PT2325305E - Vacinas peptídicas para cancros do pulmão que expressam polipéptidos ttk, urlc10 ou koc1 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Vacinas peptidicas para cancros do pulmão que expressam polipéptidos TTK, URLC10 ou KOC1"

Campo Técnico A invenção refere-se ao campo da ciência biológica, mais especificamente ao campo da terapia do cancro. Em particular, são divulgados novos péptidos que são extremamente eficazes como vacinas para o cancro, e fármacos para o tratamento e prevenção de tumores que contêm esses péptidos.

Anterioridade 0 cancro do pulmão é um dos mais comummente fatais tumores humanos. Foram reportadas muitas alterações genéticas associadas ao desenvolvimento e progressão do cancro do pulmão. As alterações genéticas podem auxiliar nos esforços de prognóstico e previsões de risco metastático ou de resposta a determinados tratamentos. (Mitsudomi T et al., (2000) Clin Câncer Res 6: 4055-63.; Niklinski et al., (2001) Lung Câncer, 34 Suppl 2: S53-8.; Watine J. (2000) Bmj 320: 379-80.). O cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) é de longe a forma mais comum de cancro do pulmão, contabilizando quase 80% dos tumores pulmonares (Society, A.C. Câncer Facts and Figures 2001, 2001.). A taxa de sobrevivência a 10 anos global permanece de apenas 10%, apesar de recentes avanços na terapia de multimodalidades, pois a maioria dos CPCNP não são diagnosticados antes dos estádios avançados (Fry, W.A. et al., (1999) Câncer. 86: 1867-76.). Embora os regimes de quimioterapia baseados na platina sejam considerados os padrões de referência para o tratamento de CPCNP, aqueles fármacos apenas conseguem prolongar a sobrevivência dos pacientes com CPCNP avançado em cerca de seis semanas (Non-small Cell Lung Câncer Collaborative Group, (1995) BMJ. 311: 899-909.). Estão a ser investigadas numerosas terapias direccionadas para esta doença, incluindo inibidores tirosina-quinase; contudo, até à data apenas foram conseguidos resultados promissores num número limitado de pacientes e com alguns beneficiários a sofrer graves reacções adversas (Kris MG, et al., (2002) Proc Am Soc Clin Oncol. 21: 292a(A1166).). 2 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Foi demonstrado que os linfócitos T citotóxicos (CTL) CD8+ reconhecem péptidos epitópicos derivados de antigénios associados ao tumor (TAA) apresentados em moléculas do MHC de classe I, e lisam as células tumorais. Desde a descoberta da família MAGE como o primeiro exemplo de TAA, muitos outros TAA foram descobertos utilizando abordagens imunológicas (Boon T. (1993) Int J Câncer 54: 177-80.; Boon T. et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen P, et al., (1991) Science 254: 1643-47.; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.). Alguns deles estão actualmente em desenvolvimento clínico como alvos de imunoterapia. Os TAA descobertos até agora incluem MAGE (van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.), gplOO (Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.), SART (Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88.) e NY-ESO-1 (Chen Y.T. et al., (1997) Proc. Natl. Acd Sei. USA, 94: 1914-8.) . Por outro lado, mostrou-se que certos produtos génicos que se demonstrou serem de algum modo especificamente sobre-expressos em células tumorais, são reconhecidos como alvos que induzem respostas imunitárias celulares. Estes produtos génicos incluem p53 (Umano Y et al., (2001) Br J Câncer, 84:1052-7.), HER2/neu (Tanaka H et al., (2001) Br J Câncer, 84: 94-9.), CEA (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Câncer 80, 92-7.) e similares.

Foi mostrado em De Nooij et al. (2003), International Journal of Câncer 103:768-774, que os antigénios Ly-6 humanos, incluindo Ly-6k, podem ser utilizados como marcadores moleculares para o carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço.

Apesar do progresso significativo na investigação básica e clínica relativamente aos TAA (Rosenberg SA et al., (1998) Nature Med, 4: 321-7.; Mukherji B. et al., (1995) Proc Natl Acad Sei USA, 92 : 8078-82.: Hu X et al., (1996) Câncer Res, 56: 2479-83.), estão disponíveis apenas um número muito limitado de TAA candidatos adequados para o tratamento de adenocarcinomas, tais como o cancro do pulmão. Os TAA que são abundantemente expressos em células cancerosas, e cuja expressão é restrita a células cancerosas, seriam candidatos promissores como alvos imunoterapêuticos. 3 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Tem sido repetidamente mostrado em ensaios de libertação de 51Cr que células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estimuladas por péptido, de certos dadores saudáveis, produzem níveis significativos de IFN- em resposta ao péptido, mas raramente exercem citotoxicidade contra células tumorais de uma maneira restrita por HLA-A24 ou A0201 (Kawano K et al., (2000) Câncer Res 60: 3550-8.; Nishizaka et al., (2000) Câncer

Res 60: 4830-7.; Tamura et al., (2001) Jpn J Câncer Res 92: 762-7.). Contudo, tanto o HLA-A24 como o HLA-A0201 são alelos de HLA comuns nas populações japonesa e caucasiana (Date Y et al., (1996) Tissue Antigens 47: 93-101.; Kondo A et al.,

(1995) J Immunol 155: 4307-12.; Kubo RT et al., (1994) J

Immunol 152: 3913-24.; Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Hlstocompatibility Workshop and Conference Oxford Unlverslty Press, Oxford, 1065 (1992); Williams F et al., (1997) Tissue Antigen 49: 129.).

Assim, os péptidos antigénicos de cancros apresentados por estes alelos de HLA podem ser especialmente úteis para o tratamento de cancros entre pacientes japoneses e caucasianos. Adicionalmente, sabe-se que a indução de CTL de baixa afinidade in vitro resulta usualmente da utilização de péptido numa concentração elevada, gerando um nível elevado de complexos péptido/MHC específicos em células apresentadoras de antigénio (APC), o que irá activar eficazmente estes CTL (Alexander-Miller et al., (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 4102-7.).

Desenvolvimentos recentes nas tecnologias dos microarrays de ADNc permitiram as construções de perfis compreensivos de expressão génica de células malignas comparativamente com células normais (Okabe, H. et al., (2001) Câncer Res., 61, 2129-37.; Lin YM. et al., (2002) Oncogene, 21,-4120-8.;

Hasegawa S. et al., (2002) Câncer Res 62:7012-7.). Esta abordagem permite um entendimento da natureza complexa das células cancerosas e dos mecanismos de carcinogénese e facilita a identificação de genes cuja expressão está desregulada em tumores (Bienz M. et al., (2000) Cell 103, 311- 320.). Entre os transcritos identificados como vulgarmente supra-regulados nos cancros do pulmão, o URLC10 (ADNc para o gene C016 diferencialmente expresso; Acesso no GenBank n.° AB105187; SEQ ID NO: 3, 4) tem particular interesse para os 4 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ presentes inventores, estando especificamente supra-regulado em células tumorais de tecidos de cancro do pulmão em mais do que 80% dos casos analisados. Pelo contrário, a análise Northern blot demonstrou que estes produtos génicos não se encontram em órgãos vitais normais (Veja-se W02004/031413).

Assim, péptidos imunogénicos derivados de URLC10 podem ter utilidade na morte de células tumorais que expressam esses antigénios. A presente invenção aborda estas e outras necessidades.

Sumário da invenção O gene URLC10 (ADNc para o gene C016 diferencialmente expresso) foi identificado como supra-regulado no cancro do pulmão. O gene foi identificado utilizando a construção de perfis de expressão génica com um microarray de ADNc com amplitude de genoma contendo 23 040 genes. Como discutido acima, a expressão de TTK, URLC10 e KOC1 está especificamente supra-regulada em células tumorais em mais do que 80% dos pacientes com cancro do pulmão e no entanto está ausente em outros órgãos vitais normais. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na identificação de péptidos epitópicos dos produtos génicos do gene (URLC10) que eliciam linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para as moléculas correspondentes. Como se discute adiante em detalhe, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de dadores saudáveis foram estimuladas utilizando péptidos candidatos a ligação ao HLA-A*2402 derivados de URLC10.

Foram então estabelecidos clones de CTL com citotoxicidade específica contra as células alvo positivas para HLA-A24 pulsadas com este péptido candidato. A análise posterior dos clones de CTL mostrou a potente actividade citotóxica contra, não apenas as células alvo pulsadas com o péptido, mas também as células tumorais que expressam endogenamente URLC10. Adicionalmente, tanto um ensaio de inibição de alvo frio como um ensaio de bloqueio do anticorpo revelaram que os clones celulares de CTL reconheciam especificamente o complexo MHC de classe I - péptido. Estes 5 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ resultados demonstram que estes péptidos são péptidos epitópicos restritos pelo HLA-A24 que podem induzir respostas imunitárias potentes e especificas contra células de cancro do pulmão que expressam URLC10.

Desse modo, a presente invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção do cancro do pulmão num indivíduo compreendendo o passo de administração ao indivíduo dos polipéptidos URLC10 da invenção. É induzida imunidade antitumoral pela administração deste polipéptido. Assim, a presente invenção proporciona métodos para indução de imunidade antitumoral num indivíduo compreendendo o passo de administração ao indivíduo do polipéptido URLC10, assim como composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de cancro do pulmão compreendendo o polipéptido URLC10.

Estes e outros objectos e características da invenção serão mais completamente evidentes quando a descrição detalhada seguinte é lida em conjunto com as figuras anexas e exemplos. Contudo, deve entender-se que tanto o resumo anterior da invenção como a descrição detalhada que se segue são de concretizações preferidas, e não são restritivos da invenção ou de outras concretizações alternativas da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por TTK-567 tem uma citotoxicidade específica do péptido. Especificamente, o clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra células alvo (A24LCL) pulsadas com TTK-567, enquanto não apresentou actividade citotóxica significativa contra as mesmas células alvo (A24LCL) não pulsadas com péptidos. A Figura 2 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por URLC10-177 tem uma citotoxicidade específica do péptido. Especificamente, o clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra células alvo (A24LCL) pulsadas com URLC10-177, enquanto não apresentou actividade citotóxica significativa contra as mesmas células alvo (A24LCL) não pulsadas com péptidos. 6 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ A Figura 3 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por KOC1-508 tem uma citotoxicidade especifica do péptido. Especificamente, o clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra células alvo (A24LCL) pulsadas com KOC1-508, enquanto não apresentou actividade citotóxica significativa contra as mesmas células alvo (A24LCL) não pulsadas com péptidos. A Figura 4 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por TTK-567 reconhece e lisa células tumorais que expressam endogenamente TTK de uma maneira restrita pelo HLA. A actividade citotóxica contra células TE1, que expressam endogenamente TTK e HLA-A24, foi testada utilizando como células efectoras os clones de CTL criados por TTK-567. Utilizaram-se células PC9 como células alvo que expressam endogenamente TTK mas não expressam HLA-A24. 0 clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra células TEl que expressam tanto TTK como HLA-A24. Por outro lado, não apresentou actividade citotóxica significativa contra células PC9 que expressam TTK mas não HLA-A24. A Figura 5 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por URLC10-177 reconhece e lisa células tumorais que expressam endogenamente URLC10 de uma maneira restrita pelo HLA. A actividade citotóxica contra células TEl, que expressam endogenamente URLC10 e HLA-A24, foi testada utilizando como células efectoras o clone de CTL criado por URLC10-177. Utilizaram-se células TE13 como células alvo que expressam endogenamente URLC10 mas não expressam HLA-A24. 0 clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra células TEl que expressam tanto URLC10 como HLA-A24. Por outro lado, não apresentou actividade citotóxica significativa contra células TE13 que expressam URLC10, mas não HLA-A24. A Figura 6 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por KOC1-508 reconhece e lisa as células tumorais que expressam endogenamente KOC1 de uma maneira restrita pelo HLA. A actividade citotóxica contra células TEl, que expressam endogenamente KOC1 e HLA-A24, foi testada utilizando como células efectoras o clone de CTL criado por KOC1-508.

Utilizaram-se células PC9 como células alvo que expressam

endogenamente KOC1 mas não expressam HLA-A24. 0 clone de CTL 7 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ apresentou elevada actividade citotóxica contra células TE1 que expressam tanto KOC1 como HLA-A24. Por outro lado, não apresentou actividade citotóxica significativa contra células PC9 que expressam KOC1, mas não HLA-A24. A Figura 7 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por TTK-567 reconhece especificamente TTK-567 de uma maneira restrita pelo HLA-A24. Prepararam-se células TE1 marcadas com Na251Cr04 como alvo quente, enquanto se utilizaram células A24LCL pulsadas com péptido TTK-567 como alvo frio (Inibidor). A razão E/T foi fixada em 20. A actividade citotóxica do clone de CTL TTK-567 contra células TE1 foi inibida pela adição de células A24LCL pulsadas com o péptido idêntico.

A Figura 8 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por URLC10-177 reconhece especificamente URLC10 de uma maneira restrita pelo HLA-A24. Prepararam-se células TE1 marcadas com Na251Cr04 como alvo quente, enquanto se utilizaram células A24LCL pulsadas com péptido URLC10-177 como alvo frio (Inibidor). A razão E/T foi fixada em 20. A actividade citotóxica do clone de CTL URLC10-177 contra TE1 foi inibida pela adição de células A24LCL pulsadas com o péptido idêntico.

A Figura 9 é um gráfico que mostra que o clone de CTL criado por KOC1-508 reconhece especificamente KOC1 de uma maneira restrita pelo HLA-A24. Prepararam-se células TE1 marcadas com Na251Cr04 como alvo quente, enquanto se utilizaram células A24LCL pulsadas com péptido KOC1-508 como alvo frio (Inibidor). A razão E/T foi fixada em 20. A actividade citotóxica do clone de CTL KOC1-508 contra células TE1 foi inibida pela adição de células A24LCL pulsadas com o péptido idêntico. A Figura 10 é um gráfico que mostra que a actividade citotóxica do clone de CTL criado por TTK-567 é especificamente bloqueada por anticorpos que reconhecem os antigénios de superfície de células T do HLA de classe I ou CD8. A especificidade da citotoxicidade do clone de CTL foi confirmada por um ensaio de bloqueio de anticorpos. Co-cultivaram-se células TE1 com anticorpos monoclonais respectivamente, e utilizaram-se como alvo. A actividade dos 8 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ CTL foi claramente bloqueada pela adição de anticorpos que reconhecem o HLA de Classe I ou CD8 e foi marginalmente afectada pela adição de anticorpos contra o HLA de Classe II ou CD4; contudo, não foi de todo inibida pela adição de um anticorpo de controlo de isotipo coincidente. A Figura 11 é um gráfico que mostra que a actividade citotóxica do clone de CTL criado por URLC10-177 é especificamente bloqueada por anticorpos que reconhecem os antigénios de superfície de células T do HLA de classe I ou CD8. A especificidade da citotoxicidade do clone de CTL foi confirmada por um ensaio de bloqueio de anticorpos. Co- cultivaram-se células TE1 com anticorpos monoclonais respectivamente, e utilizaram-se como alvo. A actividade dos CTL foi claramente bloqueada pela adição de anticorpos que reconhecem o HLA de Classe I ou CD8 e foi marginalmente afectada pela adição de anticorpos contra o HLA de Classe II ou CD4; contudo, não foi de todo inibida pela adição de um anticorpo de controlo de isotipo coincidente. A Figura 12 é um gráfico que mostra que a actividade citotóxica do clone de CTL criado por KOC1-508 é especificamente bloqueada por anticorpos que reconhecem os antigénios de superfície de células T do HLA de classe I ou CD8. A especificidade da citotoxicidade do clone de CTL foi confirmada por um ensaio de bloqueio de anticorpos. Co- cultivaram-se células TE1 com anticorpos monoclonais respectivamente, e utilizaram-se como alvo. A actividade dos CTL foi claramente bloqueada pela adição de anticorpos que reconhecem o HLA de Classe I ou CD8 e foi marginalmente afectada pela adição de anticorpos contra o HLA de Classe II ou CD4; contudo, não foi de todo inibida pela adição de um anticorpo de controlo de isotipo coincidente.

