CN101613405A - 与人结肠癌相关的基因和多肽 - Google Patents

与人结肠癌相关的基因和多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN101613405A
CN101613405A CN200910165163A CN200910165163A CN101613405A CN 101613405 A CN101613405 A CN 101613405A CN 200910165163 A CN200910165163 A CN 200910165163A CN 200910165163 A CN200910165163 A CN 200910165163A CN 101613405 A CN101613405 A CN 101613405A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
sequence seq
aminoacid sequence
rnf43
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200910165163A
Other languages
English (en)
Inventor
中村佑辅
古川洋一
田原秀晃
角田卓也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oncotherapy Science Inc
Original Assignee
Oncotherapy Science Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncotherapy Science Inc filed Critical Oncotherapy Science Inc
Publication of CN101613405A publication Critical patent/CN101613405A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提供了新的人基因RNF43，该基因在结肠癌中的表达显著提高，本申请还提供了新的人基因CXADRL1和GCUD1，与相应的非－癌组织相比，所述基因在胃癌中的表达显著提高。所述基因和由其编码的多肽可用于例如诊断细胞增殖性疾病，并用作开发针对所述疾病的药物的靶分子。

Description

与人结肠癌相关的基因和多肽
本申请是中国申请03818943.7的分案申请，该母案于2003年6月3日以国际申请号PCT/JP2003/007006提交，于2005年2月6日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。
本申请涉及2002年6月6日提交的USSN 60/386,985，2002年9月30日提交的USSN 60/415,209和2003年2月28日提交的USSN 60/451,013(在此列入本文作为参考)。
技术领域
本发明涉及生物科学领域，更具体地涉及癌症研究领域。本发明具体涉及与细胞增殖机制有关的新基因RNF43，CXADRL1和GCUD1以及由这些基因编码的多肽。本发明的基因和多肽可用于例如诊断细胞增殖性疾病，以及用作靶分子来开发针对所述疾病的药物。
背景技术
胃癌和结直肠癌是世界范围内癌症死亡的诱因。尽管最近在诊断和治疗策略方面取得了进步，但晚期癌症患者的预后仍然很差。尽管分子研究揭示出肿瘤抑制基因和/或癌基因的改变与癌症发生有关，但其精确的机理仍有待阐明。
cDNA微阵列技术使人们能够获得正常和恶性细胞中基因表达的全面分布图，并能比较恶性和相应正常细胞中的基因表达(Okabe et al.，CancerRes 61：2129-37(2001)；Lin et al.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 62：7012-7(2002))。该方法能披露癌症细胞的复杂性质，并有助于人们了解癌症发生的机理。鉴定出肿瘤中的失控基因能够更准确地诊断个体癌症，并可开发新的治疗靶(Bienz and Clevers，Cell 103：311-20(2000))。为了从整个基因组的角度揭示肿瘤发生的机理，并且找出用于诊断和新型治疗药开发的靶分子，本发明人使用23040个基因的的cDNA微阵列来分析肿瘤细胞的基因表达分布图(Okabe et al.，Cancer Res 61：2129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 62：7012-7(2002))。
被设计用于揭示癌症发生机理的研究推动了抗-肿瘤药剂分子靶的鉴定。例如，最初被开发用于抑制与Ras有关的生长-信号传导途径、其激活依赖于翻译后法尼基化的法尼基转移酶抑制剂(FTI)能在动物模型中有效治疗Ras-依赖型肿瘤(He et al.，Cell 99：335-45(1999))。联合使用抗癌药物和抗-HER2单克隆抗体trastuzumab对人进行了临床试验，以抵销原癌基因受体HER2/neu的作用；在乳腺癌患者身上已获得改善的临床反应和整体存活率(Lin et al.，Cancer Res 61：6345-9(2001))。选择性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571被开发用于治疗慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的组成型激活对白细胞转化起决定性作用。这些类型的药剂被设计用于抑制特定基因产物的致癌活性(Fujita et al.，Cancer Res 61：7722-6(2001))。因此，通常在癌细胞中被上调的基因产物可用作开发新抗癌药剂所用的潜在靶。
已阐明CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)能识别MHC I类分子上呈递的肿瘤-相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，并能裂解肿瘤细胞。由于MAGE家族是作为第一例TAA被发现的，因此，使用免疫学方法已发现了多种其它的TAA(Boon，Int J Cancer 54：177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J ExpMed 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994))。目前，一些已发现的TAA作为免疫治疗的靶正处于临床研发阶段。迄今为止已发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen et al.，Science254：1643-7(1991))、gp100(Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994))、SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998))和NY-ESO-1(Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997))。另一方面，已证实在肿瘤细胞中特异性过表达的基因产物能作为诱导细胞免疫应答的靶被识别。所述基因产物包括p53(Umano et al.，Brit J Cancer 84：1052-7(2001))、HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer 84：94-9(2001))、CEA(Nukaya et al.，IntJ Cancer 80：92-7(1999))等。
尽管已在与TAA有关的基础和临床研究中取得了显著进步(Rosenbeg etal.，Nature Med 4：321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc Natl Acad Sci USA 92：8078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 56：2479-83(1996))，但仅有少量候选TAA可用于治疗腺癌，包括结直肠癌。能在癌细胞中大量表达，同时其表达也仅局限于癌细胞的TAA是理想的免疫治疗候选靶。另外，鉴定能诱导强有力的特异性抗肿瘤免疫应答的新TAA有望促进肽免疫策略在多种类型的癌症中的临床使用(Boon and can der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994)；Shichijo etal.，J Exp Med 187：277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997)；Harris，J Natl Cancer Inst 88：1442-5(1996)；Butterfield et al.，Cancer Res 59：3134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 59：5554-9(1999)；vander Burg et al.，J Immunol 156：3308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 57：4465-8(1997)；Fujie et al.，Int J Cancer 80：169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int JCancer 81：459-66(1999)；Oiso et al.，Int J Cancer 81：387-94(1999))。
据重复报道，得自某些健康供体的经肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)对肽反应产生显著水平的IFN-γ，但在51Cr-释放试验中却很少以HLA-A24或-A0201限制性方式发挥抗肿瘤细胞的细胞毒性(Kawano et al.，Cance Res60：3550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 60：4830-7(2000)；Tamura et al.，Jpn J Cancer Res 92：762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201是日本人以及白种人中最常见的HLA等位基因之一(Date et al.，Tissue Antigens 47：93-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol 155：4307-12(1995)；Kubo et al.，JImmunol 152：3913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceeding of the eleventhInternational Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford UniversityPress，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigen 49：129(1997))。因此，由这些HLA呈递的癌症抗原肽对于治疗日本人和白种人的癌症特别有用。另外，已知低-亲和性CTL的体外诱导通常是因为使用了高浓度的肽，在抗原呈递细胞(APC)上产生了高水平的特定肽/MHC复合物，而所述复合物能有效激活这些CTL(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7(1996))。
发明概述
本发明的目的是提供与胃癌或结肠癌细胞的增殖机理有关的新蛋白质和编码所述蛋白质的基因，以及所述蛋白质和基因的制备方法和使用它们诊断和治疗胃癌或结直肠癌的方法。
为了揭示胃癌和结直肠癌的癌症发生机理，并鉴定出新的诊断标记和/或治疗这些肿瘤的药物靶，本发明人使用含有23040个基因的全-基因组cDNA微阵列分析了基因在胃和结肠癌症发生中的表达分布图。从药物学的观点看，在实际操作中抑制致癌信号比激活肿瘤-抑制效应更加容易。因此，本发明人检索了在胃和结肠癌症发生过程中被上调的基因。
从在胃癌中一般被上调的转录物中，将新的人基因CXADRL1(柯萨奇病毒和腺病毒受体样1)和GCUD1(在胃癌中被上调)分别定位于染色体带3q13和7p14。CXADRL1或GCUD1的基因转移促使细胞增殖。另外，通过转染其特异性的反义S-寡核苷酸或小的干扰RNA来降低CXADRL1或GCUD1表达即可抑制胃癌细胞生长。很多抗癌药物，如DNA和/或RNA合成抑制剂、代谢抑制因子和DNA嵌入剂不仅对癌细胞有毒，对正常生长的细胞也有毒。然而，抑制CXADRL1表达的药剂对其它器官却没有不利的作用，这是因为该基因的正常表达局限于睾丸和卵巢，因此所述药剂对治疗癌症非常重要。
另外，从在结直肠癌中一般被上调的转录物中，鉴定出定位于染色体带17pter-p13.1的基因RNF43(环指蛋白43)。另外，酵母双-杂合筛选试验(two-hybrid screening assay)揭示出RNF43蛋白与NOTCH2或STRIN结合。
NOTCH2是大的跨膜受体蛋白，该蛋白质是进化上保守的细胞间信号传导机制的组分。NOTCH2是Notch信号传导途径的蛋白质成员，据报道，它与肾脏中的肾小球发生以及心脏和眼血管系统的发育有关(McCright et al.，Development 128：491-502(2001))。据报道，三种δ/Serrate/Lag-2(DSL)蛋白，即δ1、Jaggaed1和Jaggaed2是NOTCH2的功能配体(Shimizu et al.，MolCell Biol 20：6913-22(2000))。通过包括受体的蛋白酶解和NOTCH蛋白胞内结构域的核转位的过程，在细胞内传递由Notch信号传导途径中的配体结合诱导的信号(有关评述可参见Artavanis-Tsakonas et al.，Annu Rev Cell Biol7：427-52(1999)；Weinmaster，Curr Opin Genet Dev 10：363-9(2000))。另外，通过转染与RNF43相对应的特异性反义S-寡核苷酸或小的干扰RNA来降低RNF43表达即可抑制结肠癌细胞的生长。如上所述，很多抗癌药物不仅对癌细胞有毒，对正常生长的细胞也有毒。然而，能抑制RNF43表达的药剂对其它器官却没有不利的影响，这是因为该基因的正常表达局限于胎儿，更具体地为胎肺和胎肾，因此所述药剂对治疗癌症非常重要。
因此，本发明提供了分离的新基因CXADRL1，GCUD1和RNF43，这些基因是候选的癌症诊断标记，并且是可用于开发新诊断策略和有效抗癌剂的理想的潜在靶。另外，本发明提供了由这些基因编码的多肽及其制备方法和用途。更具体地，本发明提供了下述内容：
本申请提供了新的人多肽CXADRL1，GCUD1和RNF43或其功能等同物，所述多肽能促进细胞增殖，并且在如胃癌和结直肠癌的细胞增殖疾病中被上调。
在优选实施方案中，CXADRL1多肽包括推定的431个氨基酸长的蛋白质，所述蛋白质与CXADR(柯萨奇病毒和腺病毒受体)有约37％的同一性。CXADRL1由SEQ ID NO：1的开放阅读框编码，并在密码子29-124和158-232处含有两个免疫球蛋白结构域，在密码子246-268处含有跨膜结构域。CXADRL1多肽优选包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本申请还提供了由CXADRL1多核苷酸序列的至少一部分或与SEQ ID NO：1所示序列至少30％、更优选至少40％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
另一方面，在优选实施方案中，GCUD1多肽包括推定的414个氨基酸长的蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO：3的开放阅读框编码。GCUD1多肽优选包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。本申请还提供了由GCUD1多核苷酸序列的至少一部分或与SEQ ID NO：3所示序列至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
另外，在优选实施方案中，RNF43多肽包括推定的由SEQ ID NO：5的开放阅读框编码的783个氨基酸长的蛋白质。RNF43多肽优选包括SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列，并且在密码子272-312处含有环指基元。RNF43多肽与环指蛋白同系物DKFZp566H073.1(GenBank登录号为T08729)的同源性为38％。本申请还提供了由RNF43多核苷酸序列的至少一部分或与SEQID NO：5所示序列至少30％、更优选至少40％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。
本发明还提供了新的人基因CXADRL1和GCUD1，与相应的非癌粘膜相比，在绝大多数胃癌中，所述基因的表达显著升高。除了胃癌外，CXADRL1和GCUD1还在结直肠癌和肝癌中高表达。分离的CXADRL1基因包括SEQ ID NO：1所述的多核苷酸序列。CXADRL1 cDNA特别地包括3423个核苷酸，其中含有1296个核苷酸长的开放阅读框(SEQ ID NO：1)。本发明还包括能与SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列杂交并与其至少30％、更优选至少40％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码CXADRL1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO：1的简并和等位突变体。另一方面，分离的GCUD1基因包括SEQ ID NO：3所述的多核苷酸序列。GCUD1 cDNA特别地包括4987个核苷酸，其中含有1245个核苷酸长的开放阅读框(SEQ ID NO：3)。本发明还包括能与SEQ ID NO：3所示多核苷酸序列杂交并与其至少15％、更优选至少25％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码GCUD1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO：3的简并和等位突变体。
另外，本发明提供了新的人基因RNF43，与相应的非癌粘膜相比，在绝大多数结肠癌中，所述基因的表达显著升高。除了结肠癌外，RNF43还在肺癌、胃癌和肝癌中高表达。分离的RNF43基因包括SEQ ID NO：5所述的多核苷酸序列。RNF43 cDNA特别地包括5345个核苷酸，其中含有2352个核苷酸长的开放阅读框(SEQ ID NO：5)。本发明还包括能与SEQ ID NO：5所示多核苷酸序列杂交并与其至少30％、更优选至少40％互补的多核苷酸，杂交和互补的程度应使其能编码RNF43蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQ ID NO：5的简并和等位突变体。
本文所用的分离基因是一种多核苷酸，其结构与任何天然多核苷酸结构或横跨三个以上分离基因的天然基因组多核苷酸的任何片段的结构都不相同。因此，该术语包括例如(a)具有生物体基因组中的天然基因组DNA分子的部分序列的DNA，所述DNA天然存在于所述生物体中；(b)以所得分子不同于任何天然载体或基因组DNA的方式掺入原核或真核载体或基因组DNA的多核苷酸；(c)分离的分子，如cDNA、基因组片段、聚合酶链反应(PCR)产生的片段或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因，即编码融合多肽的基因的一部分。
因此，本发明一方面提供了编码本文所述多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选分离的多核苷酸包括与SEQ ID NO：1，3或5所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选分离的核酸分子与SEQ ID NO：1，3或5所示核苷酸序列的同一性至少为65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。当分离的多核苷酸的长度长于或等于参照序列，如SEQ ID NO：1，3或5时，与参照序列的全长进行比较。当分离的多核苷酸的长度短于参照序列，如短于SEQ ID NO：1，3或5时，与相同长度的参照序列的区段进行比较(排除同源性计算所需的任何环)。
本发明还提供了生产蛋白质的方法，所述方法是用编码CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞，并且表达所述多核苷酸序列。另外，本发明提供了含有编码CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的核苷酸序列的载体，和携有编码CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸的宿主细胞。所述载体和宿主细胞可用于生产CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白。
本申请还提供了识别CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的抗体。在某种程度上还提供了CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的反义多核苷酸(如反义DNA)、核酶和siRNA(小的干扰RNA)。
本发明还提供了诊断细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括测定样本生物样品中基因的表达水平，将CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的表达水平与正常样品中的相比较，将样品中CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的高表达水平定义为患有细胞增殖性疾病，如癌症。适于通过CXADRL1或GCUD1的表达水平诊断的疾病是胃癌、结直肠癌和肝癌；适于用RNF43的表达水平检测的是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。
另外，还提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法。所述方法包括使CXADRL1，GCUD 1或RNF43多肽与受试化合物接触，并选择与CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽结合的受试化合物。
本发明还提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括使CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽与受试化合物接触，并选择能抑制CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽的表达水平或生物活性的受试化合物。
另外，本发明提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受试化合物的存在下使CXADRL1与AIP1接触，并选择抑制CXADRL1与AIP1结合的受试化合物。
另外，本发明提供了筛选可用于治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受试化合物的存在下使RNF43与NOTCH2或STRIN接触，并选择抑制RNF43与NOTCH2或STRIN结合的受试化合物。
本申请还提供了用于治疗细胞增殖性疾病，如癌症的药物组合物。药物组合物可以是例如抗癌剂。药物组合物可被描述为分别如SEQ ID NO：1，3或5所示和所述的CXADRL1，GCUD1或RNF43多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。适当的反义S-寡核苷酸具有选自核苷酸序列SEQ ID NO：23，25，27，29或31。包括具有SEQ ID NO：23或25所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的CXADRL1反义S-寡核苷酸适用于治疗胃癌；包括具有SEQ ID NO：27或29所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的GCUD1反义S-寡核苷酸适用于治疗胃癌、结直肠癌或肝癌；包括具有SEQ ID NO：31所示核苷酸序列的反义S-寡核苷酸的RNF43反义S-寡核苷酸适用于治疗结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌。适当的siRNA由一套核苷酸组成，所述核苷酸的序列选自SEQ ID NO：40和41，42和43，或62和63。由一套核苷酸序列为SEQ ID NO：40和41，或42和43的核苷酸组成的CXADRL1 siRNA适用于治疗胃癌、结直肠癌或肝癌；由一套核苷酸序列为SEQ ID NO：62和63的核苷酸组成的RNF43 siRNA适用于治疗结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌。药物组合物也可以含有通过本发明的治疗细胞增殖性疾病的化合物的筛选方法所选择的化合物。
药物组合物的作用过程需要抑制癌细胞的生长。可将所述药物组合物施用于哺乳动物，包括人和家养的哺乳动物。
本发明还提供了使用本发明提供的药物组合物治疗细胞增殖性疾病的方法。
另外，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽的步骤。预期施用CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽能引发抗肿瘤免疫力。因此，本发明还提供了引发抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括施用CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽，以及含有CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽的治疗或预防癌症的药物组合物的步骤。
应理解不论是上文的发明概述还是下文的详细描述都是优选的实施方案，而不是对本发明或本发明的其它可替换实施方案的限制。
附图说明
图1a至1d显示出A5928(CXADRL1)和C8121(GCUD1)在胃癌中的表达。图1a显示出通过cDNA微阵列检测获得的A5928在14个原发性胃癌中的相对表达率(癌症/非-癌症)。在穿过截留滤器(Cy3和Cy5信号都大于25,000)的14个胃癌中，所有胃癌中的A5928表达被上调(Cy3∶Cy5强度比率＞2.0)。图1b显示出通过cDNA微阵列检测获得的C8121在12个原发性胃癌中的相对表达率(癌症/非-癌症)。在穿过截留滤器的12个胃癌中，10个胃癌中的C8121表达被上调(Cy3∶Cy5强度比率＞2.0)。图1c显示出使用10个胃癌病例，经半-定量RT-PCR分析获得的CXADRL1表达。图1d显示出使用9个胃癌病例，经半-定量RT-PCR分析获得的GCUD1表达。将GAPDH的表达用作CXADRL1和GCUD1表达分析的内部对照。
图2a和2b显示出CXADRL1在多种人组织中的表达以及CXADRL1的推定蛋白质结构和蛋白质基元。图2a提供照片显示出经多组织Northern印迹分析获得的CXADRL1在多种人组织中的表达。图2b显示出CXADRL1的推定蛋白质结构。CXADRL1 cDNA由3423个核苷酸组成，其中具有1296个的核苷酸长的ORF，并且由7个外显子组成。
图3a至3c显示出CXADRL1的生长-促进作用。图3a提供照片显示出被CXADRL1转染的NIH3T3细胞的集落形成试验结果。图3b显示出经半-定量RT-PCR分析获得的NIH3T3-CXADRL1细胞中的外源性CXADRL1表达。将GAPDH的表达用作内部对照。#2，#5，#6和#7皆表示被CXADRL1转染的NIH3T3细胞。图3c表示NIH3T3细胞的数目。从统计学上看，NIH3T3-CXADRL1细胞在含有10％FBS的培养基中的生长要高于模拟(NIH3T3-LacZ)细胞(P＜0.05)。
图4显示出被指定用于抑制CXADRL1的反义S-寡核苷酸对MKN-1细胞的生长-抑制作用。经证实CXADRL1-AS4和CXADRL1-AS5能抑制MKN-1细胞的生长。
图5A至5C显示出CXADRL1-siRNA对St-4细胞的生长抑制作用。图5A提供照片显示出CXADRL1和GAPDH(对照)在被模拟siRNA或CXADRL1-siRNA#7转染的St-4细胞中的表达。图5B提供照片显示出经对照-siRNA或CXADRL1-siRNA#7处理的存活细胞的Giemsa染色结果。图5C显示出经对照质粒或表达CXADRL1-siRNA7的质粒转染的细胞的MTT试验结果。
图6提供照片显示出用抗-CXADRL1抗血清或抗-Flag抗体对表达经Flag-标记的外源性CXADRL1蛋白的细胞的免疫印迹分析结果。
图7显示出通过酵母双-杂合系统测定的CXADRL1和AIP1之间的相互作用。图7提供照片显示出通过双-杂合系统测定的CXADRL1和AIP1之间的相互作用。
图8显示出通过CXADRL1-207刺激产生的CTL系的肽特异性细胞毒性。CTL系对被CXADRL1-207脉冲的靶细胞(T2)显示出高细胞毒活性，而对未经肽脉冲的相同靶细胞(T2)未显示出显著的细胞毒活性。
图9显示出CXADRL1-207CTL克隆对SNU475，MKN74和SNU-C4的细胞毒活性。CXADRL1-207 CTL克隆对表达CXADRL1和HLA-A*0201的SNU475显示出高细胞毒活性。另一方面，CXADRL1-207 CTL克隆对表达CXADRL1但不表达HLA-A*0201的MKN74未显示出显著的细胞毒活性。另外，该CTL克隆对表达HLA-A*0201但不表达CXADRL1的SNU-C4未显示出显著的细胞毒活性。
图10显示出未标记靶的抑制试验结果。CXADRL1-207 CTL克隆以HLA-A*0201限制性方式特异性识别CXADRL1-207。将用Na2 51CrO4标记的SNU475制备成经标记靶，而将经CXADRL1-207肽-脉冲的T2(Peptide+)用作未标记靶(抑制剂)。将E/T比率固定为20。加入用相同肽脉冲的T2可抑制对SNU475的细胞毒活性，而加入未经肽脉冲的T2几乎无抑制作用。
图11显示出阻断试验的结果，该试验显示出针对HLA-I类，HLA-II类，CD4和CD8产生的抗体对CXADRL1-207 CTL克隆的细胞毒活性的作用。CXADRL1-207CTL克隆以HLA-I类和CD8限制性方式显示出细胞毒活性。为了检测用CXADRL1肽产生的CTL克隆的特征，检测了针对HLA-I类，HLA-II类，CD4和CD8的抗体抑制细胞毒活性的能力。水平轴表示细胞毒性抑制作用的百分比。当使用抗I类和CD8的抗体时，CTL克隆对SNU475靶的细胞毒性显著降低。该结果表明CTL克隆以依赖于HLA-I类和CD8的方式识别衍生自CXADRL1的肽。
图12提供照片显示出多种人组织中GCUD1的Northern印迹分析结果。GCUD1转录物的大小约为3.5-kb。
图13提供照片显示出GCUD1的亚细胞定位，所述定位是通过免疫细胞化学在经pcDNA3.1myc/His-GCUD1转染的细胞上观察得到的。经cMyc-标记的GCUD1蛋白表达自定位于胞质中的质粒。
图14提供照片显示出通过集落形成试验检查到的GCUD1对NIH3T3细胞的生长-促进作用。
图15显示出被指定用于抑制GCUD1的反义S-寡核苷酸对MKN-28细胞的生长-抑制作用。经证实GCUD1-AS5和GCUD1-AS8能抑制MKN-28细胞的生长。
图16提供照片显示出重组GCUD1蛋白的纯化。
图17提供照片显示出用抗-GCUD1抗血清或抗-Flag抗体对表达经Flag-标记的外源性GCUD1蛋白的细胞的免疫印迹分析结果。
图18A和18B显示出通过GCUD1-196(A)或GCUD1-272(B)刺激产生的CTL系的肽特异性细胞毒性。CTL系对被GCUD1-196或GCUD1-272脉冲的靶细胞(T2)显示出高细胞毒活性，而对未经肽脉冲的相同靶细胞(T2)未显示出显著的细胞毒活性。
图19显示出GCUD1-196 CTL克隆对SNU475和MKN45的细胞毒活性。GCUD1-196 CTL克隆对表达GCUD1和HLA-A*0201的SNU475显示出高细胞毒活性。另一方面，GCUD1-196CTL克隆对表达GCUD1但不表达HLA-A*0201的MKN45未显示出显著的细胞毒活性。
图20显示出未标记靶的抑制试验结果。GCUD1-196 CTL克隆以HLA-A*0201限制性方式特异性识别GCUD1-196。将用Na2 51CrO4标记的SNU475制备成经标记靶，而将经GCUD1-196肽-脉冲的T2(Peptide+)用作未标记靶(抑制剂)。将E/T比率固定为20。加入用相同肽脉冲的T2可抑制对SNU475的细胞毒活性，而加入未经肽脉冲的T2几乎无抑制作用。
图21显示出阻断试验的结果，该试验显示出针对HLA-I类，HLA-II类，CD4和CD8产生的抗体对GCUD1-196 CTL克隆的细胞毒活性的作用。GCUD1-196CTL克隆以HLA-I类和CD8限制性方式显示出细胞毒活性。为了检测用GCUD1肽产生的CTL克隆的特征，检测了针对HLA-I类，HLA-II类，CD4和CD8的抗体抑制细胞毒活性的能力。水平轴表示细胞毒性抑制作用的百分比。当使用抗I类和CD8的抗体时，CTL克隆对SNU475靶的细胞毒性显著降低。该结果表明CTL克隆以依赖于HLA-I类和CD8的方式识别衍生自GCUD1的肽。
图22a至22b显示出FLJ20315在结肠癌中的表达。图22a显示出通过cDNA微阵列检测获得的FLJ20315在11个原发性结肠癌病例中的相对表达率(癌症/非-癌症)。在穿过截留滤器(Cy3和Cy5信号都大于25,000)的11个结肠癌病例中，10个病例中的FLJ20315表达被上调(Cy3∶Cy5强度比率＞2.0)。图22b显示出使用18个额外的结肠癌病例，经半-定量RT-PCR分析获得的FLJ20315表达(T，肿瘤组织；N，正常组织)。将GAPDH的表达用作内部对照。
图23a提供照片显示出多个人胎组织中RNF43的胎-组织Northern印迹分析结果。图23b显示出RNF43的推定蛋白质结构。
图24a和24b提供照片显示出经myc-标记的RNF43蛋白的亚细胞定位。图24a提供照片显示出使用被pcDNA3.1myc/His-RNF43或对照质粒(模拟质粒)转染的COS7细胞的提取物对经myc-标记的RNF43蛋白进行Western-印迹分析的结果。图24b提供照片显示出用小鼠抗-myc抗体染色并用与FITC偶联的第二抗体观察到的转染细胞。细胞核用DAPI复染。
图25a至25c显示出RNF43对细胞生长的影响。图25a提供照片显示出NIH3T3细胞中RNF43的集落形成试验结果。图25b提供照片显示出模拟细胞(COS7-pcDNA)和通过用pcDNA-RNF43转染COS7细胞建立的COS7-RNF43细胞中的RNF43表达。图25c显示出稳定表达外源性RNF43的COS7-RNF43细胞和模拟细胞之间细胞生长的比较结果。
图26a和26b显示出被指定用于抑制RNA43的反义S-寡核苷酸的生长-抑制作用。图26a提供照片显示出通过半-定量RT-PCR分析获得的、用对照(RNF43-S1)或反义S-寡核苷酸(RNF43-AS1)处理12小时的LoVo细胞中的RNF43表达。图26b显示出经MTT试验测定的、用对照或反义S-寡核苷酸处理后的LoVo细胞的细胞生存力。同时进行三份MTT试验。
图27A至27C显示出RNF43-siRNA的生长抑制作用。图27A提供照片显示出RNF43-siRNA对RNF43表达的作用。图27B提供照片显示出用对照-siRNA或RNF43-siRNA处理后，存活细胞的Giemsa染色结果。图27C显示出用对照质粒或表达RNF43-siRNA的质粒转染的细胞的MTT试验结果。*表示经Fisher’s protected least显著性差异试验测定的显著性差异(p＜0.05)。
图28A和28B显示出经标记RNF43蛋白的表达。图28A提供照片显示出经pFLAG-5CMV-RNF43(泳道2)或模拟载体(泳道1)转染的COS7细胞的培养基中分泌的、经Flag-标记的RNF43蛋白的Western-印迹分析结果。图28B提供照片显示出经pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(泳道2)或模拟载体(泳道1)转染的COS7细胞的培养基中分泌的、经Myc-标记的RNF43蛋白的Western-印迹分析结果。
图29A和29B显示出含有经Myc-标记或经Flag-标记的RNF43蛋白的条件培养基的生长促进作用。图29A提供照片显示出在对照培养基(1)或被模拟载体(2)、pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(3)或pFLAG-5CMV-RNF43(4)转染的COS7细胞的条件培养基中培养的NIH3T3细胞的形态学。图29B显示出在图29A所述培养基中培养的NIH3T3细胞的数目。所示数据为每组三份实验的平均值；线条表示±SE。*表示与对照，模拟载体相比较的显著性差异(p＜0.05)。
图30A至30C表示RNF43N-末端(N1)和C-末端(C1)重组蛋白质的制备。图30A图解表示重组蛋白质RNF43-N1和-C1的结构。图30B提供照片显示出在用(泳道2)或不用(泳道1)0.2mM IPTG诱导时，经NusTM-标记的RNF43-N1蛋白在大肠杆菌中的表达。图30C提供照片显示出在用(泳道2)或不用(泳道1)0.2mM IPTG诱导时，经NusTM-标记的RNF43-C1蛋白在大肠杆菌中的表达。
图31A和31B显示出通过酵母双-杂合系统检测到的RNF43和NOTCH2之间的相互作用。图31A显示出推定的NOTCH2结构和相互作用区域。(a)显示出推定的NOTCH2蛋白全长结构，(b)显示出推定的负责相互作用的区域(ECD，胞外结构域；TM，跨膜结构域；ICD，胞内结构域)。图31B提供照片显示出通过双-杂合系统检测到的RNF43和NOTCH2之间的相互作用。
图32A和32B显示出通过酵母双-杂合系统检测到的RNF43和STRIN之间的相互作用。图32A显示出推定的STRIN结构和相互作用区域。(a)显示出推定的STRIN蛋白全长结构，(b)显示出推定的负责相互作用的区域(RING，RING结构域)。图32B提供照片显示出通过双-杂合系统检测到的RNF43和STRIN之间的相互作用。
图33显示出通过RNF43-721刺激产生的CTL系的肽特异性细胞毒性。CTL系对经RNF43-721脉冲的靶细胞(TISI)显示出高细胞毒活性(四边形)，而对未经肽脉冲的相同靶细胞(TISI)未显示出显著的细胞毒活性(三角形)。已证实CTL系具有肽特异性细胞毒性。
图34显示出通过RNF43-721刺激产生的CTL克隆的肽特异性细胞毒性。按照“材料和方法”中所述检测13个RNF43-721 CTL克隆对经肽-脉冲的靶(TISI)的细胞毒活性。已建立的RNF43-721 CTL克隆对经肽-脉冲的靶细胞(TISI)具有很强的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的相同靶细胞(TISI)未显示出任何显著的细胞毒活性。
图35显示出RNF43-721 CTL克隆45对HT29，WiDR和HCT116的细胞毒活性。RNF43-721 CTL克隆识别并裂解以HLA限制性方式内源性表达RNF43的肿瘤细胞。HT29，WiDR和HCT116皆内源性表达RNF43，将RNF43-721 CTL克隆45用作效应细胞。将TISI用作不表达RNF43的靶。RNF43-721 CTL克隆45对同时表达RNF43和HLA-A24的HT29(实心三角形)和WiDR(菱形)显示出高细胞毒活性。另一方面，RNF43-721 CTL克隆45对表达RNF43但不表达HLA-A24的HCT116(空心三角形)和表达HLA-A24但不表达RNF43的TISI(空心四边形)未显示出显著的细胞毒活性。另外，RNF43-721 CTL克隆45对经不相关的肽脉冲的TISI(点状实心四边形)和表达RNF43但几乎不表达HLA-A24的SNU-C4(实心圆)未显示出细胞毒活性。
图36显示出未标记靶的抑制试验结果。RNF43-721 CTL克隆以HLA-A24限制性方式特异性识别RNF43-721。将用Na2 51CrO4标记的HT29制备成经标记靶，而将经RNF43-721肽-脉冲的TISI(Peptide+)用作未标记靶(抑制剂)。将E/T比率固定为20。加入用相同肽脉冲的TISI可抑制对HT29的细胞毒活性(实心四边形)，而加入未经肽脉冲的TISI几乎无抑制作用(空心四边形)。
图37显示出阻断试验的结果，该试验显示出针对HLA-I类，HLA-II类，CD3，CD4和CD8产生的抗体对RNF43-721 CTL克隆的细胞毒活性的作用。RNF43-721 CTL克隆以HLA-I类、CD3和CD8限制性方式显示出细胞毒活性。为了检测用RNF43肽产生的CTL克隆的特征，检测了针对HLA-I类，HLA-II类，CD3，CD4和CD8的抗体抑制细胞毒活性的能力。水平轴表示细胞毒性抑制作用的百分比。当使用抗I类、CD3和CD8的抗体时，CTL克隆对WiDR靶的细胞毒性显著降低。该结果表明CTL克隆以依赖于HLA-I类、CD3和CD8的方式识别衍生自RNF43的肽。
