ES2364670T3 - Vacunas de péptidos para cánceres de pulmón que expresan polipéptidos ttk. - Google Patents
Vacunas de péptidos para cánceres de pulmón que expresan polipéptidos ttk. Download PDFInfo
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Abstract
Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Description
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de las ciencias biológicas, más específicamente al campo de terapia contra el cáncer. En particular, se desvelan nuevos péptidos que son extremadamente eficaces como vacunas contra el cáncer, y fármacos para tratar y prevenir tumores que contienen estos péptidos.
Técnica anterior
El cáncer de pulmón es uno de los tumores humanos más comunes y fatales. Se han referido muchas alteraciones genéticas asociadas con el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón. Los cambios genéticos pueden ayudar en los esfuerzos de pronóstico y las predicciones de riesgo de metástasis o respuesta a ciertos tratamientos. (Mitsudomi T y col., (2000) Clin Cancer Res 6: 4055-63; Niklinski y col., (2001) Lung Cancer. 34 Suppl 2: S53-8; Watine J. (2000) Bmj 320: 379-80). El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es con diferencia la forma más común de cáncer de pulmón, que supone casi el 80% de los tumores de pulmón (Society, A.C. Cancer Facts and Figures 2001, 2001). La tasa global de supervivencia a 10 años sigue siendo de solo el 10%, a pesar de los recientes avances en terapias de múltiples modalidades, porque la mayoría de los CPCNP no se diagnostican hasta fases avanzadas (Fry, W.A. y col., (1999) Cancer. 86: 1867-76). Aunque los regímenes de quimioterapia basados en platino se consideran estándares de referencia para el tratamiento de CPCNP, estos fármacos son capaces de prolongar la supervivencia de pacientes con CPCNP avanzado solo seis semanas aproximadamente (Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, (1995) BMJ. 311: 899-909). Se están investigando numerosas terapias diana para esta enfermedad, entre ellas inhibidores de la tirosina-cinasa; sin embargo, hasta la fecha se han obtenido resultados prometedores solo en un número limitado de pacientes y algunos receptores sufren reacciones adversas graves (Kris MG y col., (2002) Proc Am Soc Clin Oncol. 21: 292a(A1166)).
Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ reconocen péptidos de epítopos derivados de antígenos asociados a tumores (AAT) presentes en moléculas MHC de clase I, y lisan las células tumorales. Desde el descubrimiento de la familia MAGE como primer ejemplo de AAT, se han descubierto otros muchos AAT usando enfoques inmunológicos (Boon T. (1993) Int J Cancer 54: 177-80; Boon T. y col., (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen P y col., (1991) Science 254: 1643-47; Brichard V y col., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami Y y col., (1994) J Exp Med 180: 347-52). Algunos de ellos se encuentran ahora en desarrollo clínico como dianas de inmunoterapia. Entre los AAT descubiertos hasta ahora se incluyen MAGE (van der Bruggen P y col., (1991) Science
254: 1643-7), gp100 (Kawakami Y y col., (1994) J Exp Med 180: 347-52), SART (Shichijo S y col., (1998) J Exp Med 187:277-88), y NY-ESO-1 (Chen YT y col., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94: 1914-8). Por otra parte, algunos productos génicos mostraron estar sobreexpresados en cierta medida en las células tumorales que han demostrado ser reconocidas como dianas que inducen respuestas inmunitarias celulares. Entre estos productos génicos se incluyen p53 (Umano Y y col., (2001) Br J Cancer, 84:1052-7), HER2/neu (Tanaka H y col., (2001) Br Cancer, 84: 94-9), CEA (Nukaya I y col., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7) y similares.
A pesar del importante avance en la investigación básica y clínica relativa a los AAT (Rosenberg SA y col., (1998) Nature Med, 4: 321-7; Mukherji B. y col., (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92: 8078-82: Hu X y col., (1996) Cancer Res, 56: 2479-83), se dispone solo de un número muy limitado de ATT candidatos adecuados para el tratamiento de adenocarcinomas, como cáncer de pulmón. Los AAT que se expresan abundantemente en células cancerosas, y cuya expresión está limitada a células cancerosas, serían candidatos prometedores como dianas inmunoterapéuticas.
Se ha mostrado repetidamente en ensayos con liberación de 51Cr que las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) estimuladas por péptidos de ciertos donantes sanos producen niveles importantes de IFN- en respuesta al péptido, pero raramente ejercen citotoxicidad frente a células tumorales de una manera restringida por HLA-A24 o A0201 (Kawano K y col., (2000) Cancer Res 60: 3550-8; Nishizaka y col., (2000) Cancer Res 60: 4830-7; Tamura y col., (2001) Jpn J Cancer Res 92: 762-7). Sin embargo, HLA-A24 y HLA-A0201 son alelos HLA comunes en las poblaciones japonesa y caucásica (Date Y y col., (1996) Tissue Antigens 47: 93-101; Kondo A y col., (1995) J Immunol 155: 4307-12; Kubo RT y col., (1994) J Immunol 152: 3913-24; Imanishi y col., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams F y col., (1997) Tissue Antigen 49: 129). Así, los péptidos antigénicos de cánceres presentados por estos alelos HLA pueden ser especialmente útiles para el tratamiento de cánceres entre pacientes japoneses y caucásicos. Además, se sabe que la inducción de LTC de baja afinidad in vitro procede habitualmente del uso de péptido a una concentración elevada, lo que genera un alto nivel de complejos péptido/MHC específicos de células presentadoras de antígeno (CPA), que activarán eficazmente estos LTC (Alexander-Miller y col., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7).
Desarrollos recientes en tecnologías de micromatriz de ADNc han permitido las construcciones de perfiles extensos de expresión génica de células malignas en comparación con células normales (Okabe, H. y col., (2001) Cancer Res., 61, 2129-37; Lin YM y col., (2002) Oncogene, 21; 4120-8; Hasegawa S. y col., (2002) Cancer Res 62:7012-7). Este enfoque permite una comprensión de la naturaleza compleja de las células cancerosas y de los mecanismos de la carcinogenia y facilita la identificación de genes cuya expresión está desregulada en tumores (Bienz M. y col., (2000) Cell 103, 311-320). Entre los transcritos identificados como regulados por incremento comúnmente en cánceres de pulmón, TTK (proteincinasa TTK; Acceso GenBank nº NM_003318; SEQ ID NO: 1, 2) es de especial interés, al estar regulado por incremento específicamente en células tumorales de los tejidos de cáncer de pulmón en más del 80% de los casos analizados. En cambio, el análisis de transferencia Northern mostró que estos productos génicos no se encuentran en órganos vitales normales (véase el documento WO-2004/031.413, cuyo contenido completo se incorpora como referencia en la presente memoria descriptiva). Así, los péptidos inmunógenos obtenidos de TTK pueden encontrar utilidad en células tumorales citolíticas que expresan estos antígenos. La presente descripción aborda estas y otras necesidades.
Resumen de la invención
Un gen, TTK (proteincinasa TTK) se ha identificado como regulado por incremento en cáncer de pulmón. Los genes se identificaron usando perfiles de expresión génica con una micromatriz de ADNc del genoma completo que contenía 23.040 genes. Según se expone anteriormente, la expresión de TTK está regulada específicamente por incremento en células tumorales en más del 80% de los pacientes con cáncer de pulmón todavía ausente en otros órganos vitales normales.
La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de péptidos de epítopos de los productos génicos del gen (TTK) que provocan linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos de las moléculas correspondientes. Según se expone en detalle más adelante, se estimularon Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) de donante sano usando péptidos candidatos de unión a HLA-A*2402 obtenidos de TTK. A continuación se establecieron clones LTC con citotoxicidad específica frente a las células diana positivas de HLA-A24 pulsadas con cada uno de los péptidos candidatos. El análisis ulterior de los clones LTC mostró la potente actividad citotóxica no solo frente a las células diana pulsadas con péptidos, sino también a células tumorales que expresan endógenamente TTK. Además, un ensayo de inhibición de diana fría y un ensayo de bloqueo de anticuerpos revelaron que los clones de células LTC reconocieron específicamente el complejo peptídico MHC de clase I. Estos resultados demuestran que estos péptidos son péptidos de epítopos con restricción de HLA-A24 que pueden inducir respuestas inmunitarias potentes y específicas frente a células de cáncer de pulmón que expresan TTK.
En consecuencia, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido TTK para su uso en el tratamiento o prevención de cáncer de pulmón. La inmunidad antitumoral es inducida por la administración de estos polipéptidos. Así, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende polipéptidos TTK para su uso en la inducción de inmunidad antitumoral.
Estos y otros objetos y características de la descripción se harán evidentes de forma más completa cuando se lea la siguiente descripción detallada en conjunción con las figuras y ejemplos que la acompañan.
Breve descripción de los dibujos
Todas las figuras que no están dirigidas al polipéptido de SEQ ID NO: 8 se muestran únicamente con fines ilustrativos.
