CN107847573A

CN107847573A - 免疫诱导剂

Info

Publication number: CN107847573A
Application number: CN201680043484.5A
Authority: CN
Inventors: 栗原祥; 冈野文义
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2036-08-05
Also published as: RU2018107330A3; JPWO2017026389A1; US20180200356A1; JP7181676B2; AU2016306408B2; RU2021127767A; KR20180037999A; BR112018001542A2; DK3335725T3; US20230190899A1; US11510971B2; WO2017026389A1; EP3335725B1; AU2016306408A1; EP3335725A4; CN107847573B; FI3335725T3; MX2018001298A; CA2993427A1; EP3335725A1

Abstract

本发明的课题在于发现作为癌的治疗或预防药的有效成分有用的新的肽，提供该多肽作为免疫诱导剂的用途。含有(a)包含序列号35～67所示的氨基酸的多肽、(b)在上述(a)的多肽中缺失、替换或添加了1～数个氨基酸的多肽作为有效成分的免疫诱导剂，作为癌的治疗或预防药等有用。

Description

免疫诱导剂

技术领域

本发明涉及作为癌的治疗或预防药的有效成分有的新的免疫诱导剂。

背景技术

PDS5A(PDS5,regulator of cohesion maintenance,homolog A)蛋白质别名也称为SSC-112，是作为与染色体分配时相关的细胞周期调控因子而鉴定出的蛋白质。

已经提示了PDS5A蛋白质与癌症发病的相关性。例如，专利文献1中公开了与正常组织相比，PDS5A蛋白质在鼻咽癌、肾癌、肝癌、乳癌细胞的1种中表达高。另外，还公开了：通过使用针对PDS5A基因的反义核酸、核酶、siRNA或抗PDS5A蛋白质抗体来抑制癌细胞中的PDS5A蛋白质的表达，能够抑制癌细胞增殖；通过施与PDS5A的全长蛋白质或该蛋白质的部分肽，能够诱导癌细胞凋亡。

专利文献2中公开了与MHCⅠ类的亚型HLA-A0201结合的PDS5A蛋白质和该蛋白质的部分肽具有对癌细胞的免疫诱导活性，因此对于癌的治疗、预防有用。但是，专利文献2中并没有公开与HLA-A0201结合的全部肽，也没有公开关于与除了HLA-A0201以外的亚型结合的肽的信息。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2002/081641

专利文献2：WO2011/027807

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是发现作为癌的治疗或预防药的有效成分有用的新的多肽，提供该多肽作为免疫诱导剂的用途。

另外，本发明的课题是提供包含所述多肽与HLA分子的复合体的分离的抗原呈递细胞、和选择性地结合所述多肽与HLA分子的复合体的分离的T细胞、以及它们的癌的治疗或预防药。

用于解决课题的方法

本申请发明者们进行了深入研究，结果获得如下见解：由序列号2所示的氨基酸序列组成的人PDS5A蛋白质在白血病、恶性淋巴瘤、乳癌、肝癌、前列腺癌、胰癌、卵巢癌、肾癌、大肠癌、胃癌、恶性脑肿瘤、食道癌和肺癌的组织或细胞中特异性地表达。另外发现，存在于所述PDS5A蛋白质的特定区域的部分肽具有被抗原呈递细胞呈递、从而使对该多肽特异的T细胞活化并增殖的能力(免疫诱导活性)，以及该免疫诱导活性对癌的治疗或预防有用。基于这些结果发现，该多肽能够成为用于癌的治疗和/或预防的免疫诱导剂的有效成分，另外，与该肽接触的抗原呈递细胞、与该抗原呈递细胞接触的T细胞也对癌的治疗或预防有用，从而完成了本发明。

即，本发明具有以下(1)～(14)的特征。

(1)免疫诱导剂，含有以下(i)或(ii)作为有效成分，

(i)选自以下(a)或(b)所述的多肽组、且具有免疫诱导活性的至少一种多肽，

(a)由序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位和1074～1215位的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽，

(b)在上述(a)所述的任一多肽的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1～数个氨基酸的多肽，或

(ii)包含至少一种编码上述任一多肽的多核苷酸、且能在生物体内表达该多肽的重组载体。

(2)根据(1)所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽能结合MHCⅠ类分子。

(3)根据(2)所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽是选自以下(c)～(e)所述的多肽组的任一多肽，

(c)由序列号3～34所示的氨基酸序列组成的多肽，

(d)在上述(c)所述的多肽的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1～数个氨基酸的多肽，

(e)包含上述(c)或(d)所述的多肽作为部分序列的多肽。

(4)根据(1)所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽能结合MHCⅡ类分子。

(5)根据(4)所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽是选自以下(f)～(h)所述的多肽组的任一多肽，

(f)由序列号35～67所示的氨基酸序列组成的多肽，

(g)在上述(f)所述的多肽的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1～数个氨基酸的多肽，

(h)包含上述(f)或(g)所述的多肽作为部分序列的多肽。

(6)根据(1)～(5)的任一项所述的免疫诱导剂，作为癌的治疗或预防药的有效成分使用。

(7)根据(6)所述的免疫诱导剂，上述癌是表达PDS5A蛋白质的癌。

(8)根据(6)或(7)所述的免疫诱导剂，上述癌是白血病、恶性淋巴瘤、前列腺癌、肝癌、乳癌、胰癌、卵巢癌、肾癌、大肠癌、胃癌、恶性脑肿瘤、肺癌或食道癌。

(9)根据(1)～(8)的任一项所述的免疫诱导剂，还包含免疫增强剂。

(10)具有免疫诱导活性的多肽，是选自以下(a)或(b)所述的多肽组的任一多肽，

(a)由序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位和1074～1215位的区域内的连续7个以上氨基酸组成的具有免疫诱导活性的多肽，

(b)在上述(a)所述的多肽的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1～数个氨基酸的多肽。

(11)根据(10)所述的多肽，是选自以下(c)～(e)所述的多肽组的任一多肽，

(c)由序列号3～34所示的氨基酸序列组成的多肽，

(e)包含上述(c)或(d)所述的多肽作为部分序列的多肽。

(12)根据(10)所述的多肽，是选自以下(f)～(h)所述的多肽组的任一多肽，

(f)由序列号35～67所示的氨基酸序列组成的多肽，

(h)包含上述(f)或(g)所述的多肽作为部分序列的多肽。

(13)分离的抗原呈递细胞，包含(10)～(12)的任一项所述的具有免疫诱导活性的多肽与MHC分子的复合体。

(14)分离的T细胞，能选择性地结合(10)～(12)的任一项所述的具有免疫诱导活性的多肽与MHC分子的复合体。

本说明书包含成为本申请的优先权基础的日本专利申请号2015-158539号的公开内容。

发明的效果

根据本发明，提供作为癌的治疗或预防药的有效成分有用的新的免疫诱导剂。

另外，如后述实施例中具体显示的那样，通过本发明中使用的多肽能够诱导杀伤癌细胞的免疫细胞，能够使已经生成的癌缩小或退缩。进而，通过本发明中使用的肽能够增强杀伤癌细胞的免疫细胞的诱导，使已经生成的癌缩小或退缩。因此，本发明的多肽作为癌的治疗、预防药的有效成分有用。

附图说明

图1是显示PDS5A基因在人肿瘤组织或癌细胞株中的表达图谱的图。参照号1：显示人PDS5A基因的表达图谱。参照号2：显示作为人的持家基因的GAPDH基因的表达图谱。

图2是显示对由序列号3～19所示的氨基酸序列组成的各多肽特异的CD8阳性T细胞识别该多肽与HLA-A0201的复合体并产生IFN-γ的图。图中，横轴的带13～29分别显示经脉冲了序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽的树突状细胞的刺激的HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞的IFN-γ产生能力。带1显示不添加多肽而进行上述处理时的结果(Mock)，带2显示添加序列号74所示的本发明的范围外的阴性对照多肽进行上述处理的结果，带3显示添加由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质进行上述处理的结果，并且带4～12显示添加序列号75～83所示的本发明的范围外的多肽进行上述处理的结果。

图3是显示对由20～34所示的氨基酸序列组成的各多肽特异的CD8阳性T细胞识别该多肽与HLA-A24的复合体并产生IFN-γ的图。图中，横轴的带4～18分别显示经脉冲了序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽的树突状细胞的刺激的HLA-A24阳性CD8阳性T细胞的IFN-γ产生能力。带1显示不添加多肽而进行上述处理时的结果(Mock)，带2显示添加序列号84所示的本发明的范围外的阴性对照肽进行上述处理的结果，并且带3显示添加由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质进行上述处理的结果。

图4A是显示对由3～19所示的氨基酸序列组成的各多肽特异的CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。图中，横轴的带13～29分别显示使用序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽诱导的HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞对U251细胞的细胞毒活性。带1显示不添加多肽而诱导的CD8阳性T细胞(Mock)的细胞毒活性，带2显示使用阴性对照多肽(序列号74)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性，并且带3显示使用由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性，并且带4～12分别显示使用序列号75～83所示的本发明的范围外的多肽诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。

图4B是显示对由3～19所示的氨基酸序列组成的各多肽特异的CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。图中，横轴的带12～28分别显示使用序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽诱导的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞对Jurkat细胞的细胞毒活性。带1显示不添加多肽而诱导的CD8阳性T细胞(Mock)的细胞毒活性，带2显示使用阴性对照多肽(序列号74)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性，带3显示使用由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性，并且带4～11分别显示使用序列号75～83所示的本发明的范围外的多肽诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。

