肽片段之外，本发明的疫苗组合物还可以包含以下中的一种或多种：
1)色氨酸2，3-双加氧酶(TDO)
2)TDO的免疫原性活性肽片段
3)1)或2)的功能同系物
4)包含1)、2)或3)的多肽
5)编码1)、2)、3)或4)中任一项的核酸。
所述TOO尤其可以是本发明人提交的悬而未决申请“包含色氨酸2，3-双加氧酶或其片段的疫苗组合物”中的SEQ ID NO：1的TDO。可以包含在本发明的疫苗组合物中的TDO的有用的免疫原性活性肽片段描述于所述悬而未决的申请中。
药物组合物
本发明涉及能够在个体中治疗临床疾病、降低其风险和/或预防临床疾病的药物组合物，所述临床疾病与突变CALR，特别是外显子9突变CALR或突变JAK2，特别是JAK2V617F的表达相关。所述药物组合物尤其可以是疫苗组合物。本发明的疫苗组合物可以是“传统的”疫苗组合物，其包含抗原，例如蛋白多肽和/或核酸分子。它们也可以是包含细胞(例如源自个体并之后被加工的经修饰的细胞)的组合物的形式，或包含复合分子如抗体或TCR的组合物的形式。在具体的实施方案中，本发明的疫苗是包含本文所公开的肽或细胞的组合物的形式。
通常，疫苗是能够在个体中诱导免疫应答的物质或组合物。所述组合物可包含以下中的一种或多种：“活性成分”，例如抗原(例如蛋白、多肽、肽、核酸等)、包含一种或多种抗原以及其他元件的核酸构建体、细胞(例如负载的APC、用于过继转移的T细胞等)、复合分子(抗体、TCR和MHC复合物等)、载体、佐剂和药物载体。在下文中，更详细地公开了本发明的疫苗组合物的各种组分。
本发明的疫苗组合物在被给药至患有骨髓增生性疾病或MPN(导致外显子9突变CALR和/或突变JAK2V617F的表达)的个体时，能够引起针对肿瘤细胞或癌细胞、DC或APC的免疫应答，所述肿瘤细胞或癌细胞、DC或APC表达SEQ ID NO：10的外显子9突变CALR或其与SEQ ID NO：10具有至少70％的同一性的功能同系物，或表达SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其与SEQ ID NO：6具有至少70％的同一性的功能同系物。在一个优选的实施方案中，所述临床病症是急性或慢性髓性白血病。本发明的疫苗组合物能够在经接种的个体中引起对表达外显子9突变CALR和/或突变JAK2V617F的肿瘤细胞或癌细胞、APC和DC具有细胞毒性作用的效应T细胞的产生。在一些实施方案中，所述疫苗引起特异性识别本文所述的任意肽的效应T细胞的产生。所述疫苗组合物还能够在经接种的个体中引起特异性针对本公开内容的肽的肿瘤浸润性淋巴细胞的产生。
抗原和其他活性成分
基于蛋白/多肽的疫苗组合物
本发明的肽在本文被呈递时可备用作抗原。优选地，本发明的疫苗组合物包含以下中的一种或多种：
1)外显子9突变钙网蛋白CALR，其可以是本文在“钙网蛋白(CALR)”部分中描述的任何CALR，或JAK2突变体，特别是JAK2V617F，如在“Janus激酶2(JAK2)”部分中详述的；
2)外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段，其包含外显子9突变CALR或JAK2V617F的连续氨基酸序列，其可以是下文“外显子9突变CALR和JAK2V617F的免疫原性活性肽片段”部分中描述的任意肽；
3)外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段，其是MHC I类限制性肽片段或MHC II类限制性肽片段，例如在“MHC”部分中描述的任意MHC I类限制性肽片段或MHC II类限制性肽片段；
4)1)、2)和3)中的多肽的功能同系物；
5)包含1)、2)、3)和4)中的任意多肽的多肽，其可以是上文“包含外显子9突变CALR或JAK2V617F或其片段多肽”部分中描述的任意多肽；
6)编码1)、2)、3)和4)中的任意多肽的核酸。
对本发明的疫苗组合物中抗原的选择将取决于本领域技术人员可确定的参数。如所提及的，本发明的每种不同肽都通过特定的HLA分子呈递于细胞表面上。因此，如果将待治疗的受试者针对HLA表型进行分型，则选择已知与该特定的HLA分子结合的肽。或者，基于给定群体中多种HLA表型的普遍性来选择目的抗原。例如，HLA-A2是高加索人群中最普遍的表型，因此含有与HLA-A2结合的肽的组合物将在该群体的大部分中具有活性。此外，可根据表2中示出的锚定残基基序修饰本发明的抗原/肽，以增强与特定HLA分子结合。
本发明的组合物还可含有两种或更多种外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段的组合，所述肽片段为例如“外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段”、“包含外显子9突变CALR或JAK2V617F的多肽或其片段”和“MHC”部分中描述的任意肽。所述CALR或JAK2的免疫原性活性肽片段可各自与不同的HLA分子特异性地相互作用，以覆盖更大部分靶群体。因此，作为实例，所述药物组合物可含有受限于HLA-A分子的肽和受限于HLA-B分子的肽的组合，例如，包括那些对应于靶群体中HLA表型普遍性的HLA-A和HLA-B分子，例如HLA-A2和HLA-B35。另外，所述组合物可包含受限于HLA-C分子的肽。
在基于肽的疫苗的情况下，表位可以以“MHC-就绪(MHC-ready)”的形式给药，其能够通过外源负载呈递，而不依赖于宿主抗原呈递细胞的抗原摄取和加工。本发明的肽包含短的“MHC-就绪”形式的肽和需要蛋白酶体加工的较长形式的肽，由此提供了可以靶向多种肿瘤抗原的更复杂的疫苗组合物。疫苗靶向的不同HLA组越多，疫苗在不同人群中发挥作用的可能性就越大。
多表位疫苗组合物
本发明还涉及高度免疫原性多表位疫苗。优选地，应设计此类疫苗以促进同时递送任选地与其他合适的肽组合或彼此组合的外显子9突变CALR或JAK2V617F的最适合的免疫原性活性肽片段，和/或如下文所述的佐剂。本发明包括这样的多表位疫苗，其包含任选地与不属于或衍生自外显子9突变CALR或JAK2V617F的其他蛋白或肽片段组合的外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段，和/或如下文所述的佐剂。促使具有更复杂组成的疫苗的开发的一个重要因素是需要靶向多种肿瘤抗原，例如，通过设计包含或编码经仔细选择的CTL和Th细胞表位的集合的疫苗。因此，在一方面，本发明涉及包含I类和II类限制性外显子9突变CALR或JAK2V617F表位的疫苗组合物。
因此，本发明的肽包含短的′MHC-就绪′形式(I类限制性)的肽，以及需要蛋白酶体加工的较长形式(II类限制性)的肽。因此，本发明的组合物可以作为多表位疫苗提供，其包含如上文所定义的I类限制性表位和/或II类限制性表位。
基于核酸的疫苗组合物
本发明的疫苗组合物可包含编码CALR或JAK2多肽或其免疫活性肽片段的核酸。因此，所述核酸可编码任意上述蛋白和肽片段。所述核酸可以是例如DNA、RNA、LNA、HNA、PNA，优选所述核酸是DNA或RNA。
本发明的核酸可包含在任何合适的载体(例如表达载体中)。可获得很多载体，技术人员将能够为特定目的选择有用的载体。例如，所述载体可以以质粒、粘粒、病毒颗粒或人工染色体的形式存在。可以通过多种方法将合适的核酸序列插入到载体中，例如，可以使用本领域公知的技术将DNA插入到合适的限制性内切核酸酶位点中。除了本发明的核酸序列之外，所述载体还可包含一种或多种信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。所述载体还可包含额外的序列，例如增强子、多聚-A尾、接头、多接头、可操作的接头、多克隆位点(MCS)、终止密码子、内部核糖体进入位点(IRES)和用于整合的宿主同源序列或其他确定的元件。用于改造核酸构建体的方法是本领域公知的(参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook et al.，eds.，ColdSpring Harbor Laboratory，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。所述载体优选是表达载体，其包含与指导其在合适的细胞中的表达的调控核酸序列可操作地连接的核酸。在本发明的范围内，所述调控核酸序列通常应能够在哺乳动物细胞，优选人细胞，更优选在抗原呈递细胞中指导表达。
在一个优选的实施方案中，所述载体是病毒载体。所述载体也可以是细菌载体，例如减毒的细菌载体。可以使用减毒的细菌载体以在感染和持久性部位处诱导持久的粘膜免疫应答。可将不同的重组细菌用作载体，例如所述细菌载体可选自沙门氏菌属(Salmonella)、乳球菌属(Lactococcus)和李斯特菌属(Listeria)。通常，可显示针对异源抗原HPV16 L1或E7的免疫的诱导，在小鼠中具有强CTL诱导和肿瘤消退。所述载体还可包含编码T细胞刺激性多肽的核酸。
负载的(loaded)APC
在有用的实施方案中，通过如下给药本发明的肽来引起针对癌症疾病的免疫原性应答：通过将MHC I类或II类分子加载到来自个体的抗原呈递细胞(APC)上，通过从个体分离PBL并在将所述细胞注射回个体之前用所述肽孵育细胞，或通过从个体分离前体APC并在将细胞注射回个体之前使用细胞因子和抗原使所述细胞分化为专职APC。
因此，本发明的一方面是提供包含抗原呈递细胞的疫苗组合物，所述抗原呈递细胞包含CALR或JAK2或其免疫活性肽片段或编码所述蛋白或所述免疫活性肽片段的核酸。所述抗原呈递细胞可以是能够将抗原呈递给T细胞的任何细胞。优选的抗原呈递细胞是树突细胞。树突细胞(DC)可根据任何合适的方案制备并用于治疗方法，例如如下文所述。本领域技术人员将理解，可以采用该方案用于具有不同HLA类型和不同疾病的个体。
可将树突细胞(DC)用50μg/ml HLA限制性肽(以GMP质量合成)在37℃下脉冲1小时，并在第1天和第14天皮下给药5×106个细胞，随后每4周一次，在5次疫苗接种后进行额外的白细胞去除术。用于临床使用和质量控制的DC的产生可基本上如Nieolette et al.(2007)所述进行。
因此，在本发明的一个实施方案中，治疗患有以CALR或JAK2的表达为表征的临床病症的个体的方法——优选其中所述临床病症是骨髓增生性的，例如骨髓增生性癌症——是其中通过将肽离体呈递至个体的抗原呈递细胞(APC)，然后将如此处理的APC注射回所述个体来给药所述肽的方法。至少有两种替代方法可以进行此操作。一种替代方法是从个体中分离APC并将MHC I类分子与所述肽一起孵育(加载)。加载MHC I类分子意指将APC与肽一起孵育，以使具有特异性针对所述肽的MHC I类分子的APC与肽结合，从而能够将其呈递给T细胞。随后，将APC重新注射到个体中。另一种替代方式依赖于在树突细胞生物学领域中的最近的发现。在这种情况下，从个体分离单核细胞(作为树突细胞前体)并通过使用细胞因子和抗原使其在体外分化成专职APC(或树突细胞)。随后，用肽脉冲体外产生的DC并将其注射到个体中。
