KR20180037999A

KR20180037999A - 면역 유도제

Info

Publication number: KR20180037999A
Application number: KR1020187006155A
Authority: KR
Inventors: 아키라 쿠리하라; 후미요시 오카노
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2018-04-13
Also published as: US11510971B2; US20230190899A1; RU2018107330A; AU2016306408A1; US20180200356A1; JP7181676B2; FI3335725T3; RU2021127767A; RU2018107330A3; WO2017026389A1; EP3335725B1; CN107847573A; DK3335725T3; CA2993427A1; AU2016306408B2; EP3335725A1; EP3335725A4; RU2758112C2; CN107847573B; MX2018001298A

Abstract

암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 유용한 신규인 펩티드를 발견하여 상기 폴리펩티드의 면역 유도제로서의 사용을 제공하는 것을 과제로 한다.
(a) 서열 번호 35~67에 나타내어지는 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, (b) 상기 (a)의 폴리펩티드 중 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도제는 암의 치료 또는 예방약 등으로서 유용하다.

Description

면역 유도제

본 발명은 암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 유용한 신규인 면역 유도제에 관한 것이다.

PDS5A(PDS5, regulator of cohesion maintenance, homolog A) 단백질은 별명 SSC-112로도 불리고, 염색체의 분배 시에 관여하는 세포주기 제어 인자로서 동정된 단백질이다.

PDS5A 단백질은 발암과의 관련성이 시사되어 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에서는 PDS5A 단백질이 정상 조직에 비해 상인두암, 신장암, 간암, 유방암 세포의 1종에서의 발현이 높은 것이 개시되어 있다. 또한, 암세포 중의 PDS5A 단백질의 발현을 PDS5A 유전자에 대한 안티센스 핵산, 리보자임, siRNA, 또는 항 PDS5A 단백질항체를 사용하여 억제함으로써 암세포의 증식을 억제할 수 있는 것이나, PDS5A의 전장 단백질 또는 상기 단백질의 부분 펩티드를 투여함으로써 암세포에 아포토시스를 유도할 수 있는 것도 개시되어 있다.

특허문헌 2에서는 MHC클래스 I의 서브 타입인 HLA-A0201에 결합하는 PDS5A 단백질 및 상기 단백질의 부분 펩티드가 암세포에 대한 면역 유도 활성을 갖고 있고, 그러므로 암의 치료나 예방에 유용한 것이 개시되어 있다. 그러나, 특허문헌 2에는 HLA-A0201에 결합하는 모든 펩티드는 개시되어 있지 않고, 또한 HLA-A0201 이외의 서브 타입에 결합하는 펩티드 대한 정보는 개시되어 있지 않다.

WO 2002/081641 WO 2011/027807

본 발명의 과제는 암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 유용한 신규 폴리펩티드를 발견하고, 상기 폴리펩티드의 면역 유도제로서의 사용을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 과제는 상기 폴리펩티드와 HLA 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원제시세포 및 상기 폴리펩티드와 HLA 분자의 복합체를 선택적으로 결합하는 단리 T세포, 및 그들의 암의 치료 또는 예방약을 제공하는 것이다.

본원발명자들은 예의 연구의 결과, 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 인간 PDS5A 단백질이 백혈병, 악성림프종, 유방암, 간암, 전립선암, 췌장암, 난소암, 신장암, 대장암, 위암, 악성뇌종양, 식도암 및 폐암의 조직 또는 세포에 특이적으로 발현하고 있다는 지견을 얻었다. 또한, 상기 PDS5A 단백질의 특정 영역에 존재하는 부분 펩티드가 항원제시세포에 의해 제시되어 상기 폴리펩티드에 특이적인 T세포를 활성화 및 증식시키는 능력(면역 유도 활성)을 갖는 것, 및 상기 면역 유도 활성이 암의 치료 또는 예방에 유용한 것을 발견했다. 그들의 결과에 의거하여 상기 폴리펩티드가 암의 치료 및/또는 예방을 위한 면역 유도제의 유효 성분이 될 수 있는 것, 또한 상기 펩티드와 접촉한 항원제시세포나 상기 항원제시세포와 접촉한 T세포도 암의 치료 또는 예방에 유용한 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 이하의 (1)~(14)의 특징을 갖는다.

(1) 이하의 (i) 또는 (ii)를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도제.

(i) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드,

(a) 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 및 1074~1215위치의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드

(b) 상기 (a)에 기재된 어느 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드, 또는

(ii) 상기 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적어도 1개 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터

(2) (1)에 있어서, 상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 MHC클래스 I 분자에 결합하는 면역 유도제.

(3) (2)에 있어서, 상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 이하의 (c)~(e)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 면역 유도제.

(c) 서열 번호 3~34에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(d) 상기 (c)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드

(e) 상기 (c) 또는 (d)에 기재된 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드

(4) (1)에 있어서, 상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 MHC클래스 II 분자에 결합하는 면역 유도제.

(5) (4)에 있어서, 상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 이하의 (f)~(h)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 면역 유도제.

(f) 서열 번호 35~67에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(g) 상기 (f)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드

(h) 상기 (f) 또는 (g)에 기재된 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드

(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 사용하는 면역 유도제.

(7) (6)에 있어서, 상기 암이 PDS5A 단백질을 발현하는 암인 면역 유도제.

(8) (6) 또는 (7)에 있어서, 상기 암이 백혈병, 악성림프종, 전립선암, 간암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암, 대장암, 위암, 악성뇌종양, 폐암 또는 식도암인 면역 유도제.

(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 면역 증강제를 더 포함하는 면역 유도제.

(10) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드.

(a) 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 및 1074~1215위치의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드,

(b) 상기 (a)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드.

(11) (10)에 있어서, 이하의 (c)~(e)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 폴리펩티드.

(12) (10)에 있어서, 이하의 (f)~(h)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 폴리펩티드.

(g) 상기 (f)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드

(13) (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원제시세포.

(14) (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합하는 단리 T세포.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원번호 2015-158539호의 개시 내용을 포함한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의해 암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 유용한 신규인 면역 유도제가 제공된다.

또한, 후술하는 실시예에 있어서 구체적으로 나타내어지는 바와 같이 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드에 의해 암세포를 살상하는 면역 세포를 유도할 수 있고, 이미 발생해 있는 암을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 펩티드에 의해 암세포를 살상하는 면역 세포의 유도를 증강할 수 있고, 이미 발생해 있는 암을 축소 또는 퇴축시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 암의 치료나 예방약의 유효 성분으로서 유용하다.

도 1은 PDS5A 유전자의 인간 종양 조직 또는 암세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조번호 1; 인간 PDS5A 유전자의 발현 패턴을 나타낸다. 참조번호 2; 인간의 하우스키핑 유전자인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 서열 번호 3~19에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포가 상기 폴리펩티드와 HLA-A0201의 복합체를 인식하여 IFN-γ를 산생하는 것을 나타내는 도면이다. 도면 중, 가로축의 레인 13~29는 각각 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 펄스한 수지상세포의 자극에 의한 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 상기 처리를 행했을 경우에 대한 결과(Mock)를 나타내고, 레인 2는 서열 번호 74에 나타내는 본 발명의 범위 외의 음성 컨트롤 폴리펩티드를 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타내고, 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타내고, 그리고 레인 4~12는 서열 번호 75~83에 나타내는 본 발명의 범위 외의 폴리펩티드를 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타낸다.
도 3은 서열 번호 20~34에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포가 상기 폴리펩티드와 HLA-A24의 복합체를 인식하여 IFN-γ를 산생하는 것을 나타내는 도면이다. 도면 중, 가로축의 레인 4~18은 각각 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 펄스한 수지상세포의 자극에 의한 HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 상기 처리를 행했을 경우에 대한 결과(Mock)를 나타내고, 레인 2는 서열 번호 84에 나타내는 본 발명의 범위 외의 음성 컨트롤 펩티드를 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타내고, 그리고 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타낸다.
도 4a는 서열 번호 3~19에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포의 암세포에 대한 장해활성을 나타내는 도면이다. 도면 중, 가로축의 레인 13~29는 각각 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 사용하여 유도한 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포의 U251세포에 대한 세포장해활성을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 유도한 CD8 양성 T세포(Mock)의 세포장해활성을 나타내고, 레인 2는 음성 컨트롤의 폴리펩티드(서열 번호 74)를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 그리고 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 그리고 레인 4~12는 각각 서열 번호 75~83에 나타내는 본 발명의 범위 외의 폴리펩티드를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타낸다.
도 4b는 서열 번호 3~19에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포의 암세포에 대한 장해활성을 나타내는 도면이다. 도면 중, 가로축의 레인 12~28은 각각 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 사용하여 유도한 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포의 Jurkat 세포에 대한 세포장해활성을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 유도한 CD8 양성 T세포(Mock)의 세포장해활성을 나타내고, 레인 2는 음성 컨트롤의 폴리펩티드(서열 번호 74)를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 그리고 레인 4~11은 각각 서열 번호 75~83에 나타내는 본 발명의 범위 외의 폴리펩티드를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타낸다.
도 5a는 서열 번호 20~34에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포의 암세포에 대한 장해활성을 나타내는 도면이다. 가로축의 레인 4~18은 각각 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 사용하여 자극한 HLA-A24 양성의 CD8 양성 T세포의 THP1세포에 대한 세포장해활성을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 유도한 CD8 양성 T세포(Mock)의 세포장해활성을 나타내고, 레인 2는 음성 컨트롤의 폴리펩티드(서열 번호 84)를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 그리고 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 PDS5A 단백질을 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타낸다.
도 5b는 서열 번호 20~34에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포의 암세포에 대한 장해활성을 나타내는 도면이다. 가로축의 레인 4~18은 각각 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 사용하여 자극한 HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포의 SW480세포에 대한 세포장해활성을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 유도한 CD8 양성 T세포(Mock)의 세포장해활성을 나타내고, 레인 2는 음성 컨트롤의 폴리펩티드(서열 번호 84)를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 그리고 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 PDS5A 단백질을 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타낸다.
도 6은 서열 번호 35~67에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD4 양성 T세포가 상기 폴리펩티드와 HLA-DRB1*04의 복합체를 인식하여 IFN-γ를 산생하는 것을 나타내는 도면이다. 레인 4~36은 각각 서열 번호 35~67의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 펄스한 수지상세포의 자극에 의한 HLA-DRB1*04 양성 CD4 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 레인 1은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 상기 처리를 행했을 경우에 대한 Mock의 결과를 나타내고, 레인 2는 서열 번호 85에 나타내는 본 발명의 범위 외의 음성 컨트롤 폴리펩티드를 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타내고, 그리고 레인 3은 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 첨가하여 상기 처리를 행한 결과를 나타낸다.

<폴리펩티드>

본 발명에 있어서, 「폴리펩티드」란 복수의 아미노산이 펩티드 결합함으로써 형성되는 분자를 말한다. 구성하는 아미노산 수가 많은 폴리펩티드 분자뿐만 아니라 아미노산 수가 적은 저분자량의 분자(올리고펩티드)도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.

본 발명의 면역 유도제를 구성하는 폴리펩티드에는 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드를 들 수 있다.

(a) 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 인간 PDS5A 단백질에 있어서, 개시 메티오닌을 1위치로 했을 때에 24~97위치(74아미노산), 113~132위치(20아미노산), 134~197위치(64아미노산), 204~225위치(22아미노산), 265~332위치(68아미노산), 378~463위치(86아미노산), 472~498위치(27아미노산), 533~567위치(35아미노산), 613~643위치(31아미노산), 671~735위치(65아미노산), 737~780위치(44아미노산), 792~830위치(39아미노산), 832~899위치(68아미노산), 920~943위치(24아미노산), 946~993위치(58아미노산), 1029~1069위치(41아미노산), 및 1074~1215위치(142아미노산)의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드

(b) 상기 (a)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드.

또한, 본 발명에 있어서, 「아미노산 서열로 이루어지는」이란 아미노산 잔기가 그와 같은 순서로 배열되어 있다는 의미이다. 따라서, 예를 들면 「서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드」란 서열 번호 2에 나타내어지는 Met Asp Phe Thr···(중략) ···Asp Leu Gln Arg의 아미노산 서열을 갖는 1337아미노산 잔기의 사이즈의 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 본 명세서에서는, 예를 들면 「서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드」를 종종 「서열 번호 2의 폴리펩티드」로 약기한다. 「염기 서열로 이루어진다」라는 표현에 대해서도 마찬가지이다.