图5A是显示对由20～34所示的氨基酸序列组成的各多肽特异的CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。横轴的带4～18分别显示使用序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽刺激的HLA-A24阳性的CD8阳性T细胞对THP1细胞的细胞毒活性。带1显示不添加多肽而诱导的CD8阳性T细胞(Mock)的细胞毒活性，带2显示使用阴性对照多肽(序列号84)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性，并且带3显示使用由序列号2所示的氨基酸序列组成的PDS5A蛋白质诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。

图5B是显示对由20～34所示的氨基酸序列组成的各肽特异的CD8阳性T细胞对癌细胞的细胞毒活性的图。横轴的带4～18分别显示使用序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽刺激的HLA-A24阳性CD8阳性T细胞对SW480细胞的细胞毒活性。带1显示不添加多肽而诱导的CD8阳性T细胞(Mock)的细胞毒活性，带2显示使用阴性对照多肽(序列号84)诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性，并且带3显示使用由序列号2所示的氨基酸序列组成的PDS5A蛋白质诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。

图6是显示对由35～67所示的氨基酸序列组成的各多肽特异的CD4阳性T细胞是识别该多肽与HLA-DRB1＊04的复合体而产生IFN-γ的图。带4～36分别显示经脉冲了序列号35～67的氨基酸序列所示的多肽的树突状细胞的刺激的HLA-DRB1＊04阳性CD4阳性T细胞的IFN-γ产生能力。带1显示不添加多肽而进行上述处理时的Mock的结果，带2显示添加序列号85所示的本发明的范围外的阴性对照多肽进行上述处理的结果，并且带3显示添加由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质进行上述处理的结果。

具体实施方式

＜多肽＞

本发明中，“多肽”是指多个氨基酸通过肽键而形成的分子。不仅构成的氨基酸数多的多肽分子，氨基酸数少的低分子量分子(寡肽)也包含在本发明的多肽中。

构成本发明的免疫诱导剂的多肽可列举选自以下(a)或(b)所述的多肽组、且具有免疫诱导活性的至少一种多肽。

(a)由在由序列号2所示的氨基酸序列组成的人PDS5A蛋白质中以起始甲硫氨酸为第1位时的第24～97位(74个氨基酸)、113～132位(20个氨基酸)、134～197位(64个氨基酸)、204～225位(22个氨基酸)、265～332位(68个氨基酸)、378～463位(86个氨基酸)、472～498位(27个氨基酸)、533～567位(35个氨基酸)、613～643位(31个氨基酸)、671～735位(65个氨基酸)、737～780位(44个氨基酸)、792～830位(39个氨基酸)、832～899位(68个氨基酸)、920～943位(24个氨基酸)、946～993位(58个氨基酸)、1029～1069位(41个氨基酸)、和1074～1215位(142个氨基酸)的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽，

此外，本发明中“由……氨基酸序列组成”是指氨基酸残基以这样的顺序排列。因此，例如，“由序列号2所示的氨基酸序列组成的多肽”是指具有序列号2所示的Met Asp PheThr···(中略)···Asp Leu Gln Arg的氨基酸序列、且大小为1337个氨基酸残基的多肽。另外，本说明书中例如，“由序列号2所示的氨基酸序列组成的多肽”有时简写为“序列号2的多肽”。对于“由……碱基序列组成”这样的表述也是同样的。

另外，本发明中“免疫诱导活性”是指使与表达PDS5A蛋白质的癌细胞反应的T细胞活化和增殖的能力。具体是指：经PDS5A蛋白质或其部分多肽刺激的细胞毒性T细胞和/或辅助性T细胞的IFN-γ产生能力高于未经刺激的对照T细胞的该能力；经PDS5A蛋白质或其部分多肽刺激的细胞毒性T细胞对表达PDS5A蛋白质的癌细胞的细胞毒活性高于未经刺激的对照的T细胞的该活性；经PDS5A蛋白质或其部分多肽刺激的辅助性T细胞比未经刺激的对照的T细胞更能增强细胞毒性T细胞的细胞毒活性；或经PDS5A蛋白质或其部分多肽刺激的细胞毒性T细胞或辅助性T细胞比未经刺激的对照的T细胞更好地增殖。

细胞的增殖可以通过目视观察、显微镜下的细胞计数、流式细胞仪、培养基中的氚标记胸苷向细胞内的掺入量等确认。另外，IFN-γ产生能力力的测定可以使用例如公知的酶联免疫斑点(ELISpot)测定等来确认。具体例如，如后述的实施例所记载那样，首先，将T细胞与应评价免疫诱导活性的多肽(本发明中为PDS5A蛋白质或其部分多肽)和来自外周血单核细胞(以下表述为“PBMC”)的抗原呈递细胞进行共培养，从而使T细胞与呈递应评价的多肽的抗原呈递细胞接触。接着，使用对IFN-γ特异的抗体测定由T细胞产生的IFN-γ。由此能够测定该T细胞中的免疫细胞数。由该测定结果能够评价免疫诱导活性。

另外，细胞毒活性的测定例如，将T细胞与应评价细胞毒活性的多肽(本发明中微PDS5A蛋白质或其部分多肽)和来自PBMC的抗原呈递细胞共培养后，在生物体外调查是否显示抑制肿瘤细胞的增殖的能力或杀伤肿瘤细胞的能力(以下表述为“细胞毒活性”)，从而进行评价。T细胞与抗原呈递细胞的接触如后所述，可以通过将两者在液体培养基中共培养来达成。细胞毒活性的测定可以通过例如Ⅰnt.J.Cancer，58：P317，1994所记载的称为⁵¹Cr释放测定的公知方法来进行。

将上述诱导的T细胞施与荷癌生物体，从而能够通过其T细胞的细胞毒活性而使肿瘤缩小或退缩。于是，上述免疫诱导活性也可以作为抑制癌细胞的增殖、或使癌组织(肿瘤)缩小或消失的能力(以下表述为“抗肿瘤活性”)来评价。

在将上述多肽用于癌的治疗或预防用途时，虽然不特别限定，但免疫诱导活性的评价优选以细胞毒活性或抗肿瘤活性作为指标。

如本领域公知的那样，只要是约7氨基酸残基以上的多肽就能够包含表位，因而能够发挥抗原性和免疫原性，能够具有免疫诱导活性，因此能够作为本发明的免疫诱导剂使用。

因此，上述(a)的多肽是由序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位、或1074～1215位的区域内的连续7个以上、优选连续8、9或10个以上的氨基酸组成、且具有免疫诱导活性的多肽。特别优选是具有序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位、或1074～1215位所示的氨基酸序列的多肽。

作为通过施与癌抗原多肽来进行免疫诱导的原理，已知：多肽被摄入抗原呈递细胞，然后在该细胞内受到肽酶分解形成小片段，然后片段化的抗原肽被呈递到该抗原呈递细胞的表面上。细胞毒性T细胞等识别被呈递到细胞表面的抗原，选择性地杀伤将该抗原呈递到细胞表面的癌细胞。另外，已知辅助性T细胞识别被呈递在抗原呈递细胞的表面上的抗原，促进选择性地杀伤将该抗原呈递到细胞表面的癌细胞的细胞毒性T细胞的诱导。被呈递到抗原呈递细胞的表面上的抗原多肽的大小比较小，氨基酸数为7～30个左右。因此，从呈递在抗原呈递细胞上这样的观点考虑，作为上述(a)的多肽，优选序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位、或1074～1215位所示的氨基酸序列中的连续7～30个左右。如果由8～30个左右、9～30个左右、或9～25个左右的氨基酸组成，则是充分的。这些大小比较小的多肽有时不被摄入抗原呈递细胞内，而直接被呈递在抗原呈递细胞上的细胞表面。

另外，被抗原呈递细胞摄入的多肽被该细胞内的肽酶在随机的位置切割，产生各种多肽片段，这些多肽片段被呈递到抗原呈递细胞表面上，因此如果施与序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位、或1074～1215位那样大小较大的多肽，则通过在抗原呈递细胞内的分解，必然产生对介由抗原呈递细胞的免疫诱导有效的多肽片段。因此，介由抗原呈递细胞的免疫诱导也可以使用大小较大的多肽。例如，可以使氨基酸数为30以上、优选40以上、更优选50以上、进一步优选100以上。

进而，本发明的多肽，可以通过能够检索具有后述的MHC(在人中为HLA)的Ⅰ类分子或ⅠⅠ类分子的结合基序的由8～25个、优选9～24个、进一步优选9～23个氨基酸组成的表位肽的核对媒体、例如，Bioinformatics&Molecular Analysis Selection(BⅠMAS)的HLAPeptide Binding Predictions(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.htmL)、SYFPEⅠTHⅠ来核对，筛选能够成为表位肽的肽。具体是由序列号2所示的氨基酸序列中的24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位、或1074～1215位的区域内的连续7个以上氨基酸组成的多肽。可列举例如，序列号3～67所示的多肽、或包含由序列号3～67所示的氨基酸序列组成的多肽作为部分序列、且氨基酸残基数为10～30的多肽。其中，序列号3～67所示的多肽、和包含由序列号3～67所示的氨基酸序列组成的多肽作为部分序列、且氨基酸残基数为10～30的多肽中，序列号3～67所示的多肽的免疫诱导活性是通过与MHCⅠ类分子结合而发挥的，序列号35～67所示的多肽的免疫诱导活性是通过与MHCⅡ类分子结合而发挥的。