La fig. 1 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por TTK-567 tiene citotoxicidad específica del péptido. Específicamente, el clon LTC demostró una alta actividad citotóxica frente a células diana (A24LCL) pulsadas con TTK-567, mientras que no mostró actividad citotóxica significativa frente a las mismas células diana (A24LCL) no pulsadas con péptidos;
La fig. 2 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por URLC10-177 tiene citotoxicidad específica del péptido. Específicamente, el clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a células diana (A24LCL) pulsadas con URLC10-177, mientras que no mostró actividad citotóxica importante frente a las mismas células diana (A24LCL) no pulsadas con péptidos;
La fig. 3 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por KOC1-508 tiene citotoxicidad específica del péptido. Específicamente, el clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a células diana (A24LCL) pulsadas con KOC1-508, mientras que no mostró actividad citotóxica importante frente a las mismas células diana (A24LCL) no pulsadas con péptidos;
La fig. 4 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por TTK-567 reconoce y lisa células tumorales que expresan endógenamente TTK en una forma restringida por HLA. La actividad citotóxica frente a células TE1, que expresan endógenamente TTK y HLA-A24, se sometió a ensayo usando como células efectoras los clones LTC obtenidos por TTK-567. Se usaron células PC9 como células diana que expresan endógenamente TTK pero no expresan HLA-A24. El clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a células TE1 que expresan TTK y HLA-A24. Por otra parte, no mostró actividad citotóxica significativa frente a células PC9 que expresan TTK pero no HLA-A24;
La fig. 5 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por URLC10-177 reconoce y lisa células tumorales que expresan endógenamente URLC10 en una forma restringida por HLA. La actividad citotóxica frente a células TE1, que expresan endógenamente URLC10 y HLA-A24, se sometió a ensayo usando como células efectoras el clon LTC obtenido por URLC10-177. Se usaron células TE13 como células diana que expresan endógenamente URLC10 pero no expresan HLA-A24. El clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a células TE1 que expresan URLC10 y HLA-A24. Por otra parte, no mostró actividad citotóxica significativa frente a células TE13 que expresan URLC10, pero no HLA-A24;
La fig. 6 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por KOC1-508 reconoce y lisa las células tumorales que expresan endógenamente KOC1 en una forma restringida por HLA. La actividad citotóxica frente a células TE1, que expresan endógenamente KOC1 y HLA-A24, se sometió a ensayo usando como células efectoras el clon LTC obtenido por KOC1-508. Se usaron células PC9 como células diana que expresan endógenamente KOC1 pero no expresan HLA-A24. El clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a células TE1 que expresan KOC1 y HLA-A24. Por otra parte, no mostró actividad citotóxica significativa frente a células PC9 que expresan KOC1, pero no HLAA24;
La fig. 7 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por TTK-567 reconoce específicamente TTK-567 de una manera restringida por HLA-A24. Se prepararon células TE1 marcadas por Na251CrO4 como diana caliente, mientras que se usaron células A24LCL pulsadas con péptido TTK-567 como diana fría (Inhibidor). La relación E/T se fijó en 20. La actividad citotóxica de clon LTC TTK-567 frente a células TE1 se inhibió mediante la adición de células A24LCL pulsadas con el péptido idéntico;
La fig. 8 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por URLC10-177 reconoce específicamente URLC10 de una manera restringida por HLA-A24. Se prepararon células TE1 marcadas por Na251CrO4 como diana caliente, mientras que se usaron células A24LCL pulsadas con péptido URLC10-177 como diana fría (Inhibidor). La relación E/T se fijó en 20. La actividad citotóxica de clon LTC URLC10-177 frente a células TE1 se inhibió mediante la adición de células A24LCL pulsadas con el péptido idéntico;
La fig. 9 es un gráfico que muestra que el clon LTC obtenido por KOC1-508 reconoce específicamente KOC1 de una manera restringida por HLA-A24. Se prepararon células TE1 marcadas por Na251CrO4 como diana caliente, mientras que se usaron células A24LCL pulsadas con péptido KOC1-508 como diana fría (Inhibidor). La relación E/T se fijó en
20. La actividad citotóxica de clon LTC KOC1-508 frente a células TE1 se inhibió mediante la adición de células A24LCL pulsadas con el péptido idéntico;
La fig. 10 es un gráfico que muestra que la actividad citotóxica del clon LTC obtenido por TTK-567 está bloqueada específicamente por anticuerpos que reconocen los antígenos de superficie de linfocitos T de HLA de clase I o CD8. La especificidad de citotoxicidad del clon LTC se confirmó mediante un ensayo de bloqueo de anticuerpos. Las células TE1 se cocultivaron con anticuerpos monoclonales respectivamente, y se usaron como diana. La actividad de LTC se bloqueó claramente con la adición de anticuerpos que reconocen HLA de Clase I o CD8 y estuvo afectada marginalmente por la adición de anticuerpos a HLA de Clase II o CD4; sin embargo, no se inhibió en absoluto por la adición de un anticuerpo de control de isotipo correspondiente;
La fig. 11 es un gráfico que muestra que la actividad citotóxica del clon LTC obtenido por URLC10-177 está bloqueada específicamente por anticuerpos que reconocen los antígenos de superficie de linfocitos T de HLA de clase I o CD8. La especificidad de citotoxicidad del clon LTC se confirmó mediante un ensayo de bloqueo de anticuerpos. Las células TE1 se cocultivaron con anticuerpos monoclonales respectivamente, y se usaron como diana. La actividad de LTC se bloqueó claramente con la adición de anticuerpos que reconocen HLA de Clase I o CD8 y estuvo afectada marginalmente por la adición de anticuerpos a HLA de Clase II o CD4; sin embargo, no se inhibió en absoluto por la adición de un anticuerpo de control de isotipo correspondiente;
La fig. 12 es un gráfico que muestra que la actividad citotóxica del clon LTC obtenido por KOC1-508 está bloqueada específicamente por anticuerpos que reconocen los antígenos de superficie de linfocitos T de HLA de clase I o CD8. La especificidad de citotoxicidad del clon LTC se confirmó mediante un ensayo de bloqueo de anticuerpos. Las células TE1 se cocultivaron con anticuerpos monoclonales respectivamente, y se usaron como diana. La actividad de LTC se bloqueó claramente con la adición de anticuerpos que reconocen HLA de Clase I o CD8 y estuvo afectada marginalmente por la adición de anticuerpos a HLA de Clase II o CD4; sin embargo, no se inhibió en absoluto por la adición de un anticuerpo de control de isotipo correspondiente.
Descripción detallada de la invención
Las palabras “un”, “una”, “el” y “la” según se usan en la presente memoria descriptiva significan “al menos uno” salvo que se indique específicamente lo contrario.
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la invención.
La identificación de nuevos AAT, en particular los que inducen respuestas antitumorales potentes y específicas, merece un desarrollo ulterior de la aplicación clínica de la estrategia de vacunación con péptidos en diversos tipos de cáncer (Boon T y col., (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen P y col., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard V y col., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami Y y col., (1994) J Exp Med 180: 347-52; Shichijo S y col., (1998) J Exp Med 187:277-88; Chen YT y col., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94: 1914-8; Harris CC, (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-5; Butterfield LH y col., (1999) Cancer Res 59:3134-42; Vissers JL y col., (1999) Cancer Res 59: 5554-9; van der Burg SH y col., (1996) J. Immunol. 156:3308-14; Tanaka F y col., (1997) Cancer Res 57:4465-8; Fujie T y col., (1999) Int J Cancer 80:169-72; Kikuchi M y col., (1999) Int J Cancer 81: 459-66; Oiso M y col., (1999) Int J Cancer 81:387-94). Según se observó anteriormente, TTK se identificó previamente como sobreexpresado en cáncer de pulmón usando tecnologías de micromatriz de ADNc. Según se expone en el documento WO-2004/031.413, TTK codifica un dominio S_TKc. La proteína codificada por el gen TTK fosforila proteínas en serina, treonina y tirosina, con dicha fosforilación asociada probablemente con proliferación celular (Mills GB y col., (1992) J Biol Chem 267: 16000-6; Schmandt R y col., (1994) J. Immunol; 152(1):96-105; Stucke VM y col., (2002) EMBO J; 21(7):1723-32).
Experimentos previos demostraron que TTK estaba sobreexpresado en cáncer de pulmón y muestra expresión mínima en tejidos normales. Además, estos genes revelaron tener una función importante relacionada con proliferación celular (véase el documento WO-2004/031.413).
Los péptidos obtenidos de TTK demuestran ser epítopos de AAT restringidos por HLA-A24, un alelo HLA encontrado comúnmente en las poblaciones japonesas y caucásicas. Específicamente, usando sus afinidades de unión a HLAA24, se identificaron candidatos de péptidos de unión HLA-A24 obtenidos de TTK. Después de la estimulación in vitro de linfocitos T por células dendríticas (CD) cargados con estos péptidos, los LTC se establecieron con éxito usando TTK-567 (SYRNEIAYL (SEQ ID NO: 8)). Estos LTC mostraron una potente actividad citotóxica frente a las células A24LCL pulsadas con péptidos. Además, los clones LTC obtenidos a partir de estas células mostraron también citotoxicidad específica frente a líneas celulares de carcinoma de pulmón positivas a HLA-A24 que sobreexpresan endógenamente TTK. Sin embargo, estos clones LTC no mostraron actividad citotóxica frente a líneas celulares que carecen de expresión de HLA-A24 o de AAT diana. Las actividades citotóxicas específicas de estos clones LTC se inhibieron significativamente por la diana fría. Estos resultados demuestran que TTK es útil como AAT de células de cáncer de pulmón y que TTK-567 es un péptido de epítopo restringido por HLA-A24. Como este antígeno está sobreexpresado en la mayoría de los cánceres de pulmón y se asocia con proliferación de células tumorales, encuentra utilidad como diana inmunoterapéutica contra cánceres de pulmón.
En consecuencia, la presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido inmunógeno de menos de 15 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer de pulmón. Alternativamente, el péptido inmunógeno puede comprender una secuencia de SEQ ID NO: 8 en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, borrados o añadidos, siempre que la variante peptídica resultante conserve la actividad inmunógena (es decir, la capacidad de inducir LTC específicos de células de cáncer de pulmón). El número de residuos que se sustituirán, borrarán o añadirán es generalmente de 5 aminoácidos o menos, preferentemente 4 aminoácidos o menos, más preferentemente 3 aminoácidos o menos, más preferentemente todavía uno o dos aminoácidos.