또한, 본 발명에서 「면역 유도 활성」이란 PDS5A 단백질을 발현하는 암세포에 대하여 반응하는 T세포를 활성화 및 증식시키는 능력을 의미한다. 구체적으로는 PDS5A 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드에 의해 자극된 세포장해성 T세포 및/또는 헬퍼 T세포의 IFN-γ 산생능력이 자극되어 있지 않은 대조 T세포의 그것보다 높은 것, PDS5A 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드에 의해 자극된 세포장해성 T세포의 PDS5A 단백질 발현 암세포에 대한 세포장해활성이 자극되어 있지 않은 대조의 T세포의 그것보다 높은 것, PDS5A 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드에 의해 자극된 헬퍼 T세포가 세포장해성 T세포의 세포장해활성을 자극되어 있지 않은 대조의 T세포의 그것보다 증강하는 것, 또는 PDS5A 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드에 의해 자극된 세포장해성 T세포 또는 헬퍼 T세포가 자극되어 있지 않은 대조의 T세포의 그것보다 잘 증식하는 것을 의미한다.

세포의 증식은 육안 관찰, 현미경하에서의 세포수 계측, 플로 사이토메트리, 배지 중의 트리튬티미딘의 세포 내로의 도입량 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, IFN-γ 산생능력의 측정은, 예를 들면 공지의 ELISPOT 어세이 등을 사용하여 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이 우선 T세포를 면역 유도 활성을 평가해야 할 폴리펩티드(본 발명에서는PDS5A 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드)와 말초혈단핵구(이하, 「PBMC」라고 표기함) 유래의 항원제시세포와 공배양함으로써 T세포를 평가해야 할 폴리펩티드를 제시하는 항원제시세포와 접촉시킨다. 계속해서, T세포로부터 산생된 IFN-γ를 IFN-γ에 특이적인 항체를 사용하여 측정한다. 이에 따라 상기 T세포 중의 면역 세포 수를 측정할 수 있다. 이 측정 결과로부터 면역 유도 활성을 평가할 수 있다.

또한, 세포장해활성의 측정은, 예를 들면 T세포를 세포장해활성을 평가해야 할 폴리펩티드(본 발명에서는 PDS5A 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드) 및 PBMC 유래의 항원제시세포와 공배양한 후 생체 외에서 종양세포의 증식을 억제하는 능력 또는 종양세포를 죽이는 능력(이하, 「세포장해활성」로 표기함)을 나타내는 지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다. T세포와 항원제시세포의 접촉은 후술하는 바와 같이 양자를 액체 배지 중에서 공배양함으로써 달성할 수 있다. 세포장해활성의 측정은, 예를 들면 Int. J. Cancer, 58:P317, 1994에 기재된 ⁵¹Cr 릴리스 분석이라고 불리는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기에서 유도된 T세포를 담암생체에 투여함으로써 그 T세포의 세포장해활성에 의해 종양을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 상기 면역 유도 활성은 암세포의 증식을 억제하고, 또는 암조직(종양)을 축소 또는 소멸시키는 능력(이하, 「항종양활성」으로 표기함)으로서 평가할 수도 있다.

상기 폴리펩티드를 암의 치료 또는 예방 용도에 사용할 경우에는 특별히 한정되지 않지만, 면역 유도 활성의 평가는 세포장해활성 또는 항종양활성을 지표로 하는 것이 바람직하다.

이 분야에서 공지와 같이 약 7아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 에피토프를 포함할 수 있는 점에서 항원성 및 면역원성을 발휘할 수 있고, 면역 유도 활성을 가질 수 있으므로 본 발명의 면역 유도제로서 사용할 수 있다.

따라서, 상기 (a)의 폴리펩티드는 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 또는 1074~1215위치의 영역 내에 있어서의 연속하는 7개 이상, 바람직하게는 연속하는 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 것이다. 특히 바람직하게는 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 또는 1074~1215위치로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것이다.

암 항원 폴리펩티드를 투여하는 것에 의한 면역 유도의 원리로서 폴리펩티드가 항원제시세포에 도입되고, 그 후 상기 세포 내에서 펩티다아제에 의한 분해를 받아 보다 작은 단편이 되고, 그 후 단편화된 항원 펩티드는 상기 항원제시세포의 표면상에 제시된다. 세포표면 제시된 항원을 세포장해성 T세포 등이 인식하여 상기 항원을 세포표면에 제시하고 있는 암세포를 선택적으로 죽여 가는 것이 알려져 있다. 또한, 항원제시세포의 표면상에 제시된 항원을 헬퍼 T세포가 인식하고, 그 항원을 세포표면에 제시하고 있는 암세포를 선택적으로 죽이는 세포장해성 T세포의 유도를 촉진하는 것이 알려져 있다. 항원제시세포의 표면상에 제시되는 항원 폴리펩티드의 사이즈는 비교적 작아 아미노산 수로 7~30 정도이다. 따라서, 항원제시세포상에 제시시킨다는 관점으로부터는 상기 (a)의 폴리펩티드로서는 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 또는 1074~1215위치로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 연속하는 7~30정도인 것이 바람직하다. 8~30정도, 9~30정도, 또는 9~25정도의 아미노산으로 이루어지는 것이면 충분하다. 이들 비교적 작은 사이즈의 폴리펩티드는 항원제시세포 내에 도입되는 일 없이 직접 항원제시세포상의 세포표면에 제시되는 경우도 있다.

또한, 항원제시세포에 도입된 폴리펩티드는 상기 세포 내의 펩티다아제에 의해 랜덤한 위치에서 절단을 받아 여러 가지 폴리펩티드 단편이 생기고, 이들 폴리펩티드 단편이 항원제시세포 표면상에 제시되므로 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 또는 1074~1215위치와 같이 큰 사이즈의 폴리펩티드를 투여하면 항원제시세포 내에서의 분해에 의해 항원제시세포를 개재하는 면역 유도에 유효한 폴리펩티드 단편이 필연적으로 생긴다. 따라서, 항원제시세포를 개재하는 면역 유도는 사이즈가 큰 폴리펩티드를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 아미노산 수를 30 이상, 바람직하게는 40 이상, 보다 바람직하게는 50 이상, 더 바람직하게는 100 이상으로 해도 좋다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 후술하는 MHC(인간에 있어서는 HLA)의 클래스 I 분자 또는 클래스 II 분자와의 결합 모티브를 갖는 8~25개, 바람직하게는 9~24개, 더 바람직하게는 9~23개의 아미노산으로 이루어지는 에피토프펩티드를 검색할 수 있는 대조 매체, 예를 들면 Bioinformatics & Molecular Analysis Selection(BIMAS)의 HLA Peptide Binding Predictions(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.htmL)나 SYFPEITHI에 의해 대조하여 에피토프펩티드가 될 수 있는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로는 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 또는 1074~1215위치의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 서열 번호 3~67로 나타내어지는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 3~67에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하며, 또한 아미노산 잔기 수가 10~30인 폴리펩티드를 들 수 있다. 이 중, 서열 번호 3~67로 나타내어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 3~67에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하며, 또한 아미노산 잔기 수가 10~30인 폴리펩티드 중, 서열 번호 3~67로 나타내어지는 폴리펩티드의 면역 유도 활성은 MHC클래스 I 분자와의 결합에 의한 것이며, 서열 번호 35~67로 나타내어지는 폴리펩티드의 면역 유도 활성은 MHC클래스 II 분자와의 결합에 의한 것이다.

한편, 상기 (b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드 중 1개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 치환되고, 결실되고, 및/또는 부가된 폴리펩티드이며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 서열 번호 3~67에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드를 들 수 있다.

본 명세서 중의 「수 개」에 있어서의 「수」란 2~10의 정수, 바람직하게는 2~6의 정수, 보다 바람직하게는 2~4, 더 바람직하게는 2 또는 3의 정수를 나타낸다.

일반적으로, 어떤 폴리펩티드 중 1개 또는 수 개의 아미노산의 개변은 원래의 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 생각되고, 경우에 따라서는 원래의 폴리펩티드의 소망의 기능을 강화하는 것마저 있다고 생각되고 있다. 실제로 원래의 아미노산 서열과 비교하여 1개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 개변된(즉, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된) 아미노산 서열로 구성되는 개변 펩티드는 원래의 펩티드의 생물 활성을 유지하는 것이 알려져 있다(Mark et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81:5662-5666, Zoller and Smith, 1982, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500, Dalbadie-McFarland et al., 1982, Proc Natl Acad Sci USA. 79:6409-6413). 따라서, 상기 (b)의 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 발휘할 수 있으므로 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.

또한, 천연 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)과 같이 유사 성질을 갖는 것으로 그룹화할 수 있고, 이들 사이에서의 치환이면 폴리펩티드의 성질이 변화되지 않는 것이 많은 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 (a)의 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기를 치환할 경우에는 이들 각 그룹 사이에서 치환함으로써 면역 유도 활성을 유지할 수 있는 가능성이 높아지기 때문에 바람직하다.

또한, 상기 (b)의 폴리펩티드는 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 또는 1074~1215위치와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더 바람직하게는 99% 이상 또는 99.5% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이어도 좋다.

본 명세서에 있어서 아미노산 서열(또는 염기 서열)의 「동일성」이란 비교해야 할 2개의 아미노산 서열(또는 염기 서열)의 아미노산 잔기(또는 염기)가 가능한 한 많이 일치하도록 양쪽 아미노산 서열(또는 염기 서열)을 정렬시키고, 일치한 아미노산 잔기 수(또는 일치한 염기 수)를 전체 아미노산 잔기 수(또는 전체 염기 수)로 나눈 것을 백분율로 나타낸 것이다. 상기 정렬 시에는 필요에 따라 비교하는 2개의 서열의 일방 또는 쌍방에 적당히 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는, 예를 들면 BLAST, FASTA, CLUSTAL W 등의 주지의 프로그램을 사용하여 행할 수 있다. 갭이 삽입될 경우, 상기 전체 아미노산 잔기 수는 1개의 갭을 1개의 아미노산 잔기로서 센 잔기 수가 된다. 이렇게 하여 센 전체 아미노산 잔기 수가 비교하는 2개의 서열 간에서 상이할 경우에는 서열 동일성(%)은 긴 쪽의 서열의 전체 아미노산 잔기 수이며, 일치한 아미노산 잔기 수를 나누어서 산출된다.

암치료 또는 예방과의 관련에서 사용되었을 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 HLA의 각 형과의 복합체로서 세포 또는 엑소좀의 표면상에 제시되어야 한다. 따라서, 면역 유도 활성을 가질 뿐만 아니라 HLA의 각 형에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 그 때문에 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 결실, 및/또는 부가에 의해 펩티드를 개변하여 결합 친화성이 개선된 개변 펩티드로 해도 좋다. 천연으로 제시되는 펩티드에 추가하여 HLA의 각 형으로의 결합에 의해 제시되는 펩티드의 서열의 규칙성은 기지인 점에서(J Immunol, 1994, 152:3913; Immunogenetics, 1995, 41:178; J Immunol, 1994, 155:4307) 그러한 규칙성에 의거한 개변을 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입할 수 있다. 예를 들면, HLA-A24 결합 친화성을 높이기 위해서는 N말단으로부터 2번째의 아미노산을 류신 또는 메티오닌으로 치환하는 것 및/또는 C말단의 아미노산을 발린 또는 류신으로 치환하는 것이 바람직한 가능성이 있다. 따라서, 서열 번호 20~34의 아미노산 서열을 갖는 펩티드이며, 이들 펩티드의 N말단으로부터 2번째의 아미노산이 류신 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나 및/또는 아미노산의 C말단이 발린 또는 류신으로 치환되어 있는 펩티드는 본 발명의 범위에 포함된다.

치환을 말단 아미노산의 개소뿐만 아니라 펩티드의 TCR 인식의 가능성이 있는 위치에 도입할 수도 있다. 몇개의 연구에 의해 펩티드의 아미노산 치환물은 원래의 것과 동등하거나 또는 보다 우수한 것이 실증되어 있고, 이것에는, 예를 들면 CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377), 또는 gp100(209-217)가 있다(Zaremba et al. 1997, Cancer Res. 57:4570-4577, T. K. Hoffmann et al. 2002, J Immunol. 168(3):1338-47, S. O. Dionne et al. 2003, Cancer Immunol immunother. 52:199-206, 및 S. O. Dionne et al. 2004, Cancer Immunology, Immunotherapy, 53:307-314).