另一方面，上述(b)的多肽是在上述(a)的多肽中替换、缺失和/或添加了1个或数个氨基酸残基、且具有免疫诱导活性的多肽。可列举例如，在由序列号3～67所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、替换或添加了1～数个氨基酸的多肽。

本说明书中的“数个”中的“几”表示2～10的整数、优选2～6的整数、更优选2～4、进一步优选2或3的整数。

一般认为某多肽中的1个、或数个氨基酸的改变不影响原多肽的功能，有时甚至能强化原多肽的所期望的功能。实际上，已知由与原氨基酸序列相比改变了(即，替换、缺失、添加和/或插入了)1个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的改变肽保持原肽的生物活性(Mark et al.，1984，Proc Natl Acad Sci USA，81:5662-5666、Zoller and Smith，1982，Nucleic Acids Res.10：6487-6500、Dalbadie-McFarland et al.，1982，Proc Natl AcadSci USA.79：6409-6413)。因此，因为上述(b)的多肽也能发挥免疫诱导活性，所以可以在本发明的免疫诱导剂的制备中使用。

此外，构成天然蛋白质的20种氨基酸可以按照具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly,Ⅰle,Val,Leu,Ala,Met,Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn,Gln,Thr,Ser,Tyr,Cys)、酸性氨基酸(Asp,Glu)、碱基性氨基酸(Arg,Lys,His)、芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp)这样分组为具有类似的性质的组，已知只要是各组内的替换多肽的性质就多不变化。因此，替换本发明的上述(a)的多肽中的氨基酸残基时，通过在这些各组内进行替换，能够维持免疫诱导活性的可能性高，因此优选。

另外，上述(b)的多肽也可以是与24～97位、113～132位、134～197位、204～225位、265～332位、378～463位、472～498位、533～567位、613～643位、671～735位、737～780位、792～830位、832～899位、920～943位、946～993位、1029～1069位、或1074～1215位具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上或99.5％以上的氨基酸序列同一性、且具有免疫诱导活性的多肽。

本说明书中氨基酸序列(或碱基序列)的“同一性”是指在使需要比较的2个氨基酸序列(或碱基序列)的氨基酸残基(或碱基)尽可能多地一致地将两氨基酸序列(或碱基序列)排列，用百分率来表示一致的氨基酸残基数(或一致的碱基数)除以总氨基酸残基数(或总碱基数)而得的值。进行上述排列时，根据需要在所比较的2个序列的一方或双方中适宜地插入间隙。这样的序列排列化可以使用例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等周知的程序进行。插入间隙时，上述总氨基酸残基数变为将1个间隙作为1个氨基酸残基来计数的残基数。由此，计数的总氨基酸残基数在所比较的2个序列间不同的情形下，序列同一性(％)是以一致的氨基酸残基数除以较长一方序列的总氨基酸残基数而算出的。

在与癌治疗或预防相关地使用的情况下，本发明的多肽优选应作为与各型HLA的复合体被呈递到细胞或外泌体的表面上。因此，优选选择不仅具有免疫诱导活性、还具有对各型HLA的高结合亲和性的肽。因此，也可以是通过氨基酸残基的替换、插入、缺失、和/或添加对肽进行改变、从而改善了结合亲和性的改变肽。除了天然被呈递的肽之外，通过与各型HLA结合而被呈递的肽的序列的规则性是已知的(JⅠmmunol，1994，152：3913；Ⅰmmunogenetics，1995，41：178；JⅠmmunol，1994，155：4307)，可以将基于这样的规则性的改变导入本发明的免疫原性肽中。例如，为了提高HLA-A24结合亲和性，可以期望将N末端起第2位的氨基酸用亮氨酸或甲硫氨酸替换，和/或将C末端的氨基酸用缬氨酸或亮氨酸替换。因此，将具有序列号20～34的氨基酸序列的肽的N末端起第2位的氨基酸用亮氨酸或甲硫氨酸替换而得的肽、和/或C末端氨基酸用缬氨酸或亮氨酸替换而得的肽包含在本发明的范围内。

替换不仅可以导入末端氨基酸的位置，也可以导入能够进行肽的TCR识别的位置。数项研究证实，肽的氨基酸替换物与原肽同等或更优，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)、或gp100(209-217)(Zaremba et al.1997，Cancer Res.57：4570-4577、T.K.Hoffmann et al.2002，JⅠmmunol.168(3)：1338-47、S.O.Dionne et al.2003，CancerⅠmmunol immunother.52：199-206、和S.O.Dionne et al.2004，CancerⅠmmunology,Ⅰmmunotherapy，53：307-314)。

除了上述改变之外，只要结果产生的连接多肽保持原肽的必要的免疫诱导活性，则也可以将本发明的多肽与其他物质连接。作为其他物质的例子不限定，但包含肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合成的聚合物等。肽以不因改变而损害原肽的生物活性作为条件，可以包含糖基化、侧链氧化或磷酸化等改变。这些种类的改变可以为了付与额外的功能(例如，靶标化功能和送达功能)或稳定化多肽而进行。例如，为了提高多肽的体内(invivo)稳定性而导入D-氨基酸、氨基酸模拟体或非天然氨基酸的技术在本领域是公知的，也可以将该概念应用于本发明的多肽。多肽的稳定性可以通过数种方法测定。例如，可以使用肽酶、以及人的血浆和血清等各种生物体媒介来试验稳定性(例如，参照Verhoef et al.，1986，Eur J Drug Metab Pharmacokin，11：291-302)。

进而，可以将本发明的多肽介由间隔物或接头与其他肽连接。作为其他肽的例子不限定，包含来自其他多肽的表位肽。或者，也可以使本发明的2种或2种以上多肽介由间隔物或接头连接。介由间隔物或接头连接的肽可以相同也可以不同。对间隔物和接头的种类不特别限定，包含由肽构成的，更优选包含由具有能够被肽酶、蛋白酶和蛋白酶体等酶切断的1个或多个切断部位的肽构成的。作为接头或间隔物的例子不限定，可列举AAY(P.M.Daftarian et al.，J Trans Med，2007，5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.，JⅠmmunol.2000，165：7308-7315)、或1个～数个赖氨酸残基(S.Ota et al.，2002，CanRes.62：1471-1476、K.S.Kawamura et al.,2002,JⅠmmunol.168：5709-5715)。本发明设想了介由间隔物或接头与其他肽连接而成的多肽。

在本发明的多肽包含半胱氨酸残基的情况下，这些多肽有介由半胱氨酸残基的SH基之间的二硫键形成二聚体的倾向。因此，多肽的二聚体也包含在本发明的多肽中。

本发明的多肽可以使用周知的技法制备。可以按照例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。另外，也能够利用各种市售的肽合成仪按照常规方法来合成。

进而，也可以通过使用公知的基因工程技术，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸插入表达载体并导入宿主细胞中，在该宿主细胞中生产目的多肽，从而得到目的多肽。从宿主细胞获得目的多肽时，进行纯化或分离使得其实质上不包含其他天然宿主细胞蛋白质和它们的片段、或其他任意化学物质即可。

编码上述多肽的多核苷酸能够使用公知的基因工程技术或市售的核酸合成仪通过常规方法容易地制备。例如，具有序列号1的碱基序列的DNA，能够通过使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板，用设计成能够扩增序列号1中所记载的碱基序列的一对引物进行PCR来制备。PCR反应条件可以适当地设定，可例举例如，以由94℃30秒(变性)、55℃30秒～1分钟(退火)、72℃2分钟(延伸)组成的反应工序作为1个循环，进行例如30个循环后，72℃反应1分钟的条件等，但不限于此。另外，基于序列号1所示的碱基序列和氨基酸序列信息，制备适当的探针或引物，通过使用它们来筛选人等的cDNA文库，能够分离所需要的DNA。cDNA文库优选地从表达序列号2的蛋白质的细胞、器官或组织制作。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等操作是本领域技术人员已知的，例如可以依据Green,M.R.and Sambrook,J.,2012，Molecular Cloning：A Laboratory ManualFourth Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York、或Current Protocolin Molecular Biology：www.currentprotocols.com等中所记载的方法实施。从这样获得的DNA能够得到编码上述(a)的多肽的DNA。另外，由于编码各氨基酸的密码子是公知的，因而能够容易地确定编码特定氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列。因此，由于也能够容易地确定编码上述(b)的多肽的多核苷酸的碱基序列，所以这样的多核苷酸也使用市售的核酸合成仪通过常规方法合成即可。

作为上述宿主细胞，只要是能够表达上述多肽的细胞，任一细胞均可，作为原核细胞的例子可以例举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以例举猴肾脏细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物培养细胞、芽殖酵母、裂殖酵母、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，但不限于这些。

使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有能够在原核细胞中复制的起点、启动子、核糖体结合位点、DNA克隆位点、终止子等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示pUC系统、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。可以将编码上述多肽的DNA插入这样的表达载体，用该载体转化原核宿主细胞后，培养得到的转化体，使上述DNA所编码的多肽在原核宿主细胞中表达。此时，也可以使该多肽作为与其它的蛋白质的融合蛋白质表达。

使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区域、多聚A添加位点等的真核细胞用表达载体。作为这样的表达载体，能够例示pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等。与上述同样地，可以将编码上述多肽的DNA插入这样的表达载体，用该载体转化真核宿主细胞后，培养得到的转化体，使由上述DNA编码的多肽在真核宿主细胞中表达。在使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，可以使上述多肽作为添加了His标签、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质表达。