过继免疫治疗/过继转移
本发明的一个重要方面涉及在体外培养特异性针对外显子9突变CALR或JAK2V617F的T细胞并将这些T细胞过继转移至个体。过继转移意味着医师将已经能够产生特异性免疫应答的免疫系统的实际组分直接转移到个体中。如实施例中所示，可以在健康受试者中引起针对外显子9突变CALR或JAK2V617F或其肽片段的特异性免疫应答。
本发明的一个目的是提供特异性针对外显子9突变CALR或JAK2V617F的T细胞，其可用于例如过继转移。包含能够与外显子9突变CALR或JAK2V617F肽/MHC I类或外显子9突变CALR或JAK2V617F肽/MHC II类复合物特异性结合的T细胞受体的分离的T细胞可被过继转移至个体，所述T细胞优选为已经体外扩增的T细胞，其中所述外显子9突变CALR或JAK2V617F肽可以是上文提及的外显子9突变CALR或JAK2V617F的任意免疫原性活性肽片段。体外扩增T细胞的方法是技术人员公知的。本发明还涉及包括将T细胞给药至个体(例如患有癌症疾病的人)的治疗方法，所述T细胞包含能够特异性结合MHC限制性外显子9突变CALR或JAK2V617F肽复合物的T细胞受体，其中衍生自外显子9突变CALR或JAK2V617F的肽可以是上文提及的任意肽。本发明还涉及包含T细胞受体的T细胞用于制备治疗癌症或感染的药物的用途，所述T细胞受体能够特异性结合如本文所述的任意外显子9突变CALR或JAK2V617F或其肽片段。可以基本上如Walter et al.(1995)所述进行自体T细胞转移。在一些实施方案中，所述T细胞是细胞毒性T细胞，其特异性地识别外显子9突变CALR或JAK2V617F。
TCR转移
在另一个实施方案中，可以在过继转移之前照射这种T细胞以控制在个体中的增殖。通过TCR基因转移可对T细胞的特异性进行遗传改造(Engels et al.，2007)。这使得具有外显子9突变CALR肽特异性或JAK2V617F肽特异性的T细能够转移到个体中。通常，将T细胞用于过继性免疫疗法是有吸引力的，因为其允许T细胞在无肿瘤或无病毒的环境中的扩增，并在输注前分析T细胞功能。经TCR基因修饰的T细胞(例如用指导表达异源TCR的表达构建体转化的T细胞)在过继转移中的应用与T细胞系的转移相比具有以下几个优势：(i)重定向的T细胞的产生通常是适用的。(ii)可以选择或创建高亲和力或非常高亲和力的TCR并将其用于改造T细胞。(iii)可以使用允许稳定的TCR的更好的表面表达的经密码子优化的或鼠源化的TCR产生高亲和力T细胞。通过T细胞受体(TCR)基因转移对T细胞特异性进行的遗传工程可以基本上如Morgan et al.(2006)所述进行。
TCR转染
具有已知的抗肿瘤反应性的TCR可被遗传性地引入到原代人T淋巴细胞中。编码来自肿瘤特异性CTL克隆的TCRα和β链的基因可被转染到原代T细胞中，并以这种方式重编程具有针对肿瘤抗原的特异性的T细胞。通过电穿孔将TCR RNA转染到PBL中(Schaft et al.，2006)。或者，可使用逆转录病毒载体通过TCR基因转移以新的特异性提供T细胞(Morgan etal.，2006)。然而，来自逆转录病毒载体的原病毒可能随机整合到经转染的细胞的基因组中，随后干扰细胞生长。用TCR编码RNA电穿孔T细胞克服了这个缺点，因为RNA仅瞬时存在于经转染的细胞中，并且不能整合到基因组中(Schaft et al.，2006)。此外，细胞的转染通常用于实验室中。
佐剂和载体
本发明的疫苗组合物优选包含佐剂和/或载体。有用的佐剂和载体的实例在下文给出。因此，外显子9突变CALR或JAK2V617F多肽、外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段或其功能同系物，包含其的多肽或编码其的核酸可与佐剂和/或载体组合存在于本发明的组合物中。
佐剂是其与疫苗组合物的混合物增加或改变对外显子9突变CALR或JAK2V617F或外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段的免疫应答的任何物质(参见下文)。载体(例如多肽或多糖)是支架结构——外显子9突变CALR或JAK2V617F或其肽片段能够与其结合，并且其有助于特别是本发明的肽的呈递。
本发明的许多肽是相对小的分子，因此在本文所述的组合物中可能需需要将肽与多种材料(如佐剂和/或载体)组合以产生疫苗、免疫原性组合物等。广义定义的佐剂是促进免疫应答的物质。佐剂的一般讨论在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles&Practice(第2版，1986)的第61-63页中提供。Goding指出，当目的抗原具有低分子量或差的免疫原性时，推荐与免疫原性载体偶联。这种载体分子的实例包括匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白和禽免疫球蛋白。还已建议多种皂苷提取物可用作免疫原性组合物中的佐剂。已提出使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)——一种众所周知的细胞因子——作为佐剂(WO97/28816)。
载体可以独立于佐剂存在。载体的功能可以例如是增加特定肽片段的分子量以增加它们的活性或免疫原性，以赋予稳定性、增加生物活性、或增加血清半衰期。此外，载体可有助于将外显子9突变CALR或JAK2V617F蛋白、多肽、功能同系物或其肽片段呈递给T细胞。所述载体可以是本领域技术人员已知的任何合适的载体，例如蛋白或抗原呈递细胞。载体蛋白可以是但不限于匙孔血蓝蛋白、血清蛋白如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白、免疫球蛋白或激素如胰岛素或棕榈酸。对于人的免疫，所述载体必须是人类可接受的生理上可接受的载体并且是安全的。然而，在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载体。或者，所述载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖。
因此，本发明的一方面是将组合物中存在的外显子9突变CALR或JAK2V617F蛋白、或从其衍生的多肽片段、变体或肽与载体结合，所述载体为例如上述蛋白或抗原呈递细胞，例如树突细胞(DC)。
佐剂可以例如选自：AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)，二氧化硅，明矾，Al(OH)3，Ca3(PO4)，高岭土，碳，氢氧化铝，胞壁酰二肽，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰基-去甲酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，也称为nor-MDP)，N-乙酰基木聚糖-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，也称为MTPPE)，溶于2％角鲨烯/吐温-80.RTM.乳液的RIBI(MPL+TDM+CWS)，脂多糖及其各种衍生物包括脂质A，弗氏完全佐剂(FCA)，弗氏不完全佐剂，Merck佐剂65，多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)，来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蜡D，在棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)成员中发现的物质，Titermax，ISCOMS，Quil A，ALUN(参见US 58767和5,554,372)，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成的肽基质或GMDP，白细胞介素1，白细胞介素2，Montanide ISA-51和QS-21。与本发明一起使用的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂，例如Montanide佐剂(可从Seppic，Belgium获得)，优选Montanide ISA-51。其他优选的佐剂是基于细菌DNA的佐剂，例如包括CpG寡核苷酸序列的佐剂。其他优选的佐剂是基于病毒dsRNA的佐剂，例如poly I：C。咪唑并苯胺是优选佐剂的另一个实例。最优选的佐剂是适用于人类使用的佐剂。
Montanide佐剂(均可从Seppic，Seppic获得)可选自Montanide ISA-51、Montanide ISA-50、Montanide ISA-70、Montanide ISA-206、Montanide ISA-25、Montanide ISA-720、Montanide ISA-708、Montanide ISA-763A、Montanide ISA-207、Montanide ISA-264、Montanide ISA-27、Montanide ISA-35、Montanide ISA 51F、Montanide ISA 016D和Montanide IMS，优选选自Montanide ISA-51、Montanide IMS和Montanide ISA-720，更优选选自Montanide ISA-51。Montanide ISA-51(Seppic，Inc)是基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢的矿物油、可代谢的油或两者的混合物组合。使用含有CALR或JAK2或其肽片段的水溶液制备所述佐剂以用作乳液。所述表面活性剂是甘露醇油酸酯。QS-21(Antigenics；Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，MA)是一种高度纯化的水溶性皂苷，可作为水溶液处理。QS-21和MontanideISA-51佐剂可以在无菌的一次性小瓶中提供。
公知的细胞因子GM-CSF是本发明的另一种优选佐剂。GM-CSF已被用作佐剂十年了，并且可优选是WO 97/28816中所述的GM-CSF。
能够根据本发明使用的佐剂的所需功能列于下表中。
表3：佐剂的作用模式
Source：Cox，J.C.，和Coulter，A.R.(1997).Vaccine 15，248-56.