상기 개변에 추가하여 결과적으로 발생하는 연결 폴리펩티드가 원래의 펩티드의 필요한 면역 유도 활성을 유지하는 한, 본 발명의 폴리펩티드를 다른 물질과 연결시킬 수도 있다. 다른 물질의 예로서 한정은 하지 않지만, 펩티드, 지질, 당 및 당쇄, 아세틸기, 천연 및 합성의 폴리머 등이 포함된다. 펩티드는 개변에 의해 원래의 펩티드의 생물활성을 손상하지 않는 것을 조건으로서 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화 등의 개변을 포함할 수 있다. 이들 종류의 개변은 부가적인 기능(예를 들면, 표적화 기능 및 송달 기능)을 부여하기 위해서 또는 폴리펩티드를 안정화하기 위해서 행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 인 비보 안정성을 높이기 위해서 D-아미노산, 아미노산 모방체 또는 비천연 아미노산을 도입하는 기술이 해당 분야에 있어서 공지이며, 이 개념을 본 발명의 폴리펩티드에 적용할 수도 있다. 폴리펩티드의 안정성은 몇개의 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 펩티다아제, 및 인간의 혈장 및 혈청 등의 여러 가지 생체 매질을 사용하여 안정성을 시험할 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., 1986, Eur J Drug Metab Pharmacokin, 11:291-302를 참조).

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩티드와 연결시켜도 좋다. 다른 펩티드의 예로서 한정은 하지 않지만, 다른 폴리펩티드로부터 유래되는 에피토프펩티드가 포함된다. 또는 본 발명의 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드를 스페이서 또는 링커를 통해 연결시켜도 좋다. 스페이서 또는 링커를 통해 연결시키는 펩티드는 같아도 서로 달라도 좋다. 스페이서 및 링커의 종류는 특별히 한정되지 않고, 펩티드로 구성되는 것, 보다 바람직하게는 펩티다아제, 프로테아제 및 프로테아솜 등의 효소에 의해 절단될 수 있는 1개 또는 복수개의 절단 부위를 갖는 펩티드로 구성되는 것이 포함된다. 링커 또는 스페이서의 예로서 한정은 하지 않지만, AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med, 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165:7308-7315), 또는 1개~수 개의 라이신 잔기(S. Ota et al., 2002, Can Res. 62:1471-1476, K. S. Kawamura et al., 2002, J Immunol. 168:5709-5715)를 들 수 있다. 본 발명은 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩티드와 연결된 폴리펩티드를 상정하고 있다.

본 발명의 폴리펩티드가 시스테인 잔기를 포함할 경우, 그들의 폴리펩티드는 시스테인 잔기의 SH기 간의 디술피드 결합을 통해 2량체를 형성하는 경향이 있다. 따라서, 폴리펩티드의 2량체도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드는 주지의 기법을 사용하여 조제할 수 있다. 예를 들면, Fmoc법(플루오렌일메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라 합성할 수 있다. 또한, 각종 시판된 펩티드 합성기를 이용하여 상법에 따라 합성할 수도 있다.

또한, 공지의 유전자 공학적 방법을 사용하여 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 장착하여 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포 중에서 목적으로 하는 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수도 있다. 숙주 세포로부터 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 경우, 다른 천연의 숙주 세포 단백질 및 그들의 단편, 또는 다른 임의의 화학 물질을 실질적으로 포함하지 않도록 정제 또는 단리하면 좋다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판된 핵산 합성기를 사용한 상법에 따라 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 1의 염기 서열을 갖는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열 번호 1에 기재한 염기 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 한쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당히 설정할 수 있고, 예를 들면 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초~1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 하여, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 1분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 서열 번호 1에 나타내어지는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 사용하여 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열 번호 2의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면 Green, M. R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning:A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 또는 Current Protocolin Molecular Biology: www.currentprotocols.com 등에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 DNA로부터 상기 (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다. 또한, 각 아미노산을 코딩하는 코돈은 이미 공지이므로 특정 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 용이하게 특정할 수 있다. 따라서, 상기한 (b)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열도 용이하게 특정할 수 있으므로 그러한 폴리뉴클레오티드도 시판된 핵산 합성기를 사용하여 상법에 따라 합성하면 좋다.

상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포이면 어떠한 것이어도 좋다. 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유동물 배양세포, 출아 효모, 분열 효모, 누에 세포, 아프리카 발톱 개구리 난세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

숙주 세포로서 원핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, DNA 클로닝 부위, 터미네이터 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 장착하고, 상기 벡터로 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주 세포로서 진핵 세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 슬라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV벡터, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 장착하고, 상기 벡터로 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His태그, FLAG태그, myc태그 HA태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합하여 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니트크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

이상의 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드에는 상술한 바와 같이 다른 임의의 단백질과의 융합 단백질의 형태에 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스페라제(GST)나 His태그와의 융합 단백질 등을 예시할 수 있다. 따라서, 이러한 융합 단백질의 형태의 폴리펩티드도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 형질 전환 세포로 발현된 폴리펩티드는 번역된 후 세포 내에서 각종 수식을 받는 경우가 있다. 이러한 번역 후 수식된 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 갖는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 번역 수식으로서는 N말단 메티오닌의 탈리, N말단 아세틸화, 당쇄 부가, 세포 내 프로테아제에 의한 한정 분해, 미리스토일화, 이소프레닐화, 인산화 등을 예시할 수 있다.

<면역 유도제>

본 발명의 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 담암생체에 투여하면, 이미 발생해 있는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 또한, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 암의 발병전의 생체에 투여함으로써 종양의 발생을 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 면역 유도제의 유효 성분이 될 수 있다.

여기에서, 「종양」 및 「암」이라는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다. 이 경우, 대상이 되는 암으로서는 PDS5A 단백질을 발현하고 있는 암인 것이 바람직하고, 그 중에서도 바람직하게는 백혈병, 악성림프종, 전립선암, 간암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암, 대장암, 위암, 악성뇌종양, 폐암 또는 식도암이다.

대상 동물은 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 영장류, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유동물이며, 더 바람직하게는 인간, 개 또는 고양이이며, 특히 바람직하게는 인간이다.

대상이 되는 암 이환 개체(개체가 인간인 경우에는 암환자)는 생체 내에서 PDS5A 단백질을 발현하고 있는 암 이환 개체인 것이 바람직하고, 구체적으로는 WO2011/027807에 기재되는 암의 검출 방법에 의해 스크리닝되는 암 이환 개체인 것이 바람직하다. 특히, 대상 생체로부터 얻어진 시료 중에 포함되는 PDS5A 단백질에 대한 항체의 발현량이 건상 개체의 생체로부터 얻어진 시료 중에 포함되는 상기 항체의 발현량과 비교하여 많음으로써 스크리닝되는 암 이환 개체인 것이 바람직하다. 대상이 되는 암 이환 개체의 스크리닝에 제공되는 시료로서는 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 흉수 등의 체액, 조직, 세포를 들 수 있지만, PDS5A 단백질에 대한 항체의 발현량의 측정에 의해 스크리닝할 경우에는 혈청, 혈장, 복수 또는 흉수가 바람직하다.

본 발명의 면역 유도제의 투여 경로는 경구 투여이어도, 비경구 투여이어도 좋지만, 근육내투여, 피하투여, 정맥내투여, 동맥내투여 등의 비경구 투여가 바람직하다. 암의 치료 목적으로 상기 면역 유도제를 사용할 경우에는 항암 작용을 향상시키기 위해서 치료 대상이 되는 종양 근방의 소속 림프절에 투여할 수도 있다. 투여량은 면역 유도하는데에 유효한 양이면 좋고, 예를 들면 암의 치료 또는 예방에 사용하는 것이라면 암의 치료 또는 예방에 유효한 양이면 좋다. 암의 치료 또는 예방에 유효한 양은 종양의 크기나 증상, 대상 동물의 체중, 체적 등에 따라 적당히 선택되지만, 대상 동물이 인간인 경우 통상 1일당 유효량은 0.0001~1000㎍, 바람직하게는 0.001~1000㎍이 된다. 이것을, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 1일당 수회로 나누고, 그것을 수일 또는 수월 간격으로 투여하는 것이 바람직하다. 후술하는 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이 본 발명의 면역 유도제는 이미 형성되어 있는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 발생 초기의 소수의 암세포에도 항암 작용을 발휘할 수 있으므로 암의 발병 전이나 암의 치료 후에 사용하면 암의 발병이나 재발을 방지할 수 있다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료와 예방의 쌍방에 유용하며, 암치료 또는 예방약의 유효 성분이 될 수 있다.

본 발명의 면역 유도제는 상술한 본 발명의 폴리펩티드를 유효 성분으로서 함유하지만, 단일의 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 복수의 폴리펩티드를 조합해도 좋다. 본 발명의 폴리펩티드를 복수 조합함으로써 각 폴리펩티드가 갖는 면역 유도 활성(세포상해 활성 T세포의 유도·활성화 작용)이 증강되어 암의 치료 또는 예방을 보다 효과적으로 달성할 수 있다.

본 발명의 면역 유도제를 공지의 세포장해성 T세포를 유도할 수 있는 펩티드와 조합하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 조합함으로써 각 폴리펩티드가 갖는 면역 유도 활성(세포상해 활성 T세포의 유도·활성화 작용)이 증강되어 암의 치료 또는 예방을 보다 효과적으로 달성할 수 있다. 이 경우의 「조합」은 본 발명의 면역 유도제와 공지의 세포장해성 T세포를 유도할 수 있는 펩티드를 별개로 또는 동시에 투여하는 것을 포함한다. 여기에서 말하는 「별개로 투여하는」이란 본 발명의 면역 유도제와 공지의 세포장해성 T세포를 유도할 수 있는 펩티드를 시간차를 두고 각각 투여하는 것을 말한다. 투여하는 순서는 상관없다. 한편, 「동시에 투여하는」이란 본 발명의 면역 유도제와 공지의 세포장해성 T세포를 유도할 수 있는 펩티드를 미리 혼합해서 일체화시킨 형태로 투여하는 것, 또는 본 발명의 면역 유도제와 공지의 세포장해성 T세포를 유도할 수 있는 펩티드를 개별 형태로 시간차 없이 투여하는 것을 말한다.

본 발명의 면역 유도제는 생체 내에서의 면역학적 응답을 강화할 수 있는 다른 면역 증강제와 조합하여 사용할 수 있다. 다른 면역 증강제는 본 발명의 면역 유도제에 포함되어 있어도 좋고, 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용하여 환자에게 투여해도 좋다.

상기 「다른 면역 증강제」로서는, 예를 들면 아쥬반트를 들 수 있다. 아쥬반트는 항원의 저장소(세포 외 또는 매크로파지 내)를 제공하고, 매크로파지를 활성화하며, 또한 특정 조의 림프구를 자극함으로써 면역학적 응답을 강화할 수 있으므로 항암 작용을 높일 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역 유도제를 암의 치료 또는 예방약의 유효 성분에 사용할 경우, 면역 유도제는 유효 성분인 본 발명의 폴리펩티드에 추가하여 아쥬반트를 더 포함하는 것이 바람직하다. 다수 종류의 아쥬반트가 당업계에서 주지이며, 어느 아쥬반트이어도 사용할 수 있다. 아쥬반트의 구체예로서는 MPL(SmithKline Beecham), 살모네라균속의 Salmonella minnesota Re 595리포다당류의 정제 및 산 가수분해 후에 얻어지는 동류물; QS21(SmithKline Beecham), Quillja saponaria 추출물로부터 정제되는 순QA-21saponin; PCT출원 WO96/33739(SmithKline Beecham)에 기재된 DQS21; QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1(So, H. S., et al., 1997, Molecules and cells, 7:178-186); 프로인트의 불완전 아쥬반트; 프로인트의 완전 아쥬반트; 비타민E; 몬타나이드; 황산 알루미늄 칼륨; CpG올리고뉴클레오티드(예를 들면, Kreig, A. M., et al., 1995, Nature374:546-549를 참조); 폴리IC 및 그 유도체(폴리ICLC 등) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 기름으로부터 조제되는 여러 가지 유중수 에멀션을 들 수 있다. 그 중에서도 프로인트의 불완전 아쥬반트, 몬타나이드, 폴리IC 및 그 유도체 및 CpG올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 아쥬반트와 폴리펩티드의 혼합비는 전형적으로는 약 1:10~10:1, 바람직하게는 약 1:5~5:1, 보다 바람직하게는 약 1:1이다. 단, 아쥬반트는 상기 예시에 한정되지 않고, 당업계에서 공지의 상기 이외의 아쥬반트도 본 발명의 면역 유도제를 투여할 때에 사용할 수 있다(예를 들면, Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, 제 2 판, 1986년을 참조). 면역 유도제 및 아쥬반트의 혼합물 또는 에멀션의 조제 방법은 예방 접종의 당업자에게는 주지이다.