Descrição Detalhada da Invenção

As palavras "um", "uma", o e "a", como aqui se utilizam significam "pelo menos um" a menos que especificamente indicado de outro modo. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado 9 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ que é vulgarmente entendido por uma pessoa competente na matéria à qual a presente invenção pertence. A identificação de novos TAA, particularmente aqueles que induzem respostas imunitárias antitumorais potentes e especificas, garante o desenvolvimento adicional da aplicação clinica da estratégia de vacinação com péptidos em vários tipos de cancro (Boon T et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen P et al. , (1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V et al. , (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al. , (1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S et al. , (1998) J Exp Med 187:277-88.; Chen YT et al. , (1997) Proc.

Natl. Acd. Sei. USA, 94: 1914-8.; Harris CC, (1996) J Natl Câncer Inst 88 : 1442-5.; Butterfield LH et al., (1999) Câncer

Res 59:3134-42 .; Vissers JL et al., (1999) Câncer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH et al., (1996) J. Immunol 156:3308-14.; Tanaka F et al., (1997) Câncer Res 57:4465-8.; Fujie T et al., (1999) Int J Câncer 80:169-72.; Kikuchi M et al., (1999) Int J Câncer 81 : 459-66.; Oiso M et al., (1999) Int J Câncer 81:387-94.). Como notado acima, o TTK, o URLC10 e o KOC1 foram previamente identificados como sobre-expressos no cancro do pulmão utilizando tecnologias de microarray de ADNc. Como discutido em W02004/031413, o TTK codifica um domínio S_TKc. A proteína codificada pelo gene TTK fosforila proteínas na serina, na treonina e na tirosina, estando esta fosforilação provavelmente associada à proliferação celular (Mills GB et al., (1992) J Biol Chem 267: 16000-6.; Schmandt R et al., (1994) J Immunol.; 152 (1):96-105.; Stucke VM et al., (2002) EMBO J.; 21 (7):1723-32.). O KOC1 codifica a proteína 3 de ligação a ARNm (IMP-3) do factor de crescimento semelhante a insulina 2 (IGF2). A proteína IMP-3 contém 2 motivos de reconhecimento de ARN (RRM) funcionais em adição aos 4 domínios KH. A proteína associa-se especificamente à região não traduzida a 5' (5-prime UTR") do ARNm de comando 3 do factor de crescimento semelhante a insulina II (IGF2) humano de 6,0 kb, sugerindo um papel para IMP-3 na regulação fisiológica da produção de IGF2. (Nielsen, J. et al., (1999) Molec. Cell. Biol. 19: 1262-1270). A IMP-3 estava também sobre-expressa em cancros pancreáticos (Mueller-Pillasch, F. et al., (1997) Oncogene 14: 2729-2733). 10 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Experiências prévias demonstraram que TTK, URLC10 e KOC1 eram sobre-expressos no cancro do pulmão e apresentam uma expressão mínima em tecidos normais. Em adição, mostrou-se que estes genes possuem uma função significativa relacionada com a proliferação celular (Veja-se W02004/031413).

Na presente invenção, mostra-se que péptidos derivados de URLC10 são epítopos de TAA restritos por HLA-A24, um alelo do HLA comummente encontrado nas populações japonesa e caucasiana. Especificamente, utilizando as suas afinidades de ligação relativamente ao HLA-A24, identificaram-se candidatos a péptidos com ligação ao HLA-A24 derivados de URLC10. Após a estimulação in vitro de células T por células dendríticas (DC) carregadas com estes péptidos, os CTL foram estabelecidos com sucesso utilizando URLC10-177 (RYCNLEGPPI (SEQ ID NO:67)).

Estes CTL apresentaram actividade citotóxica potente contra as células A24LCL pulsadas com péptido. Adicionalmente, os clones de CTL derivados a partir destas células também apresentaram citotoxicidade específica contra linhas celulares de carcinoma do pulmão positivas para HLA-A24 que sobre-expressam endogenamente URLC10. Contudo, estes clones de CTL não apresentaram actividade citotóxica contra linhas celulares que não têm expressão de HLA-A24 nem do TAA alvo. As actividades citotóxicas específicas destes clones de CTL foram significativamente inibidas pelo alvo frio. Estes resultados demonstram que o URLC10 é útil como TAA de células do cancro do pulmão e que o URLC10-177 é um péptido epitópico de cada TAA restrito por HLA-A24. Como estes antigénios são sobre-expressos na maioria dos cancros do pulmão e estão associados à proliferação de células tumorais, terão utilidade como alvos imunoterapêuticos contra os cancros do pulmão.

Desse modo, a presente invenção proporciona ainda métodos de tratamento ou prevenção do cancro do pulmão num indivíduo, os referidos métodos compreendendo os passos de administração de um péptido imunogénico com menos de 15 aminoácidos e compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 7 ao indivíduo disso necessitado. Alternativamente, o péptido imunogénico pode compreender uma sequência de SEQ ID NO:67 em que 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos, eliminados ou adicionados, desde que o péptido variante resultante retenha a 11 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ actividade imunogénica (i.e., a capacidade de induzir CTL específicos para as células de cancro do pulmão). É também divulgado que o número de resíduos a substituir, eliminar ou adicionar é geralmente de 5 aminoácidos ou menos, preferivelmente 4 aminoácidos ou menos, mais preferivelmente 3 aminoácidos ou menos.

Sabe-se que os péptidos variantes (i.e., péptidos compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada por substituição, deleção ou adição de um, dois ou vários resíduos de aminoácido numa sequência de aminoácidos original) retêm a actividade biológica original (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sei USA 81: 5662-6.; Zoller MJ e Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500.; Dalbadie-McFarland G et al., (1982) Proc Natl Acad Sei USA 79: 6409-13.). No contexto da presente invenção, a modificação de aminoácidos resulta em conservação das propriedades das cadeias laterais dos aminoácidos originais (um processo conhecido como substituição conservativa de aminoácidos). Os exemplos de propriedades de cadeias laterais de aminoácidos são aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S, T) , e cadeias laterais possuindo os seguintes grupos funcionais ou características em comum: uma cadeia lateral alifática (G, A, V, L, I, P) ; uma cadeia lateral contendo grupos hidroxilo (S, T, Y); uma cadeia lateral contendo átomos de enxofre (C, M) ; uma cadeia lateral contendo ácido carboxílico e amida (D, N, E, Q) ; uma cadeia lateral contendo uma base (R, K, H) ; e uma cadeias lateral contendo um grupo aromático (H, F, Y, W) . Note-se que as letras entre parêntesis indicam os códigos de uma letra dos aminoácidos. O péptido imunogénico é um decapéptido (10-mero). A presente invenção proporciona ainda um método de indução de imunidade antitumoral contra o cancro do pulmão num indivíduo, o referido método compreendendo os passos de administração ao indivíduo de um péptido imunogénico da invenção, nomeadamente um compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67 ou uma sua variante (i.e., 1 ou 2 substituições, deleções ou adições de aminoácido) ao indivíduo disso necessitado. 12 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

No contexto da presente invenção, o indivíduo é preferivelmente um mamífero. Os mamíferos exemplificativos incluem, mas não se lhes limitando, e.g., um ser humano, um primata não humano, um ratinho, um rato, um cão, um gato, um cavalo ou uma vaca.

Na presente invenção, o péptido pode ser administrado a um indivíduo por uma via in vivo ou ex vivo. Adicionalmente, a presente invenção também proporciona a utilização de um decapéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 (e suas variantes) para o fabrico de uma composição imunogénica para o tratamento ou prevenção do cancro do pulmão.

Análises de homologia de URLC10-177 demonstram que este não tem homologia significativa com os péptidos derivados de quaisquer produtos génicos humanos conhecidos. Desse modo, a possibilidade de respostas imunitárias desconhecidas ou indesejadas com a imunoterapia contra estas moléculas é significativamente reduzida.

Em relação aos antigénios do HLA, a utilização de um tipo A-24 que é altamente expresso entre a população japonesa é favorável para obter resultados eficazes, e a utilização de subtipos, tais como A-2402, é ainda mais preferível. Tipicamente, na prática clínica, o tipo de antigénio do HLA do paciente que requer o tratamento é investigado antecipadamente, o que permite a selecção apropriada de péptidos possuindo níveis elevados de afinidade de ligação para com esse antigénio, ou possuindo indutibilidade de células T citotóxicas (CTL) por apresentação do antigénio. Adicionalmente, de modo a obter péptidos que apresentam elevada afinidade de ligação e indutibilidade de CTL, pode ser realizada a substituição, deleção ou adição de 1 ou 2 aminoácidos com base na sequência de aminoácidos do péptido parcial de URLC10 de ocorrência natural.

Adicionalmente, em adição aos péptidos que são apresentados naturalmente, como a regularidade das sequências de péptidos apresentados por ligação a antigénios do HLA é já conhecida (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24.; 13 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228.; Kondo A, et al., (1995) J. Immunol. 155:4307-12.), podem ser realizadas nos péptidos imunogénicos da invenção modificações baseadas nesta regularidade. Por exemplo, podem ser utilizados favoravelmente péptidos que apresentam elevada afinidade de ligação a HLA-24 em que o segundo aminoácido do terminal N está substituído por fenilalanina, tirosina, metionina ou triptofano. Do mesmo modo, péptidos cujo aminoácido C-terminal está substituído por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano ou metionina, podem também ser utilizados favoravelmente.

Contudo, quando a sequência peptídica é idêntica a uma porção da sequência de aminoácidos de uma proteína endógena ou exógena possuindo uma função diferente, podem ser induzidos efeitos secundários tais como desordens auto-imunes ou sintomas alérgicos contra substâncias específicas. Portanto, é preferível evitar a situação em que a sequência imunogénica coincide com a sequência de aminoácidos de uma proteína conhecida. Esta situação pode ser evitada realizando uma pesquisa de homologia utilizando bases de dados disponíveis. Se as pesquisas de homologia confirmarem que os péptidos em que 1 ou 2 aminoácidos são diferentes não existem, então pode ser evitado o perigo inerente às modificações da sequência de aminoácidos supramencionada que, por exemplo, aumentam a afinidade de ligação a antigénios do HLA, e/ou aumentam a indutibilidade de CTL.

Embora seja expectável que péptidos possuindo elevada afinidade de ligação aos antigénios do HLA como descrito acima sejam altamente eficazes como vacinas contra o cancro, os péptidos candidatos, que são seleccionados de acordo com a presença de elevada afinidade de ligação como indicador, têm que ser examinados quanto à verdadeira presença de indutibilidade de CTL. A indutibilidade de CTL pode ser confirmada por indução de células apresentadoras de antigénio portadoras de antigénios do MHC humano (por exemplo, linfócitos B, macrófagos e células dendríticas), ou mais especificamente células dendríticas derivadas de leucócitos mononucleares de sangue periférico humanos, e, após estimulação com o péptido de interesse, por mistura com células positivas para CD8 e medição da actividade citotóxica 14 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ contra as células alvo. Como sistema reaccional, podem ser utilizados animais transgénicos produzidos para expressar um antigénio do HLA humano (por exemplo, os descritos em BenMohamed L, et al., (2000) Hum. Immunol.; 61 (8):764-79 Related Articles, Books, Linkout. ) . Por exemplo, as células alvo podem ser radiomarcadas com 51Cr e similares, e a actividade citotóxica pode ser calculada a partir da radioactividade libertada pelas células alvo. Alternativamente, pode ser examinada medindo o IFN-Y produzido e libertado por CTL na presença de células apresentadoras de antigénio que são portadoras de péptidos imobilizados, e visualizando a zona de inibição nos meios utilizando anticorpos monoclonais anti-IFN-Y.

Em resultado do exame da indutibilidade de CTL dos péptidos como descrito acima, verificou-se que péptidos possuindo elevada afinidade de ligação para com um antigénio do HLA não têm necessariamente elevada indutibilidade. Contudo, decapéptidos seleccionados entre péptidos compreendendo a sequência de aminoácidos indicada por RYCNLEGPPI (SEQ ID NO:67) apresentaram indutibilidade de CTL particularmente elevada.

Como feito notar acima, a presente invenção proporciona péptidos possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, nomeadamente aqueles que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67 ou uma sua variante (i.e., aqueles em que 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos, eliminados ou adicionados). É preferível que a sequência de aminoácidos compreenda 10 aminoácidos indicados em SEQ ID NO:67 ou uma sua variante, não coincida com uma sequência de aminoácidos associada a outra proteína endógena. Em particular, são exemplos favoráveis a substituição de aminoácido por fenilalanina, tirosina, metionina ou triptofano do segundo aminoácido do terminal N, e por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano ou metionina do aminoácido C-terminal, e a adição de aminoácidos de 1 a 2 aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C.

Os péptidos aqui divulgados podem ser preparados utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, os péptidos podem ser preparados sinteticamente, utilizando tecnologia de 15 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ ADN recombinante ou síntese química. Os péptidos aqui divulgados podem ser sintetizados individualmente ou na forma de polipéptidos mais longos compreendendo dois ou mais péptidos. Os péptidos aqui divulgados são preferivelmente isolados, i.e., substancialmente isentos de outras proteínas de ocorrência natural na célula hospedeira e seus fragmentos.

Os péptidos aqui divulgados podem conter modificações, tais como glicosilação, oxidação da cadeia lateral ou fosforilação; desde que as modificações não destruam a actividade biológica dos péptidos como aqui descrito. Outras modificações incluem a incorporação de D-aminoácidos ou outros miméticos de aminoácidos que podem ser utilizados, por exemplo, para aumentar a semivida sérica dos péptidos.

Os péptidos aqui divulgados podem ser preparados sob a forma de uma combinação, que compreende dois ou mais dos péptidos aqui divulgados, para utilização como vacina contra o cancro que pode induzir CTL in vivo. Os péptidos podem ser um cocktail ou podem ser conjugados uns com os outros utilizando técnicas padrão. Por exemplo, os péptidos podem ser expressos sob a forma de uma única sequência polipeptidica. Os péptidos na combinação podem ser iguais ou diferentes. Por administração dos péptidos aqui divulgados, os péptidos são apresentados numa densidade elevada nos antigénios do HLA de células apresentadoras de antigénio, que, por sua vez, induzem CTL que reagem especificamente com o complexo formado entre o péptido apresentado e o antigénio do HLA. Alternativamente, as células apresentadoras de antigénio possuindo os péptidos aqui divulgados imobilizados na sua superfície celular, obtidas por remoção das células dendríticas dos indivíduos, podem ser estimuladas pelos péptidos aqui divulgados. A re-administração destas células aos indivíduos respectivos induz CTL, e, como resultado, pode ser aumentada a agressividade relativamente às células alvo.