本发明的疫苗组合物可包含一种以上的佐剂。此外，本发明包括治疗组合物，其还包含包括任何上述物质或其组合的任意佐剂物质和/或载体。还预期CALR或JAK2蛋白，其变体或肽片段以及佐剂可以任何合适的顺序分开给药。优选地，本发明的疫苗组合物包含Montanide佐剂，例如Montanide ISA 51或Montanide ISA 720或GM-CSF佐剂。
因此，本发明包括治疗组合物，其还包含包括任何上述物质或其组合的佐剂物质。还预期抗原——即本发明的肽——和佐剂可以任何合适的顺序同时或分开给药。
剂量和给药
本发明的外显子9突变CALR或JAK2V617F或外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段在疫苗组合物中的量可根据具体应用而变化。然而，单剂量的肽组合物优选为约10μg至约5000μg，更优选约50μg至约2500μg，例如约100μg至约1000μg。特别地，在待治疗的个体是人的本发明的实施方案中，单剂量可以在外显子9突变CALR或JAK2V617F或外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段的50μg至500μg的范围内，例如在80μg至300μg的范围内，例如在100μg到250μg的范围内。通常，将所述疫苗组合物随时间重复给药。例如，可将所述疫苗组合物给药至少2次，优选至少5次，更优选至少10次，例如10至20次。也可将所述疫苗组合物连续给药。可以以任何有用的频率重复给药。因此，例如可将所述疫苗组合物每周给药一次，例如每两周一次，例如每3周一次，例如每月一次，例如每两个月一次，例如每三个月一次，例如每半年一次，例如每年一次。特别地，可将所述疫苗组合物连续给药。在所述时间期间，给药频率可改变。在一个实施方案中，将所述疫苗组合物每1至3个月连续给药一次。给药方式包括皮内、皮下和静脉内给药，以定时释放制剂形式植入等。本文包括本领域已知的任何和所有形式的给药。还包括本领域已知的适于配制可注射的免疫原性活性肽组合物的任何和所有常规剂型，例如含有(如果需要)常规可药用载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲组分等的冻干形式和溶液、悬浮液或乳液形式。
可使用本领域技术人员已知的任何常规方案制备和给药所述药物组合物。在实施例3-5中给出了本发明的疫苗组合物的制备的非限制性实例以及例如疫苗的给药的非限制性实例。本领域技术人员将理解，该方案可容易地被改造以适于本文所述的任何疫苗组合物。在本发明的其他实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有以CALR或JAK2的表达为表征的临床病症(例如骨髓增生性疾病，例如癌症)的个体。
可使用本领域技术人员已知的几种方法测定本发明组合物的免疫保护作用。也可通过免疫后DTH反应的发生和/或检测特异性识别疫苗组合物的肽的抗体来确定成功的免疫应答。
可将本发明的疫苗组合物以治疗有效量给药至个体。所述有效量可因多种因素(例如个人的状况、体重、性别和年龄)而变化。其他因素包括给药方式。
可将所述药物组合物通过各种途径(例如皮下、局部、口服和肌肉内)提供给个体。药物组合物的给药通过口服或胃肠外完成。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内(直接到组织)、肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给药。本发明的目的还在于提供适合的局部、口服、全身和肠胃外药物制剂以用于使用疫苗组合物预防和治疗的方法。
例如，可将所述疫苗组合物以例如片剂、胶囊(每种包括定时释放和持续释放制剂)、丸剂、粉末、颗粒、酏剂、酊剂、溶液、悬浮液、糖浆和乳液的口服剂型给药，或通过注射给药。同样地，也可将它们以静脉内(推注和输注)、腹膜内、皮下、有或没有栓塞的局部、或肌肉内形式给药，所有都使用制药领域普通技术人员公知的形式。包含任意本文所述的化合物的有效但无毒量的疫苗可用作预防剂或治疗剂。还包括本领域已知的适于配制可注射的免疫原性活性肽组合物的任何和所有常规剂型，例如含有(如果需要)常规可药用载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲组分等的冻干形式和溶液、悬浮液或乳液形式。
本发明的疫苗组合物的优选给药方式包括但不限于全身给药，例如静脉内或皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、鼻内给药、口服给药、直肠给药、阴道给药、肺部给药和通常任何形式的粘膜给药。此外，在本发明的范围内，用于本文提及的任何给药形式的手段都包括在本发明中。
本发明的疫苗可被给药一次或任何次数，例如两次、三次、四次或五次。一次以上的给药疫苗具有增强所得免疫应答的作用。通过以不同于先前给药的形式或身体部位给药疫苗，可进一步增强疫苗。加强注射是同源或异源加强注射。同源加强注射是其中第一次和随后的疫苗接种包含相同构建体以及更具体地相同递送载体特别是相同病毒载体的注射。异源加强注射是其中相同构建体包含在不同病毒载体中的注射。
第二活性成分
本发明的一方面是本文提供的疫苗组合物与第二活性成分组合使用。疫苗组合物和第二活性成分的给药可以是按顺序的或组合的。以上给出了用于癌症和感染的第二活性成分的实例。其他方面，疫苗组合物可与用于待治疗的给定临床病症的其他相关疗法组合使用。这类疗法可包括手术、化疗或基因疗法、免疫刺激物质或抗体；本领域技术人员能够确定用于给定场景的适当组合治疗。
在一些情况下，将本发明的治疗方法与其他医学治疗(例如化疗、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体和/或抗生素的治疗和使用树突细胞的治疗)相结合是合适的。
监测免疫
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物是疫苗组合物。因此，监测本发明疫苗组合物被给药至其的个体中的免疫是令人关注的并且是本发明的一方面。因此，所述药物组合物可以是能够引起针对癌症和/或感染的免疫应答的免疫原性组合物或疫苗。本文使用的表述“免疫原性组合物或疫苗”是指引起至少一种类型的针对表达外显子9突变CALR或JAK2V617F的细胞(例如恶性细胞或癌细胞、APC或DC)的免疫应答的组合物。因此，这种免疫应答可以是以下中的任一种：产生能够识别细胞表面上呈递的HLA/肽复合物的CTL的CTL应答，其导致细胞裂解，即该疫苗在经接种的受试者中产生对癌细胞具有细胞毒性作用的效应T细胞；引起抗癌抗体的产生的B细胞应答；和/或DTH类型的免疫应答。本发明的目的是通过在将本发明的组合物给药至个体之后监测任何上述反应来监测所述个体的免疫。
在一方面，本发明涉及监测免疫的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供个体的血液样本
ii)提供外显子9突变CALR或JAK2V617F或其肽片段，其中所述蛋白或肽可以是本文所述的任何蛋白或肽
iii)确定所述血液样品是否包含抗体或含有特异性结合所述蛋白或肽的T细胞受体的T细胞
iv)由此确定在所述个体中是否已经引起针对所述蛋白或肽的免疫应答。
所述个体优选是人，例如已用外显子9突变CALR或JAK2V617F或外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段或编码所述蛋白或肽的核酸免疫的人。
试剂盒
本发明还涉及包含以下的试剂盒：
·本文所述的任何疫苗组合物和/或
·外显子9突变CALR或JAK2V617F蛋白或其功能同系物和/或
·外显子9突变CALR或JAK2V617F的任何免疫原性活性肽片段、其功能同系物和/或本文所述的由其衍生的肽和/或
·编码以上两个项目符号下的蛋白的任意核酸以及如何使用该试剂盒的说明。
本发明还涉及包含以下的试剂盒：
·本文所述的任何疫苗组合物和/或
·外显子9突变CALR或JAK2V617F蛋白或其功能同系物和/或
·外显子9突变CALR或JAK2V617F的任何免疫原性活性肽片段、其功能同系物和/或本文所述的由其衍生的肽和/或
·编码以上两个项目符号下的蛋白的任意核酸以及第二活性成分。
优选地，根据待治疗的临床病症选择第二活性成分，以使在癌症待治疗的的情况下，在例如以上所列的化疗剂中选择第二活性成分。同样地，如果治疗微生物/病毒感染，所述第二种活性成分优选是抗生素和/或抗病毒剂。
所述试剂盒的组分优选包含在单独的组合物中，但是在本发明的范围内，所述试剂盒的所有组分都包含在相同的组合物中。因此，所述试剂盒的组分可以以任何顺序同时或按顺序给药。
序列表
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，但是这些实施例不应被解释为对本发明的限制。
实施例1-CALR
介绍
该研究旨在描述在患有CALR突变的慢性骨髓增生性肿瘤(MPN)的患者中针对CALR外显子9突变的自发性T细胞应答。这些T细胞应答针对跨越突变的CALR C-末端的两个重叠肽。
MPN患者对CALR Long 1和CALR Long 2肽的应答
该研究得到当地伦理委员会的批准，并且在参与研究之前根据赫尔辛基宣言所有患者都签署了知情同意书。本研究包括31名具有以下诊断结果的CALRmut MPN患者：ET(n＝13)，PMF(n＝12)，后-ET MF(n＝4)或前纤维变性MF(n＝2)。用Lymphoprep分离外周血单核细胞(PBMC)，并用10％二甲基亚砜在胎牛血清中冷冻。首先，使用高度敏感和固体干扰素γ(IFN-γ)酶联免疫斑点(ELISPOT)分泌测定仔细检查来自两名MPN患者的PBMC中针对两种CALR衍生肽，CALR Long1(RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARP，SEQ ID NO：2)和CALR Long2(TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA，SEQ ID NO：3)的自发性T细胞应答的存在(图1A和1C)。已经证明ELISPOT是研究中的关键测定，其重点在于通过表征来自癌症患者的PBMC中的新肿瘤抗原应答来鉴定新的肿瘤抗原。因此，该测定先前已用于基于癌症患者中的自发免疫鉴定新的肿瘤抗原(Andersen et al.，2005)。
所述ELISPOT测定基于在触发其T细胞受体时通过单个T细胞检测抗原诱导的细胞因子(最常见为IFN-γ)释放。可通过相应细胞因子在特定硝酸纤维素滤板上的结合来检测和定量单个T细胞的反应性。当T细胞识别所检查的肽表位时，T细胞释放可使用与第二细胞因子特异性抗体缀合的酶通过比色反应检测的细胞因子。反应产物作为斑点可见。理想地，每个斑点代表由单个活化细胞所分泌的细胞因子。如先前所述进行和分析ELISPOT(Muniret al.，2013)。以不同浓度测试PBMC以确保最佳应答。将由Moodie et al.描述的自由分布重采样方法用于统计学分析并且p值≤0.05被认为是T细胞应答(Moodie et al.，2010)。
