KR101757798B1 - 면역 유도제 - Google Patents

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Abstract

(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드, (b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드, 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 함유하는 면역 유도제는 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용하다.

Description

면역 유도제{IMMUNITY INDUCER}
본 발명은 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 유용한 신규의 면역 유도제에 관한 것이다.
암은 전 사망 원인의 제일위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 하여 방사선 요법과 화학 요법을 조합시킨 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 상관없이 일부의 암을 제외하고는 암의 치료 성적은 그다지 향상되어 있지 않은 것이 현재의 상황이다. 최근, 분자생물학이나 암 면역학의 진보에 의해 암에 반응하는 세포장해성 T세포에 의해 인식되는 암 항원이나 암 항원을 코딩하는 유전자가 동정되어와서 항원특이성 면역요법에의 기대가 높아지고 있다.
면역요법에 있어서는 부작용을 경감하기 위해서 그 항원으로서 인식되는 펩티드 또는 단백질은 정상세포에는 거의 존재하지 않고 암세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 필요로 된다. 1991년 벨기에 Ludwig 연구소의 Boon et al.은 자기 암 세포주와 암반응성 T세포를 사용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식하는 인간 멜라노머 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 1). 그 후, 암환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 종양 항원을 유전자의 발현 클로닝의 수법을 도입하여 동정하는 SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되어 있고(특허문헌 1, 비특허문헌 2), 이 방법에 의해 수 개의 암 항원이 단리되어 있다. 또한, 그 일부를 타겟으로 해서 암면역요법의 임상시험이 개시되어 있다.
한편, 인간과 같이 개나 고양이에게도 유선종양, 편평상피암 등 다수의 종양이 알려져 있고, 개나 고양이의 질병 통계에서도 상위에 랭크되어 있다. 그러나, 개나 고양이의 암에 대한 유효한 치료약, 예방약 및 진단약은 현재 시점에서 존재하지 않는다. 대부분의 개나 고양이의 종양은 진행해서 종류(腫瘤)가 커지고 나서 주인이 알아차리는 케이스가 대부분이어서 내원해서 외과적 수술에 의해 절제하거나 인체약(항암제 등)을 투여해도 이미 때를 놓쳐서 처치 후 얼마 되지않아 사망하는 경우가 많다. 이러한 현상 중에서, 개나 고양이에게 유효한 암의 치료약 및 예방약이 입수가능하게 되면 개의 암에 대한 용도가 열린다고 기대된다.
PDS5A(PDS 5, regulator of cohesion maintenance, homolog A)는 별명 SSC-112이라고도 불리는 단백질로, 염색체의 분배시에 관여하는 세포주기 제어인자로서 동정되고, 정상 조직과 비교해서 상인두암, 신장암, 간장암, 유방암세포 중 1종에서 발현이 높은 것이 보고되어 있다(특허문헌 2, 비특허문헌 3∼5). 그리고, PDS5A 유전자에 대한 안티센스 핵산, 리보자임, siRNA 또는 PDS5A 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용해서 암세포 중의 PDS5A의 발현을 억제함으로써 암세포의 증식을 억제할 수 있고, 또한 PDS5A 전장 단백질 또는 PDS5A 단백질의 부분 펩티드를 투여함으로써 암세포에 아포토시스를 유도할 수 있는 것이 보고되어 있다 (특허문헌 3). 또한, 특허문헌 3에서는 암세포에 있어서 PDS5A 단백질의 mRNA량의 증가가 확인되어 있다. 그러나, PDS5A 단백질 및 상기 단백질의 부분 펩티드가 암세포에 대한 면역 유도 활성을 갖고, 그것에 의해서 상기 단백질 및 상기 단백질의 부분 펩티드가 암의 치료나 예방에 유용하다고 하는 보고는 없고, PDS5A 단백질이 암의 진단에 이용가능한 마커로서의 기능을 갖는지의 유무에 대해서는 확인되어 있지 않다.
미국 특허 제5698396호 WO2006/109943 WO2002/081641
Science, 254: 1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813(1995) Gene. 17; 328: 187-96(2004) J. Cell. Sci. 15; 118(Pt 10): 2133-41(2005) J.Cancer Res. Clin. Oncol.: 134(4): 453-62(2008)
본 발명의 목적은 암의 치료 및/또는 예방제, 또는 암의 검출에 유용한 신규의 폴리펩티드를 찾아내서 상기 폴리펩티드의 면역 유도제 또는 암의 검출에의 사용을 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구한 결과 개 유방암 유래 cDNA 라이브러리와 담암견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 그 cDNA를 기초로 하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개 PDS5, regulator of cohesion maintenance, homolog A(이하, PDS5A라고 기재함) 단백질을 제작했다. 또한, 취득한 유전자의 인간 및 마우스 상동성 유전자를 기초로 하여 서열번호 4 또는 44로 표시되는 아미노산을 갖는 인간 PDS5A(또한 서열번호 4는 서열번호 44의 부분 서열에 상당함) 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 PDS5A를 제작했다. 그리고 이들 PDS5A가 유방암, 뇌종양, 식도암, 폐암, 신장암, 대장암, 항문주위선암, 신경아종 및 백혈병의 조직 또는 세포에 특이적으로 발현하고 있는 것을 발견했다. 또한, 이들 PDS5A를 생체에 투여함으로써 생체 내에 PDS5A에 대한 면역 세포를 유도할 수 있는 것 및 PDS5A를 발현하는 생체 내의 종양을 퇴축시킬 수 있는 것을 발견했다. 또한, PDS5A의 전장 단백질 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현가능한 재조합 벡터가 PDS5A를 발현하는 암에 대하여 생체 내에서 항종양 효과를 유도하는 것을 발견했다.
또한, PDS5A의 부분 펩티드가 항원 제시세포에 의해 제시되어서 상기 펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 활성화 및 증식시키는 능력(면역 유도 활성)을 갖는 경우, 이 때문에 상기 펩티드가 암의 치료 및/또는 예방에 유용하고, 또한 상기 펩티드와 접촉한 항원 제시세포나 상기 항원 제시세포와 접촉한 T세포가 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.
(1) 이하의 (a)~(c) 중 어느 하나의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 함유하는 면역 유도제.
(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드.
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.
(2) (1)에 있어서, 상기 (b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(3) (1)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(4) (3)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(5) (3)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 2, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 aa 111∼140, aa 211∼240, aa 248∼278, aa 327∼357, aa 459∼522, aa 909∼972, aa 959∼1022, aa 994∼1057 또는 aa 1018∼1080의 영역내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열표의 서열번호 2, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 aa 111∼140, aa 211∼240, aa 248∼278, aa 327∼357, aa 459∼522, aa 909∼972, aa 959∼1022, aa 994∼1057 또는 aa 1018∼1080의 영역내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드인 면역 유도제.
(6) (5)에 있어서, 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드, 또는 서열표의 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드인 면역 유도제.
(7) (1)∼(6) 중 어느 하나에 있어서, 동물의 암 예방용인 면역 유도제.
(8) (5) 또는 (6)에 있어서, 동물의 암 치료용인 면역 유도제.
(9) (7) 또는 (8)에 있어서, 상기 암은 PDS5A를 발현하는 암인 면역 유도제.
(10) (7)∼(9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 암은 유방암, 뇌종양, 식도암, 폐암, 신장암, 대장암, 항문주위선암, 신경아종 또는 백혈병인 면역 유도제.
(11) (1)∼(10) 중 어느 하나에 있어서, 면역증강제를 더 포함하는 면역 유도제.
(12) 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리항원 제시세포.
(13) 상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합시키는 단리 T세포.
(14) 서열표의 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드, 또는 서열표의 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드로서, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드.
(15) 생체로부터 분리된 시료에 있어서 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것을 포함하는 암의 검출방법.
(16) 이하의 (a)~(c)의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현가능한 재조합 벡터를 개체에 투여하는 것을 포함하는 면역 유도 방법.
(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드.
(b) 상기 (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고 또한 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드.
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.
본 발명에 의해, 암의 치료 및/또는 예방 등에 유용한 신규의 면역 유도제가 제공된다. 후술하는 실시예에 있어서 구체적으로 표시하는 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 생체에 투여하면 생체 내에 있어서 면역 세포를 유도할 수 있고, 또한 이미 생겨 있는 암을 축소 또는 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드는 암의 치료나 예방에 유용하다.
도 1은 동정한 PDS5A 유전자의 개 정상조직 및 종양조직 또는 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조 번호 1; 개 PDS5A 유전자의 개의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴, 참조 번호 2; 개 GAPDH 유전자의 개의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴.
도 2는 동정한 PDS5A 유전자의 인간 정상조직 및 종양조직 또는 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조 번호 3; 인간 PDS5A 유전자의 인간의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴, 참조 번호 4; 인간 GAPDH 유전자의 인간의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴.
도 3은 동정한 PDS5A 유전자의 마우스 정상조직 및 종양조직 또는 암 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조 번호 5; 마우스 PDS5A 유전자의 마우스의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴, 참조 번호 6; 마우스 GAPDH 유전자의 마우스의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다.
도 4는 PDS5A 투여에 의해 항종양 효과(치료 모델-신경아종 세포주)가 확인된 것을 나타내는 그래프이다. 벡터만 또는 PDS5A를 코딩하는 플라스미드를 유전자총을 사용해서 면역하고, 암 부위의 면적, 생존 마우스의 비율로 평가했다. 또한, 각 군에는 10마리의 마우스를 사용했다. 마우스는 1주일에 대해서 2회의 관찰을 행했다. 데이터는 평균치±SD로 표시했다. 참조 번호 7; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 8; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 5는 PDS5A 투여에 의해 항종양 효과(예방 모델-신경아종 세포주)가 확인된 것을 나타내는 그래프이다. 벡터만 또는 PDS5A를 코딩하는 플라스미드를 유전자총을 사용해서 면역하고, 암 부위의 면적, 생존 마우스의 비율로 평가했다. 또한, 각 군에는 10마리의 마우스를 사용했다. 마우스는 1주일에 대해서 2회의 관찰을 행했다. 데이터는 평균치±SD로 표시했다. 참조 번호 9; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 10; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 6은 도 4의 실험에 있어서의 마우스의 생존 비율을 나타낸다. 참조 번호 11; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 12; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 7은 도 5의 실험에 있어서의 마우스의 생존 비율을 나타낸다. 참조 번호 13; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 14; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 8은 PDS5A 투여에 의해 항종양 효과(치료 모델-대장암 세포주)가 확인된 것을 나타내는 그래프이다. 벡터만 또는 PDS5A를 코딩하는 플라스미드를 유전자총을 사용해서 면역하고, 암 부위의 면적, 생존 마우스의 비율로 평가했다. 또한, 각 군에는 10마리의 마우스를 사용했다. 마우스는 1주일에 대해서 2회의 관찰을 행했다. 데이터는 평균치±SD로 표시했다. 참조 번호 15; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 16; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 9는 PDS5A 투여에 의해 항종양 효과(예방 모델-대장암 세포주)가 확인된 것을 나타내는 그래프이다. 벡터만 또는 PDS5A를 코딩하는 플라스미드를 유전자총을 사용해서 면역하고, 암 부위의 면적, 생존 마우스의 비율로 평가했다. 또한, 각 군에는 10마리의 마우스를 사용했다. 마우스는 1주일에 대해서 2회의 관찰을 행했다. 데이터는 평균치±SD로 표시했다. 참조 번호 17; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 18; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 10은 도 8의 실험에 있어서의 마우스의 생존 비율을 나타낸다. 참조 번호 19; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 20; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 11은 도 9의 실험에 있어서의 마우스의 생존 비율을 나타낸다. 참조 번호 21; 벡터의 플라스미드 투여군, 참조 번호 22; PDS5A를 코딩하는 플라스미드의 투여군을 나타낸다.
도 12는 서열표의 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 각 폴리펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포가 상기 폴리펩티드와 HLA-A0201의 복합체를 인식해서 IFN-γ를 산생하는 것을 나타내는 도면이다. 도 12 중, 횡축의 참조 번호 25∼33은 각각 서열번호 27∼35의 펩티드를 펄스한 T2세포로부터의 자극에 의한 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포의 IFN-γ 산생능을 나타낸다. 참조 번호 23은 폴리펩티드를 첨가하지 않고 상기 처리를 행했을 경우에 관한 결과를 나타내고, 참조 번호 24는 서열번호 36으로 표시되는 본 발명의 범위 외의 폴리펩티드를 첨가해서 상기 처리를 행한 결과에 대해서 나타낸다.
도 13은 서열표의 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 각 펩티드에 특이적인 CD8 양성 T세포의 암세포에 대한 장해활성을 나타내는 도면이다. 도 13 중, 횡축의 참조 번호 36∼44는 각각 서열번호 27∼35의 펩티드를 사용해서 자극한 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포의 T98G 세포에 대한 세포장해활성을 나타낸다. 참조 번호 34는 폴리펩티드를 첨가하지 않고 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타내고, 참조 번호 35는 음성 컨트롤의 펩티드(서열번호 36)를 사용해서 유도한 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 나타낸다.
본 발명의 면역 유도제에 유효성분으로서 포함되는 폴리펩티드로서는 이하의 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「폴리펩티드」란 복수의 아미노산이 펩티드 결합함으로써 형성되는 분자를 말하고, 구성하는 아미노산수가 많은 폴리펩티드 분자뿐만 아니라 아미노산수가 적은 저분자량의 분자(올리고펩티드)나 전장 단백질도 포함되며, 본 발명에서는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 PDS5A의 전장 단백질도 포함된다.
(a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지고, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드
(b) (a)의 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드
(c) (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드.
또한, 본 발명에 있어서 「아미노산 서열을 갖는다」란 아미노산 잔기가 그러한 순서로 배열되어 있다고 하는 의미이다. 따라서, 예를 들면 「서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란 서열번호 2로 표시되는 Met Asp Phe Thr··(중략) ··Asp Leu Gln Arg의 아미노산 서열을 갖고 1337 아미노산 잔기 사이즈의 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 예를 들면 「서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」를 「서열번호 2의 폴리펩티드」라고 약기하는 경우가 있다. 「염기 서열을 갖는다」라고 하는 표현에 대해서도 마찬가지이다. 이 경우, 「갖는다」라고 하는 용어는 「로 이루어진다」라고 하는 표현으로 바꾸어도 좋다.
여기서, 「면역 유도 활성」이란 생체 내에서 인터페론 등의 사이토카인을 분비하는 면역 세포를 유도하는 능력을 의미한다.
상기 폴리펩티드가 면역 유도 활성을 갖는지의 여부는, 예를 들면 공지의 엘리스폿 어세이(ELISPOT assay) 등을 사용해서 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이, 면역 유도 활성을 평가해야 할 폴리펩티드를 투여한 생체로부터 말초혈 단핵구 등의 세포를 얻고, 상기 세포를 상기 폴리펩티드와 공존 배양하고, 상기 세포로부터의 사이토카인 산생량을 특이항체를 사용해서 측정함으로써 상기 세포 중의 면역 세포수를 측정할 수 있으므로, 이것에 의해 면역 유도 활성을 평가할 수 있다.
또한, 후술의 실시예에 기재된 바와 같이, 상기 (a)∼(c)의 재조합 폴리펩티드를 담암 생체에 투여하면, 그 면역 유도 활성에 의해 종양을 퇴축시킬 수도 있다. 따라서, 상기 면역 유도 활성은 암세포의 증식을 억제하거나 또는 암조직(종양)을 축소 또는 소멸시키는 능력(이하, 「항종양활성」이라고 함)으로서 평가할 수도 있다. 폴리펩티드의 항종양활성은, 예를 들면 후술의 실시예에 구체적으로 기재하는 바와 같이, 실제로 상기 폴리펩티드를 담암 생체에 투여해서 종양이 축소 등이 되는지의 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다.
또는, 상기 폴리펩티드로 자극한 T세포(즉, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시세포와 접촉시킨 T세포)가 생체외에서 종양세포에 대하여 세포장해활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 폴리펩티드의 항종양활성을 평가할 수도 있다. T세포와 항원 제시세포의 접촉은 후술하는 바와 같이 양자를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 세포장해활성의 측정은, 예를 들면 Int. J. Cancer, 58: p317, 1994에 기재된 51Cr 릴리스 어세이(release assay)라고 불리는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 암의 치료 및/또는 예방 용도에 사용할 경우에는 특별히 한정되지 않지만, 항종양활성을 지표로 하여 면역 유도 활성을 평가하는 것이 바람직하다.
본 발명이 개시하는 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 각각 표시되는 아미노산 서열은 개의 정소 유래 cDNA 라이브러리와 담암견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드 및 그 인간(서열번호 4 및 44), 마우스(서열번호 6), 소(서열번호 8), 말(서열번호 10) 및 닭(서열번호 12)의 상동 인자로서 단리시킨 PDS5A 단백질의 아미노산 서열이다(실시예 1 참조). 또한, 개 PDS5A의 인간 상동 인자인 인간 PDS5A에서는 서열 동일성이 염기 서열 94%, 아미노산 서열 99%이며, 마우스 상동 인자인 마우스 PDS5A에서는 서열 동일성은 염기 서열 91%, 아미노산 서열 99%, 소 상동 인자인 소 PDS5A에서는 서열 동일성은 염기 서열 95%, 아미노산 서열 99%, 말 상동 인자인 말 PDS5A에서는 서열 동일성은 염기 서열 96%, 아미노산 서열 99%, 닭 상동 인자인 닭 PDS5A에서는 서열 동일성은 염기 서열 83%, 아미노산 서열 98%이다.
상기 (a)의 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 중의 연속하는 7개 이상, 바람직하게는 연속하는 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드로서, 면역 유도 활성을 갖는 것이다. 특히 바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 이 분야에서 공지한 바와 같이, 약 7 아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 항원성 및 면역원성을 발휘할 수 있다. 따라서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 아미노산 서열 중의 연속하는 7 아미노산 잔기 이상의 폴리펩티드이면 면역 유도 활성을 가질 수 있으므로 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.
또한, 암 항원 폴리펩티드를 투여하는 것에 의한 면역 유도의 원리로서, 폴리펩티드가 항원 제시세포에 취입되고, 그 후 상기 세포내에서 펩티다아제에 의해 분해됨으로써 작은 단편으로 되어 상기 세포의 표면 상에 제시되고, 그것을 세포장해성 T세포 등이 인식하고 그 항원을 제시하고 있는 세포를 선택적으로 죽여간다고 하는 것이 알려져 있다. 항원 제시세포의 표면 상에 제시되는 폴리펩티드의 사이즈는 비교적 작고, 아미노산수로 7∼30개 정도이다. 따라서, 항원 제시세포 상에 제시시킨다고 하는 관점에서는 상기 (a)의 폴리펩티드로서는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 연속하는 7∼30개 정도인 것이 바람직한 형태의 하나이며, 보다 바람직하게는 8∼30개 또는 9∼30개 정도의 아미노산으로 이루어진 것이면 충분하다. 이들 비교적 작은 사이즈의 폴리펩티드는 항원 제시세포 내에 취입되는 일이 없어 직접 항원 제시세포 상의 세포 표면에 제시되는 경우도 있다.
또한, 항원 제시세포에 취입된 폴리펩티드는 상기 세포내의 펩티다아제에 의해 랜덤한 위치에서 절단되어 각종의 폴리펩티드 단편이 생기고, 이들 폴리펩티드 단편이 항원 제시세포 표면 상에 제시되므로, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 전장 영역과 같이 큰 사이즈의 폴리펩티드를 투여하면 항원 제시세포 내에서의 분해에 의해 항원 제시세포를 통한 면역 유도에 유효한 폴리펩티드 단편이 필연적으로 생긴다. 따라서, 항원 제시세포를 통한 면역 유도에 있어서도 사이즈가 큰 폴리펩티드를 바람직하게 사용할 수 있고, 아미노산수를 30개 이상, 더욱 바람직하게는 100개 이상, 더욱 바람직하게는 200개 이상, 더욱 바람직하게는 250개 이상, 더욱 바람직하게는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 전장 영역의 폴리펩티드로 하여도 좋다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 HLA의 각 형태의 결합 모티프를 갖는 8∼12개, 바람직하게는 9∼10개의 아미노산으로 이루어진 에피토프 펩티드를 검색할 수 있는 대조 매체, 예를 들면 Bioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS)의 HLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)에 의해 대조하여 에피토프 펩티드가 될 수 있는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 구체적으로는 서열번호 2, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기번호 aa 111∼140, aa 211∼240, aa 248∼278, aa 327∼357, aa 459∼522, aa 909∼972, aa 959∼1022, aa 994∼1057 또는 aa 1018∼1080의 영역내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드가 바람직하고, 또한 서열번호 4 또는 44의 폴리펩티드에 있어서는 서열번호 27∼35로 표시되는 폴리펩티드, 또는 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드가 보다 바람직하다.
상기 (b)의 폴리펩티드는 상기 (a)의 폴리펩티드 중 소수의(바람직하게는 1개 또는 수개의) 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 폴리펩티드이며, 원래의 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖고, 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 단백질 항원에 있어서 상기 단백질의 아미노산 서열 중 소수의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 삽입되었을 경우에도 원래의 단백질과 거의 같은 항원성을 갖고 있는 경우가 있는 것은 당업자에 있어서 널리 알려져 있다. 따라서, 상기 (b)의 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 발휘할 수 있으므로 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다. 또한, 상기 (b)의 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 삽입된 폴리펩티드인 것도 바람직하다. 본 명세서 중의 「수개」란 2∼10의 정수, 바람직하게는 2∼6의 정수, 더욱 바람직하게는 2∼4의 정수를 나타낸다.
여기서, 아미노산 서열 또는 염기 서열의 「서열 동일성」이란 비교해야 할 2개의 아미노산 서열(또는 염기 서열)의 아미노산 잔기(또는 염기)가 가능한 한 많이 일치하도록 양 아미노산 서열(또는 염기 서열)을 정렬시키고, 일치한 아미노산 잔기수(또는 일치한 염기수)를 전 아미노산 잔기수(또는 전 염기수)로 나눈 것을 백분률로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는 필요에 따라서 비교하는 2개의 서열의 한쪽 또는 양쪽에 적당히 갭을 삽입한다. 이러한 서열의 정렬화는, 예를 들면 BLAST, FASTA, CLUSTAL W 등의 주지의 프로그램을 사용해서 행할 수 있다. 갭이 삽입될 경우, 상기 전 아미노산 잔기수는 1개의 갭을 1개의 아미노산 잔기로서 카운팅한 잔기수가 된다. 이렇게 하여 카운팅한 전 아미노산 잔기수가 비교하는 2개의 서열 간에서 다를 경우에는 서열 동일성(%)은 긴 쪽의 서열의 전 아미노산 잔기수로 일치한 아미노산 잔기수를 나누어서 산출한다.
또한, 천연 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)과 같이 유사한 성질을 갖는 것을 그룹으로 나눌 수 있어서 이들 사이에서의 치환이면 폴리펩티드의 성질이 변화되지 않는 경우가 많은 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 상기 (a)의 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기를 치환할 경우에는 이들 각 그룹 간에서 치환함으로써 면역 유도 활성을 유지할 수 있는 가능성이 높아지기 때문에 바람직하다.
또한, 상술한 에피토프 펩티드가 되는 상기 (b)의 폴리펩티드로서는 서열번호 2, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 aa 111∼140, aa 211∼240, aa 248∼278, aa 327∼357, aa 459∼522, aa 909∼972, aa 959∼1022, aa 994∼1057 또는 aa 1018∼1080의 영역내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드가 바람직하고, 또한 서열번호 4 또는 44의 폴리펩티드에 있어서는 또는 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드가 보다 바람직하다.
상기 (c)의 폴리펩티드는 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 일단 또는 양단에 다른 아미노산 또는 폴리펩티드가 부가된 것으로서, 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드도 본 발명의 면역 유도제의 조제에 사용할 수 있다.
또한, 상술한 에피토프 펩티드가 되는 상기 (c)의 폴리펩티드로서는 서열번호 2, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열 중의 aa 111∼140, aa 211∼240, aa 248∼278, aa 327∼357, aa 459∼522, aa 909∼972, aa 959∼1022, aa 994∼1057 또는 aa 1018∼1080의 영역내의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드가 바람직하고, 또한 서열번호 4 또는 44의 폴리펩티드에 있어서는 서열번호 27∼35로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 1∼수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고, 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드가 보다 바람직하다.
상기한 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다. 또한, 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 수법을 사용하여 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 조립하여 숙주세포에 도입하고, 상기 숙주세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 수법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 DNA는 개 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열번호 1에 기재한 염기 서열을 증폭할 수 있게 설계한 한쌍의 프라이머를 사용해서 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. 서열번호 3 또는 43의 염기 서열을 갖는 DNA이면 상기 주형으로서 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 사용함으로써 마찬가지로 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당히 설정할 수 있고, 예를 들면 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(아닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어진 반응행정을 1사이클로 하고, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 43으로 표시되는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 근거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 이것을 사용해서 개나 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지되어 있고, 예를 들면 Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 DNA로부터 상기 (a)의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다. 또한, 각 아미노산을 코딩하는 코돈은 공지되어 있기 때문에, 특정한 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 용이하게 특정할 수 있다. 따라서, 상기한 (b) 또는 (c)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열도 용이하게 특정할 수 있으므로, 그러한 폴리뉴클레오티드도 시판의 핵산 합성기를 사용해서 상법에 의해 용이하게 합성할 수 있다.