Se ha sabido que las variantes peptídicas (es decir, péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos modificada por sustitución, deleción o adición de uno, dos o más residuos de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos original) conservan la actividad biológica original (Mark DF y col., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6; Zoller MJ y Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G y col., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13). En el contexto de la presente invención, la modificación de aminoácidos produce la conservación de las propiedades de la cadena lateral de aminoácidos original (un procedimiento conocido como sustitución de aminoácidos conservadora). Algunos ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos son aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); un grupo hidroxilo que contiene cadena lateral (S, T, Y); un átomo de azufre que contiene cadena lateral (C, M); un ácido carboxílico y una amida que contiene cadena lateral (D, N, E, Q); una base que contiene cadena lateral (R, K, H); y una sustancia aromática que contiene cadena lateral (H, F, Y, W). Obsérvese que las letras entre paréntesis indican los códigos de una letra de los aminoácidos.
El péptido inmunógeno es un nonapéptido (nonámero) o un decapéptido (decámero).
Adicionalmente se desvela una composición farmacéutica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma (es decir, que incluye 1 o 2 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos) para su uso en la inducción de inmunidad antitumoral de cáncer de pulmón.
En el contexto de la presente invención, el sujeto es preferentemente un mamífero. Entre los mamíferos de ejemplo se incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca.
El péptido puede administrarse a un sujeto in vivo o ex vivo. Además, también se desvela el uso de un nonapéptido seleccionado a partir del péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (y variantes de la misma) para fabricar una composición inmunógena para tratar o prevenir cáncer de pulmón.
El análisis de homología de TTK-567 muestra que no tiene homología significativa con los péptidos obtenidos de cualquier producto génico humano conocido. En consecuencia, la posibilidad de respuestas inmunitarias desconocidas o no deseables con inmunoterapia contra estas moléculas se reduce significativamente.
En relación con antígenos HLA, el uso de un tipo A-24 que tiene una expresión elevada entre la población japonesa es favorable para obtener resultados eficaces, y el uso de subtipos, como A-2402, es todavía más preferible. Normalmente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investiga con antelación, lo que permite la selección apropiada de péptidos que tienen altos niveles de afinidad de unión a este antígeno, o que tienen inducibilidad de linfocitos T citotóxicos (LTC) por presentación de antígenos. Además, con el fin de obtener péptidos que muestran alta afinidad de unión e inducibilidad de LTC, puede realizarse sustitución, deleción o adición de 1 o 2 aminoácidos basándose en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial TTK de ocurrencia natural.
Adicionalmente, además de los péptidos que se muestran naturalmente, dado que la regularidad de las secuencias de péptidos mostrados por unión a antígenos HLA ya es conocida (Kubo R T, y col., (1994) J. Immunol., 152, 391324; Rammensee HG y col., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, y col., (1995) J. Immunol. 155:4307-12), pueden realizarse modificaciones basadas en dicha regularidad en los péptidos inmunógenos de la invención. Por ejemplo, los péptidos que muestran alta afinidad de unión a HLA-24 en los que el segundo aminoácido del extremo N sustituidos con fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano puede usarse favorablemente. Análogamente, también pueden usarse favorablemente los péptidos cuyo aminoácido en el extremo C está sustituido por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.
Sin embargo, cuando la secuencia de péptidos es idéntica a una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína endógena o exógena que tiene una función diferente, pueden inducirse efectos secundarios como trastornos autoinmunes o síntomas alérgicos contra sustancias específicas. Por tanto, es preferible evitar la situación en la que la secuencia inmunógena se corresponde con la secuencia de aminoácidos de una proteína conocida. Esta situación puede evitarse realizando una búsqueda de homología mediante el uso de bases de datos disponibles. Si las búsquedas de homología confirman que los péptidos de 1 o 2 aminoácidos no existen, entonces puede evitarse el peligro de modificaciones de la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente que, por ejemplo, aumentan la afinidad de unión con antígenos HLA, y/o aumento de la inducibilidad de LTC.
Aunque se espera que los péptidos que tienen alta afinidad de unión a los antígenos HLA según se describe anteriormente tengan una alta eficacia como vacunas contra el cáncer, los péptidos candidatos, que se seleccionan según la presencia de alta afinidad de unión como indicador, deben examinarse en relación con la presencia real de inducibilidad de LTC. La inducibilidad de LTC puede confirmarse mediante la inducción de células presentadoras de antígeno que llevan antígenos MHC humanos (por ejemplo, linfocitos B, macrófagos y células dendríticas), o más específicamente células dendríticas obtenidas de leucocitos de sangre periférica humana, y, después de estimulación con el péptido de interés, mezclando con células positivas para CD8 y midiendo la actividad citotóxica contra las células diana. Como sistema de reacción, pueden usarse animales transgénicos producidos para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, los descritos en BenMohamed L, y col., (2000) Hum. Immunol; 61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout). Por ejemplo, las células diana pueden ser radiomarcadas con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica puede calcularse a partir de la radioactividad liberada de las células diana. Alternativamente, puede examinarse midiendo el IFN- producido y liberado por LTC en presencia de células presentadoras de antígeno que transportan péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en el soporte usando anticuerpos monoclonales anti-IFN-.
Como consecuencia del examen de la inducibilidad de LTC de péptidos según se describe anteriormente, se descubrió que los péptidos que tienen alta afinidad de unión a un antígeno HLA no tenían necesariamente alta inducibilidad. Sin embargo, los nonapéptidos o decapéptidos seleccionados a partir de péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos indicadas por SYRNEIAYL (SEQ ID NO: 8) mostraron una inducibilidad de LTC especialmente alta.
Según se observa anteriormente, se desvelan péptidos que tienen inducibilidad de linfocitos T citotóxicos, en concreto los que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma (es decir, aquellos en los que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, borrados o añadidos). Es preferible que la secuencia de aminoácidos comprenda 9 aminoácidos indicados en SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma no se corresponda con una secuencia de aminoácidos asociada con otra proteína endógena. En particular, la sustitución de aminoácidos a fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano en el segundo aminoácido desde el extremo N, y a fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina en el aminoácido del extremo C, y la adición de aminoácidos de 1 o 2 aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C son ejemplos favorables.
Los péptidos pueden prepararse usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden prepararse sintéticamente, usando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse individualmente o como polipéptidos más largos que comprenden dos péptidos o más. Los péptidos son preferentemente aislados, es decir, están sustancialmente libres de otras proteínas de células hospedadoras de ocurrencia natural y fragmentos de las mismas.
Los péptidos de la presente invención pueden contener modificaciones, como glicosilación, oxidación de cadena lateral o fosforilación; en la medida en que las modificaciones no destruyan la actividad biológica de los péptidos según se describe en la presente memoria descriptiva. Entre otras modificaciones se incluye la incorporación de Daminoácidos u otros miméticos de aminoácidos que pueden usarse, por ejemplo, para incrementar la vida media en suero de los péptidos.
Los péptidos pueden prepararse como una combinación, que comprende dos o más de los péptidos de la invención, para su uso como una vacuna contra el cáncer que pueden inducir LTC in vivo. Los péptidos pueden estar en un cóctel o pueden conjugarse entre sí usando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos pueden expresarse como una única secuencia de polipéptidos. Los péptidos en la combinación pueden ser iguales o diferentes. Al administrar los péptidos de esta invención, los péptidos se presentan en una densidad elevada en los antígenos HLA de células presentadoras de antígeno, lo que, a su vez, induce LTC que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido mostrado y el antígeno HLA. Alternativamente, las células presentadoras de antígeno que tienen inmovilizados los péptidos de esta invención en su superficie celular, obtenidas eliminando células dendríticas de los sujetos, pueden ser estimuladas por los péptidos de esta invención. La readministración de estas células en los sujetos respectivos induce LTC, y, en consecuencia, la agresividad hacia las células diana puede incrementarse.
Más específicamente, se desvelan fármacos para tratar tumores o prevenir la proliferación, metástasis y dichos tumores, que comprenden uno o más de los péptidos de esta invención. Los péptidos de esta invención encuentran utilidad particular en el tratamiento de tumores, como cáncer de pulmón.
Los péptidos pueden administrarse a un sujeto directamente, como una composición farmacéutica que ha sido formulada por procedimientos convencionales de formulación. En dichos casos, además de los péptidos de esta invención, pueden incluirse vehículos, excipientes y similares que se usan corrientemente en fármacos según resulte apropiado, sin limitaciones particulares. Las composiciones inmunógenas de esta descripción pueden usarse para el tratamiento y la prevención de diversos tumores, entre ellos cánceres de pulmón.
Las composiciones inmunógenas para tratamiento y/o prevención de tumores, que comprenden como ingrediente activo uno o más péptidos de la presente invención, pueden incluir además un adyuvante de manera que la inmunidad celular se establecerá con eficacia. Alternativamente, pueden administrarse con otros ingredientes activos, como agentes antitumorales. Entre las formulaciones adecuadas se incluyen gránulos. Se describen adyuvantes adecuados en la literatura especializada (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89). Entre los adyuvantes ilustrativos se incluyen, pero no se limitan a, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y alumbre. Además, pueden usarse convenientemente formulaciones de liposomas, formulaciones granulares en las que el fármaco está unido a perlas de algunos m de diámetro, y formulaciones en las que un lípido está unido al péptido. El procedimiento de administración puede ser oral, intradérmico, subcutáneo, inyección intravenosa, o similares, y puede incluir administración sistémica o administración local en la proximidad del tumor diana. La dosis del o de los péptidos de esta invención puede ajustarse apropiadamente según la enfermedad que se tratará, la edad del paciente, el peso, el procedimiento de administración, y similares. Aunque la dosificación es comúnmente de 0,001 mg a 1.000 mg, preferentemente de 0,01 mg a 100 mg, más preferentemente 0,1 mg a 10 mg, administrados preferentemente una vez en unos días o unos meses, el experto en la materia puede seleccionar fácilmente la dosis y el procedimiento de administración apropiados, ya que la selección y la optimización de estos parámetros están comprendidos en la técnica rutinaria.