可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等周知的方法将表达载体导入宿主细胞。

为了从宿主细胞分离纯化目的多肽，可以组合进行公知的分离操作。可以例举例如用尿素等变性剂或表面活性剂处理、超声波处理、酶消化、盐析、溶剂分级沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、反相层析等，但不限于此。

在通过以上方法获得的多肽中，如上所述，也包含与其它的任意蛋白质融合的融合蛋白质形式的多肽。可以例示例如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、His标签融合的融合蛋白质等。因此这样的融合蛋白质形式的多肽也包含在本发明的范围中。进一步地，转化细胞表达的多肽有时在翻译后在细胞内受到各种修饰。这样的被翻译后修饰的多肽只要具有免疫诱导活性也包含在本发明的范围中。作为这样的翻译修饰，可以例示N末端甲硫氨酸去除、N末端乙酰化、添加糖链、由胞内蛋白酶引起的限制性分解、十四烷酰化、异戊二烯化、磷酸化等。

＜免疫诱导剂＞

将本发明的具有免疫诱导活性的多肽或包含编码该多肽的基因的表达载体施与荷癌生物体，能够使已经产生的肿瘤退缩。另外，通过将上述的具有免疫诱导活性的多肽或编码多肽的基因施与癌发病前的生物体，能够预防肿瘤发生。因此，本发明的多肽或编码该多肽的基因能够成为免疫诱导剂的有效成分。

其中，“肿瘤”和“癌”这样的术语是指恶性新生物，可以互换使用。此时，作为成为对象的癌，优选是表达PDS5A蛋白质的癌，尤其优选是白血病、恶性淋巴瘤、前列腺癌、肝癌、乳癌、胰癌、卵巢癌、肾癌、大肠癌、胃癌、恶性脑肿瘤、肺癌或食道癌。

对象动物如上所述，优选为哺乳动物，更优选为包含灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，进一步优选人、犬或猫，特别为优选人。

成为对象的患癌个体(在个体是人时为癌患者)优选为在生物体内表达PDS5A蛋白质的患癌个体，具体优选为通过WO2011/027807所记载的癌的检测方法筛选的患癌个体。特别优选为通过从对象生物体得到的试样中所含的针对PDS5A蛋白质的抗体的表达量比从健常个体的生物体得到的试样中所含的该抗体的表达量多而筛选的患癌个体。作为供于成为对象的患癌个体的筛选的试样，可列举血液、血清、血浆、腹水、胸水等体液、组织、细胞，但在通过针对PDS5A蛋白质的抗体的表达量测定来筛选时，优选血清、血浆、腹水或胸水。

本发明的免疫诱导剂的施与途径可以是经口施与，也可以是非经口施与，但优选肌内施与、皮下施与、静脉内施与、动脉内施与等非经口施与。在以治疗癌为目的使用该免疫诱导剂时，为了提高抗癌作用，也能够施与至成为治疗对象的肿瘤附近的所属淋巴结。施与量是对免疫诱导有效的量即可，例如用于癌的治疗或预防中时，只要是对癌的治疗和/或预防有效的量即可。对癌的治疗或预防有效的量要根据肿瘤的大小、症状、对象动物的体重、体积等适宜选择，当对象动物为人时，通常每天的有效量是0.0001～1000μg、优选0.001～1000μg，可以1次或分成数次施与。优选每天分数次、将其每隔数日至数月施与。如后述实施例中具体例示的那样，本发明的免疫诱导剂能够使已经形成的肿瘤退缩。因此，由于对发生初期的少数癌细胞也能够发挥抗癌作用，所以如果在癌发病前、癌治疗后使用，则能够防止癌的发病、复发。即，本发明的免疫诱导剂对癌的治疗和预防两者都有用，能够成为癌治疗或预防药的有效成分。

本发明的免疫诱导剂含有前述的本发明的多肽作为有效成分，但可以仅由单一的多肽构成，也可以组合多种多肽。通过将本发明的多肽多种组合，各多肽所具有的免疫诱导活性(细胞毒性T细胞的诱导·活化作用)被增强，能够更有效地实现癌的治疗或预防。

可以将本发明的免疫诱导剂与公知的能够诱导细胞毒性T细胞的肽组合使用。通过组合本发明的多肽，各多肽所具有的免疫诱导活性(细胞毒性T细胞的诱导·活化作用)被增强，能够更有效地实现癌的治疗或预防。此时的“组合”包含将本发明的免疫诱导剂与公知的能够诱导细胞毒性T细胞的肽分别或同时施与。这里所说的“分别施与”是指将本发明的免疫诱导剂与公知的能够诱导细胞毒性T细胞的肽设置时间差分别施与。不考虑施与的顺序。另一方面，“同时施与”是指将本发明的免疫诱导剂与公知的能够诱导细胞毒性T细胞的肽预先混合而以一体化的方式施与，或将本发明的免疫诱导剂与公知的能够诱导细胞毒性T细胞的肽以分别方式无时间差地施与。

本发明的免疫诱导剂可以与能在生物体内强化免疫应答的其他免疫增强剂组合使用。其他免疫增强剂可以包含于本发明的免疫诱导剂中，也可以作为另一种组合物与本发明的免疫诱导剂联合使用而施与给患者。

作为上述“其他免疫增强剂”，可以例举例如佐剂。佐剂通过提供抗原的储备库(细胞外或巨噬细胞内)、活化巨噬细胞、并且刺激特定组的淋巴细胞，能够强化免疫应答，因此能够提高抗癌作用。因此，在将本发明的免疫诱导剂用于癌的治疗或预防药的有效成分时，免疫诱导剂优选地除了作为有效成分的上述本发明的多肽之外还包含佐剂。多种的佐剂是本领域周知的，可以使用任一佐剂。作为佐剂的具体例子，可以例举MPL(SmithKlineBeecham)；将沙门氏菌属的明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)Re 595的脂多糖类纯化和酸水解后得到的同类物；QS21(SmithKline Beecham)；从皂树(Quillja saponaria)提取物纯化的纯QA-21皂苷；PCT申请WO 96/33739(SmithKline Beecham)中记载的DQS21；QS-7,QS-17,QS-18和QS-L1(So，H.S.，et al.,1997，Molecules and cells，7：178-186)；弗氏不完全佐剂；弗氏完全佐剂；维生素E；Montanide；明矾；CpG寡核苷酸(例如，参照Kreig，A.M.，et al.,1995，Nature374：546-549)；聚肌胞及其衍生物(聚ICLC等)以及从角鲨烯和/或生育酚这样的生物可分解性油制备的各种油包水乳液。其中优选弗氏不完全佐剂、Montanide、聚肌胞及其衍生物、以及CpG寡核苷酸。上述佐剂与多肽的混合比一般是约1:10～10:1，优选约1:5～5:1，更优选约1:1。但是，佐剂不限于上述例示，可以在施与本发明的免疫诱导剂时也使用本领域已知的上述以外的佐剂(例如，参照Goding,MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，第2版，1986年)。制备免疫诱导剂和佐剂的混合物或乳液的方法是预防接种领域的技术人员周知的。

另外，作为上述其他免疫增强剂，除了上述佐剂之外，还可以使用刺激对象的免疫应答的因子。例如，可以与本发明的免疫诱导剂组合使用具有刺激淋巴细胞、抗原呈递细胞的特性的各种细胞因子作为免疫增强剂。这样的可增强免疫应答的多种细胞因子是本领域技术人员公知的，作为其例子可以例举显示增强疫苗的防御作用的白细胞介素-12(IL-12)、GM-CSF、IL-18、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素ω(IFN-ω)、干扰素γ(IFN-γ)和Flt3配体，但不限于这些。这样的因子也可以作为上述免疫增强剂使用，可以包含于本发明的免疫诱导剂中，或者作为另一种组合物与本发明的免疫诱导剂联合使用而施与患者。

＜癌的治疗或预防药＞

本发明的免疫诱导剂能够作为癌的治疗或预防药的有效成分使用。

癌的治疗或预防药可以将本发明的免疫诱导剂与适合各施与方式的药理学上容许的担载体、稀释剂、赋形剂等添加剂适宜混合来进行制剂。

制剂方法和可使用的添加剂在医药制剂的领域是周知的，可以使用任一方法和添加剂。作为添加剂的具体例子，可以例举生理缓冲液这样的稀释剂；砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、甘氨酸等这样的赋形剂；糖浆、明胶、阿拉伯胶、山梨糖醇、聚氯乙烯、黄蓍胶等这样的结合剂；硬脂酸镁、聚乙二醇、滑石、二氧化硅等润滑剂，但不限于此。作为制剂形式，可以例举片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等经口剂；吸入剂、注射剂、栓剂、液体剂等非经口剂等。这些制剂可以通过常规已知的制法制作。

＜抗原呈递细胞＞

另外，将上述多肽与抗原呈递细胞体外(in vitro)接触，能够将该多肽呈递给抗原呈递细胞。即，上述的(a)或(b)的多肽能够作为抗原呈递细胞的处理剂使用。这里，作为抗原呈递细胞，能够优选使用保有MHC I类和II类分子的树突状细胞或B细胞。多种MHC I类分子和II类分子已经被鉴定，是周知的。人中的MHC分子称作HLA。

作为HLA I类分子，可列举HLA-A、HLA-B、HLA-C，更具体作为HLAⅠ类分子可列举HLA-A、HLA-B、HLA-C，更具体可列举HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等。