상기 숙주세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현가능한 세포이면 어떠한 것이어도 좋고, 원핵세포의 예로서는 대장균 등, 진핵세포의 예로서는 원숭이 신장세포COS1, 차이니즈-햄스터 난소세포 CHO 등의 포유동물 배양세포, 출아 효모, 분열 효모, 누에 세포, 아프리카발톱개구리 난세포 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
숙주세포로서 원핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵세포 중에서 복제가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, DNA 클로닝 부위, 터미네이터 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터에서 원핵 숙주세포를 형질전환한 후 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.
숙주세포로서 진핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터에 의해 진핵 숙주세포를 형질전환한 후 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
발현 벡터의 숙주세포로의 도입은 전기천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE덱스트린법 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.
숙주세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합하여 행할 수 있다. 예를 들면 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
이상의 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드에는 상술한 바와 같이 다른 임의의 단백질과의 융합 단백질의 형태로 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스페라아제(GST)나 His 태그와의 융합 단백질 등을 예시할 수 있다. 이러한 융합 단백질의 형태의 폴리펩티드도 상기한 (c)의 폴리펩티드로서 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 형질전환 세포에 의해 발현된 폴리펩티드는 번역된 후 세포내에서 각종 수식을 받는 경우가 있다. 이러한 번역후 수식된 폴리펩티드도 면역 유도 활성을 갖는 한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 번역 수식으로서는 N 말단 메티오닌의 탈리, N 말단 아세틸화, 당쇄 부가, 세포내 프로테아제에 의한 한정 분해, 미리스토일화, 이소프레닐화, 인산화 등을 예시할 수 있다.
후술의 실시예에 구체적으로 기재하는 바와 같이, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 담암 생체에 투여하면 이미 생성되어 있는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 또한, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 암의 발증 전의 생체에 투여함으로써 종양의 발생을 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료 및/또는 예방제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기한 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 면역 유도에 의한 암의 치료 및/또는 예방 방법에 사용할 수 있다.
여기서, 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는 악성 신생물을 의미하며, 호환적으로 사용된다.
이 경우, 대상이 되는 암으로서는 PDS5A를 발현하고 있는 암이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 유방암, 뇌종양, 식도암, 폐암, 신장암, 대장암, 항문주위선암, 신경아종 또는 백혈병이다.
또한, 대상이 되는 동물은 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 영장류, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유동물이며, 특히 바람직하게는 인간, 개 또는 고양이이다.
본 발명의 면역 유도제의 생체로의 투여 경로는 경구투여이어도 비경구 투여이어도 좋지만, 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여가 바람직하다. 암의 치료 목적으로 상기 면역 유도제를 사용할 경우에는 항암작용을 높이기 위해서 후술의 실시예에 기재하는 바와 같이 치료 대상이 되는 종양 근방의 소속 림프절에 투여할 수도 있다. 투여량은 면역 유도하는데 유효한 양이면 좋고, 예를 들면 암의 치료 및/또는 예방에 사용하는 것이면 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양이면 좋다. 암의 치료 및/또는 예방에 유효한 양은 종양의 크기나 증상 등에 따라서 적당히 선택되지만, 통상 대상 동물에 대하여 1일당 유효량으로서 0.0001∼1000㎍, 바람직하게는 0.001∼1000㎍이며, 1회 또는 수회로 나누어서 투여할 수 있다. 바람직하게는 수회로 나누고, 수일 내지 수개월 간격으로 투여한다. 후술의 실시예에 구체적으로 표시하는 바와 같이 본 발명의 면역 유도제는 이미 형성되어 있는 종양을 퇴축시킬 수 있다. 따라서, 발생 초기의 소수의 암세포에도 항암 작용을 발휘할 수 있으므로, 암의 발증전이나 암의 치료 후에 사용하면 암의 발증이나 재발을 방지할 수 있다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 암의 치료와 예방 모두에 유용하다.
본 발명의 면역 유도제는 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 각 투여 형태에 적합하고 약리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 등의 첨가제를 적당히 혼합시켜서 제제할 수도 있다. 제제 방법 및 사용가능한 첨가제는 의약 제제의 분야에 있어서 주지되어 있고, 어느 방법 및 첨가제도 사용할 수 있다. 첨가제의 구체예로서는 생리완충액과 같은 희석제; 설탕, 유당, 콘스타치, 인산칼슘, 소르비톨, 글리신 등과 같은 부형제; 시럽, 젤라틴, 아라비안 고무, 소르비톨, 폴리비닐클로라이드, 트래거캔스 등과 같은 결합제; 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 탤크, 실리카 등의 활택제 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 제제 형태로서는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등의 경구제, 흡입제, 주사 제품, 좌제, 액제 등의 비경구제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 일반적으로 알려져 있는 제법에 의해 만들 수 있다.
본 발명의 면역 유도제는 생체 내에서의 면역학적 응답을 강화할 수 있는 면역증강제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 면역증강제는 본 발명의 면역 유도제에 포함되어 있어도 좋고, 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여해도 좋다.
상기 면역증강제로서는, 예를 들면 아쥬반트를 들 수 있다. 아쥬반트는 항원의 저장소(세포외 또는 매크로파지내)를 제공하여 매크로파지를 활성화하고, 또한 특정 조의 림프구를 자극함으로써 면역학적 응답을 강화할 수 있으므로 항암 작용을 높일 수 있다. 따라서, 특히 본 발명의 면역 유도제를 암의 치료 및/또는 예방에 사용할 경우, 면역 유도제는 유효 성분인 상기 폴리펩티드 이외에 아쥬반트를 더 포함하는 것이 바람직하다. 다수 종류의 아쥬반트가 당업계에 주지되어 있으며, 어느 아쥬반트이어도 사용할 수 있다. 아쥬반트의 구체예로서는 MPL(SmithKline Beecham), 살모넬라(salmonella)속의 Salmonella minnesota Re 595리포다당류의 정제 및 산가수분해 후에 얻어지는 동류물; QS21(SmithKline Beecham), Quillja saponaria 추출물로부터 정제되는 순 QA-21 사포닌; PCT 출원WO96/33739(SmithKline Beecham)에 기재된 DQS21; QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-L1(So 외 10명, 「Molecules and cells」, 1997년, 제 7 권, p.178-186); 프로인트의 불완전 아쥬반트; 프로인트의 완전 아쥬반트; 비타민 E; 몬타나이드; 명반; CpG 올리고뉴클레오티드(예를 들면, Kreig 외 7명, 「Nature」, 제 374 권, p.546-549 참조); 폴리IC 및 그 유도체(폴리ICLC 등) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 유로 조제되는 각종 유중수 에멀젼을 들 수 있다. 그 중에서도, 프로인트의 불완전아쥬반트, 몬타나이드, 폴리IC 및 그 유도체, 및 CpG 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 상기 아쥬반트와 폴리펩티드의 혼합비는 전형적으로는 약 1:10∼10:1, 바람직하게는 약 1:5∼5:1, 보다 바람직하게는 약 1:1이다. 단, 아쥬반트는 상기 예시에 한정되지 않고, 당업계에서 공지된 상기 이외의 아쥬반트도 본 발명의 면역 유도제를 투여할 때에 사용할 수 있다(예를 들면, Goding저, 「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」, 제 2 판, 1986년을 참조). 폴리펩티드 및 아쥬반트의 혼합물 또는 에멀젼의 조제방법은 예방접종의 당업자에게는 주지이다.
또한, 상기 면역증강제로서는 상기 아쥬반트 이외에도 대상의 면역응답을 자극하는 인자를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 림프구나 항원 제시세포를 자극하는 특성을 갖는 각종 사이토카인을 면역증강제로서 본 발명의 면역 유도제와 조합시켜서 사용할 수 있다. 이러한 면역학적 응답을 증강가능한 다수의 사이토카인이 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 백신의 방어 작용을 강화시키는 것을 나타내고 있는 인터류킨-12(IL-12), GM-CSF, IL-18, 인터페론α, 인터페론β, 인터페론ω, 인터페론γ 및 Flt3 리간드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 인자도 상기 면역증강제로서 사용할 수 있고, 본 발명의 면역 유도제에 포함시켜서 또는 별개의 조성물로서 본 발명의 면역 유도제와 병용해서 환자에게 투여할 수 있다.
또한, 상기 폴리펩티드와 항원 제시세포를 인비트로에서 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드를 항원 제시세포에 제시할 수 있다. 즉, 상기한 (a)~(c)의 폴리펩티드는 항원 제시세포의 처리제로서 이용할 수 있다. 여기에서, 항원 제시세포로서는 MHC 클래스 I분자를 보유하는 수상 세포 또는 B세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 각종의 MHC 클래스 I분자가 동정되어 있고, 주지되어 있다. 인간에 있어서의 MHC 분자는 HLA라고 부른다. HLA 클래스 I분자로서는 HLA-A, HLA-B, HLA-C를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등을 들 수 있다.
MHC 클래스 I분자를 보유하는 수상 세포 또는 B세포는 주지의 방법에 의해 말초혈로부터 조제할 수 있다. 예를 들면, 골수, 제대혈 또는 환자 말초혈로부터 과립구매크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF)와 IL-3(또는 IL-4)을 사용해서 수상 세포를 유도하고, 그 배양계에 종양 관련 펩티드를 첨가함으로써 종양 특이적인 수상 세포를 유도할 수 있다.
이 수상 세포를 유효량 투여함으로써 암의 치료에 바람직한 응답을 유도할 수 있다. 사용하는 세포는 건강인으로부터 제공된 골수나 제대혈, 환자 본인의 골수나 말초혈 등을 사용할 수 있지만, 환자 본래의 자가세포를 사용할 경우에는 안전성이 높고, 중독의 부작용을 회피하는 것도 기대할 수 있다. 말초혈 또는 골수는 신선 시료, 저온 보존 시료 및 동결 보존 시료 중 어느 것이어도 좋다. 말초혈은 전체 혈을 배양해도 좋고, 백혈구 성분만을 분리해서 배양해도 좋지만, 후자쪽이 효율적이어서 바람직하다. 또한, 백혈구 성분 중에서도 단핵구를 분리해도 좋다. 또한, 골수나 제대혈을 기원으로 할 경우에는 골수를 구성하는 세포 전체를 배양해도 좋고, 이것으로부터 단핵구를 분리해서 배양해도 좋다. 말초혈이나 그 백혈구 성분, 골수세포에는 수상 세포의 기원이 되는 단핵구, 조혈 줄기세포 또는 미성숙 수상 세포나 CD4 양성 세포 등이 포함되어 있다. 사용되는 사이토카인은 안전성과 생리활성이 확인된 특성의 것이면, 천연형 또는 유전자 재조합형 등 그 생산 수법에 대해서는 상관없지만, 바람직하게는 의료용으로 사용되는 품질이 확보된 표품이 필요 최저량으로 사용된다. 첨가하는 사이토카인의 농도는 수상 세포가 유도되는 농도이면 특별히 한정되지 않고, 보통 사이토카인의 합계 농도로 10∼1000ng/mL 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20∼500ng/mL 정도이다. 배양은 백혈구의 배양에 보통 사용되고 있는 주지의 배지를 사용해서 행할 수 있다. 배양 온도는 백혈구의 증식이 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 인간의 체온인 37℃ 정도가 가장 바람직하다. 또한, 배양 중의 기체 환경은 백혈구의 증식이 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 5% CO2를 통기하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 기간은 필요수의 세포가 유도되는 기간이면 특별히 한정되지 않지만, 보통 3일∼2주일간의 사이에서 행해진다. 세포의 분리나 배양에 제공되는 기기는 적당히 적당한 것을 사용할 수 있지만, 의료용으로 안전성이 확인되고 또한 조작이 안정하고 간편한 것이 바람직하다. 특히 세포 배양장치에 대해서는 샬레, 플라스크, 보틀 등의 일반적 용기에 구애받지 않고, 적층형 용기나 다단식 용기, 롤러 보틀, 스피너식 보틀, 가방식 배양기, 중공사 컬럼 등도 사용할 수 있다.
상기 폴리펩티드와 항원 제시세포를 인비트로에서 접촉시키는 방법 자체는 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시세포를 상기 폴리펩티드를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써 행할 수 있다. 배지 중의 펩티드 농도는 특별히 한정되지 않지만, 보통 1∼100㎍/㎖ 정도, 바람직하게는 5∼20㎍/㎖ 정도이다. 배양시의 세포 밀도는 특별히 한정되지 않지만, 보통 103∼107세포/㎖ 정도, 바람직하게는 5×104∼5×106 세포/㎖ 정도이다. 배양은 상법에 따라서 37℃, 5% CO2 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 항원 제시세포가 표면 상에 제시할 수 있는 펩티드의 길이는 통상 최대 30 아미노산 잔기 정도이다. 따라서, 특별히 한정되지 않지만, 항원 제시세포와 폴리펩티드를 인비트로에서 접촉시킬 경우 상기 폴리펩티드를 약 30 아미노산 잔기 이하의 길이로 조제해도 좋다.
상기한 폴리펩티드의 공존 하에 있어서 항원 제시세포를 배양함으로써 펩티드가 항원 제시세포의 MHC 분자에 취입되어 항원 제시세포의 표면에 제시된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 사용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원 제시세포를 조제할 수 있다. 이러한 항원 제시세포는 생체내 또는 인비트로에 있어서 T세포에 대하여 상기 폴리펩티드를 제시하여 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도해서 증식시킬 수 있다.
상기한 바와 같이 해서 조제된 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 항원 제시세포를 T세포와 인비트로에서 접촉시킴으로써 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도해서 증식시킬 수 있다. 이것은 상기 항원 제시세포와 T세포를 액체 배지 중에서 공존 배양함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 항원 제시세포를 액체 배지에 현탁하고, 마이크로플레이트의 웰 등의 용기에 넣고, 이것에 T세포를 첨가해서 배양함으로써 행할 수 있다. 공존 배양시의 항원 제시세포와 T세포의 혼합 비율은 특별히 한정되지 않지만, 통상 세포수의 비율로 1:1∼1:100 정도, 바람직하게는 1:5∼1:20 정도이다. 또한, 액체 배지 중에 현탁하는 항원 제시세포의 밀도는 특별히 한정되지 않지만, 통상 100∼1000만세포/㎖ 정도, 바람직하게는 10000∼100만세포/㎖ 정도이다. 공존 배양은 상법에 따라서 37℃, 5% CO2 분위기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 2일∼3주간, 바람직하게는 4일∼2주간 정도이다. 또한, 공존 배양은 IL-2, IL-6, IL-7 및 IL-12와 같은 인터류킨의 1종 또는 복수의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, IL-2 및 IL-7의 농도는 보통 5∼20U/㎖ 정도, IL-6의 농도는 보통 500∼2000U/㎖ 정도, IL-12의 농도는 보통 5∼20ng/㎖ 정도이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 공존 배양은 신선한 항원 제시세포를 추가해서 1회~수회 반복해도 좋다. 예를 들면, 공존 배양 후의 배양 상청을 디캔팅하고, 신선한 항원 제시세포의 현탁액을 첨가해서 공존 배양을 더 행한다고 하는 조작을 1회~수회 반복해도 좋다. 각 공존 배양의 조건은 상기와 같아도 좋다.
상기 공존 배양에 의해 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포가 유도되어 증식된다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 사용하여 상기 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합시키는 단리 T세포를 조제할 수 있다.
후술의 실시예에 기재된 바와 같이, PDS5A를 코딩하는 유전자는 각각 유방암세포, 유방암조직, 뇌종양세포, 뇌종양조직, 식도암세포, 식도암조직, 폐암세포, 폐암조직, 신장암세포, 신장암조직, 대장암세포, 대장암조직, 항문주위선암조직, 항문주위선암세포, 신경아종 세포 및 백혈병세포에 특이적으로 발현하고 있다. 따라서, 이들 암종에 있어서는 PDS5A가 정상 세포보다도 유의하게 많이 존재하고 있다고 생각된다. 암세포 내에 존재하는 PDS5A의 일부가 암세포 표면 상의 MHC 분자에 제시되고, 상기한 바와 같이 해서 조제한 세포장해성 T세포가 생체 내에 투여되면 이것을 표식으로 하여 세포장해성 T세포가 암세포를 장해할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시세포는 생체 내에 있어서도 상기 폴리펩티드에 특이적인 세포장해성 T세포를 유도하고 증식시킬 수 있으므로, 상기 항원 제시세포를 생체 내에 투여함으로써도 암세포를 장해할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩티드를 사용해서 조제된 상기 세포장해성 T세포나 상기 항원 제시세포도 또한 본 발명의 면역 유도제와 마찬가지로 암의 치료 및/또는 예방제로서 유용하다.
상기한 단리 항원 제시세포나 단리 T세포를 생체에 투여할 경우에는 이들 세포를 이물로서 공격하는 생체 내에서의 면역 응답을 회피하기 위해서 치료를 받는 환자에게서 채취한 항원 제시세포 또는 T세포를 상기한 바와 같이 상기 (a)~(c)의 폴리펩티드를 사용해서 조제한 것이 바람직하다.
항원 제시세포 또는 단리 T세포를 유효성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방제의 투여 경로는 정맥내 투여나 동맥내 투여와 같은 비경구 투여가 바람직하다. 또한, 투여량은 증상이나 투여 목적 등에 따라서 적당히 선택되지만, 보통 1개∼10조개, 바람직하게는 100만개∼10억개이며, 이것을 수일 내지 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 제제는, 예를 들면 세포를 생리 완충 식염수에 현탁한 것 등이 좋고, 다른 항암제나 사이토카인 등과 병용할 수도 있다. 또한, 제제 분야에 있어서 주지의 1개 또는 2개 이상의 첨가제를 첨가할 수도 있다.
또한, 상기 (a)~(c)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상 동물의 체내에서 발현시킴으로써도 상기 생체 내에서 항체 생산이나 세포장해성 T세포를 유도할 수 있어 폴리펩티드를 투여하는 것과 동등한 효과가 얻어진다. 즉, 본 발명의 면역 유도제는 상기한 (a)~(c)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 포함하는 것이어도 좋다. 후술의 실시예에 표시되는 바와 같이 이러한 항원 폴리펩티드를 발현가능한 재조합 벡터는 유전자 백신이라고도 불린다.
유전자 백신을 제조하기 위해서 사용하는 벡터는 대상 동물 세포내(바람직하게는 포유동물 세포내)에서 발현가능한 벡터이면 특별히 한정되지 않고, 플라스미드 벡터이어도 바이러스 벡터이어도 좋고, 유전자 백신의 분야에서 공지된 어떠한 벡터를 사용해도 좋다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA나 RNA 등의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같이 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 또한, 벡터로의 상기 폴리뉴클레오티드의 조립은 당업자에게 주지의 방법을 사용해서 행할 수 있다.
유전자 백신의 투여 경로는 바람직하게는 근육내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여 등의 비경구 투여 경로이며, 투여량은 항원의 종류 등에 따라서 적당히 선택할 수 있지만, 통상 체중 1kg당 유전자 백신의 중량으로 0.1㎍∼100mg 정도, 바람직하게는 1㎍∼10mg 정도이다.
바이러스 벡터에 의한 방법으로서는, 예를 들면 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 RNA 바이러스 또는 DNA 바이러스에 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조립하고, 이것을 대상 동물에게 감염시키는 방법을 들 수 있다. 이 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.
기타 방법으로서는 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법(DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는 유전자를 직접 체내에 도입하는 인비보 방법, 및 대상 동물로부터 어느 종류의 세포를 채취해 체외에서 유전자를 상기 세포에 도입하고 그 세포를 체내에 복귀시키는 엑스비보 방법이 있다(닛케이 사이언스, 1994년 4월, p.20-45, 월간 약제사, 1994년, 제36권, 제 1 호, p. 23-48, 실험의학 증간, 1994년, 제 12 권, 제 15 호, 및 이들의 인용 문헌 등). 인비보 방법이 보다 바람직하다.
인비보 방법에 의해 투여할 경우에는 치료 목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥, 동맥, 피하, 근육내 등에 투여할 수 있다. 인비보 방법에 의해 투여할 경우는, 예를 들면 액제 등의 제제 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효성분인 본 발명의 상기 펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 주사제 등으로 하고, 필요에 따라서 관용의 담체를 첨가해도 좋다. 또한, 상기 DNA를 함유하는 리포솜 또는 막융합 리포솜(센다이바이러스(HVJ)-리포솜 등)에 있어서는 현탁제, 동결제, 원심분리 농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 「서열번호 1로 표시되는 염기 서열」이라고 했을 경우에는 서열번호 1로 실제로 표시되어 있는 염기 서열 이외에 이것과 상보적인 서열도 포함한다. 따라서, 「서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드」라고 했을 경우에는 서열번호 1로 실제로 표시되어 있는 염기 서열을 갖는 1개쇄 폴리뉴클레오티드, 그 상보적인 염기 서열을 갖는 1개쇄 폴리뉴클레오티드, 및 이들로 이루어진 2개쇄 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제할 경우에는 적당히 어느 하나의 염기 서열을 선택하는 것이 되지만, 당업자이면 용이하게 그 선택을 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드는 암 특이적으로 발현하고 있기 때문에 담암 생체 중의 혈청과만 특이적으로 반응하므로 본 발명의 폴리펩티드는 암의 검출에도 사용된다.
상기 암을 검출하는 방법으로서 생체로부터 분리된 시료를 사용하여 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 그 상동 인자인 상기 폴리펩티드와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상 또는 99.5% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 측정한다. 상기 시료를 사용해서 폴리펩티드의 발현을 측정하는 방법으로서는 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 면역 측정하는 방법(제 1 방법), 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드 자체를 면역 측정하는 방법(제 2 방법), 및 시료 중에 포함되는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 측정하는 방법(제 3 방법)을 들 수 있다. 본 발명의 방법에서는 이들 중 어느 방법에 의해 폴리펩티드의 발현을 측정해도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서, 「측정」이라고 하는 단어에는 검출, 정량 및 반정량의 모두가 포함된다.
여기서, PDS5A는 개 유방암 유래 cDNA 라이브러리와 동일 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체(암 특이적 항체)과 결합하는 폴리펩티드로서 동정된 것이다(실시예 1 참조). 즉, 담암견 생체에서는 PDS5A에 대한 항체가 특이적으로 유도되어 있다. 따라서, 담암 생체 내의 PDS5A에 대한 항체를 측정함으로써 PDS5A를 발현하는 암을 검출할 수도 있다. 또한, 상기 제 2 방법에 의해 항원인 PDS5A를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다. 또한, 후술의 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 상기 항원 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 암세포 또는 암조직, 특히 유방암세포, 유방암조직, 뇌종양세포, 뇌종양조직, 식도암세포, 식도암조직, 폐암세포, 폐암조직, 신장암세포, 신장암조직, 대장암세포, 대장암조직, 항문주위선암세포, 항문주위선암조직, 신경아종세포 및 백혈병세포에 있어서 정상 조직보다 유의하게 고발현되어 있기 때문에(실시예 1 참조), 상기 mRNA를 측정함으로써도 개의 암을 검출할 수 있다.
상기 제 1 방법에 있어서, 시료 중에 존재할 수 있는 상기 암 특이적 항체의 측정은 상기 항체와 항원항체 반응하는 항원 물질을 사용한 면역 측정에 의해 용이하게 행할 수 있다. 면역 측정법 자체는 하기에 상술한 바와 같이 주지의 상법이다. 면역 측정의 항원 물질로서 상기 (a)~(c)의 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 항체에는 교차반응성이 있고, 실제로 면역원이 된 항원 물질 이외의 분자이어도 분자 상에 면역원의 에피토프와 유사한 구조가 존재하면 그 분자는 면역원에 대하여 유도된 항체와 항원항체 반응에 의해 결합할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 서열 동일성이 높은 폴리펩티드끼리에서는 에피토프의 구조도 유사한 경우가 많고, 그 경우에는 양자는 동일한 항원성을 나타낼 수 있다. 후술의 실시예에 구체적으로 기재하는 바와 같이, 서열번호 4 또는 44의 인간 유래 폴리펩티드는 담암견 체내에서 유도된 상기 항체와 항원항체 반응한다. 따라서, 본 발명의 제 1 방법에서는 면역 측정의 항원으로서 모든 포유동물 유래의 상동 인자를 사용할 수도 있다.
통상, 단백질 등과 같은 복잡한 구조를 갖는 분자량이 큰 항원 물질의 경우, 분자 상에 구조가 다른 복수의 부위가 존재하고 있다. 따라서, 생체 내에서는 그러한 항원 물질에 대하여 복수의 부위를 각각 인식해서 결합하는 복수 종류의 항체가 생산된다. 즉, 생체 내에서 단백질 등의 항원 물질에 대하여 생산되는 항체는 복수종류의 항체 혼합물인 폴리클로날 항체이다. 또한, 본 발명에 있어서 「폴리클로날 항체」라고 말하는 경우에는 항원 물질을 체내에 포함하는 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체로서, 상기 항원 물질에 대하여 상기 생체 내에서 유도된 항체를 가리킨다.