在前两名患者中的有希望的应答之后，我们分析了另外29名CALR突变的MPN患者的PBMC。一些患者的PBMC显示出低活力；因此，我们能够分析18名患者中针对CALR Long 1和24名患者中针对CALR Long 2的应答。在24名可评估的患者中，10名患有ET，14名患有MF；后一组包括11名PMF患者、2名后-ET MF患者、1名前纤维变性MF患者。分析显示9名患者(50％)对CALR Long1(图1C)作出应答和10名患者(42％)对CALR Long2作出应答(图1D)；在这些患者中，6名(32％)对CALR Long 1和Long2均作出应答。为确认这些结果，我们对来自显示出针对CALR Long1的应答的9名患者中的5名的样品进行了额外的ELISPOT，并且在4名患者中确认了所述应答。同样地，我们在显示出针对CALR Long2的应答的10名患者中的5名中进行了补充ELISPOT，并且我们在4名患者中确认了所述应答。此外，我们在肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISPOT中检查了来自两名患者的PBMC。有趣的是，在这些患者之一中检测到显著的TNF-α应答(数据未示出)。
在整个疾病发展过程中，免疫系统与肿瘤密切相互作用。因此，虽然患有非晚期癌症的患者可维持针对癌症的免疫应答，但是在晚期阶段，癌症设法逃避免疫应答(Dunn etal.，2002)。ET和MF是从早期(ET)到晚期癌症阶段(MF)的生物连续体中MPN的不同阶段(Hasselbalch et al.，2009)。实际上，与其中14名中仅有5名(36％)产生了应答的MF患者相比，我们观察到ET患者中的更频繁的应答，10名中有8名(80％)显示出应答。通过Fisher精确检验，该差异是统计学显著的，p＝0.047。
应答不依赖于CALR突变类型
一些出版物已经证明，不同类型的CALR突变对疾病表型和预后具有不同的影响(Tefferi，Wassie et al.，2014；Cabagnols et al.，2015；Tefferi，Lasho et al.，2014)。因此，人们可能期望对CALR肽产生应答的患者中突变类型的偏斜(askewness)。在我们的24名可评估患者中，11名(46％)具有1型突变；其中5名表现出IFN-γ应答(45％)。9名患者(38％)具有2型突变；其中6名具有IFN-γ应答(67％)。4名患者(17％)既没有1型突变也没有2型突变，其中2名患者表现出IFN-γ应答(50％)。具有1型和2型突变的患者之间的应答差异没有达到统计学显著性(p＝0.41)，这表明突变类型不影响免疫系统对CALR突变反应的能力。
T细胞应答分析
接下来，我们选择使用细胞内细胞因子染色来分析来自4名具有针对CALR Long1和CALR Long2肽的应答的患者的PBMC。虽然这种方法不如ELISPOT灵敏，其允许阐明哪些免疫细胞分泌ELISPOT中鉴定的细胞因子。因此，我们可以确定所述反应细胞是否是T细胞，如果是，那么所述应答细胞是否是CD4 T细胞或CD8 T细胞。简言之，用CALR Long1或作为对照的加扰肽(MRRTMMMMMPRRRRRRKRRSKTRAPRMRK)刺激细胞。对于表面标志物，我们使用4μlNIR、10μl CD4 PerCP、2μl CD8 Pacific Blue和10μl CD3 FITC，并且对于细胞内染色，我们使用2μl与PE-Cy7或APC缀合的抗TNF-α和抗IFN-γ抗体。洗涤、透化和染色程序遵循先前描述的方法(Munir，Andersen et al.，2013)。细胞内细胞因子染色的结果证明了所分析的4名患者中2名中的应答。一名患者(C42)对CALR Long1产生应答，具有强烈的CD8 T细胞应答和更适度的CD4 T细胞应答(图2A)。另一名患者(C39)对CALR Long1(数据未示出)和CALRLong2产生应答，具有CD4 T细胞应答(数据未示出)。为确认所鉴定的应答确实是针对CALRLong 1的T细胞应答，我们使用先前描述的方法从C42患者产生树突细胞。用已经用CALRLong1脉冲的树突细胞刺激自体PBMC三次，由此产生CALR Long1特异性T细胞培养物。使用细胞内细胞因子染色，我们证明T细胞培养物对CALR Long1产生强烈的CD4 T细胞应答，以及稍弱的CD8 T细胞应答(图2B)。这些数据显示，在ELISPOT测定中鉴定的免疫应答实际上是针对突变的CALR肽的T细胞介导的应答。频繁检测T细胞应答表明，CALR突变编码高度免疫原性的癌抗原，其代表抗癌免疫疗法的理想靶标。
通常，在癌症免疫疗法中靶向突变抗原的主要限制是不同的患者显示不同的抗原。该问题不太可能限制靶向CALR外显子9突变的方法，因为所有CALR突变都共有36个氨基酸的共有序列。该短序列是设计可鉴定抗原肽的试剂的最佳大小。另外，在超过80％的患者中发现了这两个最频繁的突变类型(1型和2型)，并且这些类型共有额外的10个氨基酸共有序列(SEQ ID NO：11)。在本文，我们描述了两个CALR共有序列的免疫原性潜力；一个是1型和2型突变的共有序列(CALR Long1)，另一个是36个氨基酸末端序列的突变的泛CALR共有序列(CALR Long2)。最近，已证明CALR突变MPN的患者可具有几种类型的CALR突变(Jerominet al.，2016)，因此最重要的是免疫系统对34-氨基酸末端序列产生免疫应答，由此靶向所有CALR突变。因为我们描述了免疫系统同时靶向1型和2型突变(CALR Long1)和36-氨基酸共有序列(CALR Long2)，免疫系统实际上可能同时消除了主要的CALR突变克隆和其他亚克隆。因此，我们的结果表明CALR外显子9突变是癌症免疫疗法的可行靶标；例如，作为疫苗和过继细胞疗法的靶标。
实施例2
患者
使用Lymphoprep(Axis Shield，Oslo，Norway)分离患者外周血单核细胞(PBMC)，并用10％二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)在胎牛血清中冷冻。所述患者在参与研究前根据根据赫尔辛基宣言提供了签署的知情同意书，该研究得到了当地伦理委员会的批准。为了产生CALR Long1特异性T细胞培养物，我们选择使用来自具有针对CALR Long 1表位的强CD8+T细胞应答和更温和的CD4+T细胞应答的患者的细胞。所述患者是74岁男性高加索人，其CALR 33型突变由5bp插入组成。在被纳入该项目之前，该患者被诊断患有ET 18年。诊断后14年，一项新的骨髓活检显示该患者已发展为原发性血小板增多症后骨髓纤维化。在进行用于该项目的取样时，将所述患者用阿那格雷进行治疗。
肽
我们选择使用由KJ RossPetersen，Klampenborg，Oenmark或Schafer-N，Copenhagen，Oenmark提供的以下肽：CALRLong1(RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARP，SEQ IDNO：2)、CALRLong2(TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA，SEQ ID NO：3)、CALRLong3(KMRMRRMRRTRRKMRRKMSP，SEQ ID NO：15)、CALRLong4(RRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA，SEQ ID NO：1)和CALRLong5(RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA，SEQID NO：17)。作为阴性对照，我们使用以下两个加扰肽之一：MRRTMMMMMPRRRRRRKRRSKTRAPRMRK(SEQ ID NO：8)或TSMMRRRRRRKRRKMMKRM(SEQ ID NO：18)。
特异性针对CALRmut表位的T细胞培养物的产生
首先使用MACS CD14 MicroBeads(Miltenyi Biotech GmbH，Bergisch Gladbach，Germany)富集新鲜PBMC的CD14+细胞。这被认为是第0天。将所得的单核细胞耗尽的细胞培养物称为外周血淋巴细胞(PBL)。使用CellGro(CellGenix GmbH，Freiburg，Germany)培养经富集的细胞，并用GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(250U/ml)(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)刺激。第二天，为了产生快速树突细胞(fastDC)，我们用包含IFN-γ(1000U/ml)(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)、PolyI：C(20μg/ml)和CALR Long1肽的熟化混合物处理一半的经富集的细胞。将PBL在X-VIVO培养基中培养过夜(Lonza Group Ltd.，Basel，Switzerland)，然后用一半的fastDC刺激。将fastDC的另一半冷冻以备之后使用。
将另一半经富集的细胞培养至第7天，此时用与上述相同的熟化混合物处理这些细胞，以产生成熟的树突细胞(mDC)。第二天，将这些mDC用于刺激PBL。在第9天，加入IL-2(120U/mL)(Novartis，Basel，Switzerland)和IL-7(40U/ml)(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)。在第14天，我们解冻了在第2天已冷冻的fastDC，并使用这些细胞刺激PBL。在第16天和第24天，我们加入上述浓度的IL-2和IL-7。
IFN-γ富集和CD4+T细胞克隆
在T细胞培养的第38天，我们用CALR Long1肽刺激T细胞4h，然后使用MACS IFN-γ分泌测定法分离IFN-γ分泌细胞。使用快速扩增方案扩增经分离的细胞。对CALRLong1肽刺激起反应的绝大多数细胞是CD4+T细胞；因此，我们使用EasySep Human CD4分离试剂盒(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC，Canada)从REP培养物中分离CD4+T细胞。然后通过有限稀释法克隆经富集的CD4+T细胞，并使用饲养细胞(feeder cell)和高剂量IL-2(6000u/ml)快速扩增生长的T细胞克隆。如前所述，通过变性梯度凝胶电泳进行克隆细胞的T细胞受体克隆分型。
靶细胞
作为靶细胞，我们使用自体CD14+单核细胞和B细胞(BCL)。如上所述，使用MACSCD14 MicroBead试剂盒分离CD14+单核细胞。使用Health Protection Agency CultureCollections，Salisbury，UK处的供体BCL的EBV转染产生自体B细胞系。
细胞内细胞因子染色
在测定前一天解冻经冷冻的T细胞，并且在检查CD107a表达的实验中，在加入肽或靶细胞后直接将CD107a-PE抗体加入细胞中。刺激1小时后，将蛋白转运抑制剂Brefeldin A(BD Biosciences，SanJos é，CA，USA)加入细胞中，然后刺激细胞4h。将细胞用CD3-APC-H7、CD4-FITC、CD8-PerCP、IFN-γ-APC、TNF-α-BV421和Fixable Viability Stain 510(BDBiosciences，SanJosé，CA，USA)染色、用透化试剂/稀释剂和固定透化缓冲液(AHDiagnostics，Aarhus，Denmark)透化并洗涤。使用FACS Canto II(BD Biosciences)获得细胞，并使用FACSDiva软件分析。如果没有其他说明，在一式三份孔中运行所有的效应细胞刺激。
siRNA介导的CALR沉默
在反义链中具有3′-末端dT突出端的用于靶向沉默CALR的沉默子siRNA双链体获自Invitrogen(Invitrogen，Paisley，UK)。所述CALR siRNA双链体由有义序列GGAGCAGUUUCUGGACGGATT(SEQ ID NO：19)和反义序列UCCGUCCAGAAACUGCUCCTT(SEQ ID NO：20)组成。将沉默子siRNA双链体重悬于无RNase的水中至浓度为25μM，随后在保存在-20℃下。