또한, 상기 다른 면역 증강제로서는 상기 아쥬반트 이외에도 대상의 면역 응답을 자극하는 인자를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 림프구나 항원제시세포를 자극하는 특성을 갖는 각종 사이토카인을 면역 증강제로서 본 발명의 면역 유도제와 조합하여 사용할 수 있다. 그러한 면역학적 응답을 증강 가능한 다수의 사이토카인은 당업자에게 공지이며, 그 예로서 백신의 방어 작용을 강화하는 것이 나타내어져 있는 인터류킨-12(IL-12), GM-CSF, IL-18, 인터페론α(IFN-α), 인터페론β(IFN-β), 인터페론ω(IFN-ω), 인터페론γ(IFN-γ) 및 Flt3리간드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 인자도 상기 면역 증강제로서 사용할 수 있고, 본 발명의 면역 유도제에 포함시켜 또는 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여할 수 있다.

<암의 치료 또는 예방약>

본 발명의 면역 유도제는 암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

암의 치료 또는 예방약은 본 발명의 면역 유도제를 각 투여 형태에 적합한 약리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 등의 첨가제를 적당히 혼합시켜 제제할 수도 있다.

제제 방법 및 사용 가능한 첨가제는 의약제제의 분야에 있어서 주지이며, 어느 방법 및 첨가제도 사용할 수 있다. 첨가제의 구체예로서는 생리완충액과 같은 희석제; 설탕, 유당, 옥수수전분, 인산칼슘, 소르비톨, 글리신 등과 같은 부형제; 시럽, 젤라틴, 아라비아검, 소르비톨, 폴리비닐클로라이드, 트라간드 등과 같은 결합제; 스테아르산마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 탈크, 실리카 등의 활택제 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 제제 형태로서는 정제, 캅셀제, 과립제, 산제, 시럽제 등의 경구제, 흡입제, 주사제, 좌제, 액제 등의 비경구제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 일반적으로 알려져 있는 제법에 의해 제작할 수 있다.

<항원제시세포>

또한, 상기 폴리펩티드와 항원제시세포를 인 비트로에서 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드를 항원제시세포에 제시시킬 수 있다. 즉, 상기한 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는 항원제시세포의 처리제로서 이용할 수 있다. 여기에서, 항원제시세포로서는 MHC클래스 I 분자 및 클래스 II 분자를 보유하는 수지상세포 또는 B세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 여러 가지 MHC클래스 I 분자 및 클래스 II 분자가 동정되어 있으며, 주지이다. 인간에 있어서의 MHC 분자는 HLA라고 부른다.

HLA클래스 I 분자로서는 HLA-A, HLA-B, HLA-C를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA클래스 I 분자로서는 HLA-A, HLA-B, HLA-C를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등을 들 수 있다.

HLA클래스 II 분자로서는 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*08, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*13, HLA-DRB1*15, HLA-DRB1*15, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPB1을 들 수 있다.

HLA클래스 I 또는 HLA클래스 II 분자를 보유하는 수지상세포 또는 B세포는 주지의 방법에 의해 혈액 등으로부터 조제할 수 있다. 예를 들면, 골수, 제대혈 또는 환자 말초혈로부터 과립구 매크로파지 콜로니자극인자(GM-CSF)과 IL-3(또는IL-4)을 사용해서 수지상세포를 유도하고, 그 배양계에 종양 관련 펩티드를 첨가함으로써 종양 특이적인 수지상세포를 유도할 수 있다.

이 수지상세포를 유효량 투여함으로써 암의 치료에 바람직한 면역응답을 유도할 수 있다. 사용하는 세포는 건상인으로부터 제공된 골수나 제대혈, 환자 본인의 골수나 말초혈 등을 사용할 수 있다. 환자 본래의 자가세포는 안전성이 높아 위독한 부작용을 회피하는 것도 기대할 수 있으므로 바람직하다. 말초혈 또는 골수는 신선 시료, 저온보존 시료 및 동결보존 시료 중 어느 것이어도 좋다. 말초혈은 전혈을 배양해도 좋고, 백혈구 성분만을 분리해서 배양해도 좋지만, 후자 쪽이 효율적이어서 바람직하다. 또한, 백혈구 성분 중에서도 단핵구를 분리해도 좋다. 또한, 골수나 제대혈을 기원으로 할 경우에는 골수를 구성하는 세포 전체를 배양해도 좋고, 이제부터 단핵구를 분리해서 배양해도 좋다. 말초혈이나 그 백혈구 성분, 골수세포에는 수지상세포의 기원이 되는 단핵구, 조혈간세포 또는 미성숙 수지상세포나 CD4 양성세포 등이 포함되어 있다. 사용되는 사이토카인은 안전성과 생리활성이 확인된 특성이 것이라면 천연형 또는 유전자 재조합형 등 그 생산 방법에 대해서는 상관없지만, 바람직하게는 의료용에 사용되는 품질이 확보된 표품이 필요 최저량으로 사용된다. 첨가하는 사이토카인의 농도는 수지상세포가 유도되는 농도이면 특별히 한정되지 않고, 통상 사이토카인의 합계 농도로 10~1000ng/mL 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20~500ng/mL 정도이다. 배양은 백혈구의 배양에 통상 사용되어 있는 주지의 배지를 사용하여 행할 수 있다. 배양 온도는 백혈구의 증식이 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 인간의 체온인 37℃ 정도가 가장 바람직하다. 또한, 배양 중의 기체 환경은 백혈구의 증식이 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 5% CO₂를 통기하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 기간은 필요수의 세포가 유도되는 기간이면 특별히 한정되지 않지만, 통상 3일~2주일 간에 행해진다. 세포의 분리나 배양에 제공되는 기기는 적당히 적당한 것을 사용할 수 있지만, 의료용에 안전성이 확인되며, 또한 조작이 안정되어 간편한 것이 바람직하다. 특히, 세포배양장치에 대해서는 샬레, 플라스크, 병 등의 일반적 용기에 관계되지 않고, 적층형 용기나 다단식 용기, 롤러 병, 스피너식 병, 백식 배양기, 중공사 컬럼 등도 사용할 수 있다.

상기 폴리펩티드와 항원제시세포를 인 비트로에서 접촉시키는 방법 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 항원제시세포를 상기 폴리펩티드를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써 달성할 수 있다. 배지 중의 펩티드 농도는 특별히 한정되지 않지만, 통상 1~100㎍/mL 정도, 바람직하게는 5~20㎍/mL 정도이다. 배양 시의 세포 밀도는 특별히 한정되지 않지만, 통상 10³~10⁷세포/mL 정도, 바람직하게는 5×10⁴~5×10⁶세포/mL 정도이다. 배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO₂ 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 항원제시세포가 표면상에 제시할 수 있는 펩티드의 길이는 통상 최대로 30아미노산 잔기 정도이다. 따라서, 특별히 한정되지 않지만, 항원제시세포와 폴리펩티드를 인 비트로에서 접촉시킬 경우, 상기 폴리펩티드를 30아미노산 잔기 이하의 길이로 조제해도 좋다.

상기한 폴리펩티드의 공존하에 있어서 항원제시세포를 배양함으로써 펩티드가 항원제시세포의 MHC 분자에 도입되고, 항원제시세포의 표면에 제시된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 사용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원제시세포를 조제할 수 있다. 이러한 항원제시세포는 생체 내 또는 인 비트로에 있어서 T세포에 대하여 상기 폴리펩티드를 제시하여 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포 또는 헬퍼 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있다.

상기한 바와 같이 해서 조제되는 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원제시세포를 T세포와 인 비트로에서 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포 또는 헬퍼 T세포를 유도하고, 증식시킬 수 있다. 이것은 상기 항원제시세포와 T세포를 액체 배지 중에서 공배양함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 항원제시세포를 액체 배지에 현탁하여 마이크로 플레이트의 웰 등의 용기에 넣고, 이것에 T세포를 첨가하여 배양함으로써 행할 수 있다. 공배양 시의 항원제시세포와 T세포의 혼합비율은 특별히 한정되지 않지만, 통상 세포수의 비율로 1:1~1:100 정도, 바람직하게는 1:5~1:20 정도이다. 또한, 액체 배지 중에 현탁하는 항원제시세포의 밀도는 특별히 한정되지 않지만, 통상 100~1000만세포/mL 정도, 바람직하게는 10000~100만세포/mL 정도이다. 공배양은 상법에 따라 37℃, 5% CO₂ 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 2일~3주일, 바람직하게는 4일~2주일 정도이다. 또한, 공배양은 IL-2, IL-6, IL-7 및 IL-12와 같은 인터류킨의 1종 또는 복수종의 존재하에서 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, IL-2 및 IL-7의 농도는 통상 5~20U/mL 정도, IL-6의 농도는 통상 500~2000U/mL 정도, IL-12의 농도는 통상 5~20ng/mL 정도이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 공배양은 신선한 항원제시세포를 추가해서 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 예를 들면, 공배양 후의 배양 상청을 버리고, 신선한 항원제시세포의 현탁액을 첨가하여 공배양을 더 행한다는 조작을 1회 또는 수회 반복해도 좋다. 각각 공배양의 조건은 상기와 마찬가지이어도 좋다.

상기 공배양에 의해 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포 및 헬퍼 T세포가 유도되어 증식된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 사용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합하는 단리 T세포를 조제할 수 있다.

후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이 PDS5A 단백질을 코딩하는 유전자(PDS5A 유전자)는 각각 백혈병의 백혈구 세포, 악성림프종 조직, 악성림프종 세포, 전립선암조직, 전립선암세포, 간암조직, 간암세포, 유방암조직, 유방암세포, 췌장암조직, 췌장암세포, 난소암조직, 난소암세포, 신장암조직, 신장암세포, 대장암조직, 대장암세포, 위암조직, 위암세포, 악성뇌종양조직, 악성뇌종양세포, 폐암조직, 폐암세포, 식도암조직, 식도암세포에 특이적으로 발현하고 있다. 따라서, 이들의 암종에 있어서는 PDS5A 단백질이 정상세포보다 유의하게 많이 존재하고 있는 것으로 생각된다. 암세포 내에 존재하는 PDS5A 단백질의 일부가 암세포 표면상의 MHC 분자에 제시되고, 상기한 바와 같이 해서 조제한 세포장해성 T세포 또는 헬퍼 T세포가 생체 내에 투여되면 이것을 마크로 하여 세포장해성 T세포가 암세포를 장해 하는 또는 세포상해성 T세포의 세포장해활성을 증강할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원제시세포는 생체 내에 있어서도 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포 및 헬퍼 T세포를 유도하여 증식시킬 수 있으므로 상기 항원제시세포를 생체 내에 투여함으로써도 세포상해성 T세포가 암세포를 장해하거나 또는 세포장해성 T세포의 세포장해활성을 증강할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 사용하여 조제된 상기 세포장해성 T세포나 헬퍼 T세포, 상기 항원제시세포도 또한 본 발명의 면역 유도제와 마찬가지로 암의 치료 또는 예방약으로서 유용하다.

상기한 단리 항원제시세포나 단리 T세포를 생체에 투여할 경우에는 이들 세포를 이물로서 공격하는 생체 내에서의 면역응답을 회피하기 위해서 치료를 받는 환자로부터 채취한 항원제시세포 또는 T세포를 상기한 바와 같이 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 사용하여 조제한 것이 바람직하다.

항원제시세포 또는 단리 T세포를 유효 성분으로서 포함하는 암의 치료 또는 예방약의 투여 경로는 정맥내투여나 동맥내투여와 같은 비경구 투여가 바람직하다. 또한, 투여량은 증상이나 투여 목적 등에 따라 적당히 선택되지만, 통상 1개~10조개, 바람직하게는 100만개~10억개이며, 이것을 수일 또는 수월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 제제는, 예를 들면 세포를 생리완충 식염수에 현탁한 것 등이어도 좋고, 다른 항암제나 사이토카인 등과 병용할 수도 있다. 또한, 제제 분야에 있어서 주지의 1 또는 2 이상의 첨가제를 첨가할 수도 있다.