Se desvelan también vesículas intracelulares llamadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de esta invención y antígenos HLA en su superficie. Los exosomas pueden prepararse, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en detalle en la Traducción Japonesa Publicada de las Publicaciones Internacionales nº Hei 11-510.507 y 2000-512.161, y se preparan preferentemente usando células presentadoras de antígeno obtenidas de sujetos que son diana para el tratamiento y/o prevención. Los exosomas pueden inocularse como vacunas contra el cáncer, de modo similar a los péptidos de esta invención.
El tipo de antígenos HLA usados debe corresponderse con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, a menudo es apropiado HLA-A24, especialmente HLA-A2402.
Las composiciones de vacunas incluyen un componente que ceba linfocitos T citotóxicos. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de cebar LTC in vivo frente a antígenos víricos. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico pueden fijarse a los grupos -y -amino de un residuo de lisina y a continuación unirse a un péptido inmunógeno de la invención. El péptido lipidado puede administrarse a continuación directamente, en una micela o partícula, incorporarse en un liposoma o emulsionarse en un adyuvante. Como otro ejemplo de cebado de lípidos de respuestas LTC, pueden usarse lipoproteínas de E. coli, como tripalmitoíl-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS), para cebar LTC cuando se unen de forma covalente a un péptido apropiado (véase, por ejemplo, Deres K, y col., (1989) Nature 342:561-4).
Las composiciones inmunógenas pueden comprender también ácidos nucleicos que codifican uno o más de los péptidos inmunógenos desvelados aquí. Véase, por ejemplo, Wolff JA y col., (1990) Science 247:1465-8; patentes de EE.UU. nº 5.580.859; 5.589.466; 5.804.566; 5.739.118; 5.736.524; 5.679.647; y el documento WO-98/04.720. Entre los ejemplos de tecnologías de suministro basadas en ADN se incluyen “ADN desnudo”, suministro facilitado (bupivicaína, polímeros, mediado por péptidos), complejos de lípidos catiónicos y suministro mediado por partículas (“cañón de genes”) o mediado por presión (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.922.687).
Los péptidos inmunógenos pueden expresarse también por vectores víricos o bacterianos. Entre los ejemplos de vectores de expresión adecuados se incluyen hospedadores víricos atenuados, como vaccinia o viruela aviar. Este enfoque implica el uso de virus de vaccinia, por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. Tras la introducción en un hospedador, el virus de vaccinia recombinante expresa el péptido inmunógeno, y con ello desencadena una respuesta inmune. Se describen vectores de vaccinia y los procedimientos útiles en protocolos de inmunización, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.722.848. Otro vector adecuado es BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en Stover CK, y col., (1991) Nature 351:456-60. En la técnica se conoce una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización como, por ejemplo, vectores de adenovirus y asociados a adenovirus, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de carbunco destoxificada, y similares. Véase, por ejemplo, Shata MT y col., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ y Weiner DB y col., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; y Hipp JD y col., (2000) In Vivo 14:571-85.
Se desvelan también procedimientos de inducción de células presentadoras de antígeno usando uno o más péptidos de esta invención. Las células presentadoras de antígeno pueden ser inducidas por inducción de células dendríticas a partir de monocitos de sangre periférica y, a continuación, por la puesta en contacto (estimulación) de las mismas con uno o más péptidos de esta invención in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando se administran péptidos a los sujetos, se inducen células presentadoras de antígeno que tienen los péptidos inmovilizados en ellas en el cuerpo del sujeto. Alternativamente, después de inmovilizar los péptidos de esta invención en las células presentadoras de antígeno, las células pueden administrarse al sujeto como una vacuna.
Se desvela también un procedimiento para inducir células presentadoras de antígeno que tienen un alto nivel de inducibilidad de linfocitos T citotóxicos, en el que el procedimiento comprende la etapa de transferencia de genes que comprenden polinucleótido(s) que codifican uno o más péptidos de esta invención a células presentadoras de antígeno in vitro. Los genes introducidos pueden estar en la forma de ADN o ARN. Para el procedimiento de introducción, sin limitaciones especiales, pueden usarse de forma adecuada varios procedimientos realizados convencionalmente en este campo, como lipofección, electroporación y procedimiento de fosfato de calcio. Más específicamente, la transfección puede realizarse según se describe en Reeves ME y col., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH y col., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, y col., (1996) J. Exp. Med., 184:465-72; la Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional nº 2000-509.281. Mediante la transferencia del gen en células presentadoras de antígeno, el gen experimenta transcripción, traducción y similares en la célula, y a continuación la proteína obtenida se procesa mediante MHC de Clase I o Clase II, y pasa a través de una vía de presentación hasta los péptidos parciales presentes.
También se desvelan procedimientos para inducir LTC usando uno o más péptidos de esta invención. Cuando los péptidos de esta descripción se administran a un sujeto, se inducen LTC en el cuerpo del sujeto, y con ello se potencia la fortaleza del sistema inmunitario dirigido a las células de cáncer de pulmón en los tejidos tumorales. Alternativamente, los péptidos pueden usarse en el contexto de un procedimiento terapéutico ex vivo, en el que las células presentadoras de antígeno obtenidas del sujeto y las células positivas para CD8 o leucocitos mononucleares de sangre periférica se ponen en contacto (estimulan) con uno o más péptidos de esta invención in vitro, y, después de inducir LTC, las células se devuelven al sujeto. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender las etapas de:
a: recogida de células presentadoras de antígeno a partir de un sujeto,
b: puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno de la etapa a con un péptido de la presente invención,
c: mezclado de las células presentadoras de antígeno de la etapa b con linfocitos T CD8+ y cocultivo de manera que se induzcan linfocitos T citotóxicos, y
d: recogida de linfocitos T CD8+ del cocultivo de la etapa c.
Los linfocitos T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenidos por la etapa d pueden administrarse al sujeto como una vacuna.
Se desvelan también linfocitos T citotóxicos aislados inducidos usando los péptidos de esta invención. Los linfocitos T citotóxicos, inducidos por estimulación con una célula presentadora de antígeno que presenta uno o más péptidos de esta invención, se obtienen preferentemente de sujetos que son la diana del tratamiento y/o la prevención, y pueden administrarse en solitario o en combinación con otros fármacos, incluidos uno o más péptidos de esta invención o exosomas que tienen actividad antitumoral. Los linfocitos T citotóxicos obtenidos actúan específicamente frente a células diana que presentan los péptidos de esta invención, o preferentemente el o los mismos péptidos usados para inducción. Las células diana pueden ser células que expresan TTK endógenamente, o células que experimentan transfección con genes TTK. Las células que presentan los péptidos de esta invención en la superficie celular, debido a estimulación con estos péptidos, también pueden convertirse en objetivos de ataque.
Se desvelan también células presentadoras de antígeno que presentan complejos formados entre antígenos HLA y uno o más péptidos de esta invención. Las células presentadoras de antígeno, obtenidas a través del contacto con los péptidos de esta invención o los nucleótidos que codifican dichos péptidos, se obtienen preferentemente de sujetos que son la diana del tratamiento y/o prevención, y pueden administrarse como vacunas, en solitario o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos, exosomas o linfocitos T citotóxicos de la presente descripción.
El término “vacuna” (también referido como una composición inmunógena) se refiere a una sustancia que induce inmunidad antitumoral o suprime el cáncer de pulmón después de su inoculación en animales. Según la presente invención, se sugirió que los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 eran péptidos de epítopos con restricción HLA-A24 que pueden inducir una respuesta inmunitaria potente y específica frente a células de cáncer de pulmón que expresan TTK. Se desvela también un procedimiento de inducción de inmunidad antitumoral que usa polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma (es decir, incluyendo 1 o 2 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos). En general, la inmunidad antitumoral incluye respuestas inmunitarias como las siguientes:
-inducción de linfocitos citotóxicos contra tumores que comprenden células que expresan TTK, -inducción de anticuerpos que reconocen tumores que comprenden células que expresan TTK, e -inducción de producción de citocinas antitumorales.
Por tanto, cuando un cierto péptido induce una cualquiera de estas respuestas inmunitarias tras la inoculación en un animal, se decide que el péptido tiene un efecto inductor de inmunidad antitumoral. La inducción de la inmunidad antitumoral por un péptido puede detectarse observando in vivo o in vitro la respuesta del sistema inmunitario en el hospedador frente al péptido.
Por ejemplo, se conoce bien un procedimiento para detectar la inducción de linfocitos T citotóxicos. Una sustancia extraña que entra en el cuerpo vivo se presenta a los linfocitos T y los linfocitos B por la acción de células presentadoras de antígeno (CPA). Los linfocitos T que responden al antígeno presentado por CPA de forma específica del antígeno se diferencian en células T citotóxicas (también referidas como linfocitos T citotóxicos o LTC) debido a la estimulación por el antígeno, y después experimentan proliferación; este procedimiento se refiere en la presente memoria descriptiva como “activación” de linfocitos T. Por tanto, la inducción de LTC por un cierto péptido puede evaluarse mediante la presentación del péptido a un linfocito T por CPA, y la detección de la inducción de LTC. Además, las CPA tienen el efecto de activar linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, macrófagos, eosinófilos y células NK. Como los linfocitos T CD4+ son importantes también en la inmunidad antitumoral, la inmunidad antitumoral que induce la acción del péptido puede evaluarse usando el efecto de activación de estas células como indicadores.