将自体CD14+单核细胞与CellGro、GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(250U/mL)一起培养，第二天用CALR siRNA或阴性对照siRNA(Invitrogen)转染，使用之前所述的电穿孔参数(Met et al.，2011)。简言之，将单核细胞洗涤两次，悬浮在Opti-MEM培养基(Invitrogen)中并调节至终细胞密度为107个细胞/ml。将细胞悬浮液(200μl)在冰上预孵育5分钟，随后与5μl CALR siRNA或10μl阴性对照siRNA一起转移至2mm间隙电穿孔并使用BTX 830方波电穿孔仪(Harvard Apparatus，Holliston MA，USA)脉冲。将电穿孔设置调节为单个脉冲，250V，2ms。电穿孔后立即转移单核细胞至预热的具有1000U/ml GM-CSF和250U/mlIL-4的CellGro。孵育经电穿孔的单核细胞并用于如文中所述的实验分析。将用FITC siRNA(BDBiosciences，SanJosé，CA，USA)转染的单核细胞的流式细胞术分析用于确保适当的转染效率。
结果
CALRLong1特异性T细胞识别数个CALRmut表位
我们建立了来自具有针对CALRLong1肽的强CD8+T细胞应答的CALRmut患者的CALRLong1特异性T细胞培养物。用自体树突细胞刺PBL三次，并使用细胞内细胞因子染色(ICS)分析T细胞。令人惊讶的是，CD8+T细胞对CALRLong1未显示出应答(数据未示出)。然而，CD4+T细胞对CALRLong1作出应答(图7)。接下来，我们研究了这些CALRLong1特异性T细胞是否能够识别CALRmut C-末端中的其他表位。在用CALRLong3、CALRLong4和CALRLong5刺激时T细胞作出反应(图7)，而用CALRLong2刺激时T细胞没有作出应答(图7)，表明所述应答是针对突变序列的开始部分。由于CALRLong4肽包含在所有CALRmut患者中发现的共有的36个氨基酸C-末端，我们在48小时测定中测试了来自供体的PBMC的自发性离体ELISPOT应答。尽管背景很高，我们发现该患者中的对CALRLong4肽的显著应答，如Moodie et al.(2010)提供的规则所定义的(未示出)。
高度富集的CALRLong1特异性CD4+T细胞的克隆
为了获得更高纯度的CALRLong1特异性CD4+T细胞群，我们使用MACS IFN-γ分泌测定法富集CALRLong1特异性T细胞。这增加了CALRLong1特异性CD4+T细胞的比例(图8A)。由于几乎40％的CD4+T细胞对CALRLong1肽产生应答，我们接下来在培养物中富集CD4+T细胞并建立CALRLong1特异性CD4+T细胞克隆。我们使用ICS证明CD4+T细胞培养物之一对CALRLong1具有100％特异性(图8A)。通过流式细胞术进行的免疫表型分析显示培养物是纯CD4+T细胞培养物(图8B)，并且对CD4+CALRLong1特异性T细胞的T细胞受体克隆分型证实T细胞是克隆(数据未示出)。
CALRLong 1特异性T细胞在用自体CALRmut细胞刺激时被激活
为了评估CALR外显子9突变是否可被免疫系统靶向，至关重要的是证明CALRLong1特异性T细胞识别并在被CALRmut细胞刺激时被激活。作为靶细胞，我们使用通过PCR分析确定的具有71％CALRmut等位基因负荷(allelic burden)的CD14+单核细胞和具有0％CALRmut等位基因负荷的自体EBV转化的永生化B细胞。CALRLong1特异性T细胞在用自体CD14+单核细胞刺激时被激活，其中约80％的T细胞以1：1的效应物：靶标比分泌细胞因子(图9A)。以相同的效应物：靶标比用B细胞进行的刺激导致1.7％的T细胞分泌细胞因子(图9C)。此外，当效应物：靶标比为3∶1时，较少的T细胞被激活(图9B)。对靶细胞的纯度分析显示CD14+单核细胞的高度富集(图9D)。
通过CALRmut靶细胞的T细胞活化依赖于通过靶细胞的抗原呈递
为证明T细胞识别和活化依赖于突变CALR抗原的呈递，我们决定在评估之前用IFN-γ(300U/ml)刺激靶细胞24h以增强抗原呈递。用IFN-γ刺激CALRmut单核细胞显著增强了T细胞活化，但在用经IFN-γ处理的B细胞刺激的T细胞中没有观察到活化的变化(图10A)。接下来，我们如材料和方法中所述用CALR siRNA转染自体CD14+分选的骨髓细胞。与阴性对照相比，转染后48h用经siRNA转染的靶细胞刺激T细胞导致IFN-γ/TNF-α双阳性T细胞的比例降低近50％(图10B)。对用FITC-缀合的siRNA转染的骨髓细胞的流式细胞术分析(图10C)示出了适当的转染效率。
CALRmut特异性应答是HLA II限制性的，以HLA-DR作为限制元件
我们接下来研究了CALRmut特异性T细胞对CALRmut靶细胞的识别是否依赖于CD4-HLA II相互作用。在使用细胞之前，我们将CD14+单核细胞用HLA II阻断单克隆抗体(Tii39，BioLegend，San Diego，CA，USA)孵育30分钟。阻断靶细胞上的HLA II显著降低了活化T细胞的比例(图6A)。接下来，我们用HLA-DQ阻断抗体或HLA-DR阻断抗体(Abcam，Cambridge，UK)处理CALRLong1特异性T细胞20分钟，然后用CALRLong1肽刺激细胞。用HLA-DQ抗体处理的T细胞(图11B，中)与未用抗体处理的细胞被激活的一样多(图11B，上)。然而，在已用HLA-DR特异性抗体处理的T细胞中未观察到反应(图11B，下)。
CD4+CALRLong1特异性T细胞识别并通过自体CD34+细胞刺激被激活
已知CALR外显子9突变是早期突变事件，因此已显示CD34+造血干细胞也具有突变。因此，我们开始研究CD4+CALRLong 1特异性T细胞是否能够识别自体CD34+细胞。我们如上所述从新鲜吸出的骨髓和冷冻保存的CD14+耗尽的PBMC中富集CD34+细胞，并使用CD34+细胞作为靶细胞。由于靶细胞数量有限，以5∶1的效应物：靶标比一式两份地进行使用骨髓来源的CD34+细胞的实验。在用含5％人血清的X-VIVO中富集后，在将细胞静置48h后进行使用PBMC衍生的CD34+细胞的实验。与用阴性对照肽刺激(图12A，下)相比，骨髓来源的CD34+细胞确实能够以3∶1的效应物：靶标比激活CD4+CALRLong1特异性T细胞(图12A，上)。与用阴性对照肽刺激T细胞(图12C，下)相比，以5∶1的效应物：靶标比用PBMC衍生的CD34+细胞刺激T细胞显示出甚至更大量的活化T细胞(图12C，上)。如通过流式细胞术分析所分析的，富集的靶细胞的纯度＞50％(图12B和12D)。
CD4+CALRLong1特异性T细胞对展示CALRLong1表位的靶细胞具有细胞毒性
我们用CALRLong1肽或加扰对照肽脉冲自体B细胞。经CALRLong1脉冲的B细胞被特异性T细胞广泛识别(图13A)。接下来，我们检查了CD4+CALRLong1特异性T细胞是否对靶细胞具有细胞毒性。在标准Cr51-细胞毒性测定中，CD4+T细胞确实被证明对经CALRLong1脉冲的B细胞具有细胞毒性，在40∶1的效应物：靶标比下最大杀伤效应为45％(图13B)。此外，我们研究了用CALRLong1或加扰对照肽脉冲的B细胞刺激后CD4+CALRLong1特异性T细胞上脱粒标志物CD107a的表达，我们证明了CD107a在用CALRLong1肽刺激的T细胞上被上调(图13C)。同时，我们证明了CALRLong1特异性大量培养物中的一小部分CD4+T细胞在用CALRLong1肽刺激时确实上调CD107a(图13D)，证明大量培养物中的CD4+T细胞也具有细胞毒性能力。
实施例3
如实施例1中所述，通过IFN-γELISPOT分析来自健康供体的PBMC针对以下CARL-突变体表位的免疫应答：CALR Long1(RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARP)、CALR Long2(TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA)、CALR Long4(RRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA)和CALR Long5(RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQG WTEA)。健康供体显示出针对所有这些CALR突变表位的强免疫应答(图14、15、16、17)。
还使用TNF-αELISPOT分析健康供体对CALRLong1(图18A)和CALRLong2(图18B)的反应性，并且几个供体显示出针对肽的应答。值得注意的是，所有具有针对CALRLong1和CALRLong2的TNF-α应答的患者也在ELISPOT中显示出IFN-g应答(图14-15)。当使用细胞内细胞因子染色分析来自健康供体的细胞时，我们在几个供体中鉴定出针对CALRLong1肽的CD4+T细胞应答(未示出)。
在这些实验之后，我们得出结论，整个CALR-突变体C-末端确实具有免疫原性。然而，我们推测可能存在一部分突变序列比该序列的其余部分更具免疫原性。我们通过将整个44个氨基酸序列分成36个九聚体表位来搜索这种“免疫原性热点”。使用IFN-γELISPOT，我们研究了10个健康供体中针对这些36个九聚体表位的自发免疫应答。所有的健康供体都显示出至少一种针对CALR突变体九聚体表位之一的免疫应答，但显然大多数针对CALR突变表位的应答都局限于CALR-突变体C-末端的前半部分(图19)。为了阐明IFN-g释放细胞的表型，我们分析了五个对一些九聚体表位具有强烈应答的供体，并且再次，大多数应答是CD4+T细胞应答(图20)。然而，一个供体显示出针对肽B11的CD8+T细胞应答(图20)。
实施例4——JAK2
制备对突变JAK2肽VLNYGVCFC(SEQ ID NO：7)具有反应性的T细胞。先前描述了针对肽的特异性T细胞培养物的建立(Munir S，Andersen GH，et al.HLA-restrictedCTL that are specific for the immune checkpointligand PD-L 1 occur with highfrequency in cancer patients.Cancer Res.2013)。简言之，将来自HLA-A2阳性健康供体的外周血单核细胞(PBMC)用装载JAK201的自体树突细胞刺激，然后用IL-2、IL-7和IL-12刺激。树突细胞的产生遵循我们先前公开的方法。(Munir S，Andersen GH，etal.HLA-restricted CTL that are specific for the immune checkpoint ligand PD-L1 occur with high frequency in cancer patients.Cancer Res.2013)。将HLA-A2高亲和力结合表位HIV-1(ILKEPVHGV；SEQ ID NO：26)和JAK201(JAK201wt)野生型表位(VLNYGVCVC；SEQ ID NO：25)用作对照。这些细胞在响应突变JAK2肽时被激活，并且能够杀伤呈递突变JAK2肽的细胞。当用携带JAK2突变的癌细胞呈递时，T细胞也被激活，并且能够杀伤这些癌细胞。这取决于细胞表达突变的JAK2肽的能力，如用siRNA进行的实验所显示的(图6)。