作为HLA II类分子，可列举HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，更具体可列举HLA-DRB1＊01、HLA-DRB1＊03、HLA-DRB1＊04、HLA-DRB1＊0405、HLA-DRB1＊07、HLA-DRB1＊08、HLA-DRB1＊11、HLA-DRB1＊13、HLA-DRB1＊15、HLA-DRB1＊15、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPB1。

保有HLAI类或HLA II类分子的树突状细胞或B细胞可以通过周知的方法从血液等制备。通过使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)从骨髓、脐带血或患者外周血诱导出树突状细胞，向该培养系统中添加肿瘤相关肽，能够诱导出肿瘤特异性的树突状细胞。

通过施与有效量的该树突状细胞，能够诱导出癌的治疗中所希望的免疫应答。使用的细胞可以使用健康人提供的骨髓、脐带血、患者本人的骨髓、外周血等，但是使用患者本来的自身细胞时安全性高，也能够期待避免严重的副作用，因此优选。外周血或骨髓可以是新鲜样品、低温保存样品和冷冻保存样品的任一种。外周血可以培养全血，也可以仅分离白细胞成分并培养，但从效率的观点看，优选后者。进一步地，也可以从白细胞成分中分离单核细胞。另外，在以骨髓或脐带血为起源的情形时，可以培养构成骨髓的全部细胞，也可以从中分离单核细胞并培养。外周血、其白细胞成分、骨髓细胞中包含成为树突状细胞的起源的单核细胞、造血干细胞或未成熟树突状细胞、CD4阳性细胞等。使用的细胞因子只要是安全性和生理活性经确认的特性的细胞因子即可，不管是天然型或基因重组型等，也不管其生产方法，但优选以最小需要量使用确保了用于医疗用的品质的标准品。添加的细胞因子的浓度只要是诱导树突状细胞的浓度就不特别限定，通常优选细胞因子的总浓度为10～1000ng/ml左右、更优选20～500ng/ml左右的。培养可以使用通常用于白细胞培养的周知的培养基进行。培养温度只要白细胞能够增殖，就不特别限定，最优选作为人的体温的37℃左右。另外，培养中的气体环境只要白细胞能够增殖，就不特别限定，优选通气5％CO₂。此外，培养期间只要是能诱导必需数目的细胞的期间，就不特别限定，通常以3天～2周之间进行。供于细胞的分离、培养的仪器可以适宜使用适当的，但优选确认了医疗用安全性、并且操作稳定且简便的。特别是细胞培养装置，不限于培养皿、烧瓶和培养瓶等常见的容器，也可以使用分层型容器、多段式容器、滚瓶(roller bottle)、转瓶(spinner bottle)、袋式培养器、中空丝柱等。

使上述多肽与抗原呈递细胞体外(in vitro)接触的方法本身可以通过周知的方法来进行。例如，可以通过将抗原呈递细胞在包含上述多肽的培养液中培养来来达成。对培养基中的肽浓度不特别限定，通常是1～100μg/ml左右，优选是5～20μg/ml左右。对培养时的细胞密度不特别限定，通常是10³～10⁷个细胞/ml左右，优选是5×10⁴～5×10⁶个细胞/ml左右。优选按照常规方法在37℃、5％CO₂环境中进行培养。另外，抗原呈递细胞能够在表面上呈递的肽长度通常是最大30个氨基酸残基左右。因此，虽然不特别限定，但在抗原呈递细胞与多肽体外(in vitro)接触的情形，可以将该多肽制成约30个氨基酸残基以下的长度。

通过在上述多肽共存下培养抗原呈递细胞，从而将肽插入抗原呈递细胞的MHC分子并呈递在抗原呈递细胞表面。因此，使用上述多肽能够制备包含该多肽与MHC分子的复合体的分离的抗原呈递细胞。这样的抗原呈递细胞能够在体内或体外(in vitro)对T细胞呈递该多肽，诱导对该多肽特异的细胞毒性T细胞或辅助性T细胞并使其增殖。

通过使如上述制备的含有上述多肽与MHC分子的复合体的抗原呈递细胞与T细胞体外(in vitro)接触，能够诱导对该多肽特异的细胞毒性T细胞或辅助性T细胞并使其增殖。这可以通过在液体培养基中将上述抗原呈递细胞与T细胞共培养来进行。例如，可以通过将抗原呈递细胞悬浮于液体培养基中、将所得悬浮液置于微量平板的孔等容器中、向其添加T细胞并培养来进行。对共培养时抗原呈递细胞与T细胞的混合比率不特别限定，通常细胞数的比率为1:1～1:100个左右、优选1:5～1:20个左右。对悬浮于液体培养基中的抗原呈递细胞的密度不特别限定，通常为100～1000万个细胞/mL左右、优选10000～100万个细胞/mL左右。共培养优选按照常规方法在37℃、5％CO₂环境中进行。对培养时间不特别限定，通常为2日～3周、优选为4日～2周左右。共培养优选在1种或多种IL-2、IL-6、IL-7和IL-12这样的白细胞介素存在下进行。在这种情况下，IL-2和IL-7的浓度通常是5～20U/mL左右、ⅠL-6的浓度通常为500～2000U/mL左右、ⅠL-12的浓度通常为5～20ng/mL左右，但不限于这些。上述的共培养也可以补加新鲜的抗原呈递细胞重复一次或几次。例如，可以将弃去共培养后的培养上清、添加新鲜的抗原呈递细胞悬液进一步进行共培养这样的操作重复一次或几次。各共培养的条件可以与上述同样。

通过上述共培养，对该多肽特异的细胞毒性T细胞和辅助性T细胞被诱导、增殖。因此，使用上述多肽，能够制备与该多肽和MHC分子的复合体选择性结合的分离的T细胞。

如后述的实施例所记载的那样，编码PDS5A蛋白质的基因(PDS5A基因)分别在白血病的白血球细胞、恶性淋巴瘤组织、恶性淋巴瘤细胞、前列腺癌组织、前列腺癌细胞、肝癌组织、肝癌细胞、乳癌组织、乳癌细胞、胰癌组织、胰癌细胞、卵巢癌组织、卵巢癌细胞、肾癌组织、肾癌细胞、大肠癌组织、大肠癌细胞、胃癌组织、胃癌细胞、恶性脑肿瘤组织、恶性脑肿瘤细胞、肺癌组织、肺癌细胞、食道癌组织、食道癌细胞中特异性地表达。因此考虑，在这些癌种中PDS5A蛋白质比正常细胞有意义地多地存在。存在于癌细胞内的PDS5A蛋白质的一部分被癌细胞表面上的MHC分子呈递，如果在生物体内施与如上所述制备的细胞毒性T细胞或辅助性T细胞，则细胞毒性T细胞以PDS5A蛋白质的一部分为目标毒害癌细胞或增强细胞毒性T细胞的细胞毒活性。另外，呈递上述多肽的抗原呈递细胞在生物体内也能够诱导对该多肽特异的细胞毒性T细胞和辅助性T细胞，使其增殖，因此通过将该抗原呈递细胞施与生物体内，也能够由细胞毒性T细胞毒害癌细胞，或增强细胞毒性T细胞的细胞毒活性。即，使用上述多肽制备的上述细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、上述抗原呈递细胞也与本发明的免疫诱导剂同样作为癌的治疗或预防药有用。

在将上述分离的抗原呈递细胞、分离的T细胞施与至生物体时，为了避免在生物体内将这些细胞作为异物攻击的生物体内的免疫应答，优选这些分离的细胞是将从接受治疗的患者采集的抗原呈递细胞或T细胞如上所述用上述(a)或(b)的多肽制备的。

包含抗原呈递细胞或分离的T细胞抗原作为有效成分的癌的治疗或预防药的施与途径优选静脉内施与或动脉内施与这样的非经口施与。另外，施与量根据症状或施与目的等适当地选择，通常是1个～10兆个、优选为100万个～10亿个细胞，并且优选地每数日或数月施与一次。制剂可以将细胞悬浮在例如生理缓冲盐水中而制成的悬浮液等，也可以与其他抗癌剂、细胞因子等联合使用。另外，还可以添加制剂领域周知的1种或2种以上添加剂。

＜基因疫苗＞

此外，根据本发明，通过使编码上述(a)或(b)的多肽的多核苷酸在对象动物的体内表达，也能够进行免疫诱导、即在该生物体内诱导抗体生产、细胞毒性T细胞，获得与施与多肽同等的效果。即，本发明的免疫诱导剂也可以包含重组载体作为有效成分，所述重组载体包含编码上述(a)或(b)的多肽的多核苷酸、并能够在生物体内表达该多肽。如后述实施例所示，这样的能够表达抗原多肽的重组载体也被称为“基因疫苗”。

用于制造基因疫苗的载体只要是能在对象动物细胞内(优选哺乳动物细胞内)表达的载体，就不特别限定，可以是质粒载体，也可以是病毒载体，可以使用基因疫苗领域中公知的任意载体。另外，编码上述多肽的DNA、RNA等多核苷酸如上所述能够通过常规方法容易地制备。另外，该多核苷酸可以通过使用本领域技术人员周知的方法插入载体。

基因疫苗的施与途径优选是肌内施与、皮下施与、静脉内施与、动脉内施与等的非经口施与途径，施与量可以根据抗原种类等适当地选择，通常是每1kg体重0.1μg～100mg左右、优选1μg～10mg左右