En la técnica es bien conocido un procedimiento para evaluar la acción de inducción de LTC usando células dendríticas (CD) como CPA. La CD es una CPA representativa que tiene la acción más intensa de inducción de LTC entre las CPA. En este procedimiento, el polipéptido de prueba se pone en contacto inicialmente con CD y a continuación esta CD se pone en contacto con linfocitos T. La detección de linfocitos T que tienen efectos citotóxicos contra las células de interés después del contacto con CD muestra que el polipéptido de prueba tiene una actividad de inducción de los linfocitos T citotóxicos. La actividad de LTC contra tumores puede detectarse, por ejemplo, usando la lisis de células tumorales marcadas con 51Cr como indicador. Alternativamente, se sabe bien evaluar el grado de daño de células tumorales usando actividad de captación de 3H-timidina o liberación de LDH (lactosa deshidrogenasa) como indicador.
Aparte de CD, pueden usarse también células mononucleares de sangre periférica (CMSP) como CPA. Se ha comunicado que la inducción de LTC se potencia mediante el cultivo de CMSP en presencia de GM-CSF e IL-4. Análogamente, se ha demostrado que los LTC se inducen mediante el cultivo de CMSP en presencia de hemocianina de lapa (KLH) e IL-7.
Los polipéptidos de prueba que confirmaron poseer actividad de inducción de LTC por estos procedimientos son polipéptidos que tienen efecto de activación de CD y actividad ulterior de inducción de LTC. Por tanto, los polipéptidos que inducen LTC frente a células tumorales son útiles como vacunas contra el cáncer de pulmón. Además, las CPA que han adquirido la capacidad de inducir LTC frente al cáncer de pulmón mediante la puesta en contacto con los polipéptidos son útiles como vacunas contra el cáncer de pulmón. Además, las LTC que han adquirido citotoxicidad debido a la presentación de antígenos del polipéptido por CPA pueden usarse también como vacunas contra el cáncer de pulmón. Dichos procedimientos terapéuticos para el cáncer de pulmón, que usan inmunidad antitumoral debida a CPA y LTC, se refieren como inmunoterapia celular.
Generalmente, cuando se usa un polipéptido para inmunoterapia celular, la eficacia de la inducción de LTC puede incrementarse combinando una pluralidad de polipéptidos que tienen diferentes estructuras y poniéndolos en contacto con CD. Por tanto, cuando se estimulan CD con fragmentos de proteínas, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.
La inducción de inmunidad antitumoral por un polipéptido puede confirmarse adicionalmente observando la inducción de la producción de anticuerpos contra tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos contra un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y cuando el crecimiento, la proliferación y/o la metástasis de células tumorales se suprimen por dichos anticuerpos, se determina que el polipéptido induce inmunidad antitumoral.
La inmunidad antitumoral puede inducirse administrando una vacuna de esta invención, y la inducción de inmunidad antitumoral permite el tratamiento y prevención de cáncer de pulmón. La terapia o la prevención de la aparición de cáncer de pulmón pueden incluir la inhibición del crecimiento de células de cáncer de pulmón, la involución de células de cáncer de pulmón y la supresión de la ocurrencia de células de cáncer de pulmón. La disminución de la mortalidad de individuos que tienen cáncer de pulmón, la disminución de marcadores de cáncer de pulmón en la sangre, el alivio de síntomas detectables que acompañan al cáncer de pulmón y similares se incluyen también en la terapia o prevención de cáncer de pulmón. Dichos efectos terapéuticos y preventivos son preferentemente estadísticamente significativos, por ejemplo, observados con un nivel de significación del 5% o menos, en los que el efecto terapéutico o preventivo de una vacuna contra el cáncer de pulmón se compara con un control sin administración de vacuna. Por ejemplo, pueden usarse la prueba t de Student, la prueba U de Mann-Whitney o ANOVA para determinar la significación estadística.
El péptido mencionado anteriormente, que tiene actividad inmunológica, o un polinucleótido o vector que codifica dicho péptido, puede combinarse con un adyuvante. Un adyuvante se refiere a un compuesto que mejora la respuesta inmunitaria contra el péptido cuando se administra de manera conjunta (o sucesiva) con el péptido que tiene actividad inmunológica. Entre los ejemplos de adyuvantes adecuados se incluyen toxina del cólera, toxina de salmonella, alumbre y similares, pero no se limitan a estos. Además, una vacuna de esta invención puede combinarse apropiadamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de estos vehículos son agua esterilizada, suero salino fisiológico, tampón de fosfato, fluido de cultivo y similares. Además, la vacuna puede contener, cuando sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares. La vacuna se administra de forma sistémica o local. La administración de la vacuna puede realizarse mediante administración única o con recuerdos con administraciones múltiples.
Cuando se usa CPA o LTC como vacuna de esta invención, el cáncer de pulmón puede tratarse o prevenirse, por ejemplo, mediante el procedimiento ex vivo. Más específicamente, las CMSP del sujeto que recibe tratamiento o prevención son recogidas, en contacto ex vivo con un péptido de la presente invención. Después de la inducción de CPA o LTC, es posible administrar las células al sujeto. La CPA puede inducirse también introduciendo un vector que codifica el péptido en CMSP ex vivo. La CPA o LTC inducida in vitro puede clonarse antes de la administración. Al clonar y hacer crecer células que tienen alta actividad para dañar las células diana, la inmunoterapia celular puede realizarse con más eficacia. Además, las CPA y los LTC aislados de esta manera pueden usarse para inmunoterapia celular no solo contra personas de las que se obtienen las células, sino también contra tipos similares de enfermedades en otras personas.
En los siguientes ejemplos se describen aspectos de la presente invención, que se ofrecen solo para ilustrar la presente invención y para ayudar al experto en la materia a preparar y usar la misma.
Aunque en la práctica o la prueba de la presente invención pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria descriptiva, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados.
Ejemplos
La presente invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos, pero no está limitada a ellos.
Materiales y métodos
Líneas celulares
Las células A24LCL (HLA-A24/24) y las líneas celulares EHM (HLA-A3/3), de linfoblastoide B humano, fueron obsequios generosos recibidos de Takara Shuzo Co, Ltd. (Otsu, Japón). Las células A24LCL se usaron para ensayos de citotoxicidad mediados por péptidos. Las líneas celulares de carcinoma de pulmón TE1 (HLA-A2402+), TE13 (HLA-A2402−) y PC9 (HLA-A2402−) fueron adquiridas en ATCC. Los niveles de expresión de TTK, URLC10 y KOC1 en las líneas celulares de carcinoma de pulmón se determinaron mediante micromatriz de ADNc y RT-PCR que revelaron una intensa expresión de los tres genes en TE1, expresión de TTK y KOC1 en PC9 y expresión de URLC10 en TE13 (datos no mostrados).
Selección de candidatos de péptidos obtenidos de TTK, URLC10 y KOC1
Se predijeron péptidos nonámeros y decámeros obtenidos de TTK, URLC10 o KOC1 que se unen a la molécula HLA-A24 mediante el software de predicción de unión “BIMAS” (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, y col., (1994) J. Immunol; 152(1):163-75; Kuzushima K, y col., (2001) Blood; 98(6):1872-81). Estos péptidos fueron sintetizados por Mimotopes (San Diego, LA) según el procedimiento estándar de síntesis de fase sólida y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. La pureza (> 90%) y la identidad de los péptidos se determinaron por HPLC analítica y análisis de espectrometría de masas, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml y se almacenaron a −80° C.
Inducción de LTC in vitro
Se usaron células dendríticas (CD) obtenidas de monocitos como células presentadoras de antígeno (CPA) para inducir respuestas de LTC frente a péptidos presentados en HLA. Las CD se generaron in vitro según se describe en otra parte (Nukaya I y col., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7., Tsai V y col., (1997) J. Immunol. 158:1796-802). Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) aisladas a partir de un voluntario normal (HLAA*2402) por solución de Ficoll-Paque (Pharmacia) se separaron por adherencia a un matraz de cultivo tisular de plástico (Becton Dickinson) de manera que los enriquezcan para la fracción de monocitos. La población enriquecida con monocitos se puso en cultivo en presencia de 1.000 U/ml de GM-CSF (proporcionado por Kirin Brewery Company) y 1.000 U/ml de IL-4 (Genzyme) en AIM-V (Invitrogen) que contenía suero autólogo (SA) inactivado por calor al 2%. Después de 7 días en el cultivo, las CD generadas por citocinas fueron pulsadas con 20 g/ml de péptidos de unión a HLA-A24 en presencia de 3 g/ml de 2-microglobulina durante 4 h a 20°C en AIM-V. A continuación, estas CD pulsadas con péptidos se sometieron a irradiación (5.500 rad) y se mezclaron en una proporción de 1:20 con linfocitos T CD8+ autólogos, obtenidos por selección positiva con Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) y DETACHa BEAD™ (Dynal). Estos cultivos se colocaron en placas de 48 pocillos (Corning); cada pocillo contenía 1,5 x 104 CD pulsadas con péptidos, 3 x 105 linfocitos T CD8+ y 10 ng/ml de IL-7 (Genzyme) en 0,5 ml de AIM-V/SA al 2%. Tres días más tarde, estos cultivos se suplementaron con IL-2 (CHIRON) hasta una concentración final de 20 UI/ml. En los días 7 y 14, los linfocitos T se reestimularon adicionalmente con las CD pulsadas con péptidos autólogas. Las CD se prepararon cada vez de la misma forma descrita anteriormente. Se sometió a ensayo la citotoxicidad frente a células A24LCL pulsadas con péptidos después de la 3ª ronda de estimulación con péptidos el día 21.
Procedimiento de expansión de LTC
Los LTC se expandieron en cultivo usando el procedimiento similar al descrito por Riddell SR, y col., (Walter EA y col., (1995) N Engl J Med 333:1038-44, Riddel y col., (1996) Nature Med. 2:216-23). Se resuspendió un total 5 x 104 de LTC en 25 ml de AIM-V/SA al 5% con 25 x 106 CMSP irradiadas (3.300 rad) y 5 x 106 células EHM irradiadas
(8.000 rad) en presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de iniciar los cultivos, se añadieron 120 UI/ml de IL-2 a los cultivos. Los cultivos se nutrieron con AIM-V/SA al 5% nuevo que contenía 30 UI/ml de IL-2 en los días 5, 8 y 11.