<유전자 백신>

또한, 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상 동물의 체내에서 발현시킴으로써도 면역유도, 즉 상기 생체 내에서 항체 생산이나 세포장해성 T세포를 유도할 수 있고, 폴리펩티드를 투여하는 것과 동등한 효과가 얻어진다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 상기한 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 유효 성분으로서 포함하는 것이어도 좋다. 후술하는 실시예에 나타내어지는 바와 같이 이러한 항원 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 「유전자 백신」이라고도 불린다.

유전자 백신을 제조하기 위해서 사용하는 벡터는 대상 동물 세포 내(바람직하게는 포유동물 세포 내)에서 발현 가능한 벡터이면 특별히 한정되지 않고, 플러스미드 벡터이어도 바이러스 벡터이어도 좋고, 유전자 백신의 분야에서 공지의 어떠한 벡터를 사용해도 좋다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA나 RNA 등의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같이 상법에 따라 용이하게 조제할 수 있다. 또한, 벡터로의 상기 폴리뉴클레오티드의 장착은 당업자에게 주지의 방법을 사용하여 행할 수 있다.

유전자 백신의 투여 경로는 바람직하게는 근육내투여, 피하투여, 정맥내투여, 동맥내투여 등의 비경구 투여 경로이며, 투여량은 항원의 종류 등에 따라 적당히 선택할 수 있지만, 통상 체중 1kg당 유전자 백신의 중량으로 0.1㎍~100mg 정도, 바람직하게는 1㎍~10mg 정도이다.

바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 RNA바이러스 또는 DNA바이러스에 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 장착하고, 이것을 대상 동물에 감염시키는 방법을 들 수 있다. 이 중에서 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.

그 밖의 방법으로서는 발현 플러스미드를 직접 근육내에 투여하는 방법(DNA백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA백신법, 리포솜법이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는 유전자를 직접 체내에 도입하는 인 비보 방법 및 대상 동물로부터 어떤 종류의 세포를 채취하여 체외에서 유전자를 상기 세포에 도입하여 그 세포를 체내로 리턴시키는 엑스 비보 방법이 있지만, 인 비보 방법이 보다 바람직하다.

인 비보 방법에 의해 투여하는 경우에는 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 근육내 등에 투여할 수 있다. 인 비보 방법에 의해 투여하는 경우에는, 예를 들면 액제 등의 제제 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효 성분인 본 발명의 상기 펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 주사제 등이 되고, 필요에 따라 관용의 담체를 추가해도 좋다. 또한, 상기 DNA를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜(센다이바이러스(HVJ)-리포솜 등)에 있어서는 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 「서열 번호 1에 나타내어지는 염기 서열」이라고 했을 경우에는 서열 번호 1에 실제로 나타내어져 있는 염기 서열 외에 이것과 상보적인 서열도 포함한다. 따라서, 「서열 번호 1에 나타내어지는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드」라고 했을 경우에는 서열 번호 1에 실제로 나타내어져 있는 염기 서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 그 상보적인 염기 서열을 갖는 단일쇄 폴리뉴클레오티드, 및 이들로 이루어지는 이중쇄 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우에는 적당히 어느 하나의 염기 서열을 선택하게 되지만 당업자라면 용이하게 그 선택을 할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다.

<실시예 1: 각 조직에서의 발현 해석>

(1) 각 암세포주에서의 PDS5A 유전자 발현 해석

인간 PDS5A 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열(서열 번호 1)을 Gene Bank로부터 얻었다. 얻어진 유전자에 대하여 인간 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전 사진 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50~100mg 및 각 세포주 5~10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(Life Technologies제)을 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 사용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies제)에 의해 첨부된 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 진 풀 cDNA(Life Technologies제), QUICK-Clone cDNA(Clontech Laboratories, Inc.제) 및 Large-Insert cDNA Library(Clontech Laboratories, Inc.제)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(프라이머의 염기 서열은 서열 번호 68 및 69에 기재)를 사용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전 사진 반응에 의해 조제한 샘플 0.25μL, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM의 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(TAKARA SHUZO CO., LTD.제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 25μL로 하고, Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories, Inc.제)를 사용하여 94℃-30초, 55℃-30초, 및 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행했다. 비교 대조를 위하여 하우스키핑 유전자인 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머(인간 GAPDH 프라이머의 염기 서열은 서열 번호 70 및 71에 기재)도 동시에 사용했다.

그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이 인간 PDS5A 유전자는 대부분의 암세포주, 즉 백혈병, 악성림프종, 전립선암, 간암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암, 대장암, 위암, 악성뇌종양, 폐암, 식도암에서 발현이 검출되었다.

(2) 인간 암조직에 있어서의 PDS5A 단백질의 발현(면역조직 화학 염색)

파라핀 포매된 다종류의 암조직 어레이(BIOMAX제)의 암조직 72검체를 사용하여 면역조직 화학 염색을 행했다. 인간 암조직 어레이를 60℃에서 3시간 처리 후 크실렌을 채운 염색병에 넣어 5분 마다 크실렌을 교체하는 조작을 3회 행했다. 이어서, 크실렌 대신에 에탄올 및 PBS-T로 마찬가지의 조작을 행했다. 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 시트르산 완충액(pH 6.0)을 채운 염색병에 인간 암조직 어레이를 넣고, 125℃에서 5분간 처리 후 실온에서 40분 이상 정치했다. 절편 주위의 여분인 수분을 킴와이프로 닦아내고, DAKOPEN으로 둘러싸 Peroxidase Block(DAKO제)을 적당량 적하했다. 실온에서 5분간 정치 후 PBS-T를 채운 염색병에 넣어 5분 마다 PBS-T를 교체하는 조작을 3회 행했다. 블록킹액으로서 10% FBS를 포함하는 PBS-T 용액을 넣고, 모이스트 챔버 내에서 실온에서 1시간 정치했다. 이어서, PDS5A 단백질에 반응하는 시판 토끼 폴리클로날항체(sigma사)를 5% FBS를 포함하는 PBS-T 용액으로 10㎍/mL로 조제한 용액을 얹고, 모이스트 챔버 내에서 4℃에서 하룻밤 정치했다. PBS-T에서 10분간 3회 세정을 행한 후 Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO제) 적당량 적하하고, 모이스트 챔버 내에 실온에서 30분간 정치했다. PBS-T에서 10분간 3회 세정을 행한 후 DAB 발색액(DAKO제)을 넣어 실온에서 10분 정도 정치한 후 발색액을 버리고, PBS-T에서 10분간 3회 세정을 행한 후 증류수로 린싱하여 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 각 에탄올 용액에 순서대로 1분간씩 넣은 후 크실렌 중에서 하룻밤 정치했다. 슬라이드 유리를 인출하여 Glycergel Mounting Medium(DAKO제)로 밀봉 후 관찰을 행했다.

그 결과, PDS5A 단백질은 검증한 대부분의 암, 전립선암, 간암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암, 대장암, 위암, 악성뇌종양, 폐암, 식도암에서 강한 발현이 확인되었다.

<실시예 2: 펩티드에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도>

(1) HLA-A0201과 HLA-A24에 결합하는 펩티드 모티브의 예측

서열 번호 2로 나타내어지는 인간 PDS5A 단백질의 아미노산 서열의 정보를 GenBank로부터 얻었다. HLA-A0201과 HLA-A24 결합 모티브 예측을 위하여 공지의 BIMAS 소프트(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/에서 이용 가능)를 사용한 컴퓨터 예측 프로그램을 사용하여 인간 PDS5A 단백질의 아미노산 서열을 해석하고, HLA-A0201 분자가 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 3~19로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 17종류와, HLA-A24 분자가 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 20~34로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 14종류를 선택했다. 선택한 모든 폴리펩티드는 Greiner Bio-One International GmbH의 커스텀 펩티드 합성 서비스에 합성 의뢰했다. 또한, 합성된 폴리펩티드는 HPLC 분석과 매스스펙트럼 분석에 의한 품질이 보증된 것이다.

(2) 펩티드에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도

HLA-A0201 양성의 건상인으로부터 말초혈을 분리하고, Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika, Durham, NC)에 중층하여 1,500rpm으로 실온에서 20분간 원심분리했다. PBMC를 함유하는 획분을 회수하고, 냉각 인산염 완충액 중에서 3회(또는 그 이상) 세정하여 PBMC를 얻었다. 얻어진 PBMC를 AIM-V 배지(Life Technololgies제) 20mL에 현탁하고, 배양 플라스크(Falcon제) 중에 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 2시간 부착시켰다. 비부착 세포는 T세포 조제에 사용하고, 부착 세포는 수지상세포를 조제하기 위해서 사용했다.

부착 세포를 AIM-V 배지 중에서 IL-4(1000U/mL) 및 GM-CSF(1000U/mL)의 존재하에서 배양했다. 6일 후에 IL-4(1000U/mL), GM-CSF(1000U/mL), IL-6(1000U/mL, Genzyme제), IL-1β(10ng/mL, Genzyme제) 및 TNF-α(10ng/mL, Genzyme제)를 첨가한 AIM-V 배지에 교환하여 2일간 더 배양한 후 얻어진 비부착 세포 집단을 수지상세포로서 사용했다.

조제한 수지상세포를 AIM-V 배지 중에 1×10⁶세포/mL의 세포 밀도로 현탁하고, 상기 (1)에서 선택한 HLA-A0201 분자에 결합 가능하다고 예상되는 펩티드를 10㎍/mL의 농도로 첨가하고, 96구멍 플레이트를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양 후 X선 조사(3000rad)하여 AIM-V 배지로 세정하고, 10% 인간 AB 혈청(Nabi제), IL-6(1000U/mL) 및 IL-12(10ng/mL, Genzyme제)를 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하고, 24 구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×10⁵세포씩 첨가했다. 또한, 조제한 T세포 집단을 1구멍당 각각 1×10⁶세포 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양했다. 7일 후 각각의 배양 상청을 버리고, 상기와 마찬가지로 하여 얻은 각 펩티드로 처리 후 X선 조사한 수지상세포를 10% 인간 AB 혈청(Nabi제), IL-7(10U/mL, Genzyme제) 및 IL-2(10U/mL, Genzyme제)를 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하고(세포 밀도: 1×10⁵세포/mL), 24 구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×10⁵세포씩 첨가하여 더 배양했다. 같은 조작을 7일 간격으로 4회 반복한 후 자극된 T세포를 회수하고, 플로 사이토메트리에 의해 CD8 양성 T세포의 유도를 확인했다.

또한, 음성 컨트롤로서 본 발명의 범위 외의 서열인 펩티드(서열 번호 74)를 HLA-A0201 분자가 결합하는 기지의 펩티드(서열 번호 75~83) 및 WO 2011/027807의 실시예 5에 의거하여 제작한 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 PDS5A 단백질을 비교예로서 사용하여 상기와 마찬가지의 처리를 행했다.

또한, HLA-A24 분자에 결합 가능하다고 예상되는 펩티드에 대해서도 HLA-A24 양성의 건상인의 말초혈로부터 유도한 수지상세포와 T세포 집단을 사용하여 상기와 마찬가지의 방법으로 펩티드에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도를 시도했다. 또한, 음성 컨트롤로서 본 발명의 범위 외의 서열인 펩티드(서열 번호 84)를 상기 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 PDS5A 단백질을 비교예로서 사용하여 마찬가지의 처리를 행했다.

<실시예 3: 세포장해성 T세포 항원 에피토프의 결정>

(1) IFN-γ 산생능

실시예 2(2)에서 유도한 T세포 각각에 대하여 에피토프펩티드 및 단백질에 대한 특이성을 조사하기 위해서 HLA-A0201 분자를 발현하는 수지상세포에 각종 폴리펩티드를 펄스했다. 상기 수지상세포는 10㎍/mL의 농도로 AIM-V 배지 중 각 폴리펩티드를 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 4시간 배양해서 조제했다. 또한, 각종 폴리펩티드에는 HLA-A0201 분자가 결합 가능하다고 예상되는 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 각 폴리펩티드, 음성 컨트롤 폴리펩티드(서열 번호 74), HLA-A0201 분자에 결합하는 기지의 폴리펩티드(서열 번호 75~83) 및 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 PDS5A 단백질을 사용했다. 펄스 후의 수지상세포 5×10⁴개에 대하여 5×10³개의 T세포를 첨가하고, 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지 중에서 96구멍 플레이트에서 24시간 배양했다. 배양 후의 상청을 취하여 IFN-γ의 산생량을 ELISA법에 의해 측정했다.