시료 중의 항체의 측정은 상기한 폴리펩티드를 항원으로서 사용한 면역 측정에 의해 용이하게 행할 수 있다. 면역 측정 자체는 이 분야에 있어서 주지되어 있으며, 반응 양식으로 분류하면 샌드위치법, 경합법, 응집법, 웨스턴블럿법 등이 있다. 또한, 표식으로 분류하면 방사 면역 측정, 형광 면역 측정, 효소 면역 측정, 바이오틴 면역 측정 등이 있고, 어느 방법을 사용해도 상기 항체의 면역 측정을 행할 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 샌드위치 ELISA나 응집법은 조작이 간편해서 대규모의 장치 등을 필요로 하지 않기 때문에 본 발명의 방법에 있어서의 상기 항체의 면역 측정 방법으로서 바람직하게 적용할 수 있다. 항체의 표식으로서 효소를 사용할 경우, 효소로서는 턴오버수가 큰 것, 항체와 결합시켜도 안정한 것, 기질을 특이적으로 착색시키는 등의 조건을 충족시키는 것이면 특별히 제한은 없고, 통상의 효소 면역 측정법에 사용되는 효소, 예를 들면 페르옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리 포스파타아제, 글루코오스옥시다아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코오스-6-인산화 탈수소효소, 말산 탈수소효소 등을 사용할 수도 있다. 또한, 효소저해 물질이나 보효소 등을 사용할 수도 있다. 이들 효소와 항체의 결합은 말레이미드 화합물 등의 가교제를 사용하는 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 기질로서는 사용하는 효소의 종류에 따라서 공지의 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소로서 페르옥시다아제를 사용할 경우에는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지신을, 또한 효소로서는 알칼리 포스파타아제를 사용할 경우에는 파라니트로페놀 등을 사용할 수 있다. 방사성 동위체로서는 125I나 3H 등의 통상 래디오이뮤노어세이에서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 형광 색소로서는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)이나 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(TRITC) 등의 통상의 형광 항체법에 사용되는 것을 사용할 수 있다.
또한, 이들 면역 측정법 자체는 주지되어 있어서 본 명세서에서 설명할 필요가 없지만, 간단히 기재하면, 예를 들면 샌드위치법에서는 항원으로서 사용하는 상기 폴리펩티드를 고상으로 부동화하여 혈청 등의 시료와 반응시키고 세정한 후 적당한 2차 항체를 반응시키고 세정한 후 고상에 결합한 2차 항체를 측정한다. 항원 폴리펩티드를 고상으로 부동화함으로써 미결합의 2차 항체를 용이하게 제거할 수 있기 때문에 본 발명의 암의 검출방법의 형태로서 바람직하다. 2차 항체로서는, 예를 들면 시료가 개 유래이면 항견 IgG 항체를 사용할 수 있다. 2차 항체를 상기에 예시한 표식물질로 표식해 둠으로써 고상에 결합한 2차 항체를 측정할 수 있다. 이렇게 해서 측정한 2차 항체량이 혈청 시료 중의 상기 항체량에 상당한다. 표식물질로서 효소를 사용할 경우에는 효소작용에 의해 분해되어 발색하는 기질을 첨가하고, 기질의 분해량을 광학적으로 측정함으로써 항체량을 측정할 수 있다. 표식물질로서 방사성 동위체를 사용할 경우에는 방사성 동위체가 발하는 방사선량을 신틸레이션 카운터(scintillation counter) 등에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 제 2 방법에서는 생체로부터 얻은 시료 중에 포함될 수 있는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자가 측정된다. 상술한 바와 같이, 암환자에 있어서는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원항체 반응하는 암 특이적 항체의 양이 유의하게 많지만, 이것은 암환자 체내에 있어서 상기 암 특이적 항체의 항원인 이들의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자의 산생량이 유의하게 많은 것을 나타내고 있다. 따라서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 측정함으로써도 상기 제 1 방법과 마찬가지로 생체내의 암을 검출할 수 있다.
시료 중의 폴리펩티드의 측정은 주지의 면역 측정법에 의해 용이하게 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 제작하고, 이것을 사용해서 면역 측정을 행함으로써 시료 중에 존재할 수 있는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 측정할 수 있다. 면역 측정 방법 자체는 상술한 바와 같이 주지의 상법이다.
여기서, 「항원 결합성 단편」이란 항체 분자 중에 포함되는 Fab 단편이나 F(ab') 2단편과 같은 항원과의 결합능을 갖는 항체 단편을 의미한다. 항체는 폴리클로날 항체이어도 모노클로날이어도 좋지만, 면역 측정 등을 위해서는 재현성이 높은 모노클로날 항체가 바람직하다. 폴리펩티드를 면역원으로 하는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체의 조제방법은 주지되어 있으며, 상법에 의해 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Haemocyanin, KLH)이나 카제인 등의 캐리어 단백질에 결합시킨 것을 면역원으로 하여 아쥬반트와 함께 동물에게 면역함으로써 상기 폴리펩티드에 대한 항체를 유기할 수 있다. 면역된 동물로부터 채취한 비장세포나 림프구와 같은 항체 산생 세포를 미엘로마 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하고, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 결합하는 항체를 산생 하는 하이브리도마를 선택하고, 이것을 증식시켜서 배양 상청으로부터 상기 단백질을 대응 항원으로 하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법은 주지의 상법이다.
본 발명의 제 3 방법에서는 생체로부터 얻은 시료 중에 포함될 수 있는 PDS5A를 코딩하는 mRNA가 측정된다. 후술의 실시예에 구체적으로 표시하는 바와 같이 PDS5A를 코딩하는 mRNA는 암, 유방암, 뇌종양, 식도암, 폐암, 신장암, 대장암, 항문주위선암, 신경아종 및 백혈병의 조직 또는 세포에 있어서 유의하게 고발현하고 있다. 따라서, 시료 중의 상기 mRNA를 측정함으로써 생체 내의 암을 검출할 수 있다.
본 발명의 검출방법에서는 상기한 바와 같이 측정한 폴리펩티드의 발현량에 근거하여 대상 생체가 암인지의 여부 등을 판단한다. 암의 검출은 대상 생체에 있어서의 폴리펩티드의 발현을 측정하는 것만으로도 가능하지만, 검출 정밀도를 높이는 관점에서는 1~복수의 건상자 시료에 있어서의 폴리펩티드의 발현량(항체량, 폴리펩티드량 또는 mRNA량)을 조사해서 건상자 기준치를 취득하고, 대상 생체의 측정치를 상기 건상자 기준치와 비교하는 것이 바람직하다. 더욱 검출 정밀도를 높이고 싶을 경우에는 암이 감염되어 있는 것을 알고 있는 다수의 환자에게서 얻은 시료에 대해서 폴리펩티드 발현량을 조사해서 암환자 기준치를 취득하고, 대상 생체의 측정치를 건상자 기준치 및 암환자 기준치의 쌍방과 비교해도 좋다. 상기 기준치는, 예를 들면 각 시료에 있어서의 폴리펩티드 발현량을 수치화하고 그 평균치를 산출 함으로써 정할 수 있다. 또한, 건상자 기준치와 암환자 기준치는 미리 다수의 건상자 및 암환자에 대해서 폴리펩티드 발현량을 조사해서 정해 둘 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 방법으로 기준치와의 비교를 행할 경우에는 미리 정한 기준치를 사용해도 좋다.
본 발명의 검출방법에서는 다른 암 항원이나 암 마커에 의한 검출을 조합하여 사용해도 좋다. 이것으로 의해, 암의 검출 정밀도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명의 검출방법에 의하면, 생체 내의 암을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하면 눈에 보이지 않는 작은 사이즈의 종양이나 체내 심부의 종양도 검출할 수 있으므로 암의 조기발견에 유용하다. 또한, 암의 치료후 경과 관찰 중인 환자에 대해서 본 발명의 검출방법을 적용하면, 암의 재발이 있었을 경우에 그 암을 빠른 시기에 검출할 수 있다.
또한, 담암 생체에 있어서, 본 발명에서 측정 대상이 되는 상기 소정의 폴리펩티드를 발현하는 암세포의 수가 증가하면 그만큼 상기 생체 내에 있어서의 상기 폴리펩티드 및 그 mRNA의 축적량이 증대하여 혈청 중에 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 많이 산생된다. 한편, 암세포의 수가 감소하면 그만큼 생체 내의 상기 폴리펩티드 및 그 mRNA의 축적량이 감소하여 혈청 중의 상기 폴리펩티드에 대한 항체가 감소한다. 따라서, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에는 종양의 증대나 암의 전이가 발생하고 있는, 즉 암의 진행도가 진행되어 있다고 판단할 수 있다.
또한, 후술의 실시예에 표시하는 바와 같이, 동일 종류의 종양에 있어서 악성형에서는 양성형보다 유의하게 상기 항체량이 많다. 그 때문에, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량이 많을 경우에는 암의 악성도가 보다 높다고 판단할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의하면 암의 악성도를 검출할 수도 있다.
또한, 상기 소정의 폴리펩티드의 발현량의 증감을 지표로 하여 암의 치료 효과를 모니터링할 수도 있다. 따라서, 암의 치료 중이나 치료 후의 개체에 대해서 상기 폴리펩티드의 발현량을 관찰함으로써 항암제의 치료 효과나 종양 적출 후의 잔존 종양 유무, 또한 경과 관찰에서도 전이·재발을 조기에 아는 단서가 얻어진다. 적절하게 치료할 수 있는 경우에는 폴리펩티드의 발현량은 치료전의 담암 상태보다 저하하므로 그 생체에 대하여 행한(행하고 있는) 치료 효과가 양호하다고 판단할 수 있다. 폴리펩티드 발현량이 상승 또는 유지되어 있을 경우, 또는 일단 저하한 후 더욱 상승이 보여졌을 경우에는 치료 효과가 불충분하다고 판단할 수 있어서, 다른 치료 방법으로의 변경이나 항암제 투여량의 변경 등 치료 방법 선택의 유용한 판단 재료가 된다.
본 발명의 암의 검출방법의 대상이 되는 암으로서는 PDS5A를 발현하고 있는 암이며, 유방암, 뇌종양, 식도암, 폐암, 신장암, 대장암, 항문주위선암, 신경아종 또는 백혈병을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 본 발명의 방법의 대상이 되는 생체는 포유동물인 것이 바람직하고, 인간이나 개, 고양이가 보다 바람직하다.
본 발명의 방법에 제공하는 시료로서는 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 흉수 등의 체액, 조직, 세포를 들 수 있다. 특히, 상기 제 1 방법 및 제 2 방법에 있어서는 혈청, 혈장, 복수 및 흉수를 바람직하게 사용할 수 있고, 또한 mRNA를 측정하는 상기 제 3 방법에 있어서는 조직 시료 및 세포 시료가 바람직하다.
제 1 방법에서 면역 측정의 항원으로서 사용되는 상기한 폴리펩티드는 암검출 시약으로서 제공할 수 있다. 상기 시약은 상기 폴리펩티드만으로 이루어져 있어도 좋고, 또한 상기 폴리펩티드의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 상기 시약은 플레이트나 멤브레인 등의 고상에 고정화한 상태로 제공될 수도 있다.
제 2 방법에서 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 폴리펩티드 또는 그 상동 인자를 면역 측정할 때에 사용되는 상기 폴리펩티드 또는 그 상동 인자와 항원항체 반응하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편도 암검출 시약으로서 제공할 수 있다. 이 경우의 암 검출 시약도 상기 항체 또는 항원 결합성 단편만으로 이루어진 것이어도 좋고, 또한 상기 항체 또는 항원 결합성 단편의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 또한, 상기 항체 또는 항원 결합성 단편은 망간이나 철 등의 금속을 결합시킨 것이어도 좋다. 그러한 금속 결합 항체 또는 항원 결합성 단편을 체내에 투여하면 항원 단백질이 보다 많이 존재하는 부위에 상기 항체 또는 항원 결합성 단편이 보다 많이 집적하므로 MRI 등에 의해 금속을 측정하면 항원 단백질을 산생하는 암세포의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 제 3 방법에서 mRNA의 측정에 사용되는 상기한 암 검출용 폴리뉴클레오티드도 암검출 시약으로서 제공할 수 있다. 이 경우에 암 검출용 시약도 상기 폴리뉴클레오티드만으로 이루어진 것이어도 좋고, 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 안정화 등에 유용한 각종 첨가제 등을 포함하고 있어도 좋다. 상기 시약 중에 포함되는 상기 암 검출용 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 프라이머 또는 프로브이다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 근거하여 보다 구체적으로 설명한다.
실시예 1: SEREX법에 의한 신규 암 항원 단백질의 취득
(1) cDNA 라이브러리의 제작
담암견의 유방암조직으로부터 산-구아니디움-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-chloroform법)에 의해 전 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(TAKARA SHUZO CO., LTD. 제품)를 사용해서 키트 첨부 프로토콜에 따라서 폴리A NA를 정제했다.
이 얻어진 mRNA(5㎍)를 사용해서 cDNA파지 라이브러리를 합성했다. cDNA파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, Zap-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE 제품)을 사용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA파지 라이브러리의 사이즈는 1×106pfu/㎖이었다.
(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝
상기 제작한 cDNA파지 라이브러리를 사용하여 이뮤노스크리닝(immunoscreening)를 행했다. 구체적으로는 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트에 2340클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시키고, 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)를 만들고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Sciece 제품)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮음으로써 단백질을 유도·발현시켜서 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수해서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl(pH7.5))에 침지하고 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.
상기 환견 혈청으로서는 항문근위 종양의 환견에서 채취한 혈청을 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하지 않은 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-BLue MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 다음에 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO3(pH8.3)의 버퍼를 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 15시간 정치한 후 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 그 다음에, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthecare Bio-Science사 제품)에 통액하여 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시키고, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그대로 통과하는 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고 이것을 이뮤노스크리닝 재료로 했다.
이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯팅한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항견 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제품)를 실온에서 1시간 반응시켜 NBT/BCIP 반응액(Roche사 제품)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15mm의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴(pH7.5)) 500㎕에 용해시켰다. 발색반응 양성 콜로니가 단일화될 때까지 상기와 같은 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG와 반응하는 30940개의 파지클론을 스크리닝하여 1개의 양성 클론을 단리했다.
(3) 단리 항원 유전자의 서열 동일성 검색
상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕과, 정제한 파지 용액 100㎕ 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE 제품) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시킨 후, LB 배지를 3ml 첨가하고 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕에서 20분간 보온한 후 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하고, 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 그 다음에 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD600이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕과 정제한 파지 용액 10㎕을 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시키고, 50㎕를 안피실린(최종 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 한천 배지에 뿌려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 안피실린(최종 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 배지 37℃에서 배양한 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(KIAGEN사 제품)을 사용해서 목적의 인서트를 갖는 플라스미드 DNA를 정제했다.
정제한 플라스미드는 서열번호 13에 기재된 T3 프라이머와 서열번호 14에 기재된 T7 프라이머를 사용하여 프라이머 워킹(primer walking)법에 의한 인서트 전장 서열의 해석을 행했다. 이 서열 해석에 의해 서열번호 1에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 사용하여 서열 동일성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 서열 동일성 검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 PDS5A 유전자인 것이 판명되었다. 개 PDS5A의 인간 상동 인자인 인간 PDS5A에서는 서열 동일성이 염기 서열 94%, 아미노산 서열 99%이며, 마우스 상동 인자인 마우스 PDS5A에서는 서열 동일성이 염기 서열 91%, 아미노산 서열 99%, 소 상동 인자인 소 PDS5A에서는 서열 동일성이 염기 서열 95%, 아미노산 서열 99%, 말 상동 인자인 말 PDS5A에서는 서열 동일성이 염기 서열 96%, 아미노산 서열 99%, 닭 상동 인자인 닭 PDS5A에서는 서열 동일성이 염기 서열 83%, 아미노산 서열 98%이었다. 인간 PDS5A의 염기 서열을 서열번호 3 및 43, 아미노산 서열을 서열번호 4 및 44에, 마우스 PDS5A의 염기 서열을 서열번호 5, 아미노산 서열을 서열번호 6에, 소 PDS5A의 염기 서열을 서열번호 7, 아미노산 서열을 서열번호 8에, 말 PDS5A의 염기 서열을 서열번호 9, 아미노산 서열을 서열번호 10에, 닭 PDS5A의 염기 서열을 서열번호 11, 아미노산 서열을 서열번호 12에 나타낸다.
(4) 각 조직에서의 발현 해석
상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개, 인간 및 마우스의 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 아래와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50∼100mg 및 각 세포주 5∼10×106개의 세포로부터 TRIZOL 시약(Invitrogen사 제품)을 사용해서 첨부의 프로토콜에 따라 전 RNA를 추출했다. 이 전 RNA를 사용해서 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen사 제품)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 진풀(gene pool) cDNA(Invitrogen사 제품), QUICK-Clone cDNA(Clontech사 제품) 및 Large-Insert cDNA Library(Clontech사 제품)을 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적 프라이머(개 프라이머는 서열번호 15 및 16, 인간 프라이머는 서열번호 17 및 18, 마우스 프라이머는 서열번호 19 및 20에 기재)를 사용해서 아래와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2㎛, 0.2mM의 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(TAKARA SHUZO CO., LTD. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)를 사용하여 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복해서 행했다. 비교 대조를 위해서, GAPDH 특이적인 프라이머(개 및 인간 GAPDH 프라이머는 서열번호 21 및 22, 마우스 GAPDH 프라이머는 서열번호 23 및 24에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 개 PDS5A 유전자는 건상한 개 조직에서는 거의 조직에서 발현이 보이지 않고, 한편 개 종양조직에서는 강한 발현이 보여졌다. 인간 및 마우스 PDS5A 유전자의 발현도 개 PDS5A 유전자와 마찬가지로 인간 및 마우스 정상조직에서는 거의 발현을 확인할 수 없고, 암세포에서는 대부분의 세포주에서 발현이 검출되었다(도 2, 3).
실시예 2: PDS5A의 생체 내에서의 암 항원성의 해석 및 약효 평가
(1) 생체 내에서 PDS5A를 발현하는 재조합 벡터의 제작
서열번호 5의 염기 서열을 기초로 하여 이하의 방법으로 생체 내에서 PDS5A를 발현하는 재조합 벡터를 제작했다. PCR은 실시예 1에 있어서 발현이 보여진 마우스 암 세포주 N2A(ATCC로부터 구입)로부터 조제했다. cDNA를 1㎕, NotI 및 XhoI 제한효소절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 25 및 26에 기재)를 각 0.4㎛, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(TAKARA SHUZO CO., LTD. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)을 사용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-4분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 5의 아미노산 서열 전장을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스겔에서 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 사용해서 약 4000bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen사 제품)로 라이게이션(ligation)했다. 이것을 대장균에 형질전환한 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 NotI 및 XhoI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제한 후, 목적 유전자 서열을 NotI, XhoI 제한효소로 처리한 포유류 발현 벡터 PCDNA 3.1(Invitrogen사 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 포유류의 세포 내에서 PDS5A 단백질이 산생된다.
상기에서 제작한 플라스미드 DNA 100㎍에 50㎍의 금 입자(Bio Rad사 제품), 스페르미딘 100㎕(SIGMA사 제품), 1M CaCl2 100㎕(SIGMA사 제품)을 첨가하고, 보텍스(vortex)로 교반하고 10분간 실온에서 정치했다(이후 금-DNA 입자라고 기재함). 3000rpm으로 1분 원심한 후, 상청을 버리고 100% 에탄올(WAKO사 제품)로 3회 세정했다. 금-DNA 입자에 100% 에탄올 6ml을 첨가하고 보텍스로 충분히 교반한 후, 금-DNA 입자를 Tefzel Tubing(Bio Rad사 제품)에 유입시켜서 벽면에 침전시켰다. 금-DNA 입자가 부착된 Tefzel Tubing의 에탄올을 풍건하고, 유전자총에 적합한 길이로 잘랐다.
(2) DNA 백신법에 의한 PDS5A의 항종양 효과
10마리의 A/J 마우스(7주령, 수컷, Japan SLC Inc.에서 구입) 및 Balb/c 마우스(7주령, 수컷, Japan SLC Inc.에서 구입)의 피하에 마우스 신경아종 세포주 N2a, 대장암 세포주 CT26을 각각 1×106개 이식한 후, 상기에서 제작한 튜브를 유전자총에 고정하고, 순 헬륨가스를 사용해서 400psi의 압력으로 체모한 마우스의 복강에 DNA 백신을 7일마다 총 3회 경피 투여하고(플라스미드 DNA 접종량은 2㎍/마리가 됨), 항종양 효과를 평가했다(치료 모델). 또한, 마찬가지로 10마리의 A/J 마우스 및 Balb/c 마우스에 DNA 백신을 7일마다 총 3회 경피 투여한 후에 N2a 세포, CT26 세포를 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 컨트롤로서 PDS5A 유전자가 삽입되어 있지 않은 플라스미드 DNA를 각 모델에서 10마리씩 투여했다.
항종양 효과는 종양의 크기(장경×단경2/2) 및 생존 마우스의 비율로 평가했다. 결과를 도 4∼11에 나타낸다. 본 검토의 결과, 신경아종 세포주를 사용한 치료 모델에 있어서 41일 후에는 컨트롤군 및 PDS5A 플라스미드 투여군에서 각각 569㎣, 109㎣이 되고, PDS5A 플라스미드 투여군에서 유의한 종양의 축소가 관찰되었다(도 4). 마찬가지로 신경아종 세포주를 사용한 예방 모델에 있어서도 43일 후에는 컨트롤군 및 PDS5A 플라스미드 투여군에서 각각 476㎣, 0㎣이 되고, PDS5A 플라스미드 투여군에서는 종양의 완전한 퇴축이 관찰되었다(도 5). 또한, 대장암 세포주를 사용한 치료 모델에 있어서, 41일 후에는 컨트롤군 및 PDS5A 플라스미드 투여군에서 각각 589㎣, 189㎣이 되고, PDS5A 플라스미드 투여군에서 유의한 종양의 축소가 관찰되었다(도 8). 마찬가지로 대장암 세포주를 사용한 예방 모델에 있어서도 43일 후에는 컨트롤군 및 PDS5A 플라스미드 투여군에서 각각 397㎣, 43㎣이 되고, PDS5A 플라스미드 투여군에서 유의한 종양의 축소가 관찰되었다(도 9). 또한, 신경아종 세포주를 사용한 양 모델에 있어서의 생존의 경과를 관찰한 결과, 치료 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여후 84일에서 전례 사망한 것에 비해, PDS5A 플라스미드 투여군에서는 60%의 마우스가 생존하여 있었다(도 6). 또한, 예방 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여후 90일에서 전례 사망한 것에 비해 PDS5A 플라스미드를 투여한 군에서는 모든 마우스가 생존하여 있었다(도 7). 또한, 대장암 세포주를 사용한 양 모델에 있어서의 생존 경과를 관찰한 결과, 치료 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여후 84일에서 전례 사망한 것에 비해 PDS5A 플라스미드 투여군에서는 40%의 마우스가 생존하여 있었다(도 10). 또한, 예방 모델에 있어서 컨트롤군에서는 투여 후 90일에서 전례 사망한 것에 비해 PDS5A 플라스미드를 투여한 군에서는 80%의 마우스가 생존하여 있었다(도 11).
이상의 결과로부터, PDS5A 플라스미드 투여군은 컨트롤군에 비해서 유의한 항종양 효과가 확인되고, 이것으로부터 PDS5A가 강한 암항원성을 갖는 암항원이며, 암의 치료 및 예방에 유효한 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 펩티드 에피토프 반응성 CD8 양성 T세포의 유도
인간 PDS5A 단백질의 아미노산 서열 중의 HLA-A0201 결합 모티프 예측을 위해서, 공지의 BIMAS 소프트웨어(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/에서 이용 가능)를 사용한 컴퓨터 예측 프로그램을 사용해서 서열번호 4 및 44의 아미노산 서열을 해석하고, HLA 클래스 I분자에 결합 가능하다고 예상되는 서열번호 27∼35의 폴리펩티드를 선택했다.
HLA-A0201 양성의 건상인으로부터 말초혈을 분리하고, Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika, Durham, NC)에 중층하고, 1,500rpm으로 실온에서 20분간 원심분리했다. 말초혈 단핵구(PBMC)를 함유하는 획분을 회수하고, 냉 인산염 완충액 중에서 3회( 또는 그 이상) 세정하여 PBMC를 얻었다. 얻어진 PBMC를 AIM-V 배지(Life Technololgies, Inc., 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 20ml에 현탁하고, 배양 플라스크(Falcon) 중에 37℃, 5% CO2의 조건하에서 2시간 부착시켰다.비부착 세포는 T세포 조제에 사용하고, 부착 세포는 수상 세포를 조제하기 위해서 사용했다.