Establecimiento de clones LTC
Se prepararon las diluciones para tener 0,3, 1 y 3 LTC/pocillo en 96 placas de microvaloración de fondo redondo (Nalge Nunc International). Se cultivaron los LTC con 7 x 104 células/pocillo de CMSP alogénicas, 1 x 104 células/pocillo de EHM, 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en total de 150 l/pocillo de AIM-V que contenía SA al 5%. Se añadieron 50 l/pocillo de IL-2 al medio 10 días después, de manera que IL-2 pasó a tener 125 U/ml en la concentración final. Se sometió a ensayo la actividad citotóxica de los LTC en el día 14º, y los clones LTC se expandieron usando el mismo procedimiento anterior.
Ensayo de citotoxicidad
Las células diana se marcaron con 100 Ci de Na251CrO4 durante 1 h a 37°C en una incubadora de CO2 (Perkin Elmer Life Sciences). Las dianas pulsadas con péptidos se prepararon incubando las células con 20 m/ml del péptido durante 16 h a 37°C antes del marcado. Las células diana marcadas se lavaron y se mezclaron con células efectoras en un volumen final de 0,2 ml en placas de microvaloración de fondo redondo. Las placas se centrifugaron (4 minutos a 800 x g) para aumentar el contacto entre células y se colocaron en una incubadora de CO2 a 37°C. Después de 4 h de incubación, se recogieron 0,1 ml del sobrenadante de cada pocillo y se determinó la radioactividad con un contador gamma.
El porcentaje de citotoxicidad específica se determinó calculando el porcentaje de liberación de 51Cr específica mediante la fórmula siguiente:
{(cpm de la liberación de la muestra de prueba − cpm de la liberación espontánea)/(cpm de la liberación máxima − cpm de la liberación espontánea)} x 100.
La liberación espontánea se determinó incubando las células diana en solitario, en ausencia de células efectoras, y la liberación máxima se obtuvo incubando las células diana con HCl 1 N. Todas las medidas se realizaron en duplicado, y los errores típicos de las medias estuvieron consistentemente por debajo del 10% del valor de la media.
La especificidad de los antígenos se confirmó mediante el ensayo de inhibición de diana fría, que usó células A24LCL sin marcar que fueron pulsadas con o sin péptido (20 m/ml durante 16 h a 37°C) para competir por el reconocimiento de las células tumorales marcadas con 51Cr.
Se realizó el ensayo de bloqueo de citotoxicidad mediante el uso de los anticuerpos monoclonales (AcM) (AcM antiMHC-clase I de ratón, AcM anti-MHC-clase II, AcM anti-CD8 y AcM anti-CD4) para confirmar la forma de restricción de HLA. Los AcM de IgG1 antirratón, IgG2a antirratón se usaron como Isotipo.
Resultados
Predicción de péptidos de unión HLA-A24 obtenidos de TTK, URLC10 o KOC1
La Tabla 1 muestra los péptidos de unión HLA-A*2402 para TTK (Acceso GenBank nº NM_003318; SEQ ID NO: 1, 2) en orden de afinidad de unión. La Tabla 1A muestra péptidos nonámeros obtenidos de TTK y la Tabla 1B muestra péptidos decámeros obtenidos de TTK. La Tabla 2 muestra los péptidos de unión HLA-A*2402 para URLC10 (Acceso GenBank nº AB105187; SEQ ID NO: 3, 4) en orden de afinidad de unión. La Tabla 2A muestra péptidos nonámeros obtenidos de URLC10 y la Tabla 2B muestra péptidos decámeros obtenidos de URLC10. La Tabla 3 muestra los péptidos de unión HLA-A*2402 para KOC1 (Acceso GenBank nº NM_006547; SEQ ID NO: 5, 6) en orden de afinidad de unión. La Tabla 3A muestra péptidos nonámeros obtenidos de KOC1 y la Tabla 3B muestra péptidos decámeros obtenidos de KOC1.
Tabla 1A Péptidos de unión nonámeros HLA-A24 obtenidos de TTK
- Posición de inicio
- Secuencia de aminoácidos SED ID NO: Puntuación de unión Posición de inicio Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Puntuación de unión
- 90
- RYSQAIEAL 7 400 71 KLEKNSVPL 17 12
- 567
- SYRNEIAYL 8 200 201 KNLSASTVL 18 12 N.R
- 549
- IYAIKYVNL 9 200 467 RTPVVKNDF 19 10,1 N.R
- 590
- DYEITDQYI 10 90 102 KYGQNESFA 20 10 N.R
- 652
- NFLIVDGML 11 42 19 KVRDIKNKF 21 8,9 N.R
- 141
- KFAFVHISF 12 28 777 KQRISIPEL 22 8,8 N.R
- 214
- SFSGSLGHL 13 20 75 NSVPLSDAL 23 8,6 N.R
- 28
- KNEDLTDEL 14 19 605 GNIDLNSWL 24 8,6 N.R
- 111
- RIQVRFAEL 15 15,8 596 QYIYMVMEC 25 8,3 N.R
- 108
- SFARIQVRF 16 14 535 GSSKVFQVL 26 8,1 N.R
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N de TTK. La puntuación de unión se obtiene de “BIMAS” descrito en Materiales y métodos.
N.R. indica “no realizado”
5 Tabla 1B Péptidos de unión decámeros HLA-A24 obtenidos de TTK
- Posición de inicio
- Secuencia de aminoácidos SED ID NO: Puntuación de unión Posición de inicio Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Puntuación de unión
- 810
- KYVLGQLVGL 27 600 168 KAVERGAVPL 37 14,4
- 725
- YYMTYGKTPF 28 150 232 RGQTTKARFL 38 12
- 598
- IYMVMECGNI 29 75 185 RNLNLQKKQL 39 12
- 728
- TYGKTPFQQI 30 72 777 KQRISIPELL 40 11,2
- 755
- EFPDIPEKDL 31 36 573 AYLNKLQQHS 41 10,8
- 490
- CFQQQQHQIL 32 36 373 EYQEPEVPES 42 9,9
- 143
- AFVHISFAQF 33 18 74 KNSVPLSDAL 43 9,6
- 569
- RNEIAYLNKL 34 15,8 315 KPSGNDSCEL 44 8,8
- 359
- KTESSLLAKL 35 15,8 61 NPEDWLSLLL 45 8,6
- 553
- KYVNLEEADN 36 15 763 DLQDVLKCCL 46 8,6
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N de TTK. La puntuación de unión se obtiene de “BIMAS” descrito en Materiales y métodos.
10 Tabla 2A Péptidos de unión nonámeros HLA-A24 obtenidos de URLC10
- Posición de inicio
- Secuencia de aminoácidos SED ID NO: Puntuación de unión Posición de inicio Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Puntuación de unión
- *154
- KPEEKRFLL 47 14,4 193 EYAGSMGES 57 5,5 N.R
- *48
- RADPPWAPL 48 9,6 168 FFYLKCCKI 58 5,5 N.R
- *205
- LWLAILLLL 49 8,4 128 AAVKIFPRF 59 5 N.R
- *57
- GTMALLALL 50 7,2 58 TMALLALLL 60 4,8 N.R
- *203
- GGLWLAILL 51 7,2 152 RPKPEEKRF 61 4,8 N.R
- *62
- LALLLVVAL 52 7,2 197 SMGESCGGL 62 4,8 N.R
- *53
- WAPLGTMAL 53 6 173 CCKIRYCNL 63 4 N.R
- *214
- ASIAAGLSL 54 6 28 DPGRGARRL 64 4 N.R
- *54
- APLGTMALL 55 6 31 RGARRLRRF 65 4 N.R
- *212
- LLASIAAGL 56 5,6 N.R 202 CGGLWLAIL 66 4 N.R
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N de URLC10. La puntuación de unión se obtiene de “BIMAS” descrito en Materiales y métodos.
N.R. indica “no realizado”
Tabla 2B Péptidos de unión decámeros HLA-A24 obtenidos de URLC10
- Posición de inicio
- Secuencia de aminoácidos SED ID NO: Puntuación de unión Posición de inicio Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Puntuación de unión
- *177
- RYCNLEGPPI 67 100 196 GSMGESCGGL 77 6 N.R
- *159
- RFLLEEPMPF 68 30 204 GLWLAILLLL 78 5,6 N.R
- *152
- RPKPEEKRFL 69 9,6 123 PYCVIAAVKI 79 5,5 N.R
- *211
- LLLASIAAGL 70 8,4 193 EYAGSMGESC 80 5 N.R
- *172
- KCCKIRYCNL 71 8 61 LLALLLVVAL 81 4,8 N.S
- *169
- FYLKCCKIRY 72 7,5 202 CGGLWLAILL 82 4,8 N.R
- *57
- GTMALLALLL 73 7,2 56 LGTMALLALL 83 4,8 N.R
- *53
- WAPLGTMALL 74 6 70 LPRVWTDANL 84 4 N.R
- *203
- GGLWLAILLL 75 6 N.R 201 SCGGLWLAIL 85 4 N.R
- *198
- MGESCGGLWL 76 6 N.R 213 LASIAAGLSL 86 4 N.R
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N de URLC10.
La puntuación de unión se obtiene de “BIMAS” descrito en Materiales y métodos.