그 결과, 폴리펩티드를 펄스하지 않는 수지상세포 및 음성 컨트롤 폴리펩티드를 사용한 레인 1 및 2에 비해 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 펄스한 수지상세포를 사용한 레인 13~29에서는 명백히 높은 IFN-γ 산생이 확인되었다(도 2). 이 결과로부터 서열 번호 3~19의 펩티드는 특이적으로 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포를 증식 자극시켜 IFN-γ 산생을 유도하는 능력을 갖는 T세포 에피토프펩티드인 것이 판명되었다. 또한, 이들 펩티드를 사용한 IFNγ의 산생량은 HLA-A0201 분자가 결합하는 서열 번호 75~83으로 나타내어지는 아미노산 서열의 기지의 펩티드(레인 4~12) 및 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질(레인 3)로 자극한 T세포로부터 산생되는 IFNγ보다 현저히 높은 것도 판명되었다. 즉, 서열 번호 3~19의 폴리펩티드는 지금까지 보고되어 있는 펩티드와 비교하여 현저히 높은 면역 유도 활성을 갖고 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 서열 번호 2로 나타내어지는 전장 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에는 상기 면역 유도 활성을 갖는 서열 번호 3~19가 포함되어 있음에도 불구하고, 서열 번호 2의 전장 PDS5A 단백질로 자극한 T세포로부터 산생되는 IFN-γ의 산생량은 낮았다. 이것은 전장 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에는 면역 유도 활성을 억제하는 서열도 많이 포함되는 점에서 충분한 면역 유도 활성을 나타내지 않았던 것으로 생각된다.

또한, 상기와 마찬가지로 실시예 3(2)에서 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드를 사용하여 유도한 펩티드에피토프 반응성 CD8 양성 T세포에 대해서 펩티드에피토프에 대한 특이성을 조사하기 위해서 서열 번호 20~34폴리펩티드(레인 4~18), 서열 번호 84의 아미노산 서열로 나타내어지는 음성 컨트롤 폴리펩티드, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 나타내어지는 전장 PDS5A 단백질을 펄스한 HLA-A24 분자를 발현하는 수지상세포에 대한 T세포의 IFN-γ의 산생량을 상기 방법에 준하여 ELISA법에 의해 측정했다.

그 결과, 폴리펩티드를 펄스하고 있지 않는 수지상세포의 레인 1 및 음성 컨트롤 폴리펩티드를 사용한 레인 2에 비해 서열 번호 20~34의 폴리펩티드를 펄스한 수지상세포를 사용한 레인 4~18에서는 배양 상청에 있어서 현저한 IFN-γ 산생이 확인되었다(도 3).

이 결과로부터 서열 번호 20~34의 폴리펩티드는 특이적으로 HLA-A24 양성 CD8 양성 T세포를 증식 자극시켜 IFN-γ 산생을 유도하는 능력을 갖는 T세포 에피토프펩티드인 것이 판명되었다. 또한, 이들 폴리펩티드를 사용한 IFNγ의 산생량은 서열 번호 2의 아미노산 서열로 나타내어지는 전장 PDS5A 단백질로 자극한 T세포로부터 산생되는 IFNγ보다 현저히 높은 것도 판명되었다. 상기와 마찬가지의 이유에 의해 전장 PDS5A 단백질에서는 충분한 면역 유도 활성을 나타내지 않았던 것으로 생각된다.

(2) 세포장해성 평가

이어서, 본 발명에서 사용되는 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드가 HLA-A0201 양성이며 인간 PDS5A 단백질을 발현하는 종양세포상의 HLA-A0201 분자 상에 제시되는 것인지, 또한 본 발명의 폴리펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포가 HLA-A0201 양성이며 인간 PDS5A 단백질을 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는지, 또한 기지의 펩티드(서열 번호 75~83) 및 PDS5A 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포와 비교하여 종양세포를 현저히 장해하는지를 검토했다.

인간 PDS5A 단백질의 발현이 확인되어 있는 인간 글리오마(악성뇌종양) 세포주 U251세포, 백혈병 세포주 Jurkat세포, 간암 세포주 SK-Hep1, 유방암 세포주 MCF7, 췌장암 세포주 Panc1, 난소암 세포주 OVCAR3, 신장암 세포주 A498, 대장암 세포주 HCT116, 위암 세포주 KATO3, 및 폐암 세포주 NCI-H522(ATCC로부터 구입) 합계 10종의 세포주를 각각 1×10⁶개 50mL용적의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% 소 태아 혈청(이하 FBS라고 함, Gibco제)을 포함하는 RPMI 배지(Gibco제)에서 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 1×10³개씩 첨가하고, 또한 이것에 10%의 FBS를 포함하는 RPMI 배지로 현탁된 5×10⁴개의 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드, 음성 컨트롤 폴리펩티드(서열 번호 74), 기지의 펩티드(서열 번호 75~83) 및 서열 번호 2의 아미노산 서열로 나타내어지는 전장 PDS5A 단백질에 의한 자극으로 유도된 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포를 각각 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양 후 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬51의 양을 측정함으로써 각 폴리펩티드 및 단백질의 자극으로 유도된 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 산출했다.

그 결과, 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드 자극으로 유도된 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포가 상기 10종의 세포 모두에 대하여 통상에서는 예상할 수 없을 정도로 현저한 세포장해활성을 갖는 것이 판명되었다. 대표예로서 도 4a, 및 도 4b에 각각 U251세포, 및 Jurkat세포에 대한 세포장해활성의 결과를 나타낸다. 서열 번호 3~19의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포(각각 레인 13~29)에서는 서열 번호 75~83의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드(각각 레인 4~12) 및 전장 PDS5A 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포(레인 3)와 비교하여 U251세포 및 Jurkat세포에 대하여 현저히 높은 세포장해활성을 나타내고 있다. 한편, 음성 컨트롤의 폴리펩티드(레인 2)를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포는 Mock(레인 1)과 같은 정도이며, 세포장해활성을 나타내지 않았다. 이 결과는 본 발명에서 사용되는 서열 번호 3~19의 폴리펩티드가 HLA-A0201 양성이며 인간 PDS5A 폴리펩티드를 발현하는 종양세포상의 HLA-A0201 분자상에 제시되는 것이며, 또한 본 발명의 폴리펩티드는 이러한 종양세포를 장해할 수 있는 CD8 양성 세포장해성 T세포를 예상할 수 없을 정도로 유도하는 능력이 있는 것을 시사하고 있다. 또한, 전장 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에는 서열 번호 3~19가 포함되어 있음에도 불구하고, 서열 번호 3~19의 폴리펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포에 의한 세포장해활성보다 현저히 약했다(레인 3, 13~29). 이것은 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에는 면역 유도 활성을 억제하는 서열이 많이 포함되는 점에서 강한 세포장해활성을 갖는 T세포를 유도할 수 없었기 때문인 것으로 생각된다.

마찬가지로 서열 번호 20~34의 폴리펩티드가 HLA-A24 양성이며 인간 PDS5A 단백질을 발현하는 종양세포상의 HLA-A24 분자상에 제시되는 것인지, 또한 본 발명의 폴리펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포가 HLA-A24 양성이며 인간 PDS5A 단백질을 발현하는 종양세포를 장해할 수 있는지, 또한 PDS5A 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포와 비교하여 종양세포를 현저히 장해하는지를 검토했다.

HLA-A24 양성이며 인간 PDS5A 단백질을 발현하는 백혈병 세포주 THP1, 인간 글리오마 세포주 KNS-42, 간암 세포주 SK-Hep1, 신장암 세포주 Caki1, 대장암 세포주 SW480, 위암 세포주 KATO3(RIKEN, Japan 및 ATCC로부터 구입)의 합계 6종에 크롬51을 도입하고, 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드, 음성 컨트롤 폴리펩티드(서열 번호 84), 및 전장 PDS5A 단백질에 의한 자극으로 유도된 HLA-A24 양성의 CD8 양성 T세포를 배양했을 때의 장해를 받은 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬51의 양을 측정했다.

그 결과, 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드로 자극된 HLA-A24 양성의 CD8 양성 T세포가 사용한 모든 암세포에 대하여 통상에서는 예상할 수 없을 정도로 현저한 세포장해활성을 갖는 것이 판명되었다. 대표예로서 도 5a 및 도 5b에 각각 THP1세포 및 SW480세포에 대한 세포장해활성의 결과를 나타낸다. 서열 번호 20~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드로 자극된 CD8 양성 T세포(각각 레인 4~18)에서는 전장 PDS5A 단백질로 자극된 CD8 양성 T세포(레인 3)와 비교하여 THP1세포 및 SW480세포에 대하여 현저히 높은 세포장해활성을 나타내고 있다. 한편, 음성 컨트롤의 폴리펩티드를 사용하여 유도한 CD8 양성 T세포는 Mock(레인 1)과 같은 정도이며, 세포장해활성을 나타내지 않았다(레인 2). 따라서, 서열 번호 20~34는 HLA-A24 양성이며 인간 PDS5A 단백질을 발현하는 세포상의 HLA-A24 분자상에 제시되는 것이며, 이 결과는 본 발명의 폴리펩티드가 이러한 세포를 장해할 수 있는 CD8 양성 세포장해성 T세포를 유도하는 능력이 있는 것을 시사하고 있다.

반면에 상기 14종의 암세포에 대하여 서열 번호 3~34의 아미노산 서열로 나타내어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 폭로시킨 결과, 암세포는 완전히 사멸되지 않았다. 이 점에서 이들 폴리펩티드에는 직접적으로 암세포를 죽이는 작용이 없는 것도 확인했다.

세포장해활성은 상기와 같이 본 발명에서 사용되는 각 폴리펩티드로 자극 유도된 CD8 양성 T세포 5×10⁴개와 크롬51을 도입시킨 1×10³개의 각 종양세포를 혼합하여 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크롬51의 양을 측정하고, 이하 계산식*에 의해 산출한 CD8 양성 T세포의 각 종양세포(표적세포라고 함)에 대한 세포장해활성을 나타낸 결과이다.

*식: 세포장해활성(%)=CD8 양성 T세포를 추가했을 때의 표적세포로부터의 크롬51 유리량÷1N 염산을 추가한 표적세포로부터의 크롬51 유리량×100

<실시예 4: PDS5A 단백질 유래 펩티드에피토프 반응성 CD4 양성 T세포의 유도>

CD4 양성 T세포 항원 에피토프 예측을 위하여 SYFPEITHI 알고리즘(라멘시(Rammensee) 저의 컴퓨터 예측 프로그램을 사용하여 인간 PDS5A 단백질의 아미노산 서열을 해석하고, HLA클래스 II 결합 펩티드라고 예상되는 서열 번호 35~67에 나타내는 33종류의 펩티드를 선택했다. 선택한 모든 펩티드는 Greiner Bio-One International GmbH의 커스텀 펩티드 합성 서비스에 합성 의뢰했다.

HLA-DRB1*04 양성의 건상인으로부터 말초혈을 분리하고, Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika제)에 중층하여 1,500rpm으로 실온에서 20분간 원심분리했다. PBMC를 함유하는 획분을 회수하고, 냉각 인산염 완충액 중에서 3회(또는 그 이상) 세정하여 PBMC를 얻었다. 얻어진 PBMC를 20mL의 AIM-V 배지(Life Technololgies제)에 현탁하고, 배양 플라스크(Falcon제) 중에 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 2시간 부착시켰다. 비부착 세포는 T세포 조제에 사용하고, 부착 세포는 수지상세포를 조제하기 위해서 사용했다.

한편, 부착 세포를 AIM-V 배지 중에서 IL-4(1000U/mL) 및 GM-CSF(1000U/mL)의 존재하에서 배양했다. 6일 후에 IL-4(1000U/mL), GM-CSF(1000U/mL), IL-6(1000U/mL, Genzyme제), IL-1β(10ng/mL, Genzyme제) 및 TNF-α(10ng/mL, Genzyme제)를 첨가한 AIM-V 배지에 교환해서 2일간 더 배양한 후 얻어진 비부착 세포 집단을 수지상세포로서 사용했다.