图38A和38B显示出用RNF43-11-9(A)或RNF43-11-10(B)产生的CTL系的肽特异性细胞毒性。这些CTL系对经RNF43-11-9或RNF43-11-10脉冲的靶细胞(T2)显示出高细胞毒活性，而对未经肽脉冲的相同靶细胞(T2)未显示出显著的细胞毒活性。
图39A和39B显示出通过RNF43-11-9(A)或RNF43-11-10(B)刺激产生的CTL克隆的肽特异性细胞毒性。按照“材料和方法”中所述检测4个RNF43-11-9CTL克隆或7个RNF43-11-10克隆对经肽-脉冲的靶(T2)的细胞毒活性。已建立的RNF43-11-9和RNF43-11-10CTL克隆对经肽-脉冲的靶细胞(T2)具有很强的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的相同靶细胞(T2)未显示出任何显著的细胞毒活性。
图40A和40B显示出RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17 CTL克隆25对HT29和DLD-1的细胞毒活性。RNF43-5 CTL克隆90和RNF43-17 CTL克隆25识别并裂解以HLA限制性方式内源性表达RNF43的肿瘤细胞。HT29和DLD-1皆内源性表达RNF43，将RNF43-5 CTL克隆90和RNF43-17 CTL克隆25用作效应细胞。将T2用作不表达RNF43的靶。RNF43-5 CTL克隆90和RNF43-17 CTL克隆25对同时表达RNF43和HLA-A*0201的DLD-1显示出高细胞毒活性。另一方面，RNF43-5 CTL克隆90和RNF43-17 CTL克隆25对表达RNF43但不表达HLA-A*0201的HT29未显示出显著的细胞毒活性。
图41显示出未标记靶的抑制试验结果。RNF43-11-9 CTL克隆以HLA-A2限制性方式特异性识别RNF43-11-9。将用Na2 51CrO4标记的HCT116制备成经标记靶，而将经RNF43-11-9肽-脉冲的T2(Peptide+)用作未标记靶(抑制剂)。将E/T比率固定为20。加入用相同肽脉冲的T2可抑制对HCT116的细胞毒活性，而加入未经肽脉冲的TISI几乎无抑制作用。
发明详述
除非另有说明，本文所用术语“一个”、“一种”指的是“至少一个”和“至少一种”。
本申请鉴定出新的人基因CXADRL1和GCUD1，与相应的非癌组织相比，所述基因在胃癌中的表达显著升高。CXADRL1cDNA由3423个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO：1所示的1296个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的431个-氨基酸长的蛋白质。CXADRL1与AIP1结合。AIP1(atripin-1-相互作用蛋白1)是与atropin-1结合的蛋白质，atropin-1是遗传病齿状核红核-苍白球底丘脑核萎缩(dentatorubral-pallidoluysian atrophy)的致病基因。AIP1编码推定的1455个氨基酸长的蛋白质，其中含有鸟苷酸激酶-样结构域、2个WW结构域和5个PDZ结构域。已证实AIP1的小鼠同系物能与活化素型IIA相互作用。然而，AIP1的功能仍有待阐明。推测的氨基酸序列与CXADR(柯萨奇病毒和腺病毒受体)的同一性约为37％。因此，将该蛋白质命名为CXADRL1(柯萨奇病毒和腺病毒受体样1)。另一方面，GCUD1 cDNA由4987个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO：3所示的1245个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的414个-氨基酸长的蛋白质。由于该蛋白质的表达在胃癌中被上调，因此，将其命名为GCUD1(在胃癌中被上调)。
此外，本发明包括新的人基因RNF43，与相应的非癌组织相比，所述基因在结肠癌中的表达显著升高。RNF43 cDNA由5345个核苷酸组成，其中含有如SEQ ID NO：5所示的2352个核苷酸长的开放阅读框。开放阅读框编码推定的783个-氨基酸长的蛋白质。RNF43与NOTCH2和STRIN结合。据报道NOTCH2是大的跨膜受体蛋白，该蛋白质是进化上保守的细胞间信号传导机制的组分。NOTCH2是Notch信号传导途径的蛋白质成员，据报道，它与肾脏中的肾小球发生以及心脏和眼血管系统的发育有关。另据报道，三种δ/Serrate/Lag-2(DSL)蛋白，即δ1、Jaggaed1和Jaggaed2是NOTCH2的功能配体。STRIN编码推定的与小鼠Trif共享79％同一性的蛋白质。STRIN或Trif的功能仍有待阐明。
CXADRL1，GCUD1或RNF43在细胞内的外源性表达总能使细胞生长增强，而用反义S-寡核苷酸或小的干扰RNA(siRNA)抑制其表达会导致对癌细胞的显著生长-抑制作用。这些发现表明CXADRL1，GCUD1和RNF43为癌细胞提供了致癌活性，抑制这些蛋白质的活性不失为一种治疗癌症的理想策略。
本发明包括新的人基因CXADRL1，其包括SEQ ID NO：1所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码CXADRL1蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其功能等同物。与CXADRL1蛋白功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人CXADRL1蛋白相对应的同源蛋白质以及人CXADRL1蛋白的突变体。
本发明还包括新的人基因GCUD1，其包括SEQ ID NO：3所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码GCUD1蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或其功能等同物。与GCUD1功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人GCUD1蛋白相对应的同源蛋白质以及人GCUD1蛋白的突变体。
另外，本发明包括新的人基因RNF43，其包括SEQ ID NO：5所述的多核苷酸序列及其简并序列和突变体，条件是它们都能编码RNF43蛋白，所述蛋白质包括SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或其功能等同物。与RNF43功能等同的多肽包括例如其它生物体中与人RNF43蛋白相对应的同源蛋白质以及人RNF43蛋白的突变体。
在本发明中，术语“功能等同”指的是所述多肽具有类似于CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的促进细胞增殖的活性，并能赋予癌细胞以致癌活性。通过将编码所述多肽的DNA导入表达各个多肽的细胞，并检测对细胞增殖的促进作用或集落形成活性的提高，即可判断所述多肽是否具有细胞增殖活性。所述细胞包括例如针对CXADRL1和GCUD1的NIH3T3细胞；针对RNF43的NIH3T3细胞，SW480细胞和COS7细胞。或者，可通过检测其与AIP1的结合能力来判断所述多肽是否与CXADRL1功能等同。另外，可通过检测其与NOTCH2或STRIN的结合能力来判断所述多肽是否与RNF43功能等同。
与给定蛋白质功能等同的多肽的制备方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括在蛋白质中导入突变的已知方法。例如，本领域技术人员通过定点诱变(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152：271-275(1995)；Zoller andSmith，Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al.，Nucleic Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154：350-367(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82：488-492(1985)；Kunkel，Methods Enzymol85：2763-2766(1988))在人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列中导入适当的突变，即可制备出与所述的任一种蛋白质功能等同的多肽。氨基酸突变也可自然发生。本发明的多肽包括具有人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列的蛋白质，其中一个或多个氨基酸已经突变，条件是所得突变多肽与人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的功能等同。所述突变体中突变氨基酸的数目一般为10个氨基酸或更少，优选为6个氨基酸或更少，更优选为3个氨基酸或更少。
已知经突变或修饰的蛋白质能保留原始的生物活性，其中所述蛋白质具有因在某个氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-5666(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-6500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-6413(1982))。
优选将待突变的氨基酸残基突变成不同的氨基酸，其中氨基酸侧链的特性是保守的(已知为保守的氨基酸取代过程)。氨基酸侧链特性的例子为：疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，以及具有下述官能团或共有特性的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱基侧链(R，K，H)和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。需说明的是括号中的字母表示氨基酸的单字母代码。
在人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基所得多肽的例子是含有人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白与其它肽或蛋白质的融合蛋白，本发明包括所述融合蛋白。通过本领域技术人员众所周知的技术即可制备融合蛋白，例如将编码本发明的人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA连接，使得读码框匹配，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达所述融合DNA。对于与本发明的蛋白质融合的肽或蛋白质没有限制。
可用于与本发明的蛋白质融合的已知肽包括例如FLAG(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204-1210(1988))、含有6个His(组氨酸)残基的6×His、10×His、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标记、HSV-标记、E-标记、SV40T抗原片段、lck标记、α-微管蛋白片段、B-标记、C蛋白片段等。可与本发明的蛋白质融合的蛋白质包括例如GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等。
通过将编码上述融合肽或蛋白质的商购DNA与编码本发明多肽的DNA融合，并表达所制备的融合DNA即可制备出融合蛋白。
另一种本领域已知的分离功能等同多肽的方法是例如使用杂交技术的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，Cold Spring HarborLab.Press(1989))。本领域技术人员能容易地分离出与编码人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的DNA序列(即SEQ ID NO：1，3或5)的全部或部分具有高度同源性的DNA，并且能从分离的DNA中分离出人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的功能等同多肽。本发明的多肽包括由能与编码人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的DNA序列的全部或部分杂交的DNA编码、并且与人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括对应于人源蛋白质的哺乳动物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。当从动物中分离与编码人CXADRL1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用得自睾丸或卵巢的组织。或者，当从动物中分离与编码人GCUD1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用得自睾丸、卵巢或脑的组织。另外，当从动物中分离与编码人RNF43蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用得自胎肺或胎肾的组织。
本领域技术人员可以常规选择分离DNA所用的杂交条件，所述DNA编码与人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽。例如，可通过于68℃使用“Rapid-hyb缓冲液”(Amersham LIFE SCIENCE)进行预杂交达30分钟或更长时间，加入经标记的探针并于68℃加热1小时或更长时间来进行杂交。例如，可在低严紧条件下进行下述洗涤步骤。低严紧条件是例如42℃，2×SSC，0.1％SDS，或优选为50℃，2×SSC，0.1％SDS。更优选使用高度严紧条件。高度严紧条件是例如室温下用2×SSC，0.01％SDS洗涤3次，每次20分钟，然后于37℃用1×SSC，0.1％SDS洗涤3次，每次20分钟，再于50℃用1×SSC，0.1％SDS洗涤2次，每次20分钟。然而，几个诸如温度和盐浓度的因素可影响杂交的严紧度，本领域技术人员可适当选择这些因素以获得所需的严紧度。
可以使用基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法替代杂交来分离DNA，所述DNA编码与人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽，所述方法使用基于编码蛋白质的DNA序列信息(SEQ ID NO：1，3或5)所合成的引物。
由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、与人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽一般与人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。“高度同源性”一般指的是同源性为40％或更高，优选为60％或更高，更优选为80％或更高，甚至更优选为95％或更高。根据“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA80：726-730(1983)”中的算法即可测定多肽的同源性。
本发明多肽的氨基酸序列、分子量、等电点、糖链的存在或缺乏、或形式可以有所不同，这取决于用于产生所述多肽的细胞或宿主或所使用的纯化方法。无论如何，只要其功能等同于本发明的人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白，就落入本发明的范围。
通过本领域技术人员众所周知的方法可将本发明的多肽制备成重组蛋白质或天然蛋白质。通过下述方法即可制备重组蛋白质，即将编码本发明多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获得提取物，通过对提取物进行层析来纯化多肽，所述层析包括例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、或利用固定有抗本发明蛋白质之抗体的层析柱的亲和层析，或一种以上所述柱的组合。
另外，当在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中将本发明的多肽表达成与谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白或添加有多个组氨酸的重组蛋白质时，可使用谷胱甘肽柱或镍柱来纯化所表达的重组蛋白质。或者，当将本发明的多肽表达成被c-myc，多个组氨酸或FLAG标记的蛋白质时，可分别使用抗c-myc，His或FLAG的抗体来检测和纯化所述蛋白质。
纯化融合蛋白之后，必要时也可以通过凝血酶或Xa因子切割来切除非目的多肽区域。
通过本领域技术人员已知的方法，例如通过使结合有能与CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白结合的下述抗体的亲和柱与表达本发明多肽的组织或细胞提取物接触，即可分离出天然蛋白质。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还包括本发明多肽的部分肽。部分肽具有本发明多肽所特有的氨基酸序列，并由至少7个氨基酸，优选为8个或更多个氨基酸，更优选为9个或更多个氨基酸组成。部分肽可用于例如制备抗本发明多肽的抗体，筛选与本发明多肽结合的化合物，以及筛选本发明多肽的促进剂或抑制剂。
通过基因工程，通过已知的肽合成法或通过用适当的肽酶消化本发明的多肽，即可产生本发明的部分肽。例如，可以使用固相合成或液相合成来进行肽合成。
另外，本发明提供了编码本发明多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸可用于体内或体外产生如上所述的本发明多肽，或者可用于因编码本发明蛋白质的基因中的基因异常所致疾病的基因治疗。可以使用任何形式的本发明的多核苷酸，只要它能编码本发明的多肽即可，其包括mRNA，RNA，cDNA，基因组DNA和化学合成的多核苷酸。本发明的多核苷酸包括含有给定核苷酸序列及其简并序列的DNA，只要所得DNA能编码本发明的多肽即可。
通过本领域技术人员已知的方法即可制备本发明的多核苷酸。例如，可通过下述方法制备本发明的多核苷酸：由表达本发明多肽的细胞制备cDNA文库，并使用本发明DNA(如SEQ ID NO：1，3或5)的部分序列作为探针进行杂交。例如，通过Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中所述的方法即可制备cDNA文库；或者也可以使用商购的cDNA文库。也可通过下述方法制备cDNA文库：从表达本发明多肽的细胞中提取RNA，基于本发明DNA的序列(如SEQ ID NO：1，3或5)合成寡DNA，使用寡DNA作为引物进行PCR，并扩增编码本发明蛋白质的cDNA。
另外，通过对所得cDNA的核苷酸进行测序，即可常规测定由cDNA编码的翻译区，并能容易地获得本发明多肽的氨基酸序列。另外，通过使用所得cDNA或其部分作为探针筛选基因组DNA文库，即可分离出基因组DNA。
更具体地，可首先从表达本发明目的多肽的细胞、组织或器官中制备mRNA(CXADRL1：睾丸或卵巢；GCUD1：睾丸、卵巢或脑；RNF43：胎肺或胎肾)。可使用已知方法分离mRNA；例如，通过胍超速离心(Chirgwinet al.，Biochemistry 18：5294-5299(1979))或AGPC法(Chomczynski and Sacchi，Anal Biochem 162：156-159(1987))即可制备总RNA。另外，可使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等从总RNA中纯化mRNA，或者使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。
使用逆转录酶，用所得mRNA合成cDNA。可使用商购的试剂盒，如AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)合成cDNA。或者，可以根据5’-RACE法(Frohman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：8998-9002(1988)；Belyavsky et al.，Nucleic Acids Res 17：2919-2932(1989))合成和扩增cDNA，所述方法使用本文所述的引物、5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和聚合酶链反应(PCR)。
由PCR产物制备所需DNA片段，并与载体DNA连接。使用重组载体转化大肠杆菌等，由选定菌落制备所需重组载体。通过常规方法，如双脱氧核苷酸链终止法证实所需DNA的核苷酸序列。
考虑到用于表达的宿主中的密码子使用频率，将本发明多核苷酸的核苷酸序列设计成能够更有效地表达(Grantham et al.，Nucleic Acids Res 9：43-74(1981))。可通过商购试剂盒或常规方法改变本发明多核苷酸的序列。例如，可通过用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或适当的多核苷酸片段、添加接头或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或TAG)来改变序列。
具体地说，本发明的多核苷酸包括含有核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5的DNA。
另外，本发明提供了能在严紧条件下与具有核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5的多核苷酸杂交、并且编码与上文所述的本发明CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可适当选择严紧条件。例如，可使用低度严紧条件。更优选使用高度严紧条件。这些条件与上文所述的相同。上述杂交DNA优选为cDNA或染色体DNA。
本发明还提供了载体，其中插入了本发明的多核苷酸。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的多核苷酸，尤其是DNA，从而表达本发明的多肽，或者可用于施用本发明的多核苷酸以进行基因治疗。
当宿主细胞为大肠杆菌，并且在大肠杆菌(如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue)中大量扩增和制备载体时，载体应具有欲在大肠杆菌中扩增的″ori″和用于选择转化的大肠杆菌的标记基因(例如用药物进行选择的药物-抗性基因，如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等)。例如，可使用M13-系列载体、pUC-系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，也可使用pGEM-T、pDIRECT和pT7亚克隆和提取cDNA以及上述载体。当使用载体制备本发明的蛋白质时，表达载体特别有用。例如，欲在大肠杆菌中表达的表达载体应具有欲在大肠杆菌中扩增的上述特征。当将大肠杆菌，如JM109，DH5α，HB101或XL1Blue用作宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中有效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward etal.，Nature 341：544-546(1989)；FASEB J 6：2422-2427(1992))、araB启动子(Better et al.，Science 240：1041-1043(1988))或T7启动子等。在此方面，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(此时，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体也可含有多肽分泌所用的信号序列。介导多肽分泌至大肠杆菌周质的信号序列的例子为pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 169：4379(1987))。将载体导入靶宿主细胞的方法包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，也可使用下述载体制备本发明的多肽，即得自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids Res18(17)：5322(1990))，pEF，pCDM8)，得自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，得自植物的表达载体(例如pMH1，pMH2)，得自动物病毒的表达载体(例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，得自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)，得自酵母的表达载体(例如“毕赤氏酵母表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)以及得自枯草芽孢杆菌的表达载体(如pPL608，pKTH50)。
为了在动物细胞，如CHO，COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.，Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima et al.，Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV启动子等，优选还具有选择转化子所用的标记基因(例如用药物进行选择的药物抗性基因(如新霉素、G418))。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。
另外，可使用一些方法在稳定表达基因的同时在细胞内扩增基因的拷贝数。例如，可将含有互补DHFR基因的载体(如pCHO I)导入核酸合成途径缺失的CHO细胞，然后通过氨甲蝶呤(MTX)进行扩增。另外，当瞬时表达基因时，可以使用这样一种方法，其中含有SV40复制起点的载体(pcD等)被转化至染色体上含有表达SV40T抗原的基因的COS细胞。
按上述方法获得的本发明多肽可分离自宿主细胞的内部或外部(如培养基)，并被纯化成基本上纯的均质多肽。本文所用的与给定多肽有关的术语“基本上纯”指的是多肽基本上不含其它生物大分子。基本上纯的多肽是指干重至少75％(如至少80，85，95或99％)纯。通过任何适当的标准方法皆可测定纯度，所述方法包括例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。分离和纯化多肽的方法不局限于任何特定的方法；实际上，可使用任何标准方法。
例如，可以适当选择柱层析、过滤、超滤、盐沉淀、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶，并将它们组合用于分离和纯化多肽。
层析的例子包括例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。通过液相层析，如HPLC和FPLC即可进行这些层析。因此，本发明提供了通过上述方法制备的高度纯化的多肽。
通过在纯化前或纯化后用适当的蛋白质修饰酶处理本发明的多肽，即可对其进行任意修饰或部分缺失。有用的蛋白质修饰酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酰内肽酶、蛋白激酶、葡糖苷酶等。
本发明提供了与本发明的多肽结合的抗体。本发明的抗体可以任何形式被使用，如单克隆或多克隆抗体，并且包括通过用本发明的多肽免疫动物，如兔获得的抗血清、所有类别的多克隆和单克隆抗体、人抗体和通过基因重组产生的人源化抗体。
可用作抗原以获得抗体的本发明多肽可得自任何动物，但优选得自哺乳动物，如人、小鼠或大鼠，更优选得自人。人源多肽可得自本文公开的核苷酸或氨基酸序列。
根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白质或蛋白质的部分肽。部分肽可含有例如本发明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。更具体地，包含密码子235-276，493-537或70-111的CXADRL1多肽可用作制备抗本发明CXADRL1的抗体所用的部分肽。
或者，为了制备抗本发明多肽的抗体，可使用含有下述氨基酸序列中的任一个的肽。
-RNF43；SEQ ID No：80，97或108
-CXADRL1；SEQ ID No：124
-GCUD1；SEQ ID No：164
在本文中，抗体被定义为与本发明多肽的全长或片段反应的蛋白质。
可将编码本发明多肽或其片段的基因插入已知表达载体，然后按本文所述用所述载体转化宿主细胞。通过任何标准方法从宿主细胞的外部或内部回收所需多肽或其片段，随后将其用作抗原。或者，将表达多肽的完整细胞或其裂解物或化学合成的多肽用作抗原。
可用抗原免疫任何哺乳动物，但优选考虑与细胞融合所用亲代细胞的相容性。一般使用啮齿类、兔形目(Lagomorpha)或灵长类动物。啮齿类动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如兔。灵长类动物包括例如Catarrhini猴(old world猴)，如食蟹猴(Macaca fascicularis)，恒河猴(rhesus monkey)，sacred狒狒和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体地，可稀释抗原，将其悬浮于适当量的磷酸缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中。必要时，可将抗原悬浮液与适当量的标准佐剂，如弗氏完全佐剂混合，制成乳剂，然后施用给哺乳动物。优选随后按照4至21天的间隔多次施用与适当量的弗氏不完全佐剂混合的抗原。适当的载体也可用于免疫。按上文所述进行免疫之后，通过标准方法检查血清中所需抗体量的增加。
通过从经检查后确定血清中所需抗体量有所增加的经免疫哺乳动物体内收集血液，并通过使用任何常规方法从血液中分离出血清，即可制备抗本发明多肽的多克隆抗体。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，可以从血清中分离含有多克隆抗体的组分。可以使用例如与本发明多肽偶联的亲和柱获得仅识别本发明多肽的组分，并使用蛋白A或蛋白G柱进一步纯化该组分，从而由所述组分制备免疫球蛋白G或M。
为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物体内收集免疫细胞，按上文所述检查血清中水平有所增加的所需抗体，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选得自脾脏。其它可与上述免疫细胞融合的优选亲代细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选为具有用药物选择融合细胞时所需的获得型特性的骨髓瘤细胞。
可根据已知方法，例如Milstein等的方法(Galfre and Milstein，MethodsEnzymol 73：3-46(1981))融合上述免疫细胞和骨髓瘤细胞。
通过在标准的选择培养基，如HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养即可选择出通过细胞融合获得的杂交瘤。一般在HAT培养基中维持细胞培养物数天至数周，维持的时间应足以使除所需杂交瘤以外的所有其它细胞(非融合细胞)死亡。然后进行标准的有限稀释以筛选和克隆能产生所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上文所述的用抗原免疫非人动物以制备杂交瘤的方法外，也可在体外用多肽、表达多肽的细胞或其裂解物免疫人淋巴细胞，例如被EB病毒感染的人淋巴细胞。然后，使经免疫的淋巴细胞与得自人的能够无限分裂的骨髓瘤细胞，如U266融合，从而产生能生成所需人抗体的杂交瘤，所述抗体能结合所述多肽(未审公开的日本专利申请(JP-A)Sho 63-17688)。
随后，将所得杂交瘤移植到小鼠腹腔中并抽取腹水。可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明多肽的亲和柱来纯化所获得的单克隆抗体。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的多肽，还可用作本发明多肽的候选激动剂和拮抗剂。另外，所述抗体还可用于与本发明多肽相关之疾病的抗体治疗。当给人体施用所得抗体时(抗体治疗)，优选人抗体或人源化抗体以降低免疫原性。
例如，可以用选自多肽、表达多肽的细胞或其裂解物的抗原免疫携有人抗体基因的转基因动物。然后从动物体内收集产生抗体的细胞并与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤，从中可制备出抗所述多肽的人抗体(参见WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。
或者，可通过癌基因无限增殖化能产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞，并将其用于制备单克隆抗体。
也可使用基因工程技术重组制备如此获得的单克隆抗体(参见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in theUnited Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可从能产生抗体的免疫细胞，如杂交瘤或经免疫的淋巴细胞中克隆编码抗体的DNA，将其插入适当载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了按上文所述制备的重组抗体。
另外，本发明的抗体可以是抗体片段或经修饰的抗体，只要它们能结合本发明的一种或多种多肽即可。例如，抗体片段可以是Fab，F(ab’)2，Fv或单链Fv(scFv)，其中通过适当接头连接得自H和L链的Fv片段(Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-5883(1988))。更具体地，通过用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体即可产生抗体片段。或者，可构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在适当宿主细胞中表达(参见例如Coet al.，J Immunol 152：2968-2976(1994)；Better and Horwitz，Methods Enzymol178：476-496(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol.121：652-663(1986)；Rousseaux et al.，Methods Enzymol121：663-669(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol 9：132-137(1991))。
通过与多种分子，如聚乙二醇(PEG)偶联即可修饰抗体。本发明提供了这种经修饰的抗体。通过对抗体进行化学修饰即可获得经修饰的抗体。这些修饰方法是本领域的常规技术。
或者，本发明的抗体可以是得自非人抗体的可变区与得自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或者是含有得自非人抗体的互补决定区(CDR)、得自人抗体的构架区(FR)和恒定区的人源化抗体。使用已知技术即可制备出所述抗体。
可将按上文所述获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于普通蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当选择和组合使用柱层析，如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等可以分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.EdHarlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作亲和柱。可以使用的蛋白A柱的例子包括例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除亲和层析以外的层析例包括例如：离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。可通过液相层析，如HPLC和FPLC进行层析过程。
例如，可以使用吸光度测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光来测定本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在培养板上，将本发明的多肽上样于板上，然后上样含有所需抗体的样品，如产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体样品。然后上样能识别第一抗体并被酶，如碱性磷酸酶标记的第二抗体，并保温培养板。接着，在洗涤之后，在培养板中加入酶底物，如对硝基苯磷酸，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可用作多肽。可使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的活性。
上述方法通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明多肽的样品，并检测或测定抗体和多肽形成的免疫复合物，可以检测或测定本发明的多肽。
由于检测或测定本发明多肽的方法可特异性检测或测定多肽，因此，所述方法可用于多种使用所述多肽的实验。
本发明还提供了含有至少15个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸能与编码人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：1，3或5)或其互补链杂交。优选本发明的多核苷酸是能与编码本发明多肽的DNA特异性杂交的多核苷酸。本文所用术语“特异性杂交”指的是在通常的杂交条件下，优选在严紧杂交条件下不与编码其它蛋白质的DNA发生显著交叉杂交。所述多核苷酸包括能与编码本发明多肽的DNA或其互补链特异性杂交的探针、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如反义寡核苷酸和核酶)。另外，所述多核苷酸可用于制备DNA芯片。
本发明包括能与核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5内的任何位点杂交的反义寡核苷酸。优选所述反义寡核苷酸针对的是核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5中的至少15个连续核苷酸。甚至更优选上述反义寡核苷酸在上述至少15个连续核苷酸中含有起始密码子。更具体地，所述反义寡核苷酸包括含有核苷酸序列SEQ ID NO：23或25的反义寡核苷酸用于抑制CXADRL1表达；含有核苷酸序列SEQ ID NO：27或29的反义寡核苷酸用于抑制GCUD1的表达；含有核苷酸序列SEQ ID NO：31的反义寡核苷酸用于抑制RNF43的表达。
反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物可用作反义寡核苷酸。所述修饰产物的例子包括低级烷基磷酸酯修饰，如甲基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型修饰，硫代磷酸酯修饰和氨基磷酸酯修饰。
本文所用术语“反义寡核苷酸”不仅意味着其中与构成DNA或mRNA特定区域的核苷酸相对应的核苷酸能够完全互补，还意味着其中可含有一个或多个核苷酸错配，只要DNA或mRNA和反义寡核苷酸能与核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5特异性杂交即可。
“至少15个连续核苷酸序列区域”中所包含的这种多核苷酸的同源性至少为70％或更高，优选为80％或更高，更优选为90％或更高，甚至更优选为95％或更高。可以使用本文提及的算法测定同源性。所述多核苷酸可用作探针以按照下文实施例所述分离或检测编码本发明的多肽，或用作扩增所用的引物。
本发明的反义寡核苷酸衍生物通过下述机制对产生本发明多肽的细胞发挥作用，即与编码多肽的DNA或mRNA结合，抑制其转录或翻译，促进mRNA降解并抑制本发明多肽的表达，从而导致多肽功能受抑制。
通过与对衍生物无活性的适当基质混合，可将本发明的反义寡核苷酸衍生物制成外用制剂，如涂抹剂(liniment)或泥罨敷剂(poultice)。
必要时，也可通过加入赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛剂等，将衍生物配制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。通过下述的一般方法即可制备所述制剂。