Mais especificamente, são divulgados fármacos para o tratamento de tumores ou prevenção da proliferação, metástases, e similares, de tumores, que compreendem um ou mais dos péptidos aqui divulgados. Os péptidos da presente invenção têm particular utilidade no tratamento do cancro do pulmão. 16 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Os péptidos da presente invenção podem ser administrados a um indivíduo directamente, sob a forma de uma composição farmacêutica que tenha sido formulada por métodos convencionais de formulação. Nestes casos, em adição aos péptidos da presente invenção, podem ser incluídos conforme apropriado, transportadores, excipientes e similares, que são vulgarmente utilizados para fármacos, sem limitações particulares. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada para o tratamento e prevenção dos cancros do pulmão.

As composições imunogénicas para o tratamento e/ou prevenção de tumores, que compreendem como ingrediente activo um ou mais péptidos aqui divulgados, podem ainda incluir um adjuvante de modo a que a imunidade celular seja eficazmente estabelecida. Alternativamente, podem ser administrados com outros ingredientes activos, tais como agentes antitumorais. As formulações adequadas incluem grânulos. Os adjuvantes adequados estão descritos na literatura (Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89.). Os exemplos de adjuvantes incluem, mas não se lhes limitam, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio e alúmen. Adicionalmente, podem ser convenientemente utilizadas formulações lipossómicas, formulações granulares em que o fármaco está ligado a contas de alguns pm de diâmetro, e formulações em que um lípido está ligado ao péptido. 0 método de administração pode ser oral, por injecção intradérmica, subcutânea, intravenosa, ou similar, e pode incluir administração sistémica ou administração local na vizinhança do tumor alvo. A dose do(s) péptido(s) aqui divulgado(s) pode ser ajustada apropriadamente de acordo com a doença a tratar, a idade e peso do paciente, o método de administração, e similares. Embora a dosagem seja vulgarmente de 0,001 mg a 1000 mg, preferivelmente de 0,01 mg a 100 mg, mais preferivelmente de 0,1 mg a 10 mg, preferivelmente administrada uma vez em alguns dias a alguns meses, um perito na especialidade pode prontamente seleccionar a dose e o método de administração apropriados, pois a selecção e optimização destes parâmetros está bem dentro das habilitações de rotina. 17 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ A presente invenção proporciona ainda vesículas intracelulares denominadas exossomas, que apresentam complexos formados entre os péptidos da presente invenção e antigénios do HLA na sua superfície. Os exossomas podem ser preparados, por exemplo, utilizando os métodos descritos em detalhe na Tradução Japonesa Publicada da Publicação Internacional N.°

Hei 11-510507 e 2000-512161, e são preferivelmente preparados utilizando células apresentadoras de antigénio obtidas a partir dos indivíduos que são os alvos de tratamento e/ou de prevenção. Os exossomas aqui divulgados podem ser inoculados como vacinas contra o cancro, similarmente aos péptidos aqui divulgados. O tipo de antigénios do HLA utilizados tem que ser compatível com o indivíduo que requer o tratamento e/ou prevenção. Por exemplo, na população japonesa, é frequentemente apropriado o HLA-A24, particularmente o HLA-A2402.

Em algumas concretizações, as composições de vacina aqui divulgadas incluem um componente que estimula linfócitos T citotóxicos. Os lipidos foram identificados como agentes capazes de estimular CTL in vivo contra antigénios virais. Por exemplo, resíduos de ácido palmítico podem ser ligados aos grupos - e -amino de um resíduo de lisina e depois ligados a um péptido imunogénico da invenção. O péptido lipidado pode então ser administrado directamente, numa micela ou numa partícula, incorporado num lipossoma, ou emulsionado num adjuvante. Como outro exemplo de um lípido que estimula as respostas de CTL, podem ser utilizadas lipoproteínas de E. coli, tais como tripalmitoí1-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS), para estimular os CTL, quando ligados covalentemente a um péptido apropriado (veja-se, e.g., Deres K, et al., (1989) Nature 342:561-4.).

As composições imunogénicas aqui divulgadas podem também compreender ácidos nucleicos que codificam um ou mais dos péptidos imunogénicos aqui divulgados. Veja-se, e.g., Wolff JA et al., (1990) Science 247:1465-8; Patentes U.S. 5, 580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; e WO 98/04720 . Os exemplos de tecnologias de entrega à base de ADN incluem "ADN nu", entrega facilitada (mediação por 18 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ péptidos, bupivicaína, polímeros), complexos lipídicos catiónicos, e entrega mediada por partículas ("canhão génico") ou mediada por pressão (veja-se, e.g., Patente U.S. 5,922,687).

Os péptidos imunogénicos aqui divulgados podem também ser expressos por vectores virais ou bacterianos. Os exemplos de vectores de expressão adequados incluem hospedeiros virais atenuados, tais como vaccinia ou fowlpox. Esta abordagem envolve a utilização de vírus vaccinia, e.g., como vector para expressar sequências de nucleótidos que codificam o péptido. Após introdução num hospedeiro, o vírus vaccinia recombinante expressa o péptido imunogénico, e desse modo elicia uma resposta imunitária. Vectores de vaccinia e métodos úteis em protocolos de imunização estão descritos em, e.g., Patente U.S. 4,722,848. Outro vector adequado é o BCG (Bacilo de Calmette-Guerin). Os vectores de BCG estão descritos em Stover CK, et ai., (1991) Nature 351:456-60. Uma ampla variedade de outros vectores úteis para administração terapêutica ou imunização e.g., vectores de adenovírus e vírus adeno-associados, vectores retroviral, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina antraz destoxifiçada, e similares, são conhecidos na especialidade. Veja-se, e.g., Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ e Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; e Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85. A presente invenção também proporciona métodos de indução de células apresentadoras de antigénio utilizando um ou mais péptidos da presente invenção. As células apresentadoras de antigénio podem ser induzidas por indução de células dendriticas a partir dos monócitos de sangue periférico e depois contacto (estimulação) com um ou mais péptidos da presente invenção in vitro, ex vivo ou in vivo. Quando os péptidos são administrados aos indivíduos, células apresentadoras de antigénio que possuem os péptidos imobilizados são induzidas no corpo do indivíduo.

Alternativamente, após imobilização nas células apresentadoras de antigénio, as células podem ser administradas ao indivíduo sob a forma de uma vacina. Por exemplo, a administração ex vivo pode compreender passos de: 19 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ a: colheita de células apresentadoras de antigénio de um indivíduo, e b: contacto das células apresentadoras de antigénio do passo a com um péptido.

As células apresentadoras de antigénio obtidas no passo b podem ser administradas ao indivíduo sob a forma de uma vacina. A presente invenção também proporciona um método para indução de células apresentadoras de antigénio possuindo um nível elevado de indutibilidade de células T citotóxicas, em que o método compreende o passo de transferência de genes compreendendo polinucleótido(s) que codifica(m) um ou mais péptidos da presente invenção para células apresentadoras de antigénio in vitro. Os genes introduzidos podem estar na forma de ADN ou ARN. Para o método de introdução, sem limitações particulares, podem ser utilizados adequadamente vários métodos convencionalmente realizados neste campo, tais como o método da lipofecção, da electroporação e do fosfato de cálcio. Mais especificamente, a transfecção pode ser realizada como descrito em Reeves ME, et al., (1996) Câncer Res., 56:5672-7.; Butterfield LH, et ai., (1998) J. Immunol., 161:5607-13.; Boczkowski D, et al., (1996) J. Exp. Med., 184:465-72.; Tradução japonesa Publicada da Publicação Internacional 2000-509281. Ao transferir o gene para células apresentadoras de antigénio, o gene sofre transcrição, tradução, e similares na célula, e depois a proteína obtida é processada pelo MHC de Classe I ou de Classe II, e prossegue através de uma via de apresentação para apresentar péptidos parciais. A presente invenção proporciona ainda um método in vitro para a indução de CTL utilizando um ou mais péptidos da presente invenção. Quando os péptidos aqui divulgados são administrados a um indivíduo, os CTL são induzidos no corpo do indivíduo, e a força do sistema imunitário direccionado para as células de cancro do pulmão nos tecidos tumorais é assim aumentada. Alternativamente, os péptidos aqui divulgados podem ser utilizados no contexto de um método terapêutico ex vivo, em que células apresentadoras de antigénio e células positivas para CD8 ou leucócitos mononucleares de sangue periférico, 20 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ derivados do indivíduo, são colocados em contacto (estimulados) com um ou mais péptidos aqui divulgados in vitro, e, após indução dos CTL, as células são devolvidas ao indivíduo. Por exemplo, o método pode compreender passos de: a: colheita de células apresentadoras de antigénio de um indivíduo, b: contacto das células apresentadoras de antigénio do passo a com um péptido, c: mistura das células apresentadoras de antigénio do passo b com células T CD8+ e co-cultura de modo a induzir células T citotóxicas: , e d: colheita de células T CD8+ da co-cultura do passo c.

As células T CD8+ possuindo actividade citotóxica obtidas no passo d podem ser administradas ao indivíduo sob a forma de uma vacina. A presente invenção proporciona ainda células T citotóxicas isoladas induzidas utilizando os péptidos da presente invenção, em que a célula T citotóxica isolada actua especificamente contra células alvo apresentadoras do péptido que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67. As células T citotóxicas, induzidas por estimulação com uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um ou mais péptidos aqui divulgados, são preferivelmente derivadas de indivíduos que são o alvo do tratamento e/ou prevenção, e podem ser administradas individualmente ou em combinação com outros fármacos, incluindo um ou mais péptidos aqui divulgados ou exossomas possuindo actividade antitumoral. As células T citotóxicas obtidas actuam especificamente contra células alvo apresentadoras dos péptidos da presente invenção. As células alvo podem ser células que expressam URLC10 endogenamente, ou células que estão transfectadas com genes de URLC10. As células que apresentam os péptidos aqui divulgados na superfície celular, devido a estimulação com esses péptidos, podem também tornar-se alvos de ataque. A presente invenção também proporciona células apresentadoras de antigénio que apresentam complexos formados entre antigénios do HLA e um péptido da presente invenção. As células apresentadoras de antigénio, obtidas através do 21 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ contacto com os péptidos aqui divulgados ou os nucleótidos que codificam esses péptidos, são preferivelmente derivadas de indivíduos que são o alvo do tratamento e/ou prevenção, e podem ser administradas sob a forma de vacinas, individualmente ou em combinação com outros fármacos, incluindo os péptidos, exossomas, ou células T citotóxicas da presente divulgação.

No contexto da presente invenção, o termo "vacina" (também referido como uma composição imunogénica) refere-se a uma substância que induz imunidade antitumoral ou suprime o cancro do pulmão após inoculação em animais. De acordo com a presente invenção, foi sugerido que polipéptidos compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 são péptidos epitópicos restritos por HLA-A24 que podem induzir uma resposta imunitária potente e específica contra células de cancro do pulmão que expressam URLC10.

Assim, a presente invenção também abrange um método de indução de imunidade antitumoral utilizando polipéptidos compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 7 ou uma sua variante (i.e., incluindo 1 ou 2 substituições, deleções ou adições de aminoácido). Em geral, a imunidade antitumoral inclui respostas imunitárias tal como se segue: • indução de linfócitos citotóxicos contra tumores compreendendo células que expressam URLC10, • indução de anticorpos que reconhecem tumores compreendendo células que expressam URLC10, e • indução da produção de citoquinas antitumorais.

Portanto, quando um determinado péptido induz qualquer uma destas respostas imunitárias após inoculação num animal, decide-se que o péptido tem efeito indutor de imunidade antitumoral. A indução da imunidade antitumoral por um péptido pode ser detectada por observação in vivo ou in vitro da resposta do sistema imunitário no hospedeiro contra o péptido.

Por exemplo, é bem conhecido um método para detecção da indução de linfócitos T citotóxicos. Uma substância estranha que entra no corpo vivo é apresentada a células T e a células B pela acção de células apresentadoras de antigénio 22 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ (APC). As células Τ que respondem ao antigénio apresentado pelas APC de uma maneira específica do antigénio diferenciam-se em células T citotóxicas (também referidas como linfócitos T citotóxicos ou CTL) devido a estimulação pelo antigénio, e depois proliferam; este processo é referido aqui como "activação" de células T. Portanto, a indução de CTL por um determinado péptido pode ser avaliada pela apresentação do péptido a uma célula T por APC, e detecção da indução de CTL. Adicionalmente, as APC têm o efeito de activar células T CD4+, células T CD8+, macrófagos, eosinófilos e células NK. Como as células T CD4+ são também importantes na imunidade antitumoral, a acção indutora de imunidade antitumoral do péptido pode ser avaliada utilizando o efeito de activação destas células como indicador.

Um método para a avaliação da acção indutora de CTL utilizando células dendríticas (DC) como APC é bem conhecido na especialidade. A DC é uma APC representativa possuindo a mais forte acção indutora de CTL entre as APC. Neste método, o polipéptido de teste é inicialmente colocado em contacto com a DC e depois esta DC é colocada em contacto com células T. A detecção de células T possuindo efeitos citotóxicos contra as células de interesse após o contacto com DC mostra que o polipéptido de teste possui uma actividade de indução das células T citotóxicas. A actividade de CTL contra tumores pode ser detectada, por exemplo, utilizando a lise de células tumorais marcadas com 51Cr como indicador. Alternativamente, é bem conhecido como avaliar o grau de danos em células tumorais utilizando a actividade de captação de 3H-timidina ou a libertação de LDH (lactose-desidrogenase) como indicador.

Para além das DC, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) podem também ser utilizadas como APC. Está reportado que a indução de CTL é aumentada por cultura de PBMC na presença de GM-CSF e IL-4. Similarmente, mostrou-se que os CTL são induzidos por cultura de PBMC na presença de hemocianina de lapa Fissurella (KLH) e IL-7.

Os polipéptidos de teste que se confirmou possuírem actividade indutora de CTL por estes métodos são polipéptidos possuindo efeito de activação de DC e subsequente actividade indutora de CTL. Portanto, polipéptidos que induzem CTL contra 23 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ células tumorais são úteis como vacinas contra o cancro do pulmão. Adicionalmente, as APC que adquiriram a capacidade de induzir CTL contra o cancro do pulmão por contacto com os polipéptidos são úteis como vacinas contra o cancro do pulmão. Adicionalmente, os CTL que adquiriram citotoxicidade devido à apresentação dos antigénios polipeptidicos pelas APC podem ser também utilizados como vacinas contra o cancro do pulmão. Estes métodos terapêuticos para o cancro do pulmão, utilizando imunidade antitumoral devido a APC e CTL, são referidos como imunoterapia celular.