조제한 수지상세포를 AIM-V 배지 중에 1×10⁶세포/mL의 세포 밀도로 현탁하고, 서열 번호 35~67의 각 폴리펩티드, 음성 컨트롤 폴리펩티드(서열 번호 85) 및 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 PDS5A 단백질을 각각 10mg/mL의 농도로 첨가하고, 96구멍 플레이트를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양 후 X선 조사(3000rad)하여 AIM-V 배지에서 세정하고, 10% 인간 AB 혈청(Nabi제), IL-6(1000U/mL) 및 IL-12(10ng/mL, Genzyme제)를 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하고, 24구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×10⁵세포씩 첨가했다. 또한, 조제한 T세포 집단을 1구멍당 각각 1×10⁶세포 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양했다. 7일 후 각각의 배양 상청을 버리고, 상기와 마찬가지로 해서 얻은 각 펩티드 및 PDS5A 단백질로 처리 후 X선 조사한 수지상세포를 10% 인간 AB 혈청(Nabi사제) 및 IL-2(10U/mL, Genzyme제)를 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하고, 24구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×10⁵세포씩 첨가하여 더 배양했다. 마찬가지의 조작을 7일 간격으로 4회 반복한 후 자극된 T세포를 회수하고, 플로 사이토메트리에 의해 CD4 양성 T세포의 유도를 확인했다. 그 결과, 유도한 각 구멍의 T세포가 증식하고 있는 것이 확인되었다.

<실시예 5: HLA-DRB1*04 양성 CD4 양성 T세포를 자극하는 PDS5A 단백질 유래 헬퍼 T세포 항원 에피토프의 결정>

상기 실시예 4에서 유도한 CD4 양성 T세포의 각 펩티드 단백질에 대한 특이성을 조사하기 위해서 각종 폴리펩티드로 HLA-DRB1*04 분자를 발현하는 PBMC를 펄스했다. 상기 PBMC는 10㎍/mL의 농도로 AIM-V 배지 중 각 폴리펩티드를 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 4시간 배양해서 조제했다. 또한, 각종 폴리펩티드에는 서열 번호 35~67의 아미노산 서열로 나타내어지는 각 폴리펩티드, 음성 컨트롤 폴리펩티드(서열 번호 85) 및 서열 번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 전장 PDS5A 단백질을 사용했다. 펄스 후의 PBMC5×10⁴개에 대하여 5×10⁴개의 CD4 양성 T세포를 첨가하고, 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지 중에서 96구멍 플레이트에서 24시간 배양했다. 배양 후의 상청을 취하여 IFN-γ의 산생량을 ELISA법에 의해 측정했다.

그 결과, 각각 서열 번호 35~67의 각 펩티드를 펄스한 PBMC를 사용한 구멍의 배양 상청에 있어서 1000pg/mL 이상의 IFN-γ가 산생되어 있었다. 한편, 음성 컨트롤 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 펄스하고 있지 않는 수지상세포만(Mock)을 사용한 구멍의 배양 상청에서는 IFN-γ의 산생은 거의 확이되지 않았다. 따라서, 서열 번호 35~67의 아미노산 서열로 나타내어지는 각종 폴리펩티드는 특이적으로 HLA-DRB1*04 양성 CD4 양성 T세포를 증식 자극시켜 IFN-γ 산생을 유도하는 능력을 갖는 T세포 에피토프펩티드인 것이 판명되었다. 또한, 전장 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에는 상기 면역 유도 활성을 갖는 서열 번호 35~67이 포함되어 있음에도 불구하고, 전장 PDS5A 단백질을 펄스한 PBMC 세포를 사용한 구멍의 배양 상청에 있어서의 IFN-γ의 산생량이 극히 적었다. 이것은 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에 면역 유도 활성을 억제하는 서열이 많이 포함되기 때문에 충분한 면역 유도 활성을 나타내지 않았던 것으로 생각된다.

이어서, HLA-DRB1*04 양성 T세포를 증식 자극시키는 능력을 갖는 서열 번호 35~67의 폴리펩티드가 PDS5A 단백질로부터 항원제시세포 내에서 내추럴하게 프로세스되어서 HLA-DR상에 제시되는 에피토프인지의 여부에 대해서 검토했다. PDS5A 단백질을 일과적으로 발현시킨 HEK293 세포(ATCC로부터 구입)의 라이세이트를 미성숙 수지상세포에 첨가하여 소화시키고, 수지상세포를 성숙화시킨 후 서열 번호 35~67의 폴리펩티드, 음성 컨트롤 폴리펩티드 및 PDS5A 단백질로 자극된 T세포가 본 수지상세포에 의해 자극되는지를 조사했다. HLA-DRB1*04 양성의 건상인으로부터 말초혈을 분리하고, Lymphocyte separation medium에 중층하여 1,500rpm으로 실온에서 20분간 원심분리했다. PBMC를 함유하는 상간(相間)을 수확하고, 냉각 인산염 완충액 중에서 3회(또는 그 이상) 세정하여 PBMC를 얻었다. 얻어진 PBMC를 AIM-V 배지 20mL에 현탁하고, 배양 플라스크(Falcon) 중에 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 2시간 부착시키고, 부착 세포를 AIM-V 배지 중에서 IL-4(1000U/mL) 및 GM-CSF(1000U/mL)의 존재하에서 6일간 배양하여 미성숙 수지상세포를 제작했다. 상기 라이세이트를 5×10⁵개의 미성숙 수지상세포에 첨가하고, IL-4(1000U/mL), GM-CSF(1000U/mL), IL-6(1000U/mL), IL-1β(10ng/mL) 및 TNF-α(10ng/mL)를 첨가한 AIM-V 배지 중에서 2일간 배양했다. 배양 후의 수지상세포를 X선 조사(3000rad)하고, AIM-V 배지로 세정 후 10% 인간 AB 혈청을 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하여 96구멍 플레이트 1구멍당 각각 3.3×10⁴개씩 첨가했다. 이들 5×10⁴개의 서열 번호 35~67의 폴리펩티드 음성 컨트롤 폴리펩티드 및 PDS5A 단백질로 자극된 T세포를 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 24시간 배양했다. 배양 후의 상청을 취하여 IFN-γ의 산생량을 ELISA법에 의해 측정했다.