通过直接施用于病痛部位或注射至血管以使其到达病痛部位，将反义寡核苷酸衍生物施用给患者。也可使用反义寡核苷酸-固定介质增加持久性和膜-通透性。所述介质如脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂，或其衍生物。
可根据患者的身体状况适当调整本发明的反义寡核苷酸衍生物的剂量，并按所需的量使用所述剂量。例如，可以施用的剂量范围为0.1至100mg/kg，优选为0.1至50mg/kg。
本发明还包括小的干扰RNA(siRNA)，其含有核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5的有义链核酸和反义链核酸组合。更具体地，抑制RNF43表达的siRNA包括其有义链含有核苷酸序列SEQ ID NO：40，41，42或43的siRNA。或者，抑制CXADRL1表达的siRNA包括其有义链含有核苷酸序列SEQ IDNO：62或63的siRNA。
术语″siRNA″指的是能防止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括将DNA用作模板以转录RNA的技术。siRNA含有编码人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：1，3或5)的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA使得单个转录物(双链RNA)具有来自靶基因的有义和互补反义序列，如发夹结构。
该方法被用于改变细胞中的基因表达，其中在所述细胞中，作为例如细胞恶性转化的结果，CXADRL1，GCUD1或RNF43的表达被上调。siRNA与靶细胞中CXADRL1，GCUD1或RNF43转录物的结合导致细胞产生的蛋白质减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，并且可以与天然转录物一样长。优选寡核苷酸长度为19-25个核苷酸。最优选寡核苷酸长度少于75，50或25个核苷酸。能抑制其在哺乳动物细胞中的表达的CXADRL1，GCUD1或RNF43 siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO：112-114中的任一个的寡核苷酸。这些序列分别是下述siRNA序列的靶序列。
SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：40，41(RNF43)；
SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：42，43(RNF43)；和
SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：62，63(CXADRL1)。
使用可得自Ambion网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)的siRNA设计计算机程序设计siRNA的核苷酸序列。基于下述方案通过计算机程序选择siRNA合成所用的核苷酸序列。
选择siRNA靶位点：
1.自目标转录物的AUG起始密码子开始，扫描下游的AA二核苷酸序列。记录每个AA和3′方向邻接的19个核苷酸的出现，以作为潜在的siRNA靶位点。Tuschl等推荐针对5′和3′非翻译区(UTR)和起始密码子附近的区域(75个碱基以内)设计siRNA，因为所述区域中的调节蛋白结合位点较多。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。
2.将潜在的靶位点与人基因组数据库进行比较，无需考虑任何与其它编码序列具有显著同源性的靶序列。可使用能在NCBI服务器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中找到的BLAST进行同源性检索。
3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion网站，优选沿着需评价之基因的长度选择几个靶序列。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA能抑制本发明多肽的表达，从而可用于抑制本发明多肽的生物活性。含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达-抑制剂也可用于抑制本发明多肽的生物活性。因此，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病，如癌症。
另外，本发明提供了使用本发明多肽的表达水平作为诊断标记以诊断细胞增殖性疾病的方法。
该诊断方法包括步骤：(a)检测本发明的CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的表达水平；和(b)将表达水平的升高与细胞增殖性疾病，如癌症相关联。
通过定量与CXADRL1，GCUD1或RNF43基因相对应的mRNA或由所述基因编码的蛋白质，即可估计特定样品中CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的表达水平。本领域技术人员已知定量mRNA的方法。例如，通过Northern印迹或RT-PCR即可估计出与CXADRL1，GCUD1或RNF43基因相对应的mRNA的水平。由于CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的全长核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，3或5，本领域的任何技术人员都可设计探针或引物的核苷酸序列以定量CXADRL1，GCUD1或RNF43基因。
也可基于基因所编码蛋白质的活性或量来分析CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的表达水平。下文将描述测定CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白量的方法。例如，免疫测定法可用于测定生物材料中的蛋白质。任何生物材料都可用于测定蛋白质或其活性。例如，可分析血样以估计由血清标记编码的蛋白质。另一方面，可选择适当方法，以根据每种待分析蛋白质的活性测定CXADRL1，GCUD1或RNF43基因所编码蛋白质的活性。
估计样品(检测样品)中CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的表达水平，并与正常样品中的表达水平相比较。当比较结果表明靶基因的表达水平高于正常样品中的表达水平时，可以判断受试者患有细胞增殖性疾病。可同时测定得自正常样品和受试者的样本中的CXADRL1，GCUD1或RNF43基因的表达水平。或者，以分析先前从对照组收集的样品中的基因表达水平所得的结果为基础，通过统计学方法测定表达水平的正常范围。通过将受试者的样品与正常范围相比较得出结果；当结果未落入正常范围时，可判断受试者患有细胞增殖性疾病。在本发明中，被诊断的细胞增殖性疾病优选为癌症。更优选地，当估计出CXADRL1或GCUD1基因的表达水平并与正常样品中的表达水平相比较时，诊断出的细胞增殖性疾病是胃癌、结直肠癌或肝癌；而当估计出RNF43基因的表达水平时，诊断出的疾病是结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌。
在本发明中，还提供了诊断细胞增殖性疾病所用的诊断试剂，所述疾病如癌症，包括胃癌、结直肠癌、肺癌和肝癌。本发明的诊断试剂含有与本发明的多核苷酸或多肽结合的化合物。优选与本发明的多核苷酸杂交的寡核苷酸或与本发明多肽结合的抗体可用作所述化合物。
另外，本发明还提供了使用本发明的多肽筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法。所述筛选方法的实施方案包括步骤：(a)使受试化合物与本发明的多肽接触，(b)检测本发明多肽与受试化合物之间的结合活性，和(c)选择与本发明多肽结合的化合物。
用于筛选的本发明多肽可以是重组多肽或得自天然的蛋白质，或其部分肽。可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。与受试化合物接触的本发明多肽可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。
至于使用本发明的多肽筛选蛋白质，例如与本发明多肽结合的蛋白质的方法，可以使用多种本领域技术人员众所周知的方法。通过例如免疫沉淀法，特别是按照下述方式即可进行所述筛选。通过将基因插入外源基因的表达载体，如pSV2neo，pcDNAI和pCD8，在动物细胞等中表达编码本发明多肽的基因。用于表达的启动子可以是任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))、EF-1α启动子(Kim et al.，Gene 91：217-223(1990))、CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193-200(1991))、RSVLTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SRα启动子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8：466(1988))、CMV即早期启动子(Seed andAruffo，Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-3369(1987))、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1：385-394(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9：946(1989))、HSV TK启动子等。可根据任何方法将基因导入动物细胞以表达外源基因，所述方法如电穿孔法(Chu etal.，Nucleic Acids Res 15：1311-1326(1987))、磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopata et al.，NucleicAcids Res 12：5707-5717(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 4：642-1643(1985))、脂质转染法(Derijard，B Cell 7：1025-1037(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al.，Science 259：230-234(1993))等。通过在本发明多肽的N-或C-末端导入特异性已被揭示的单克隆抗体表位，可将本发明的多肽表达成含有单克隆抗体识别位点(表位)的融合蛋白。可以使用商购的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖-结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体可以商购。
本文还报道了通过仅导入由几个至十几个氨基酸组成的小表位而制备的融合蛋白，以致于融合不会改变本发明多肽的特性。诸如聚组氨酸(His-标记)、流感病毒聚集体HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-标记)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标记)、E-标记(单克隆噬菌体上的表位)等的表位和识别它们的单克隆抗体可用作表位-抗体系统，用于筛选与本发明多肽结合的蛋白质(ExperimentalMedicine 13：85-90(1995))。
在免疫沉淀中，通过在使用适当去污剂制备的细胞裂解物中加入这些抗体以形成免疫复合物。免疫复合物由本发明的多肽、能与所述多肽结合的多肽和抗体组成。除了使用抗上述表位的抗体外，还可使用可按上文所述制备的抗本发明多肽的抗体进行免疫沉淀。
当抗体是小鼠IgG抗体时，可通过例如蛋白A Sepharose凝胶或蛋白GSepharose凝胶沉淀免疫复合物。如果本发明的多肽被制备成与表位，如GST的融合蛋白，可按照与使用抗本发明多肽的抗体相同的方式，使用与这些表位特异性结合的物质，如谷胱甘肽-Sepharose 4B形成免疫复合物。
可根据或按照例如文献中所述的方法(Harlow and Lane，Antibodies，511-552，Cold Spring Harbor Laboratory publications，New York(1988))进行免疫沉淀。
SDS-PAGE常用于分析被免疫沉淀的蛋白质，使用具有适当浓度的凝胶，通过蛋白质的分子量可分析结合的蛋白质。由于通过普通的染色法，如考马斯染色或银染难以检测与本发明多肽结合的蛋白质，通过在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质并检测蛋白质即可改善蛋白质的检测敏感性。当已揭示出蛋白质的分子量时，可直接从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中纯化靶蛋白质并测定其序列。
至于使用本发明多肽筛选与所述多肽结合的蛋白质的方法，可以使用例如West-Western印迹分析(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。具体地说，可通过下述步骤获得与本发明多肽结合的蛋白质：使用噬菌体载体(如ZAP)，由有望表达与本发明多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官(例如，筛选与CXADRL1结合的蛋白质时，所述组织如睾丸和卵巢；筛选与GCUD1结合的蛋白质时，所述组织为睾丸、卵巢和脑；筛选与RNF43结合的蛋白质时，所述组织为胎肺和胎肾)或经培养细胞制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达蛋白质，将表达的蛋白质固定于滤膜上，使经纯化和标记的本发明多肽与上述滤膜反应，以及根据标记检测表达与本发明多肽结合的蛋白质的噬斑。利用生物素和亲和素之间的结合，或利用与本发明多肽特异性结合的抗体，或与本发明多肽融合的肽或多肽(如GST)，可以标记本发明的多肽。也可利用使用放射性同位素或荧光等的方法。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双-杂合系统(“MATCHMAKER双-杂合系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双-杂合试验试剂盒”，“MATCHMAKER单-杂合系统”(Clontech)；“HybriZAP双-杂合载体系统”(Stratagene)；参见文献“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-292(1994)”)。
在双-杂合系统中，本发明的多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合并在酵母细胞中表达。cDNA文库制备自有望表达与本发明多肽结合的蛋白质的细胞，使得所述文库表达时能与VP16或GAL4转录激活区融合。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，从检测到的阳性克隆中分离得自文库的cDNA(当在酵母细胞中表达与本发明多肽结合的蛋白质时，两者的结合激活了报道基因，使得阳性克隆能被检测到)。通过将上文分离到的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白质即可制备由cDNA编码的蛋白质。
至于报道基因，除了HIS3基因外，还可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
也可使用亲和层析筛选与本发明多肽结合的化合物。例如，可将本发明的多肽固定在亲和柱的载体上，将含有能与本发明多肽结合的蛋白质的受试化合物上样于亲和柱。本文中的受试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。上样受试化合物之后，洗涤柱，即可制备与本发明多肽结合的化合物。
当受试化合物是蛋白质时，分析所得蛋白质的氨基酸序列，基于所述序列合成寡DNA，使用该寡DNA作为探针筛选cDNA文库以获得编码蛋白质的DNA。
在本发明中，使用表面胞质基因组共振现象的生物传感器可用作检测或定量结合化合物的仪器。当使用所述生物传感器时，仅使用极少量的多肽并且无需标记，即可实时观察到表现为表面胞质基因组共振信号的本发明多肽和受试化合物之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，可以使用生物传感器，如BIAcore评价本发明多肽和受试化合物之间的结合。
当固定化的本发明多肽暴露于合成化合物，或天然物质库，或随机噬菌体肽展示文库时筛选结合分子的方法，以及基于组合化学技术(Wrightonet al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))进行高通量筛选从而不仅分离出蛋白质，还分离出与本发明蛋白质结合的化合物(包括激动剂和拮抗剂)的方法是本领域技术人员众所周知的。
或者，本发明的筛选方法可包括下述步骤：
a)使候选化合物与已导入载体的细胞接触，所述载体含有一个或多个标记基因的转录调节区和在转录调节区控制之下表达的报道基因，其中一个或多个标记基因选自CXADRL1，GCUD1和RNF43，
b)测定所述报道基因的活性；和
c)选择与对照相比能降低所述报道基因的表达水平的化合物。
适当的报道基因和宿主细胞是本领域众所周知的。通过使用标记基因的转录调节区可以制备筛选所需的报道构建体。当标记基因的转录调节区已为本领域技术人员所知时，使用先前已知的序列信息即可制备报道构建体。当仍未鉴定出标记基因的转录调节区时，可基于标记基因的核苷酸序列信息，从基因组文库中分离出含有转录调节区的核苷酸区段。
通过筛选分离出的化合物是能促进或抑制本发明多肽活性的候选药物，可用于治疗或预防例如细胞增殖性疾病所导致的疾病，如癌症。通过本发明的筛选方法获得的化合物包括这样一种化合物，其中通过本发明的筛选方法获得的、具有与本发明多肽结合之活性的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
在另一个实施方案中，本发明提供了筛选候选药剂的方法，所述药剂是治疗细胞增殖性疾病的潜在靶。如上文所详细讨论的，通过控制CXADRL1，GCUD1或RNF43的表达水平，就可以控制胃癌，或结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌的发生和发展。因此，通过利用CXADRL1，GCUD1或RNF43的表达水平和活性作为指标进行筛选，即可鉴定出身为治疗细胞增殖性疾病的潜在靶的候选药剂。在本发明的上下文中，所述筛选包括例如下述步骤：
a)使候选化合物与表达CXADRL1，GCUD1或RNF43的细胞接触；和
b)选择与缺乏所述化合物时检测到的表达水平相比，能降低CXADRL1，GCUD1或RNF43表达水平的化合物。
表达CXADRL1，GCUD1或RNF43中的至少一种的细胞包括例如由胃癌、结直肠癌、肺癌或肝癌建立的细胞系；所述细胞可用于本发明的上述筛选。通过本领域技术人员众所周知的方法即可估计出表达水平。在筛选方法中，可将能降低CXADRL1，GCUD1或RNF43中的至少一种的表达水平的化合物选择为候选药剂。
在本发明的另一个筛选治疗细胞增殖性疾病所用化合物的方法的实施方案中，所述方法利用本发明多肽的生物活性作为指标。由于本发明的CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白具有促进细胞增殖的活性，使用此活性作为指标可以筛选出能促进或抑制本发明蛋白质之一的此活性的化合物。该筛选方法包括步骤：(a)使受试化合物与本发明的多肽接触；(b)检测步骤(a)中多肽的生物活性；和(c)选择与缺乏受试化合物时检测到的生物活性相比，能抑制多肽生物活性的化合物。
任何多肽都可用于筛选，只要它们具有CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的生物活性即可。所述生物活性包括人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的细胞-增殖活性，RNF43与NOTCH2或STRIN结合的活性。例如，可使用人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白，也可使用与这些蛋白质功能等同的多肽。所述多肽可由细胞内源或外源性地表达。
可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物或天然化合物。
通过所述筛选分离出的化合物是本发明多肽的候选激动剂或拮抗剂。术语“激动剂”指的是通过与本发明多肽结合而激活所述多肽功能的分子。类似地，术语“拮抗剂”指的是通过与本发明多肽结合而抑制所述多肽功能的分子。另外，通过所述筛选分离出的化合物是能抑制本发明多肽与分子(包括DNA和蛋白质)的体内相互作用的候选化合物。
当本发明方法欲检测的生物活性是细胞增殖时，通过例如制备能表达本发明多肽的细胞，在受试化合物的存在下培养细胞，并按实施例中所述测定细胞增殖的速度，测定细胞周期，以及测定集落形成活性即可检测到所述活性。
通过上述筛选分离出的化合物是能抑制本发明多肽之活性的候选药物，并可用于治疗与本发明多肽相关的疾病，如包括癌症的细胞增殖性疾病。更具体地，当将CXADRL1或GCUD1蛋白的生物活性用作指标时，通过本发明的方法筛选的化合物用作治疗胃癌、结直肠癌或肝癌的候选药物。另一方面，当将RNF43蛋白的生物活性用作指标时，通过本发明的方法筛选的化合物还可用作治疗结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌的候选药物。
另外，通过本发明的筛选方法可以获得的化合物还包括这样一种化合物，其中能抑制CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白之活性的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
在本发明的另一个筛选治疗细胞增殖性疾病所用化合物的方法的实施方案中，所述方法利用RNF43与NOTCH2或STRIN的结合能力。已证实本发明的RNF43蛋白能与NOTCH2和STRIN结合。这些发现表明本发明的RNF43蛋白通过与诸如NOTCH2和STRIN的分子结合而发挥细胞增殖功能。因此，抑制RNF43蛋白与NOTCH2或STRIN之间的结合有望导致细胞增殖受抑制，能抑制结合的化合物可用作治疗细胞增殖性疾病，如癌症的药物。通过本发明的方法筛选的化合物所治疗的细胞增殖性疾病优选为结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌。
该筛选方法包括步骤：(a)在受试化合物的存在下使本发明的多肽与NOTCH2或STRIN接触；(b)检测多肽与NOTCH2或STRIN之间的结合；和(c)选择能抑制多肽与NOTCH2或STRIN之间的结合的化合物。
用于筛选的本发明的RNF43多肽以及NOTCH2或STRIN可以是重组多肽或天然来源的蛋白质，或者也可以是它们的部分肽，只要能保留彼此之间的结合能力即可。用于筛选的RNF43多肽、NOTCH2或STRIN可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。
可以使用任何受试化合物，例如细胞提取物、细胞培养物上清液、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化的或粗的蛋白质、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。
至于筛选能抑制RNF43蛋白与NOTCH2或STRIN结合的化合物的方法，可使用多种本领域技术人员众所周知的方法。可在体外检测系统，如细胞系统中进行筛选。更具体地，首先使RNF43多肽，或者NOTCH2或STRIN与支持物结合，再在支持物上添加另一种蛋白质以及受试样品。接着保温混合物，洗涤，检测和/或测定与支持物结合的另一种蛋白质。
同样，通过本发明可分离出能干扰CXADRL1和AIP1结合的化合物。抑制CXADRL1和AIP1之间的结合有望能抑制细胞增殖，而能抑制结合的化合物可用作治疗细胞增殖性疾病，如癌症的药物。
可用于结合蛋白质的支持物包括例如不溶性的多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；和合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；优选使用由上述材料制备的可商购的珠和板(如多孔板，生物传感器芯片等)。当使用珠时，可将其填充于柱中。
可根据常规方法，如化学键合和物理吸附使蛋白质与支持物结合。或者，可经由特异性识别蛋白质的抗体使蛋白质与支持物结合。另外，也可以利用亲和素和生物素结合使蛋白质与支持物结合。
在例如，但不限于磷酸缓冲液和Tris缓冲液的缓冲液中进行蛋白质之间的结合，只要缓冲液不会抑制蛋白质之间的结合即可。
在本发明中，使用表面胞质基因组共振现象的生物传感器可用作检测或定量结合蛋白质的仪器。当使用所述生物传感器时，仅使用极少量的多肽并且无需标记，即可实时观察到表现为表面胞质基因组共振信号的蛋白质之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，可以使用生物传感器，如BIAcore评价RNF43多肽与NOTCH2或STRIN之间的结合。
或者，可标记RNF43多肽，或NOTCH2或STRIN，结合蛋白质的标记可用于检测或测定结合蛋白质。具体地，预标记一种蛋白质之后，在受试化合物的存在下使标记的蛋白质与另一种蛋白质接触，洗涤后根据标记检测或测定结合蛋白质。
在本发明的方法中，可使用标记物质，如放射性同位素(如3H，14C，32P，33P，35S，125I，131I)、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶)、荧光物质(如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明)和生物素/亲和素标记蛋白质。当用放射性同位素标记蛋白质时，可通过液体闪烁进行检测或测定。或者，通过加入酶底物，用吸光计检测底物的酶促变化，如颜色的产生，即可检测或测定用酶标记的蛋白质。另外，当将荧光物质用作标记时，可使用荧光光度计检测或测定结合蛋白质。
另外，使用抗RNF43多肽和NOTCH2或STRIN的抗体也可检测或测定RNF43多肽与NOTCH2或STRIN的结合。例如，使固定于支持物上的RNF43多肽与受试化合物和NOTCH2或STRIN接触之后，保温混合物并洗涤，使用抗NOTCH2或STRIN的抗体进行检测或测定。或者，将NOTCH2或STRIN固定于支持物上，将抗RNF43的抗体用作抗体。
当在本发明的筛选方法中使用抗体时，优选用上述的一种标记物质标记抗体，并基于标记物质检测或测定抗体。或者，将抗RNF43多肽、NOTCH2或STRIN的抗体用作第一抗体，用经标记物质标记的第二抗体可以检测出所述第一抗体。另外，使用蛋白G或蛋白A柱可以检测或测定在本发明的筛选方法中与蛋白质结合的抗体。
或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双-杂合系统(“MATCHMAKER双-杂合系统”，“哺乳动物MATCHMAKER双-杂合试验试剂盒”，“MATCHMAKER单-杂合系统”(Clontech)；“HybriZAP双-杂合载体系统”(Stratagene)；参见文献“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-292(1994)”)。
在双-杂合系统中，本发明的RNF43多肽与SRF-结合区或GAL4-结合区融合并在酵母细胞中表达。与本发明的RNF43多肽结合的NOTCH2或STRIN与VP16或GAL4转录激活区融合，并能在受试化合物的存在下在酵母细胞中表达。当受试化合物不能抑制RNF43多肽与NOTCH2或STRIN之间的结合时，两者的结合会激活报道基因，使得阳性克隆能被检测到。
至于报道基因，除了HIS3基因外，还可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。
通过筛选分离出的化合物是能抑制本发明RNF43蛋白之活性的候选药物，并可用于治疗与RNF43蛋白相关的疾病，例如细胞增殖性疾病，如癌症，更具体地为结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌。另外，通过本发明的筛选方法可以获得的化合物还包括这样一种化合物，其中能抑制RNF43蛋白与NOTCH2或STRIN之间的结合的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代被改变。
当将通过本发明的方法分离出的化合物作为药物施用于人和其它哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒、黑猩猩以治疗细胞增殖性疾病(如癌症)时，可直接施用分离的化合物，或使用已知的药物制备方法将其配制成剂量形式。例如，根据需要，可以糖衣片剂、胶囊、酏剂和微囊剂型口服药物，或者以溶于水或任何其它药物可接受液体的无菌溶液或悬浮液注射剂形式非口服给药。例如，可以常规药物实践所需的单位剂量形式将化合物与药学可接受载体或介质混合，所述载体或介质具体地为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、增味剂、赋形剂、载体、防腐剂、结合剂等。这些制品中活性成分的量能提供所示范围内的适当剂量。
可与片剂和胶囊混合的添加剂的例子有：如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶的结合剂；如晶体纤维素的赋形剂；如玉米淀粉、明胶和藻酸的膨胀剂；如硬脂酸镁的润滑剂；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味剂；如胡椒薄荷、Gaultheria adenothrix油和樱桃的增味剂。当单位剂量形式是胶囊时，上述成分中还可包括液体载体，如油。可使用注射用载体，如蒸馏水，根据常规药物实践配制注射用的无菌混合物。
生理盐水、葡萄糖和其它包括助剂的等渗液体，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠可用作注射用的水溶液。它们可与适当的增溶剂，如醇，特别是乙醇；聚醇，如丙二醇和聚乙二醇；非离子型表面活性剂，如Polysorbate 80(TM)和HCO-50一起使用。
芝麻油或豆油可用作油质液体，并可与苯甲酸苄酯或苄醇一起用作增溶剂，并可与如磷酸缓冲液和醋酸钠缓冲液的缓冲液；如盐酸普鲁卡因的止痛剂；如苄醇、酚的稳定剂；和抗氧化剂一起配制。可将制备好的注射液注入适当的安瓿中。
可使用本领域技术人员众所周知的方法给患者施用本发明的药物组合物，例如以动脉内、静脉内、经皮注射给药和鼻内、经支气管、肌内或口服给药。给药剂量和方法随患者体重和年龄的变化而改变；然而，本领域技术人员可常规选择给药剂量和方法。如果所述化合物可由DNA编码，可将DNA插入基因治疗载体，施用所述载体以进行治疗。给药剂量和方法随患者体重、年龄和症状的变化而改变；但本领域技术人员可适当选择给药剂量和方法。
例如，当给正常成人(体重为60kg)口服给药时，尽管根据症状的不同有一些差异，但与本发明多肽结合并调节其活性的化合物剂量约为0.1mg至100mg/天，优选约为1.0mg至50mg/天，更优选约为1.0mg至20mg/天。
当以注射液形式给正常成人(体重为60kg)非肠道给药时，尽管根据患者、靶器官、症状和给药方法的不同有一些差异，但合适的静脉内注射剂量约为0.01mg至30mg/天，优选约为0.1至20mg/天，更优选约为0.1至10mg/天。当给其它动物给药时，可以施用被转换成60kg体重的量。
另外，本发明提供了使用抗本发明多肽的抗体治疗或预防细胞增殖性疾病，如癌症的方法。根据此方法，需施用药物有效量的抗本发明多肽的抗体。由于CXADRL1，GCUD1和RNF43蛋白的表达在癌细胞中被上调，因此抑制这些蛋白质的表达可导致细胞增殖活性降低，通过抗体与这些蛋白质的结合有望治疗或预防细胞增殖性疾病。因此，以足以降低本发明蛋白质活性的剂量施用抗本发明多肽的抗体，所述剂量范围是0.1至约250mg/kg/天。成人的剂量范围一般约为5mg至17.5g/天，优选约为5mg至10g/天，最优选约为100mg至3g/天。
或者，将与特异于肿瘤细胞的细胞表面标记结合的抗体用作药物传递的工具。例如，以足以损伤肿瘤细胞的剂量施用与细胞毒性剂偶联的抗体。
本发明还涉及诱导抗-肿瘤免疫力的方法，所述方法包括施用CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白或其免疫活性片段，或编码蛋白质或其片段的多核苷酸的步骤。CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白或其免疫活性片段可用作抗细胞增殖性疾病的疫苗。在某些情况下，蛋白质或其片段可以与T细胞受体(TCR)结合的形式，或者以被抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞、树状细胞(DC)或B-细胞呈递的形式被施用。由于DC具有强的抗原呈递能力，因此在APC中最优选使用DC。
在本发明中，抗细胞增殖性疾病的疫苗指的是当接种于动物时，具有诱导抗-肿瘤免疫力功能的物质。根据本发明，含有氨基酸序列SEQ ID NO：80，97或108的多肽是HLA-A24或HLA-A*0201限制性的表位肽，它们能诱导针对表达RNF43的结直肠癌、肺癌、胃癌或肝癌细胞的强有力的特异性免疫应答。根据本发明，含有氨基酸序列SEQ ID NO：124的多肽是HLA-A*0201限制性的表位肽，它们能诱导针对表达CXADRL1的结肠癌、胃癌或肝癌细胞的强有力的特异性免疫应答。根据本发明，含有氨基酸序列SEQ ID NO：164的多肽是HLA-A*0201限制性的表位肽，它们能诱导针对表达GCUD1的结肠癌、胃癌或肝癌细胞的强有力的特异性免疫应答。因此，本发明还包括使用含有氨基酸序列SEQ ID NO：80，97，108，124或164的多肽诱导抗-肿瘤免疫力的方法。一般说来，抗-肿瘤免疫力包括如下所述的免疫应答：
-诱导抗肿瘤的细胞毒淋巴细胞，
-诱导识别肿瘤的抗体，和
-诱导产生抗-肿瘤的细胞因子。
因此，当将某种蛋白质接种于动物可诱导任一种免疫应答时，就可以说该蛋白质具有诱导抗-肿瘤免疫力的作用。通过观察宿主免疫系统在体内或体外针对蛋白质的反应，即可检测出蛋白质诱导的抗-肿瘤免疫力。
例如，检测细胞毒T淋巴细胞诱导的方法是众所周知的。进入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递至T细胞和B细胞。以抗原特异性方式对APC呈递的抗原作出反应的T细胞因受抗原的刺激而分化成细胞毒T细胞(或细胞毒T淋巴细胞；CTL)，然后进行增殖(也称作T细胞激活)。因此，通过用APC将某种肽呈递至T细胞，并检测CTL的诱导即可评价肽导致的CTL诱导。另外，APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞对抗-肿瘤免疫力也很重要，因此，使用这些细胞的激活作用作为标志，即可评价肽的抗-肿瘤免疫力诱导作用。
评价以树状细胞(DC)作为APC的CTL诱导作用的方法是本领域众所周知的。DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在此方法中，起初使受试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。与DC接触后检测到具有针对感兴趣细胞的细胞毒作用的T细胞，这表明受试多肽具有诱导细胞毒T细胞的活性。例如，使用51Cr-标记的肿瘤细胞的裂解作为标志，可以检测抗肿瘤的CTL活性。或者，使用3H-胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为标志评价肿瘤细胞损害程度的方法也是众所周知的。
除了DC外，也可将外周血单核细胞(PBMC)用作APC。在这种情况下，据报道，在GM-CSF和IL-4的存在下培养PBMC可以增强CTL诱导。类似地，已证实在匙孔戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7的存在下培养PBMC可以诱导CTL。
经这些方法证实具有CTL诱导活性的受试多肽是具有DC激活作用继而具有CTL诱导活性的多肽。因此，能诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗肿瘤疫苗。另外，通过与多肽接触获得诱导抗肿瘤CTL的能力的APC可用作抗肿瘤疫苗。另外，因APC呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤疫苗。使用APC和CTL所导致的抗-肿瘤免疫力的肿瘤治疗方法被称为细胞免疫治疗。
通常，当使用多肽进行细胞免疫治疗时，已知混合多种具有不同结构的多肽并将它们与DC接触可以增加CTL-诱导的效率。因此，当用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段较为有利。
或者，通过观察对抗肿瘤抗体产生的诱导可以进一步证实多肽对抗-肿瘤免疫力的诱导。例如，当在用多肽免疫的实验室动物中诱导出抗多肽的抗体时，以及在肿瘤细胞的生长受所述抗体抑制时，可测定出多肽具有诱导抗-肿瘤免疫力的能力。
通过施用本发明的疫苗可诱导抗-肿瘤免疫力，所述抗-肿瘤免疫力的诱导可治疗和预防细胞增殖性疾病，如胃癌、结直肠癌、肺癌和肝癌。抗癌治疗或癌症发生的预防包括下述步骤中的任何一种，如抑制癌细胞生长、癌症的退化和对癌症发生的抑制作用。癌症的治疗或预防也包括患癌个体死亡率的降低、血液中肿瘤标记的减少、与癌症相伴随的可测症状的减轻等。优选治疗和预防作用在统计学上是显著的，例如，与未施用疫苗的对照相比，优选在5％或更低的显著性水平上观察到抗细胞增殖性疾病的治疗或预防效果。例如，Student′s t-试验、Mann-Whitney U-试验或ANOVA可用于统计学分析。
上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂混合。佐剂指的是当与具有免疫活性的蛋白质一起(或相继)施用时能增强抗蛋白质的免疫应答的化合物。佐剂的例子包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等，但并不局限于此。另外，本发明的疫苗可与药物可接受载体适当混合。所述载体的例子是无菌水、生理盐水、磷酸缓冲液、培养液等。另外，必要时疫苗还可含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂等。可全身或局部施用疫苗。可通过单次给药施用疫苗，或通过多次给药加强免疫。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可通过例如来自体内的方法治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，使来自体内的细胞与多肽接触，诱导APC或CTL之后，可给受试者施用细胞。也可通过在来自体内的PBMC中导入编码多肽的载体来诱导APC。在给药前可克隆在体外诱导的APC或CTL。通过克隆和培养具有较高靶细胞损害活性的细胞，可更有效地进行细胞免疫治疗。另外，按此方式分离的APC和CTL不仅可用于针对细胞所来源的个体的细胞免疫治疗，还可用于针对来自其它个体的相似类型肿瘤的细胞免疫治疗。
另外，本发明提供了用于治疗或预防细胞增殖性疾病，如癌症的药物组合物，其含有药物有效量的本发明多肽。药物组合物可用于产生抗肿瘤免疫力。CXADRL1的正常表达局限于睾丸和卵巢，GCUD1的正常表达局限于睾丸、卵巢和脑；而RNF43的正常表达局限于胎儿，更具体地为胎肺和胎肾。因此，抑制这些基因不会对其它器官有不利影响。因此，优选使用CXADRL1和GCUD1多肽治疗细胞增殖性疾病，特别是胃癌、结肠癌或肝癌；优选使用RNF43多肽治疗细胞增殖性疾病，特别是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已证实分别含有氨基酸序列SEQ ID NO：80，97和108的RNF43肽片段能诱导抗RNF43的免疫应答，因此，含有氨基酸序列SEQ ID NO：80，97或108的多肽是用于药物组合物的优选多肽的例子，所述组合物可用于治疗或预防细胞增殖性疾病，特别是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已证实分别含有氨基酸序列SEQ ID NO：124的CXADRL1肽片段能诱导抗CXADRL1的免疫应答，因此，含有氨基酸序列SEQ ID NO：124的多肽是用于药物组合物的优选多肽的例子，所述组合物可用于治疗或预防细胞增殖性疾病，特别是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已证实分别含有氨基酸序列SEQ ID NO：164的GCUD1肽片段能诱导抗GCUD1的免疫应答，因此，含有氨基酸序列SEQ ID NO：164的多肽是用于药物组合物的优选多肽的例子，所述组合物可用于治疗或预防细胞增殖性疾病，特别是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。在本发明中，以足以诱导抗-肿瘤免疫力的剂量施用多肽或其片段，所述剂量范围是0.1mg至10mg，优选为0.3mg至5mg，更优选为0.8mg至1.5mg。可以重复给药。例如，每2周可施用1mg肽或其片段4次以诱导抗-肿瘤免疫力。