N.R. indica “no realizado”. N.S. indica “no sintetizado”
5 Tabla 3A Péptidos de unión nonámeros HLA-A24 obtenidos de KOC1
- Posición de inicio
- Secuencia de aminoácidos SED ID NO: Puntuación de unión Posición de inicio Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Puntuación de unión
- *350
- SYENDIASM 87 37,5 4 LYIGNLSEN 97 8,25
- *141
- GFQLENFTL 88 30 423 KQGQHIKQL 98 8 N.R
- *508
- KTVNELQNL 89 14,4 561 KQHQQQKAL 99 8 N.R
- *26
- KIPVSGPFL 90 12 310 ITISPLQEL 100 7,9 N.R
- *192
- KPCDLPLRL 91 11,5 470 IYGKIKEEN 101 7,7 N.R
- *433
- RFAGASIKI 92 11 356 ASMNLQAHL 102 7,2 N.R
- *505
- KGGKTVNEL 93 10,6 93 QWEVLDSLL 103 7,2 N.R
- *190
- KQKPCDLPL 94 9,6 43 DCPDESWAL 104 7,2 N.R
- *152
- AYIPDEMAA 95 9 92 LQWEVLDSL 105 6,7 N.R
- *320
- LYNPERTIT 96 9 55 EALSGKIEL 106 6,6 N.R
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N de KOC1. La puntuación de unión se obtiene de “BIMAS” descrito en Materiales y métodos.
N.R. indica “no realizado”
10 Tabla 3B Péptidos de unión decámeros HLA-A24 obtenidos de KOC1
- Posición de inicio
- Secuencia de aminoácidos SED ID NO: Puntuación de unión Posición de inicio Secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: Puntuación de unión
- *470
- IYGKIKEENF 107 100 91 HLQWEVLDSL 117 8,4 N.R
- *272
- KFTEEIPLKI 108 18,5 359 NLQAHLIPGL 118 7,2 N.R
- *290
- RLIGKEGRNL 109 12 364 LIPGLNLNAL 119 7,2 N.R
- *309
- KITISPLQEL 110 10,6 165 LQQPRGRRGL 120 7,2 N.R
- *350
- SYENDIASMN 111 10,5 273 FTEEIPLKIL 121 7,2 N.R
- *192
- KPCDLPLRLL 112 9,6 406 ETVHLFIPAL 122 6 N.R
- *320
- LYNPERTITV 113 9 N.R 138 KLNGFQLENF 123 6 N.R
- *4
- LYIGNLSENA 114 9 N.R 9 LSENAAPSDL 124 6 N.R
- *548
- VAQRKIQEIL 115 8,4 N.R 88 IPPHLQWEVL 125 6 N.R
- *83
- LQIRNIPPHL 116 8,4 N.R 127 SSKDQARQAL 126 5,7 N.R
La posición de inicio indica el número de aminoácido desde el extremo N de KOC1. La puntuación de unión se obtiene de “BIMAS” descrito en Materiales ymétodos.
N.R. indica “no realizado”
Estimulación de los linfocitos T usando los péptidos predichos
Los LTC para los péptidos obtenidos de TTK, URLC10 o KOC1 se generaron de la manera descrita en la sección “Materiales y métodos” anterior. Los LTC resultantes que mostraron actividad citotóxica detectable se expandieron, y se establecieron los clones LTC que mostraron actividades citotóxicas elevadas frente a la diana pulsada con péptido en comparación con las actividades frente a diana pulsada sin péptido.
Los clones LTC estimulados por los péptidos de unión HLA-A24 TTK-567 (SYRNEIAYL (SEQ ID NO: 8)) (fig. 1), URLC10-177 (RYCNLEGPPI (SEQ ID NO: 67)) (fig. 2) o por KOC1-508 (KTVNELQNL (SEQ ID NO: 89)) (fig. 3) mostraron una actividad citotóxica potente frente a la diana pulsada con péptido sin mostrar ninguna actividad citotóxica significativa frente a dianas no pulsadas con ningún péptido.
Actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer de pulmón que expresan endógenamente TTK, URLC10 o KOC1
Se examinó la capacidad de los clones LTC establecidos descritos para reconocer y destruir células tumorales que expresan endógenamente TTK, URLC10 o KOC1. La actividad citotóxica contra células TE1, que expresan endógenamente TTK y HLA-A24, se sometió a ensayo usando como células efectoras el clon LTC obtenido por TTK
567. Se usaron células PC9 como las células diana que expresan endógenamente TTK pero no HLA-A24. El clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a las células TE1 que expresan TTK y HLA-A24. Por otra parte, no mostró actividad citotóxica significativa frente a las células PC9 que expresan TTK pero no HLA-A24 (fig. 4). La actividad citotóxica frente a las células TE1, que expresan endógenamente URLC10 y HLA-A24, se sometió a ensayo usando como células efectoras el clon LTC obtenido por URLC10-177. Se usaron células TE13 como células diana que expresan endógenamente URLC10 pero no HLA-A24. El clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a las células TE1 que expresan URLC10 y HLA-A24. Por otra parte, no mostró actividad citotóxica significativa frente a las células TE13 que expresan URLC10 pero no HLA-A24 (fig. 5). La actividad citotóxica frente a las células TE1, que expresan endógenamente KOC1 y HLA-A24, se sometió a ensayo usando como células efectoras el clon LTC obtenido por KOC1-508. Las células PC9 se usaron como células diana que expresan endógenamente KOC1 pero no HLA-A24. El clon LTC mostró alta actividad citotóxica frente a las células TE1 que expresan KOC1 y HLA-A24. Por otra parte, no mostró actividad citotóxica significativa frente a las células PC9 que expresan KOC1 pero no HLAA24 (fig. 6).
Los clones LTC descritos anteriormente mostraron una potente actividad citotóxica frente a la línea celular de cáncer de pulmón TE1, una línea celular que expresa TTK, URLC10 y KOC1, y HLA-A24. Por otra parte, los clones LTC frente a TTK-567 o KOC1-508 no mostraron actividad citotóxica contra la línea celular de cáncer de pulmón PC9, una línea celular que expresa TTK y KOC1 pero no HLA-A24; análogamente, el clon LTC obtenido contra URLC10177 no mostró una actividad citotóxica frente a la línea celular de cáncer de pulmón TE13, una línea celular que expresa URLC10 pero no HLA-A24. Estos clones LTC no muestran tampoco actividad citotóxica contra células A24LCL, células que expresan HLA-A24, pero no expresan TTK, URLC10 o KOC1 (fig. 1, 2 y 3). Estos resultados demuestran claramente que TTK-567, URLC10-177 y KOC1-508 se expresaron naturalmente en la superficie de células tumorales con molécula HLA-A24 y reconocieron LTC.
Ensayo de inhibición de diana fría
El ensayo de inhibición de diana fría se realizó para confirmar la especificidad de los clones LTC según se describe en la sección de “Materiales y métodos” anterior. Las células TE1 marcadas por Na251CrO4 se prepararon como diana caliente, mientras que las células A24LCL pulsadas con péptido TTK-567 se usaron como diana fría (Inhibidor). La actividad citotóxica del clon LTC TTK-567 frente a células TE1 fue inhibida específicamente por la adición de células A24LCL pulsadas con el péptido idéntico (fig. 7). Con respecto a URLC10, las células TE1 marcadas por Na251CrO4 se prepararon como diana caliente, mientras que las células A24LCL pulsadas con péptido URLC10-177 se usaron como diana fría (Inhibidor). La actividad citotóxica del clon LTC URLC10-177 frente a TE1 fue inhibida específicamente por la adición de células A24LCL pulsadas con el péptido idéntico (fig. 8). Como antes, las células TE1 marcadas por Na251CrO4 se prepararon como diana caliente, mientras que se usaron células A24LCL pulsadas con péptido KOC1-508 como diana fría (Inhibidor). La relación E/T se fijó en 20. La actividad citotóxica del clon LTC KOC1-508 frente a células TE1 fue inhibida específicamente por la adición de células A24LCL pulsadas con el péptido idéntico (fig. 9). La citotoxicidad específica frente a células TE1 diana fue inhibida significativamente cuando se añadió diana fría pulsada con péptido en el ensayo en diversas proporciones pero no se inhibió en absoluto mediante la adición de diana fría. Estos resultados se indicaron como un porcentaje de inhibición de lisis específica en la relación E/T de 20.
Bloqueo de actividad LTC por anticuerpos que se unen a antígenos de superficie de linfocitos T
Para ver si la actividad destructiva observada está mediada por los linfocitos T citotóxicos, se investigaron los efectos de los anticuerpos en las actividades de destrucción, en las que se usaron anticuerpos que reconocen antígenos de superficie de linfocitos T relacionados con la función de LTC. Las actividades de LTC se bloquearon claramente con la adición de anticuerpos que reconocen HLA de Clase I y CD8 pero se ven afectadas escasamente por la adición de anticuerpos a HLA de Clase II o CD4, como el clon LTC TTK-567 mostrado en la fig. 10, el clon LTC URLC10-177 de la fig. 11 y el clon LTC KOC1-508 de la fig. 12. Estos resultados muestran que las actividades citotóxicas de los clones LTC contra las células de carcinoma de pulmón son la actividad citotóxica restringida por HLA de clase I y mediada por CD8.
Análisis de homología de los péptidos de antígenos
Los clones LTC establecidos contra TTK-567, URLC10-177 o KOC1-508 mostraron una actividad citotóxica potente. Así, es posible que la secuencia de TTK-567, URLC10-177 o KOC1-508 sea homóloga a los péptidos obtenidos de otras moléculas, de las que se sabe que sensibilizan el sistema inmunitario humano. Para excluir esta posibilidad, se realizó un análisis de homología con las secuencias de péptidos como consultas usando el algoritmo BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) (Altschul SF, y col., (1997) Nucleic Acids Res; 25(17):3389-402; Altschul SF, y col., (1990) J Mol. Biol; 215(3):403-10) y no revelaron ninguna secuencia con homología significativa. Estos resultados indican que las secuencias de TTK-567, URLC10-177 y KOC1-508 son únicas y que existe una posibilidad baja de que los péptidos provoquen respuestas inmunológicas no pretendidas en cualquier molécula no relacionada.