作为利用病毒载体的方法，可以例举将编码上述多肽的多核苷酸插入例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等RNA病毒或DNA病毒中，并用其感染对象动物的方法。其中特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等的方法。

作为其他方法，可以例举将表达质粒直接施与至肌内的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂质转染(Lipofectin)法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别优选DNA疫苗法、脂质体法。

为了使本发明中所用的编码上述多肽的基因实际上作为药品发挥作用，有将基因直接导入体内的体内(in vivo)方法和从对象动物采集某种细胞、体外将基因导入该细胞、并将所述细胞送回体内的离体(ex vivo)方法，更优选体内方法。

在通过体内方法施与时，可以根据治疗目的的疾病、症状等通过适当的施与途径施与。例如，可以施与静脉、动脉、皮下、肌内等。在通过体内方法施与时，例如可以采用液体剂等制剂形式，通常可以制成含有作为有效成分的编码本发明的上述肽的DNA的注射剂等，根据需要可以添加惯用的担载体。另外，含有该DNA的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)可以采取混悬剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形式。

另外，在本发明中，在谈及“序列号1所示的碱基序列”时，除了指序列号1实际上显示的碱基序列之外，还包含与之互补的序列。因此，在谈及“具有序列号1所示碱基序列的多核苷酸”时，包含具有序列号1实际上显示的碱基序列的单链多核苷酸、具有与之互补的碱基序列的单链多核苷酸、和由它们组成的双链多核苷酸。在制备编码本发明中所用多肽的多核苷酸时，适宜选择任一碱基序列序列，只要是本领域技术人员就能够容易地进行这种选择。

实施例

以下，基于实施例更具体地说明本发明。

＜实施例1：各组织中的表达分析＞

(1)各癌细胞株中的PDS5A基因表达分析

从Gene Bank获得编码人PDS5A蛋白质的氨基酸序列的基因序列(序列号1)。通过RT-PCR(逆转录PCR，Reverse Transcription-PCR)法对所得的基因研究在人各种细胞株中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(Life Technologies社制)，按照其所附的方案从各组织50～100mg和各细胞株5～10×10⁶个细胞中提取总RNA。利用该总RNA，通过Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies社制)按照所附的方案合成cDNA。对于人正常组织(脑、海马、精巢、结肠、胎盘)的cDNA，使用GenePool cDNA(Life Technologies社制)、QUⅠCK-Clone cDNA(クロンテック社制)和Large-Ⅰnsert cDNA Library(クロンテック社制)。使用对所获得基因特异的引物(引物的碱基序列记载于序列号68和69)如下进行PCR反应。即，按照通过逆转录反应制备的样品0.25μl、上述引物各2μM、0.2mM各dNTP、0.65U ExTaq聚合酶(宝酒造社制)的方式添加各试剂和所附的缓冲液，使总量为25μl，使用Thermal Cycler(BIO RAD社)，将94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟的循环重复30次。出于比较对照的目的，也同时使用持家基因GAPDH基因的特异性引物(人GAPDH引物的碱基序列记载于序列号70和71)。

其结果如图1所示，人PDS5A基因在大部分癌细胞株、即白血病、恶性淋巴瘤、前列腺癌、肝癌、乳癌、胰癌、卵巢癌、肾癌、大肠癌、胃癌、恶性脑肿瘤、肺癌、食道癌中检测到表达。

(2)人癌组织中的PDS5A蛋白质的表达(免疫组织化学染色)

使用石蜡包埋的多种癌组织阵列(BⅠOMAX社制)的癌组织72个样本，进行免疫组织化学染色。将人癌组织阵列在60℃处理3小时后，装入充满二甲苯的染色瓶中将每隔5分钟替换二甲苯的操作重复3次。接着用乙醇和PBS-T代替二甲苯进行同样的操作。在充满包含0.05％Tween20的10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)的染色瓶中加入人癌组织阵列，在125℃处理5分钟后，在室温静置40分钟以上。用Kimwipe(无尘擦拭纸)擦去切片周围多余的水分，用DAKOPEN包围，滴加适量的Peroxidase Block(DAKO社制)。室温静置5分钟后，放入充满PBS-T的染色瓶中，将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。作为封闭液，添加包含10％FBS的PBS-T溶液，在湿润箱内室温静置1小时。接着，添加将与PDS5A蛋白质反应的市售兔多克隆抗体(sigma社)用包含5％FBS的PBS-T溶液调制为10μg/mL而得的溶液，在湿润箱内4℃静置一晚。用PBS-T进行3次10分钟的洗涤后，适量滴加Peroxidase Labelled PolymerConjugated(DAKO社制)，在湿润箱内室温静置30分钟。用PBS-T进行3次10分钟的洗涤后，添加DAB显色液(DAKO社制)，室温静置10分钟左右后，丢弃显色液，用PBS-T进行3次10分钟的洗涤后，用蒸馏水淋洗，依次放入70％、80％、90％、95％、100％的各乙醇溶液中各1分钟后，在二甲苯中静置一晚。取出载玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAKO社制)封入后，进行观察。

其结果是，在PDS5A蛋白质在验证的绝大多数癌、前列腺癌、肝癌、乳癌、胰癌、卵巢癌、肾癌、大肠癌、胃癌、恶性脑肿瘤、肺癌、食道癌中确认了强的表达。

＜实施例2：肽表位反应性CD8阳性T细胞的诱导＞

(1)结合HLA-A0201和HLA-A24的肽基序的预测

从GenBank获得序列号2所示的人PDS5A蛋白质的氨基酸序列的信息。为了预测HLA-A0201和HLA-A24的结合基序，使用利用了公知的BⅠMAS软件(可在http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/利用)的计算机预测程序对人PDS5A蛋白质的氨基酸序列进行分析，选择了预想能结合HLA-A0201分子的由序列号3～19所示的氨基酸序列组成的多肽17种、预想能结合HLA-A24分子的由序列号20～34所示的氨基酸序列组成的多肽14种。选择的全部多肽委托株式会社グライナー·ジャパン的订制肽合成服务进行合成。此外，合成的多肽通过HPLC分析和质谱分析来保证品质。

(2)肽表位反应性CD8阳性T细胞的诱导

从HLA-A0201阳性的健常人分离外周血，叠层于Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika，Durham，NC)，以1500rpm室温离心分离20分钟。回收含有PBMC的级分，在冷却磷酸盐缓冲液中洗涤3次(或3次以上)，得到PBMC。将所得的PBMC悬浮于AⅠM-V培养基(Life Technololgies社制)20mL中，在培养烧瓶(Falcon社制)中在37℃、5％CO₂的条件下使其附着2小时。非附着细胞用于制备T细胞，附着细胞用于制备树突状细胞。

将附着细胞在AⅠM-V培养基中在ⅠL-4(1000U/mL)和GM-CSF(1000U/mL)的存在下培养。6日后交换成添加有ⅠL-4(1000U/mL)、GM-CSF(1000U/mL)、ⅠL-6(1000U/mL、Genzyme社制)、ⅠL-1β(10ng/mL、Genzyme社制)和TNF-α(10ng/mL、Genzyme社制)的AⅠM-V培养基，进一步培养2日后，使用所得的非附着细胞集团作为树突状细胞。

将制备的树突状细胞以1×10⁶细胞/mL的细胞密度悬浮于AⅠM-V培养基中，以10μg/mL的浓度添加上述(1)中选择的预想能结合HLA-A0201分子的肽，使用96孔板在37℃、5％CO₂的条件下培养4小时。培养后，进行X射线照射(3000rad)，用AⅠM-V培养基洗涤，用含有10％人AB血清(Nabi社制)、ⅠL-6(1000U/mL)和ⅠL-12(10ng/mL，Genzyme社制)的AⅠM-V培养基中悬浮，在24孔板每1孔中分别添加各1×10⁵个细胞。进一步将制备的T细胞集团在每1孔中分别添加1×10⁶细胞，在37℃、5％CO₂的条件下培养。7日后，丢弃各培养上清，将用与上述同样地得到的各肽处理后经X射线照射的树突状细胞用含有10％人AB血清(Nabi社制)、ⅠL-7(10U/mL，Genzyme社制)和ⅠL-2(10U/mL，Genzyme社制)的AⅠM-V培养基悬浮(细胞密度：1×10⁵细胞/mL)，在24孔板的每1孔中分别添加各1×10⁵个细胞，进一步培养。将同样的操作每隔7日重复，重复4次后，回收经刺激的T细胞，用流式细胞仪确认CD8阳性T细胞的诱导。

此外，作为阴性对照，使用本发明的范围外的序列的肽(序列号74)，使用结合HLA-A0201分子的已知的肽(序列号75～83)和基于WO2011/027807的实施例5制作的由序列号2所示的氨基酸序列组成的PDS5A蛋白质作为比较例，进行与上述同样的处理。

另外，对于预想能结合HLA-A24分子的肽，也使用从HLA-A24阳性的健常人的外周血诱导的树突状细胞和T细胞集团通过与上述同样的方法尝试肽表位反应性CD8阳性T细胞的诱导。此外，作为阴性对照，使用本发明的范围外的序列的肽(序列号84)，使用上述由序列号2所示的氨基酸序列组成的PDS5A蛋白质作为比较例进行同样的处理。