한편, 부착 세포를 AIM-V 배지 중에서 IL-4(1000U/㎖) 및 GM-CSF(1000U/㎖)의 존재 하에서 배양했다. 6일 후에 IL-4(1000U/㎖), GM-CSF(1000U/㎖), IL-6 (1000U/㎖, Genzyme, Cambridge, MA), IL-1β (10ng/㎖, Genzyme, Cambridge, MA) 및 TNF-α(10ng/㎖, Genzyme, Cambridge, MA)를 첨가한 AIM-V 배지로 교환하고 2일간 더 배양한 후 얻어진 비부착 세포 집단을 수상 세포로서 사용했다.
조제한 수상 세포를 AIM-V 배지 중에 1×106세포/㎖의 세포밀도로 현탁하고, 선택한 폴리펩티드 각각을 10㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 96구멍 플레이트를 사용해서 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양 후, X선 조사(3000rad)하고, AIM-V 배지로 세정하고, 10% 인간 AB 혈청(Nabi, Miami, FL), IL-6(1000U/㎖) 및 IL-12(10ng/㎖, Genzyme, Cambridge, MA)를 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하고, 24구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×105세포씩 첨가했다. 또한 조제한 T세포 집단을 1구멍당 각각 1×106세포 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양했다. 7일 후, 각각의 배양 상청을 버리고, 상기와 같이 동일하게 해서 얻은 각 폴리펩티드로 처리한 후 X선 조사한 수상 세포를 10% 인간 AB 혈청(Nabi, Miami, FL), IL-7(10U/㎖, Genzyme, Cambridge, MA) 및 IL-2(10U/㎖, Genzyme, Cambridge, MA)를 함유하는 AIM-V 배지로 현탁하고(세포밀도: 1×105세포/㎖), 24구멍 플레이트 1구멍당 각각 1×105세포씩 첨가하고 더 배양했다. 같은 조작을 7일 간격으로 4∼6회 반복한 후에 자극된 T세포를 회수하고, 플로우 사이트 메트리(Flow Site Metry)에 의해 CD8 양성 T세포의 유도를 확인했다.
실시예 4: HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포를 자극하는 PDS5A 중의 세포장해성 T세포 항원 에피토프의 결정
상기에서 유도한 각 구멍의 T세포내 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드에 의해 자극된 T세포가 증식하여 있는 것이 현미경 하에 있어서의 세포수 계측에 의해 확인되었다. 증식이 보여진 T세포 각각에 대해서 펄스에 사용한 각 폴리펩티드에 대한 특이성을 조사하기 위해서 폴리펩티드에 의해 펄스된 HLA-A0201 분자를 발현하는 T2세포(Salter RD et al., Immunogenetics, 21: 235-246(1985), ATCC로부터 구입)(10㎍/㎖의 농도로 AIM-V 배지에 각 폴리펩티드를 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양) 5×104개에 대하여 5×103개의 T세포를 첨가하고, 10% 인간AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지 중에서 96구멍 플레이트에서 24시간 배양했다. 배양 후 상청을 취하고, IFN-γ의 산생량을 ELISA법에 의해 측정했다. 그 결과, 폴리펩티드를 펄스하지 않은 T2세포를 사용한 구멍의 배양 상청에 비하여 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드를 펄스한 T2세포를 사용한 구멍의 배양 상청에 있어서 IFN-γ 산생이 확인되었다(도 12). 따라서, 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드는 특이적으로 HLA-A0201 양성 CD8 양성 T세포를 증식 자극시켜 IFN-γ 산생을 유도하는 능력을 갖는 T세포 에피토프 펩티드인 것이 판명되었다. 한편, 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 범위 외의 폴리펩티드를 첨가해서 상기 처리를 행했을 경우, IFN-γ의 산생은 확인되지 않았다(도 12).
다음에, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드인 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드가 HLA-A0201 양성이고 PDS5A를 발현하는 종양세포 상의 HLA-A0201 분자 상에 제시되는 것인지 또는 본 폴리펩티드에 의해 자극된 CD8 양성 T세포가 HLA-A0201 양성이고 PDS5A를 발현되는 종양세포를 장해할 수 있는지를 검토했다.
PDS5A의 발현이 확인된 악성 뇌종양 세포주, T98G(Stein GH et al., J. Cell Physiol., 99:43-54(1979), ATCC로부터 구입)를 105개 50ml 용적의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가하고 37℃에서 2시간 인큐베이팅했다. 그 후 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지로 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 103개씩 첨가하고, 이것에 후에 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지로 현탁한 105, 5×104, 2.5×104 및 1.25×104개의 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드에 의해 자극된 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포를 각각 더 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양후, 장해를 받은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정함으로써 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드에 의해 자극된 CD8 양성 T세포의 세포장해활성을 산출했다.
그 결과, 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드에 의해 자극된 HLA-A0201 양성의 CD8 양성 T세포가 T98G에 대한 세포장해활성을 갖는 것이 판명되었다(도 13). 따라서, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드인 서열번호 27∼35의 각 폴리펩티드는 HLA-A0201 양성이고 PDS5A를 발현하는 종양세포 상의 HLA-A0201 분자 상에 제시되는 것이며, 또한 이들 폴리펩티드는 이러한 종양세포를 장해할 수 있는 CD8 양성 세포장해성 T세포를 유도하는 능력이 있는 것이 밝혀졌다. 한편, 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 범위 외의 폴리펩티드를 첨가해서 상기 처리를 행했을 경우 세포장해활성은 보여지지 않았다(도 13).
또한, 세포장해활성은 상기한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 각 폴리펩티드에 의해 자극 유도된 CD8 양성 T세포 105개와 크롬 51을 취입시킨 103개의 악성 뇌종양 세포주 T98G를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양후 배지로 방출시킨 크롬 51의 양을 측정하고, 이하 계산식 ＊에 의해 산출한 CD8 양성 T세포의 T98G에 대한 세포장해활성을 나타낸 결과이다.
＊식: 세포장해활성(%)=CD8 양성 T세포를 첨가했을 때의 T98G로부터의 크롬 51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량×100.
실시예 5: 재조합 PDS5A 단백질의 제작, 약효 평가 및 암의 검출과 암진단
(1) 재조합 PDS5A 단백질의 제작
실시예 1에서 취득한 서열번호 1의 유전자를 기초로 하여 이하의 방법으로 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 얻은 파지미드 용액으로 조제해서 서열 해석에 제공한 벡터를 1㎕, NotI 및 XhoI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 37 및 38에 기재)를 각 0.4㎛, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(TAKARA SHUZO CO., LTD. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)를 사용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-4분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 2의 아미노산 서열 전장을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스겔에서 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 사용해서 약 4000bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen사 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질전환한 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 NotI 및 XhoI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제한 후 목적 유전자 서열을 NotI, XhoI 제한효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30A(Novagen사 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질이 산생될 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)으로 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.
또한, 서열번호 43의 유전자를 기초로 하여 이하의 방법으로 인간 PDS5A의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA로부터 RT-PCR법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, NotI 및 XhoI 제한효소절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 39 및 40에 기재)를 각 0.4㎛, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS폴리메라아제(TAKARA SHUZO CO., LTD. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)을 사용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-4분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 44의 아미노산 서열 전장을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스겔에서 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 사용해서 약 4000bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen사 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질전환한 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 NotI 및 XhoI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제한 후 목적 유전자 서열을 NotI, XhoI 제한효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30A(Novagen사 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질이 산생될 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.
또한, 서열번호 5의 유전자를 기초로 하여 이하의 방법으로 마우스 PDS5A의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA로부터 RT-PCR법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, NotI 및 XhoI 제한효소절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 41 및 42에 기재)를 각 0.4㎛, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS폴리메라아제(TAKARA SHUZO CO., LTD. 제품)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가해서 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사 제품)을 사용하여 98℃-10초, 55℃-15초, 72℃-4분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 6의 아미노산 서열 전장을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스겔에서 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제품)를 사용해서 약 4000bp의 DNA 단편을 정제했다.
정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Blunt(Invitrogen사 제품)에 라이게이션했다. 이것을 대장균에 형질전환한 후 플라스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스로 확인했다. 목적 서열과 일치한 플라스미드를 NotI 및 XhoI 제한효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제한 후, 목적 유전자 서열을 NotI, XhoI 제한효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30A(Novagen사 제품)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질이 산생될 수 있다. 이 플라스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.
(2) 재조합 PDS5A 단백질의 정제
상기에서 얻어진 서열번호 2, 서열번호 44 또는 서열번호 6을 발현하는 각각의 재조합 대장균을 100㎍/㎖ 안피실린 함유 LB 배지에서 600nm에서의 흡광도가 0.7부근이 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 최종 농도가 1mM가 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 더 배양했다. 그 후 4800rpm으로 10분간 원심해서 집균했다. 이 균체 펠릿을 인산 완충화 생리식염수로 현탁하고, 4800rpm으로 10분간 더 원심하여 균체의 세정을 행했다.
이 균체를 50mM 트리스염산 완충액(pH8.0)으로 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 6000rpm으로 20분간 원심분리하고, 얻어진상청을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분이라고 했다.
불용성 획분을 50mM 트리스염산 완충액(pH8.0)으로 현탁하고 6000rpm으로 15분간 원심했다. 본 조작을 2회 반복하여 탈프로테아제 조작을 행했다.
이 잔사를 6M 구아니딘염산염, 0.15M 염화나트륨 함유 50mM 트리스염산 완충액(pH8.0)으로 현탁하고, 4℃에서 20시간 정치해서 단백질을 변성시켰다. 이 변성 조작 후, 6000rpm으로 30분간 원심하여 얻어진 가용성 획분을 정법에 따라서 조제한 니켈 킬레이트 컬럼(담체: Chelateing Sepharose(상표) Fast Flow(GE Health Care사), 컬럼 용량 5mL, 평형화 완충액: 6M 구아니딘염산염, 0.15M 염화나트륨 함유 50mM 트리스염산 완충액(pH8.0)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 더 정치해서 니켈 킬레이트화한 담체에의 흡착을 행했다. 이 컬럼 담체를 1500rpm으로 5분간 원심하여 상청을 회수하고, 컬럼 담체에 대해서는 인산 완충화 생리식염수로 현탁한 후 컬럼에 재충전했다.
컬럼 미흡착 획분을 컬럼 용량의 10배량의 0.5M 염화나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH4.0)으로 세정 조작을 행한 후, 즉시 0.5M 염화나트륨 함유 0.1M 아세트산 완충액(pH3.0)으로 용출을 행해서 정제 획분으로 하고, 이후 이 정제 획분을 투여 시험용 재료로 했다. 또한, 각 용출 획분 중의 목적 단백질은 정법에 따라 행한 쿠마시 염색에 의해 확인했다.
상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품을 반응용 완충액(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 5mM CaCl2(pH8.0))으로 치환한 후, FactorXa Cleavage Capture Kit(Novagen사 제품)을 사용해서 첨부 프로토콜에 따라서 FactorXa 프로테아제에 의한 His 태그의 절단 및 목적 단백질의 정제를 행했다. 그 다음에, 상기 방법에 의해 얻어진 정제 표품 12ml를 한외여과 NANOSEP 10K OMEGA(Pall Corporation 제품)를 사용하여 생리용 인산완충액(Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd. 제품) 치환한 후, HT Tuffryn Acrodisc 0.22㎛(Pall Corporation 제품)으로 무균 여과를 행하고, 이것을 실험에 사용했다.
(3) 재조합 마우스 PDS5A 단백질의 담암 마우스에 대한 항종양 효과
A/J 마우스(7주령, 수컷, Japan SLC Inc.에서 구입)의 피하에 마우스 신경아종 세포주 N2a를 1×106개 이식하고, 종양이 평균 50∼100㎣에 달한 시점(전형적으로는 종양 접종후 7일간)에서 마우스를 1군 10마리로 하여 무작위로 군을 나누고, 재조합 마우스 PDS5A 단백질의 항종양 효과의 평가를 행했다(치료 모델). 상술한 바와 같이 정제한 재조합 마우스 PDS5A 단백질 100㎍(0.5ml)에 50㎍의 폴리IC를 혼합해서 암 치료제를 조제하고, 이것을 담암 마우스에 1주일 마다 피하에 총 3회 투여했다. 그 결과, 암 치료제 투여로부터 31일 후에는 종양을 완전히 퇴축되었다. 한편, PBS(-) 투여 음성 컨트롤군 및 폴리IC 단독 투여군(50㎍)에서는 투여후 31일 후에는 종양이 각각 평균 1657㎣, 평균 932㎣가 되었다.
또한, A/J 마우스에 대하여 재조합 마우스 PDS5A 단백질 100㎍(0.5ml)과 50㎍의 폴리IC를 혼합한 암 치료제를 조제하고, 이것을 1주일 마다 피하에 총 3회 투여를 행한 후에 N2a 세포를 1×106개 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 1군은 10마리로 하고, 비교 대조로서 PBS(-) 투여 음성 컨트롤군 및 폴리IC 단독 투여군(50㎍)을 할당했다. 그 결과, 암 치료제 투여를 투여한 군에서는 암 치료제를 투여하고 40일 후에 있어서도 종양의 발생은 관찰되지 않았다. 한편, PBS(-) 투여 음성 컨트롤군 및 폴리IC 단독 투여군(50㎍)에서는 투여후 40일 후에는 각각 평균 1989㎣, 평균 1843㎣가 되었다.
동일한 실험을 대장암 모델에서 행했다. Balb/c 마우스(7주령, 수컷, Japan SLC Inc.에서 구입)의 피하에 대장암 세포주 CT26을 1×106개 이식하고, 종양이 평균 50∼100㎣에 달한 시점(전형적으로는 종양 접종 후 7일간)에서 마우스를 1군 10마리로 하여 무작위로 군을 나누고, 재조합 마우스 PDS5A 단백질의 항종양 효과의 평가를 행했다(치료 모델). 상술한 바와 같이 정제한 재조합 마우스 PDS5A 단백질 100㎍(0.5ml)에 50㎍의 폴리IC를 혼합해서 암 치료제를 조제하고, 이것을 담암 마우스에 1주일 마다 피하에 총 3회 투여를 행했다. 그 결과, 암 치료제 투여로부터 24일 후에는 종양을 완전히 퇴축되었다. 한편, PBS(-) 투여 음성 컨트롤군 및 폴리IC 단독 투여군(50㎍)에서는 투여후 24일 후에는 종양이 각각 평균 1449㎣, 평균 835㎣가 되었다.
또한, Balb/c 마우스에 대하여 재조합 마우스 PDS5A 단백질 100㎍(0.5ml)과 50㎍의 폴리IC를 혼합한 암 치료제를 조제하고, 이것을 1주일 마다 피하에 총 3회 투여를 행한 후에 CT26 세포를 1×106개 이식해서 항종양 효과를 평가했다(예방 모델). 또한, 1군은 10마리로 하고, 비교 대조로서 PBS(-) 투여 음성 컨트롤군 및 폴리IC 단독 투여군(50㎍)을 할당했다. 그 결과, 암 치료제 투여를 투여한 군에서는 암 치료제를 투여해서 31일 후에 있어서도 종양의 발생은 관찰되지 않았다. 한편, PBS(-) 투여 음성 컨트롤군 및 폴리IC 단독 투여군(50㎍)에서는 투여후 31일 후에는 각각 평균 1781㎣, 평균 1675㎣가 되었다.
이상의 결과로 재조합 PDS5A 단백질이 암의 치료 및 예방에 유효한 것이 밝혀졌다.
(4) 재조합 PDS5A 단백질의 담암 환견에 대한 항종양 효과
표피에 종류를 가진 담암 환견 3마리(유선종양 3마리)에 대하여 후술의 실시예 5에 기재한 재조합 단백질의 항종양 효과의 평가를 행했다. 투여를 행하기 전에 우선 후술의 실시예 5(3)에 기재된 방법에 의해 각 환견의 혈청 중의 재조합 단백질에 대한 항체가를 측정한 바 건상견와 비교해서 높은 항체가가 검출되었다. 이것으로부터 이들 담암 환견의 생체 중의 종양 조직에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질이 암 항원으로서 발현하고 있는 것이 시사되었다.
상술한 바와 같이 정제한 재조합 PDS5A 단백질(개 유래 및 인간 유래) 각각 500㎍(2.5ml)에 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)를 혼합해서 2종류의 암 치료제를 조제하고, 이것을 1주일마다 종양 근방의 소속 림프절에 총 3회 투여를 행했다. 그 결과, 암 치료제 투여 시점에서 각각 크기가 약 500㎣ 및 1000㎣이었던 종류가 암 치료제 투여로부터 각각 13일 후 및 21일 후에는 완전히 퇴축되었다. 한편, PBS(-) 투여 음성 컨트롤군에서는 PBS 투여 시점에서 약 800㎣이었던 종류가 투여후 21일 후에는 1625㎣가 되었다.
또한, 항문 주위에 발생한 선암 및 표피에 발생한 편평상피암의 환견 각 1마리에 대하여 후술의 실시예 5와 같이 정제한 재조합 개 PDS5A 단백질 500㎍(2.5ml)에 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 제품)를 혼합해서 암 치료제로 하고, 이것을 1주일 마다 종양 근방의 피하에 총 4회 투여했다. 그 결과, 암 치료제 투여 시점에서 각각 암의 크기가 약 370㎣ 및 280㎣이었던 종류가 암 치료제 투여로부터 각각 35일 후 및 42일 후에는 완전히 퇴축되었다.
(5) 재조합 PDS5A 단백질을 사용한 암의 검출
악성 종양이 확인된 환견 112마리와 건상견 30마리의 혈액을 채취하고 혈청을 분리했다. 상기 (2)에서 제작한 개 PDS5A 단백질(서열번호 2)을 사용해서 ELISA법으로 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 항체가를 측정했다. 제작한 단백질의 고상화는 인산 완충화 생리식염수로 5㎍/mL로 희석한 재조합 단백질 용액을 96구멍 Immobilizer Amino Plate(Nunc사 제품)에 100㎕/well 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 행했다. 블록킹은 3% BSA(bovine serum albumin(소 혈청 알부민)), Sigma-Aldrich Japan 제품) 함유 50mM 중탄산 나트륨 완충용액(pH8.4)(이하 블록킹 용액)을 100㎕/well 첨가하고 실온에서 1시간 진탕했다. 희석에 블록킹 용액을 사용한 1000배 희석 혈청을 100㎕/well 첨가하고 실온에서 3시간 진탕시켜 반응시켰다. 0.05% Tween20(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제) 함유 인산 완충화 생리식염수(이하 PBS-T)로 3회 세정하고, 블록킹 용액으로 3000배 희석한 HRP 수식 항견 IgG 항체(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사 제품)를 100㎕/well 첨가하고 실온에서 1시간 진탕시켜 반응시켰다. PBS-T로 3회 세정하고, HRP 기질 TMB(1-Step Turbo TMB(테트라메틸벤지딘), PIERCE사)를 100㎕/well 첨가하고 실온에서 30분간 효소기질 반응시켰다. 그 후, 0.5M 황산 용액(Sigma-Aldrich Japan 제품)을 100㎕/well 첨가해서 반응을 정지한 후, 마이크로플레이트 리더로 450nm의 흡광도 측정을 행했다. 컨트롤로서는 제작한 재조합 단백질을 고상화하지 않은 것, 담암견 혈청을 반응시키지 않은 것을 상기와 같이 행하여 비교했다.
상기 암진단에 사용한 전체 112 검체는 적출된 종양조직을 사용한 병리진단 결과 모두 악성이라고 확정 진단이 되어있다.
구체적으로는 악성 흑색종, 악성 혼합종양, 간세포암, 기저세포암, 구강내종류, 항문주위선암, 항문낭종류, 항문낭 아포크린선암, 셀트리 세포종, 질전정암(膣前庭癌), 피지선암, 피지선상피종, 지선선종, 한선암, 비강내선암, 비선암, 갑상선암, 대장암, 기관지선암, 선암, 선관암, 유선암, 복합형 유선암, 유선악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 섬유육종, 혈관주피종, 골육종, 연골육종, 연부조직육종, 조직구육종, 점액육종, 미분화 육종, 폐암, 비만세포종, 피부평활근종, 복강내 평활근종, 평활근종, 편평상피암, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 부신수질종양, 과립막세포종, 갈색 세포종 등의 암진단을 받은 검체이다.
이들 담암견 생체 유래의 혈청은 건상견 유래 혈청에 비교해서 재조합 단백질에 대한 높은 항체가를 나타냈다. 본 진단법에 의한 악성 판단을 건상견 평균치의 2배 이상으로 했을 경우, 94검체, 83.9%에서 악성암이라고 진단할 수 있는 것을 알았다. 이 94검체의 암의 종류는 이하와 같다. 또한, 검체에 따라서는 복수 종류의 암이 감염되어 있는 것도 있지만, 이하에 나타내는 수치는 암의 종류마다 누계값이다.
악성 흑색종 5예, 림프종 10예, 과립막세포종 1예, 간세포암 3예, 악성 정소종양 3예, 구강내종류 3예, 항문주위선암 5예, 육종 9예, 유선암 35예, 폐암 1예, 선관암 4예, 피지선암 2예, 비만 세포종 5예, 평활근육종 1예, 편평상피암 4예, 악성 혼합종양 2예, 혈관주피종 1예.
또한, 상기 (2)에서 제작한 인간 PDS5A 단백질(서열번호 44)을 사용하여 상기와 동일하게 해서 암진단을 행한 바 동일한 결과가 얻어졌다.