Geralmente, quando se utiliza um polipéptido para imunoterapia celular, a eficiência da indução de CTL pode ser aumentada combinando uma pluralidade de polipéptidos possuindo diferentes estruturas e fazendo-os contactar com DC. Portanto, quando se estimulam DC com fragmentos de proteinas, é vantajoso utilizar uma mistura de múltiplos tipos de fragmentos. A indução de imunidade antitumoral por um polipéptido pode ser adicionalmente confirmada observando a indução de produção de anticorpos contra os tumores. Por exemplo, quando são induzidos anticorpos contra um polipéptido num animal de laboratório imunizado com o polipéptido, e quando o crescimento, a proliferação e/ou a metástase de células tumorais são suprimidos por esses anticorpos, é determinado que o polipéptido induz imunidade antitumoral. A imunidade antitumoral pode ser induzida por administração de uma vacina da presente invenção, e a indução de imunidade antitumoral permite o tratamento e a prevenção de cancro do pulmão. A terapia contra, ou a prevenção do inicio de, cancro do pulmão, podem incluir a inibição do crescimento das células de cancro do pulmão, a involução de células do cancro do pulmão e a supressão da ocorrência de células de cancro do pulmão. A diminuição na mortalidade de indivíduos com cancro do pulmão, a diminuição de marcadores de cancro do pulmão no sangue, o alívio de sintomas detectáveis que acompanham o cancro do pulmão, e similares, estão também incluídos na terapia ou na prevenção de cancro do pulmão. Estes efeitos terapêuticos e preventivos são de preferência estatisticamente significativos, por exemplo, observados com 24 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ um nível de significância de 5% ou menos, em que o efeito terapêutico ou preventivo de uma vacina contra o cancro do pulmão é comparado com um controlo sem administração da vacina. Por exemplo, o teste t de Student, o teste U de Mann-Whitney ou o ANOVA podem ser utilizados para a determinação da significância estatística. 0 supramencionado péptido, possuindo actividade imunológica, ou um polipéptido ou um vector que codifica esse péptido, podem ser combinados com um adjuvante. Um adjuvante refere-se a um composto que aumenta a resposta imunitária contra o péptido quando administrado conjuntamente (ou sucessivamente) com o péptido que possui actividade imunológica. Os exemplos de adjuvantes adequados incluem a toxina da cólera, a toxina de Salmonella, alúmen e similares, mas não lhes estão limitados. Adicionalmente, uma vacina da presente divulgação pode ser combinada apropriadamente com um transportador farmaceuticamente aceitável. Os exemplos destes transportadores são a água esterilizada, a solução salina fisiológica, o tampão de fosfato, fluido de cultura e similares. Adicionalmente, a vacina pode conter, conforme necessário, estabilizantes, suspensões, conservantes, tensioactivos e similares. A vacina é administrada sistemicamente ou localmente. A administração da vacina pode ser realizada através de um única administração ou reforçada por múltiplas administrações.

Quando se utilizam APC ou CTL como vacina da presente invenção, o cancro do pulmão pode ser tratado ou prevenido, por exemplo, pelo método ex vivo. Mais especificamente, PBMC do indivíduo que recebe o tratamento ou prevenção são colhidos, e colocados em contacto ex vivo com um péptido da presente invenção. Após a de APC ou CTL, as células podem ser administradas ao indivíduo. As APC podem também ser induzidas por introdução de um vector que codifica o péptido em PBMC ex vivo. As APC ou os CTL induzidos in vitro podem ser clonados antes da administração. Por clonagem e crescimento das células possuindo elevada actividade de danificação de células alvo, a imunoterapia celular pode ser tornada mais eficaz. Adicionalmente, as APC e os CTL isolados desta maneira podem ser utilizados para imunoterapia celular não apenas contra os 25 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ indivíduos de quem as células são derivadas, mas também contra tipos similares de doenças em outros indivíduos.

Aspectos da presente invenção são descritos nos exemplos seguintes, que são apresentados apenas para ilustrar a presente invenção e para auxiliar uma pessoa competente na matéria a praticá-la e utilizá-la.

Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos adiante.

EXEMPLOS A presente invenção é ilustrada, mas não restrita, pelos Exemplos seguintes.

MATERIAIS E MÉTODOS

Linhas celulares

As células A24LCL (HLA-A24/24) e EHM (HLA-A3/3), as linhas celulares linfoblastóides B humanas, foram generosas ofertas de Takara Shuzo Co, Ltd. (Otsu, Japão). As células A24LCL foram utilizadas para ensaios de citotoxicidade mediada pelos péptidos. As linhas celulares de carcinoma do pulmão TE1 (HLA-A2402+), TE13 (HLA-A2402-) e PC9 (HLA-A2402-) foram adquiridas a ATCC. Os níveis de expressão de TTK, URLC10 e KOC1 nas linhas celulares de carcinoma do pulmão foram determinados por microarray de ADNc e RT-PCR que revelaram forte expressão de todos os três genes em expressão de TE1, TTK e KOC1 em PC9, e expressão de URLC10 em TE13 (resultados não mostrados).

Selecção de candidatos de péptido derivado de TTK, URLC10 e KOC1

Os péptidos 9-mero e 1O-mero derivados de TTK, URLC10 ou KOC1 que se ligam à molécula de HLA-A24 foram previstos pelo software de previsão de ligação "BIMAS" (http://bimas.dcrt.nih.qov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) 26 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ (Parker KC, et al., (1994) J Immunol.; 152 (1):163-75.,-Kuzushima K, et al., (2001) Blood.; 98 (6): 1872-81.)· Estes péptidos foram sintetizados por Mimotopes (San Diego, LA) de acordo com o método padrão de síntese em fase sólida e foram purificados por HPLC de fase inversa. A pureza (>90%) e a identidade dos péptidos foram determinadas por HPLC analítica e análise por espectrometria de massa, respectivamente. Os péptidos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml e armazenados a -80°C.

Indução de CTL in vitro

Utilizaram-se células dendríticas (DC) derivadas de monócitos como células apresentadoras de antigénio (APC) para induzir respostas de CTL contra péptidos apresentados em HLA.

As DC foram geradas in vitro como descrito noutros documentos (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Câncer 80, 92-7., Tsai V et al., (1997) J. Immunol 158:1796-802.). Resumidamente, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) isoladas de um voluntário normal (HLA-A*2402) por solução Ficoll-Paque (Pharmacia) foram separadas por aderência a um balão de plástico de cultura de tecidos (Becton Dickinson) de modo enriquecê-las na fracção de monócitos. A população enriquecida em monócitos foi cultivada na presença de 1000 U/ml de GM-CSF (fornecido por Kirin Brewery Company) e 1000 U/ml de IL-4 (Genzyme) em AIM-V (Invitrogen) contendo 2% de soro autólogo (AS) inactivado por calor. Após 7 dias na cultura, as DC geradas por citóquinas foram pulsadas com 20 pg/ml de péptidos que se ligam a HLA-A24 na presença de 3 yg/ml de 2- microglobulina durante 4 h a 20°C em AIM-V. Estas DC pulsadas com péptido foram então irradiadas (5500 rad) e misturadas numa razão de 1:20 com células T CD8+ autólogas, obtidas por selecção positiva com Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) e DETACHa BEAD™ (Dynal). Estas culturas foram estabelecidas em placas de 48 poços (Corning); cada poço continha 1,5 x 104 DC pulsadas com péptido, 3 x 105 células T CD8+ e 10 ng/ml de IL-7 (Genzyme) em 0,5 ml de AIM-V/2% de AS. Três dias mais tarde, estas culturas foram suplementadas com IL-2 (CHIRON) até uma concentração final de 20 IU/ml. Nos dias 7 e 14, as células T foram adicionalmente reestimuladas com as DC pulsadas com péptido autólogas. As DC foram preparadas de cada vez da mesma maneira que se descreveu acima. A citotoxicidade foi testada 27 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ contra células A24LCL pulsadas com péptido após o 3.° ciclo de estimulação com péptido no dia 21.

Procedimento de Expansão de CTL

Os CTL foram expandidos em cultura utilizando o método similar ao descrito por Riddell SR, et al., (Walter EA et al., (1995) N Engl J Med 333:1038-44.;, Riddel et al., (1996) Nature Med. 2:216-23.) . Um total de 5 x 104 dos CTL foram ressuspensos em 25 ml de AIM-V/5% de AS com 25 x 106 PBMC irradiadas (3300 rad) e 5 x 106 células EHM irradiadas (8000 rad) na presença de 40 ng/ml de anticorpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen) . Um dia após a iniciação das culturas, adicionaram-se 120 IU/ml de IL-2 às culturas. As culturas foram alimentadas com AIM-V/5% de AS fresco contendo 30 IU/ml de IL-2 nos dias 5, 8 e 11.

Estabelecimento de clones de CTL

As diluições foram efectuadas de modo a ter 0,3, 1 e 3 CTL/poço numa placa de microtítulo de fundo redondo de 96 poços (Nalge Nunc International). Os CTL foram cultivados com 7χ104 células/poço de PBMC alogénicas, lxlO4 células/poço de EHM, 30 ng/ml de anticorpo anti-CD3, e 125 U/ml de IL-2 no total de 150 μΐ/poço de AIM-V contendo 5% de AS. Adicionaram-se 50 μΐ/poço de IL-2 ao meio 10 dias mais tarde de modo que a IL-2 ficou a 125 U/ml na concentração final. A actividade citotóxica dos CTL foi testada no 14° dia, e os clones de CTL foram expandidos utilizando o mesmo método que acima.

Ensaio de Citotoxicidade

As células alvo foram marcadas com 100 pCi de Na251Cr04 durante lha 37°C numa incubadora com CO2 (Perkin Elmer Life Sciences). Prepararam-se alvos pulsados com péptido incubando as células com 20 pg/ml do péptido durante 16 h a 37°C antes da marcação. Enxaguaram-se as células alvo marcadas e misturaram-se com células efectoras num volume final de 0,2 ml em placas de microtítulo de fundo redondo. Centrifugaram-se as placas (4 minutos a 800 x g) para aumentar o contacto célula-com-célula e colocaram-se numa incubadora com CO2 a 37°C. Após 28 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 4 h de incubação, recolheram-se 0,1 ml do sobrenadante de cada poço e determinou-se a radioactividade com um contador gama. A percentagem de citotoxicidade específica foi determinada calculando a percentagem de libertação específica de 51Cr através da seguinte fórmula: { (cpm da libertação da amostra de teste — cpm da libertação espontânea)/(cpm da libertação máxima — cpm da libertação espontânea)} x 100 A libertação espontânea foi determinada incubando as células alvo sozinhas, na ausência de células efectoras, e a libertação máxima foi obtida incubando as células alvo com HC1 IN. Todas as medições foram realizadas em duplicado, e os erros-padrão das médias foram consistentemente inferiores a 10% do valor da média. A especificidade para com o antigénio foi confirmada pelo ensaio de inibição de alvo frio, que utilizou células A24LCL não marcadas que foram pulsadas com ou sem péptido (20 pg/ml durante 16 h a 37°C) para competir pelo reconhecimento de células tumorais marcadas com 51Cr. 0 ensaio de bloqueio de citotoxicidade utilizando os anticorpos monoclonais (mAb) (mAb de ratinho anti-MHC-classe I, mAb anti-MHC-classe II, mAb anti-CD8 e mAb anti-CD4) foi realizado para confirmar o modo de restrição por HLA. Utilizaram-se mAb anti-IgGl de ratinho, anti-IgG2a de ratinho como Isotipo.

RESULTADOS

Previsão de péptidos que se ligam ao HLA—A24 derivados de TTK, UKLC10 ou KOC1

A Tabela 1 mostra os péptidos que se ligam a HLA-A*2402 para TTK (Acesso no GenBank n.° NM_003318; SEQ ID NO: 1, 2) por ordem de afinidade de ligação. A Tabela IA mostra péptidos 9-mero derivados de TTK e a Tabela 1B mostra péptidos 10-mero derivados de TTK. A Tabela 2 mostra os péptidos que se ligam a HLA-A*2402 para URLC10 (Acesso no GenBank n.° AB105187; SEQ ID NO: 3, 4) por ordem de afinidade de ligação. A Tabela 2A mostra péptidos 9-mero derivados de URLC10 e a Tabela 2B 29 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ mostra péptidos 1 O-mero derivados de URLC10. A Tabela 3 mostra os péptidos que se ligam a HLA-A*2402 para KOC1 (Acesso no GenBank n.° NM_006547; SEQ ID NO: 5, 6) por ordem de afinidade de ligação. A Tabela 3A mostra péptidos 9-mero derivados de KOC1 e a Tabela 3B mostra péptidos 10-mero derivados de KOC1.

Tabela IA. Péptidos 9-mero que se ligam a HLA-A24 derivados de TTK

Posição de Inicio Sequência de Aminoácidos SEQ Pontuação ID de NO: Ligação Posição de Inicio Sequência de aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação 90 RYSQAIEAL 7 400 71 KLEKNSVPL 17 12 567 SYRNEIAYL 8 200 201 KNLSASTVL 18 12 N.D 549 IYAIKYVNL 9 200 467 RTPVVKNDF 19 10, 1 N.D 590 DYEITDQYI 10 90 102 KYGQNESFA 20 10 N.D 652 NFLIVDGML 11 42 19 KVRDIKNKF 21 8,9 N.D 141 KFAFVHISF 12 28 777 KQRISIPEL 22 8,8 N.D 214 SFSGSLGHL 13 20 75 NSVPLSDAL 23 8,6 N.D 28 KNEDLTDEL 14 19 605 GNIDLNSWL 24 8,6 N.D 111 RIQVRFAEL 15 15, 8 596 QYIYMVMEC 25 8,3 N.D 108 SFARIQVRF 16 14 535 GSSKVFQVL 26 8,1 N.D A posição de inicio indica . o número do aminoácido a partir do terminal N de TTK. A pontuação de ligação é derivada de "BIMAS" descrito em Materiais e Métodos. N.D. indica "não determinado"

Tabela 1B. Péptidos 10-mero que se ligam a HLA-A24 derivados de TTK

Posição de Inicio Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação Posição de Inicio Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação 810 KYVLGQLVGL 27 600 168 KAVERGAVPL 37 14, 4 725 YYMTYGKTPF 28 150 232 RGQTTKARFL 38 12 598 IYMVMECGNI 29 75 185 RNLNLQKKQL 39 12 728 TYGKTPFQQI 30 72 777 KQRISIPELL 40 11,2 755 EFPDIPEKDL 31 36 573 AYLNKLQQHS 41 10, 8 490 CFQQQQHQIL 32 36 373 EYQEPEVPES 42 9,9 143 AFVHISFAQF 33 18 74 KNSVPLSDAL 43 9,6 569 RNEIAYLNKL 34 15, 8 315 KPSGNDSCEL 44 8,8 359 KTESSLLAKL 35 15, 8 61 NPEDWLSLLL 45 8,6 553 KYVNLEEADN 36 15 763 DLQDVLKCCL 46 co A posição de inicio indica o número do aminoácido a partir do terminal N de TTK. A pontuação de ligação é derivada de "BIMAS" descrito em Materiais e Métodos. 30 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Tabela 2Α. Péptidos 9-mero que se ligam a HLA-A24 derivados de URLC10