＜实施例3：细胞毒性T细胞抗原表位的确定＞

(1)IFN-γ产生能力

为了对于实施例2(2)诱导的T细胞分别研究针对表位肽和蛋白质的特异性，对表达HLA-A0201分子的树突状细胞脉冲各种多肽。所述树突状细胞，以10μg/mL的浓度在AⅠM-V培养基中添加各多肽，在37℃、5％CO₂的条件下培养4小时，从而制备。另外，各种多肽使用预想能结合HLA-A0201分子的序列号3～19的氨基酸序列所示的各多肽、阴性对照多肽(序列号74)、结合HLA-A0201分子的已知的多肽(序列号75～83)和由序列号2所示的氨基酸序列组成的PDS5A蛋白质。对脉冲后的树突状细胞5×10⁴个，添加5×10³个T细胞，在包含10％人AB血清的AⅠM-V培养基中以96孔板培养24小时。取培养后的上清，通过ELⅠSA法测定IFN-γ的产生量。

其结果是，与使用未脉冲多肽的树突状细胞和阴性对照多肽的带1和2相比，使用脉冲了序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽的树突状细胞的带13～29确认了明显高的IFN-γ产生(图2)。由结果判明，序列号3～19的肽是具有特异性地刺激HLA-A0201阳性CD8阳性T细胞增殖、诱导IFN-γ产生的能力的T细胞表位肽。进而判明，使用这些肽的IFNγ的产生量，也显著高于由经结合HLA-A0201分子的序列号75～83所示的氨基酸序列的已知的肽(带4～12)和由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质(带3)刺激的T细胞产生的IFNγ。即，显示序列号3～19的多肽具有与到目前为止报告的肽相比显著高的免疫诱导活性。另外，虽然序列号2所示的全长PDS5A蛋白质的氨基酸序列中包含上述具有免疫诱导活性的序列号3～19，但是由经序列号2的全长PDS5A蛋白质刺激的T细胞产生的IFN-γ的产生量低。考虑这是因为，全长PDS5A蛋白质的氨基酸序列中也包含大量抑制免疫诱导活性的序列，因而不显示充分的免疫诱导活性。

进而，与上述同样地，为了对于实施例3(2)中使用序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽诱导的肽表位反应性CD8阳性T细胞调查针对肽表位的特异性，依据上述方法通过ELⅠSA法，针对脉冲了序列号20～34多肽(带4～18)、序列号84的氨基酸序列所示的阴性对照多肽、序列号2的氨基酸序列所示的全长PDS5A蛋白质的表达HLA-A24分子的树突状细胞，测定T细胞的IFN-γ的产生量。

其结果是，与未脉冲多肽的树突状细胞的带1和使用了阴性对照多肽的带2相比，使用脉冲了序列号20～34的多肽的树突状细胞的带4～18中，在培养上清确认了显著的IFN-γ产生(图3)。

由该结果判明，序列号20～34的多肽是具有特异性地刺激HLA-A24阳性CD8阳性T细胞增殖、诱导IFN-γ产生的能力的T细胞表位肽。进而还判明，使用这些多肽的IFNγ的产生量与从经序列号2的氨基酸序列所示的全长PDS5A蛋白质刺激的T细胞产生的IFNγ相比显著高。基于与上述同样的理由，考虑全长PDS5A蛋白质不显示充分的免疫诱导活性。

(2)细胞毒性评价

接下来研究，本发明中使用的序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽是否被呈递在HLA-A0201阳性且表达人PDS5A蛋白质的肿瘤细胞上的HLA-A0201分子上，以及经本发明的多肽刺激的CD8阳性T细胞是否毒害HLA-A0201阳性且表达人PDS5A蛋白质的肿瘤细胞，进而是否与经已知的肽(序列号75～83)和经PDS5A蛋白质刺激的CD8阳性T细胞相比显著毒害肿瘤细胞。

将确认了表达人PDS5A蛋白质的人神经胶质瘤(恶性脑肿瘤)细胞株U251细胞、白血病细胞株Jurkat细胞、肝癌细胞株SK-Hep1、乳癌细胞株MCF7、胰癌细胞株Panc1、卵巢癌细胞株OVCAR3、肾癌细胞株A498、大肠癌细胞株HCT116、胃癌细胞株KATO3、和肺癌细胞株NCⅠ-H522(从ATCC购买)共计10种细胞株各1×10⁶个分别收集在50mL容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用包含10％胎牛血清(以下称为FBS、キブコ社制)的RPMⅠ培养基(キブコ社制)洗涤3次，在96孔V底板的每1孔中各添加1×10³个，进一步在其中分别添加用包含10％的FBS的RPMⅠ培养基悬浮的5×10⁴个通过序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽、阴性对照多肽(序列号74)、已知的肽(序列号75～83)和序列号2的氨基酸序列所示的全长PDS5A蛋白质刺激而诱导的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞，在37℃、5％CO₂的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的肿瘤细胞释放的培养上清中的铬51的量，从而计算出经各多肽和蛋白质的刺激而诱导的CD8阳性T细胞的细胞毒活性。

其结果判明，经序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽刺激而诱导的HLA-A0201阳性的CD8阳性T细胞对上述10种细胞全部具有通常无法预想地显著的细胞毒活性。作为代表例，图4A和4B显示分别针对U251细胞和Jurkat细胞的细胞毒活性的结果。经序列号3～19的氨基酸序列所示的多肽刺激的CD8阳性T细胞(分别为带13～29)，与经序列号75～83的氨基酸序列所示的多肽(分别为带4～12)和全长PDS5A蛋白质刺激的CD8阳性T细胞(带3)相比，对U251细胞和Jurkat细胞显示显著高的细胞毒活性。另一方面，使用阴性对照的多肽(带2)诱导的CD8阳性T细胞与Mock(带1)为同程度，不显示细胞毒活性。该结果提示，本发明中使用的序列号3～19的多肽被呈递到HLA-A0201阳性且表达人PDS5A多肽的肿瘤细胞上的HLA-A0201分子上，进而本发明的多肽具有无法预想的程度的诱导能够毒害这样的肿瘤细胞的CD8阳性细胞毒性T细胞的能力。另外，全长PDS5A蛋白质的氨基酸序列中虽然包含序列号3～19，但比经序列号3～19的多肽刺激的CD8阳性T细胞的细胞毒活性显著弱(带3、13～29)。考虑这是因为，PDS5A蛋白质的氨基酸序列中包含大量抑制免疫诱导活性的序列，因而不能诱导具有强的细胞毒活性的T细胞。

同样地，研究序列号20～34的多肽是否被呈递在HLA-A24阳性且表达人PDS5A蛋白质的肿瘤细胞上的HLA-A24分子上，以及经本发明的多肽刺激的CD8阳性T细胞能否毒害HLA-A24阳性且表达人PDS5A蛋白质的肿瘤细胞，进而是否与经PDS5A蛋白质刺激的CD8阳性T细胞相比显著地毒害肿瘤细胞。

使HLA-A24阳性且表达人PDS5A蛋白质的白血病细胞株THP1、人神经胶质瘤细胞株KNS-42、肝癌细胞株SK-Hep1、肾癌细胞株Caki1、大肠癌细胞株SW480、胃癌细胞株KATO3(从理化学研究所和ATCC购买)的共计6种掺入铬51，测定培养经序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽、阴性对照多肽(序列号84)、和全长PDS5A蛋白质刺激而诱导的HLA-A24阳性的CD8阳性T细胞时，从受到毒害的细胞释放的培养上清中的铬51的量。

其结果判明，经序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽刺激的HLA-A24阳性的CD8阳性T细胞对所使用的全部癌细胞具有通常无法预想地显著的细胞毒活性。作为代表例，图5A和5B分别显示针对THP1细胞和SW480细胞的细胞毒活性的结果。经序列号20～34的氨基酸序列所示的多肽刺激的CD8阳性T细胞(分别为带4～18)，与经全长PDS5A蛋白质刺激的CD8阳性T细胞(带3)相比，对THP1细胞和SW480细胞显示显著高的细胞毒活性。另一方面，使用阴性对照的多肽诱导的CD8阳性T细胞与Mock(带1)为同程度，不显示细胞毒活性(带2)。因此，序列号20～34被呈递在HLA-A24阳性且表达人PDS5A蛋白质的细胞上的HLA-A24分子上，该结果显示本发明的多肽具有诱导能够毒害这样的细胞的CD8阳性细胞毒性T细胞的能力。

另一方面，使上述14种癌细胞暴露于序列号3～34的氨基酸序列所示的多肽和由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质，结果癌细胞完全没有死灭。由此也确认，这些多肽并没有直接杀伤癌细胞的作用。

细胞毒活性如上所述，是显示将经本发明中使用的各多肽刺激诱导的CD8阳性T细胞5×10⁴个与掺入了铬51的1×10³个各肿瘤细胞混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式＊算出的CD8阳性T细胞对各肿瘤细胞(称为靶标细胞)的细胞毒活性的结果。

＊式：细胞毒活性(％)＝加入CD8阳性T细胞时从靶标细胞游离的铬51游离量÷从加入了1N盐酸的靶标细胞游离的铬51游离量×100

＜实施例4：来自PDS5A蛋白质的肽表位反应性CD4阳性T细胞的诱导＞

为了预测CD4阳性T细胞抗原表位，使用SYFPEⅠTHⅠ算法(Rammensee著)的计算机预测程序分析人PDS5A蛋白质的氨基酸序列，选择了预想为HLA II类结合肽的序列号35～67所示的33种肽。选择的全部肽委托株式会社グライナー·ジャパン的订制肽合成服务进行合成。