이상의 것으로부터, PDS5A 단백질을 사용해서 상기 단백질에 특이적으로 반응하는 혈청 중의 항체가를 측정함으로써 암의 검출이라고 진단할 수 있는 것을 알수 있었다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 각종 암에 대하여 항종양 활성을 발휘하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 유도제는 암의 치료 및/또는 예방 또는 암의 검출에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Pharmaceutical Composition for Treatment and Prevention of Cancers <130> 10057 <160> 44 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 4396 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (116)..(4129) <223> <400> 1 ccgacgaggg gcggcggcac aaccaccaga caaaggcccg ggcgctcgat gcaccttccg 60 ccccatgagg aggaggagcc ggtagaggac tgtgaaagaa aagttgtccc ccagg atg 118 Met 1 gac ttc acc gcg cag ccc aag cct gcc act gcc ctc tgt ggc gtc gtg 166 Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val Val 5 10 15 agt gca gac ggg aag atc gct tac cct ccg ggg gta aag gag atc acc 214 Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile Thr 20 25 30 gac aag atc acc acc gat gaa atg atc aag cga ctg aag atg gta gta 262 Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val Val 35 40 45 aaa act ttt atg gat atg gat cag gac tca gaa gat gaa aaa cag cag 310 Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln Gln 50 55 60 65 tat ctc cca cta gcc 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Leu Leu Gly 390 395 400 ttt gta aga gaa aga aca ctg gat aaa cgg tgg cga gta aga aaa gaa 1366 Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys Glu 405 410 415 gct atg atg ggt ctg gct cag ctc tat aag aaa tac tgt ctt cat ggt 1414 Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His Gly 420 425 430 gaa gca gga aag gaa gct gca gag aaa gtc agc tgg ata aag gac aaa 1462 Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp Lys 435 440 445 ctt ttg cat att tat tat caa aat agc atc gat gac aaa ctg ttg gta 1510 Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu Val 450 455 460 465 gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtc ccc cac aac ctg gaa aca gaa 1558 Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr Glu 470 475 480 gag aga atg aaa tgc ttg tat tat tta tac gct agt ttg gat cca aat 1606 Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Asn 485 490 495 gct gtc aaa gct ctc aat gaa atg tgg aaa tgt cag aac atg ctt cga 1654 Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu Arg 500 505 510 agt cat gta cga gaa ctc ttg gat ttg cac aag caa cct aca tca gag 1702 Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser Glu 515 520 525 gct aac tgt tct gcc atg ttt gga aaa ctg atg acc ata gca aag aat 1750 Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys Asn 530 535 540 545 ttg cct gac cct ggg aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa ttt aac cag 1798 Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn Gln 550 555 560 gtc ctt ggt gat gat gag aaa ttg cgg tct cag ctg gag tta cta atc 1846 Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu Ile 565 570 575 agc cca acc tgt tca tgc aaa caa gca gat gtt tgt gtg aga gaa ata 1894 Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Val Cys Val Arg Glu Ile 580 585 590 gct cga aaa ctt gca aat cct aag cag cca aca aat cct ttt cta gag 1942 Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu Glu 595 600 605 atg gtc aaa ttt ctg ttg gaa aga att gca cct gtg cac att gat tca 1990 Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp Ser 610 615 620 625 gaa gcc ata agt gca ctg gta aaa ctg atg aat aaa tca ata gaa ggg 2038 Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu Gly 630 635 640 aca gca gat gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct att cgt 2086 Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile Arg 645 650 655 tcg gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttc aca cat cct acc tcg 2134 Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr Ser 660 665 670 ttc cac tct gca gag aca tat gag tcc ctg tta cag tgc ctc aga atg 2182 Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg Met 675 680 685 gaa gat gac aag gta gca gaa gct gct ata caa att ttt aga aat aca 2230 Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr 690 695 700 705 ggc cac aaa ata gaa aca gac cta ccc cag ata cga tcg acc tta att 2278 Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile 710 715 720 ccc att tta cat cag aaa gca aag aga ggt act cca cat caa gca aaa 2326 Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala Lys 725 730 735 cag gct gtt cac tgt ata cat gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc cag 2374 Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val Gln 740 745 750 ctt gca cag att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gat gta 2422 Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp Val 755 760 765 cca gaa caa ctt att act ccg tta gtt tca ttg ggc cac att tct atg 2470 Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser Met 770 775 780 785 tta gcc cca gat caa ttt gct tcc cca atg aaa tcc gta gta gca aat 2518 Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala Asn 790 795 800 ttt att gtg aaa gat ctg cta atg aat gac agg tca aca ggt gag aag 2566 Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu Lys 805 810 815 aat gga aaa tta tgg tct cca gat gaa gag gtt tcc ccc gaa gta cta 2614 Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val Leu 820 825 830 gca aag gta cag gca att aaa ctt ctg gta agg tgg ctg ttg ggt atg 2662 Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met 835 840 845 aaa aac aac cag tct aaa tct gcc aat tca act ctt cga tta tta tca 2710 Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser 850 855 860 865 gcg atg ttg gtt agt gag ggt gac ctg aca gag caa aag agg atc agt 2758 Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile Ser 870 875 880 aaa tct gat atg tct cgc ttg cga tta gct gct ggt agt gcc ata atg 2806 Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met 885 890 895 aag ctt gct cag gaa cct tgt tac cat gaa att ata act cca gaa cag 2854 Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu Gln 900 905 910 ttt cag ctc tgt gca ctt gtt att aac gat gag tgc tac caa gta agg 2902 Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val Arg 915 920 925 cag ata ttt gcc cag aag ttg cat aaa gct ctc gtg aag tta ctg ctg 2950 Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu Leu 930 935 940 945 cca ttg gaa tat atg gcg atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct gtg 2998 Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro Val 950 955 960 aag gag aga aga gca cat gca cga cag tgt tta cta aaa aat atc agt 3046 Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser 965 970 975 ata cgc agg gag tac att aaa cag aac ccc atg gct act gag aaa tta 3094 Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu 980 985 990 cta tca ctg ttg cct gaa tat gta gtt cca tac atg att cac ctg cta 3142 Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu Leu 995 1000 1005 gcc cat gat cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat cag ctt 3187 Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln Leu 1010 1015 1020 cgt gat att aaa gag tgc cta tgg ttc atg ctt gaa gtt tta atg 3232 Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met 1025 1030 1035 aca aag aat gaa aac aat agc cat gca ttt atg aag aag atg gca 3277 Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met Ala 1040 1045 1050 gag aac atc aag tta aca aaa gat gcc cag tct cca gat gaa tcc 3322 Glu Asn Ile Lys Leu Thr Lys Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu Ser 1055 1060 1065 aag atg aat gaa aaa ctt tat aca gta tgt gat gtg gct ctg tgt 3367 Lys Met Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu Cys 1070 1075 1080 gtt ata aat agt aaa agt gct ttg tgc aat gca gat tca cca aag 3412 Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro Lys 1085 1090 1095 gat cca gtc ctt cca atg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag gat 3457 Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys Asp 1100 1105 1110 ttc tgt aat gac aag agt tat att tca gaa gag acc aga gta ctt 3502 Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu 1115 1120 1125 ctg tta aca gga aag cca aaa cct gct gga gta cta ggt gca gta 3547 Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala Val 1130 1135 1140 aac aag cct tta tca gca aca gga aga aaa cca tat gta aga agc 3592 Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg Ser 1145 1150 1155 act gga gct gag act gga agc aat att aat gta aat tca gag ctg 3637 Thr Gly Ala Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu Leu 1160 1165 1170 aac cct tca acc gga aat cga tca agg gaa caa agt tca gag gca 3682 Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu Ala 1175 1180 1185 gta gaa act gga gtt agt gaa aat gaa gag aac cct gtg aga att 3727 Val Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg Ile 1190 1195 1200 att tct gtc aca cct gta aaa aat att gac cca gta aag aat aag 3772 Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn Lys 1205 1210 1215 gag att aat tct gat cag act acc cag ggc aac atc agc agt gac 3817 Glu Ile Asn Ser Asp Gln Thr Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser Asp 1220 1225 1230 cga gga aag aag aga agt gta gca gca gct ggt aca gag aac atc 3862 Arg Gly Lys Lys Arg Ser Val Ala Ala Ala Gly Thr Glu Asn Ile 1235 1240 1245 caa caa aaa aca gat gag aaa gta gac gaa tca gga cca cct gcc 3907 Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro Ala 1250 1255 1260 cct tca aaa ccc agg aga gga cgc cga ccc aag tct gaa tct cag 3952 Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser Gln 1265 1270 1275 ggc aat gca acc aaa aat gat gac ata aac aaa cct ctt ggc aag 3997 Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Ile Asn Lys Pro Leu Gly Lys 1280 1285 1290 gga aga aag aga gct gcg gtc agt cag gaa agc cct ggg ggt ctg 4042 Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Ser Gln Glu Ser Pro Gly Gly Leu 1295 1300 1305 gaa gca ggt aat gcc aaa gca ccc aaa ctg caa gat gta gcc aaa 4087 Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Val Ala Lys 1310 1315 1320 aag gca gta cca gca gag aga cag att gac tta caa agg taa 4129 Lys Ala Val Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1325 1330 1335 aaagaaaact catttgcaaa gggaaaaaat gaaggccaaa cagaagcaca gactccagct 4189 tctgcaaaaa cttggattca caatgtccct gaacagaaaa tgaagttaac ttcagaacac 4249 actttctgcc ttgaaaactg aaagaaacta ttacttcctt ttcacatgac cacaagtcct 4309 ttgatggaaa tgtacagaga aactcttgag agagagagag agagagagag agagagagag 4369 agaggctaaa agcaactcta ttctatc 4396 <210> 2 <211> 1337 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val 1 5 10 15 Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile 20 25 30 Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val 35 40 45 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn 130 135 140 Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys 145 150 155 160 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 165 170 175 Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser 180 185 190 Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser 195 200 205 Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg 355 360 365 Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile 370 375 380 Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu 385 390 395 400 Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys 405 410 415 Glu 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Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln Gln Tyr Leu Pro 15 20 25 cta gcc ttg cat ctt gca tct gaa ttc ttc ctc agg aac ccc aat aaa 328 Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg Asn Pro Asn Lys 30 35 40 gat gtg cgt ctc ctt gta gca tgt tgt ttg gct gat atc ttt cgt atc 376 Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp Ile Phe Arg Ile 45 50 55 60 tat gcc cca gaa gct cca tat act tcc cat gat aaa ctt aag gac ata 424 Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys Leu Lys Asp Ile 65 70 75 ttt ttg ttt att acc aga caa tta aaa ggt ttg gag gat aca aag agt 472 Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Thr Lys Ser 80 85 90 cca cag ttt aat aga tac ttt tat tta tta gag aat tta gct tgg gtt 520 Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val 95 100 105 aaa tca tat aac atc tgc ttt gaa ttg gaa gat tgc aat gaa att ttt 568 Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys Asn Glu Ile Phe 110 115 120 att cag ctt ttt aga act ctc ttc tca gtg atc aac aat agc cac aat 616 Ile Gln Leu Phe Arg 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His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu Phe Lys Leu Lys 240 245 250 agc aat gat gga gaa gag cga tta gct gtt gtt cga ctt cta gct aaa 1000 Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg Leu Leu Ala Lys 255 260 265 ttg ttt ggc tcc aaa gat tct gat ttg gca aca cag aat cgt cct ctt 1048 Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln Asn Arg Pro Leu 270 275 280 tgg caa tgt ttt ctt gga cga ttt aat gat att cat gtt cct gtg aga 1096 Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His Val Pro Val Arg 285 290 295 300 tta gaa agt gtg aaa ttt gcc agt cat tgt tta atg aat cac cca gat 1144 Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met Asn His Pro Asp 305 310 315 tta gcg aag gat ctc aca gaa tat tta aag gtt aga tca cat gat cca 1192 Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg Ser His Asp Pro 320 325 330 gaa gaa gct att cgt cat gat gtc att gtt act ata ata aca gct gcc 1240 Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile Ile Thr Ala Ala 335 340 345 aag agg gac ctg gcc tta gta aat gat cag ctg ctt ggc ttt gta agg 1288 Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu Gly Phe Val Arg 350 355 360 gaa aga aca ctg gat aaa cgg tgg cga gta aga aaa gaa gct atg atg 1336 Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys Glu Ala Met Met 365 370 375 380 ggt ctg gct cag ctt tat aag aaa tac tgt ctt cat ggt gaa gca gga 1384 Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His Gly Glu Ala Gly 385 390 395 aag gaa gct gca gag aaa gtc agc tgg ata aag gac aaa ctt ctg cat 1432 Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp Lys Leu Leu His 400 405 410 att tat tat cag aac agc att gac gac aaa ctg ttg gta gag aaa atc 1480 Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu Val Glu Lys Ile 415 420 425 ttt gct cag tat ctt gtc ccc cac aac ctg gaa aca gaa gag aga atg 1528 Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr Glu Glu Arg Met 430 435 440 aaa tgc tta tat tac tta tat gct agt ttg gat cca aat gct gta aaa 1576 Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys 445 450 455 460 gct ctc aac gaa atg tgg aag tgt cag aac atg ctt cgg agc cat gta 1624 Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu Arg Ser His Val 465 470 475 cgc gaa cta ttg gat ttg cac aag cag cct aca tca gag gct aac tgt 1672 Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser Glu Ala Asn Cys 480 485 490 tct gcc atg ttt gga aaa ctg atg acc ata gca aag aat ttg cct gac 1720 Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys Asn Leu Pro Asp 495 500 505 ccc ggg aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa ttt aac cag gtt ctc ggc 1768 Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly 510 515 520 gat gat gag aaa ctt cgg tct cag ttg gag tta tta att agc cca acc 1816 Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu Ile Ser Pro Thr 525 530 535 540 tgt tct tgc aaa caa gca gat att tgt gtg aga gaa ata gcc cgg aaa 1864 Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu Ile Ala Arg Lys 545 550 555 ctt gca aat cct aag caa cca aca aat cct ttt cta gag atg gtc aaa 1912 Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu Glu Met Val Lys 560 565 570 ttt ctg ttg gaa aga atc gca cct gtg cac att gat tca gaa gcc ata 1960 Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp Ser Glu Ala Ile 575 580 585 agt gca cta gtg aaa ttg atg aat aag tca ata gag ggg aca gca gat 2008 Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu Gly Thr Ala Asp 590 595 600 gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct atc cgt tca gga ctt 2056 Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile Arg Ser Gly Leu 605 610 615 620 gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttt aca cat cct acc tcg ttc cac tct 2104 Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr Ser Phe His Ser 625 630 635 gca gag aca tat gag tcc ttg tta cag tgc cta aga atg gag gat gac 2152 Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg Met Glu Asp Asp 640 645 650 aag gta gca gaa gct gct att caa att ttt aga aat aca ggt cac aaa 2200 Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys 655 660 665 ata gaa aca gac ctt ccc cag ata cga tcg acc tta att ccc att tta 2248 Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile Pro Ile Leu 670 675 680 cat caa aaa gca aag agg ggt act cca cac caa gca aaa cag gct gtg 2296 His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala Lys Gln Ala Val 685 690 695 700 cac tgt ata cac gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc cag ctt gca cag 2344 His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val Gln Leu Ala Gln 705 710 715 att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gat gtg cca gaa caa 2392 Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp Val Pro Glu Gln 720 725 730 ctt ata act cca tta gtt tca ttg ggc cac att tct atg tta gca cca 2440 Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser Met Leu Ala Pro 735 740 745 gat cag ttt gct tcc cca atg aaa tct gta gta gca aat ttt att gtg 2488 Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala Asn Phe Ile Val 750 755 760 aaa gat ctg cta atg aat gac agg tca aca ggt gaa aag aat gga aaa 2536 Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu Lys Asn Gly Lys 765 770 775 780 ctg tgg tct cca gat gaa gag gtt tcc cct gaa gta cta gca aag gta 2584 Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val Leu Ala Lys Val 785 790 795 cag gca att aaa ctt ctg gta agg tgg ctg ttg ggt atg aaa aac aac 2632 Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met Lys Asn Asn 800 805 810 cag tct aaa tct gcc aat tca acc ctt cgg tta tta tca gcg atg ttg 2680 Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser Ala Met Leu 815 820 825 gtt agt gag ggt gac ctg aca gag caa aag agg atc agt aaa tct gat 2728 Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile Ser Lys Ser Asp 830 835 840 atg tct cgc ttg cga tta gct gct ggt agt gcc ata atg aag ctt gct 2776 Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met Lys Leu Ala 845 850 855 860 cag gaa cct tgt tac cat gaa att att acc cca gaa cag ttt cag ctc 2824 Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu Gln Phe Gln Leu 865 870 875 tgt gca ctt gtt att aat gat gag tgt tac caa gta agg cag ata ttt 2872 Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val Arg Gln Ile Phe 880 885 890 gct cag aag ctg cat aag gca ctt gtg aag tta ctg ctc cca ttg gag 2920 Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu Leu Pro Leu Glu 895 900 905 tat atg gcg atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct gtg aag gag aga 2968 Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro Val Lys Glu Arg 910 915 920 aga gca cac gca cga caa tgt tta ctg aaa aat atc agt ata cgc agg 3016 Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser Ile Arg Arg 925 930 935 940 gaa tac att aag cag aat cct atg gct act gag aaa tta tta tca ctg 3064 Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu Leu Ser Leu 945 950 955 ttg cct gaa tat gta gtt cca tac atg att cac ctg cta gcc cat gat 3112 Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu Leu Ala His Asp 960 965 970 cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat cag ctt cgt gat atc aaa 3160 Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln Leu Arg Asp Ile Lys 975 980 985 gag tgc cta tgg ttc atg ctt gaa gtt tta atg aca aag aat gaa aac 3208 Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn 990 995 1000 aat agc cat gcc ttt atg aag aag atg gca gag aac atc aag tta 3253 Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu 1005 1010 1015 acc aga gat gcc cag tct cca gat gaa tcc aag aca aat gaa aaa 3298 Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu Ser Lys Thr Asn Glu Lys 1020 1025 1030 ctg tat aca gta tgt gat gtg gct ctc tgt gtt ata aat agt aaa 3343 Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu Cys Val Ile Asn Ser Lys 1035 1040 1045 agt gct ttg tgc aat gca gat tca cca aag gac cca gtc ctc cca 3388 Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro Lys Asp Pro Val Leu Pro 1050 1055 1060 atg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag gac ttc tgt aac gat aag 3433 Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys Asp Phe Cys Asn Asp Lys 1065 1070 1075 agt tat att tca gaa gag aca aga gta ctt ctg tta aca gga aag 3478 Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys 1080 1085 1090 cca aag cct gct gga gta cta ggt gca gta aat aag cct tta tca 3523 Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala Val Asn Lys Pro Leu Ser 1095 1100 1105 gca acg gga agg aaa ccc tat gtt aga agc act ggc act gag act 3568 Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg Ser Thr Gly Thr Glu Thr 1110 1115 1120 gga agc aat att aat gta aat tca gag ctg aac cct tca acc gga 3613 Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu Leu Asn Pro Ser Thr Gly 1125 1130 1135 aat cga tca agg gaa cag agt tca gag gca gca gaa act gga gtt 3658 Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu Ala Ala Glu Thr Gly Val 1140 1145 1150 agt gaa aat gaa gag aac cct gtg agg att att tca gtc aca cct 3703 Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val Thr Pro 1155 1160 1165 gta aag aat att gac cca gta aag aat aag gaa att aat tct gat 3748 Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn Lys Glu Ile Asn Ser Asp 1170 1175 1180 cag gct acc cag ggc aac atc agc agt gac cga gga aag aaa aga 3793 Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser Asp Arg Gly Lys Lys Arg 1185 1190 1195 aca gta aca gca gct ggt gca gag aat atc caa caa aaa aca gat 3838 Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn Ile Gln Gln Lys Thr Asp 1200 1205 1210 gag aaa gta gat gaa tcg gga cct ccc gcc cct tcc aaa ccc agg 3883 Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ser Lys Pro Arg 1215 1220 1225 aga gga cgt cga ccc aag tct gaa tct cag ggc aat gct acc aaa 3928 Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser Gln Gly Asn Ala Thr Lys 1230 1235 1240 aat gat gat cta aat aaa cct att aac aag gga agg aag aga gct 3973 Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn Lys Gly Arg Lys Arg Ala 1245 1250 1255 gca gtg ggt cag gag agc cct ggg ggt ttg gaa gca ggt aat gcc 4018 Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly Leu Glu Ala Gly Asn Ala 1260 1265 1270 aaa gca ccc aaa ctg caa gat tta gcc aaa aag gca gca cca gca 4063 Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala 1275 1280 1285 gaa aga caa att gac tta caa agg taa aaatgcattt gcaaagggag 4110 Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1290 1295 aaaatgaagg ccaaacagaa gcaggctcca gcttctgcaa aaacttggat tcacaaatgt 4170 ccctgaacag aaaatgaagc tcacttcaga acacacactc tctgccttga aaactaaaga 4230 gactattact tccttttcac atgaccacaa gtcctctgat ggaaatgtac agcagaaact 4290 cttgagagag aggctaaaag caactctgtt ctcccccttc ccctagactt ttcttacgaa 4350 aagtcaataa 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atgtgtacac ataatcatat ttaagttttt tgcataaaat aaatgcttct 5250 agatgtcatg gcagtctttt taatcttttt atcatatgct ttcttgtgaa ttttttcatg 5310 ttaaagagct aaagtcataa catgattaca gtcaactctc cattatctat ataaaatagt 5370 gactaagcct caggttttta attttgtgat aacaaaataa cgaaggcatg taagacctga 5430 ttctggagga acatgaaatt tgtcttttct catgtccaga gttctatcct gcccccactg 5490 tccactgtag ggtcatccgc aaagccctag cagaatgtgc tcactccatt tccttacacg 5550 tttctagcat gggtcagagg aaacaacatt tgtgttataa cttcgtcttg ataggctgta 5610 gtgtacatgg gatgtaaaac aaacaagtgt atcaaaggtg gatgattctg ttagagtgaa 5670 gtttgagagt aaatgtcact tacgtttctc atagataatc aagagttggc tgtgtattga 5730 ctgaaagatg ggtaattatt ttaaatatgc atttacacac atttaggtat cagaagatgc 5790 ttagggaaca atggatacca atgatagaaa atgatacctt tacaggggca gaaaaatccc 5850 cactcttcct tattgcctct tcagaaccct ttagaaagta taaaatattg cctccaacat 5910 gctgaaaaag agtatctatg cataagtatc agagaagtcc ctcaagcaat cagtaggtgt 5970 gttctattta gagagagttt aaagttctct tagcatcaga caacttgatt cctaaggttt 6030 ccagtgtgtc accaacaaaa agtgcattga tagggacctt tgtctcttcc tccctttgat 6090 taattgcccg gcatcacagt ttactagatt accaagtgtt acatcatatt aaataaaatg 6150 tagcagaacc atctgcatca atatattcct gtttagattt ttgcaggaga gaagttaaaa 6210 ggatttgctc cttgtatgat gtaagtggcc caccccaatt ttgtaacatg atgcaagtgt 6270 ctggcactaa gggaagcaag agtagggttg tggaaagacc aagctgatgg ggagggactt 6330 gtttacggga atttttttag ttttcctttt caaaggaaaa cattaaaatc ccttaggaat 6390 ttggtattca catctcagag aactacaaca caaaagtgca gacttatatt tgagaattaa 6450 tgttaaccct ttgtgtctag tttgaagctt cttgtatttg tctaaaacaa caagccagaa 6510 ttttgtatct cctttgataa aaagtgtgta taatgtaaag tagttttgca tattcttgtg 6570 ctgcacatgg gctgaatttt taaatttttt ttaaaaactt gaagcagaac cttgtaattt 6630 gtgtaaatga caagtgtaaa atcctaccat aaaatgctaa aaatatgcac tgtttcaaat 6690 aaaaccaaga aatgcagcat taaaaaaaaa aaaaaa 6726 <210> 4 <211> 1297 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp 1 5 10 15 Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln Gln Tyr Leu Pro Leu Ala 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Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys 1265 1270 1275 Leu Gln Asp Leu Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile 1280 1285 1290 Asp Leu Gln Arg 1295 <210> 5 <211> 4452 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (148)..