提供下述实施例是为了阐明本发明，并帮助本领域技术人员制备和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的意思相同。尽管在本发明的实践或检验中可使用与本文所述类似或等同的方法和材料，但下文描述了适当的方法和材料。本文提及的任何专利、专利申请和出版物都列入本文作为参考。
实施本发明的最佳模式
通过下述实施例详细阐明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
1.材料与方法
(1)患者和组织样本
在已接受外科手术的患者知情同意的情况下，从其手术样品中获得所有胃癌和结肠癌组织以及相应的非-癌组织。
(2)全基因组cDNA微阵列
在此研究中使用含有23040个基因的来自机构内部的全基因组cDNA微阵列。从微量解剖组织中提取总RNA，用DNase I处理提取的总RNA，用Ampliscribe T7转录试剂盒(Epicentre Technologies)进行扩增，并在逆转录过程中使用Cy-染料(Amersham)进行标记(分别使用Cy5和Cy3标记得自非-癌组织和肿瘤的RNA)。然后，根据先前描述的方法(Ono et al.，Cancer Res 60：5007-11(2000))进行杂交、洗涤和检测，使用Array Vision软件(AmershamPharmacia)测定每个靶点Cy5和Cy3的荧光强度。每个点测定双份数值，减去背景信号之后，计算两个值的平均值。然后，将载玻片上的所有荧光强度归一化以调整每个载玻片上52个持家基因的平均Cy5和Cy3强度。从进一步的研究中排除Cy3和Cy5的强度皆低于25,000个荧光单位的基因，选择Cy3/Cy5信号比率＞2.0的基因进行进一步评价。
(3)细胞系
人胚肾293(HEK293)得自TaKaRa。COS7细胞、NIH3T3细胞、人宫颈癌细胞系HeLa、人胃癌细胞系MKN-1和MKN-28、人肝癌细胞系Alexander以及人结肠癌细胞系LoVo，HCT116，DLD-1和SW480皆得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。人肝癌细胞系SNU475和人结肠癌细胞系SNUC4和SNUC5得自韩国细胞系库。在适当培养基单层中培养所有细胞：COS7，NIH3T3，HEK293和Alexander使用Dulbecco改进的Eagle培养基；MKN-1，MKN-28，SNU475，SNUC4，DLD-1和SNUC5使用RPMI1640；HCT116使用McCoy’s 5A培养基；SW480使用Leibovitz’s L-15；LoVo使用HAM’s F-12；HeLa使用Eagle’s极限必需培养基(Life Technologies，GrandIsland，NY)。所有培养基中都添加有10％胎牛血清和1％抗菌/抗真菌溶液(Sigma)。人胃癌细胞系St-4由日本癌症研究所的Tsuruo博士惠赠。在添加有10％胎牛血清和1％抗菌/抗真菌溶液(Sigma)的RPMI1640单层中培养St-4细胞。
T2细胞(HLA-A*0201)和EHM(HLA-A3/3)，人B-类淋巴母细胞系由Shiku教授(Univ.Mie)惠赠。HT29(结肠癌细胞系；HLA-A24/01)，WiDR(结肠癌细胞系；HLA-A24/01)和HCT116(结肠癌细胞系；HLA-A02/01)，DLD-1(结肠癌细胞系；HLA-A24/01)，SNU475(肝细胞癌细胞系；HLA-A*0201)，MKN45(胃癌细胞系；HLA-A2阴性)，MKN74(胃癌细胞系；HLA-A2阴性)皆购自ATCC。TISI细胞(HLA-A24/24)由Takara Shuzo有限公司(Otsu，Japan)惠赠。RT-PCR检测表明CXADRL1在SNU475和MKN74中强表达。RT-PCR检测表明GCUD1在SNU475和MKN45中强表达。
(4)RNA制备和RT-PCR
根据厂商提供的方案，使用Qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)或Trizol试剂(Life Technologies)提取总RNA。使用聚dT 12-18引物(Amersham PharmaciaBiotech)与Superscript II逆转录酶(Life Technologies)，将10微克总RNA等分试样逆转录成单链cDNA。稀释每个单链cDNA制品，随后在20μl PCR缓冲液(TaKaRa)中通过标准的RT-PCR实验进行PCR扩增。在下述条件下使用GeneAmp PCR 9700系统(Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行扩增：94℃变性4分钟；接着94℃30秒，56℃30秒和72℃45秒共20(GAPDH)，35(CXADRL1)，30(GCUD1)，30(RNF43)轮循环。引物序列为：GAPDH：正向，5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQ ID NO：7)和反向，5’-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQ ID NO：8)；CXADRL1：正向，5’-AGCTGAGACATTTGTTCTCTTG(SEQ ID NO：9)和反向：5’-TATAAACCAGCTGAGTCCAGAG(SEQ ID NO：10)；GCUD 1正向：5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(SEQ ID NO：11)，反向：5’-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(SEQ ID NO：12)，RNF43正向：5’-CAGGCTTTGGACGCACAGGACTGGTAC-3’(SEQ ID NO：13)和反向：5’-CTTTGTGATCATCCTGGCTTCG GTGCT-3’(SEQ ID NO：14)。
(5)Northern-印迹分析
使人多组织印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与CXADRL1，GCUD1或RNF43经32P-标记的PCR产物杂交。根据厂商的推荐进行预-杂交，杂交和洗涤。于-80℃用增感屏对印迹进行放射自显影24至72小时。
(6)cDNA末端的5’快速扩增(5’RACE)
根据厂商说明，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)进行5’RACE实验。为了扩增CXADRL1的5’部分，使用了基因-特异性的反向引物(5’-GGTTGAGATTTAAGTTCTCAAA-3’(SEQ ID NO：15))和试剂盒提供的AP-1引物。由人睾丸mRNA(Clontech)合成cDNA模板。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR产物，并用ABI PRISM 3700 DNA测序仪(AppliedBiosystems)测定其序列。
(7)构建表达CXADRL1，GCUD1和FLJ20315的质粒
使用下述基因特异性引物套，通过RT-PCR扩增CXADRL1，GCUD1和RNF43的完整编码区：CXADRL1，5’-AGTTAAGCTTGCCGGGATGACTTCTCAGCGTTCCCCTCTGG-3’(SEQ ID NO：16)和5’-ATCTCGAGTACCAAGGACCCGGCCCGACTCTG-3’(SEQ ID NO：17)；GCUD 1，5’-GCGGATCCAGGATGGCTGCTGCAGCTCCTCCAAG-3’(SEQ ID NO：18)和5’-TAGAATTCTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3’(SEQ ID NO：19)；forRNF43，5’-TGCAGATCTGCAGCTGGTAGCATGAGTGGTG-3’(SEQ IDNO：20)和5’-GAGGAGCTGTGTGAACAGGCTGTGTGAGATGT-3’(SEQ IDNO：21)。将PCR产物克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)或pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)载体的适当克隆位点。
(8)免疫印迹
用PB S将用pcDNA3.1myc/His-CXADRL1，pcDNA3.1myc/His-GCUD1，pcDNA3.1myc/His-RNF43或pcDNA3.1myc/His-LacZ转染的细胞洗涤2次，并收集于裂解缓冲液(150mM NaCl，1％Triton X-100，50mM Tris-HCl pH7.4，1mM DTT和1×完全蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer))中。匀浆之后，以10,000×g离心细胞30分钟，通过Bradford试验(Bio-Rad)使上清液中的蛋白质浓度标准化。通过10％SDS-PAGE分离蛋白质，并用小鼠抗-myc抗体(SANTA CRUZ)进行免疫印迹。将与HRP-偶联的山羊抗-小鼠IgG(Amersham)用作ECL检测系统(Amersham)的第二抗体。
(9)免疫组化染色
用含有4％低聚甲醛的PBS将经pcDNA3.1myc/His-CXADRL1，pcDNA3.1myc/His-GCUD 1，pcDNA3.1myc/His-RNF43或pcDNA3.1myc/His-LacZ转染的细胞固定15分钟，然后，于室温(RT)下用含有0.1％Triton X-100的PBS将细胞透化2.5分钟。随后，于4℃用含2％BSA的PBS覆盖细胞24小时以阻断非特异性杂交。将1∶1000稀释的小鼠抗-myc单克隆抗体(Sigma)用作第一抗体，在同与罗丹明-偶联的抗-小鼠第二抗体(Leinco和ICN)保温之后观察反应。用4’，6’-二脒-2’-苯基吲哚二盐酸化物(DAPI)复染细胞核。在ECLIPSE E800显微镜下获得荧光图像。
(10)集落形成试验
将被表达每种基因的质粒或对照质粒转染的细胞与适当浓度的遗传霉素一起保温10至21天。用100％甲醇固定细胞并通过Giemsa溶液染色。所有实验都进行三份。
(11)建立过表达CXADRL1或RNF43的细胞
在含有适当浓度遗传霉素的培养基中维持分别被pcDNA3.1myc/His-CXADRL1，pcDNA3.1myc/His-RNF43，pcDNA3.1myc/His-LacZ或对照质粒转染的NIH3T3，COS7和LoVo细胞。转染2周后，选择存活的单个集落，通过半定量RT-PCR检查每种基因的表达。
(12)检查反义寡核苷酸对细胞生长的作用
使用LIPOFECTIN试剂(GIBCO BRL)，用质粒或者CXADRL1，GCUD1或RNF43的合成S-寡核苷酸转染铺于10-cm平皿上的细胞(2×105个细胞/皿)。然后在添加有适当浓度遗传霉素的培养基中培养6至12天。然后，用100％甲醇固定细胞并用Giemsa溶液染色。S-寡核苷酸的序列如下：
CXADRL1-S4，5’-TCTGCACGGTGAGTAG-3’(SEQ ID NO：22)；
CXADRL1-AS4，5’-CTACTCACCGTGCAGA-3’(SEQ ID NO：23)；
CXADRL1-S5，5’-TTCTGTAGGTGTTGCA-3’SEQ ID NO：24)；
CXADRL1-AS5，5’-TGCAACACCTACAGAA-3’(SEQ ID NO：25)；
GCUD1-S5，5’-CTTTTCAGGATGGCTG-3’(SEQ ID NO：26)；
GCUD1-AS5，5’-CAGCCATCCTGAAAAG-3’(SEQ ID NO：27)；
GCUD1-S8，5’-AGGTTGAGGTAAGCCG-3’(SEQ ID NO：28)；
GCUD1-AS8，5’-CGGCTTACCTCAACCT-3’(SEQ ID NO：29)；
RNF43-S1，5’-TGGTAGCATGAGTGGT-3’(SEQ ID NO；30)；和
RNF43-AS1，5’-ACCACTCATGCTACCA-3’(SEQ ID NO：31)。
(13)3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)试验
用指定用于抑制CXADRL1，GCUD1或RNF43的有义或反义S-寡核苷酸转染三份以5×105个细胞/皿的密度铺于100mm平皿的细胞。转染72小时之后，用含有500μg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)(Sigma)的新鲜培养基更换培养基，将平板置于37℃保温4小时。然后，加入1ml 0.01N HCl/10％SDS以裂解细胞。用ELISA平板读数器，在570nm的检测波长下(参比波长为630nm)测定裂解液的吸光度。用与对照相比而言的吸光度描述细胞生存力。
(14)构建psiH1BX3.0
由于据报道H1RNA基因由RNA聚合酶III转录，所述酶可在3’末端产生具有尿苷的短转录物，因此，使用一套引物5’-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3’[SEQ ID NO：32]和5’-CCAAAGGG TTTCTGCAGTTTCA-3’[SEQID NO：33]，以人胎盘DNA作为模板，通过PCR扩增含有其启动子区域的H1RNA基因的基因组片段。纯化产物，根据厂商提供的方案使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将产物克隆至pCR2.0质粒载体。纯化含有H1RNA基因的BamHI-XhoI片段，将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒的第1257至56位核苷酸，使用一套引物5’-TGCGGA TCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’(SEQ IDNO：34)和5’-CTCTATCT CGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’(SEQ ID NO：35)，通过PCR扩增质粒，然后用BamHI和XhoI消化。将连接的DNA用作PCR模板，PCR引物是5’-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3’(SEQ ID NO：36)和5’-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO：37)。用HindIII消化产物，随后自身连接以产生psiH1BX3.0载体质粒。通过将双链寡核苷酸5’-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3’(SEQ ID NO：38)和5’-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTG CTTC-3’(SEQ ID NO：39)克隆至psiH1BX载体的BbsI位点，制备出psiH1BX-EGFP以用作对照。
(15)检查RNF43-或CXADRL1-siRNA的基因沉默作用
通过将双链寡核苷酸克隆至psiH1BX3.0载体，制备出表达RNF43-siRNA或CXADRL1-siRNA的质粒。用作RNF43 siRNA的寡核苷酸是：siRNA16-4，5’-TCCCGTCACCGGATCCAACTCAGTTCAAGAGACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3’(SEQ ID NO：40)和5’-AAAAGTCACCGGATCCAACTCAGTCTCTTGAACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3’(SEQ ID NO：41)；siRNA1834，5’-TCCCGCTATTGCACAGAACGCAGTTCAAGAGACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3’(SEQ ID NO：42)和5’-AAAAGCTATTGCACAGAACGCAGTCTCTTGAACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3’(SEQ ID NO：43)；siRNA1，5’-TCCCCAGAAAGCTGTTATCAGAGTTCAAGAGACTCTGATAACAGCTTTCTG-3’(SEQ ID NO：44)和5’-AAAACAGAAAGCTGTTATCAGAGTCTCTTGAACTCTGATAACAGCTTTCTG-3’(SEQ ID NO：45)；siRNA14，5’-TCCCTGAGCCACCTCCAATCCACTTCAAGAGAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3’(SEQ ID NO：46)和5’-AAAATGAGCCACCTCCAATCCACTCTCTTGAAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3’(SEQ ID NO：47)；siRNA15，5’-TCCCCTGCACGGACATCAGCCTATTCAAGAGATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3’(SEQ ID NO：48)和5’-AAAACTGCACGGACATCAGCCTATCTCTTGAATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3’(SEQ ID NO：49)。用作CXADRL1-siRNA的寡核苷酸是：siRNA#1，5’-TCCCGTGTCAGAGAGCCCTGGGATTCAAGAGATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3’(SEQ ID NO：50)和5’-AAAAGTGTCAGAGAGCCCTGGGATCTCTTGAATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3’(SEQ ID NO：51)；siRNA#2，5’-TCCCCCTCAATGTCATTTGGATGTTCAAGAGACATCCAAATGCAATTGAGG-3’(SEQ ID NO：52)和5’-AAAACCTCAATGTCATTTGGATGTCTCTTGAACATCCAAATGCAATTGAGG-3’(SEQ ID NO：53)；siRNA#3，5’-TCCCTGTCATTTGGATGGTCACTTTCAAGAGAAGTGACCATCCAAATGACA-3’(SEQ ID NO：54)和5’-AAAATGTCATTTGGATGGTCACTTCTCTTGAAAGTGACCATCCAAATGACA-3’(SEQ ID NO：55)；siRNA#4，5’-TCCCTGCCAACCAACCTGAACAGTTCAAGAGACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3’(SEQ ID NO：56)和5’-AAAATGCCAACCAACCTGAACAGTCTCTTGAACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3’(SEQ ID NO：57)；siRNA#5，5’-TCCCCCAACCTGAACAGGTCATCTTCAAGAGAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3’(SEQ ID NO：58)和5’-AAAACCAACCTGAACAGGTCATCTCTCTTGAAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3’(SEQ ID NO：59)；siRNA#6，5’-TCCCCCTGAACAGGTCATCCTGTTTCAAGAGAACAGGATGACCTGTTCAGG-3’(SEQ ID NO：60)和5’-AAAACCTGAACAGGTCATCCTGTTCTCTTGAAACAGGATGACCTGTTCAGG-3’(SEQ ID NO：61)；以及CXADRL-siRNA#7，5’-TCCCCAGGTCATCCTGTATCAGGTTCAAGAGACCTGATACAGGATGACCTG-3’(SEQ IDNO：62)和5’-AAAACAGGTCATCCTGTATCAGGTCTCTTGAACCTGATACAGGATGACCTG-3’(SEQ ID NO：63)。根据厂商推荐的方法，使用FuGENE6试剂(Roche)将psiH1BX-RNF43，psiH1BX-CXADRL1或psiH1BX-mock质粒转染至SNUC4或St-4细胞。转染48小时之后，从细胞中提取总RNA。
(16)构建RNF43蛋白重组的氨基-和羧基-末端区域
使用下述引物套，通过RT-PCR扩增RNF43的氨基-和羧基-末端区域：5’-GAAGATCTGCAGCGGTGGAGTCTGAAAG-3’(SEQ ID NO：64)和5’-GGAATTCGGACTGGGAAAATGAATCTCCCTC-3’(SEQ ID NO：65)(氨基-末端区域)；以及5’-GGAGATCTCCTGATCAGCAAGTCACC-3’(SEQ IDNO：66)和5’-GGAATTCCACAGCCTGTTCACACAGCTCCTC-3’(SEQ IDNO：67)(羧基-末端区域)。用BamHI-EcoRI消化产物，克隆至pET-43.1a(+)载体(Novagen)的BamHI-EcoRI位点。将质粒转染至大肠杆菌BL21trxB(DE3)pLysS细胞。加入0.2mM IPTG之后，从在25℃培养16小时的细胞中提取重组RNF43蛋白。
(17)酵母双-杂合实验
根据厂商提供的方案，使用MATCHMAKER GAL4双杂合系统3(Clontech)进行酵母双-杂合试验。将RNF43完整的编码序列克隆至pAS2-1载体的EcoRI-BamHI位点以作为饵，用以筛选人-睾丸cDNA文库(Clontech)。为了进一步证实酵母中的相互作用，将pAS2-RNF43用作诱饵载体，将pACT2-NOTCH2和pACT2-STRIN用作捕获载体。
我们将CXADRL1的胞质区克隆至pAS2-1载体的EcoRI位点以作为饵，用以筛选人睾丸cDNA文库(Clontech)。为了进一步证实酵母中的相互作用，我们将pAS2-CXADRL1用作诱饵载体，将pACT2-AIP1用作捕获载体。
(18)制备CXADRL特异性抗体
通过用包含密码子235-276(Ab-1)，493-537(Ab-2)或70-111(Ab-3)的CXADRL合成肽进行免疫，制备出抗-CXADRL抗血清。使用在被pET-CXADRL质粒转染的大肠杆菌中制备的经His-标记的重组CXADRL1蛋白纯化血清。通过10％SDS-PAGE进一步分离从表达经Flag标记的CXADRL1的细胞中提取的蛋白质，并用抗-CXADRL1血清或抗-Flag抗体进行免疫印迹。分别将与HRP-偶联的山羊抗-兔IgG或与HRP-偶联的绵羊抗-小鼠IgG抗体用作ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的第二抗体。抗-CXADRL1抗血清的免疫印迹显示出50kD经FLAG-标记的CXADRL1带，其模式与用抗-FLAG抗体检测到的相同。
(19)制备重组GCUD1蛋白
为了产生特异于GCUD1的抗体，需制备重组GCUD1蛋白。使用下述引物套，通过RT-PCR扩增GCUD1的完整编码区：5’-GCGGATCCAGGATGGCTGCAGCTCCTCCAAG-3’(SEQ ID NO：68)和5’-CTGAATTCACTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3’(SEQ ID NO：69)。纯化产物，用BamH1和EcoR1消化，克隆至pGEX6P-2的适当克隆位点。将所得质粒称为pGEX-GCUD1。将pGEX-GCUD1质粒转化至大肠杆菌DH10B。通过加入IPTG诱导重组蛋白质的产生，根据厂商提供的方法，用GlutathioneSepharoseTM4B(Amersham Pharmacia)纯化蛋白质。
(20)制备GCUD1特异性抗体
抗GCUD1的多克隆抗体纯化自血清。通过10％SDS-PAGE进一步分离用表达经Flag标记的GCUD1的质粒转染的细胞中的蛋白质，并用抗-GCUD1或抗-Flag抗体进行免疫印迹。分别将与HRP-偶联的山羊抗-兔IgG(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)或与HRP-偶联的抗-Flag抗体用作ECL检测系统(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的第二抗体。抗-GCUD1抗体的免疫印迹显示出47kD经FLAG-标记的GCUD1带，其模式与用抗-FLAG抗体检测到的相同。
(21)统计学分析
对数据进行差异分析(ANOVA)和
Figure G2009101651634D00521
F试验。
(22)制备肽
借助于结合预测软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)预测能与HLA-A24或HLA-A*0201分子结合的RNF43，CXADRL1或GCUD19聚体和10聚体肽。根据标准的固相合成法，通过Mimotopes，San Diego，LA合成这些肽，并通过反相HPLC进行纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析测定肽的纯度(＞90％)和同一性。以20mg/ml的浓度将肽溶解于二甲基亚砜(DMSO)，并储存于-80℃。
(23)体外CTL诱导
将衍生自单核细胞的树状细胞(DC)用作抗原呈递细胞(APC)以诱导针对HLA上呈递的肽的CTL应答。按文献所述在体外产生DC(Nukaya et al.，Int J Cancer 80：92-7(1999)；Tsai et al.，J Immunol 158：1796-802(1997))。具体地说，使用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液从具有HLA-A*0201或HLA-A24的健康志愿者体内分离外周血单核细胞(PBMC)，通过粘附于塑料组织培养瓶(Becton Dickinson)分离出PBMC的单核细胞组分。在含有2％热-灭活的自身血清(AS)、1000U/ml GM-CSF(由Kirin Brewery公司提供)和1000U/mlIL-4(Genzyme)的AIM-V培养基(Invitrogen)中将所述单核细胞组分培养7天以获得DC组分。于20℃，在AIM-V中，在3μg/ml β2-微球蛋白的存在下将20μg/ml候选肽脉冲至富含DC的细胞群体上达4小时。然后，照射(5500拉德)这些经肽脉冲的抗原呈递细胞，并以1∶20的比例与自身CD8+T细胞混合，所述T细胞是通过用Dynabeads M-450 CD8(Dynal)和Detachabead(Dynal)进行阳性选择而获得的。在48-孔培养板(Corning)中建立这些培养物，在每孔0.5ml含有2％AS的AIM-V中含有1.5×104个经肽脉冲的抗原呈递细胞，3×105个CD8+T细胞和10ng/mlIL-7(Genzyme)。3天后，在这些培养物中添加IL-2(CHIRON)至终浓度为20IU/ml。在第7和14天，使用每次皆按照与上述相同的方法制备的经自身肽-脉冲的抗原呈递细胞重新刺激T细胞。第21天，收集培养物中的淋巴细胞并检测其针对经肽-脉冲的TISI或T2细胞的细胞毒性。
(24)CTL扩展(expansion)
使用与Riddell等所述的方法(Walter et al.，N Engl J Med 333：1038-1044，1995；Riddel et al.，Nature Med.2：216-223，1996)类似的方法，在培养物中进一步扩展经培养的淋巴细胞，已证实所述细胞对经肽-脉冲的TISI或T2细胞具有显著的细胞毒性。将5×104个淋巴细胞重新悬浮于25ml添加有5％AS的AIM-V中，其中还含有25×106个经照射(3300拉德)的PBMC，5×106个经照射(8000拉德)的EHM细胞和40ng/ml抗-CD3单克隆抗体(Pharmingen)。培养1天后，在培养物中加入120IU/ml IL-2。在第5，8和11天，培养物包含新鲜的AIM-V，其中添加有5％AS和30IU/ml IL-2。
(25)建立CTL克隆
使用一些具有强细胞毒性的淋巴细胞获得CTL克隆。在96孔圆底微滴板(Nalge Nunc International)中，将细胞悬浮液稀释成密度为0.3，1和3CTL/淋巴细胞/孔。在150μl/孔添加有5％AS的AIM-V中培养这些细胞，所述培养基中含有7×104个细胞/孔的同种异体PBMC，1×104个细胞/孔的EHM，30ng/ml抗-CD3抗体和125U/ml IL-2。10天后，在培养基中加入50μl/孔IL-2至终浓度为125U/ml。第14天，检测经培养CTL的细胞毒活性，使用与上述相同的方法扩展CTL克隆。
(26)细胞毒性试验
于37℃，在CO2温箱中用100μCi Na2 51CrO4(Perkin Elmer Life Sciences)将靶细胞标记1小时。当使用经肽脉冲的靶时，在用Na2 51CrO4标记前，于37℃加入20μg/ml肽与靶细胞一起保温16小时。冲洗靶细胞，在圆底微滴板中与效应细胞混合至终体积为0.2ml。离心微滴板(4分钟，800×g)以增加细胞与细胞的接触，并置于37℃的CO2温箱中。保温4小时之后，从每个孔中收集0.1ml上清液，用γ计数器测定其放射性。当评价针对内源性表达RNF43或CXADRL1或GCUD1的靶细胞的细胞毒性时，在过量30倍的未标记K562细胞的存在下检测细胞裂解活性，K562的存在是为了降低任何由NK-样效应细胞引起的非-特异性裂解。通过未标记靶的抑制试验进一步证实抗原特异性，所述试验利用被肽脉冲(20μg/ml，16小时，37℃)的未标记TISI或T2细胞以竞争经51Cr-标记的HT29或SNU475细胞的识别。通过阻断试验检查MHC限制，测定抗HLA-I类(W6/32)抗体和抗HLA-II类抗体，抗CD4抗体和抗CD8抗体(DAKO)对细胞毒性的抑制作用。
通过用下述公式计算特异性51Cr-释放的百分比以测定特异性细胞毒性的百分比：{(受试样品释放的cpm-自发释放的cpm)/(最大释放的cpm-自发释放的cpm)}×100。通过在缺乏效应细胞时仅保温靶细胞来测定自发释放，通过使靶与1N HCl保温获得最大释放。所有决定因子都测两份，平均值的标准误差始终低于平均值的10％。
2.结果
(1)鉴定两个常在胃癌中被上调的新的人基因CXADRL1和GCUD1
利用含有23040个基因的全基因组cDNA微阵列，将20例胃癌的表达分布图与相应的非癌粘膜相比较。由微阵列分析检测到的常被上调的基因中，对应于UniGene簇的EST，Hs.6658(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/UniGene/)、机构内部登录号为A5928的基因在4.09至48.60的范围内过表达(图1a)。由于该基因的开放阅读框编码的蛋白质与CXADR(柯萨奇病毒和腺病毒受体)的同一性约为37％。因此，将该基因命名为CXADRL1(柯萨奇病毒和腺病毒受体样1)。CXADRL1也在6例结肠癌的6例中和20例HCC的12例中被上调。另外，通过微阵列我们还注意到对应于UniGene簇的KIAA0913基因产物(Hs.75137)、机构内部登录号为C8121的基因，与相应的非-癌胃粘膜相比，所述基因在12个胃癌组织的9个中有显著增强的表达(图1b)。将机构内部登录号为C8121的基因称为GCUD1(在胃癌中被上调)。GCUD1也在6例结肠癌中的5例，6例HCC中的1例，14例肺癌(鳞状细胞细胞癌)中的1例，13例睾丸精原细胞瘤中的1例中被上调。为了阐明cDNA微阵列的结果，通过半定量RT-PCR检查这些转录物在胃癌中的表达，以证实CXADRL1在所有10个肿瘤中的表达增加(图1c)，GCUD1在9例癌症中的7例中表达提高(图1d)。
(2)新基因CXADRL1的分离和结构
使用CXADRL1 PCR产物作为探针的多-组织Northern-印迹分析揭示出3.5-kb转录物在睾丸和卵巢中的表达(图2a)。由于A5928小于在Northern印迹上检测到的基因，进行5’RACE实验以测定CXADRL1基因的完整编码序列。推定的全长cDNA由3423个核苷酸组成，其中1296个核苷酸长的开放阅读框(SEQ ID NO：1)编码431个氨基酸长的蛋白质(SEQ IDNO：2)(GenBank登录号：AB071618)。第一个ATG的侧翼序列为(CCCGGGATGA)(SEQ ID NO：70)，这与真核生物中起始翻译所用的共有序列一致，其上游具有框内终止密码子。使用BLAST程序在NCBI(国立生物技术信息中心)数据库中进行同源性检索，鉴定出GenBank登录号为AC068984的基因组序列，该序列被定位于染色体带3q13。将该cDNA与基因组序列相比较，揭示出CXADRL1由7个外显子组成(图2b)。
用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)检索蛋白质基元，结果表明推测的蛋白质含有2个免疫球蛋白结构域(密码子29-124和158-232)和一个跨膜结构域(密码子246-268)，暗示CXADRL1可能属于免疫球蛋白超家族。
(3)CXADRL1对细胞生长的作用
通过用表达CXADRL1的质粒(pcDNA3.1myc/His-CXADRL1)转染NIH3T3细胞以进行集落-形成试验。与被模拟载体转染的细胞相比，被pcDNA3.1myc/His-CXADRL1转染的细胞产生显著更多的集落(图3a)。为了进一步研究CXADRL1的生长-促进作用，建立了稳定表达外源性CXADRL1的NIH3T3细胞(图3b)。在含有10％FBS的培养基中，NIH3T3-CXADRL1细胞的生长速度显著高于亲代NIH3T3细胞(图3c)。
(4)通过反义S-寡核苷酸抑制CXADRL1在人胃癌细胞中的表达
将6对对应于CXADRL1的对照和反义S-寡核苷酸转染至MKN-1胃癌细胞，在被检查的6个胃癌细胞系中，MKN-1显示出最高水平的CXADRL1表达。转染6天后，通过MTT试验测定转染细胞的生存力。被反义S-寡核苷酸(CXADRL1-AS4或-AS5)转染的存活细胞显著少于被对照S-寡核苷酸(CXADRL1-S4或-S5)转染的存活细胞(图4)。在三个独立的实验中获得了一致的结果。
(5)表达CXADRL1 siRNA的质粒的构建及其对胃癌细胞生长的作用
构建表达多种CXADRL1-siRNA的质粒，并检查其对CXADRL1表达的作用。在构建的siRNA中，psiH1BX-CXADRL7能显著抑制CXADRL1在St-4细胞中的表达(图5A)。为了检测抑制CXADRL1是否能导致结肠癌细胞的生长抑制，用psiH1BX-CXADRL7或模拟载体转染St-4细胞。用psiH1BX-CXADRL7转染的存活细胞数目少于存活的对照细胞数目(图5B和5C)。
(6)制备抗-CXADRL1抗体
为了检查CXADRL1的表达并研究其功能，制备了抗CXADRL1的抗血清。用抗-CXADRL1进行的免疫印迹检测到50kD经FLAG-标记的CXADRL1带，这与用抗-FLAG抗体检测到的大小几乎相同(图6)。
(7)通过酵母双-杂合筛选系统鉴定CXADRL1-相互作用蛋白
为了阐明CXADRL1的功能，我们使用酵母双-杂合筛选系统搜索CXADRL1-相互作用蛋白。在鉴定出的阳性克隆中，通过同时用pAS2.1-CXADRL1和pACT2-AIP1转化酵母细胞而使核AIP1(atrophin相互作用蛋白1)的C-末端区域与CXADRL1相互作用(图7)。阳性克隆含有密码子808至1008，AIP1中负责相互作用的区域就位于该区域内。
(8)推测衍生自CXADRL1的候选肽
表1以高结合亲和性的次序显示出候选肽(SEQ ID NO：115-154)。总共选择和检查了下述40个肽。
表1  推测衍生自CXADRL1的候选肽
HLA-A*0201 9聚体        HLA-A*0201 10聚体
Figure G2009101651634D00571
(9)使用候选肽刺激T细胞并建立CTL克隆
按照“材料和方法”中所述的方法，使用这些衍生自CXADRL1的候选肽培养淋巴细胞。扩展所获得的显示出可测细胞毒活性的淋巴细胞，并建立CTL克隆。使用有限稀释法由上述CTL系增殖CTL克隆。与未经任何肽脉冲的靶相比，用CXADRL1-207(ALSSGLYQC)(SEQ ID NO：124)诱导的CTL克隆对经肽脉冲的靶显示出较高的细胞毒活性。图8显示了该CTL克隆的细胞毒活性。该CTL克隆对经肽脉冲的靶显示出很强的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的靶未显示出任何细胞毒活性。
(10)针对内源性表达CXADRL1以作为靶的肿瘤细胞系的细胞毒活性
检查针对推测肽产生的CTL克隆识别并杀死内源性表达CXADRL1的肿瘤细胞的能力。图9显示出针对CXADRL1-207(ALSSGLYQC)(SEQ IDNO：124)产生的CTL克隆75的结果。CTL克隆75对表达CXADRL1和HLA-A*0201的SNU475显示出强有力的细胞毒活性，然而对表达CXADRL1但不表达HLA-A*0201的MKN74，以及表达HLA-A*0201但不表达CXADRL1的SNU-C4却未显示出细胞毒活性。
(11)已建立的CTL的特异性
进行未标记靶的抑制试验以进一步证实CXADRL1-207 CTL克隆的特异性。将经51Cr标记的SNU475细胞用作经标记靶，而将用CXADRL1-207(SEQ ID NO：124)脉冲的未经51Cr标记的T2细胞用作未标记靶。当在试验中以多个比例加入用CXADRL1-207(SEQ ID NO：124)脉冲的T2时，针对SNU475细胞的特异性细胞裂解被显著抑制(图10)。以E/T＝20的比例将这些结果表示为特异性裂解的百分比。
关于CXADRL1-207 CTL克隆，为了检查这些CTL克隆的特征，检测了抗HLA-I类，HLA-II类，CD4和CD8的抗体抑制细胞毒活性的能力。当使用抗-HLA-I类抗体和抗-CD8抗体时，CTL克隆对SNU475细胞的细胞毒性受到显著抑制(图11)，这表明CTL克隆以HLA-I类和CD8方式识别衍生自CXADRL1的肽。
(12)表达和鉴定新的人基因GCUD1
使用GCUD1 cDNA作为探针进行多-组织Northern印迹分析，结果显示出5.0-kb转录物在睾丸、卵巢和脑中特异性表达(图12)。尽管与GCUD1相对应的KIAA0913的核苷酸序列(GenBank登录号：XM-014766)由4987个核苷酸组成，使用睾丸、卵巢和癌症组织的RT-PCR实验揭示出由由4987个核苷酸组成的转录物含有1245个核苷酸长的开放阅读框(SEQID NO：3)(GenBank登录号：AB071705)。另外，在基因组数据库中检索对应于GUCD1的基因组序列以寻找出定位于染色体带7p14的草图序列(GenBank登录号：NT-007819)。将cDNA序列与基因组序列相比较，揭示出GUCD1基因由8个外显子组成。
(13)GCUD1的亚细胞定位
将对应于GCUD1的完整编码区克隆至pCDNA3.1myc/His载体，将构建体瞬时转染至COS7细胞。COS7细胞的免疫细胞化学染色揭示出经标记的GCUD1蛋白存在于胞质中(图13)。
(14)GCUD1对细胞生长的作用
为了分析GCUD1对细胞生长的作用，通过用表达GCUD1的质粒(pcDNA3.1myc/His-GCUD1)转染NIH3T3细胞来进行集落-形成试验。与对照质粒(pcDNA3.1myc/His-LacZ)相比，pcDNA3.1myc/His-GCUD1能在NIH3T3细胞中诱导明显更多的集落(图14)。通过三个独立的实验进一步证实了该结果。
(15)通过指定用于减少GCUD1表达的反义S-寡核苷酸抑制胃癌细胞 的生长
为了检测抑制GCUD1是否能导致胃癌细胞死亡，合成了多个被设计用于抑制GCUD1表达的反义S-寡核苷酸。用各个反义S-寡核苷酸转染6天后，通过MTT试验测定转染细胞的生存力。在MKN-28细胞中，被反义S-寡核苷酸(GCUD1-AS5或-AS8)转染的存活细胞显著少于被对照S-寡核苷酸(GCUD1-S5或-S8)转染的存活细胞(图15)。通过三个独立的实验进一步证实该结果。用MKN-1细胞观察到类似的结果。
(16)制备抗-GCUD1抗体
为了检查GCUD1的表达并研究其功能，制备了抗GCUD1的抗血清。重组GCUD1蛋白提取和纯化自表达GST-GCUD1融合蛋白的细菌细胞(图16)。用重组蛋白质免疫三只兔。用抗-GCUD1血清而不是预免疫血清进行的免疫印迹显示出47kD经FLAG-标记的GCUD1带，这与用抗-FLAG抗体检测到的大小几乎相同(图17)。
(17)推测衍生自GCUD1的候选肽
表2(GCUD1)以高结合亲和性的次序显示出候选肽(SEQ ID NO：155-194)。总共选择和检查了下述40个肽。
表.2推测衍生自GCUD1的候选肽
HLA-A*0201 9聚体            HLA-A*0201 10聚体
Figure G2009101651634D00601
(18)使用候选肽刺激T细胞并建立CTL克隆
按照“材料和方法”中所述的方法，使用这些衍生自GCUD1的候选肽培养淋巴细胞。扩展所获得的显示出可测细胞毒活性的淋巴细胞，并建立CTL克隆。使用有限稀释法由上述CTL系增殖CTL克隆。与未经任何肽脉冲的靶相比，用GCUD1-196(KMDAEHPEL)(SEQ ID NO：164)和GCUD1-272(FLTTASGVSV)(SEQ ID NO：177)诱导的CTL克隆对经肽脉冲的靶显示出较高的细胞毒活性。图18显示了这些CTL克隆的细胞毒活性。每个CTL克隆对经肽脉冲的靶显示出很强的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的靶未显示出任何细胞毒活性。