Discusión La identificación de nuevos AAT, especialmente los que inducen respuestas inmunitarias antitumorales potentes y específicas, merece un mayor desarrollo de la aplicación clínica de estrategias de vacunación con péptidos en varios tipos de cáncer (Boon T. y col., (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen P y col., (1991) Science 254: 1643-7; Brichard V y col., (1993) J Exp Med 178: 489-95; Kawakami Y y col., (1994) J Exp Med 180: 347-52; Shichijo S y col., (1998) J Exp Med 187:277-88; Chen Y.T. y col., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94: 1914-8; Harris CC., (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-5; Butterfield LH y col., (1999) Cancer Res 59:3134-42; Vissers JL y col., (1999) Cancer Res 59: 5554-9; van der Burg SH y col., (1996) J. Immunol. 156:3308-14; Tanaka F y col., (1997) Cancer Res 57:4465-8; Fujie T y col., (1999) Int J Cancer 80:169-72; Kikuchi M y col., (1999) Int J Cancer 81: 459-66; Oiso M y col., (1999) Int J Cancer 81:387-94).
Las tecnologías de micromatriz de ADNc pueden desvelar perfiles extensos de expresión génica de células malignas (Okabe H. y col., (2001) Cancer Res., 61, 2129-37; Lin Y-M. y col., (2002) Oncogene, 21; 4120-8; Hasegawa S. y col., (2002) Cancer Res 62:7012-7), y encuentran utilidad en la identificación de AAT potenciales. Entre los transcritos que son regulados por incremento en cánceres de pulmón, se identificó un nuevo gen humano, denominado TTK, con el uso de estas tecnologías.
Según se mostró anteriormente, TTK está sobreexpresado en cáncer de pulmón y muestra una expresión mínima en tejidos normales. Además, se ha demostrado que estos genes tienen una función importante en relación con la proliferación celular (véase el documento WO-2004/031.413). Así, los péptidos obtenidos de TTK pueden servir como epítopos de AAT, que, a su vez, pueden usarse para inducir respuestas inmunitarias importantes y específicas contra células cancerosas.
Así, como TTK es un AAT nuevo, las vacunas contra el cáncer que usan estos péptidos de epítopos pueden ser útiles como inmunoterapia contra carcinoma de pulmón u otro cáncer con expresión de estas moléculas.
Aplicabilidad industrial
La presente descripción identifica nuevos AAT, especialmente aquellos que inducen respuestas inmunitarias antitumorales potentes y específicas. Dichos AAT merecen un mayor desarrollo de la aplicación clínica de la estrategia de vacunación con péptidos en cáncer de pulmón.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.
UNIVERSIDAD DE TOKIO
5
<120> Vacunas de péptidos para cánceres de pulmón que expresan polipéptidos TTK, URLC10 o KOC1
<130> ONC-A0414P 10 <150> US 60/656,857
<151> 2005-02-05
<160> 126 15 <170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 2984
<212> ADN 20 <213> Homo sapiens
<400> 1
- <210>
- 2
- <211>
- 857
- <212> 5
- ADN
- <213>
- Homo sapiens
- <400>
- 2
- <210>
- 3
- <211>
- 1214
- <212> 5
- ADN
- <213>
- Homo sapiens
- <400>
- 3
- <210>
- 4
- <211>
- 223
- <212> 5
- PRT
- <213>
- Homo sapiens
- <400>
- 4
- <210>
- 5
- <211>
- 4168
- <212> 5
- ADN
- <213>
- Homo sapiens
- <400>
- 5
- <210>
- 6
- <211>
- 579
- <212> 5
- PRT
- <213>
- Homo sapiens
- <400>
- 6
- Arg Arg Lys
- <210> 5
- 7
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- 10 <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 7
- 15
- <210>
- 8
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- 9
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- Artificial
- 20
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- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
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- 8
- <210>
- 9
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- 9
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- 9
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- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 47
- <210>
- 48
- <211>
- 9
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- PRT
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- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 48
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- 49
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- 9
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- PRT
- <213>
- Artificial
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- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 49
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- 50
- <211>
- 9
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- PRT
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- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 50
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- 51
- <211>
- 9
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- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 51
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- 52
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- 9
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- PRT
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- Artificial
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- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
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- 53
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- 9
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- PRT
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- Artificial
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- 9
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- Artificial
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- 9
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- PRT
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- Artificial
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- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
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- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 56
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- 57
- <211>
- 9
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- PRT
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- Artificial
- 15 <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 57
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- <210>
- 58
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- 9
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- PRT
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- Artificial
- 25
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <210>
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- 9
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- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
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- <400>
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- 9
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- Artificial
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- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
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- 61
- <211>
- 9
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- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
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- 62
- <211>
- 9
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- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
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- 63
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- 9
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- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 64
- <210>
- 65
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 65
- <210>
- 66
- <211>
- 9
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- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
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- 67
- <211>
- 10
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- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 67
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 68
- <210>
- 69
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 69
- <210>
- 70
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 70
- <210>
- 71
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 71
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 72
- <210>
- 73
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 73
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- 74
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 74
- <210>
- 75
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 75
- <210>
- 76
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 76
- <210>
- 77
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 77
- <210>
- 78
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 78
- <210>
- 79
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 79
<210> 80
<211> 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 80
- <210>
- 81
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 81
- <210>
- 82
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 82
- <210>
- 83
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 83
- <210>
- 84
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 84
- <210>
- 85
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 85
- <210>
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- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 86
- <210>
- 87
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 87
- <210>
- 88
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 88
- <210>
- 89
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 89
- <210>
- 90
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 90
- <210>
- 91
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 91
- <210>
- 92
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 92
- <210>
- 93
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 93
- <210>
- 94
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 94
- <210>
- 95
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 95
- <210>
- 96
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 96
- <210>
- 97
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 97
- <210>
- 98
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 98
- <210>
- 99
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 99
- <210>
- 100
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- 5
- <400>
- 100
- <210>
- 101
- <211> 10
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223> 15
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
<400> 102
- 30
- <210>
- 103
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- 35
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 103
- <210>
- 104
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213> 45
- Artificial
- <220>
<223> Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
<400> 104 25 <210> 111
- <210>
- 105
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 105
- <210>
- 106
- <211>
- 9
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 106
- <210>
- 107
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 107
- <210>
- 108
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 108
- <210>
- 109
- <211>
- 10
- <212> 5
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- 10
- <400>
- 109
- <210>
- 110
- <211> 15
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223> 20
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 110
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
<400> 111
- 35
- <210>
- 112
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- 40
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 112
- <210>
- 113
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 113
- <210>
- 114
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 114
- <210>
- 115
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 115
- <210>
- 116
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 116
- <210>
- 117
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- 5
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 117
- <210>
- 118
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213> 15
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400> 20
- 118
- <210>
- 119
- <211>
- 10
- <212> 25
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- 30
- <400>
- 119
- <210>
- 120
- <211> 35
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223> 40
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 120
45 <210> 121
<211> 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223> 5
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400>
- 121
10 <210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
<400> 122
- 20
- <210>
- 123
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Artificial
- 25
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <210>
- 124
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213> 35
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400> 40
- 124
<210> 125
<211> 10 45 <212> PRT
<213> Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- <400> 5
- 125
- <210>
- 126
- <211>
- 10
- <212> 10
- PRT
- <213>
- Artificial
- <220>
- <223>
- Una secuencia de péptidos sintetizada artificialmente
- 15
- <400>
- 126
Claims (17)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
-
- 2.
- Un péptido de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, en la que 1 o 2 aminoácidos están sustituidos, borrados
o añadidos, mientras se mantiene la inducibilidad de linfocitos T citotóxicos. -
- 3.
- El péptido según la reivindicación 2, en el que el segundo aminoácido del extremo N es fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano.
-
- 4.
- El péptido según la reivindicación 2, en el que el aminoácido del extremo C es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina.
-
- 5.
- Una composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos de la reivindicación 1 o 2.
-
- 6.
- Un exosoma que presenta en su superficie un complejo que comprende un péptido según la reivindicación 1 o 2 y un antígeno HLA.
-
- 7.
- El exosoma según la reivindicación 6, en el que el antígeno HLA es HLA-A24.
-
- 8.
- El exosoma según la reivindicación 7, en el que el antígeno HLA es HLA-A2402.
-
- 9.
- Un método in vitro para inducir células presentadoras de antígeno que tienen una alta inducibilidad de linfocitos T citotóxicos que comprende la etapa de puesta en contacto de una célula presentadora de antígeno con un péptido según la reivindicación 1 o 2.
-
- 10.
- Un método in vitro para inducir linfocitos T citotóxicos mediante la puesta en contacto de un linfocito T con un péptido según la reivindicación 1 o 2.
-
- 11.
- El método de inducción de células presentadoras de antígeno que tienen una alta inducibilidad de linfocitos T citotóxicos según la reivindicación 9, en el que dicho método comprende la etapa de transferencia de un gen que comprende un polinucleótido que codifica un péptido consistente en el péptido según la reivindicación 1 o 2 a una célula presentadora de antígeno.
-
- 12.
- Una célula presentadora de antígeno, que comprende un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido según la reivindicación 1 o 2.
-
- 13.
- Una vacuna para inhibir la proliferación de células de cáncer de pulmón, en el que la vacuna comprende un péptido según la reivindicación 1 o 2 como ingrediente activo.
-
- 14.
- La vacuna según la reivindicación 13 para la administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLAA24.
-
- 15.
- Uso del péptido según la reivindicación 1 o 2, o de un polinucleótido que codifica dicho péptido para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de cáncer de pulmón.
-
- 16.
- Una composición farmacéutica que comprende un péptido según la reivindicación 1 o 2, o un polinucleótido que codifica dicho péptido para su uso en el tratamiento o prevención de cáncer de pulmón.
-
- 17.
- El uso según la reivindicación 15 o la composición farmacéutica según la reivindicación 16, en el que la composición farmacéutica es una vacuna.
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