首先通过ELISPOT分析T细胞的特异性。通过ELISPOT可以容易地检测到显著的IFN-γ和TNF-α的JAK201肽特异性释放(图21a)，表明T细胞确实对JAK201肽具有特异性。JAK201突变肽(SEQ ID NO：7)和JAK201野生型(SEQ ID NO：25)肽之间的唯一区别是缬氨酸至苯丙氨酸置换，随后，我们仔细检查了这两种肽之间可能的交叉反应性。使用ELISPOT，我们证明了与JAK201wt肽相比，特异性T细胞在用JAK201肽刺激时释放显著更多的IFN-γ以及TNF-α(图21b)。这通过ICS确认(未示出)。使用Cr51细胞毒性测定，我们观察到突变肽和野生型肽之间的一些交叉反应性。然而，特异性T细胞需要相比于JAK201肽的更高浓度的JAK201wt肽来被激活以杀伤靶细胞，证明了相比于JAK201wt肽，T细胞确实对JAK201肽具有更高的亲和力(图21c)。
接下来，使用标准Cr51细胞毒性测定，我们证明了CD8+JAK201特异性T细胞确实是细胞毒性效应细胞。因此，用JAK201或HIV对照肽脉冲TAP缺陷型T2细胞，并且仅表面上展示JAK201肽的细胞被T细胞杀伤(数据未示出)。我们进一步证明，对靶细胞的杀伤依赖于通过HLA-A2的JAK201呈递，因为特异性T细胞仅能识别用JAK201肽脉冲的经HLA-A2转染的K562细胞，而未用肽脉冲的经HLA-A2转染的K562细胞或用JAK201肽脉冲的经HLA-A3转染的K562细胞未被识别(图21d)。
接下来，我们检查了JAK201特异性T细胞识别和杀伤携带JAK2V617F突变的癌细胞的能力。UKE-1、SET-2和THP-1是HLA-A2阳性的急性髓性白血病癌细胞系。THP-1细胞是JAK2wt，而UKE-1细胞是JAK2V617F突变纯合的，SET-2是JAK2V617F突变杂合的。我们首先检查了JAK201特异性T细胞对UKE-1癌细胞系的反应。UKE-1细胞能够激活JAK201特异性T细胞，因为如通过ELISPOT所检测的，用UKE-1细胞对T细胞的刺激导致IFN-γ的释放(图22a)。此外，测定前2天已用100U/mlIFN-γ预处理的UKE-1细胞对JAK201特异性T细胞的刺激导致IFN-γ从T细胞甚至更多的释放(图22a)。已知IFN-γ诱导免疫蛋白酶体并上调细胞表面上的HLA I类，总体上增强了靶细胞的抗原呈递。接下来，将UKE-1细胞用作细胞毒性测定中的靶细胞，UKE-1细胞被JAK201特异性T细胞有效地裂解，并且用IFN-γ处理UKE-1细胞后裂解增强(图22b)。最初，SET-2细胞未被T细胞裂解，但在用IFN-γ刺激后，癌细胞同样被T细胞裂解(未示出)。
然后我们检查了JAK2V617F突变的细胞内表达对JAK201特异性T细胞识别靶细胞的重要性。因此，为了沉默JAK2V617F突变，我们用JAK2V617F siRNA转染UKE-1细胞，并将经转染的细胞用作靶细胞，并如之前所述使用空白转染的UKE-1细胞来比较识别。在反义链具有3′-末端突出dT碱基的用于靶向沉默JAK2V617F的沉默子siRNA双链体(对于双链体1，有义序列5′-GAGUAUGUUUCUGUGGAGATT-3′(SEQ ID NO：21)，反义序列5′-UCUCCACAGAAACAUACUCTT-3′(SEQ ID NO：22)；和对于双链体2，有义序列5′-GGAGUAUGUUUCUGUGGAGTT-3′(SEQ ID NO：23，反义序列5′-CUCCACAGAAACAUACUCCTT-3′(SEQID NO：24))获自Invitrogen(Invitrogen，Paisley，UK)。对于JAK2V617F沉默实验，使用如之前所述的电穿孔参数，用JAK2V617F siRNA转染UKE-1细胞。电穿孔后立即将UKE-1细胞转移至含有10％胎牛血清的预热的RPMI1640，置于培养箱中，并在转染后22h在标准Cr51细胞毒性测定中用作靶细胞。重要的是，消除了对经siRNA转染的UKE-1细胞的杀伤，而经空白转染的细胞仍然被JAK201特异性T细胞杀伤(图22c)。这表明靶细胞杀伤确实依赖于JAK2V617F突变的细胞内表达。作为另外的对照，我们在标准Cr51细胞毒性测定中观察到JAK201特异性T细胞不杀伤JAK2wt急性髓性白血病癌细胞系THP-1(数据未示出)。
最后，为证实对表达JAK2V617F突变的细胞的识别，我们用编码JAK2V617F突变的mRNA转染JAK2wt THP-1细胞，使用编码神经生长因子受体(NGFR)的mRNA作为对照，并将这些细胞在细胞因子释放和颗粒酶B测定中用作靶细胞。用PE缀合的抗-NGFR mAb转染后20h控制转染细胞中NGFR的表达并显示74％的细胞被转染。在ELISPOT测定中使用经转染的细胞作为靶细胞，我们能够证明与经NGFR转染的细胞相比，在响应经JAK2V617F转染的细胞时JAK201特异性T细胞特异性释放IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B(图22d)。超过50％的费城染色体阴性慢性MPN患者具有JAK2V617F突变。这种获得性体细胞突变仅在骨髓恶性肿瘤中发现，使其成为癌症特异性抗原。因此，JAK2V617F是癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。
在本研究中，我们研究了JAK2V617F是否被T细胞特异性识别。首先，我们建立了特异性针对跨越V617F突变的HLA-A2限制性JAK2肽的CD8+T细胞培养物。当用突变的JAK2肽刺激时和当用携带JAK2V617F突变的癌细胞刺激时，这些特异性T细胞释放TNF-α和IFN-γ。我们进一步证明特异性T细胞选择性杀伤具有JAK2V617F突变的癌细胞，并且用IFN-γ处理JAK2V617F突变的癌细胞增强了杀伤作用。重要的是，通过用JAK2V617F短干扰RNA转染下调JAK2V617F突变消除了T细胞介导的杀伤。最后，证实了对表达JAK2V617F突变的细胞的特异性识别，因为JAK2wt白血病细胞中JAK2V617F突变的敲入(knock in)刺激JAK201特异性T细胞分泌更多细胞因子和颗粒酶B。
总之，免疫系统能够有效靶向携带JAK2V617F突变的癌细胞，为特定癌症免疫治疗作为JAK2V617F的新治疗方式奠定了基础。因此，用JAK201肽进行疫苗接种或靶向JAK2V617F突变的过继细胞疗法可能是靶向JAK2V617F阳性的MPN的方法。可以改造T细胞以表达靶向突变靶标的经修饰的T细胞受体。然而，在利用该选择之前，必须进一步考虑突变和野生型JAK2表位之间的交叉反应性。
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Claims (110)

1.一种用于治疗或预防骨髓增生性疾病的方法的疫苗组合物，其包含：
a)以下中的一种或多种：
(i)包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：16的CALR的外显子9突变体，例如SEQ ID NO：10中示出的CALR的外显子9突变体；
(ii)如SEQ ID NO：10所示的外显子9突变CALR的免疫原性活性肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：10的第361至411位氨基酸中的至少一些；
(iii)由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1组成的免疫原性活性肽或其片段；
(iv)(i)、(ii)或(iii)中的多肽的功能同系物，其中所述功能同系物与SEQ ID NO：10具有至少70％的序列同一性，和/或所述功能同系物是由与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10的氨基酸的连续序列相同的序列组成的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸，例如最多两个氨基酸，例如最多一个氨基酸已被置换；
(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任意多肽的多肽；
(vi)编码(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中的任意多肽的核酸；
或
b)以下中的一种或多种：
(vii)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体；
(viii)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体的免疫原性活性多肽片段，所述片段包含至少第617位氨基酸；
(ix)(vii)和(viii)中的多肽的功能同系物，其中所述功能同系物与SEQ ID NO：6具有至少70％的序列同一性，和/或所述功能同系物是由与SEQ ID NO：6的氨基酸的连续序列相同的序列组成的免疫原性活性多肽，除了最多三个氨基酸，例如最多两个氨基酸，例如最多一个氨基酸已被置换，其中所述功能同系物包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸；
(x)包含(vii)、(viii)或(ix)中的任意多肽的多肽；
(xi)编码(vii)、(viii)、(ix)或(x)中的任意多肽的核酸，
所述疫苗组合物还包含佐剂。
2.权利要求1的疫苗组合物，所述疫苗组合物任选地还包含佐剂，其用作药物。
3.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段包含SEQ IDNO：10或其中最多3个氨基酸已被置换的其功能同系物的范围为8至50个，例如范围为8至40个，例如范围为8至29个氨基酸的连续序列或由所述连续序列组成。
4.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段包含SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：1或其中最多3个氨基酸已被置换的其功能同系物的范围为8至50个，例如范围为8至40个，例如范围为8至29个氨基酸的连续序列或由所述连续序列组成。
5.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段包含或由以下组成：
a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的范围为8至29个氨基酸的连续序列，或
b)SEQ ID NO：15的范围为15至20个氨基酸的连续序列；或
c)SEQ ID NO：1的范围为25至36个氨基酸的连续序列；或
d)SEQ ID NO：17的范围为39至44个氨基酸的连续序列；
e)或其功能同系物，其中最多2个氨基酸已被置换。
6.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段包含或由以下组成：
a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15的范围为8至11个氨基酸的连续序列，例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15的9至10个氨基酸的连续序列；或
b)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的范围为11至29，例如范围为15至29，例如范围为20至29个氨基酸的连续序列，例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的25至29个氨基酸的连续序列；或