(19)针对内源性表达GCUD1以作为靶的肿瘤细胞系的细胞毒活性
检查针对推测肽产生的CTL克隆识别并杀死内源性表达GCUD1的肿瘤细胞的能力。图19显示出针对GCUD1-196(SEQ ID NO：164)产生的CTL克隆23的结果。CTL克隆23对表达GCUD1和HLA-A*0201的SNU475显示出强有力的细胞毒活性，然而对表达GCUD1但不表达HLA-A*0201的MKN45却未显示出细胞毒活性。
(20)已建立的CTL的特异性
进行未标记靶的抑制试验以进一步证实GCUD1-196 CTL克隆的特异性。将经51Cr标记的SNU475细胞用作经标记靶，而将用GCUD1-196脉冲的未经51Cr标记的T2细胞用作未标记靶。当在试验中以多个比例加入用GCUD1-196(SEQ ID NO：164)脉冲的T2时，针对SNU475细胞的特异性细胞裂解被显著抑制(图20)。以E/T＝20的比例将这些结果表示为特异性裂解的百分比。
关于GCUD1-196(SEQ ID NO：164)CTL克隆，为了检查这些CTL克隆的特征，检测了抗HLA-I类，HLA-II类，CD4和CD8的抗体抑制细胞毒活性的能力。当使用抗-HLA-I类抗体和抗-CD8抗体时，CTL克隆对SNU475细胞的细胞毒性受到显著抑制(图21)，这表明CTL克隆以HLA-I类和CD8方式识别衍生自GCUD1的肽。
(21)鉴定在人结肠癌中常被上调的基因FLJ20315
使用含有23040个基因的cDNA微阵列将11个结肠癌组织的表达分布图与相应的结肠非癌粘膜组织相比较。根据此分析，多个基因在癌症组织中的表达水平经常比相应的非癌组织中的高。其中，与相应的非癌粘膜相比，对应于UniGene簇的EST(FLJ20315)，Hs.18457(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/UniGene/)、机构内部登录号为B4469的基因在癌症组织中以1.44至11.22的放大范围被上调(图22a)。FLJ20315也在18例胃癌中的6例，20例HCC中的12例，22例肺癌(腺癌)中的11例，2例睾丸精原细胞瘤中的2例和9例前列腺癌中的3例中被上调。为了阐明微阵列的结果，通过半定量RT-PCR检查这些转录物在其它结肠癌样品中的表达，以进一步证实18例肿瘤中的15例中FLJ20315表达的增加(图22b)。
(22)RNF43的表达和结构
使用国立生物技术信息中心的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，在公共数据库中对FLJ20315序列进行额外的同源性检索，鉴定出包括XM_097063，BF817142的EST，以及被定位于染色体带17pter-p13.1的基因组序列(GenBank登录号为NT-010651)。结果，获得5345个核苷酸长的装配序列，其中含有2352个核苷酸长的开放阅读框(SEQ ID NO：5)，其编码783个氨基酸长的蛋白质(SEQ ID NO：6)(GenBank登录号：AB081837)。将该基因称为RNF43(环指蛋白43)。第一个ATG的侧翼序列为(AGCATGC)，这与真核生物中起始翻译所用的共有序列一致，其上游具有框内终止密码子。将该cDNA与基因组序列相比较，揭示出该基因由11个外显子组成。使用以RNF43的PCR产物为探针的成人多-组织Northern-印迹进行的Northern-印迹分析未检测到任何带(数据未显示)。然而，使用以相同PCR产物为探针的人胎组织Northern-印迹在胎肺和胎肾中检测到5.2kb-转录物的表达(图23a)。用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)检索蛋白质基元，揭示出推测的蛋白质含有环指基元(密码子272-312)(图23b)。
(23)经myc-标记的RNF43蛋白的亚细胞定位
为了研究RNF43蛋白的亚细胞定位，将表达经myc-标记的RNF43蛋白的质粒(pDNAmyc/His-RNF43)瞬时转染至COS7细胞。使用细胞提取物和抗-myc抗体的Western印迹分析揭示出对应于经标记蛋白质的85.5-Kda带(图24a)。随后用相同抗体对细胞进行免疫组化染色，结果表明蛋白质主要存在于细胞核中(图24b)。在SW480人结肠癌细胞中观察到类似的RNF43亚细胞定位。
(24)RNF43对细胞生长的作用
通过用表达RNF43的质粒(pcDNA-RNF43)转染NIH3T3细胞以进行集落-形成试验。与对照细胞相比，被pcDNA-RNF43转染的细胞产生显著更多的集落(图25a)。在RNF43的内源性表达很低的SW480细胞中也显示出由RNF43导致的增加的集落形成活性(数据未显示)。为了进一步研究该生长-促进作用，建立了稳定表达外源性RNF43的COS7细胞(COS7-RNF43)(图25b)。在含有10％FBS的培养基中，COS7-RNF43细胞的生长速度显著高于COS7-模拟细胞(图25c)。
(25)：通过指定用于降低RNF43表达的反义S-寡核苷酸抑制结肠癌细 胞生长
为了检测抑制RNF43表达是否能导致结肠癌细胞的生长阻滞和/或细胞死亡，合成了5对对应于RNF43的对照和反义S-寡核苷酸，并将它们转染至LoVo结肠癌细胞，在被检查的11个结肠癌细胞系中，LoVo细胞显示出较高水平的RNF43表达。转染12小时后，与对照S-寡核苷酸(RNF43-S1)相比，5个反义S-寡核苷酸中的RNF43-AS1能显著抑制RNF43表达(图26a)。转染6天后，被RNF43-AS1转染的存活细胞数目显著少于被RNF43-S1转染的存活细胞数目，暗示着抑制RNF43表达能抑制转染细胞的生长和/或存活(图26b)。在三个独立的实验中获得一致的结果。
(26)表达RNF43 siRNA的质粒的构建及其对结肠癌细胞生长的作用
最近已证实在哺乳动物细胞中，短的干扰RNA(siRNA)具有基因特异性的基因沉默作用，而不会诱导基因表达的全面改变，所述siRNA由具有19个互补核苷酸和3’末端互补的胸苷或尿苷二聚体的20至21聚体双链RNA(dsRNA)组成。因此，本发明人构建了表达多种RNF43-siRNA的质粒，并检查了它们对RNF43表达的作用。在多种RNF43-siRNA中，psiH1BX-RNF16-4和psiH1BX-RNF1834能显著抑制SNUC4细胞中的RNF43表达(图27A)。为了检测抑制RNF43是否能导致结肠癌细胞的生长受抑制，用psiH1BX-RNF16-4，psiH1BX-RNF1834或模拟载体转染SNUC4细胞。与反义S-寡核苷酸的数据一致，被psiH1BX-RNF16-4或psiH1BX-RNF1834转染的存活细胞数目少于存活的对照细胞数目(图27B，27C)。
(27)经Flag-标记的RNF43蛋白在具有经Flag-标记的外源性RNF43蛋 白的COS7细胞的培养基中的分泌
由于使用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http:// smart.embl-heidelberg.de)检索具有RNF43氨基酸序列的蛋白质基元推测出信号肽和环指结构域，因此检查了RNF43蛋白的分泌情况。将表达经Flag-标记的RNF43(pFLAG-RNF43)或经Myc-标记的RNF43(pcDNA3.1-Myc/His-RNF43)的质粒或模拟载体转染至COS7细胞，在添加有0.5％胎牛血清的培养基中培养细胞48小时。用抗-Flag抗体或抗-Myc抗体进行Western印迹分析，分别在含有被pFLAG-RNF43或pcDNA3.1-Myc/His-RNF43转染的细胞的培养基，而不是含有被模拟载体转染的细胞的培养基中检测出分泌的经Flag-标记的RNF43或经Myc-标记的蛋白质(图28A和28B)。
(28)被pFLAG-RNF43转染的细胞的培养基对NIH3T3细胞的作用
由于RNF43的外源性表达对NIH3T3细胞有生长促进作用，因此，检查了分泌的经Flag-标记的RNF43是否也对NIH3T3细胞有增殖作用。不更换培养基，或用被模拟载体转染的细胞的条件培养基，或用被pFlag-RNF43转染的细胞的条件培养基培养NIH3T3细胞。正如所期望的那样，与在条件培养基中培养的未经处理的细胞或被模拟载体转染的细胞相比，在条件培养基中培养的被pFlag-RNF43或pcDNA3.1-Myc/His-RNF43转染的细胞显示出显著较高的生长速度(图29A和29B)。这些数据表明RNF43可以自泌的方式发挥其生长促进作用。
(29)制备重组氨基-和羧基-末端RNF43蛋白
为了产生抗RNF43的特异性抗体，构建了表达经Nus-标记的RNF43蛋白的质粒(图30A)。将质粒转化至大肠杆菌BL21trxB(DE3)pLysS细胞，通过SDS-PAGE观察到细菌提取物中具有预期大小的重组蛋白质的产生(图30B和30C)。
(30)通过酵母双杂合筛选系统鉴定RNF43-相互作用蛋白
为了阐明RNF43的致癌机理，使用酵母双杂合筛选系统搜索RNF43-相互作用蛋白。在鉴定出的阳性克隆中，通过用pAS2.1-RNF43和pACT2-NOTCH2(图31B)，或pAS2.1-RNF43和pACT2-STRIN(图32B)同时转化酵母细胞使NOTCH2或STRIN与RNF43相互作用。图31A和图32A分别显示了NOTCH2和STRIN中负责相互作用的区域。
(31)推测衍生自RNF43的HLA-A24结合肽
使用结合预测软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)扫描RNF43的氨基酸序列以搜索长度为9或10个氨基酸的与HLA-A24结合的肽。表3以高结合亲和性的次序显示出推测的肽(SEQ IDNO：71-90)。总共选择和检查了下述20个肽。
表3
推测的与HLA-A24结合的RNF43多肽
Figure G2009101651634D00641
在表中，起始位置表示自RNF43 N-末端起的氨基酸位置。
(32)使用推测的肽刺激T细胞
根据“材料和方法”中所述的方法产生针对这些衍生自RNF43的肽的CTL。扩展所获得的显示出可测细胞毒活性的CTL，并建立CTL系。
表4显示了通过9聚体-肽(SEQ ID NO：71-80)刺激所诱导的CTL系的细胞毒活性。
表4  CTL系(9聚体)的细胞毒性
NE：未建立CTL系
用RNF43-350(HYHLPAAYL)(SEQ ID NO：72)，RNF43-639(LFNLQKSSL)(SEQ ID NO：73)和RNF43-721(NSQPVWLCL)(SEQ ID NO：80)刺激的CTL系对经肽脉冲的靶的细胞毒活性高于对未经任何肽脉冲的靶的细胞毒活性。由这些CTL开始，用RNF43-639建立了一个CTL克隆，用RNF43-721建立了13个CTL克隆。
用RNF43-721刺激的CTL系对经肽脉冲的靶显示出强有力的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的靶未显示出任何显著的细胞毒活性(图33)。
表5显示了通过检查用10聚体-肽(SEQ ID NO：81-90)刺激的CTL系的细胞毒活性所获得的结果。
表5  CTL系(10聚体)的细胞毒性
Figure G2009101651634D00661
NE：未建立CTL系
与未经任何肽脉冲的靶相比，用RNF43-81(KLMQSHPLYL)(SEQ IDNO：87)或RNF43-54(KMDPTG KLNL)(SEQ ID NO：88)刺激的CTL系对经肽脉冲的靶显示出适度的细胞毒活性。
(33)建立CTL克隆
使用有限稀释法由上述CTL系增殖CTL克隆。建立了13个针对RNF43-721的CTL克隆和1个针对RNF43-639的CTL克隆(见上文的表4)。图34显示了RNF43-721 CTL克隆的细胞毒活性。每个CTL克隆对经肽脉冲的靶具有很强的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的靶未显示出任何细胞毒活性。
(34)针对内源性表达RNF43以作为靶的结肠癌细胞系的细胞毒活性
检查针对推测肽产生的CTL克隆识别并杀死内源性表达RNF43的肿瘤细胞的能力。图35显示出针对RNF43-721产生的CTL克隆45的结果。CTL克隆45对表达RNF43和HLA-A24的HT29和WiDR显示出强有力的细胞毒活性。另一方面，CTL克隆45对HCT116(表达RNF43但不表达HLA-A24)或TISI(表达HLA-A24但不表达RNF43)未显示出任何细胞毒活性。另外，CTL克隆45对经不相关肽脉冲的TISI和表达RNF43但几乎不表达HLA-A24的SNU-C4未显示出任何细胞毒活性(数据未显示)。
(35)鉴定已建立的CTL
进行未标记靶的抑制试验以进一步证实RNF43-721 CTL克隆的特异性。将经51Cr标记的HT29细胞用作经标记靶，而将用RNF43-721脉冲的未经51Cr标记的TISI细胞用作未标记靶。当在试验中以多个比例加入用RNF43-721脉冲的TISI时，针对HT29细胞的特异性细胞裂解被显著抑制(图36)。以E/T＝20的比例将这些结果表示为特异性裂解的百分比。为了检查针对RNF43肽产生的CTL克隆的特征，检测了抗HLA-I类，HLA-II类，CD3，CD4和CD8的抗体抑制CTL克隆的细胞毒活性的能力。当使用抗-HLA-I类，CD3和CD8的抗体时，CTL克隆对WiDR细胞靶的细胞毒性受到显著抑制(图37)。该结果表明CTL克隆经由HLA-I类，CD3和CD8识别衍生自RNF43的肽。
(36)RNF43-721肽的同源性分析
针对RNF43-721建立的CTL克隆显示出很强的细胞毒活性。该结果表示RNF43-721的序列与其它已知可致敏人免疫系统的分子所衍生的肽同源。为了排除这种可能性，使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)进行RNF43-721的同源性分析。在BLAST所列的分子中未发现与RNF43-721完全匹配或高度同源的序列(表6)。
表6
RNF43-721的同源性分析
(BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)
鉴定(9/9)    0
鉴定(8/9)    0
鉴定(7/9)    0
鉴定(6/9)    2
这些结果表明RNF43-721的序列是独特的，用RNF43-721建立的CTL克隆对其它分子产生免疫应答的可能性很小。
(37)修饰RNF43-721以改善表位呈递的效力
为了改善肽呈递的效力，在锚位点上进行氨基酸改变以修饰RNF43-721肽。该修饰有望能改善肽与HLA I类分子的结合亲和性。表7表明将第2位氨基酸(SEQ ID NO：91和92)改变后，RNF43-721与HLA-A24分子的结合亲和性较好。
表7
RNF43-721天然肽的修饰肽的预测结合能力
序列         分值        排位＊
NSQPVWLCL    10.08       10
NFQPVWLCL    50.40       3
NYQPVWLCL    504.00      1
＊在HLA-A24限制性的9聚体肽中
(38)推测衍生自RNF43的候选肽
表8按高结合亲和性次序显示出候选肽(SEQ ID NO：87和93-111)。
表8
RNF43：预测表位肽(HLA-A*0201)
            9聚体                            10聚体
编号  起始  序列       分值     编号  起始   序列        分值
      位置                            位置
1     60    KLNLTLEGV  274.3    11    81     KLMQSHPLYL  1521.5
2     8     QLAALWPWL  199.7    12    357    YLLGPSRSAV  1183.7
3     82    LMQSHPLYL  144.2    13    202    LMTVVGTIFV  469.6
4     358   LLGPSRSAV  118.2    14    290    CLHEFHRNCV  285.1
5     11    ALWPWLLMA  94.8     15    500    SLSSDFDPLV  264.2
6     15    WLLMATLQA  84.5     16    8      QLAAIWPWLL  160.2
7     200   WILMTVVGT  40.1     17    11     ALWPWLLMAT  142.2
8     171   KLMEFVYKN  34.5     18    7      LQLAALWPWL  127.3
9     62    NLTLEGVFA  27.3     19    726    WLCLTPRQPL  98.2
10    156   GLTWPVVLI  23.9     20    302    WLHQHRTCPL  98.2
总共选择和检查了下述20个肽。
(39)使用候选肽刺激T细胞
按照“材料和方法”中所述的方法，使用这些衍生自RNF43的候选肽培养淋巴细胞。扩展所获得的显示出可测细胞毒活性的淋巴细胞，并建立CTL系。表9显示出使用9聚体-肽(SEQ ID NO：93-102)刺激诱导的CTL系的细胞毒活性。
表9
CTL系(HLA-A＊02019聚体)的细胞毒性
Figure G2009101651634D00691
NE：未建立CTL系
用RNF43-11-9(ALWPWLLMA)(SEQ ID NO：97)诱导的CTL系对经肽脉冲的靶的细胞毒活性高于对未经任何肽脉冲的靶的细胞毒活性。由这些CTL开始，用RNF43-11-9建立了4个CTL克隆。用RNF43-11-9刺激的CTL系对经肽脉冲的靶显示出强有力的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的靶未显示出任何显著的细胞毒活性(图38A)。
表10显示了通过检查用10聚体-肽(SEQ ID NO：87和103-111)诱导的CTL系的细胞毒活性所获得的结果。
表10
CTL系(HLA-A＊0201 10聚体)的细胞毒性
NE：未建立CTL系
用RNF43-11-10(ALWPWLLMAT)(SEQ ID NO：108)诱导的CTL系对经肽脉冲的靶的细胞毒活性高于对未经任何肽脉冲的靶的细胞毒活性(图38B)。
(40)建立CTL克隆
使用有限稀释法由上述CTL系增殖CTL克隆。建立了4个针对RNF43-11-9的CTL克隆(见上文的表9)。图39A和39B显示了RNF43肽-衍生的CTL克隆的细胞毒活性。每个CTL克隆对经肽脉冲的靶具有很强的细胞毒活性，而对未经任何肽脉冲的靶未显示出任何细胞毒活性。
(41)针对内源性表达RNF43以作为靶的结肠癌细胞系的细胞毒活性
检查针对推测肽产生的CTL克隆识别并杀死内源性表达RNF43的肿瘤细胞的能力。图40A和40B显示出针对RNF43衍生肽产生的CTL克隆的结果。该CTL克隆对表达RNF43和HLA-A*0201的DLD-1显示出强有力的细胞毒活性，但对表达RNF43但不表达HLA-A*0201的HT29未显示出任何细胞毒活性。
(42)CTL克隆的特异性
进行未标记靶的抑制试验以进一步证实RNF43-5-11(9聚体)CTL克隆的特异性。将经51Cr标记的HCT116细胞用作经标记靶，而将用RNF43-5脉冲的未经51Cr标记的T2细胞用作未标记靶。当在试验中以多个比例加入用RNF43-5脉冲的T2时，HCT-116细胞靶的特异性细胞裂解被显著抑制(图41)。
工业实用性
与非癌胃组织相比，新的人基因CXADRL1和GCUD1在胃癌中的表达显著提高。另一方面，与非癌粘膜组织相比，新的人基因RNF43在结肠癌细胞中的表达显著提高。因此，这些基因可用作癌症的诊断标记，由它们编码的蛋白质可用于癌症诊断试验。
本发明人还证实新蛋白质CXADRL1，GCUD1或RNF43的表达能促进细胞生长，而通过与CXADRL1，GCUD1或RNF43基因相对应的反义寡核苷酸或小的干扰RNA可抑制细胞生长。这些发现暗示CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白中的每一种都能刺激致癌活性。因此，这些新的癌症蛋白质中的每一种都是对开发抗癌药物有用的靶。例如，能阻断CXADRL1，GCUD1或RNF43表达或抑制其活性的药剂具有作为抗-癌药剂，特别是治疗胃癌和结肠癌的抗-癌药剂的治疗用途。所述药剂的例子包括反义寡核苷酸、小的干扰RNA和能识别CXADRL1，GCUD1或RNF43的抗体。
另外，本发明人还证实了CXADRL1能与AIP1相互作用。CXADRL1与AIP1的结合有望调节CXADRL1的细胞增殖活性。因此，能抑制由CXADRL1与AIP1组成的复合物形成的药剂可用于治疗和预防癌症，尤其是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。或者，本发明人还证实了RNF43能与NOTCH2或STRIN相互作用。RNF43与NOTCH2或STRIN的结合有望调节RNF43的细胞增殖活性。因此，能抑制由RNF43与NOTCH2或STRIN组成的复合物形成的药剂可用于治疗和预防癌症，尤其是结肠癌、肺癌、胃癌和肝癌。
尽管根据本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但本发明的多种变化和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，并不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)
     国立大学法人东京大学(THE UNIVERSITY OF TOKYO)
<120>与人结肠癌相关的基因和多肽
<130>ONC-A0203Y2P
<150>US 60/386,985
<151>2002-06-06
<150>US 60/415,209
<151>2002-09-30
<150>US 60/451,013
<151>2003-02-28
<160>194
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3423
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(238)..(1533)
<223>
<400>1
gctggcgagc ccggaacgcc tctggtcaca gctcagcgtc cgcggagccg ggcggcgctg     60
gagctgcact tggctcgtct gtgggtctga cagtcccagc tctgcgcggg gaacagcggc    120
ccggagctgg gtgtgggagg accaggctgc cccaagagcg cggagactca cgcccgctcc    180
tctcctgt tg cgaccgggag ccgggtagga ggcaggcgcg ctccctgcgg ccccggg      237
atg act tct cag cgt tcc cct ctg gcg cct ttg ctg ctc ctc tct ctg      285
Met Thr Ser Gln Arg Ser Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
cac ggt gtt gca gca tcc ctg gaa gtg tca gag agc cct ggg agt atc      333
His Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile
            20                  25                  30
cag gtg gcc cgg ggt cag cca gca gtc ctg ccc tgc act ttc act acc      381
Gln Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr
        35                  40                  45
agc gct gcc ctc att aac ctc aat gtc att tgg atg gtc act cct ctc      429
Ser Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu
    50                  55                  60
tcc aat gcc aac caa cct gaa cag gtc a tc ctg tat cag ggt gga cag     477
Ser Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
atg ttt gat ggt gcc ccc cgg ttc cac ggt agg gta gga ttt aca ggc      525
Met Phe Asp Gly Ala Pro Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly
                85                  90                  95
acc atg cca gct acc aat gtc tct atc ttc att aat aac act cag tta      573
Thr Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu
            100                 105                 110
tca gac act ggc acc tac cag tgc ctg gtc aac aac ctt cca gac ata    621
Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile
        115                 120                 125
ggg ggc agg aac att ggg gtc acc ggt ctc aca gtg tta gtt ccc cct    669
Gly Gly Arg Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro
    130                 135                 140
tct gcc cca cac tgc caa atc caa gga tcc cag gat att ggc agc gat    717
Ser Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
gtc atc cta ctc tgt agc tca gag gaa ggc att cct cga cca act tac    765
Val Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr
                165                 170                 175
ctt tgg gag aag tta gac aat acc ctc aaa cta cct cca aca gct act    813
Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr
            180                 185                 190
cag gac cag gtc cag gga aca gtc acc atc cgg aac atc agt gcc ctg    861
Gln Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu
        195                 200                 205
tct tca ggt ttg tac cag tgc gtg gct tct aat gct att gga acc agc    909
Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser
    210                 215                 220
acc tgt ctt ctg gat ctc cag gtt att tca ccc cag ccc agg aac att    957
Thr Cys Leu Leu Asp Leu Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile
225                 230                 235                 240
gga cta ata gct gga gcc att ggc act ggt gca gtt att atc att ttt   1005
Gly Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe
                245                 250                 255
tgc att gca cta att tta ggg gca ttc ttt tac tgg aga agc aaa aat   1053
Cys Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn
            260                 265                 270
aaa gag gag gaa gaa gaa gaa att cct aat gaa ata aga gag gat gat   1101
Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp
        275                 280                 285
ctt cca ccc aag tgt tct tct gcc aaa gca ttt cac act gag att tcc   1149
Leu Pro Pro Lys Cys Ser Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser
    290                 295                 300
tcc tcg gac aac aac aca cta acc tct tcc aat gcc tac aac agt cga   1197
Ser Ser Asp Asn Asn Thr Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg
305                 310                 315                 320
tac tgg agc aac aat cca aaa gtt cat aga aac aca gat tca gtc agc   1245
Tyr Trp Ser Asn Asn Pro Lys Val His Arg Asn Thr Asp Ser Val Ser
                325                 330                 335
cac ttc agt gac ttg ggc caa tct ttc tct ttc cac tca ggc aat gcc   1293
His Phe Ser Asp Leu Gly Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala
            340                 345                 350
aac ata cca tcc att tat gct aat ggg acc cat ctg gtc ccg ggt caa   1341
Asn Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln
        355                 360                 365
cat aag act ctg gta gtg aca gcc aac aga ggg tca tca cca cag gtg   1389
His Lys Thr Leu Val Val Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val
    370                 375                 380
atg tcc agg agc aat ggc tca gtc agt agg gag cct cgg cct cca cac   1437
Met Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val Ser Arg Glu Pro Arg Pro Pro His
385                 390                 395                 400
act cat tcc tac acc atc agc cac gca aca ctg gaa cga att ggt gca      1485
Thr His Ser Tyr Thr Ile Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala
                405                 410                 415
gta cct gtc atg gta cca gcc cag agt cgg gcc ggg tcc ttg gta tag      1533
Val Pro Val Met Val Pro Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val
            420                 425                 430
gacatgagga aatgttgtgt tcagaaatga ataaatggaa tgccctcata caagggggag    1593
ggtggggtgg ggagtgctgg gaaagaaaca cttccttata attatattag taaaatgcac    1653
aaagaagaag gcagtgctgt tacttggcca ctaagatgtg taaaatggac tgaaatgctc    1713
catcatgaag acttgcttcc ccaccaaaga tgtcctggga ttctgctgga tctcaaagat    1773
gtgccaagcc aaggaaaaag atacaagagc agaatagtac ttaaaatcca aactgccgcc    1833
cagatgggct tgttcttcat gcctaactta ataattttta agagattaaa gtgccagatg    1893
gagtttaaat attgaaatta ttttaaaagg taggtgtctt taagaaaata acaagcaacc    1953
ctgtgatatg ttccgtctct cccaattccc tcgttatata gagggcttaa tggtataaat    2013
ggttaatatt ggtcccaaca gggctgactc ttctatcata taatcaaaac tttttacatg    2073
agcaaaattc agtaagaaat gggggaagac aaaggaaacg tctttgagaa gccccttcat    2133
atttatttat ttatctcttc ctgaaccatg aatttcatat gtggaatatt gctatattga    2193
cagattcttg cctgtctgtg ttattctagg atctgttaca ggtccatggc aattactgtt    2253
tattttttcc tggaaaaata tttttttata aaaggctttt tttttttttt aaatacatga    2313
gaggcattgg gctaagaaag aaaagactgt tgtataatac cttgttcaat ggttgtattt    2373
agtgagctca tagaggtcca tcatatcatg accgagctag gttgtgtggg caggaaggta    2433
gggctaaggg gttgtagcct tgctgggcag cctctcagag caaggttgtt cagatctccc    2493
ttgctattac agtaggttac tattaatgag ggcagcacct gatgcctttt gtactgaggt    2553
atgtaacttt ctccttattt gacaagtaga agttaactta cttgtcaggg agggcagacg    2613
tttttttgtt ctgtttcgtt tttcaaaata atgctttttg caaaagaggt aagactgaga    2673
ctaaaggtgt tatcttctgg tgtgctcctg gaagtgtcta ccctacattt gtgtcagctc    2733
agggttgcag tgttgcccag atgcatttta catcactgta aagagattac ttttgtggtt    2793
actacctggc ttggctggcc ttgcggttca ccagattaat ttacaaactc ccccacttta    2853
ttttgtgcta tgtagatctg gccatacttg cattagtgac tgtcttgcct taaccacact    2913
taagcaaccc acaaatttct tctcagattt gtttcctaga ttacttatga tactcatccc    2973
atgtctcaat aagagtgtct tttctttctg gatgtgttct cttactccct cttaccacca    3033
tactttttgc tctcttctcc tgcaagcgta gtcttcacag ggagtggctt cctgacattt    3093
ttttcagtta tgtgaatgaa tggaaaccaa cagctgctgc aaacactgtt tttccaagaa    3153
ggctacaetc agaacctaac cattgccaac catttcagta ttgataaaaa gctgaattta    3213
ctttagcatt acttattttt ttttccattt gatggttctt actttgtaaa aatttaaata    3273
aatgaatgtc tatacttttt ataaagaaaa gtgaaaatac catgacactg aaaagatgat    3333
gctatcagat gctgtttaga aagcatttat cttgcatttc tttattcttt ctaattatct    3393
aaaattcaat aaaattttat tcatataaaa                                     3423
<210>2
<211>431
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Thr Ser Gln Arg Ser Pro Leu Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
His Gly Val Ala Ala Ser Leu Glu Val Ser Glu Ser Pro Gly Ser Ile
            20                  25                  30
Gln Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr
        35                  40                  45
Ser Ala Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val Thr Pro Leu
    50                  55                  60
Ser Asn Ala Asn Gln Pro Glu Gln Val Ile Leu Tyr Gln Gly Gly Gln
65                  70                  75                  80
Met Phe Asp Gly Ala Pro Arg Phe His Gly Arg Val Gly Phe Thr Gly
                85                  90                  95
Thr Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu
            100                 105                 110
Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile
        115                 120                 125
Gly Gly Arg Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Ala Pro His Cys Gln Ile Gln Gly Ser Gln Asp Ile Gly Ser Asp
145                 150                 155                 160
Val Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile Pro Arg Pro Thr Tyr
                165                 170                 175
Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu Lys Leu Pro Pro Thr Ala Thr
            180                 185                 190
Gln Asp Gln Val Gln Gly Thr Val Thr Ile Arg Asn Ile Ser Ala Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala Ile Gly Thr Ser
    210                 215                 220
Thr Cys Leu Leu Asp Leu Gln Val Ile Ser Pro Gln Pro Arg Asn Ile
225                 230                 235                 240
Gly Leu Ile Ala Gly Ala Ile Gly Thr Gly Ala Val Ile Ile Ile Phe
                245                 250                 255
Cys Ile Ala Leu Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser Lys Asn
            260                 265                 270
Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ile Pro Asn Glu Ile Arg Glu Asp Asp
        275                 280                 285
Leu Pro Pro Lys Cys Ser Ser Ala Lys Ala Phe His Thr Glu Ile Ser
    290                 295                 300
Ser Ser Asp Asn Asn Thr Leu Thr Ser Ser Asn Ala Tyr Asn Ser Arg
305                 310                 315                 320
Tyr Trp Ser Asn Asn Pro Lys Val His Arg Asn Thr Asp Ser Val Ser
                325                 330                 335
His Phe Ser Asp Leu Gly Gln Ser Phe Ser Phe His Ser Gly Asn Ala
            340                 345                 350
Asn Ile Pro Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu Val Pro Gly Gln
        355                 360                 365
His Lys Thr Leu Val Val Thr Ala Asn Arg Gly Ser Ser Pro Gln Val
    370                 375                 380
Met Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val Ser Arg Glu Pro Arg Pro Pro His
385                 390                 395                 400
Thr His Ser Tyr Thr Ile Ser His Ala Thr Leu Glu Arg Ile Gly Ala
                405                 410                 415
Val Pro Val Met Val Pro Ala Gln Ser Arg Ala Gly Ser Leu Val
            420                 425                 430
<210>3
<211>4987
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(60)..(1304)
<223>
<400>3
gcggccgcag cctcagcacc gcagagcgga gagcggagcc cggagcccgc cgccccagg    59
atg gct gca gct cct cca agt tac tgt ttt gtt gcc ttc cct cca cgt    107
Met Ala Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val Ala Phe Pro Pro Arg
1               5                   10                  15
gct aag gat ggt ctg gtg gta ttt ggg aaa aat tca gcc cgg ccc aga    155
Ala Lys Asp Gly Leu Val Val Phe Gly Lys Asn Ser Ala Arg Pro Arg
            20                  25                  30
gat gaa gtg caa gag gtt gtg tat ttc tcg gct gct gat cac gaa ccg    203
Asp Glu Val Gln Glu Val Val Tyr Phe Ser Ala Ala Asp His Glu Pro
        35                  40                  45
gag agc aag gtt gag tgc act tac att tca atc gac caa gtt cca agg    251
Glu Ser Lys Val Glu Cys Thr Tyr Ile Ser Ile Asp Gln Val Pro Arg
    50                  55                  60
acc tat gcc ata atg ata agc aga ccc gcc tgg ctc tgg gga gca gaa    299
Thr Tyr Ala Ile Met Ile Ser Arg Pro Ala Trp Leu Trp Gly Ala Glu
65                  70                  75                  80
atg gga gcc aat gaa cat gga gtg tgc ata gcc aat gaa gcc atc aac    347
Met Gly Ala Asn Glu His Gly Val Cys Ile Ala Asn Glu Ala Ile Asn
                85                  90                  95
acc aga gag cca gct gcc gag ata gaa gcc ttg ctg ggg atg gat ctg    395
Thr Arg Glu Pro Ala Ala Glu Ile Glu Ala Leu Leu Gly Met Asp Leu
            100                 105                 110
gtc agg ctt ggt tta gaa aga ggg gaa aca gct aaa gaa gcc tta gat    443
Val Arg Leu Gly Leu Glu Arg Gly Glu Thr Ala Lys Glu Ala Leu Asp
        115                 120                 125
gtc att gtc tcc ttg ttg gaa gaa cat gga caa ggt ggg aat tac ttt    491
Val Ile Val Ser Leu Leu Glu Glu His Gly Gln Gly Gly Asn Tyr Phe
    130                 135                 140
gaa gat gca aac tcc tgc cac agc ttc caa agt gca tat ctg att gtg    539
Glu Asp Ala Asn Ser Cys His Ser Phe Gln Ser Ala Tyr Leu Ile Val
145                 150                 155                 160
gat cgt gat gaa gcc tgg gtg ctc gag acc ata ggg aag tac tgg gct    587
Asp Arg Asp Glu Ala Trp Val Leu Glu Thr Ile Gly Lys Tyr Trp Ala
                165                 170                 175
gcc gag aaa gtc aca gag gga gtg agg tgc att tgc agt cag ctt tcg    635
Ala Glu Lys Val Thr Glu Gly Val Arg Cys Ile Cys Ser Gln Leu Ser
            180                 185                 190
ctc acc act aag atg gat gca gag cat ccg gaa ctc agg agt tac gct    683
Leu Thr Thr Lys Met Asp Ala Glu His Pro Glu Leu Arg Ser Tyr Ala
        195                 200                 205
cag agc caa ggt tgg tgg acg gga gag ggc gag ttc aat ttt tcc gaa    731
Gln Ser Gln Gly Trp Trp Thr Gly Glu Gly Glu Phe Asn Phe Ser Glu
    210                 215                 220
gtc ttt tct cca gtt gag gat cat cta gac tgc ggt gct ggc aaa gac    779
Val Phe Ser Pro Val Glu Asp His Leu Asp Cys Gly Ala Gly Lys Asp
225                 230                 235                 240
agc tta gaa aaa caa gaa gaa agc atc aca gtg cag act atg atg aac    827
Ser Leu Glu Lys Gln Glu Glu Ser Ile Thr Val Gln Thr Met Met Asn
                245                 250                 255
acc tta cgg gac aaa gcc agc gga gtg tgc ata gac tct gag ttt ttc    875
Thr Leu Arg Asp Lys Ala Ser Gly Val Cys Ile Asp Ser Glu Phe Phe
            260                 265                 270
ctc acc aca gcc agt gga gtg tct gtc ctg ccg cag aat aga agc tct    923
Leu Thr Thr Ala Ser Gly Val Ser Val Leu Pro Gln Asn Arg Ser Ser
        275                 280                 285
ccg tgc att cac tac ttc act gga acc cct gat cct tcc agg tcc ata    971
Pro Cys Ile Hi s Tyr Phe Thr Gly Thr Pro Asp Pro Ser Arg Ser Ile
    290                 295                 300
ttc aag cct ttc atc ttt gtt gat gac gta aaa ctt gtc ccc aaa aca   1019
Phe Lys Pro Phe Ile Phe Val Asp Asp Val Lys Leu Val Pro Lys Thr
305                 310                 315                 320
cag tct ccc tgt ttt ggg gat gac gac cct gcc aaa aag gag cct cgg   1067
Gln Ser Pro Cys Phe Gly Asp Asp Asp Pro Ala Lys Lys Glu Pro Arg
                325                 330                 335
ttc cag gag aaa cca gac cgc cgg cat gag ctg tac aaa gcc cac gag   1115
Phe Gln Glu Lys Pro Asp Arg Arg His Glu Leu Tyr Lys Ala His Glu
            340                 345                 350
tgg gca cgt gcc atc atc gaa agt gac cag gag caa ggt cgc aag ctg   1163
Trp Ala Arg Ala Ile Ile Glu Ser Asp Gln Glu Gln Gly Arg Lys Leu
        355                 360                 365
agg agc acc atg ctg gag ctg gag aag caa ggc ctg gaa gcc atg gaa   1211
Arg Ser Thr Met Leu Glu Leu Glu Lys Gln Gly Leu Glu Ala Met Glu
    370                 375                 380
gaa atc ctg acc agc tcc gag cca ctg gac cct gcg gaa gtg ggg gac   1259
Glu Ile Leu Thr Ser Ser Glu Pro Leu Asp Pro Ala Glu Val Gly Asp
385                 390                 395                 400
ctt ttc tat gac tgt gtt gac acg gag att aag ttc ttt aag tga          1304
Leu Phe Tyr Asp Cys Val Asp Thr Glu Ile Lys Phe Phe Lys
                405                 410
agtaagcgtt ccctttcccc ttcttattta agacttccca ccttactaaa ttaccagcaa    1364
aacaaaccac tctcctgttt gagtaaaatg agaaagttaa tatgtggcct ccttttctga    1424
agccagatca aactgttacc ttgtgttcca ccttgaatct cacagcgtcc ccttctgcaa    1484
tgtaggtctc cttcctgtgc agtgtaacat gtatcccgtt gcctgttgtt cggttgtgtg    1544
actaattgtg gattttaagc tgctattatt gtatttcagt ggcaatggac acattagcct    1604
tttacaagag gactagagtt catcaagcct tgaaaggcag gcttcacagt gccgagttgg    1664
cgggaaaagc aaattctttt gaagtcttag tctttccctc agtagcggtt tctttcaggt    1724
taacaagagg catttgtgca cacacacagg gctcttgtgt gtgttgtcaa ggggaccctc    1784
cgtggcctcc cgtgagtgca tgcctgtagt gcacagtgtc tctacaggtg tcttctgggg    1844
ggcagaacca attggaagga agaaagggac ccctctccag tcctggctcc ttcctacatc    1904
ctgggctcct gaagaagctg tcttcccatt ttccatgcgc tgtgcttatg tgtggtggac    1964
tgcagagctg cttccactta caggagagct gataatttgt tagctggaac ctattcactt    2024
ccgagattca gacatagcca tgctggtggc cttctgaatc actgcatgga tgtcccagga    2084
ggcagctctc cccacacagc agcacagcca tcacaggatt ccttgtgtag aaatgattcc    2144
cagtctagtt accaacagct agtctaggag taattgaatg gccctatggc acagttccac    2204
ccacagagta gtgaatctct cagccaagga gggaaagaaa aggaagaact cttgactatt    2264
tagattctag ttaaatatct ggaatcctag cagtcactac attatctcag cagagagact    2324
ttaattaaac tgatttgttt ccaatgtcgg gttcacttaa aggatttgac ttaccaccag    2384
agcatagaaa agcatgcaag gaagaccaga tgggcttagc attgggaaga cagagggcaa    2444
ggaggtgata gatggatata gaagcatttc tctgcaggat accagttcag gccccaccat    2504
tcctgccaag gccattacat cccacaaacc caaatacaaa gcagctgact tccctggatc    2564
ttccccccac tcctcacacc tcacatgtcc caggagctgc cttcattcag gcgggtagct    2624
gcactgggca tggggtggtg gtgggagctt accgccacct attcaagctc tcagctactc    2684
ctgaaacggg cagagatgat gaacagaagt gtatgtaaat acagcagcta gtgggagagc    2744
accagttggg cctaatcctg cctcatcatt cttggcagga atctgcaaat ggaaacattg    2804
tgagtatcag caatctggga agtgacaggg ttaataactc cttcccagaa gctgtatcat    2864
gagattttga ggggaccgag ccctgttaca tggatgtgaa cagtgaggat cagaggtttt    2924
atcagaacac attctttttt tctaccaact ctccagagcg tgagtatagg agtgccatga    2984
gctttttagt cagcagtttt gtaaactctg tatataaaat cattaaccac acattgtggg    3044
tgatgggaag acgatttcag ctgacagagt taatggcaac caataatggt ggcctgtagc    3104
tgctaagagc ttcacgcagg tttggcctgg gctttcactg ttggtgaatt tagagtgtcc    3164
ttttaggtgg ggcggctatt ctaaaagtgt ctttctatca ctgttaaggg ggggggaaag    3224
tgaggttcga ggatgacgta ggtaactctc ccctcccaag tccatgttcc aagtggctat    3284
gtaaagcaag atgatacaga aagctgctct aaaatctcac tgagtgattt caccttcgcc    3344
tactatgaaa tgtctcatca gacctgacat gtctgagata accaaggtga ttcaggattt    3404
gatcaaaaga agtctagtaa gaattaatta cacagaagcc tcctttcatt tctatgggcc    3464
aaacaaaggc catggataac cctacccgct ttatgtcatt acccattggg aaacacaatg    3524
gctacttctg ttagggtaca ttgaccttgg tcaagcatct taaagaaggc aaccctaatt    3584
gagagctgtc ttggctaata ctctgcacca caattgtgat gtcctagtcc taccactaga    3644
gggcatggta cagcctggca aaagttaaaa ggggtgtggc agctcccatc aggtctggag    3704
gtggtctata agcacagttg acagttgtgc attgggatgg gtggagaaag acgacaagag    3764
agcagagaat ctgctgatgt ggctgcgctt acttttagtg actttatgta cttatattaa    3824
cagctggaaa taggttgttg ggttttgagc aggctgttat agtgaggaat gttcattttt    3884
aaatgttcct aacagatttt gcttttgaaa aatgcttgtt acatgaataa tttgtggacc    3944
agggattgct tttctgaagg cagtataggg aacatgaata ttcaagatga aatacaaaaa    4004
ttatgtttaa gggtcatagt gtataagtag cttcctagga aaccctttgt gtatcttttc    4064
agactggggt gggggctgag catgcttgtg cagaaagaag ccatagccag aaaggacaga    4124
atctctcccc cactcccttg ccccataacc aaacataagc tagctagtct tgtctaatag    4184
atgggattta ctataggtga agatagccct catattcaag gacagaagct ctggcaggag    4244
taaattagca aagcagaaat agtacccttt cattcttgga ggtgctttga aattttaggt    4304
agaatataat cgaaattatg gaggttcctt agtgctcaat aatataagac ctggtgttat    4364
tagaacgagt ctttcttata aactaacaga gcaggtatat gcctgttaga ccttagctgt    4424
ggggttcctt tactattggg tgaatcatta ggtataaaaa ataatcatca accaggcaaa    4484
ttactttgct tcctagctga tgtcatccca cattggtaca ggtgttattc agtactgggt    4544
ggttcagcag ggaagccggg tgggaccagt gtgtctgtca tgaaaccact aactgcattc    4604
ctgactgaag agccatctgt catttattgg ggaaggtctt cagttgagct ctcagcctta    4664
ggaaggaagc acgtggagga gggacggagg aggttccctt gctgggcatg cttcgtagag    4724
ggccaggagc agcaggtcat gtgcacatgc cgttgcagca caagcttatg cttcccgtag    4784
ccgtggcttt tcattctgca cagtcccagg tcccagctcc cctcttatgg tttctgtcat    4844
aatgtgcttt atctgattga ctccaaacat cccgaaatgt cacctgcaga tttctcgtgg    4904
gaaccaatat gtacatgttt gcaattatgc tgtgagaatt taaatgtgtt agatggaaaa    4964
tgctattggc agggaataat aat                                            4987
<210>4
<211>414
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Ala Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val Ala Phe Pro Pro Arg
1               5                   10                  15
Ala Lys Asp Gly Leu Val Val Phe Gly Lys Asn Ser Ala Arg Pro Arg
            20                  25                  30
Asp Glu Val Gln Glu Val Val Tyr Phe Ser Ala Ala Asp His Glu Pro
        35                  40                  45
Glu Ser Lys Val Glu Cys Thr Tyr Ile Ser Ile Asp Gln Val Pro Arg
    50                  55                  60
Thr Tyr Ala Ile Met Ile Ser Arg Pro Ala Trp Leu Trp Gly Ala Glu
65                  70                  75                  80
Met Gly Ala Asn Glu His Gly Val Cys Ile Ala Asn Glu Ala Ile Asn
                85                  90                  95
Thr Arg Glu Pro Ala Ala Glu Ile Glu Ala Leu Leu Gly Met Asp Leu
            100                 105                 110
Val Arg Leu Gly Leu Glu Arg Gly Glu Thr Ala Lys Glu Ala Leu Asp
        115                 120                 125
Val Ile Val Ser Leu Leu Glu Glu His Gly Gln Gly Gly Asn Tyr Phe
    130                 135                 140
Glu Asp Ala Asn Ser Cys His Ser Phe Gln Ser Ala Tyr Leu Ile Val
145                 150                 155                 160
Asp Arg Asp Glu Ala Trp Val Leu Glu Thr Ile Gly Lys Tyr Trp Ala
                165                 170                 175
Ala Glu Lys Val Thr Glu Gly Val Arg Cys Ile Cys Ser Gln Leu Ser
            180                 185                 190
Leu Thr Thr Lys Met Asp Ala Glu His Pro Glu Leu Arg Ser Tyr Ala
        195                 200                 205
Gln Ser Gln Gly Trp Trp Thr Gly Glu Gly Glu Phe Asn Phe Ser Glu
    210                 215                 220
Val Phe Ser Pro Val Glu Asp His Leu Asp Cys Gly Ala Gly Lys Asp
225                 230                 235                 240
Ser Leu Glu Lys Gln Glu Glu Ser Ile Thr Val Gln Thr Met Met Asn
                245                 250                 255
Thr Leu Arg Asp Lys Ala Ser Gly Val Cys Ile Asp Ser Glu Phe Phe
            260                 265                 270
Leu Thr Thr Ala Ser Gly Val Ser Val Leu Pro Gln Asn Arg Ser Ser
        275                 280                 285
Pro Cys Ile His Tyr Phe Thr Gly Thr Pro Asp Pro Ser Arg Ser Ile
    290                 295                 300
Phe Lys Pro Phe Ile Phe Val Asp Asp Val Lys Leu Val Pro Lys Thr
305                 310                 315                 320
Gln Ser Pro Cys Phe Gly Asp Asp Asp Pro Ala Lys Lys Glu Pro Arg
                325                 330                 335
Phe Gln Glu Lys Pro Asp Arg Arg His Glu Leu Tyr Lys Ala His Glu
            340                 345                 350
Trp Ala Arg Ala Ile Ile Glu Ser Asp Gln Glu Gln Gly Arg Lys Leu
        355                 360                 365
Arg Ser Thr Met Leu Glu Leu Glu Lys Gln Gly Leu Glu Ala Met Glu
    370                 375                 380
Glu Ile Leu Thr Ser Ser Glu Pro Leu Asp Pro Ala Glu Val Gly Asp
385                 390                 395                 400
Leu Phe Tyr Asp Cys Val Asp Thr Glu Ile Lys Phe Phe Lys
                405                 410
<210>5
<211>5345
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(489)..(2840)
<223>
<400>5
gtacttggtt aagcagttga aacctttttt gagcaggatc tgtaaaagca taattgaatt     60
tgtttcaccc ccgtggattc cagtgggccc gacagcgcaa cagtgcctgg caacttgatg    120
catatggaag agcaatgcca agtgatctga cataatacaa attcacgaag tgacatttta    180
tcacaagcaa agttggaaat tccaaagaga agtggtgaga tctttactag tcacagtgaa    240
gatgggagaa aatgacatac ctgcagcaga tgtgggctga aaatatcctc ttctctgccc    300
aatcaggaat gctacctgtt tttgggaata aactttagag aaaggaaggg ccaaaactac    360
gacttggctt tctgaaacgg aagcataaat gttcttttcc tccatttgtc tggatctgag    420
aacctgcatt tggtattagc tagtggaagc agtatgtatg gttgaagtgc attgctgcag    480
ctggtagc atg agt ggt ggc cac cag ctg cag ctg gct gcc ctc tgg ccc     530
         Met Ser Gly Gly His Gln Leu Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro
         1               5                   10
tgg ctg ctg atg gct acc ctg cag gca ggc ttt gga cgc aca gga ctg      578
Trp Leu Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu
15                  20                  25                  30
gta ctg gca gca gcg gtg gag tct gaa aga tca gca gaa cag aaa gct      626
Val Leu Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala
                35                  40                  45
att atc aga gtg atc ccc ttg aaa atg gac ccc aca gga aaa ctg aat      674
Ile Ile Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn
            50                  55                  60
ctc act ttg gaa ggt gtg ttt gct ggt gtt gct gaa ata act cca gca      722
Leu Thr Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Ile Thr Pro Ala
        65                  70                  75
gaa gga aaa tta atg cag tcc cac ccg ctg tac ctg tgc aat gcc agt      770
Glu Gly Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser
    80                  85                  90
gat gac gac aat ctg gag cct gga ttc atc agc atc gtc aag ctg gag      818
Asp Asp Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu
95                  100                 105                 110
agt cct cga cgg gcc ccc cgc ccc tgc ctg tca ctg gct agc aag gct      866
Ser Pro Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala
                115                 120                 125
cgg atg gcg ggt gag cga gga gcc agt gct gtc ctc ttt gac atc act     914
Arg Met Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr
            130                 135                 140
gag gat cga gct gct gct gag cag ctg cag cag ccg ctg ggg ctg acc     962
Glu Asp Arg Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr
        145                 150                 155
tgg cca gtg gtg ttg atc tgg ggt aat gac gct gag aag ctg atg gag    1010
Trp Pro Val Val Leu Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu
    160                 165                 170
ttt gtg tac aag aac caa aag gcc cat gtg agg att gag ctg aag gag    1058
Phe Val Tyr Lys Asn Gln Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu
175                 180                 185                 190
ccc ccg gcc tgg cca gat tat gat gtg tgg atc cta atg aca gtg gtg    1106
Pro Pro Ala Trp Pro Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val
                195                 200                 205