Posição de Início Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação Posição de Início Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação 154 KPEEKRFLL 47 14, 4 193 EYAGSMGES 57 LO LO N.D 48 RADPPWAPL 48 9,6 168 FFYLKCCKI 58 LO LO N.D 205 LWLAILLLL 49 00 0^ 128 AAVKIFPRF 59 5 N.D 57 GTMALLALL 50 7,2 58 TMALLALLL 60 00 N.D 203 GGLWLAILL 51 7,2 152 RPKPEEKRF 61 d^ 00 N.D 62 LALLLWAL 52 7,2 197 SMGESCGGL 62 00 N.D 53 WAPLGTMA L 53 6 173 CCKIRYCNL 63 4 N.D 214 ASIAAGLSL 54 6 28 DPGRGARRL 64 4 N.D 54 APLGTMALL 55 6 31 RGARRLRRF 65 4 N.D 212 LLASIAAGL 56 5,6 N.D 202 CGGLWLAIL 66 4 N.D A posição de início indica o número do aminoácido a partir do terminal N de URLC10. A pontuação de ligação é derivada de e Métodos. N.D. indica "não determinado" "BIMAS" descrito em Materiais

Tabela 2B. Péptidos 10 -mero que se ligam a HLA-A24 derivados de URLC10 Posição de Início Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação Posição de Início Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de Ligação 177 RYCNLEGPPI 67 100 196 GSMGESCGGL 77 6 N.D 159 RFLLEEPMPF 68 30 204 GLWLAILLLL 78 5, 6 N.D 152 RPKPEEKRFL 69 9,6 123 PYCVIAAVKI 79 5, 5 N.D 211 LLLASIAAGL 70 CO dú> 193 EYAGSMGESC 80 5 N.D 172 KCCKIRYCNL 71 8 61 L LALLLWAL 81 4,8 N.S 169 FYLKCCKIRY 72 7,5 202 CGGLWLAILL 82 d^ OO N.D 57 GTMALLALLL 73 7,2 56 LGTMALLALL 83 d^ OO N.D 53 WAPLGTMALL 74 6 70 LPRVWTDANL 84 4 N.D 203 GGLWLAILLL 75 6 N.D 201 SCGGLWLAIL 85 4 N.D 198 MGESCGGLWL 76 6 N.D 213 LASIAAGLSL 86 4 N.D A posição de início indica o número do aminoácido a partir do terminal N de URLC10. A pontuação de ligação é derivada de "BIMAS" descrito em Materiais e Métodos. N.D. indica "não determinado". N.S. indica "não sintetizado" 31 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Tabela 3Α. Péptidos 9-mero que se ligam a HLA-A24 derivados de K0C1

Posição de inicio Sequência de aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de ligação Posição de início Sequência de aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de ligação 350 SYENDIASM 87 37,5 4 LYIGNLSEN 97 8,25 141 GFQLENFTL 88 30 423 KQGQHIKQL 98 8 N.D 508 KTVNELQNL 89 14, 4 561 KQHQQQKAL 99 8 N.D 26 KIPVSGPFL 90 12 310 ITISPLQEL 100 7,9 N.D 192 KPCDLPLRL 91 11,5 470 IYGKIKEEN 101 7,7 N.D 433 RFAGASIKI 92 11 356 ASMNLQAHL 102 7,2 N.D 505 KGGKTVNEL 93 10,6 93 QWEVLDSLL 103 7,2 N.D 190 KQKPCDLPL 94 9,6 43 DCPDESWAL 104 7,2 N.D 152 AYIPDEMAA 95 9 92 LQWEVLDSL 105 6,7 N.D 320 LYNPERTIT 96 9 55 EALSGKIEL 106 6,6 N.D A posição de início indica o número do aminoácido a partir do terminal N de K0C1. A pontuação de ligação é derivada de "BIMAS" descrito em Materiais e Métodos. N.D. indica "não determinado"

Tabela 3B. Péptidos 1 O-mero que se ligam a HLA-A24 derivados de K0C1

Posição de início Sequência de aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de ligação Posição de inicio Sequência de aminoácidos SEQ ID NO: Pontuação de ligação 470 IYGKIKEENF 107 100 91 HLQWEVLDSL 117 8,4 N.D 272 KFTEEIPLKI 108 18,5 359 NLQAHLIPGL 118 7,2 N.D 290 RLIGKEGRNL 109 12 364 LIPGLNLNAL 119 7,2 N.D 309 KITISPLQEL 110 10,6 165 LQQPRGRRGL 120 7,2 N.D 350 SYENDIASMN 111 10,5 273 FTEEIPLKIL 121 7,2 N.D 192 KPCDLPLRLL 112 9,6 406 ETVHLFIPAL 122 6 N.D 320 LYNPERTITV 113 9 N.D 138 KLNGFQLENF 123 6 N.D 4 LYIGNLSENA 114 9 N.D 9 LSENAAPSDL 124 6 N.D 548 VAQRKIQEIL 115 8,4 N.D 88 IPPHLQWEVL 125 6 N.D 83 LQIRNIPPHL 116 8,4 N.D 127 SSKDQARQAL 126 5,7 N.D A posição de início indica o número do aminoácido a partir do terminal N de K0C1. A pontuação de ligação é derivada de "BIMAS" descrito em Materiais e Métodos. N.D. indica "não determinado"

Estimulação das células T utilizando os péptidos previstos

Os CTL para os péptidos derivados de TTK, URLC10 ou KOC1 foram gerados da maneira descrita na secção "Materiais e 32 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ Métodos" acima. Expandiram-se os CTL resultantes que apresentam actividade citotóxica detectável, e estabeleceram-se os clones de CTL que demonstraram actividades citotóxicas superiores contra o alvo pulsado com péptido em comparação com as actividades contra o alvo sem pulso de péptido.

Os clones de CTL estimulados pelos péptidos que se ligam a HLA-A24 TTK-567 (SYRNEIAYL (SEQ ID NO: 8)) (Figura 1), URLC10-177 (RYCNLEGPPI (SEQ ID NO:67)) (Figura 2) ou por K0C1-508 (KTVNELQNL (SEQ ID NO:89)) (Figura 3) apresentaram potente actividade citotóxica contra o alvo pulsado com péptido sem apresentarem nenhuma actividade citotóxica significativa contra alvos não pulsados com nenhum péptido.

Actividade citotóxica contra linhas celulares de cancro do pulmão que expressam endogenamente TTK, URLC10 ou KOC1

Os clones de CTL estabelecidos descritos acima foram examinados quanto à sua capacidade de reconhecer e matar células tumorais que expressam endogenamente TTK, URLC10 ou KOC1. A actividade citotóxica contra células TE1, que expressam endogenamente TTK e HLA-A24, foi testada utilizando como células efectoras o clone de CTL criado por TTK-567. As células PC9 foram utilizadas como células alvo que expressam endogenamente TTK mas não HLA-A24. O clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra as células TE1 que expressam TTK e HLA-A24. Por outro lado, não apresentou actividade citotóxica significativa contra as células PC9 que expressam TTK mas não HLA-A24 (Figura 4). A actividade citotóxica contra células TE1, que expressam endogenamente

URLC10 e HLA-A24, foi testada utilizando como células efectoras o clone de CTL criado por URLC10-177. As células TE13 foram utilizadas como células alvo que expressam endogenamente URLC10 mas não HLA-A24. O clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra as células TEl que expressam URLC10 e HLA-A24. Por outro lado, não apresentou actividade citotóxica significativa contra as células TE13 que expressam URLC10 mas não HLA-A24 (Figura 5). A actividade citotóxica contra células TEl, que expressam endogenamente KOC1 e HLA-A24, foi testada utilizando como células efectoras o clone de CTL criado por KOC1-508. As células PC9 foram 33 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ utilizadas como células alvo que expressam endogenamente KOC1 mas não HLA-A24. 0 clone de CTL apresentou elevada actividade citotóxica contra as células TE1 que expressam KOC1 e HLA-A24. Por outro lado, não apresentou actividade citotóxica significativa contra as células PC9 que expressam KOC1 mas não HLA-A24 (Figura 6).

Os clones de CTL descritos acima apresentaram actividade citotóxica potente contra a linha celular TE1 de cancro do pulmão, uma linha celular que expressa TTK, URLC10 e K0C1, e HLA-A24. Por outro lado, os clones de CTL contra TTK-567 ou KOC1-508 não apresentaram actividade citotóxica contra a linha celular PC9 de cancro do pulmão, uma linha celular que expressa TTK e KOC1 mas não HLA-A24; do mesmo modo, o clone de CTL criado contra URLC10-177 não apresentou actividade citotóxica contra a linha celular TE13 de cancro do pulmão, uma linha celular que expressa URLC10 mas não HLA-A24. Estes clones de CTL também não apresentam actividade citotóxica contra células A24LCL, células que expressam HLA-A24, mas não expressam TTK, URLC10 nem KOC1 (Figura 1, 2 e 3) . Estes resultados demonstram claramente que TTK-567, URLC10-177 e KOC1-508 eram expressos naturalmente na superfície de células tumorais com molécula de HLA-A24 e reconhecidos pelos CTL.

Ensaio de inibição de alvo frio 0 ensaio de inibição de alvo frio foi realizado para confirmar a especificidade dos clones de CTL como descrito na secção de "Materiais e Métodos" acima. Prepararam-se células TE1 marcadas com Na251Cr04 como alvo quente, enquanto células A24LCL pulsadas com péptido TTK-567 foram utilizadas como alvo frio (Inibidor). A actividade citotóxica do clone de CTL TTK-567 contra células TE1 foi especificamente inibida pela adição de células A24LCL pulsadas com o péptido idêntico (Figura 7). Em relação a URLC10, prepararam-se células TE1 marcadas com Na251Cr04 como alvo quente, enquanto células A24LCL pulsadas com péptido URLC10-177 foram utilizadas como alvo frio (Inibidor). A actividade citotóxica do clone de CTL URLC10-177 contra TE1 foi especificamente inibida pela adição de células A24LCL pulsadas com o péptido idêntico (Figura 8). Como acima, prepararam-se células TE1 marcadas com Na251Cr04 como alvo quente, enquanto células A24LCL pulsadas com péptido 34 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ KOC1-508 foram utilizadas como alvo frio (Inibidor). A razão E/T foi fixada em 20. A actividade citotóxica do clone de CTL KOC1-508 contra células TE1 foi especificamente inibida pela adição de células A24LCL pulsadas com o péptido idêntico (Figura 9) . A citotoxicidade especifica contra células alvo TE1 foi significativamente inibida quando se adicionou alvo frio pulsado com péptido no ensaio em várias razões mas não foi de todo inibida pela adição de alvo frio. Estes resultados foram indicados como uma percentagem de inibição de lise específica à razão E/T de 20.

Bloqueio da actividade de CTL por anticorpos que se ligam a antigénios de superfície de células T

Para verificar se a actividade de morte observada é mediada pelas células T citotóxicas, investigaram-se os efeitos de anticorpos sobre as actividades de morte, em que se utilizaram anticorpos que reconhecem antigénios de superfície de células T relacionados com a função de CTL. As actividades dos CTL foram claramente bloqueadas pela adição de anticorpos que reconhecem o HLA de Classe I e CD8 mas são pouco afectadas pela adição de anticorpos para o HLA de Classe II ou CD4, como o clone de CTL TTK-567 mostrado na Figura 10, o clone de CTL URLC10-177 na Figura 11 e o clone de CTL KOC1-508 na

Figura 12. Estes resultados mostram que as actividades citotóxicas de clones de CTL contra as células de carcinoma do pulmão são a actividade citotóxica restrita pelo HLA de classe I e mediada por CD8.

Análise de homologia dos péptidos antiqénicos

Os clones de CTL estabelecidos contra TTK-567, URLC10-177 ou KOC1-508 apresentaram potente actividade citotóxica. Assim, é possível que a sequência de TTK-567, URLC10-177 ou KOC1-508 seja homóloga aos péptidos derivados de outras moléculas, que se sabe que sensibilizam o sistema imunitário humano. Para excluir esta possibilidade, foi realizada uma análise de homologia com as sequências peptídicas como interrogação utilizando o algoritmo BLAST (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast. cgi) (Altschul SF, et al., (1997) Nucleic Acids Res.; 25 (17) :3389-402.; Altschul SF, et al., (1990) J Mol Biol.; 215 (3):403-10.) e esta não revelou 35 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ nenhuma sequência com homologia significativa. Estes resultados indicam que as sequências de TTK-567, URLC10-177 e KOC1-508 são únicas e há pouca possibilidade que os péptidos criem respostas imunológicas não pretendidas contra uma molécula não relacionada.

DISCUSSÃO A identificação de novos TAA, particularmente aqueles que induzem respostas imunitárias antitumorais potentes e especificas, garante o desenvolvimento adicional da aplicação clinica de estratégias de vacinação com péptidos em vários tipos de cancros (Boon T. et al., (1996) J Exp Med 183: 725- 9.; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.;

Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88.; Chen Y.T. et al., (1997) Proc.

Natl. Acd. Scl. USA, 94: 1914-8.; Harris CC., (1996) J Natl Câncer Inst 88 : 1442-5.; Butterfield LH et al., (1999) Câncer

Res 59:3134-42 .; Vissers JL et al., (1999) Câncer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH et al., (1996) J. Immunol 156:3308- 14.; Tanaka F et al., (1997) Câncer Res 57:4465-8.; Fujie T et al., (1999) Int J Câncer 80 : 169-72 .; Kikuchi M et al., (1999) Int J Câncer 81 : 459-66.; Oiso M et al., (1999) Int J Câncer 81:387-94.).

As tecnologias de microarrays de ADNc podem revelar perfis compreensivos de expressão génica de células malignas (Okabe H. et al., (2001) Câncer Res., 61, 2129-37.; Lin Y-M. et al., (2002) Oncogene, 21;4120-8.; Hasegawa S. et al., (2002) Câncer Res 62:7012-7.) e, ter utilidade na identificação de potenciais TAA. Entre os transcritos que são supra-regulados nos cancros do pulmão, foram identificados três novos genes humanos, denominados TTK, URLC10 e KOC1, respectivamente, utilizando estas tecnologias.

Como demonstrado acima, TTK, URLC10 e KOC1 são sobre-expressos no cancro do pulmão e apresentam uma expressão mínima em tecidos normais. Em adição, mostrou-se que estes genes possuem uma função significativa relacionada com a proliferação celular (Veja-se W02004/031413). Assim, péptidos derivados de TTK, URLC10 e KOC1 podem servir como epítopos de 36 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ ΤΑΑ, os quais, por sua vez, podem ser utilizados para induzir respostas imunitárias significativas e específicas contra células cancerosas.

Assim, como TTK, URLC10 e KOC1 são novos TAA, vacinas contra o cancro utilizando estes péptidos epitópicos podem ser úteis como imunoterapêuticos contra o carcinoma do pulmão ou outro cancro que expressa estas moléculas.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente divulgação identifica um novo TAA, particularmente aqueles que induzem respostas imunitárias antitumorais potentes e específicas. Estes TAA garantem o desenvolvimento adicional da aplicação clinica da estratégia de vacinação com péptidos no cancro do pulmão.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se aos itens seguintes: 1. Um péptido isolado com menos do que cerca de 15 aminoácidos seleccionado do grupo que consiste em péptidos compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 67 e 89.