c)SEQ ID NO：17的范围为29至44，例如范围为36至44，例如范围为29至36个氨基酸的连续序列，例如SEQ ID NO：17的40至44个氨基酸的连续序列；或
d)a)、b)或c)的功能同系物，其中最多两个氨基酸已被置换。
7.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物在给药至患有临床病症的个体时能够引起针对表达包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR的癌细胞和/或表达包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR的抗原呈递细胞的免疫应答，所述临床病症由包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR的表达来表征。
8.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在所述个体中引起细胞免疫应答。
9.权利要求8的疫苗组合物，其中所述细胞免疫应答特异性针对外显子9突变CALR。
10.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够引起特异性识别外显子9突变CALR的细胞毒性T细胞的形成。
11.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含特异性识别外显子9突变CALR的细胞。
12.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段由SEQ IDNO：6或其中最多3个氨基酸已被置换的其功能同系物的范围为8至50，例如范围为8至40，例如范围为8至29个氨基酸的连续序列组成。
13.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段由SEQ IDNO：7或其中最多2个氨基酸已被置换的其功能同系物的范围为8至9个氨基酸的连续序列其组成。
14.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫原性活性肽片段包含或由以下组成：
a)SEQ ID NO：7的范围为8至9个氨基酸的连续序列；
b)a)的功能同系物，其中最多2个氨基酸已被置换。
15.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物在给药至患有临床病症的个体时能够引起针对细胞，例如表达SEQ ID NO：6的JAK2V617F或与其具有至少70％的序列同一性的功能同系物的癌细胞和/或抗原呈递细胞的免疫应答，所述临床病症由SEQID NO：6的JAK2V617F的表达来表征。
16.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在所述个体中引起细胞免疫应答。
17.权利要求16的疫苗组合物，其中所述细胞免疫应答特异性针对JAK2V617F。
18.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够引起特异性识别JAK2V617F的细胞毒性T细胞的形成。
19.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含特异性识别JAK2V617F的细胞。
20.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述药物用于治疗或预防骨髓增生性疾病。
21.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述骨髓增生性疾病是原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症或急性或慢性髓性白血病。
22.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其包含具有至少一种以下特征的MHC I类限制性肽：
a)能够以至少1/104PBL的频率在患有临床病症的个体的PBL群体中诱导产INF-γ的细胞，如通过ELISPOT测定所确定的，和/或
b)能够在肿瘤组织的样品中原位检测与表位肽具有反应性的CTL(细胞毒性T细胞)；或
c)能够在体外诱导能够特异性识别外显子9突变CALR或JAK2V617F的T细胞的生长。
23.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其包含受限于MHC I类分子的肽片段。
24.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其包含受限于MHC II类分子的肽片段。
25.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其包含能够以至少5/104PBL的频率在患有临床病症的个体的PBL群体中诱导产INF-γ的细胞的肽片段。
26.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其包含能够在患有临床病症的个体的PBL群体中诱导产INF-γ的细胞的肽片段，在所述临床病症中表达包含SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：1的外显子9突变CALR。
27.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其包含能够在患有临床病症的个体的PBL群体中诱导产INF-γ的细胞的肽片段，在所述临床病症中表达SEQ ID NO：6的JAK2V617F或其与SEQ ID NO：6具有至少70％的同一性的功能同系物。
28.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述骨髓增生性疾病是癌症。
29.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述肽片段由最多50个氨基酸残基，优选最多30个氨基酸残基，更优选最多20个氨基酸残基，例如最多9个氨基酸残基组成。
30.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述肽片段选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17和任意上述的功能同系物，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，其中最多三个氨基酸已被置换。
31.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述肽片段选自SEQ ID NO：7和其功能同系物，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，其中最多三个，例如最多两个，例如最多一个氨基酸已被置换。
32.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述肽片段是SEQ ID NO：7。
33.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述多肽是具有最多100个氨基酸，优选最多60个氨基酸，更优选最多20个氨基酸，例如最多9个氨基酸的多肽，其包含SEQ IDNO：7的氨基酸的连续序列，优选包含SEQ ID NO：7。
34.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述多肽是具有最多100个氨基酸，优选最多60个氨基酸，更优选最多20个氨基酸，例如最多9个氨基酸的多肽，其包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17的至少8个氨基酸的连续序列。
35.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述多肽是具有最多100个氨基酸，例如最多90个氨基酸，例如最多80个氨基酸，例如最多60个氨基酸，例如最多40个氨基酸，例如最多30个氨基酸，例如最多29个氨基酸的多肽，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：15、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17。
36.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗在经接种的个体中引起对细胞具有细胞毒性作用的T细胞的产生，所述细胞例如为表达包含SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：1的外显子9突变CALR的癌细胞和/或呈递包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR的抗原的抗原呈递细胞。
37.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗在经接种的个体中引起对表达包含SEQ ID NO：7的突变JAK2的癌细胞和/或呈递SEQ ID NO：6的突变JAK2的抗原的抗原呈递细胞具有细胞毒性作用的T细胞的产生。
38.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在受试者中引起临床应答，其中所述临床应答由稳定的疾病、部分应答或完全缓解表征。
39.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其还包含选自蛋白或肽片段的免疫原性活性蛋白或肽片段，其不是CALR或外显子9突变CALR。
40.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其还包含选自蛋白或肽片段的免疫原性活性蛋白或肽片段，其不是JAK2或JAK2V617F。
41.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂和咪唑并苯胺。
42.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide ISA佐剂。
43.权利要求42的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide ISA 51或Montanide ISA720。
44.权利要求43的疫苗组合物，其中所述佐剂是Montanide ISA 51。
45.权利要求1至41中任一项的疫苗组合物，其中所述佐剂是GM-CSF。
46.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含含有免疫原性活性肽片段或编码所述免疫原性活性肽片段的核酸的抗原呈递细胞。
47.权利要求45的疫苗组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
48.权利要求2或3的疫苗组合物，其中所述核酸编码如前述权利要求中任一项中所定义的肽。
49.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述核酸被包含在载体中。
50.权利要求48的疫苗组合物，其中所述载体选自病毒载体和细菌载体。
51.权利要求48或49的疫苗组合物，其中所述载体还包含编码T细胞刺激性多肽的核酸。