ggc acc atc ttt gtg atc atc ctg gct tcg gtg ctg cgc atc cgg tgc    1154
Gly Thr Ile Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys
            210                 215                 220
cgc ccc cgc cac agc agg ccg gat ccg ctt cag cag aga aca gcc tgg    1202
Arg Pro Arg His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gln Gln Arg Thr Ala Trp
        225                 230                 235
gcc atc agc cag ctg gcc acc agg agg tac cag gcc agc tgc agg cag    1250
Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln
    240                 245                 250
gcc cgg ggt gag tgg cca gac tca ggg agc agc tgc agc tca gcc cct    1298
Ala Arg Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro
255                 260                 265                 270
gtg tgt gcc atc tgt ctg gag gag ttc tct gag ggg cag gag cta cgg    1346
Val Cys Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg
                275                 280                 285
gtc att tcc tgc ctc cat gag ttc cat cgt aac tgt gtg gac ccc tgg    1394
Val Ile Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp Pro Trp
            290                 295                 300
tta cat cag cat cgg act tgc ccc ctc tgc gtg ttc aac atc aca gag    1442
Leu His Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Val Phe Asn Ile Thr Glu
        305                 310                 315
gga gat tca ttt tcc cag tcc ctg gga ccc tct cga tct tac caa gaa    1490
Gly Asp Ser Phe Ser Gln Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Tyr Gln Glu
    320                 325                 330
cca ggt cga aga ctc cac ctc att cgc cag cat ccc ggc cat gcc cac    1538
Pro Gly Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His
335                 340                 345                 350
tac cac ctc cct gct gcc tac ctg ttg ggc cct tcc cgg agt gca gtg    1586
Tyr His Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val
                355                 360                 365
gct cgg ccc cca cgg cct ggt ccc ttc ctg cca tcc cag gag cca ggc    1634
Ala Arg Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Gly
            370                 375                 380
atg ggc cct cgg cat cac cgc ttc ccc aga gct gca cat ccc cgg gct    1682
Met Gly Pro Arg His His Arg Phe Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala
        385                 390                 395
cca gga gag cag cag cgc ctg gca gga gcc cag cac ccc tat gca caa    1730
Pro Gly Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Ala Gln His Pro Tyr Ala Gln
    400                 405                 410
ggc tgg gga atg agc cac ctc caa tcc acc tca cag cac cct gct gct    1778
Gly Trp Gly Met Ser His Leu Gln Ser Thr Ser Gln His Pro Ala Ala
415                 420                 425                 430
tgc cca gtg ccc cta cgc cgg gcc agg ccc cct gac agc agt gga tct    1826
Cys Pro Val Pro Leu Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser
                435                 440                 445
gga gaa agc tat tgc aca gaa cgc agt ggg tac ctg gca gat ggg cca    1874
Gly Glu Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro
            450                 455                 460
gcc agt gac tcc agc tca ggg ccc tgt cat ggc tct tcc agt gac tct    1922
Ala Ser Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser
        465                 470                 475
gtg gtc aac tgc acg gac atc agc cta cag ggg gtc cat ggc agc agt    1970
Val Val Asn Cys Thr Asp Ile Ser Leu Gln Gly Val His Gly Ser Ser
    480                 485                 490
tct act ttc tgc agc tcc cta agc agt gac ttt gac ccc cta gtg tac    2018
Ser Thr Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr
495                 500                 505                 510
tgc agc cct aaa ggg gat ccc cag cga gtg gac atg cag cct agt gtg    2066
Cys Ser Pro Lys Gly Asp Pro Gln Arg Val Asp Met Gln Pro Ser Val
                515                 520                 525
acc tct cgg cct cgt tcc ttg gac tcg gtg gtg ccc aca ggg gaa acc    2114
Thr Ser Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly Glu Thr
            530                 535                 540
cag gtt tcc agc cat gtc cac tac cac cgc cac cgg cac cac cac tac    2162
Gln Val Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr
        545                 550                 555
aaa aag cgg ttc cag tgg cat ggc agg aag cct ggc cca gaa acc gga    2210
Lys Lys Arg Phe Gln Trp His Gly Arg Lys Pro Gly Pro Glu Thr Gly
    560                 565                 570
gtc ccc cag tcc agg cct cct att cct cgg aca cag ccc cag cca gag    2258
Val Pro Gln Ser Arg Pro Pro Ile Pro Arg Thr Gln Pro Gln Pro Glu
575                 580                 585                 590
cca cct tct cct gat cag caa gtc acc gga tcc aac tca gca gcc cct    2306
Pro Pro Ser Pro Asp Gln Gln Val Thr Gly Ser Asn Ser Ala Ala Pro
                595                 600                 605
tcg ggg cgg ctc tct aac cca cag tgc ccc agg gcc ctc cct gag cca    2354
Ser Gly Arg Leu Ser Asn Pro Gln Cys Pro Arg Ala Leu Pro Glu Pro
            610                 615                 620
gcc cct ggc cca gtt gac gcc tcc agc atc tgc ccc agt acc agc agt    2402
Ala Pro Gly Pro Val Asp Ala Ser Ser Ile Cys Pro Ser Thr Ser Ser
        625                 630                 635
ctg ttc aac ttg caa aaa tcc agc ctc tct gcc cga cac cca cag agg    2450
Leu Phe Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu Ser Ala Arg His Pro Gln Arg
    640                 645                 650
aaa agg cgg ggg ggt ccc tcc gag ccc acc cct ggc tct cgg ccc cag    2498
Lys Arg Arg Gly Gly Pro Ser Glu Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Gln
655                 660                 665                 670
gat gca act gtg cac cca gct tgc cag att ttt ccc cat tac acc ccc      2546
Asp Ala Thr Val His Pro Ala Cys Gln Ile Phe Pro His Tyr Thr Pro
                675                 680                 685
agt gtg gca tat cct tgg tcc cca gag gca cac ccc ttg atc tgt gga      2594
Ser Val Ala Tyr Pro Trp Ser Pro Glu Ala His Pro Leu Ile Cys Gly
            690                 695                 700
cct cca ggc ctg gac aag agg ctg cta cca gaa acc cca ggc ccc tgt      2642
Pro Pro Gly Leu Asp Lys Arg Leu Leu Pro Glu Thr Pro Gly Pro Cys
        705                 710                 715
tac tca aat tca cag cca gtg tgg ttg tgc ctg act cct cgc cag ccc      2690
Tyr Ser Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gln Pro
    720                 725                 730
ctg gaa cca cat cca cct ggg gag ggg cct tct gaa tgg agt tct gac      2738
Leu Glu Pro His Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp
735                 740                 745                 750
acc gca gag ggc agg cca tgc cct tat ccg cac tgc cag gtg ctg tcg      2786
Thr Ala Glu Gly Arg Pro Cys Pro Tyr Pro His Cys Gln Val Leu Ser
                755                 760                 765
gcc cag cct ggc tca gag gag gaa ctc gag gag ctg tgt gaa cag gct      2834
Ala Gln Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala
            770                 775                 780
gtg tga gatgttcagg cctagctcca accaagagtg tgctccagat gtgtttgggc       2890
Val
cctacctggc acagagtcct gctcctggga aaggaaagga ccacagcaaa caccattctt    2950
tttgccgtac ttcctagaag cactggaaga ggactggtga tggtggaggg tgagagggtg    3010
ccgtttcctg ctccagctcc agaccttgtc tgcagaaaac atctgcagtg cagcaaatcc    3070
atgtccagcc aggcaaccag ctgctgcctg tggcgtgtgt gggctggatc ccttgaaggc    3130
tgagtttttg agggcagaaa gctagctatg ggtagccagg tgttacaaag gtgctgctcc    3190
ttctccaacc cctacttggt ttccctcacc ccaagcctca tgttcatacc agccagtggg    3250
ttcagcagaa cgcatgacac cttatcacct ccctccttgg gtgagctctg aacaccagct    3310
ttggcccctc cacagtaagg ctgctacatc aggggcaacc ctggctctat cattttcctt    3370
ttttgccaaa aggaccagta gcataggtga gccctgagca ctaaaaggag gggtccctga    3430
agctttccca ctatagtgtg gagttctgtc cctgaggtgg gtacagcagc cttggttcct    3490
ctgggggttg agaataagaa tagtggggag ggaaaaactc ctccttgaag atttcctgtc    3550
tcagagtccc agagaggtag aaaggaggaa tttctgctgg actttatctg ggcagaggaa    3610
ggatggaatg aaggtagaaa aggcagaatt acagctgagc ggggacaaca aagagttctt    3670
ctctgggaaa agttttgtct tagagcaagg atggaaaatg gggacaacaa aggaaaagca    3730
aagtgtgacc cttgggtttg gacagcccag aggcccagct ccccagtata agccatacag    3790
gccagggacc cacaggagag tggattagag cacaagtctg gcctcactga gtggacaaga    3850
gctgatgggc ctcatcaggg tgacattcac cccagggcag cctgaccact cttggcccct    3910
caggcattat cccatttgga atgtgaatgt ggtggcaaag tgggcagagg accccacctg    3970
ggaacctttt tccctcagtt agtggggaga ctagcaccta ggtacccaca tgggtattta    4030
tatctgaacc agacagacgc ttgaatcagg cactatgtta agaaatatat ttatttgcta    4090
atatatttat ccacaaacag gcactatgtt aagaaatata tttatttgct aatatattta    4150
tccacaaatg tggtctggtc ttgtggtttt gttctgtcgt gactgtcact cagggtaaca    4210
acgtcatctc tttctacatc aagagaagta aattatttat gttatcagag gctaggctcc    4270
gattcatgaa aggatagggt agagtagagg gcttggcaat aagaactggt ttgtaagccc    4330
ctaaaagtgt ggcttagtga gatcagggaa ggagaaagca tgactggatt cttactgtgc    4390
ttcagtcatt attattatac tgttcacttc acacattatc atacttcagt gactcagacc    4450
ttgggcaaat actctgtgcc tcgctttttc agtccataaa atgggcctac ttaatagttg    4510
ttgcaggact tacatgagat aatagagtgt agaaaatatg ttccaaagtg gaaagtttta    4570
ttcatgtgat agaaaacatc caaacctgtc acagagccca tctgaacaca gcatgggacc    4630
gccaacaaga agaaagcccg cccggaagca gctcaatcag gaggctgggc tggaatgaca    4690
gcgcagcggg gcctgaaact atttatatcc caaagctcct ctcagataaa cacaaatgac    4750
tgcgttctgc ctgcactcgg gctattgcga ggacagagag ctggtgctcc attggcgtga    4810
agtctccagg gccagaaggg gcctttgtcg cttcctcaca aggcacaagt tccccttctg    4870
cttccccgag aaaggtttgg taggggtggt ggtttagtgc ctatagaaca aggcatttcg    4930
cttcctagac ggtgaaatga aagggaaaaa aaggacacct aatctcctac aaatggtctt    4990
tagtaaagga accgtgtcta agcgctaaga actgcgcaaa gtataaatta tcagccggaa    5050
cgagcaaaca gacggagttt taaaagataa atacgcattt ttttccgccg tagctcccag    5110
gccagcattc ctgtgggaag caagtggaaa ccctatagcg ctctcgcagt taggaaggag    5170
gggtggggct gtcgctggat ttcttctcgg tctctgcaga gacaatccag agggagacag    5230
tggattcact gcccccaatg cttctaaaac ggggagacaa aacaaaaaaa aacaaacttc    5290
cgggttacca tcggggaaca ggaccgacgc ccagggccac cagccccctc gtgcc         5345
<210>6
<211>783
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Met Ser Gly Gly His Gln Leu Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp Leu
1               5                   10                  15
Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala Ile Ile
        35                  40                  45
Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn Leu Thr
    50                  55                  60
Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Ile Thr Pro Ala Glu Gly
65                  70                  75                  80
Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser Asp Asp
                85                  90                  95
Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu Ser Pro
            100                 105                 110
Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met
        115                 120                 125
Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr Glu Asp
    130                 135                 140
Arg Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr Trp Pro
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu Phe Val
                165                 170                 175
Tyr Lys Asn Gln Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu Pro Pro
            180                 185                 190
Ala Trp Pro Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val Gly Thr
        195                 200                 205
Ile Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys Arg Pro
    210                 215                 220
Arg His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gln Gln Arg Thr Ala Trp Ala Ile
225                 230                 235                 240
Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln Ala Arg
                245                 250                 255
Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro Val Cys
            260                 265                 270
Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg Val Ile
        275                 280                 285
Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp Pro Trp Leu His
    290                 295                 300
Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Val Phe Asn Ile Thr Glu Gly Asp
305                 310                 315                 320
Ser Phe Ser Gln Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Tyr Gln Glu Pro Gly
                325                 330                 335
Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His Tyr His
            340                 345                 350
Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val Ala Arg
        355                 360                 365
Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Gly Met Gly
    370                 375                 380
Pro Arg His His Arg Phe Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Ala Gln His Pro Tyr Ala Gln Gly Trp
                405                 410                 415
Gly Met Ser His Leu Gln Ser Thr Ser Gln His Pro Ala Ala Cys Pro
            420                 425                 430
Val Pro Leu Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser Gly Glu
        435                 440                 445
Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro Ala Ser
    450                 455                 460
Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser Val Val
465                 470                 475                 480
Asn Cys Thr Asp Ile Ser Leu Gln Gly Val His Gly Ser Ser Ser Thr
                485                 490                 495
Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr Cys Ser
            500                 505                 510
Pro Lys Gly Asp Pro Gln Arg Val Asp Met Gln Pro Ser Val Thr Ser
        515                 520                 525
Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly Glu Thr Gln Val
    530                 535                 540
Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr Lys Lys
545                 550                 555                 560
Arg Phe Gln Trp His Gly Arg Lys Pro Gly Pro Glu Thr Gly Val Pro
                565                 570                 575
Gln Ser Arg Pro Pro Ile Pro Arg Thr Gln Pro Gln Pro Glu Pro Pro
            580                 585                 590
Ser Pro Asp Gln Gln Val Thr Gly Ser Asn Ser Ala Ala Pro Ser Gly
        595                 600                 605
Arg Leu Ser Asn Pro Gln Cys Pro Arg Ala Leu Pro Glu Pro Ala Pro
    610                 615                 620
Gly Pro Val Asp Ala Ser Ser Ile Cys Pro Ser Thr Ser Ser Leu Phe
625                 630                 635                 640
Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu Ser Ala Arg His Pro Gln Arg Lys Arg
                645                 650                 655
Arg Gly Gly Pro Ser Glu Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Gln Asp Ala
            660                 665                 670
Thr Val His Pro Ala Cys Gln Ile Phe Pro His Tyr Thr Pro Ser Val
        675                 680                 685
Ala Tyr Pro Trp Ser Pro Glu Ala His Pro Leu Ile Cys Gly Pro Pro
    690                 695                 700
Gly Leu Asp Lys Arg Leu Leu Pro Glu Thr Pro Gly Pro Cys Tyr Ser
705                 710                 715                 720
Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gln Pro Leu Glu
                725                 730                 735
Pro His Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp Thr Ala
            740                 745                 750
Glu Gly Arg Pro Cys Pro Tyr Pro His Cys Gln Val Leu Ser Ala Gln
        755                 760                 765
Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala Val
    770                 775                 780
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>7
acaacagcct caagatcatc ag                                      22
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>8
ggtccaccac tgacacgttg                                         20
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>9
agctgagaca tttgttctct tg                                      22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>10
tataaaccag ctgagtccag ag                                      22
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>11
ttcccgatat caacatctac cag                                     23
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>12
agtgtgtgac ctcaataagg cat                                     23
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>13
caggctttgg acgcacagga ctggtac                                      27
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>14
ctttgtgatc atcctggctt cggtgct                                      27
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>15
ggttgagatt taagttctca aa                                           22
<210>16
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>16
agttaagctt gccgggatga cttctcagcg ttcccctctg g                      41
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>17
atctcgagta ccaaggaccc ggcccgactc tg                                32
<210>18
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>18
gcggatccag gatggctgct gcagctcctc caag                     34
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>19
tagaattctt aaagaactta atctccgtgt caacac                   36
<210>20
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>20
tgcagatctg cagctggtag catgagtggt g                        31
<210>21
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>21
gaggagctgt gtgaacaggc tgtgtgagat gt                       32
<210>22
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>22
tctgcacggt gagtag                                         16
<210>23
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>23
ctactcaccg tgcaga                                         16
<210>24
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>24
ttctgtaggt gttgca                                            16
<210>25
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>25
tgcaacacct acagaa                                            16