(4146) <223> <400> 5 acggacggag ccgctttgtg tgcagcccga cgaggggcgg cggcggcggc gcaaccacct 60 gacagaggcc cggcgctcgc tgcaccgtcc gcccgcatga ggaggagagg ccggtagagg 120 actgtgagag aaaagttatt ccccagg atg gac ttc acg cag ccg aag cct gcc 174 Met Asp Phe Thr Gln Pro Lys Pro Ala 1 5 act gcc ctc tgt ggc gtc gtg agt gcg gac ggg aag atc gct tac cct 222 Thr Ala Leu Cys Gly Val Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro 10 15 20 25 ccg gga gta aaa gag atc acc gac aag atc acc acc gat gaa atg atc 270 Pro Gly Val Lys Glu Ile Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile 30 35 40 aaa cgt ctg aag atg gta gtg aaa act ttt atg gat atg gat cag gat 318 Lys Arg Leu Lys Met Val Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp 45 50 55 tca gaa gat gaa aag caa cag tat ctc cca cta gcc ttg cat ctc gca 366 Ser Glu Asp Glu Lys Gln Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala 60 65 70 tct gaa ttc ttt ctc agg aac cct aat aaa gat gtg cgc ctt ctc gta 414 Ser Glu Phe Phe Leu Arg Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val 75 80 85 gca tgt tgt ttg gct gat ata ttt cga atc tat gcc cca gaa gct cca 462 Ala Cys Cys Leu Ala Asp Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro 90 95 100 105 tat act tcc cat gat aaa ctt aag gac ata ttt ctc ttt att acc aga 510 Tyr Thr Ser His Asp Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg 110 115 120 cag tta aaa ggt ttg gag gat aca aag agt cca cag ttt aat aga tat 558 Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr 125 130 135 ttt tat tta tta gag aat tta gct tgg gtt aaa tca tat aac atc tgc 606 Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys 140 145 150 ttt gag ttg gaa gat tgc aat gaa att ttt att cag ctt ttt aga act 654 Phe Glu Leu Glu Asp Cys Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr 155 160 165 ctc ttc tcg gta atc aac aat agc cac aat acg aaa gta caa atg cac 702 Leu Phe Ser Val Ile Asn Asn Ser His Asn Thr Lys Val Gln Met His 170 175 180 185 atg tta gac ttg atg agt tct atc atc atg gaa ggt gat gga gtt act 750 Met Leu Asp Leu Met Ser Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr 190 195 200 caa gaa tta ttg gat tcc att ctt atc aac ctc atc cct gca cac aag 798 Gln Glu Leu Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys 205 210 215 aac tta aat aaa cag tcc ttc gac ctt gca aaa gtc cta ctg aaa agg 846 Asn Leu Asn Lys Gln Ser Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg 220 225 230 aca gtc cag act att gaa gca tgt att gcc aat ttt ttc aat caa gtc 894 Thr Val Gln Thr Ile Glu Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val 235 240 245 ctg gtg ctg ggc aga tca tca gtc agc gac ctg tct gaa cac gta ttt 942 Leu Val Leu Gly Arg Ser Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe 250 255 260 265 gat ctg att cag gaa ctt ttt gct atc gat cct cag tta ctg tta tct 990 Asp Leu Ile Gln Glu Leu Phe Ala Ile Asp Pro Gln Leu Leu Leu Ser 270 275 280 gtc atg cca cag ctt gaa ttc aaa ctg aag agc aac gat ggt gaa gaa 1038 Val Met Pro Gln Leu Glu Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu 285 290 295 cgc cta gct gtg gtt cga ctc ctc gca aaa ttg ttc ggc tct aaa gat 1086 Arg Leu Ala Val Val Arg Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp 300 305 310 tca gat tta gca aca cag aat cgg cct ctc tgg cag tgc ttt ctt ggg 1134 Ser Asp Leu Ala Thr Gln Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly 315 320 325 cga ttt aat gac att cat gtt cct gtg agg tta gaa agt gtg aag ttt 1182 Arg Phe Asn Asp Ile His Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe 330 335 340 345 gcc agc cac tgt ttg atg aat cac cca gac tta gcg aag gat ctg aca 1230 Ala Ser His Cys Leu Met Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr 350 355 360 gaa tat ttg aaa gtt agg tca cat gat cca gaa gaa gcc att cgt cat 1278 Glu Tyr Leu Lys Val Arg Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His 365 370 375 gat gtt att gtt act ata ata aca gct gcc aaa aga gac ctt gcc tta 1326 Asp Val Ile Val Thr Ile Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu 380 385 390 gta aat gat cag ttg ctt ggc ttt gtc agg gaa agg aca ctg gat aaa 1374 Val Asn Asp Gln Leu Leu Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys 395 400 405 cgg tgg cga gta aga aaa gaa gcc atg atg ggt ctg gct cag ctc tat 1422 Arg Trp Arg Val Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr 410 415 420 425 aag aaa tac tgt ctt cat ggg gaa gca gga aag gaa gcc gcg gag aaa 1470 Lys Lys Tyr Cys Leu His Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys 430 435 440 gtc agc tgg ata aag gac aag ctg ctg cat atc tac tat cag aac agc 1518 Val Ser Trp Ile Lys Asp Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser 445 450 455 att gat gac aaa cta ttg gta gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtt 1566 Ile Asp Asp Lys Leu Leu Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val 460 465 470 ccc cac aac ctg gaa aca gaa gag aga atg aaa tgc tta tat tat tta 1614 Pro His Asn Leu Glu Thr Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu 475 480 485 tat gct agc ttg gat cca aat gct gta aaa gct ctc aat gaa atg tgg 1662 Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp 490 495 500 505 aaa tgt cag aac atg ctt cga agt cat gtg cgt gaa cta ttg gac tta 1710 Lys Cys Gln Asn Met Leu Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu 510 515 520 cac aag cag cct aca tca gaa gcg aac tgt tct gcc atg ttt ggg aaa 1758 His Lys Gln Pro Thr Ser Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys 525 530 535 ctg atg acc ata gca aag aat ttg cct gac cct gga aaa gca caa gat 1806 Leu Met Thr Ile Ala Lys Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp 540 545 550 ttt gta aag aaa ttt aac cag gtt ctt ggt gat gat gag aaa ctg agg 1854 Phe Val Lys Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg 555 560 565 tct cag ttg gaa tta tta atc agc cca acc tgt tca tgc aag cag gct 1902 Ser Gln Leu Glu Leu Leu Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala 570 575 580 585 gac gtt tgt gtg agg gaa ata gct cgg aaa ctt gca aat cct aag cag 1950 Asp Val Cys Val Arg Glu Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln 590 595 600 cca acc aac cct ttt cta gag atg gtc aaa ttt ctt ttg gaa aga att 1998 Pro Thr Asn Pro Phe Leu Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile 605 610 615 gct cct gtg cac atc gat tca gaa gcc ata agt gca ctg gta aaa ctg 2046 Ala Pro Val His Ile Asp Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu 620 625 630 atg aat aag tca atc gaa ggg acg gcc gat gat gaa gag gag ggt gtc 2094 Met Asn Lys Ser Ile Glu Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val 635 640 645 agt cca gac tca gcc atc cgc tca gga ctt gag ctt ctt aag gtt ctg 2142 Ser Pro Asp Ser Ala Ile Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu 650 655 660 665 tct ttc aca cat cct acc tcg ttc cac tct gca gag aca tat gag tcc 2190 Ser Phe Thr His Pro Thr Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser 670 675 680 ttg tta cag tgc cta aga atg gag gat gac aag gta gca gaa gct gca 2238 Leu Leu Gln Cys Leu Arg Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala 685 690 695 ata caa att ttt aga aac aca ggc cac aaa ata gaa act gac ctt ccc 2286 Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro 700 705 710 cag ata cgg tca acc ttg atc ccc att tta cat cag aaa gcc aag cgg 2334 Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys 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Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala 940 945 950 ttg tgt gcc aaa gac cct gtg aaa gaa agg aga gca cac gct cgg cag 3054 Leu Cys Ala Lys Asp Pro Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln 955 960 965 tgt ttg tta aag aac atc agc atc cgc agg gag tac atc aaa cag aac 3102 Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn 970 975 980 985 ccc atg gcc act gag aaa tta ttg tca ctg ctg cct gaa tat gtg gtt 3150 Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val 990 995 1000 cca tac atg att cac ctc cta gcc cat gat cct gat ttc aca cgg 3195 Pro Tyr Met Ile His Leu Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg 1005 1010 1015 tca caa gat gtt gat caa ctt cgt gat ata aaa gag tgc ctg tgg 3240 Ser Gln Asp Val Asp Gln Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp 1020 1025 1030 ttt atg ctt gaa gtc tta atg aca aag aat gaa aac aac agc cat 3285 Phe Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His 1035 1040 1045 gca ttc atg aaa aag atg gca gag aat atc aag cta acc aga gac 3330 Ala Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp 1050 1055 1060 gcc cag tct ccc gat gaa tcc aag aca aat gaa aaa ctt tat acg 3375 Ala Gln Ser Pro Asp Glu Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr 1065 1070 1075 gtt tgt gac gtg gct ctg tgt gtt ata aat agt aaa agt gct ttg 3420 Val Cys Asp Val Ala Leu Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu 1080 1085 1090 tgc aat gca gac tca cca aag gac cca gtc ctc cca atg aag ttc 3465 Cys Asn Ala Asp Ser Pro Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe 1095 1100 1105 ttt aca cag cct gaa aag gac ttc tgt aat gac aaa agc tat att 3510 Phe Thr Gln Pro Glu Lys Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile 1110 1115 1120 tca gaa gag aca aga gtt ctt ctg tta aca gga aag cca aag cct 3555 Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro 1125 1130 1135 act gga gta tta ggt aca gtg aac aag cct tta tca gca acg gga 3600 Thr Gly Val Leu Gly Thr Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly 1140 1145 1150 agg aag cct tat gtt aga agc gcc ggc aca gag act gga agc aat 3645 Arg Lys Pro Tyr Val Arg Ser Ala Gly 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musculus <400> 6 Met Asp Phe Thr Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val Val 1 5 10 15 Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val Val 35 40 45 Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln Gln 50 55 60 Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg Asn 65 70 75 80 Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp Ile 85 90 95 Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys Leu 100 105 110 Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp 115 120 125 Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu 130 135 140 Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys Asn 145 150 155 160 Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn Asn 165 170 175 Ser His Asn Thr Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser Ser 180 185 190 Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser Ile 195 200 205 Leu 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Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met 835 840 845 Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile Ser 865 870 875 880 Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met 885 890 895 Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu Gln 900 905 910 Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val Arg 915 920 925 Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu Leu 930 935 940 Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro Val 945 950 955 960 Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser 965 970 975 Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu 980 985 990 Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu Leu 995 1000 1005 Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln Leu 1010 1015 1020 Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met 1025 1030 1035 Thr Lys Asn 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atg gat cag gac tca gaa gat gaa aaa cag 192 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 cag tat ctc cca cta gcc ttg cat cta gca tct gaa ttt ttt ctc agg 240 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 aat ccc aat aaa gat gtg cgt ctc ctt gta gca tgt tgt ttg gct gac 288 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 atc ttt cga atc tat gcc cca gaa gct cca tat act tcc cat gat aaa 336 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys 100 105 110 ctt aag gac ata ttt ttg ttt att acc aga cag tta aaa ggt ttg gag 384 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 115 120 125 gat aca aag agc ccg cag ttt aat aga tac ttt tat tta tta gag aat 432 Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn 130 135 140 tta gca tgg gtt aaa tcg tat aac atc tgc ttt gaa ttg gaa gat tgc 480 Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys 145 150 155 160 aat gaa att ttt att cag ctt ttt agg act ctc ttc tca gtg atc aac 528 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 165 170 175 aat agc cac aat aag aag gta caa atg cac atg tta gac ttg atg agt 576 Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser 180 185 190 tct atc atc atg gaa ggt gat gga gtt act caa gaa tta ttg gac tcc 624 Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser 195 200 205 att ctt att aac ctc att cct gca cat aag aac tta aat aaa cag tcg 672 Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 ttt gac ctc gca aaa gtc cta ttg aaa agg aca gtc cag act att gaa 720 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 gca tgc att gcc aat ttt ttc aat caa gta ctg gtg ctg gga aga tca 768 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 tca gta agt gat ttg tca gaa cat gta ttt gat ctg att cag gaa ctt 816 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 ttt gct ata gat ccc cat tta tta tta tct gtt atg ccg cag ctt gaa 864 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 ttc aaa ctg aag agc aat gat gga gaa gaa cga tta gct gtt gtt cga 912 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 ctt tta gct aaa ttg ttt ggc tct aaa gat tcc gat tta gca aca cag 960 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 aat cgt cct ctg tgg cag tgt ttt ctt gga cga ttt aat gac att cat 1008 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 gtt cct gtg aga tta gaa agt gtg aaa ttt gcc agt cac tgt tta atg 1056 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 aat cac cca gat tta gca aag gat ctc aca ggt ttc act ctg gca ctg 1104 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Gly Phe Thr Leu Ala Leu 355 360 365 ttt cag gtc tct aac agt cat gga cta tgg cga gta aga aaa gaa gct 1152 Phe Gln Val Ser Asn Ser His Gly Leu Trp Arg Val Arg Lys Glu Ala 370 375 380 atg atg ggt ctg gct cag ctt tat aag aaa tac tgt ctt cat ggt gaa 1200 Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His Gly Glu 385 390 395 400 gca gga aag gaa gct gca gag aaa gtc agc tgg ata aag gac aaa ctt 1248 Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp Lys Leu 405 410 415 ttg cat ata tat tat caa aat agc atc gat gac aaa cta ttg gta gag 1296 Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu Val Glu 420 425 430 aaa atc ttt gct caa tat ctt gtc ccc cac aac ctg gaa aca gaa gag 1344 Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr Glu Glu 435 440 445 aga atg aaa tgc ttg tat tat tta tat gct agt ttg gat cca aat gct 1392 Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Asn Ala 450 455 460 gtc aaa gct ctc aat gaa atg tgg aag tgt cag aac atg ctt aga agt 1440 Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu Arg Ser 465 470 475 480 cat gta cga gaa ctg ttg gat ttg cac aag cag cct aca tca gaa gct 1488 His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys 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Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu Gly Thr 595 600 605 gca gat gac gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct att cgt tca 1872 Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile Arg Ser 610 615 620 gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttc aca cat cct acc tcg ttc 1920 Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr Ser Phe 625 630 635 640 cac tct gca gag aca tat gag tcc ctg ttg cag tgc ctc aga atg gaa 1968 His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg Met Glu 645 650 655 gat gac aag gta gca gaa gcc gcc ata cag att ttt aga aac aca ggc 2016 Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr Gly 660 665 670 cac aaa ata gaa aca gac cta ccc cag ata cgg tcg acc tta att ccc 2064 His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile Pro 675 680 685 att tta cat cag aaa gca aag aga gga act cca cac caa gca aaa cag 2112 Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala Lys Gln 690 695 700 gct gtt cac tgt ata cat gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc cag ctt 2160 Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val Gln Leu 705 710 715 720 gca cag att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gac gta cca 2208 Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp Val Pro 725 730 735 gaa caa ctt ata act ccg tta gtt tca ttg ggc cac att tct atg tta 2256 Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser Met Leu 740 745 750 gca cca gat cag ttt gct tcc cca atg aaa tct gta gta gca aat ttt 2304 Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala Asn Phe 755 760 765 att gtt aaa gat cta cta atg aat gac agg tca aca ggt gag aag aat 2352 Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu Lys Asn 770 775 780 gga aaa tta tgg tct cca gat gaa gag gtt tcc cct gaa gta cta gca 2400 Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val Leu Ala 785 790 795 800 aag gta cag gca att aaa ctt ctg gta aga tgg ctg ttg ggt atg aaa 2448 Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met Lys 805 810 815 aac aac cag tct aaa tct gcc aat tca act ctt cgg tta tta tca gca 2496 Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser Ala 820 825 830 atg ttg gtt agt gag ggt gac ctg aca gag cag aag agg atc agt aaa 2544 Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile Ser Lys 835 840 845 tct gat atg tct cgc ttg cga tta gct gct ggt agt gcc ata atg aag 2592 Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met Lys 850 855 860 ctt gct cag gaa cct tgt tac cat gaa att ata acc cca gaa cag ttt 2640 Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu Gln Phe 865 870 875 880 cag ctc tgt gca ctt gtt att aat gat gag tgc tat caa gta agg cag 2688 Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val Arg Gln 885 890 895 ata ttt gct cag aag cta cac aag gca ctt gtg aag tta ctg ctc cca 2736 Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu Leu Pro 900 905 910 ttg gag tat atg gcc atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct gtg aag 2784 Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro Val Lys 915 920 925 gag aga aga gca cat gca cga cag tgt tta cta aaa aac atc agt ata 2832 Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser Ile 930 935 940 cgc agg gag tac att aaa cag aac ccc atg gct act gag aaa cta tta 2880 Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu Leu 945 950 955 960 tca ctg ttg cct gag tat gta gtt ccg tat atg att cac ctg cta gct 2928 Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu Leu Ala 965 970 975 cat gat cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat cag ctt cgt gat 2976 His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln Leu Arg Asp 980 985 990 att aaa gag tgc ctc tgg ttc atg ctt gaa gtt tta atg aca aaa aat 3024 Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn 995 1000 1005 gaa aat aat agc cat gcc ttt atg aaa aag atg gca gag aat atc 3069 Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile 1010 1015 1020 aag cta aca aaa gat gcc cag tct cca gat gaa tcc aag aca aat 3114 Lys Leu Thr Lys Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu Ser Lys Thr Asn 1025 1030 1035 gaa aaa ctt tat aca gtg tgt gat gtg gcc ctg tgc gtg ata aat 3159 Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu Cys Val Ile Asn 1040 1045 1050 agt aaa agt gct ttg tgc aat gca gag tca cca aag gat cca gtc 3204 Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Glu Ser Pro Lys Asp Pro Val 1055 1060 1065 ctg cca gtg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag gac ttc tgt aat 3249 Leu Pro Val Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys Asp Phe Cys Asn 1070 1075 1080 gac aag agt tat att tca gaa gag aca aga gta ctt ctg tta aca 3294 Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr 1085 1090 1095 gga aag cca aaa cct gct gga gta cta ggt gct gta aac aag cct 3339 Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala Val Asn Lys Pro 1100 1105 1110 ttg tca gca acg gga agg aaa cca tat gtt aga agc act gga gct 3384 Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg Ser Thr Gly Ala 1115 1120 1125 gag acc gga agc aat att aat gta aat tca gag ctg aac cct tcc 3429 Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu Leu Asn Pro Ser 1130 1135 1140 acc gga aat cga cca agg gaa cag agt tca gag gca gca gaa act 3474 Thr Gly Asn Arg Pro Arg Glu Gln Ser Ser Glu Ala Ala Glu Thr 1145 1150 1155 ggt gtt agt gaa aat gag gag aac cct gta aga att att tct gtc 3519 Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val 1160 1165 1170 aca cca gta aag aat att gac cca gta aag aat aag gaa att aat 3564 Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn Lys Glu Ile Asn 1175 1180 1185 tct gat cag tct gcc cag ggc aac atc agc agt gac cga gga aag 3609 Ser Asp Gln Ser Ala Gln Gly Asn Ile Ser Ser Asp Arg Gly Lys 1190 1195 1200 aaa aga aca gta aca gca gct ggt gca gag aat atc caa caa aaa 3654 Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn Ile Gln Gln Lys 1205 1210 1215 aca gat gag aaa gca gat gaa tca gga cca cct gcc cct tca aaa 3699 Thr Asp Glu Lys Ala Asp Glu Ser Gly Pro Pro Ala Pro Ser Lys 1220 1225 1230 ccc agg aga gga cgt cga ccc aaa tct gaa tct cag ggc aat gca 3744 Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser Gln Gly Asn Ala 1235 1240 1245 acc aaa aat gat gat ata aat aaa cct ctt agt aag gga 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atagaagtct actgaattaa ttttttagaa gaagagaaat 4402 cagattaaat gtcttttttt tttccttttg gaaactttta tgtataattc tttctgcctg 4462 cctacttttc tgcaaaatga gatgtacaga tttcagttcc ctgctatgaa aagtgatgtg 4522 gtggcaattt tataaatgtt gctttctgat ttttatcaga gtgagaaaat aattaaaatt 4582 attattgatt tcatatcact tcatattttg atttcccctc cattttagtt taatataatt 4642 tgcaataaat gtacatattg ttgtctgttt cataaagcat atcactttaa agtggttttt 4702 actcctgtga ttatgttgga atatttgaaa ttttaaagga gtaaaaactg tccagcattt 4762 ggttttataa tgtttgtcac cagattttta ttattgatgt aaaaaaaagt caattctttt 4822 taaatagttg gactttggca gctttgtaag gaaagtggga ggtgcttagg attgctatca 4882 atttcagcat tgtgctgttg ggaataagtg ttttgctttt gtctgccagt ctgggctccg 4942 tttttatgtt ttttttgaag acaactattg catcaatata ttgtttcttg gcattgttca 5002 gcataggtaa tgtgtgcact tttcgtgtac acatattcat atttaagttt tttgcataaa 5062 ataaatgctt ctagatgtca tatggtagtc ttttttaatc tttttatcac attatgtttt 5122 cctgtgcagt ttttatgtga aagggctaaa gttataaaga aacaacatga ttacagtcaa 5182 ctctccatta tctatacaaa acagtgacta tgcctcaggt tttggatttt gcataaaatc 5242 acgtaattaa tcataaaatt aaagtaacaa agcataccgt aagagctaat tcaggaggaa 5302 ctcgagattg gtcctttctc acctgccccc actctccact taagcccttt ccccaaagcc 5362 ccatctgaat gtgctcagtg tccttgcgca cacctggcgt gggtttgagg acataaatgt 5422 ttgtgtgata acttggtctt gacaggctgt aagtctacgt gagatgtaaa gagtgaacat 5482 gacctgtgtc caaaaaggat gataatgtta aatgtaaaat ttgttggtag taaatgtcac 5542 ttaatgttct cataggtaat caagagttgg ctgtatactg actgactgaa agatggataa 5602 ttctcttaaa tatgcatata cacacattta ggtattggat gatggctagg gaacaatgga 5662 taccagatat taccttttaa aagggcagaa aaagttctac tcttccttat tgcctcttca 5722 taatccttta gaaagataag atattgcctc caacatgctg aaaaagaata tctatgcata 5782 agcatcagag aagtccctca agccatcagt gggcatgttc tgtttagatg ttgaagttct 5842 cttagcatca gacagcttga ttcttaaggc caccaatttg ccaccaataa aaagcacact 5902 ggtagaggcc gcctctctct cgtctccttt taactgacca ttcagcatca tagctgacta 5962 gattacctag cgtgaagtca tagctaacgt agtgtagcag ccattcccat cagttatggc 6022 tgcttagatt tttgcaagag 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caballus <220> <221> CDS <222> (1)..(4014) <223> <400> 9 atg gac ttc acc gcg cag ccc aag cct gcc act gcc ctc tgt ggc gtc 48 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val 1 5 10 15 gtg agt gcg gac ggg aag atc gct tac cct ccg ggg gta aag gag atc 96 Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile 20 25 30 acc gac aag atc acc act gac gaa atg atc aaa cga ctg aag atg gta 144 Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val 35 40 45 gta aaa act ttt atg gat atg gac cag gac tca gaa gat gaa aaa cag 192 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 cag tat ctc cca ctc gcc ttg cat ctt gca tct gaa ttt ttc ctc agg 240 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 aat ccc aat aaa gat gtg cgt ctc ctt gta gca tgt tgt ttg gct gac 288 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 atc ttt cga atc tat gcc cca gaa gct cca tat act tcc cat gat aaa 336 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro 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Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 ttt gac ctc gct aaa gtg ctg ttg aaa agg aca gtc cag act att gag 720 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 gca tgc att gct aat ttt ttc aat caa gtc ctg gtg ctg gga aga tca 768 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 tca gta agt gat tta tca gaa cat gta ttt gat ctg att cag gaa ctt 816 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 ttt gct ata gat cct cat ttg tta tta tct gtc atg cca cag ctt gaa 864 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 ttc aaa ctg aag agc aat gat gga gaa gag cga cta gct gtt gtt cga 912 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 ctt tta gct aaa ttg ttt ggt tct aaa gat tcc gat ttg gca aca cag 960 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 aat cgt cct ctt tgg cag tgt ttt ctc gga cga ttt aat gac att cac 1008 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 gtt cct gtg aga tta gaa agt gtg aaa ttt gcc agt cac tgt tta atg 1056 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 aac cac cca gat tta gca aag gac ctc aca gaa tat ttg aaa gtt aga 1104 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg 355 360 365 tca cat gat cca gaa gaa gcc att cgt cat gat gtc att gtt act ata 1152 Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile 370 375 380 ata aca gct gcc aaa aga gac ctt gcc tta gta aat gat cag ctg ctt 1200 Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu 385 390 395 400 ggc ttt gta agg gaa aga aca ctg gat aaa cgg tgg cga gta aga aaa 1248 Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys 405 410 415 gaa gct atg atg ggt ctg gct cag ctt tat aag aaa tac tgt ctt cat 1296 Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His 420 425 430 ggt gaa gca gga aag gaa gct gca gag aaa gtc agt tgg ata aag gac 1344 Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp 435 440 445 aaa ctt ttg cat att tat tat cag aat agc atc gat gac aaa ctg ttg 1392 Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu 450 455 460 gta gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtt ccc cac aac ctg gaa aca 1440 Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr 465 470 475 480 gaa gag aga atg aaa tgc tta tat tat tta tat gct agt ttg gat cca 1488 Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro 485 490 495 aat gct gtc aaa gct ctc aat gaa atg tgg aag tgt cag aac atg ctt 1536 Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu 500 505 510 aga agt cat gta cga gaa tta ctg gat ttg cat aag cag cct aca tca 1584 Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser 515 520 525 gag gct aac tgt tct gct atg ttt gga aaa ctg atg acc ata gca aag 1632 Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys 530 535 540 aat ttg cct gac cct ggg aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa ttt aac 1680 Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn 545 550 555 560 cag gtt ctc ggt gat gat gag aaa cta cgg tct cag ttg gag tta tta 1728 Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu 565 570 575 atc agc cca acc tgt tca tgc aaa cag gca gat gtt tgt gtg aga gaa 1776 Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Val Cys Val Arg Glu 580 585 590 ata gct cgg aaa ctt gca aat cct aag caa cca aca aat cct ttt cta 1824 Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu 595 600 605 gag atg gtc aaa ttt ctg ttg gaa aga att gca cct gtg cac att gat 1872 Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp 610 615 620 tcg gaa gcc ata agt gca ctg gta aaa ttg atg aat aaa tcc ata gag 1920 Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu 625 630 635 640 ggg aca gca gat gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gcg att 1968 Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile 645 650 655 cgt tca gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttc aca cat cct acc 2016 Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr 660 665 670 tcg ttc cac tct gca gag acg tat gag tcc ctg tta cag tgc ctc aga 2064 Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg 675 680 685 atg gaa gat gac aag gta gca gaa gct gct ata caa att ttt aga aat 2112 Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn 690 695 700 aca ggc cac aaa att gaa aca gac ctg ccc cag ata cga tcg acc tta 2160 Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu 705 710 715 720 att ccc att tta cat cag aaa gca aag aga ggt act cca cac caa gca 2208 Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala 725 730 735 aaa cag gct gtt cac tgt ata cat gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc 2256 Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val 740 745 750 cag ctt gca cag att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gat 2304 Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala 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Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys 980 985 990 tta tta tca ctg ttg cct gaa tat gta gtt cca tat atg att cac cta 3024 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu 995 1000 1005 tta gcc cat gat cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat caa 3069 Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln 1010 1015 1020 ctt cgt gat att aaa gag tgc cta tgg ttc atg ctt gaa gtt tta 3114 Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu 1025 1030 1035 atg aca aag aat gaa aac aat agc cat gcc ttt atg aag aag atg 3159 Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met 