52.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物用于治疗其中表达包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的外显子9突变CALR和/或SEQ ID NO：6的突变JAK2V617F的骨髓增生性疾病。
53.一种试剂盒，其包含权利要求1至51中任一项的疫苗组合物，和第二活性成分。
54.权利要求53的试剂盒，其中所述第二活性成分是免疫刺激性组合物。
55.权利要求54的试剂盒，其中所述免疫刺激性组合物包含IFN-γ。
56.权利要求54或55的试剂盒，其中所述免疫刺激性组合物还包含一种或多种白细胞介素。
57.权利要求53至56中任一项的试剂盒，其中所述白细胞介素选自IL-2和/或IL-21。
58.权利要求53至56中任一项的试剂盒，其中所述第二活性成分是抗癌剂。
59.权利要求58的试剂盒，其中所述抗癌剂是化疗剂。
60.权利要求59的试剂盒，其中所述化疗剂选自辅酶B12(Actimide)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、柔红霉素(Daunorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊苷(Etoposide)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、亮丙瑞林(Leucovorin)、氮芥(Mechlorethamine)、马法兰(Melphalan)、巯基嘌吟(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、瑞复美(Revlimid)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、Valrubicin、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)。
61.权利要求53至60中任一项的试剂盒，其中所述第二活性成分是抗生素。
62.权利要求61的包含疫苗组合物的试剂盒，其中所述抗生素选自阿莫西林、青霉素、阿昔洛韦和/或阿糖腺苷。
63.权利要求53至62中任一项的试剂盒，其中所提供的组合物可同时或依次给药。
64.如权利要求1至52中任一项所定义的肽片段和I类HLA或II类HLA分子或这类分子的片段的复合物。
65.权利要求64的复合物，其是单体的。
66.权利要求64的复合物，其是多聚体的。
67.一种在患有临床病症的个体中检测外显子9突变CALR反应性T细胞或JAK2V617F反应性T细胞的存在的方法，所述方法包括使肿瘤组织或血液样品与权利要求64-66中任一项的复合物接触并检测所述复合物与所述组织或血细胞的结合。
68.一种分子，其能够与权利要求1至52、103至104或107至108中任一项所定义的肽片段特异性结合。
69.权利要求8的分子，其是抗体或其片段。
70.权利要求68或69中任一项的分子，其中所述分子是T细胞受体。
71.一种分子，其能够阻断权利要求68至70中任一项的分子的结合。
72.一种治疗或预防临床病症的方法，所述临床病症以外显子9突变CALR的表达和/或JAK2V617F的表达为表征，所述方法包括将有效量的权利要求1-52中任一项的疫苗组合物、权利要求68-71中任一项的分子、权利要求97-102中任一项的组合物或权利要求103-104或107-108中任一项的肽给药至患有所述临床病症的个体。
73.权利要求72的方法，其中所述待治疗或预防的临床病症是表达外显子9突变CALR和/或JAK2V617F的癌症疾病。
74.权利要求72-73中任一项的方法，其与其他癌症治疗组合。
75.权利要求74的方法，其中所述其他治疗选自化疗、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗。
76.权利要求72-75中任一项的方法，其中所述待治疗或预防的临床病症是导致外显子9突变CALR和/或JAK2V617F在抗原呈递细胞中的表达的病症。
77.权利要求76的方法，其与针对所述病症的其他治疗组合。
78.权利要求77的方法，其中所述其他治疗选自化疗、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗。
79.权利要求72-78中任一项的方法，其中将所述外显子9突变CALR或JAK2V617F的免疫原性活性肽片段以每个个体范围为50μg至500μg、例如范围为80μg至300μg、例如范围为100μg至250μg的剂量给药，其中所述个体优选是人。
80.权利要求1-72中任一项的疫苗组合物、权利要求74-63中任一项的试剂盒、权利要求68至70中任一项的分子或权利要求89至96中任一项的肽片段用于制备治疗或预防临床病症的药物的用途。
81.权利要求80的用途，其中所述待治疗或预防的疾病是其中表达外显子9突变CALR和/或JAK2V617F的癌症疾病。
82.权利要求80或81的用途，其与其他癌症治疗组合。
83.权利要求82的用途，其中所述其他治疗选自化疗、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗。
84.权利要求83的用途，其中所述待治疗或预防的临床病症是导致外显子9突变CALR和/或JAK2V617F在抗原呈递细胞中的表达的病症。
85.权利要求84的用途，其与针对所述感染的其他治疗组合。
86.权利要求85的用途，其中所述其他治疗选自化疗、放射疗法、使用免疫刺激物质的治疗、基因疗法、使用抗体的治疗和使用树突细胞的治疗。
87.一种监测免疫的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供来自个体的血液样本；
b)提供：
(i)包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的CALR的外显子9突变体，例如SEQ ID NO：10中示出的CALR的外显子9突变体；
(ii)如SEQ ID NO：10所示的外显子9突变CALR的免疫原性活性肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：10的第361至411位氨基酸中的至少一些；
(iii)由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17组成的免疫原性活性肽或其片段；或
(iv)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体；
(v)如SEQ ID NO：6所示的JAK2V617F突变体的免疫原性活性多肽片段，所述片段包含SEQ ID NO：6的至少第617位氨基酸；或
(vi)上述中任一项的功能同系物；和
c)确定所述血液样品是否包含抗体或包含特异性结合所述蛋白或肽的T细胞受体的T细胞，从而确定在所述个体中是否已经产生针对所述蛋白或肽的免疫应答。
88.权利要求87的方法，其中所述肽片段是如权利要求1至52中任一项所定义的肽片段。
89.包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：1的连续序列的至少一部分的免疫原性活性外显子9突变CALR肽片段，或其功能同系物，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，或编码所述肽片段的核酸，其用于治疗或预防与突变CALR的表达相关的临床病症，如骨髓增生性疾病。
90.权利要求89的肽片段，其中所述肽片段如权利要求1至52中任一项所定义。
91.权利要求89或90中任一项的肽片段，其用于治疗或预防癌症。
92.权利要求89-91中任一项的肽片段，其中所述肽片段包含或由SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：17组成，或其功能同系物，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，或编码所述CALR肽片段的核酸，其用于治疗或预防与突变CALR的表达相关的临床病症，如骨髓增生性疾病。
93.包含SEQ ID NO：7的连续序列的至少一部分的免疫原性活性JAK2V617F肽片段，或其功能同系物，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，或编码所述JAK2V617F肽片段的核酸，其用于治疗或预防与突变JAK2V617F的表达相关的临床病症，如骨髓增生性疾病。
94.权利要求93的肽片段，其中所述肽片段如权利要求1至52中任一项所定义。
95.权利要求93或94中任一项的肽片段，其用于治疗或预防癌症。
96.权利要求93至95中任一项的肽片段，其中所述肽片段包含或由SEQ ID NO：7组成，或其功能同系物，所述功能同系物是具有相同序列的多肽，除了最多三个氨基酸已被置换，或编码所述JAK2肽片段的核酸，其用于治疗或预防与JAK2V617F的表达相关的临床病症，如骨髓增生性疾病。
97.包含特异性识别外显子9突变CALR的细胞的组合物，其中优选所述外显子9突变CALR包含SEQ ID NO：16的连续序列，其中最多3个氨基酸被置换。
98.权利要求97的组合物，其中所述细胞是细胞毒性T细胞。
99.权利要求97-98中任一项的组合物，其中所述细胞通过使前述权利要求中任一项或权利要求103至104中任一项中所定义的肽或肽片段与包含T细胞的细胞群接触而获得。
100.包含特异性识别JAK2V617F的细胞的组合物，其中优选JAK2V617F包含SEQ ID NO：6的连续序列，其中最多3个氨基酸被置换。
101.权利要求100的组合物，其中所述细胞是细胞毒性T细胞。
102.权利要求100-101中任一项的组合物，其中所述细胞通过使权利要求107至108中任一项中所定义的肽或肽片段与包含T细胞的细胞群接触而获得。
103.一种肽，其包含CALR的序列(SEQ ID NO：9)或包含SEQ ID NO：1的序列的CALR外显子9突变体序列的最多达50个连续氨基酸或由其组成，其中所述突变体任选地具有SEQ IDNO：10的序列，其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO：1、2、3、15、16或17中任一个的序列，更优选其中所述连续氨基酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：17，任选地其中最多1至10个连续氨基酸被置换，例如保守性置换。
104.权利要求103的肽，其中所述肽具有免疫原性活性。
105.一种药物组合物，其包含权利要求103-104中任一项的肽，和任选的防腐剂和/或佐剂。
106.一种治疗有需要的个体的方法，包括将权利要求103-104中任一项的肽给药至所述个体。
107.一种肽，其包含JAK2的序列(SEQ ID NO：5)或包含SEQ ID NO：6的序列的JAK2V617F序列的最多达50个连续氨基酸或由其组成，其中所述连续氨基酸包含SEQ IDNO：7的序列，任选地其中最多1至10个连续氨基酸被置换，例如保守性置换。
108.权利要求107的肽，其中所述肽具有免疫原性活性。
109.一种药物组合物，其包含权利要求107-108中任一项的肽，和任选的防腐剂和/或佐剂。
110.一种治疗有需要的个体的方法，包括将权利要求107-108中任一项的肽给药至所述个体。
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