그 결과, 도 6에 나타내는 바와 같이 서열 번호 35~67의 폴리펩티드로 자극된 레인 4~36의 T세포는 PDS5A 단백질을 첨가한 수지상세포의 자극에 의해 IFN-γ를 산생하는 것을 알 수 있었다. 한편, 레인 2에서 나타내는 음성 컨트롤 폴리펩티드로 자극한 레인 2 및 폴리펩티드로 자극하고 있지 않은 레인 1에 있어서는 IFN-γ의 산생은 거의 확인되지 않았다. 따라서, 서열 번호 35~67의 폴리펩티드가 PDS5A 단백질이 항원제시세포 내에서 내추럴하게 프로세스되어서 HLA-DR상에 제시되는 에피토프인 것이 명백해졌다. 또한, 본 실험에 있어서도 전장 PDS5A 단백질을 펄스한 레인 3에서는 IFN-γ의 산생량이 극히 적었다. 전장 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중에는 면역 유도 활성을 억제하는 서열이 많이 포함되는 점에서 충분한 면역 유도 활성을 나타내지 않았던 것으로 생각된다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명의 각종 암에 대하여 항종양 활성을 발휘하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 유도제는 암의 치료 또는 예방에 또는 암의 검출에 유용하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 원용되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Immunity inducing agent <130> PH-6650-PCT <150> JP 2015-158539 <151> 2015-08-10 <160> 85 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 7190 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (541)..(4554) <400> 1 ggccggcgga ggaaggggag ggagcgagga gcgcgcgctg ctctcgcgtg ctctcgcgcc 60 gctcgcgtga ccggccggtg tgtgcgcgag gccccggctc ccggggcacg gacggccggg 120 cgcgcgcctc tgcgaggggc gtccgggtcc gagtcggcgg tccgggccgg cgcgaggtgc 180 gtgcgggcgg gccgcggggg tcccggacgg acacaagcgc acacactccc ggaggagcct 240 tcgaggctgc tcttcctcgg ccagacggag agcggcactg tctccccgcc cagcgctcac 300 tcgccccgcg tctccccccg cggcggctgc tcctcctcgg caccgccagc cccagcgccg 360 ctcccgggcg ggcgggcggc ggcggcggcg gcggcgggac ccgcggagcc gctttgtgtg 420 cagcccgact aggggcggcg gcgcaaccac ctgacagagg cccgggcgct cgatgcacct 480 tccgcccgca tgaggaggag aggccggtag aggactgtga accaaaagtt gtcccccagg 540 atg gac ttc acc gcg cag ccc aag cct gcc act gcc ctc tgt ggc gtc 588 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr 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aaa ctt cgg tct cag ttg gag tta tta 2268 Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu 565 570 575 att agc cca acc tgt tct tgc aaa caa gca gat att tgt gtg aga gaa 2316 Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu 580 585 590 ata gcc cgg aaa ctt gca aat cct aag caa cca aca aat cct ttt cta 2364 Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu 595 600 605 gag atg gtc aaa ttt ctg ttg gaa aga atc gca cct gtg cac att gat 2412 Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp 610 615 620 tca gaa gcc ata agt gca cta gtg aaa ttg atg aat aag tca ata gag 2460 Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu 625 630 635 640 ggg aca gca gat gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct atc 2508 Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile 645 650 655 cgt tca gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttt aca cat cct acc 2556 Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr 660 665 670 tcg ttc 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Ala Ala Gly Ser Ala Ile 885 890 895 atg aag ctt gct cag gaa cct tgt tac cat gaa att att acc cca gaa 3276 Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu 900 905 910 cag ttt cag ctc tgt gca ctt gtt att aat gat gag tgt tac caa gta 3324 Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val 915 920 925 agg cag ata ttt gct cag aag ctg cat aag gca ctt gtg aag tta ctg 3372 Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu 930 935 940 ctc cca ttg gag tat atg gcg atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct 3420 Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro 945 950 955 960 gtg aag gag aga aga gca cac gca cga caa tgt tta ctg aaa aat atc 3468 Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile 965 970 975 agt ata cgc agg gaa tac att aag cag aat cct atg gct act gag aaa 3516 Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys 980 985 990 tta tta tca ctg ttg cct gaa tat gta gtt cca tac atg att cac ctg 3564 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu 995 1000 1005 cta gcc cat gat cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat cag 3609 Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln 1010 1015 1020 ctt cgt gat atc aaa gag tgc cta tgg ttc atg ctt gaa gtt tta 3654 Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu 1025 1030 1035 atg aca aag aat gaa aac aat agc cat gcc ttt atg aag aag atg 3699 Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met 1040 1045 1050 gca gag aac atc aag tta acc aga gat gcc cag tct cca gat gaa 3744 Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu 1055 1060 1065 tcc aag aca aat gaa aaa ctg tat aca gta tgt gat gtg gct ctc 3789 Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu 1070 1075 1080 tgt gtt ata aat agt aaa agt gct ttg tgc aat gca gat tca cca 3834 Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro 1085 1090 1095 aag gac cca gtc ctc cca atg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag 3879 Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys 1100 1105 1110 gac ttc tgt aac gat aag agt tat att tca gaa gag aca aga gta 3924 Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val 1115 1120 1125 ctt ctg tta aca gga aag cca aag cct gct gga gta cta ggt gca 3969 Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala 1130 1135 1140 gta aat aag cct tta tca gca acg gga agg aaa ccc tat gtt aga 4014 Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg 1145 1150 1155 agc act ggc act gag act gga agc aat att aat gta aat tca gag 4059 Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu 1160 1165 1170 ctg aac cct tca acc gga aat cga tca agg gaa cag agt tca gag 4104 Leu Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu 1175 1180 1185 gca gca gaa act gga gtt agt gaa aat gaa gag aac cct gtg agg 4149 Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg 1190 1195 1200 att att tca gtc aca cct gta aag aat att gac cca gta aag aat 4194 Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn 1205 1210 1215 aag gaa att aat tct gat cag gct acc cag ggc aac atc agc agt 4239 Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser 1220 1225 1230 gac cga gga aag aaa aga aca gta aca gca gct ggt gca gag aat 4284 Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn 1235 1240 1245 atc caa caa aaa aca gat gag aaa gta gat gaa tcg gga cct ccc 4329 Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro 1250 1255 1260 gcc cct tcc aaa ccc agg aga gga cgt cga ccc aag tct gaa tct 4374 Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser 1265 1270 1275 cag ggc aat gct acc aaa aat gat gat cta aat aaa cct att aac 4419 Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn 1280 1285 1290 aag gga agg aag aga gct gca gtg ggt cag gag agc cct ggg ggt 4464 Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly 1295 1300 1305 ttg gaa gca ggt aat gcc aaa gca ccc aaa ctg caa gat tta gcc 4509 Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala 1310 1315 1320 aaa aag gca gca cca gca gaa aga caa att gac tta caa agg taa 4554 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1325 1330 1335 aaatgcattt gcaaagggag aaaatgaagg ccaaacagaa gcaggctcca gcttctgcaa 4614 aaacttggat tcacaaatgt ccctgaacag aaaatgaagc tcacttcaga acacacactc 4674 tctgccttga aaactaaaga gactattact tccttttcac atgaccacaa gtcctctgat 4734 ggaaatgtac agcagaaact cttgagagag aggctaaaag caactctgtt ctcccccttc 4794 ccctagactt ttcttacgaa aagtcaataa ttaagcaaat tgcttaacac ttggttccag 4854 ttcctgccta tctggagttt aaatgcgtaa tacaccatta atttccacgc tgcagttttt 4914 attttaaaga aagtaacaag atgtctttac actgacactg aaaattcatc cattttagag 4974 ccaggaattc ccatgttaca caggaaaaaa tagaagtcta ctgaattaat tttttaaaag 5034 aaaagagatc agattaaata tttctttgtt tttccttttg gaaactttta tgtataattc 5094 tttctgcctg cctacttttc tgcaaaaatg agatgtacag atttcggttc cctgctatga 5154 aaagtgatgt ggtagcaatt ttataaatgt tgctttctga tttttatcag agtgagaaaa 5214 ttaaaattat tgatttgcaa gtagtaaaca gttcatattt tgatttcccc tcattttagt 5274 ttaatataat ttgcaataaa tgtacatatt gttgtttgtt tcataaagca tatcacttta 5334 aaatggtttt tactcctgtg attatgttgg aatatttgga attttaaagg agtaaagact 5394 gtccagcatt tggttttata atgtttgtca ccagattttt attaatgtaa aaaaaatcaa 5454 tttttaaaaa atagttggac tttggcagct tttaaggaaa gttggaggtg ttttaggatt 5514 gctatcaatt ttcagcattg tgctatttgg aaataagtgt tttgcttttg tctgatggtc 5574 tgggctcatt tttatgttta ttttagaaaa ctgttgcatc aatatattat gtttcttggc 5634 attgttcagc ataggtaatg tgtgcacttt atgtgtacac ataatcatat ttaagttttt 5694 tgcataaaat aaatgcttct agatgtcatg gcagtctttt taatcttttt atcatatgct 5754 ttcttgtgaa ttttttcatg ttaaagagct aaagtcataa catgattaca gtcaactctc 5814 cattatctat ataaaatagt gactaagcct caggttttta attttgtgat aacaaaataa 5874 cgaaggcatg taagacctga ttctggagga acatgaaatt tgtcttttct catgtccaga 5934 gttctatcct gcccccactg tccactgtag ggtcatccgc aaagccctag cagaatgtgc 5994 tcactccatt tccttacacg tttctagcat gggtcagagg aaacaacatt tgtgttataa 6054 cttcgtcttg ataggctgta gtgtacatgg gatgtaaaac aaacaagtgt atcaaaggtg 6114 gatgattctg ttagagtgaa gtttgagagt aaatgtcact tacgtttctc atagataatc 6174 aagagttggc tgtgtattga ctgaaagatg ggtaattatt ttaaatatgc atttacacac 6234 atttaggtat cagaagatgc ttagggaaca atggatacca atgatagaaa atgatacctt 6294 tacaggggca gaaaaatccc cactcttcct tattgcctct tcagaaccct ttagaaagta 6354 taaaatattg cctccaacat gctgaaaaag agtatctatg cataagtatc agagaagtcc 6414 ctcaagcaat cagtaggtgt gttctattta gagagagttt aaagttctct tagcatcaga 6474 caacttgatt cctaaggttt ccagtgtgtc accaacaaaa agtgcattga tagggacctt 6534 tgtctcttcc tccctttgat taattgcccg gcatcacagt ttactagatt accaagtgtt 6594 acatcatatt aaataaaatg tagcagaacc atctgcatca atatattcct gtttagattt 6654 ttgcaggaga gaagttaaaa ggatttgctc cttgtatgat gtaagtggcc caccccaatt 6714 ttgtaacatg atgcaagtgt ctggcactaa gggaagcaag agtagggttg tggaaagacc 6774 aagctgatgg ggagggactt gtttacggga atttttttag ttttcctttt caaaggaaaa 6834 cattaaaatc ccttaggaat ttggtattca catctcagag aactacaaca caaaagtgca 6894 gacttatatt tgagaattaa tgttaaccct ttgtgtctag tttgaagctt cttgtatttg 6954 tctaaaacaa caagccagaa ttttgtatct cctttgataa aaagtgtgta taatgtaaag 7014 tagttttgca tattcttgtg ctgcacatgg gctgaatttt taaatttttt ttaaaaactt 7074 gaagcagaac cttgtaattt gtgtaaatga caagtgtaaa atcctaccat aaaatgctaa 7134 aaatatgcac tgtttcaaat aaaaccaaga aatgcagcat taaaaaaaaa aaaaaa 7190 <210> 2 <211> 1337 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val 1 5 10 15 Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile 20 25 30 Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val 35 40 45 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn 130 135 140 Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys 145 150 155 160 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 165 170 175 Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser 180 185 190 Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser 195 200 205 Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg 355 360 365 Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile 370 375 380 Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu 385 390 395 400 Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys 405 410 415 Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His 420 425 430 Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp 435 440 445 Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu 450 455 460 Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr 465 470 475 480 Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro 485 490 495 Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu 500 505 510 Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser 515 520 525 Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys 530 535 540 Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn 545 550 555 560 Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu 565 570 575 Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu 580 585 590 Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu 595 600 605 Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp 610 615 620 Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu 625 630 635 640 Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile 645 650 655 Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr 660 665 670 Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg 675 680 685 Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn 690 695 700 Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu 705 710 715 720 Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala 725 730 735 Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val 740 745 750 Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp 755 760 765 Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser 770 775 780 Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala 785 790 795 800 Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu 805 810 815 Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val 820 825 830 Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly 835 840 845 Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu 850 855 860 Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile 865 870 875 880 Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile 885 890 895 Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu 900 905 910 Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val 915 920 925 Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu 930 935 940 Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro 945 950 955 960 Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile 965 970 975 Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys 980 985 990 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu 995 1000 1005 Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln 1010 1015 1020 Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu 1025 1030 1035 Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met 1040 1045 1050 Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu 1055 1060 1065 Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu 1070 1075 1080 Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro 1085 1090 1095 Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys 1100 1105 1110 Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val 1115 1120 1125 Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala 1130 1135 1140 Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg 1145 1150 1155 Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu 1160 1165 1170 Leu Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu 1175 1180 1185 Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg 1190 1195 1200 Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn 1205 1210 1215 Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser 1220 1225 1230 Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn 1235 1240 1245 Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro 1250 1255 1260 Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser 1265 1270 1275 Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn 1280 1285 1290 Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly 1295 1300 1305 Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala 1310 1315 1320 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1325 1330 1335 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp Ile 1 5 10 <210> 5 <211> 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5 10 15 <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 1 5 10 15 Asp Thr Lys <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser 1 5 10 15 Tyr <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu 1 5 10 15 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 1 5 10 15 Asn Ser <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met 1 5 10 15 His <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser Ser Ile Ile 1 5 10 15 Met Glu <210> 42 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn 1 5 10 15 Lys Gln Ser <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ile Gln Glu Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met 1 5 10 15 Pro Gln Leu Glu Phe Lys Leu 20 <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly 1 5 10 15 Ser Lys <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 His Asp Val Ile Val Thr Ile Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala 1 5 10 15 Leu Val Asn <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys Asn Leu Pro Asp 1 5 10 15 Pro Gly Lys <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu 1 5 10 15 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Cys Leu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser 1 5 10 15 Ile Glu Gly Thr Ala 20 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Pro Thr Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln 1 5 10 15 <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Asp Leu <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala 1 5 10 15 Lys Arg <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln 1 5 10 15 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val 1 5 10 15 Gln Leu Ala Gln 20 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala Asn Phe Ile Val Lys Asp 1 5 10 15 <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Val Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu 1 5 10 15 Gly Met Lys <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys 1 5 10 15 Ser Ala <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser Ala Met Leu Val Ser Glu 1 5 10 15 Gly Asp Leu Thr 20 <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met 1 5 10 15 Lys Leu <210> 59 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Cys Tyr Gln Val Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu 1 5 10 15 Val Lys Leu <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro 1 5 10 15 <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser Ile Arg Arg Glu 1 5 10 15 Tyr Ile <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu 1 5 10 15 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn 1 5 10 15 Asn Ser His Ala Phe Met 20 <210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg 1 5 10 15 Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu 20 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys 1 5 10 15 Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu 20 <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly 1 5 10 15 Arg Lys <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Glu Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp 1 5 10 15 Pro <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 68 gtaaggtggc tgttgggtat g 21 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 69 ggctagcagg tgaatcatgt atgg 24 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 70 gggctgcttt taactctg 18 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 71 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 72 gcggccgcat ggacttcacc gcgcagccc 29 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 73 ctcgagttac ctttgtaagt caatttgtc 29 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu 1 5 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val 1 5 10 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His Val 1 5 10 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu 1 5 10 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr 1 5 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser Ser Val 1 5 10 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu 1 5 <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln 1 5 10 15 Asp Val

Claims

이하의 (i) 또는 (ii)를 유효 성분으로서 함유하는 면역 유도제.
(i) 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드,
(a) 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 및 1074~1215위치의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
(b) 상기 (a)에 기재된 어느 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드, 또는
(ii) 상기 어느 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적어도 1개 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 벡터
제 1 항에 있어서,
상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 MHC클래스 I 분자에 결합하는 면역 유도제.
제 2 항에 있어서,
상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 이하의 (c)~(e)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 면역 유도제.
(c) 서열 번호 3~34에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(d) 상기 (c)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드
(e) 상기 (c) 또는 (d)에 기재된 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드
제 1 항에 있어서,
상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 MHC클래스 II 분자에 결합하는 면역 유도제.
제 4 항에 있어서,
상기 (i)에 기재된 폴리펩티드가 이하의 (f)~(h)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 면역 유도제.
(f) 서열 번호 35~67에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(g) 상기 (f)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드
(h) 상기 (f) 또는 (g)에 기재된 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료 또는 예방약의 유효 성분으로서 사용하는 면역 유도제.
제 6 항에 있어서,
상기 암이 PDS5A 단백질을 발현하는 암인 면역 유도제.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
상기 암이 백혈병, 악성림프종, 전립선암, 간암, 유방암, 췌장암, 난소암, 신장암, 대장암, 위암, 악성뇌종양, 폐암 또는 식도암인 면역 유도제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 증강제를 더 포함하는 면역 유도제.
이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되며, 또한 면역 유도 활성을 갖는 어느 하나의 폴리펩티드.
(a) 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열 중의 24~97위치, 113~132위치, 134~197위치, 204~225위치, 265~332위치, 378~463위치, 472~498위치, 533~567위치, 613~643위치, 671~735위치, 737~780위치, 792~830위치, 832~899위치, 920~943위치, 946~993위치, 1029~1069위치, 및 1074~1215위치의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드,
(b) 상기 (a)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드.
제 10 항에 있어서,
이하의 (c)~(e)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 폴리펩티드.
(c) 서열 번호 3~34에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(d) 상기 (c)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드
(e) 상기 (c) 또는 (d)에 기재된 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드
제 10 항에 있어서,
이하의 (f)~(h)에 기재된 폴리펩티드군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드인 폴리펩티드.
(f) 서열 번호 35~67에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(g) 상기 (f)에 기재된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 1~수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드
(h) 상기 (f) 또는 (g)에 기재된 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원제시세포.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합하는 단리 T세포.