2. Um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, em que o referido péptido compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 67 e 89, em que 1, 2, ou vários aminoácidos estão substituídos, eliminados ou adicionados. 3. 0 péptido do item 2, em que o segundo aminoácido do terminal N é fenilalanina, tirosina, metionina ou triptofano. 4. 0 péptido do item 2, em que o aminoácido C-terminal é fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano ou metionina. 5. Uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção do cancro do pulmão, a referida composição compreendendo um ou mais péptidos do item 1 ou 2. 6. Um exossoma que apresenta na sua superfície um complexo compreendendo um péptido do item 1 ou 2 e um antigénio do HLA. 37 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 7. Ο exossoma do item 6, em que o antigénio do HLA é HLA-A24. 8. 0 exossoma do item 7, em que o antigénio do HLA é HLA-A2402. 9. Um método de indução de células apresentadoras de antigénio possuindo uma elevada indutibilidade de células T citotóxicas compreendendo o passo de contacto de uma célula apresentadora de antigénio com um péptido do item 1 ou 2. 10. Um método de indução de células T citotóxicas por contacto de uma célula T com um péptido do item 1 ou 2. 11. O método de indução de células apresentadoras de antigénio possuindo elevada indutibilidade de células T citotóxicas, o referido método compreendendo o passo de transferência de um gene compreendendo um polinucleótido que codifica um péptido do item 1 ou 2 para uma célula apresentadora de antigénio. 12. Uma célula T citotóxica isolada que é induzida por contacto de uma célula T com um péptido do item 1 ou 2. 13. Uma célula apresentadora de antigénio, que compreende um complexo formado entre um antigénio do HLA e um péptido do item: 1 ou 2. 14. A célula apresentadora de antigénio do item 13, induzida pelo método da reivindicação 9. 15. Uma vacina para inibição da proliferação de células de cancro do pulmão, em que a vacina compreende um péptido do item 1 ou 2 como ingrediente activo. 16. A vacina do item 15, formulada para administração a um indivíduo cujo antigénio do HLA é HLA-A24. 17. A vacina do item 15, sendo a referida vacina capaz de suprimir o crescimento de células de cancro do pulmão. 18. Um método de tratamento ou prevenção de cancro do pulmão num indivíduo compreendendo a administração ao referido indivíduo de uma vacina compreendendo um péptido do item 1 ou 2, um seu fragmento imunologicamente activo, ou um 38 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ polinucleótido que codifica o referido péptido ou fragmento imunologicamente activo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> Vacinas peptídicas para cancros do pulmão que expressam polipéptidos TTK, URLC10 ou K0C1 <130> N2624 EP/1 S3 <150> US 60/656,857 <151> 2005-02-25 <160> 126 <170> Patentln version 3.1

<210> 1 <211> 2984 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ggaaattcaa acgtgtttgc ggaaaggagt ttgggttcca tcttttcatt tccccagcgc 60 agctttctgt agaaatggaa tccgaggatt taagtggcag agaattgaca attgattcca 120 taatgaacaa agtgagagac attaaaaata agtttaaaaa tgaagacctt actgatgaac 180 taagcttgaa taaaatttct gctgatacta cagataactc gggaactgtt aaccaaatta 240 tgatgatggc aaacaaccca gaggactggt tgagtttgtt gctcaaacta gagaaaaaca 300 gtgttccgct aagtgatgct cttttaaata aattgattgg tcgttacagt caagcsattg 360 aagcgcttcc cceagataaa tatggccaaa atgagagttt tgctagaatt caagtgagat 420 ttgctgaatt aaaagctatt caagagccag atgatgcacg tgactacttt caaatggcca 480 gagcaaactg caagaaattt gcttttgttc atatatcttt tgcacaattt gaactgtcac 540 aaggtaatgt caaaaaaagt aaacaacttc ttcaaaaagc tçtagaacgt ggagcagtac 600 cactagaaat gctggaaatt gccctgcgga atttaaacct ccaaaaaaag caçctgcttt 660 cagaggagga aaagaagaat ttatcagcat ctacggtatt aactgcceaa gaatcatttt 720 ccggttcact tgggcattta cagaatagga acaacagttg tgattccaga ggacagacta 780 etaaagccag gtttttatat ggagagaaca tgeeaecaca agatgcagaa ataggttacc 840 ggaattcatt gagacaaact aacaaaacta aacagtcarg cccatttgga agagtcccag 900 ttaaccttct aaatagccca gattgtgatg tgaagacaga tgattcagtt gtaccttgtt 960 ttatgaaaag acaaacctct agatcagaat gccgagattt ggttgtgcct ggatctaaac 1020 caagtggaaa tgattcctgt gaattaagaa atttaaagtc tgttcaaaat agtcatttca 1080 aggaacctct ggtgtcagat gaaaagagtt ctgaacttat tattactgat tcaataaccc 1140 EP 2 325 305/PT 39 tgaagaataa aacggaatca agtcttctag ctaaattaga agaaactaaa gagtatcaag 1200 aaccagaggt tccagagagt aaccagaaac agtggcaatc taagagaaag tcagagtgta 1260 ttaaccagaa tcctgctgca tcttcaaatc actggeagat tccggagtta gcccgaaaag 1320 ttaatacaça gcagaaacat accacttttg agcaacctgt cttttcagtt tcaaaacagt 1380 caccaccaat atcaacatct aaatggtttg acccaaaatc tatttgtaag acaccaagca 1440 gcaatacctt ggatgattac atgagctgtt ttagaactcc agttgtaaag aatgactttc 1500 cacctgcttg tcagttgtca acaccttatg gccaacctgc ctgtttccag cagcaacagc 1560 atcaaatact tgccactcca cttcaaaatt tacaggtttt agcatcttct tcagcaaatg 1620 aatgcattte ggttaaagga agaatttatt ccattttaaa gcagatagga agtggaggtt 1680 caagcaaggt atttcaggtg ttaaatgaaa agaaacagat atatgctata aaatatgtga 1740 acttagaaga agcagataac caaactcttg atagttaccg gaacgaaata gcttatttga 1800 ataaactaca acaacacagt gataagatca tccgacttta tgattatgaa atcacggacc 1860 agtacatcta catggtaatg gagtgtggaa atattgatct taatagttgg cttaaaaaga 1920 aaaaatccat tgatccatgg gaacgcaaga gttactggaa aaatatgtta gaggcagttc 1980 acacaatcca tcaacatggc attgttcaca gtgatcttaa accagctaac tttctgatag 2040 ttgatggaat gctaaagcta attgattttg ggattgcaaa ccaaatgcaa ccagatacaa 2100 caagtgttgt taaagattct caggttggca cagttaatta tatgccacca gaagcaatca 2160 aagatatgtc ttcctccaga gagaatggga aatctaagtc aaagataagc cccaaaagtg 2220 atgtttggtc cttaggatgt attttgtact atatgactta cgggaaaaca ccatttcagc 2280 agataattaa tcagatttct aaattacatg ccataattga tcctaatcat gaaattgaat 2340 ttcccgatat tccagagaaa gatcttcaag atgtgttaaa gtgttgttta aaaagggacc 2400 caaaacagag gatatccatt cctgagçtcc tggctcatcc ctatgttcaa attcaaactc 24 60 atccagttaa ccaaatggcc aagggaacca ctgaagaaat gaaatatgtt ctgggccaac 2520 ttgttggtct gaattctcct aactccattt tgaaagctgc taaaacttta tatgaacact 2580 atagtggtgg tgaaagtcat aattcttcat cctccaagac ttttgaaaaa aaaaggggaa 2640 aaaaatgatt tgcagttatt cgtaatgtca aataccacct ataaaatata ttggactgtt 2700 atactcttga atccctgtgg aaatctacat ttgaagacaa catcactctg aagtgttatc 2760 agcaaaaaaa attcagtaga ttatctttaa aagaaaactg taaaaatagc aaccacttat 2820 ggtactgtat atattgtaga cttgttttct ctgttttatg ctcttgtçta atctacttga 2880 catcatttta ctcttggaat agtgggtgga tagcaagtat attctaaaaa actttgtaaa 2940 taaagttttg tggctaaaat gacactaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2984 40ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <210> 2 <211 > 857 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Ser Glu Asp Leu Ser 1 5 Met Asn Lys val Arg Asp Ile 20 Thr Asp Glu Leu Ser Leu Asn 35 Ser Gly Thr Val Asn Gin Ile 50 55 . Trp Leu Ser Leu Leu Leu Lys 65 70 Asp Ala Leu Leu Asn Lys Leu 85 Ala Leu Pro Pro Asp Lys Tyr 100 Gin Vai Arg Phe Ala Glu Leu 115 Arg Asp Tyr Phe Gin Met Ala 130 135 Vai His Ile Ser Phe Ala Gin 145 150 Lys Ser Lys Gin Leu Leu Gin 165 Leu Glu Met Leu Glu Ile Ala 180

Arg Glu Leu Thr Ile Asp Ser Ile 10 15

Asn Lys Phe Lys Asn Glu Asp Leu 25 30

Ile Ser Ala Asp Thr Thr Asp Asn 45

Met Met Ala Asn Asn Pro Glu Asp 60

Glu Lys Asn Ser Vai Pro Leu Ser 75 80

Gly Arg Tyr Ser Gin Ala Ile Glu 90 95

Gin Asn Glu Ser Phe Ala Arg Ile 105 110

Ala ile Gin Glu Pro Asp Asp Ala 125

Ala Asn Cys Lys Lys Phe Ala Phe 140

Glu Leu Ser Gin Gly Asn Vai Lys 155 - 160

Ala Vai Glu Arg Gly Ala Vai Pro 170 175

Arg Asn Leu Asn Leu Gin Lys Lys 185 190 41 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Gin Leu Leu Ser Glu Glu Glu Lys 195 200

Lys Asn Leu Ser Ala Ser Thr Vai 205

Leu Thr Ala Gin Glu Ser Phe Ser 210 215

Gly Ser Leu Gly His Leu Gin Asn 220

Arg Asn Aan Ser Cys Asp Ser Arg 225 230

Gly Gin Thr Thr Lys Ala Arg Phe 235 240

Leu Tyr Gly Glu Asn Met Pro Pro 245

Gin Asp Ala Glu Ile Gly Tyr Arg 250 255

Asn Ser Leu Arg Gin Thr Asn Lys 260

Thr Lys Gin Ser Cys Pro Phe Gly 265 270

Arg Vai Pro Vai Asn Leu Leu Asn 275 280

Ser Pro Asp Cys Asp Vai Lys Thr 285

Asp Asp Ser Vai Vai Pro Cys Phe 290 295

Met Lys Arg Gin Thr Ser Arg Ser 300

Glu Cys Arg Asp Leu Vai Vai Pro 305 310

Gly Ser Lys Pro Ser Gly Asn Asp 315 320

Ser Cys Glu Leu Arg Asn Leu Lys 325

Ser Vai Gin Asn Ser His Phe Lys 330 335

Glu Pro Leu Vai Ser Asp Glu Lys 340

Ser Ser Glu Leu Ile Ile Thr Asp 345 350

Ser Ile Thr Leu Lys Asn Lys Thr 355 360

Glu Ser Ser Leu Leu Ala Lys Leu 365

Glu Glu Thr Lys Glu Tyr Gin Glu 370 375

Pro Glu Vai Pro Glu Ser Asn Gin 380

Lys Gin Trp Gin Ser Lys Arg Lys 385 390

Ser Glu Cys Ile Asn Gin Asn Pro 395 400

Ala Ala Ser Ser Asn His Trp Gin 405

Ile Pro Glu Leu Ala Arg Lys Vai 410 415

Asn Thr Glu Gin Lys His Thr Thr 420

Phe Glu Gin Pro Vai Phe Ser Vai 425 430 42 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Ser Lys Gin Ser Pro Pro Ile Ser Thr Ser Lys Trp Phe Asp Pro Lys 435 440 445

Ser He Cys Lys Thr Pro Ser Ser Asn Thr Leu Asp Asp Tyr Met Ser 450 455 460

Cys Phe Arg Thr Pro Vai Vai Lys Asn Asp Phe Pro Pro Ala Cys Gin 465 470 475 4Θ0

Leu Ser Thr Pro Tyr Gly Gin Pro Ala Cys Phe Gin Gin Gin Gin His 485 490 495

Gin Ile Leu Ala Thr Pro Leu Gin Asn Leu Gin Vai Leu Ala Ser Ser 500 505 510

Ser Ala Asn Glu Cys Ile Ser Vai Lys Gly Arg lie Tyr Ser lie Leu 515 520 525

Lys Gin Ile Gly Ser Gly Gly Ser Ser Lys Vai Phe Gin Vai Leu Asn 530 535 540

Glu Lys Lys Gin Ile Tyr Ala Ile Lys Tyr Vai Asn Leu Glu Glu Ala 545 550 555 560

Asp Asn Gin Thr Leu Asp Ser Tyr Arg Asn Glu Ile Ala Tyr Leu Asn 565 570 575

Lys Leu Gin Gin His Ser Asp Lys Ile Ile Arg Leu Tyr Asp Tyr Glu 580 585 590

Ile Thr Asp Gin Tyr Ile Tyr Met Vai Met Glu Cys Gly Asn ile Asp 595 600 605

Leu Asn Ser Trp Leu Lys Lys Lys Lys Ser He Asp Pro Trp Glu Arg 610 615 620

Lys Ser Tyr Trp Lys Asn Met Leu Glu Ala Vai -His Thr Ile His Gin 625 630 635 640

His Gly Ile Vai His Ser Asp Leu Lys Pro Ala Asn Phe Leu Ile Vai 645 650 655

Asp Gly Met Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ile Ala Asn Gin Met Gin 660 665 670

Pro Asp Thr Thr Ser Vai Vai Lys Asp Ser Gin Vai Gly Thr Vai Asn 675 680 685 43 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Tyr Met Pro Pro Glu Ala Xle Lys Asp Met Ser Ser Ser Arg Glu Asn 690 695 700