1040 1045 1050 gca gaa aac atc aag tta aca aaa gat gcc cag tct cca gat gaa 3204 Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Lys Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu 1055 1060 1065 tcc aag aca aat gaa aaa ctt tat aca gtg tgt gat gtg gct ctg 3249 Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu 1070 1075 1080 tgt gtt ata aac agt aaa agt gct ttg tgc aat gca gat tca cca 3294 Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro 1085 1090 1095 aag gat cca gtc ctt cca atg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag 3339 Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys 1100 1105 1110 gac ttc tgt aat gac aag agt tat att tca gaa gag aca aga gta 3384 Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val 1115 1120 1125 ctt ctg tta aca gga aag cca aaa cct gct gga gta ctt ggt gca 3429 Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala 1130 1135 1140 gta aac aag cct tta tcg gca acg gga agg aaa cca tat gtt aga 3474 Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg 1145 1150 1155 agc act gga act gag act gga agc act att aat gtc aat tca gag 3519 Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Thr Ile Asn Val Asn Ser Glu 1160 1165 1170 ctg aac cct tca act gga agt cga tca aga gaa cag agt tca gag 3564 Leu Asn Pro Ser Thr Gly Ser Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu 1175 1180 1185 gca gca gaa act gga gtt agt gaa aat gaa gag aac cct gtg aga 3609 Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg 1190 1195 1200 att att tct gtc acg cct gta aag aat att gac ccg gta aag aat 3654 Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn 1205 1210 1215 aag gag att aat tct gat cag gct acc cag ggc aac atc agc agt 3699 Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser 1220 1225 1230 gac cga gga aag aaa aga aca gta aca gca gct ggt aca gag aat 3744 Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Thr Glu Asn 1235 1240 1245 atc caa caa aaa aca gat gag aaa gtg gat gaa tca gga cca cct 3789 Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro 1250 1255 1260 gcc cct tca aaa ccc agg aga gga cgt cga ccc aag tct gaa tct 3834 Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser 1265 1270 1275 cag ggc aat gca acc aaa aat gat gat ata aat aaa cct ctt agc 3879 Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Ile Asn Lys Pro Leu Ser 1280 1285 1290 aag gga aga aag aga gcc gcg gtc agt cag gaa agc cct ggg ggt 3924 Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Ser Gln Glu Ser Pro Gly Gly 1295 1300 1305 ttg gaa gca ggt aat gcc aaa gca ccc aaa ctg caa gac ata gcc 3969 Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Ile Ala 1310 1315 1320 aaa aag gca gca cca gca gag aga cag att gac cta caa agg taa 4014 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1325 1330 1335 taaaactcgt ttgcaaaggg agaaaatgaa ggccaaacag aagcaggctc cagcttctgt 4074 aaaacttgga ttcaaaatgt ccctgaagag aaatgaagtt aagttcagaa cacacacttt 4134 ctgccttgaa aactgaaaga aaccattact ttcttttcac atgaccacaa gtctttgatg 4194 gaaatgtaca gcagaaactc ttgagagagg ctaaaagcaa ctctattcta cccttccccc 4254 cagacttttc ttatgaaaag tcaataatta agcaaattgc ttaacacttg gttccagttc 4314 ctgcatatct ggagtttaaa ggcatagtac accattaatt tccatgctgc agtttttatt 4374 ttaaagaaag taacaggatg tccttacact gacactgaaa attcatcaat tttagagcca 4434 ggaattcccg ttgttacaca agaaaaaaat agaagtctac tgaattaatt ttttagaaga 4494 aaaaagatca gattaaatat ttctttgttt ttccttttgg aaacttttat gtataattct 4554 ttctgcctgc ctacttttct gcaaaaatga gatgtacaga tttcagttcc ctgctatgaa 4614 aagtgatgtg gtggcaattt tataaatgtt gctttctgat ttttatcaga gtgagaaaat 4674 aattaaaatt attattgatt tcatatcact tcatattttg atttcccctc cattttagtt 4734 taatataatt tgcaataaat gtacatattg ttgtttgttt cataaagcat atcactttaa 4794 agtggttttt actcctgtga ttatgttggg atatttggaa ttttaaagga gtaaagactg 4854 tccagcattt ggttttataa tgtttgtcac cagattttta ttattgatgt aaaaaaacaa 4914 agtcaatttt ttaaaatagt tggactttgg cagctttgta aggaaagttg gaagtgttta 4974 ggattgctat caatttcagc attgtgctat tgggaaataa gtgttttgct tttgtctgcc 5034 gatctgggct cagtttttat gtttatttta gaagacaact gttgcatcaa tatattgctt 5094 cttggcattg ttcagcatag gtaatgtgtg cacttttgtg tacacatgct catatttaag 5154 ttttcgcata aaataaatgc ttctagatgt catatggtag tcttttttaa tctttttatc 5214 atatgttgtg aatttttttt atgtgaaagg gctaatgtca ttaaacaaag aacatgatta 5274 cagtcaactc tccattatct atataaaata gtgactgtgc ctcaggtttt gaattttgca 5334 gtaatcataa acttaaaata atgaaggcat actgcaggag ctaattcagg aggaacttga 5394 aatttgtcct ttctcacgct cagagttatg gcctgccccc attctccatt gtaggctctt 5454 tcccaaagcc ctagctgggt gttcttactc cattcccaca cacatgccta gcctgggtta 5514 gaggatggaa acgacgcttg cattataact tggtcttcat aggctgtagt ctacatggga 5574 tgtacaaaca gtgaatgtga gctgtgacaa aaaaggatgg ttatgttaat gcgaaaattt 5634 gctggtagta aatgtcactt atgttctcat agataatcaa gagttggctg tatattgact 5694 gagtgaaaaa tgggtagttc ttttaaatat gcatatacac acatttaggt atcatgatga 5754 ttagggaaca atggatacca gtgacagaaa acagtatctt ttgaaagggc agaaacagcc 5814 ctactcttcc ttattgcctc ttcctaaccc tttagaagga aagtataaaa aaaacattgc 5874 ctccaacatg ctgaagaaga atatctatgc ataagcatct gagaagtccc tcaagcaatc 5934 agtgggcacg ttctatttag aaagatttta aagttccctt agcatcagac agcttggttc 5994 ttaaggccac caattggtca ccaataagaa gcacacctgt agggaacttc tttctctctt 6054 aactcctttt gataattact cagcaccaca gctgagagat tacatagtgt tcagtcatat 6114 tcaacataat gtagcagaac catttgcatc agtttatggc tgctgagatt attgcaggag 6174 aggagttagc tgaaaggatc tggtccgcat acacatgtaa ctggcccact catgatttta 6234 taacatgtct ggcactaagg gaagggagaa taggatgata ggaaagattg agctgatgtg 6294 gagggacttg tttaagggaa atttgtcatt tttcctttga aaaaggaaaa agtaaaatcc 6354 cttaggaatt tggtattcgt atctcagaga aatacaacac aaagtgcaga cttatatttg 6414 agaattaatg ttaacccttt gtgtctagtt tgaagcttct tgtatttgtc taaaactaca 6474 agccagaatt ttgtatctcc tttgataaaa agtgtgtata atgtaaagta gttttgcata 6534 ttgtgctgca catgggctga atttttaaaa tttttttaaa gacttgaagc agaaccttgt 6594 aatttgtgta aatgacaagt gtaaaatcct accataaaat gctaaaaata tgcattgttt 6654 caaataaaac caagaaatgc agcatt 6680 <210> 10 <211> 1337 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 10 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val 1 5 10 15 Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile 20 25 30 Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val 35 40 45 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn 130 135 140 Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys 145 150 155 160 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 165 170 175 Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser 180 185 190 Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser 195 200 205 Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg 355 360 365 Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile 370 375 380 Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu 385 390 395 400 Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys 405 410 415 Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His 420 425 430 Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp 435 440 445 Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu 450 455 460 Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr 465 470 475 480 Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro 485 490 495 Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu 500 505 510 Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser 515 520 525 Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys 530 535 540 Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn 545 550 555 560 Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu 565 570 575 Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Val Cys Val Arg Glu 580 585 590 Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu 595 600 605 Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp 610 615 620 Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu 625 630 635 640 Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile 645 650 655 Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr 660 665 670 Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg 675 680 685 Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn 690 695 700 Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu 705 710 715 720 Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala 725 730 735 Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val 740 745 750 Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp 755 760 765 Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser 770 775 780 Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala 785 790 795 800 Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu 805 810 815 Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val 820 825 830 Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly 835 840 845 Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu 850 855 860 Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile 865 870 875 880 Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile 885 890 895 Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu 900 905 910 Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val 915 920 925 Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala 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<211> 4809 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> CDS <222> (231)..(4301) <223> <400> 11 ggctgttctt ccccggccgg acggagagcg gcactgtgtc cccgcggcgc gcgctcggcg 60 gagcctcccc ctctccgctg ctgccgccgc cgccaccgag cagctccccc tcccccttcc 120 gagcagagcc gccgcaccgc cgcgcaggga ggaggcggcg ggagcgggcg ggcagcggcc 180 ggcggggcgg cggcggagcg gcgaggagcg gccggcgcgg aggccgctcc atg ctg 236 Met Leu 1 cac ctt ccg gag ctg cgt gag agg ccg gta gag gac tgt gca gaa gga 284 His Leu Pro Glu Leu Arg Glu Arg Pro Val Glu Asp Cys Ala Glu Gly 5 10 15 aag ttt ctg agc agc ggc acc agg atg gac ttc ccg gct gcc caa cca 332 Lys Phe Leu Ser Ser Gly Thr Arg Met Asp Phe Pro Ala Ala Gln Pro 20 25 30 aaa ccc gcc gcc gat ggt aaa atc atc tac tac ccg ccc gga gtg aag 380 Lys Pro Ala Ala Asp Gly Lys Ile Ile Tyr Tyr Pro Pro Gly Val Lys 35 40 45 50 gag acc acc gac aaa att acc aac gat gag gtg gtg aaa cgg tta aag 428 Glu Thr Thr Asp Lys Ile Thr Asn Asp Glu Val Val Lys Arg Leu Lys 55 60 65 atg gtg gta aaa acg ttc atg gat atg gac cag gac tca gaa gac gag 476 Met Val Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu 70 75 80 aaa cag cag tat ctc cca tta gcc ttg cac ctt gca tct gaa ttc ttc 524 Lys Gln Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe 85 90 95 ctc agg aat ccc aat aaa gat gtg cgc ctc ctt gta gca tgt tgc ttg 572 Leu Arg Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu 100 105 110 gct gat atc ttt cgt atc tat gct cct gaa gct cca tat act tcc cat 620 Ala Asp Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His 115 120 125 130 gac aaa ctt aag gac ata ttc ttg ttt att aca aga caa tta aaa ggc 668 Asp Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly 135 140 145 ttg gag gac aca aag agc cct cag ttt aac aga tac ttt tac ttg tta 716 Leu Glu Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu 150 155 160 gag aat tta gct tgg gtt aaa tct tac aac atc tgc ttt gag ttg gaa 764 Glu Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu 165 170 175 gat tgc aat gaa att ttt att cag ctt ttt agg act ctt ttt tca gtt 812 Asp Cys Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val 180 185 190 atc aat aat agc cac aac cag aag gta caa atg cat atg ctg gat ttg 860 Ile Asn Asn Ser His Asn Gln Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu 195 200 205 210 atg agt tct atc atc atg gaa ggc gat gga gta act cag gag ctg ctg 908 Met Ser Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu 215 220 225 gac tcc att ttg att aac ctc att cct gca cac aag aac ctt aat aag 956 Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys 230 235 240 caa gca ttt gat ctt gca aaa gtc ctg ctg aaa agg act gtc cag acc 1004 Gln Ala Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr 245 250 255 att gaa ccg tgc att gcc aat ttt ttt aac cag gtt ctg gta ctg gga 1052 Ile Glu Pro Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly 260 265 270 aag tct tca gta agt gac tta tca gaa cat gta ttt gac ttg ata cta 1100 Lys Ser Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Leu 275 280 285 290 gag ctt ttt gcc ata gat cct cac tta ctg ctg tct gtc atg ccc cag 1148 Glu Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln 295 300 305 ctt gaa ttc aaa ctg aag agc aat gat gga gaa gaa cgt ttg gct gtt 1196 Leu Glu Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val 310 315 320 gtt cga ctt ttg gct aaa ctc ttt ggc tct aaa gat tct gat ctg gcc 1244 Val Arg Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala 325 330 335 aca caa aat cgt cct ctt tgg cag tgc ttt ctt ggg cgg ttc aat gat 1292 Thr Gln Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp 340 345 350 atc cat gtc cct gtg aga tta gag agt gtg aaa ttc gcc agt cat tgt 1340 Ile His Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys 355 360 365 370 tta atg aac cat cca gac tta gcg aaa gac ctc act gaa tat ttg aag 1388 Leu Met Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys 375 380 385 gtt agg tca cat gac cca gag gaa gct att cga cac gat gtt att gtt 1436 Val Arg Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val 390 395 400 aca att att act gcg ggc aag aga gat ctt tcc tta gtc aat gat cag 1484 Thr Ile Ile Thr Ala Gly Lys Arg Asp Leu Ser Leu Val Asn Asp Gln 405 410 415 ctg ctg ggc ttc gta agg gaa aga aca cta gac aaa cga tgg cga gta 1532 Leu Leu Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val 420 425 430 aga aaa gaa gct atg atg ggt ctt gcc cag cta tac aag aaa tac tgt 1580 Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys 435 440 445 450 ctt cat gcc gag gct gga aaa gat gct gca gag aaa gtg agc tgg ata 1628 Leu His Ala Glu Ala Gly Lys Asp Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile 455 460 465 aag gat aaa ctt ttg cac ata tat tat caa aat agc att gat gac aaa 1676 Lys Asp Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys 470 475 480 tta cta gta gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtt cca cac aat ttg 1724 Leu Leu Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu 485 490 495 gaa aca gaa gag cga atg aag tgc ttg tat tat ttg tat gcc agc ttg 1772 Glu Thr Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu 500 505 510 gat cca aat gct gtc aaa gca ctg aat gag atg tgg aag tgc cag aac 1820 Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn 515 520 525 530 atg ctg agg agt cac gta cga gaa tta cta gac ttg cat aag cag ccc 1868 Met Leu Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro 535 540 545 aca tca gaa gca aac agt gct gcc atg ttt ggg aag ctg atg acc ata 1916 Thr Ser Glu Ala Asn Ser Ala Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile 550 555 560 gca aaa aac ctt cca gat cct gga aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa 1964 Ala Lys Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys 565 570 575 ttc aat cag gtt cta ggc gat gat gaa aag ctt cgg tcc cag ctt gaa 2012 Phe Asn Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu 580 585 590 ctg tta att agc cct acg tgt tct tgt aaa cag gca gat gtc tgt gtg 2060 Leu Leu Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Val Cys Val 595 600 605 610 aga gag ata gcc cgg aaa ctt gca aat cct aag cag cca aca aat cct 2108 Arg Glu Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro 615 620 625 ttt ctg gaa atg gtc aaa ttt ctt ttg gaa aga att gct cct gta cat 2156 Phe Leu Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His 630 635 640 att gac tca gaa gcc att agt gca cta gta aaa ttg atg aat aaa tca 2204 Ile Asp Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser 645 650 655 ata gag ggg aca gct gat gat gaa gag gag ggt gta agt cct gat act 2252 Ile Glu Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr 660 665 670 gca att cgt gca gga ctt gaa ctt ctc aag gtt ctg tcc ttt aca cat 2300 Ala Ile Arg Ala Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His 675 680 685 690 cct acc tcg ttt cac tct gcg gag acc tat gag tct ctg ctg cag tgc 2348 Pro Thr Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys 695 700 705 ctc agg atg gaa gat gat aag gta gct gag gca gcc ata cag att ttc 2396 Leu Arg Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe 710 715 720 aga aac acg ggt cac aaa ata gaa aca gac ctg cca cag ata aga tca 2444 Arg Asn Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser 725 730 735 aca tta att cca att ttg cat cag aaa gca aaa aga ggc act ccc cat 2492 Thr Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His 740 745 750 cag gca aaa caa gcc gtt cac tgt ata cat gcc ata ttt tca aat aaa 2540 Gln Ala Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Ser Asn Lys 755 760 765 770 gaa gtg caa ctt gct cag atc ttt gag cct ctt agt aga agt ttg aat 2588 Glu Val Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn 775 780 785 gct gat gta cca gaa caa ctg ata act cca tta gtc tca ctg ggt cac 2636 Ala Asp Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His 790 795 800 att tct atg ttg gct cca gac cag ttt gct tct cca atg aaa tct gtt 2684 Ile Ser Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val 805 810 815 gtt gca aat ttc gtt gta aaa gat ctt cta atg aat gac agg tca aca 2732 Val Ala Asn Phe Val Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr 820 825 830 ggt gag aaa aat gga aag ttg tgg tct cca gat gaa gag gtg tct cca 2780 Gly Glu Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro 835 840 845 850 gaa gta cta gca aag gtg caa gca att aaa ctt ttg gta cgc tgg ctg 2828 Glu Val Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu 855 860 865 ctg ggt atg aaa aac aac cag tca aaa tct gca aat tcc aca ctc cga 2876 Leu Gly Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg 870 875 880 ttg tta tca gct atg ctt gtc agt gaa gga gac ttg aca gaa cag aag 2924 Leu Leu Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys 885 890 895 cga atc agt aaa tcc gat atg tct cga cta cga tta gct gct ggc agt 2972 Arg Ile Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser 900 905 910 gca ata atg aag ctt gca cag gaa cca tgt tac cat gaa ata att acc 3020 Ala Ile Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr 915 920 925 930 cca gaa cag ttc caa ctc tgt gcg ctc gtc att aat gat gag tgc tac 3068 Pro Glu Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr 935 940 945 caa gtg agg cag ata ttt gcc cag aaa ctg cat aaa gca ctt gtg aaa 3116 Gln Val Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys 950 955 960 tta ctg ctc cct ttg gaa tat atg gca atc ttt gct ttg tgt gcc aaa 3164 Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys 965 970 975 gat cct gtg aaa gag aga aga gca cat gcc aga cag tgc ttg ctt aaa 3212 Asp Pro Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys 980 985 990 aac atc agt ata cga aga gag tat att aag cag aat cct atg gct 3257 Asn Ile Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala 995 1000 1005 aac gaa aaa ttg ctg tcc ttg ctg cct gaa tat gtg gta cca tat 3302 Asn Glu Lys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr 1010 1015 1020 atg att cat tta ctg gca cat gat cca gat ttc aca aaa cct cag 3347 Met Ile His Leu Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Lys Pro Gln 1025 1030 1035 gat gtt gat cag ctt cgt gat gtc aaa gag tgc ctg tgg ttc atg 3392 Asp Val Asp Gln Leu Arg Asp Val Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met 1040 1045 1050 ctt gaa gtt tta atg aca aag aat gag aac aat agc cat gcc ttc 3437 Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe 1055 1060 1065 atg aaa aag atg gca gaa aac atc aag ctt aca cga gat gcc cag 3482 Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln 1070 1075 1080 tct cct gat gag cca aag gcc aat gag aaa ctt tat aca gta tgt 3527 Ser Pro Asp Glu Pro Lys Ala Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys 1085 1090 1095 gat gta gca ctg tgt gta atc aac agc aaa agt gct tta tgc aat 3572 Asp Val Ala Leu Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn 1100 1105 1110 gca gat tca cca aag gac cct gta ttg cca acc aaa ttt ttt aca 3617 Ala Asp Ser Pro Lys Asp Pro Val Leu Pro Thr Lys Phe Phe Thr 1115 1120 1125 caa cct gaa aag gat ttt tcc aat gac cgg aat tac att tca gaa 3662 Gln Pro Glu Lys Asp Phe Ser Asn Asp Arg Asn Tyr Ile Ser Glu 1130 1135 1140 gag aca aga gtt ctt ctt ttg aca gga aag cca aaa cca act ggt 3707 Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Thr Gly 1145 1150 1155 gtg tta gat aca gta aac aag cca ttg tct gca act gga agg aga 3752 Val Leu Asp Thr Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Arg 1160 1165 1170 ccg tat att aga act aca gga tca gag act gga agc aat atc agt 3797 Pro Tyr Ile Arg Thr Thr Gly Ser Glu Thr Gly Ser Asn Ile Ser 1175 1180 1185 gta aac tct gag ctg agc tct tct gca gga aac aga tca agg gaa 3842 Val Asn Ser Glu Leu Ser Ser Ser Ala Gly Asn Arg Ser Arg Glu 1190 1195 1200 caa agt tca gat ata tca gaa act ggt gtc agt gaa aac gat gaa 3887 Gln Ser Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Asp Glu 1205 1210 1215 aac cct gtg cga att att tca gtc aca cca gca aag aca gaa cct 3932 Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val Thr Pro Ala Lys Thr Glu Pro 1220 1225 1230 gtg aaa aat aag gaa att aat tct gac cag gct acg caa gga aac 3977 Val Lys Asn Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn 1235 1240 1245 agt act gaa cgt ggg aaa aaa aga aca gca aca gca tct gga act 4022 Ser Thr Glu Arg Gly Lys Lys Arg Thr Ala Thr Ala Ser Gly Thr 1250 1255 1260 gag aat att cat cag aaa gca gaa gaa aac aat gca gat gaa aca 4067 Glu Asn Ile His Gln Lys Ala Glu Glu Asn Asn Ala Asp Glu Thr 1265 1270 1275 gga cca tcg ctt gca gca aaa acc agg aga ggg cgt cca ccc aaa 4112 Gly Pro Ser Leu Ala Ala Lys Thr Arg Arg Gly Arg Pro Pro Lys 1280 1285 1290 cct gaa cct cag ggt acc act gca aaa aat gag gaa aca aat aag 4157 Pro Glu Pro Gln Gly Thr Thr Ala Lys Asn Glu Glu Thr Asn Lys 1295 1300 1305 cca cct gtc agg gga aga aaa agg gca gca gcc agt caa gaa agt 4202 Pro Pro Val Arg Gly Arg Lys Arg Ala Ala Ala Ser Gln Glu Ser 1310 1315 1320 cca ggg agt tta gag gca ggt aac gcc aaa gca cca aaa cag caa 4247 Pro Gly Ser Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Gln Gln 1325 1330 1335 gac aca gca aaa aag cca gca gca gca cag aga cag atc gat cta 4292 Asp Thr Ala Lys Lys Pro Ala Ala Ala Gln Arg Gln Ile Asp Leu 1340 1345 1350 caa agg taa aaagaaaact cactcgaaaa gggaggaaat gaaggccaaa 4341 Gln Arg 1355 taaaggcatg ctccaagctt ctgcaaaaac taggattcag aaatttcctg tacaggaact 4401 gaaattgctt caaaacacac agctttcagc tctgaaaaca gaaggaaaac tatgcttccc 4461 tttcacgtga aattaatcct tctcaatgga aatgtaaagc agaaactctt gagaaagagg 4521 ctaaaagcat ctgtacttat ttccccagag acttttttta tgaaaagtca ataattaagc 4581 aaattgctta acacttggtt ccagttcctg cattctggag tttaaaagtg tatttacacc 4641 attaattttc atgctgcatt ttcttttttt ttttaaagga agtcagaggg aggtccttac 4701 actgacactg aaaattcgcg atcctagagc caggtattcc catgttccac agaaaaagta 4761 gaagtctact gaatggattt taaataagac tagaaaaaaa aaaaaaaa 4809 <210> 12 <211> 1356 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 12 Met Leu His Leu Pro Glu Leu Arg Glu Arg Pro Val Glu Asp Cys Ala 1 5 10 15 Glu Gly Lys Phe Leu Ser Ser Gly Thr Arg Met Asp Phe Pro Ala Ala 20 25 30 Gln Pro Lys Pro Ala Ala Asp Gly Lys Ile Ile Tyr Tyr Pro Pro Gly 35 40 45 Val Lys Glu Thr Thr Asp Lys Ile Thr Asn Asp Glu Val Val Lys Arg 50 55 60 Leu Lys Met Val Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu 65 70 75 80 Asp Glu Lys Gln Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu 85 90 95 Phe Phe Leu Arg Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys 100 105 110 Cys Leu Ala Asp Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr 115 120 125 Ser His Asp Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu 130 135 140 Lys Gly Leu Glu Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu 165 170 175 Leu Glu Asp Cys Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe 180 185 190 Ser Val Ile Asn Asn Ser His Asn Gln Lys Val Gln Met His Met Leu 195 200 205 Asp Leu Met Ser Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu 210 215 220 Leu Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu 225 230 235 240 Asn Lys Gln Ala Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val 245 250 255 Gln Thr Ile Glu Pro Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val 260 265 270 Leu Gly Lys Ser Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu 275 280 285 Ile Leu Glu Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met 290 295 300 Pro Gln Leu Glu Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu 305 310 315 320 Ala Val Val Arg Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp 325 330 335 Leu Ala Thr Gln Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe 340 345 350 Asn Asp Ile His Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser 355 360 365 His Cys Leu Met Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr 370 375 380 Leu Lys Val Arg Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val 385 390 395 400 Ile Val Thr Ile Ile Thr Ala Gly Lys Arg Asp Leu Ser Leu Val Asn 405 410 415 Asp Gln Leu Leu Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp 420 425 430 Arg Val Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys 435 440 445 Tyr Cys Leu His Ala Glu Ala Gly Lys Asp Ala Ala Glu Lys Val Ser 450 455 460 Trp Ile Lys Asp Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp 465 470 475 480 Asp Lys Leu Leu Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His 485 490 495 Asn Leu Glu Thr Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala 500 505 510 Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys 515 520 525 Gln Asn Met Leu Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys 530 535 540 Gln Pro Thr Ser Glu Ala Asn Ser Ala Ala Met Phe Gly Lys Leu Met 545 550 555 560 Thr Ile Ala Lys Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val 565 570 575 Lys Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln 580 585 590 Leu Glu Leu Leu Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Val 595 600 605 Cys Val Arg Glu Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr 610 615 620 Asn Pro Phe Leu Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro 625 630 635 640 Val His Ile Asp Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn 645 650 655 Lys Ser Ile Glu Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro 660 665 670 Asp Thr Ala Ile Arg Ala Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe 675 680 685 Thr His Pro Thr Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu 690 695 700 Gln Cys Leu Arg Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln 705 710 715 720 Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile 725 730 735 Arg Ser Thr Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr 740 745 750 Pro His Gln Ala Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Ser 755 760 765 Asn Lys Glu Val Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser 770 775 780 Leu Asn Ala Asp Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu 785 790 795 800 Gly His Ile Ser Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys 805 810 815 Ser Val Val Ala Asn Phe Val Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg 820 825 830 Ser Thr Gly Glu Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val 835 840 845 Ser Pro Glu Val Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg 850 855 860 Trp Leu Leu Gly Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr 865 870 875 880 Leu Arg Leu Leu Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu 885 890 895 Gln Lys Arg Ile Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala 900 905 910 Gly Ser Ala Ile Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile 915 920 925 Ile Thr Pro Glu Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu 930 935 940 Cys Tyr Gln Val Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu 945 950 955 960 Val Lys Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys 965 970 975 Ala Lys Asp Pro Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu 980 985 990 Leu Lys Asn Ile Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met 995 1000 1005 Ala Asn Glu Lys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro 1010 1015 1020 Tyr Met Ile His Leu Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Lys Pro 1025 1030 1035 Gln Asp Val Asp Gln Leu Arg Asp Val Lys Glu Cys Leu Trp Phe 1040 1045 1050 Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala 1055 1060 1065 Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala 1070 1075 1080 Gln Ser Pro Asp Glu Pro Lys Ala Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val 1085 1090 1095 Cys Asp Val Ala Leu Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys 1100 1105 1110 Asn Ala Asp Ser Pro Lys Asp Pro Val Leu Pro Thr Lys Phe Phe 1115 1120 1125 Thr Gln Pro Glu Lys Asp Phe Ser Asn Asp Arg Asn Tyr Ile Ser 1130 1135 1140 Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Thr 1145 1150 1155 Gly Val Leu Asp Thr Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg 1160 1165 1170 Arg Pro Tyr Ile Arg Thr Thr Gly Ser Glu Thr Gly Ser Asn Ile 1175 1180 1185 Ser Val Asn Ser Glu Leu Ser Ser Ser Ala Gly Asn Arg Ser Arg 1190 1195 1200 Glu Gln Ser Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Asp 1205 1210 1215 Glu Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val Thr Pro Ala Lys Thr Glu 1220 1225 1230 Pro Val Lys Asn Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly 1235 1240 1245 Asn Ser Thr Glu Arg Gly Lys Lys Arg Thr Ala Thr Ala Ser Gly 1250 1255 1260 Thr Glu Asn Ile His Gln Lys Ala Glu Glu Asn Asn Ala Asp Glu 1265 1270 1275 Thr Gly Pro Ser Leu Ala Ala Lys Thr Arg Arg Gly Arg Pro Pro 1280 1285 1290 Lys Pro Glu Pro Gln Gly Thr Thr Ala Lys Asn Glu Glu Thr Asn 1295 1300 1305 Lys Pro Pro Val Arg Gly Arg Lys Arg Ala Ala Ala Ser Gln Glu 1310 1315 1320 Ser Pro Gly Ser Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Gln 1325 1330 1335 Gln Asp Thr Ala Lys Lys Pro Ala Ala Ala Gln Arg Gln Ile Asp 1340 1345 1350 Leu Gln Arg 1355 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T3 primer <400> 13 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 14 taatacgact cactatagg 19 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 15 aatagcatcg atgacaaact gttgg 25 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 16 ggtcaggcaa attctttgct atgg 24 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 17 gtaaggtggc tgttgggtat g 21 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 18 ggctagcagg tgaatcatgt atgg 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 19 acttctggta aggtggctgt tgg 23 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 20 gggctaggag gtgaatcatg tatgg 25 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 21 gggctgcttt taactctg 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 22 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gapdh primer <400> 23 cttcaccacc atggagaagg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gapdh primer <400> 24 tgaagtcgca ggagacaacc 20 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 25 atggacttca cgcagccgaa gcctgccact gcc 33 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 26 ttacctttgt aaatcaattt gtctctctgc tggaactgcc 40 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His Val 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser Ser Val 1 5 10 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Leu Gln Cys Cys Ser Ala Tyr Lys Leu 1 5 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 37 gcggccgcat ggacttcacc gcgcagccca agcc 34 <210> 38 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 38 ctcgagttac ctttgtaagt caatctgtct ctctgctggt actgc 45 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 39 gcggccgcat ggacttcacc gcgcagccc 29 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 40 ctcgagttac ctttgtaagt caatttgtc 29 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sense <400> 41 gcggccgcat ggacttcacg cagccgaagc c 31 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer antisense <400> 42 ctcgagttac ctttgtaaat caatttg 27 <210> 43 <211> 7190 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (541)..(4554) <223> <400> 43 ggccggcgga ggaaggggag ggagcgagga gcgcgcgctg ctctcgcgtg ctctcgcgcc 60 gctcgcgtga ccggccggtg tgtgcgcgag gccccggctc ccggggcacg gacggccggg 120 cgcgcgcctc tgcgaggggc gtccgggtcc gagtcggcgg tccgggccgg cgcgaggtgc 180 gtgcgggcgg gccgcggggg tcccggacgg acacaagcgc acacactccc ggaggagcct 240 tcgaggctgc tcttcctcgg ccagacggag agcggcactg tctccccgcc cagcgctcac 300 tcgccccgcg tctccccccg cggcggctgc tcctcctcgg caccgccagc cccagcgccg 360 ctcccgggcg ggcgggcggc ggcggcggcg gcggcgggac ccgcggagcc gctttgtgtg 420 cagcccgact aggggcggcg gcgcaaccac ctgacagagg cccgggcgct cgatgcacct 480 tccgcccgca tgaggaggag aggccggtag aggactgtga accaaaagtt gtcccccagg 540 atg gac ttc acc gcg cag ccc aag cct gcc act gcc ctc tgt ggc gtc 588 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val 1 5 10 15 gtg agt gcc gac ggg aag atc gct tac cct ccg ggg gta aaa gag atc 636 Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile 20 25 30 acc gac aag atc acc acg gac gag atg atc aaa cgc ctg aag atg gta 684 Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val 35 40 45 gtg aaa acc ttt atg gat atg gat cag gac tca gaa gat gaa aaa cag 732 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 cag tat ctc cca cta gcc ttg cat ctt gca tct gaa ttc ttc ctc agg 780 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 aac ccc aat aaa gat gtg cgt ctc ctt gta gca tgt tgt ttg gct gat 828 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 atc ttt cgt atc tat gcc cca gaa gct cca tat act tcc cat gat aaa 876 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys 100 105 110 ctt aag gac ata ttt ttg ttt att acc aga caa tta aaa ggt ttg gag 924 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 115 120 125 gat aca aag agt cca cag ttt aat aga tac ttt tat tta tta gag aat 972 Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn 130 135 140 tta gct tgg gtt aaa tca tat aac atc tgc ttt gaa ttg gaa gat tgc 1020 Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys 145 150 155 160 aat gaa att ttt att cag ctt ttt aga act ctc ttc tca gtg atc aac 1068 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 165 170 175 aat agc cac aat aag aag gta caa atg cac atg cta gat ttg atg agt 1116 Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser 180 185 190 tct atc atc atg gaa ggt gat gga gtt act caa gaa tta ttg gac tcc 1164 Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser 195 200 205 att ctt att aac ctc att cct gca cat aag aac tta aat aaa cag tcc 1212 Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 ttt gac ctt gca aaa gtg cta ttg aaa aga aca gtc cag act att gag 1260 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 gca tgc att gct aat ttt ttc aat caa gtc ctg gtg ctg gga aga tca 1308 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 tca gta agt gat ttg tca gaa cat gta ttt gat ctg att cag gaa ctt 1356 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 ttt gct ata gat cct cat tta tta tta tcc gtc atg cca cag ctt gaa 1404 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 ttc aaa cta aag agc aat gat gga gaa gag cga tta gct gtt gtt cga 1452 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 ctt cta gct aaa ttg ttt ggc tcc aaa gat tct gat ttg gca aca cag 1500 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 aat cgt cct ctt tgg caa tgt ttt ctt gga cga ttt aat gat att cat 1548 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 gtt cct gtg aga tta gaa agt gtg aaa ttt gcc agt cat tgt tta atg 1596 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 aat cac cca gat tta gcg aag gat ctc aca gaa tat tta aag gtt aga 1644 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg 355 360 365 tca cat gat cca gaa gaa gct att cgt cat gat gtc att gtt act ata 1692 Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile 370 375 380 ata aca gct gcc aag agg gac ctg gcc tta gta aat gat cag ctg ctt 1740 Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu 385 390 395 400 ggc ttt gta agg gaa aga aca ctg gat aaa cgg tgg cga gta aga aaa 1788 Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys 405 410 415 gaa gct atg atg ggt ctg gct cag ctt tat aag aaa tac tgt ctt cat 1836 Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His 420 425 430 ggt gaa gca gga aag gaa gct gca gag aaa gtc agc tgg ata aag gac 1884 Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp 435 440 445 aaa ctt ctg cat att tat tat cag aac agc att gac gac aaa ctg ttg 1932 Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu 450 455 460 gta gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtc ccc cac aac ctg gaa aca 1980 Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr 465 470 475 480 gaa gag aga atg aaa tgc tta tat tac tta tat gct agt ttg gat cca 2028 Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro 485 490 495 aat gct gta aaa gct ctc aac gaa atg tgg aag tgt cag aac atg ctt 2076 Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu 500 505 510 cgg agc cat gta cgc gaa cta ttg gat ttg cac aag cag cct aca tca 2124 Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser 515 520 525 gag gct aac tgt tct gcc atg ttt gga aaa ctg atg acc ata gca aag 2172 Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys 530 535 540 aat ttg cct gac ccc ggg aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa ttt aac 2220 Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn 545 550 555 560 cag gtt ctc ggc gat gat gag aaa ctt cgg tct cag ttg gag tta tta 2268 Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu 565 570 575 att agc cca acc tgt tct tgc aaa caa gca gat att tgt gtg aga gaa 2316 Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu 580 585 590 ata gcc cgg aaa ctt gca aat cct aag caa cca aca aat cct ttt cta 2364 Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu 595 600 605 gag atg gtc aaa ttt ctg ttg gaa aga atc gca cct gtg cac att gat 2412 Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp 610 615 620 tca gaa gcc ata agt gca cta gtg aaa ttg atg aat aag tca ata gag 2460 Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu 625 630 635 640 ggg aca gca gat gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct atc 2508 Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile 645 650 655 cgt tca gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttt aca cat cct acc 2556 Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr 660 665 670 tcg ttc cac tct gca gag aca tat gag tcc ttg tta cag tgc cta aga 2604 Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg 675 680 685 atg gag gat gac aag gta gca gaa gct gct att caa att ttt aga aat 2652 Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn 690 695 700 aca ggt cac aaa ata gaa aca gac ctt ccc cag ata cga tcg acc tta 2700 Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu 705 710 715 720 att ccc att tta cat caa aaa gca aag agg ggt act cca cac caa gca 2748 Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala 725 730 735 aaa cag gct gtg cac tgt ata cac gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc 2796 Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val 740 745 750 cag ctt gca cag att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gat 2844 Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp 755 760 765 gtg cca gaa caa ctt ata act cca tta gtt tca ttg ggc cac att tct 2892 Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser 770 775 780 atg tta gca cca gat cag ttt gct tcc cca atg aaa tct gta gta gca 2940 Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala 785 790 795 800 aat ttt att gtg aaa gat ctg cta atg aat gac agg tca aca ggt gaa 2988 Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu 805 810 815 aag aat gga aaa ctg tgg tct cca gat gaa gag gtt tcc cct gaa gta 3036 Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val 820 825 830 cta gca aag gta cag gca att aaa ctt ctg gta agg tgg ctg ttg ggt 3084 Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly 835 840 845 atg aaa aac aac cag tct aaa tct gcc aat tca acc ctt cgg tta tta 3132 Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu 850 855 860 tca gcg atg ttg gtt agt gag ggt gac ctg aca gag caa aag agg atc 3180 Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile 865 870 875 880 agt aaa tct gat atg tct cgc ttg cga tta gct gct ggt agt gcc ata 3228 Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile 885 890 895 atg aag ctt gct cag gaa cct tgt tac cat gaa att att acc cca gaa 3276 Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu 900 905 910 cag ttt cag ctc tgt gca ctt gtt att aat gat gag tgt tac caa gta 3324 Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val 915 920 925 agg cag ata ttt gct cag aag ctg cat aag gca ctt gtg aag tta ctg 3372 Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu 930 935 940 ctc cca ttg gag tat atg gcg atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct 3420 Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro 945 950 955 960 gtg aag gag aga aga gca cac gca cga caa tgt tta ctg aaa aat atc 3468 Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile 965 970 975 agt ata cgc agg gaa tac att aag cag aat cct atg gct act gag aaa 3516 Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys 980 985 990 tta tta tca ctg ttg cct gaa tat gta gtt cca tac atg att cac ctg 3564 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu 995 1000 1005 cta gcc cat gat cca gat ttt aca aga tca caa gat gtt gat cag 3609 Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln 1010 1015 1020 ctt cgt gat atc aaa gag tgc cta tgg ttc atg ctt gaa gtt tta 3654 Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu 1025 1030 1035 atg aca aag aat gaa aac aat agc cat gcc ttt atg aag aag atg 3699 Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met 1040 1045 1050 gca gag aac atc aag tta acc aga gat gcc cag tct cca gat gaa 3744 Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu 1055 1060 1065 tcc aag aca aat gaa aaa ctg tat aca gta tgt gat gtg gct ctc 3789 Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu 1070 1075 1080 tgt gtt ata aat agt aaa agt gct ttg tgc aat gca gat tca cca 3834 Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro 1085 1090 1095 aag gac cca gtc ctc cca atg aaa ttt ttt aca caa cct gaa aag 3879 Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys 1100 1105 1110 gac ttc tgt aac gat aag agt tat att tca gaa gag aca aga gta 3924 Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val 1115 1120 1125 ctt ctg tta aca gga aag cca aag cct gct gga gta cta ggt gca 3969 Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala 1130 1135 1140 gta aat aag cct tta tca gca acg gga agg aaa ccc tat gtt aga 4014 Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg 1145 1150 1155 agc act ggc act gag act gga agc aat att aat gta aat tca gag 4059 Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu 1160 1165 1170 ctg aac cct tca acc gga aat cga tca agg gaa cag agt tca gag 4104 Leu Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu 1175 1180 1185 gca gca gaa act gga gtt agt gaa aat gaa gag aac cct gtg agg 4149 Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg 1190 1195 1200 att att tca gtc aca cct gta aag aat att gac cca gta aag aat 4194 Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn 1205 1210 1215 aag gaa att aat tct gat cag gct acc cag ggc aac atc agc agt 4239 Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser 1220 1225 1230 gac cga gga aag aaa aga aca gta aca gca gct ggt gca gag aat 4284 Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn 1235 1240 1245 atc caa caa aaa aca gat gag aaa gta gat gaa tcg gga cct ccc 4329 Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro 1250 1255 1260 gcc cct tcc aaa ccc agg aga gga cgt cga ccc aag tct gaa tct 4374 Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser 1265 1270 1275 cag ggc aat gct acc aaa aat gat gat cta aat aaa cct att aac 4419 Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn 1280 1285 1290 aag gga agg aag aga gct gca gtg ggt cag gag agc cct ggg ggt 4464 Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly 1295 1300 1305 ttg gaa gca ggt aat gcc aaa gca ccc aaa ctg caa gat tta gcc 4509 Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala 1310 1315 1320 aaa aag gca gca cca gca gaa aga caa att gac tta caa agg taa 4554 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1325 1330 1335 aaatgcattt gcaaagggag aaaatgaagg ccaaacagaa gcaggctcca gcttctgcaa 4614 aaacttggat tcacaaatgt ccctgaacag aaaatgaagc tcacttcaga acacacactc 4674 tctgccttga aaactaaaga gactattact tccttttcac atgaccacaa gtcctctgat 4734 ggaaatgtac agcagaaact cttgagagag aggctaaaag caactctgtt ctcccccttc 4794 ccctagactt ttcttacgaa aagtcaataa ttaagcaaat tgcttaacac ttggttccag 4854 ttcctgccta tctggagttt aaatgcgtaa tacaccatta atttccacgc tgcagttttt 4914 attttaaaga aagtaacaag atgtctttac actgacactg aaaattcatc cattttagag 4974 ccaggaattc ccatgttaca caggaaaaaa tagaagtcta ctgaattaat tttttaaaag 5034 aaaagagatc agattaaata tttctttgtt tttccttttg gaaactttta tgtataattc 5094 tttctgcctg cctacttttc tgcaaaaatg agatgtacag atttcggttc cctgctatga 5154 aaagtgatgt ggtagcaatt ttataaatgt tgctttctga tttttatcag agtgagaaaa 5214 ttaaaattat tgatttgcaa gtagtaaaca gttcatattt tgatttcccc tcattttagt 5274 ttaatataat ttgcaataaa tgtacatatt gttgtttgtt tcataaagca tatcacttta 5334 aaatggtttt tactcctgtg attatgttgg aatatttgga attttaaagg agtaaagact 5394 gtccagcatt tggttttata atgtttgtca ccagattttt attaatgtaa aaaaaatcaa 5454 tttttaaaaa atagttggac tttggcagct tttaaggaaa gttggaggtg ttttaggatt 5514 gctatcaatt ttcagcattg tgctatttgg aaataagtgt tttgcttttg tctgatggtc 5574 tgggctcatt tttatgttta ttttagaaaa ctgttgcatc aatatattat gtttcttggc 5634 attgttcagc ataggtaatg tgtgcacttt atgtgtacac ataatcatat ttaagttttt 5694 tgcataaaat aaatgcttct agatgtcatg gcagtctttt taatcttttt atcatatgct 5754 ttcttgtgaa ttttttcatg ttaaagagct aaagtcataa catgattaca gtcaactctc 5814 cattatctat ataaaatagt gactaagcct caggttttta attttgtgat aacaaaataa 5874 cgaaggcatg taagacctga ttctggagga acatgaaatt tgtcttttct catgtccaga 5934 gttctatcct gcccccactg tccactgtag ggtcatccgc aaagccctag cagaatgtgc 5994 tcactccatt tccttacacg tttctagcat gggtcagagg aaacaacatt tgtgttataa 6054 cttcgtcttg ataggctgta gtgtacatgg gatgtaaaac aaacaagtgt atcaaaggtg 6114 gatgattctg ttagagtgaa gtttgagagt aaatgtcact tacgtttctc atagataatc 6174 aagagttggc tgtgtattga ctgaaagatg ggtaattatt ttaaatatgc atttacacac 6234 atttaggtat cagaagatgc ttagggaaca atggatacca atgatagaaa atgatacctt 6294 tacaggggca gaaaaatccc cactcttcct tattgcctct tcagaaccct ttagaaagta 6354 taaaatattg cctccaacat gctgaaaaag agtatctatg cataagtatc agagaagtcc 6414 ctcaagcaat cagtaggtgt gttctattta gagagagttt aaagttctct tagcatcaga 6474 caacttgatt cctaaggttt ccagtgtgtc accaacaaaa agtgcattga tagggacctt 6534 tgtctcttcc tccctttgat taattgcccg gcatcacagt ttactagatt accaagtgtt 6594 acatcatatt aaataaaatg tagcagaacc atctgcatca atatattcct gtttagattt 6654 ttgcaggaga gaagttaaaa ggatttgctc cttgtatgat gtaagtggcc caccccaatt 6714 ttgtaacatg atgcaagtgt ctggcactaa gggaagcaag agtagggttg tggaaagacc 6774 aagctgatgg ggagggactt gtttacggga atttttttag ttttcctttt caaaggaaaa 6834 cattaaaatc ccttaggaat ttggtattca catctcagag aactacaaca caaaagtgca 6894 gacttatatt tgagaattaa tgttaaccct ttgtgtctag tttgaagctt cttgtatttg 6954 tctaaaacaa caagccagaa ttttgtatct cctttgataa aaagtgtgta taatgtaaag 7014 tagttttgca tattcttgtg ctgcacatgg gctgaatttt taaatttttt ttaaaaactt 7074 gaagcagaac cttgtaattt gtgtaaatga caagtgtaaa atcctaccat aaaatgctaa 7134 aaatatgcac tgtttcaaat aaaaccaaga aatgcagcat taaaaaaaaa aaaaaa 7190 <210> 44 <211> 1337 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val 1 5 10 15 Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile 20 25 30 Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val 35 40 45 Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln 50 55 60 Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp 85 90 95 Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys 100 105 110 Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn 130 135 140 Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys 145 150 155 160 Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn 165 170 175 Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser 180 185 190 Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser 195 200 205 Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser 210 215 220 Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu 225 230 235 240 Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser 245 250 255 Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu 260 265 270 Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu 275 280 285 Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg 290 295 300 Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln 305 310 315 320 Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His 325 330 335 Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met 340 345 350 Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg 355 360 365 Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile 370 375 380 Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu 385 390 395 400 Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys 405 410 415 Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His 420 425 430 Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp 435 440 445 Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu 450 455 460 Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr 465 470 475 480 Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro 485 490 495 Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu 500 505 510 Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser 515 520 525 Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys 530 535 540 Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn 545 550 555 560 Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu 565 570 575 Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu 580 585 590 Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu 595 600 605 Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp 610 615 620 Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu 625 630 635 640 Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile 645 650 655 Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr 660 665 670 Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg 675 680 685 Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn 690 695 700 Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu 705 710 715 720 Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala 725 730 735 Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val 740 745 750 Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp 755 760 765 Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser 770 775 780 Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala 785 790 795 800 Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu 805 810 815 Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val 820 825 830 Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly 835 840 845 Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu 850 855 860 Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile 865 870 875 880 Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile 885 890 895 Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu 900 905 910 Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val 915 920 925 Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu 930 935 940 Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro 945 950 955 960 Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile 965 970 975 Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys 980 985 990 Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val Pro Tyr Met Ile His Leu 995 1000 1005 Leu Ala His Asp Pro Asp Phe Thr Arg Ser Gln Asp Val Asp Gln 1010 1015 1020 Leu Arg Asp Ile Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu 1025 1030 1035 Met Thr Lys Asn Glu Asn Asn Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met 1040 1045 1050 Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu 1055 1060 1065 Ser Lys Thr Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu 1070 1075 1080 Cys Val Ile Asn Ser Lys Ser Ala Leu Cys Asn Ala Asp Ser Pro 1085 1090 1095 Lys Asp Pro Val Leu Pro Met Lys Phe Phe Thr Gln Pro Glu Lys 1100 1105 1110 Asp Phe Cys Asn Asp Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val 1115 1120 1125 Leu Leu Leu Thr Gly Lys Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala 1130 1135 1140 Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly Arg Lys Pro Tyr Val Arg 1145 1150 1155 Ser Thr Gly Thr Glu Thr Gly Ser Asn Ile Asn Val Asn Ser Glu 1160 1165 1170 Leu Asn Pro Ser Thr Gly Asn Arg Ser Arg Glu Gln Ser Ser Glu 1175 1180 1185 Ala Ala Glu Thr Gly Val Ser Glu Asn Glu Glu Asn Pro Val Arg 1190 1195 1200 Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp Pro Val Lys Asn 1205 1210 1215 Lys Glu Ile Asn Ser Asp Gln Ala Thr Gln Gly Asn Ile Ser Ser 1220 1225 1230 Asp Arg Gly Lys Lys Arg Thr Val Thr Ala Ala Gly Ala Glu Asn 1235 1240 1245 Ile Gln Gln Lys Thr Asp Glu Lys Val Asp Glu Ser Gly Pro Pro 1250 1255 1260 Ala Pro Ser Lys Pro Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ser 1265 1270 1275 Gln Gly Asn Ala Thr Lys Asn Asp Asp Leu Asn Lys Pro Ile Asn 1280 1285 1290 Lys Gly Arg Lys Arg Ala Ala Val Gly Gln Glu Ser Pro Gly Gly 1295 1300 1305 Leu Glu Ala Gly Asn Ala Lys Ala Pro Lys Leu Gln Asp Leu Ala 1310 1315 1320 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Glu Arg Gln Ile Asp Leu Gln Arg 1325 1330 1335

Claims (16)

  1. 이하의 (a), (c) 및 (d) 중 어느 하나의 폴리펩티드류에서 선택되고 또한 면역 유도 활성을 갖는 적어도 1개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현가능한 재조합 벡터를 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
    (a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
    (c) 서열표의 서열번호 27∼35 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드.
    (d) 상기 (a) 및 (c) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하는 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 (a) 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드는 (c) 서열표의 서열번호 27∼35 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  7. 제 1 항, 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물의 암 예방용인 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  8. 제 1 항, 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물의 암 치료용인 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  9. 제 1 항, 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 PDS5A를 발현하는 암인 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  10. 제 1 항, 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 뇌종양, 식도암, 폐암, 신장암, 대장암, 항문주위선암, 신경아종 또는 백혈병인 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  11. 제 1 항, 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역증강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방용 또는 치료용인 면역 유도제.
  12. 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 포함하는 단리 항원 제시세포로서,
    상기 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 27∼35 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단리 항원 제시세포.
  13. 면역 유도 활성을 갖는 폴리펩티드와 MHC 분자의 복합체를 선택적으로 결합시키는 단리 T세포로서,
    상기 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 27∼35 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 단리 T세포.
  14. 서열표의 서열번호 27∼35 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 부분 서열로서 포함하고 또한 아미노산 잔기수가 10∼12개인 폴리펩티드로서:
    면역 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 생체로부터 분리된 시료에 있어서 서열표의 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 대한 항체를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 검출방법.
  16. 삭제
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