从HLA-DRB1＊04阳性的健常人分离外周血，叠层于Lymphocyte separationmedium(OrganonpTeknika社制)，以1500rpm室温离心分离20分钟。回收含有PBMC的级分，在冷却磷酸盐缓冲液中洗涤3次(或3次以上)，得到PBMC。将所得的PBMC悬浮于AⅠM-V培养基(Life Technololgies社制)20mL中，在培养烧瓶(Falcon社制)中在37℃、5％CO₂的条件下使其附着2小时。非附着细胞用于制备T细胞，附着细胞用于制备树突状细胞。

另一方面，将附着细胞在AⅠM-V培养基中在ⅠL-4(1000U/mL)和GM-CSF(1000U/mL)的存在下培养。6日后交换成添加有ⅠL-4(1000U/mL)、GM-CSF(1000U/mL)、ⅠL-6(1000U/mL、Genzyme社制)、ⅠL-1β(10ng/mL、Genzyme社制)和TNF-α(10ng/mL、Genzyme社制)的AⅠM-V培养基，进一步培养2日后，使用所得的非附着细胞集团作为树突状细胞。

将制备的树突状细胞以1×10⁶细胞/mL的细胞密度悬浮于AⅠM-V培养基中，分别以10mg/mL的浓度添加序列号35～67的各多肽、阴性对照多肽(序列号85)和由序列号2所示的氨基酸序列组成的PDS5A蛋白质，使用96孔板在37℃、5％CO₂的条件下培养4小时。培养后，进行X射线照射(3000rad)，用AⅠM-V培养基洗涤，用含有10％人AB血清(Nabi社制)、ⅠL-6(1000U/mL)和ⅠL-12(10ng/mL，Genzyme社制)的AⅠM-V培养基悬浮，在24孔板每1孔中分别添加各1×10⁵个细胞。进一步将制备的T细胞集团在每1孔中分别添加1×10⁶细胞，在37℃、5％CO₂的条件下培养。7日后，丢弃各培养上清，将用与上述同样地得到的各肽和PDS5A蛋白质处理后经X射线照射的树突状细胞用含有10％人AB血清(Nabi社制)和ⅠL-2(10U/mL、Genzyme社制)的AⅠM-V培养基悬浮，在24孔板的每1孔中分别添加各1×10⁵细胞，进一步培养。将同样的操作每隔7日重复，重复4次后，回收经刺激的T细胞，用流式细胞仪确认CD4阳性T细胞的诱导。其结果确认了诱导的各孔的T细胞增殖。

＜实施例5：刺激HLA-DRB1＊04阳性CD4阳性T细胞的来自PDS5A蛋白质的辅助性T细胞抗原表位的确定＞

为了调查上述实施例4中诱导的CD4阳性T细胞对各肽蛋白质的特异性，用各种多肽脉冲表达HLA-DRB1＊04分子的PBMC。所述PBMC以10μg/mL的浓度在AⅠM-V培养基中添加各多肽，在37℃、5％CO₂的条件下培养4小时，从而制备。另外，各种多肽使用序列号35～67的氨基酸序列所示的各多肽、阴性对照多肽(序列号85)和由序列号2所示的氨基酸序列组成的全长PDS5A蛋白质。对脉冲后的PBMC 5×10⁴个，添加5×10⁴个CD4阳性T细胞，在包含10％人AB血清的AⅠM-V培养基中以96孔板培养24小时。取培养后的上清，通过ELⅠSA法测定IFN-γ的产生量。

其结果是，在使用分别脉冲了序列号35～67的各肽的PBMC的孔的培养上清中，产生了1000pg/mL以上的IFN-γ。另一方面，在仅使用了阴性对照多肽和未脉冲多肽的树突状细胞的(Mock)的孔的培养上清中基本没有发现IFN-γ的产生。因此判明了，序列号35～67的氨基酸序列所示的各种多肽是具有特异性地刺激HLA-DRB1＊04阳性CD4阳性T细胞增殖、诱导IFN-γ产生的能力的T细胞表位肽。此外，全长PDS5A蛋白质的氨基酸序列中虽然包含上述具有免疫诱导活性的序列号35～67，但使用脉冲了全长PDS5A蛋白质的PBMC胞的孔的培养上清中的IFN-γ的产生量极少。考虑这是因为，PDS5A蛋白质的氨基酸序列中包含大量抑制免疫诱导活性的序列，因而不显示充分的免疫诱导活性。

接下来，对于具有刺激HLA-DRB1＊04阳性T细胞增殖的能力的序列号35～67的多肽是否是由PDS5A蛋白质在抗原呈递细胞内被天然加工而呈递在HLA-DR上的表位进行研究。将一过性表达PDS5A蛋白质的HEK293细胞(从ATCC购买)的裂解液添加到未成熟树突状细胞中使其消化，使树突状细胞成熟化后，调查经序列号35～67的多肽、阴性对照多肽和PDS5A蛋白质刺激的T细胞是否受到本树突状细胞刺激。从HLA-DRB1＊04阳性的健常人分离外周血，叠层于Lymphocyte separation medium，以1500rpm室温离心分离20分钟。收获含有PBMC的级分，在冷却磷酸盐缓冲液中洗涤3次(或3次以上)，得到PBMC。将所得的PBMC悬浮于AⅠM-V培养基(Life Technololgies社制)20mL中，在培养烧瓶(Falcon社制)中在37℃、5％CO₂的条件下使其附着2小时，将附着细胞在AⅠM-V培养基中在ⅠL-4(1000U/mL)和GM-CSF(1000U/mL)存在下培养6日，制作未成熟树突状细胞。将上述裂解液添加到5×10⁵个未成熟树突状细胞中，在添加了ⅠL-4(1000U/mL)、GM-CSF(1000U/mL)、ⅠL-6(1000U/mL)、ⅠL-1β(10ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)的AⅠM-V培养基中培养2日。将培养后的树突状细胞进行X射线照射(3000rad)，用AⅠM-V培养基洗涤后，用含有10％人AB血清的AⅠM-V培养基悬浮，在96孔板的每1孔中分别添加各3.3×10⁴个。在其中添加5×10⁴个经序列号35～67的多肽阴性对照多肽和PDS5A蛋白质刺激的T细胞，在37℃、5％CO₂的条件下培养24小时。取培养后的上清，通过ELⅠSA法测定IFN-γ的产生量。

其结果如图6所示，可知经序列号35～67的多肽刺激的带4～36的T细胞通过添加了PDS5A蛋白质的树突状细胞的刺激而产生IFN-γ。另一方面，带2所示的经阴性对照多肽刺激的带2和未经多肽刺激的带1基本没有发现IFN-γ的产生。因此明确了，序列号35～67的多肽是PDS5A蛋白质在抗原呈递细胞内被自然加工而呈递在HLA-DR上的表位。此外，本实验中也脉冲了全长PDS5A蛋白质的带3，IFN-γ的产生量极少。考虑由于全长PDS5A蛋白质的氨基酸序列中包含大量抑制免疫诱导活性的序列，因而不显示充分的免疫诱导活性。

产业可利用性

本发明的包含对各种癌发挥抗肿瘤活性的多肽的免疫诱导剂对癌的治疗或预防、或癌的检测有用。

将本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims

1.免疫诱导剂，含有以下(i)或(ii)作为有效成分，

2.根据权利要求1所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽能结合MHCⅠ类分子。

3.根据权利要求2所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽是选自以下(c)～(e)所述的多肽组的任一多肽，

(c)由序列号3～34所示的氨基酸序列组成的多肽，

(e)包含上述(c)或(d)所述的多肽作为部分序列的多肽。

4.根据权利要求1所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽能结合MHCⅡ类分子。

5.根据权利要求4所述的免疫诱导剂，上述(i)所述的多肽是选自以下(f)～(h)所述的多肽组的任一多肽，

(f)由序列号35～67所示的氨基酸序列组成的多肽，

(h)包含上述(f)或(g)所述的多肽作为部分序列的多肽。

6.根据权利要求1～5的任一项所述的免疫诱导剂，作为癌的治疗或预防药的有效成分使用。

7.根据权利要求6所述的免疫诱导剂，上述癌是表达PDS5A蛋白质的癌。

8.根据权利要求6或7所述的免疫诱导剂，上述癌是白血病、恶性淋巴瘤、前列腺癌、肝癌、乳癌、胰癌、卵巢癌、肾癌、大肠癌、胃癌、恶性脑肿瘤、肺癌或食道癌。

9.根据权利要求1～8的任一项所述的免疫诱导剂，还包含免疫增强剂。

10.具有免疫诱导活性的多肽，是选自以下(a)或(b)所述的多肽组的任一多肽，

11.根据权利要求10所述的多肽，是选自以下(c)～(e)所述的多肽组的任一多肽，

(c)由序列号3～34所示的氨基酸序列组成的多肽，

(e)包含上述(c)或(d)所述的多肽作为部分序列的多肽。

12.根据权利要求10所述的多肽，是选自以下(f)～(h)所述的多肽组的任一多肽，

(f)由序列号35～67所示的氨基酸序列组成的多肽，

(h)包含上述(f)或(g)所述的多肽作为部分序列的多肽。

13.分离的抗原呈递细胞，包含权利要求10～12的任一项所述的具有免疫诱导活性的多肽与MHC分子的复合体。

14.分离的T细胞，能选择性地结合权利要求10～12的任一项所述的具有免疫诱导活性的多肽与MHC分子的复合体。