Gly Lys Ser Lys Ser Lys Xle Ser Pro Lys Ser Asp Vai Trp Ser Leu 705 710 715 720

Gly Cys Ile Leu Tyr Tyr Met 'Thr Tyr Gly Lys Thr Pro Phe Gin Gin 725 730 735

Ile ile Asn Gin Ile Ser Lys Leu His Ala Ile Ile Asp Pro Asn His 740 745 750

Glu Ile Glu Phe Pro Asp Ile Pro Glu Lys Asp Leu Gin Asp Vai Leu 755 760 765

Lys Cys Cys Leu Lys Arg Asp Pro Lys Gin Arg Ile Ser Ile Pro Glu 770 775 780

Leu Leu Ala His Pro Tyr Vai Gin Ile Gin Thr His Pro Vai Asn Gin 785 790 795 800

Met Ala Lys Gly Thr Thr Glu Glu Met Lys Tyr Vai Leu Gly Gin Leu 805 810 815

Vai Gly Leu Asn Ser Pró Asn Ser Ile Leu Lys Ala Ala Lys Thr Leu B20 825 830

Tyr Glu His Tyr Ser Gly Gly Glu Ser His Asn Ser Ser Ser Ser Lys 835 840 845

Thr Phe Glu Lys Lys Arg Gly Lys Lys 850 855

<210> 3 <211> 1214 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 aacggcccag gcaggggcct tactagtaag cacgttttgg gaagtcctca gggcacgcag 60 44 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ gcaecgtçac ctcacacact agtgcgctgg agtgtgtcat tagcatctgg aatctctccc 120 cagggatgtg gtttttgttt gttttttttt ttttttttgg tattataatg agctaaaagc 180 tattcagggg cgagttatca gaggtgagcc cgtgctcttc agcggagaag atcccctacc 240 tggccgccgg ccactttctg tgggccgtgg ggtcctcaag gagacggccc ttgggctcag 300 gggctgcgtt tccacacgcg cctttcccag ggctcccgcg cccgttcctg cctggccgcc 360 ggccgctcca acagcagcac aaggcgggac tcagaaccgg cgttcagggc cgccagcggc 420 cgcgaggccc tgagatgagg ctccaaagac cccgacaggc cccggcgggt gggaggcgcg 480 cgccccgggg cgggcggggc tccccctacc ggccagaccc ggggagaggc gcgcggaggc 540 tgcgaaggtt ccagaagggc gqggaggggg ÊgccgcqCgc tgaCCCtCCC tgggcaccgc 600 tggggacgat ggcgctgctc gccttgctgc tggtcgtggc cctaccgcgg gtgtggacag 660 acgccaacct gactgcgaga caacgagatc cagaggactc ccagcgaacg gacgagggtg 720 acaatagagt gtggtgtcat gtttgtgaga gagaaaacac tttcgagtgc cagaacccaa 780 ggaggtgcaa atggacagag ccatactgcg ttatagcggc cgtgaaaata tttccacgtt 840 tttteatggt tgcgaagcag tgctccgctg gttgtgcagc gatggagaga cccaagccag 900 aggagaagcg gtttctcctg geagagccca tgcccttctt ttacctcaag tgttgtaaaa 960 ttcgctactg caatttagag gggccaccta tcaactcatc agtgttcaaa gaatatgctg 1020 gqagcatggg tgagagctgt ggtgggctgt ggctggccat cctcctgctg ctggcctcca 1080 ttgcagccgg cctcagcctg tcttgagcca cgggactgcc acagactgag ccttccggag 1140 catggactcg ctccagaccg ttgtcacctg ttgcattaaa cttgttttcc gttgaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaa 1214

<210> 4 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Arg Leu Gin Arg Pro Arg Gin Ala Pro Ala Gly Gly Arg Arg Ala 15 10 15

Pro Arg Gly Gly Arg Gly Ser Pro Tyr Arg Pro Asp Pro Gly Arg Gly 20 25 30

Ala Arg Arg Leu Arg Arg Phe Gin Lys Gly Gly Glu Gly Ala Pro Arg 35 40 45 45 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Ala Asp Pro Pro Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu 50 55 60

Leu Leu Vai Vai Ala Leu Pro Arg Vai Trp Thr Asp Ala Asn Leu Thr 65 70 75 80

Ala Arg Gin Arg Asp Pro Glu Asp Ser Gin Arg Thr Asp Glu Gly Asp 85 90 95

Asn Arg Vai Trp Cys His Vai Cys Glu Arg Glu Asn Thr Phe Glu Cys 100 105 110

Gin Asn Pro Arg Arg Cys Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Vai Ile Ala 115 120 125

Ala Val Lys Ile Phe Pro Arg Phe Phe Met Vai Ala Lys Gin Cys Ser 130 135 140

Ala Gly Cys Ala Ala Met Glu Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe 145 150 155 160

Leu Leu Glu Glu Pro Met Pro Phe Phe Tyr Leu Lys Cys Cys Lys Ile 165 Π0 175

Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn Ser Ser Val Phe Lys 180 185 190

Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala 195 200 205

Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ser 210 215 220

<210> 5 <211> 4168 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 aagacttagg aagactggtg gatgcgtttg ggttgtagct aggctttttc ttttctttct cttttaaaac acatctagac aaggaaaaaa caagcctcgg atctgatttt tcactcctcg ttcttgtgct tggttcttac tgtgtttgtg tattttaaag gcgagaagac gaggggaaca aaaccagctg gatccatcca tcaccgtggg tggttttaat ttttcgtttt ttctcgttat ΕΡ 2 325 305/PT 46 ttttttttaa acaaccactc ttcacaatga acaaactgta tatcggaaac ctcagcgaga 300 acgccgcccc ctcggaccta gaaagtatct tcaaggacgc caagatcccg gtgtcgggac 360 ccttcctggt gaagactggc tacgcgttcg tggactgccc ggacgagagc tgggccctca 420 aggccatcga ggcgctttca ggtaaaatag aactgcacgg gaaacccata gaagttgagc 480 actcggtccc aaaaaggcaa aggattcgga aacttcagat acgaaatatc ecgcctcatt 540 tacagtggga ggtgctggat agtttactag tccagtatgg agtggtggag agctgtgagc 600 aagtgaacac tgactcggaa actgcagttg taaatgtaac ctattccagt aaggaccaag 660 ctagacaagc actagacaaa ctgaatggat ttcagttaga gaatttcacc ttgaaagtag 720 cctatatccc tgatgaaatg gccgcccagc aaaacccctt gcagcagccc cgaggtcgcc 780 gggggcttgg gcagaggggc tcctcaaggc aggggtctcc aggatccgta tccaagcaga 840 aaccatgtga tttgcctctg cgcctgctgg ttcccaccca atttgtcgga gccatcatag 900 gaaaagaagg tgccaccatt cggaacatca ccaaacagac ccagtctaaa atcgatgtcc 960 accgtaaaga aaatgcgggg gctgctgaga agtcgattac tatcctctct actcctgaag 1020 gcacctctgc ggcttgtaag tctattctgg agattatgca taaggaagct caagatataa 1080 aattcacaga agagatcccc ttgaagattt tagctcataa taactttgtt ggacgtctta 1140 ttggtaaaga aggaagaaat cttaaaaaaa ttgagcaaga cacagacact aaaatcacga 1200 tatctccatt gcaggaattg acgctgtata atccagaacg caccattaca gttaaaggca 1260 atgttgagac atgtgccaaa gctgaggagg agatcatgaa gaaaatcagg gagtcttatg 1320 aaaatgatat tgcttctatg aatcttcaag cacatttaat tcctggatta aatctgaacg 1380 ccttgggtct gttcccaccc acttcaggga tgccacctcc cacctcaggg cccccttcag 1440 ccatgactcc tccctaeceg cagtttgagc aatcagaaac ggagactgtt catctgttta 1500 tcccagctct atcagtcggt gccatcatcg gcaagcaggg ccagcacatc aagcagcttt 1560 ctcgctttgc tggagcttca attaagattg ctccagcgga agcaccagat gctaaagtga 1620 ggatggtgat tatcactgga ccaccagagg ctcagttcaa ggctcaggga agaatttatg 1680 gaaaaattaa agaagaaaac tttgttagtc ctaaagaaga ggtgaaactt gaagctcata 1740 tcagagtgcc atcctttgct gctggcagag ttattggaaa aggaggcaaa acggtgaatg 1800 aacttcagaa tttgtcaagt gcagaagttg ttgtccctcg tgaccagaca cctgatgaga 1860 atgaccaagt ggttgtcaaa ataactggtc acttctatgc Ctgccaggtt gcccagagaa 1920 aaattcagga aattctgact caggtaaagc agcaccaaca acagaaggct ctgcaaagtg 1980 gaccacctca gtcaagacgg aagtaaaggc tcaggaaaca gcccaccaca gaggcagatg 2040 EP 2 325 305/PT 47 ccaaaeeaaa gacagattgc ttaaccaaca gatgggcgct gaccccctat ccagaatcac 2100 atgcacaagt ttttacctag ccagttgttt ctgaggacca ggcaactttt gaactcctgt 2160 ctctgtgaga atgtatactt tatgctctct gaaatgtatg acacccagct ttaaaacaaa 2220 caaacaaaca aacaaaaaaa gggtggggga gggagggaaa gagaagagct ctgcacttcc 2280 ctttgttgta gtctcacagt ataacagata ttctaattct tcttaatatt cccccataat 2340 gccagaaatt ggcttaatga tgctttcact aaattcatca aatagattgc tcctaaatcc 2400 aattgttaaa attggatcag aataattatc acaggaactt aaatgttaag ccattagcat 2460 agaaaaactg ttctcagttt tatttttacc taacactaac atgagtaacc taagggaagt 2520 gctgaatggt gttggcaggg gtattaaacg tgcattttta ctcaactacc tcaggtattc 2580 agtaatacaa tgaaaagcaa aattgttcct tttttttgaa aattttatat actttataat 2640 gatagaagtc caaccgtttt ttaaaaaata aatttaaaat ttaacagcaa tcagctaaca 2700 ggcaaattaa gatttttact tctggctggt gacagtaaag ctggaaaatt aatttcaggg 2760 ttttttgagg cttttgacac agttattagt taaatcaaat gttcaaaaat acggagcagt 2820 gcctagtatc tggagagcag cactaccatt tattctttca tttatagttg ggaaagtttt 2880 tgacggtact aacaaagtgg tcgcaggaga ttttggaacg gctggtttaa atggcttcag 2940 gagacttcag ttttttgttt agctacatga ttgaatgcat aataaatgct ttgtgcttct 3000 gactatcaat acctaaagaa agtgcatcag tgaagagatg caagactttc aactgactgg 3060 caaaaagcaa gctttagctt gtcttatagg atgcttagtt tgccactaca cttcagacca 3120 atgggacagt catagatggt gtgacagtgt ttaaacgcaa caaaaggcta catttccatg 3180 gggccagcac tgtcatgagc ctcactaagc tattttgaag atttttaagc actgataaat 3240 taaaaaaaaa aaattagact ccaccttaag tagtaaagta taacaggatt tctgtatact 3300 gtgcaatcag ttctttgaaa aaaaagtcaa aagatagaga atacaagaaa agtttttggg 3360 atataatttg aatgactgtg aaaacatatg acctttgata acgaactcat ttgctcactc 3420 cttgacagca aagcccagta cgtacaattg tgttgggtgt gggtggtctc caaggccacg 34 80 ctgctctctg aattgatttt ttgagttttg tttgtaagat gatcacagtc atgttacact 3540 gatctaaagg acatatatat aaccctttaa aaaaaaaatc actgcctcat tcttatttca 3600 agatgaattt ctatacagac tagatgtttt tctgaagatc aattagacat tttgaaaatg 3660 atttaaagtg ttttccttaa tgttctctga aaacaagttt cttttgtagt tttaaccaaa 3720 aaagtgccct ttttgtcact ggattctcct agcattcatg attttttttt catacaatga 3780 attaaaattg ctaaaatcat ggactggctt tctgçttgga tttcaggtaa gatgtgttta 3840 aggccagagc ttttctçagt atttgatttt tttccccaat atttgatttt ttaaaaatat 3900 acacataggt gctgcattta tatctgctgg tttaaattct gtcatatttc acttctagcc 3960 ttttagtatg gcaaatcata ttttactttt acttaagcat ttgtaatttg gagtatctgg 4020 tactagctaa gaaataattc tataattgag ttttgtacte accatatatg gateattcet 4080 catgtataat gtgccccaaa tgcagcttca ttttccagat accttgacgc agaataaatt 4140 ttttcatcat ttaggtgcaa aaaaaaaa 4168 48 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

<210> 6 <211> 579 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 6

Met Asn Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser 1 5 10 15 Asp Leu Glu Ser Ile Phe Lys Asp Ala Lys Ile Pro Vai Ser Gly Pro 20 25 30 Phe Leu Vai Lys Thr Gly Tyr Ala Phe Vai Asp Cys Pro Asp Glu Ser 35 40 45 Trp Ala Leu Lys Ala Ile Glu Ala Leu Ser Gly Lys Ile Glu Leu His 50 55 60 Gly Lys Pro Xle Glu Vai Glu His Ser Vai Pro Lys Arg Gin Arg Ile 65 70 75 80 Arg Lys Leu Gin Ile Arg Asn Ile Pro Pro His Leu Gin Trp Glu Vai 85 90 95 Leu Asp Ser Leu Leu Vai Gin Tyr Gly Vai Vai Glu Ser Cys Glu Gin 100 105 110 Vai Asn Thr Asp Ser Glu Thr Ala Vai Vai Asn Vai Thr Tyr Ser Ser 115 120 125 Lys Asp Gin Ala Arg Gin Ala Leu Asp Lys Leu Asn Gly Phe Gin Leu 130 135 140 Glu Asn Phe Thr Leu Lys, Vai Ala Tyr Ile Pro Asp Glu Met Ala Ala 145 150 155 160 Gin Gin Asn Pro Leu Gin Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gly Leu Gly Gin 165 Π0 175 Arg Gly Ser Ser Arg Gin Gly Ser Pro Gly Ser Vai Ser Lys Gin Lys 180 185 190 Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu Leu Vai Pro Thr Gin Phe Vai Gly 195 200 205 Ala Ile Ilè Gly Lys Glu Gly Ala Thr Ile Arg Asn Ile Thr Lys Gin 210 215 220 Thr Gin Ser Lys Ile Asp Vai His Arg Lys Glu Asn Ala Gly Ala Ala 225 230 235 240 Glu Lys Ser Xle Thr Ile Leu Ser Thr Pro Glu Gly Thr Ser Ala Ala 245 250 255 49 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Cys Lys Ser lie Leu Glu Ile Met His Lys Glu Ala Gin Asp Ile Lys 260 265 270

Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile Leu Ala His Asn Asn Phe Vai 275 280 285

Gly Arg Leu Ile Gly Lys Glu Gly Arg Asn Leu Lys Lys Ile Glu Gin 290 295 300

Asp Thr Asp Thr Lys Ile Thr Ile Ser Pro Leu Gin Glu Leu Thr Leu 305 310 315 320

Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Vai Lys Gly Asn Vai Glu Thr Cys 325 330 335

Ala Lys Ala Glu Glu Glu Ile Met Lys Lys Ile Arg Glu Ser Tyr Glu 340 345 350

Asn Asp Ile Ala Ser Met Asn Leu Gin Ala His Leu Ile Pro Gly Leu 355 360 365

Asn Leu Asn Ala Leu Gly Leu Phe Pro Pro Thr Ser Gly Met Pro Pro 370 375 380

Pro Thr Ser Gly Pro Pro Ser Ala Met Thr Pro Pro Tyr Pro Gin Phe 385 390 395 400

Glu Gin Ser Glu Thr Glu Thr Vai His Leu Phe Ile Pro Ala Leu Ser 405 410 415

Vai Gly Ala Ile Ile Gly Lys Gin Gly Gin His Ile Lys Gin Leu Ser 420 425 430

Arg Phe Ala Gly Ala Ser Ile Lys Ile Ala Pro Ala Glu Ala Pro Asp 435 440 445

Ala Lys Vai Arg Met Vai Ile Ile Thr Gly Pro Pro Glu Ala Gin Phe 450 455 460

Lys Ala Gin Gly Arg Ile Tyr Gly Lys Ile Lys Glu Glu Asn Phe Vai 465 470 475 4B0

Ser Pro Lys Glu Glu Vai Lys Leu Glu Ala His Ile Arg Vai Pro Ser 485 490 495

Phe Ala Ala Gly Arg Vai Ile Gly Lys Gly Gly Lys Thr Vai Asn Glu 500 505 510 50 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Leu Gin Asn Leu Ser Ser Ala Glu Vai Vai Vai Pro Arg Asp Gin Thr 515 520 525

Pro Asp 530

Glu Asn Asp Gin Vai Vai Vai Lys Ile Thr Gly His Phe Tyr 535

Ala Cys 545

Gin Vai Ala Gin Arg Lys Ile Gin Glu Ile Leu Thr Gin Vai 550 555 560

Lys Gin His Gin Gin Gin Lys Ala Leu Gin Ser Gly Pro Pro Gin Ser 565 57 0 575

Arg Arg Lys <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 7

Arg Tyr Ser Gin Ala Ile Glu Ala Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 8

Ser Tyr Arg Asn Glu Ile Ala Tyr Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 9

Ile Tyr Ala lie Lys Tyr Vai Asn Leu 1 5 51 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 10 Asp Tyr Glu Ile Thr Asp Gin Tyr Ile 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 11 Asn Phe Leu Ile Vai Asp Gly Met Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 12 Lys Phe Ala Phe Vai His ile Ser Phe 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 13 Ser Phe Ser Gly Ser Leu Gly His Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 52 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 14

Lys Asn Glu Asp Leu The Asp Glu Lau 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 15 Arg Ile Gin Vai Arg Phe Ala Glu Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 16 Ser Phe Ala Arg Ile Gin Vai Arg Phe 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 17 Lys Leu Glu Lys Asn Ser Vai Pro Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 18 Lys Asn Leu Ser Ala Ser Thr Val Leu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptídica <400> 19 sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 53 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

Arg Thr Pro Vai Vai Lys Asn Asp Phe 1 S <210 > <211> <212> <213> 20 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 20

Lys Tyr Gly Gin Asn Glu Ser Phe Ala 1 5 <210> <211 > <212> <213> 21 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 21

Lys Vai Arg Asp Ile Lys Asn Lys Phe 1 5 <210 > <211> <212> <213> 22 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 22

Lys Gin Arg Ile Ser Ile Pro Glu Leu 1 5 <210> <211 > <212> <213> 23 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 23

Asn Ser Vai Pro Leu Ser Asp Ala Leu 1 5 <210 > <211> <212> <213> 24 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 24

Gly Asn Ile Asp Leu Asn Ser Trp Leu 1 5 54 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <210> 25 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 25 Gin Tyr Ile Tyr Met Vai Met Glu Cys 1 5 <210 > 26 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 26 Gly Ser Ser Lys Vai Phe Gin Val Leu 1 5 <210> 27 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 27 Lys Tyr Val Leu Gly Gin Leu Val Gly Leu 1 5 10 <210 > 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 28 Tyr Tyr Met Thr Tyr Gly Lys Thr Pro Phe 1 5 10 <210> 29 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 29 Ile Tyr Met Val Met Glu Cys Gly Asn Ile 1 5 10 <210 > 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 55 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 30 Thr Tyr Gly Lys Thr Pro Phe Gin Gin Ile 15 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 31 Glu Phe Pro Asp Ile Pro Glu Lys Asp Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 32 Cys Phe Gin Gin Gin Gin His Gin ile Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 33 Ala Phe Vai His Ile Ser Phe i Ala Gin Phe 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica <400> 34 Arg Asn Glu Ile Ala Tyr Leu . Asn Lys Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 56 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <400> 35 Lys Thr Glu Ser Ser Leu Leu Ala Lys Leu 1 5 10 <210 > 36 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 36 Lys Tyr Val Asn Leu Glu Glu Ala Asp Asn 1 5 10 <210> 37 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 37 Lys Ala Val Glu Arg Gly Ala Val Pro Leu 1 5 10 <210 > 38 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 38 Arg Gly Gin Thr Thr Lys Ala Arg Phe Leu 1 5 10 <210> 39 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 39 Arg Asn Leu Asn Leu Gin Lys Lys Gin Leu 1 5 10 <210 > 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 40 Lys Gin Arg Ile Ser Ile Pro Glu Leu Leu 1 5 10 <210> 41 sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 57 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 41 Ala Tyr Leu Asn Lys Leu Gin Gin His Ser 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 42 Glu Tyr Gin Glu Pro Glu Vai Pro Glu Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 43 Lys Asn Ser Vai Pro Leu Ser Asp Ala Leu 1 5 10 <210> 44 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 44 Lys Pro Ser Gly Asn Asp Ser Cys Glu Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 45 Asn Pro Glu Asp Trp Leu Ser Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 58 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 46 Asp Leu Gin Asp Vai Leu Lys Cys Cys Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 47 Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe Leu Leu 1 5 <210 > 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 48 Arg Ala Asp Pro Pro Trp Ala Pro Leu 1 5 <210> 49 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 49 Leu Trp Leu Ala Ile Leu Leu Leu Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 50 Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 59 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <400> 51

Gly Gly Leu Trp Leu Ala lie Leu Leu 1 5 <210 > <211 > <212> <213> 52 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 52

Leu Ala Leu Leu Leu Vai Vai Ala Leu 1 5 <210> <211 > <212> <213> 53 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 53

Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu 1 5 <210 > <211 > <212> <213> 54 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 54

Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu 1 5 <210> <211 > <212> <213> 55 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 55

Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu 1 5 <210 > <211> <212> <213> 56 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 56

Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu 1 5 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 60 <210> <211 > <212> <213> 57 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <4 Ο Ο > 57

Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 58 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 58

Phe Phe Tyr Leu Lys Cys Cys Lys Ile 1 S <210> <211> <212> <213> 59 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 59

Ala Ala Vai Lys Ile Phe Pro Arg Phe 1 5 <210> <211> <212> <213> 60 9 PRT Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 60

Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> <211 > <212> <213> 61 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 61

Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe 1 s <210> <211> 62 9 <212> PRT <213> Artificial 61 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 62

Ser Met Giy Glu Ser Cys Gly Gly Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 63

Cys Cys Lys Ile Arg Tyr Cys Asn Leu 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 64

Asp Pro Gly Arg Gly Ala Arg Arg Leu i 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 65

Arg Gly Ala Arg Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 6 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 66

Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala He Leu 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 62 <400> 67 Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile 15 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 68

Arg Phe Leu Leu Glu Glu Pro Met Pro Phe <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 69

Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe Leu 1 5 10 <210 > <211> 70 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 70

Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu 1 5 10 <210 > <211 > 71 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 71

Lys Cys Cys Lys Ile Arg Tyr Cys Asn Leu 15 10 1 S 10 <210> <211 > 69 10 <212> PRT <213> Artificial <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 72

Phe Tyr Leu Lys Cys Cys Lys Ile Arg Tyr 15 10 63 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <210> 73 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 73 Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 <210 > 74 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 74 Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 75 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 75 Gly Gly Leu Trp Leu Ala Ile ! Leu Leu Leu 1 5 10 <210 > 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 76 Met Gly Glu Ser Cys Gly Gly Leu Trp Leu 1 5 10 <210> 77 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 77 Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys : Gly Gly Leu 1 5 10 <210 > 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 64 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 78 Gly Leu Trp Leu Ala Ile Leu i Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 79 Pro Tyr Cys Vai Ile Ala Ala i Vai Lys Ile 1 S 10 <210> 80 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 80 Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys 1 5 io <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 81 Leu Leu Ala Leu Leu Leu Vai Val Ala Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 82 Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala . Ile Leu Leu 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 65 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <400> 83 Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 <210 > 84 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 84 Leu Fro Arg Vai Trp Thr Asp Ala Asn Leu 1 5 10 <210> 85 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 85 Ser Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala Ile Leu 1 5 10 <210 > 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 86 Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu 1 5 10 <210> 87 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 87 Ser Tyr Glu Asn Asp Ile Ala Ser Met 1 5 <210 > 88 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 88 Gly Phe Gin Leu Glu Asn Phe Thr Leu 1 5 sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 66 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <210> <211> <212> <213> 89 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 89

Lys Thr Vai Asn Glu Leu Gin Asn Leu 1 5 <210> <211> <212> <213> 90 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 90

Lys Ile Pro Vai Ser Gly Pro Phe Leu 1 5 <210> <211> <212> <213> 91 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 91

Lys Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu 1 5 <210> <211> <212> <213> 92 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 92

Arg Phe Ala Gly Ala Ser Ile Lys Ile L 5 <210> <211> <212> <213> 93 9 PRT Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 93

Lys Gly Gly Lys Thr Vai Asn Glu Leu 1 5 67 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 94 Lys Gin Lys Pro Cys Asp Leu Pro Leu 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 95 Ala Tyr Ile Pro Asp Glu Met Ala Ala 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 96 Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr 1 5 <210 > 97 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 97 Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 98 Lys Gin Gly Gin His Ile LyS Gin Leu 1 5 sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente <210> 99 <211> 9 68 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 99 Lys Gin His Gin Gin Gin Lys Ala Leu 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 100 Ile Thr Ile Ser Pro Leu Gin Glu Leu 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <4 0 0 > 101 Ile Tyr Gly Lys Ile Lys Glu Glu Asn 1 5 <210 > 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 102 Ale Ser Met Asn Leu Gin Ala His Leu 1 5 <210> 103 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 103 Gin Trp Glu Vai Leu Asp Ser Leu Leu 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> 69 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 104 Asp Cys Pro Asp Glu Ser Trp Ala Leu 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 105 Leu Gin Trp Glu Vai Leu Asp Ser Leu 1 5 <210> 106 <211 > 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 106 Glu Ala Leu Ser Gly Lys Ile Glu Leu 1 5 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 107 Ile Tyr Gly Lys Ile Lys Glu Glu Asn Phe 1 5 10 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 108 Lys Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile 1 5 10 <210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente 70 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <400> 109 Arg Leu ILe Gly Lys Glu Gly Arg Asn Leu 1 5 10 <210 > 110 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 110 Lys lie Thr lie Ser Pro Leu Gin Glu Leu 1 5 10 <210> 111 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 111 Ser Tyr Glu Asn Asp Ile Ala Ser Met Asn 1 5 10 <210 > 112 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 112 Lys Pro Cys Asp Leu Pro Leu Arg Leu Leu 1 5 10 <210 > 113 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 113 Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Vai 1 5 10 <210 > 114 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 114 Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala 1 5 10 sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 71 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ

<210> 115 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 115 Vai Ala Gin Arg Lys Ile Gin Glu Ile Leu 1 5 10 <210 > 116 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 116 Leu Gin Ile Arg Asn Ile Pro Pro His Leu 1 5 10 <210 > 117 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 117 His Leu Gin Trp Glu Vai Leu Asp Ser Leu 1 5 10 <210 > 118 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 118 Asn Leu Gin Ala His Leu Ile Pro Gly Leu 1 5 10 <210 > 119 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 119 Leu Ile Pro Gly Leu Asn Leu Asn Ala Leu 1 5 10 <210 > 120 <211 > 10 <212> PRT sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 72 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <213> Artificial <2 2 Ο > <223> Uma sequência peptidica sintetizada artificialmente <400> 120 Leu Gin Gin Pro Arg Gly Arg Arg Gly Leu 1 5 10 <210 > 121 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 121 Phe Thr Glu Glu Ile Pro Leu Lys Ile Leu 1 5 10 <210 > 122 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 122 Glu Thr Vai His Leu Phe Ile Pro Ala Leu 1 5 10 <210> 123 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptidica <400> 123 Lys Leu Asn Gly Phe Gin Leu Glu Asn Phe 1 5 10 <210 > 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Uma sequência peptidica <400> 124 Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser Asp Leu 1 5 ío <210> 125 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial <220> sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente sintetizada artificialmente 73 ΕΡ 2 325 305/ΡΤ <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 125

Ile Pro Pro HÍ3 Leu Gin Trp Glu Vai Leu 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Uma sequência peptídica sintetizada artificialmente <400> 126

Ser Ser Lys Aap Gin Ala Arg Gin Ala Leu 15 10

Lisboa, 2014-04-16

Claims (20)

1. ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido dos seguintes (A) ou (B): (A) um péptido com menos do que 15 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; (B) um péptido com menos do que 15 aminoácidos possuindo indutibilidade de células T citotóxicas, em que o referido péptido compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, em que 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos, eliminados ou adicionados.
2. 2. Péptido da reivindicação 1, em que o referido péptido é o seguinte (A) ou (B): (A) um péptido que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; (B) um péptido possuindo indutibilidade de células T citotóxicas em que o referido péptido consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, em que 1 ou 2 aminoácidos estão substituídos, eliminados ou adicionados.
3. 3. Péptido da reivindicação 1 ou 2, em que o segundo aminoácido do terminal N é fenilalanina, tirosina, metionina ou triptofano.
4. 4. Péptido da reivindicação 1 ou 2, em que o aminoácido C-terminal é fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano ou metionina.
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um ou mais péptidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. 6. Composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção do cancro do pulmão, a referida composição compreendendo um ou mais péptidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
7. 7. Exossoma que apresenta na sua superfície um complexo compreendendo um péptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um antigénio do HLA. ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 2/3
8. 8. Exossoma da reivindicação 7, em que o antigénio do HLA é HLA-A24.
9. 9. Exossoma da reivindicação 8, em que o antigénio do HLA é HLA-A2402.
10. 10. Método in vitro de indução de células apresentadoras de antigénio possuindo uma elevada indutibilidade de células T citotóxicas compreendendo o passo de contacto de uma célula apresentadora de antigénio com um péptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
11. 11. Método in vitro de indução de células T citotóxicas por contacto de uma célula T com um péptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
12. 12. Método de indução de células apresentadoras de antigénio possuindo elevada indutibilidade de células T citotóxicas da reivindicação 10, o referido método compreendendo o passo de transferência de um gene compreendendo um polinucleótido que codifica um péptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para uma célula apresentadora de antigénio.
13. 13. Célula T citotóxica, induzida por contacto de uma célula T com um péptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que actua especificamente contra células alvo que apresentam o péptido que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.
14. 14. Célula apresentadora de antigénio, que compreende um complexo formado entre um antigénio do HLA e um péptido de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
15. 15. Célula apresentadora de antigénio da reivindicação 14, induzida pelo método da reivindicação 10.
16. 16. Vacina compreendendo um ou mais péptidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um polinucleótido que os codifica, como ingrediente activo. ΕΡ 2 325 305/ΡΤ 3/3
17. 17. Vacina para utilização na inibição da proliferação de células de cancro do pulmão, em que a vacina compreende um ou mais péptidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um polinucleótido que o codifica, como ingrediente activo.
18. 18. Vacina para utilização no tratamento ou prevenção de cancro do pulmão, em que a referida vacina compreende um ou mais péptidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um polinucleótido que codifica o referido péptido ou fragmento imunologicamente activo.
19. 19. Vacina de qualquer uma das reivindicações 16 a 18, ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 5 a 6, em que a referida vacina ou composição farmacêutica são formuladas para administração a um indivíduo cujo antigénio do HLA é HLA-A24.
20. 20. Vacina da reivindicação 19, ou composição farmacêutica da reivindicação 19, em que a referida vacina ou composição farmacêutica são formuladas para administração a um indivíduo cujo antigénio do HLA é HLA-A2402. Lisboa, 2014-04-16