<210>26
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>26
cttttcagga tggctg                                            16
<210>27
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>27
cagccatcct gaaaag                                            16
<210>28
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>28
aggttgaggt aagccg                                            16
<210>29
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>29
cggcttacct caacct                                            16
<210>30
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>30
tggtagcatg agtggt                                    16
<210>31
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的S-寡核苷酸
<400>31
accactcatg ctgcca                                    16
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>32
tggtagccaa gtgcaggtta ta                             22
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>33
ccaaagggtt tctgcagttt ca                             22
<210>34
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>34
tgcggatcca gagcagattg tactgagagt                     30
<210>35
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>35
ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca                      29
<210>36
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>36
tttaagcttg aagaccatttt tggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaac                47
<210>37
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>37
tttaagcttg aagacatggg aaagagtggt ctca                              34
<210>38
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸序列
<400>38
caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c          51
<210>39
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的寡核苷酸序列
<400>39
aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c           51
<210>40
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>40
tcccgtcacc ggatccaact cagttcaaga gactgagttg gatccggtga c           51
<210>41
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>41
aaaagtcacc ggatccaact cagtctcttg aactgagttg gatccggtga c            51
<210>42
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>42
tcccgctatt gcacagaacg cagttcaaga gactgcgttc tgtgcaatag c            51
<210>43
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>43
aaaagctatt gcacagaacg cagtctcttg aactgcgttc tgtgcaatag c            51
<210>44
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>44
tccccagaaa gctgttatca gagt tcaaga gactctgata acagctttct g           51
<210>45
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>45
aaaacagaaa gctgttatca gagtctcttg aactctgata acagctttct g            51
<210>46
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>46
tccctgagcc acctccaatc cacttcaaga gagtggattg gaggtggctc a            51
<210>47
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>47
aaaatgagcc acctccaatc cactctcttg aagtggattg gaggtggctc a            51
<210>48
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>48
tcccctgcac ggacatcagc ctattcaaga gataggctga tgtccgtgca g            51
<210>49
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>49
aaaactgcac ggacatcagc ctatctcttg aataggctga tgtccgtgca g            51
<210>50
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>50
tcccgtgtca gagagccctg ggattcaaga gatcccaggg ctctctgaca c            51
<210>51
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>51
aaaagtgtca gagagccctg ggatctcttg aatcccaggg ctctctgaca c            51
<210>52
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>52
tccccctcaa tgtcatttgg atgttcaaga gacatccaaa tgcaattgag g            51
<210>53
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>53
aaaacctcaa tgtcatttgg atgtctcttg aacatccaaa tgcaattgag g            51
<210>54
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>54
tccctgtcat ttggatggtc actttcaaga gaagtgacca tccaaatgac a            51
<210>55
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>55
aaaatgtcat ttggatggtc acttctcttg aaagtgacca tccaaatgac a            51
<210>56
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>56
tccctgccaa ccaacctgaa cagttcaaga gactgttcag gttggttggc a            51
<210>57
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>57
aaaatgccaa ccaacctgaa cagtctcttg aactgttcag gttggttggc a            51
<210>58
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>58
tcccccaacc tgaacaggtc atcttcaaga gagatgacct gttcaggttg g            51
<210>59
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>59
aaaaccaacc tgaacaggtc atctctcttg aagatgacct gttcaggttg g            51
<210>60
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>60
tccccctgaa caggtcatcc tgtttcaaga gaacaggatg acctgttcag g            51
<210>61
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>61
aaaacctgaa caggtcatcc tgttctcttg aaacaggatg acctgttcag g            51
<210>62
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>62
tccccaggtc atcctgtatc aggttcaaga gacctgatac aggatgacct g            51
<210>63
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>用于siRNA的人工合成的寡核苷酸
<400>63
aaaacaggtc atcctgtatc aggtctcttg aacctgatac aggatgacct g            51
<210>64
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>64
gaagatctgc agcggtggag tctgaaag                            28
<210>65
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>65
ggaattcgga ctgggaaaat gaatctccct c                        31
<210>66
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>66
ggagatctcc tgatcagcaa gtcacc                              26
<210>67
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>67
ggaattccac agcctgttca cacagctcct c                        31
<210>68
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>68
gcggatccag gatggctgca gctcctccaa g                        31
<210>69
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>69
ctgaattcac ttaaagaact taatctccgt gtcaacac                 38
<210>70
<211>10
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>70
cccgggatga                                            10
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>71
Ser Tyr Gln Glu Pro Gly Arg Arg Leu
1               5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>72
His Tyr His Leu Pro Ala Ala Tyr Leu
1               5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>73
Leu Phe Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu
1               5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>74
Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu
1               5
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>75
Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln Ala
1               5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>76
Arg Ala Pro Gly Glu Gln Gln Arg Leu
1               5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>77
Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu
1               5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>78
Arg Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu
1               5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>79
Lys Ala Val Ile Arg Val Ile Pro Leu
1               5
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>80
Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu
1               5
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>81
Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu
1               5                   10
<210>82
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>82
His Tyr His Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu
1               5                   10
<210>83
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>83
Cys Tyr Ser Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu
1               5                   10
<210>84
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>84
Ile Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu
1               5                   10
<210>85
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>85
Val Phe Asn Ile Thr Glu Gly Asp Ser Phe
1               5                   10
<210>86
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>86
Thr Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe
1               5                   10
<210>87
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>87
Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu
1               5                   10
<210>88
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>88
Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn Leu
1               5                   10
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>89
His Tyr Thr Pro Ser Val Ala Tyr Pro Trp
1               5                   10
<210>90
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>90
Gly Gln Glu Leu Arg Val Ile Ser Cys Leu
1               5                   10
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>91
Asn Phe Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu
1               5
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>92
Asn Tyr Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu
1               5
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>93
Lys Leu Asn Leu Thr Leu Glu Gly Val
1               5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>94
Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp Leu
1               5
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>95
Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu
1               5
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>96
Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val
1               5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>97
Ala Leu Trp Pro Trp Leu Leu Met Ala
1               5
<210>98
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>98
Trp Leu Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala
1               5
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>99
Trp Ile Leu Met Thr Val Val Gly Thr
1               5
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>100
Lys Leu Met Glu Phe Val Tyr Lys Asn
1               5
<210>101
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>101
Asn Leu Thr Leu Glu Gly Val Phe Ala
1               5
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>102
Gly Leu Thr Trp Pro Val Val Leu Ile
1               5
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>103
Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val
1               5                   10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>104
Leu Met Thr Val Val Gly Thr Ile Phe Val
1               5                   10
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>105
Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val
1               5                   10
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>106
Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val
1               5                   10
<210>107
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>107
Gln Leu Ala Ala Ile Trp Pro Trp Leu Leu
1               5                   10
<210>108
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>108
Ala Leu Trp Pro Trp Leu Leu Met Ala Thr
1               5                   10
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>109
Leu Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp Leu
1               5                   10
<210>110
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>110
Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gln Pro Leu
1               5                   10
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>111
Trp Leu His Gln His Arg Thr Cys Pro Leu
1               5                   10
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>112
gtcaccggat ccaactcagt                                  20
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>113
gctattgcac agaacgcagt                                  20
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA的人工合成靶序列
<400>114
caggtcatcc tgtatcaggt                                  20
<210>115
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>115
Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr
1               5
<210>116
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>116
Leu Leu Leu Leu Ser Leu His Gly Val
1               5
<210>117
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>117
Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val
1               5
<210>118
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>118
Trp Met Val Thr Pro Leu Ser Asn Ala
1               5
<210>119
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>119
Cys Leu Val Asn Asn Leu Pro Asp Ile
1               5
<210>120
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>120
Ser Leu His Gly Val Ala Ala Ser Leu
1               5
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>121
Val Ile Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu
1               5
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>122
Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met
1               5
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>123
Ala Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr
1               5
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>124
Ala Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys
1               5
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>125
Val Met Ser Arg Ser Asn Gly Ser Val
1               5
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>126
Ser Ile Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu
1               5
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>127
Lys Val His Arg Asn Thr Asp Ser Val
1               5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>128
Arg Ile Gly Ala Val Pro Val Met Val
1               5
<210>129
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>129
Asn Ile Gly Val Thr Gly Leu Thr Val
1               5
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>130
Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu
1               5
<210>131
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>131
Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile
1               5
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>132
Leu Leu Ser Leu His Gly Val Ala Ala
1               5
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>133
Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu Ile Leu
1               5
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>134
Thr Met Pro Ala Thr Asn Val Ser Ile
1               5
<210>135
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>135
Tyr Leu Trp Glu Lys Leu Asp Asn Thr Leu
1               5                   10
<210>136
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>136
Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met Val
1               5                   10
<210>137
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>137
Ala Leu Ser Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val
1               5                   10
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>138
Ala Leu Ile Asn Leu Asn Val Ile Trp Met
1               5                   10
<210>139
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>139
Ile Leu Leu Cys Ser Ser Glu Glu Gly Ile
1               5                   10
<210>140
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>140
Val Leu Pro Cys Thr Phe Thr Thr Ser Ala
1               5                   10
<210>141
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>141
Leu Leu Leu Ser Leu His Gly Val Ala Ala
1               5                   10
<210>142
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>142
Ser Ile Tyr Ala Asn Gly Thr His Leu Val
1               5                   10
<210>143
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>143
Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Gln Cys
1               5                   10
<210>144
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>144
Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ala Ser Asn Ala
1               5                   10
<210>145
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>145
Pro Leu Leu Leu Leu Ser Leu His Gly Val
1               5                   10
<210>146
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>146
Ile Gln Val Ala Arg Gly Gln Pro Ala Val
1               5                   10
<210>147
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>147
Phe Ile Asn Asn Thr Gln Leu Ser Asp Thr
1               5                   10
<210>148
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>148
Leu Val Pro Gly Gln His Lys Thr Leu Val
1               5                   10
<210>149
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>149
Asn Leu Pro Asp Ile Gly Gly Arg Asn Ile
1               5                   10
<210>150
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>150
Val Leu Val Pro Pro Ser Ala Pro His Cys
1               5                   10
<210>151
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>151
Ala Val Ile Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu
1               5                   10
<210>152
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>152
Val Ile Ile Ile Phe Cys Ile Ala Leu Ile
1               5                   10
<210>153
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>153
Ile Leu Gly Ala Phe Phe Tyr Trp Arg Ser
1               5                   10
<210>154
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>154
Gly Leu Thr Val Leu Val Pro Pro Ser Ala
1               5                   10
<210>155
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>155
Ser Ile Phe Lys Pro Phe Ile Phe Val
1               5
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>156
Trp Leu Trp Gly Ala Glu Met Gly Ala
1               5
<210>157
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>157
Ile Met Ile Ser Arg Pro Ala Trp Leu
1               5
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>158
Leu Leu Gly Met Asp Leu Val Arg Leu
1               5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>159
Phe Ile Phe Val Asp Asp Val Lys Leu
1               5
<210>160
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>160
Val Cys Ile Asp Ser Glu Phe Phe Leu
1               5
<210>161
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>161
Lys Pro Phe Ile Phe Val Asp Asp Val
1               5
<210>162
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>162
Ile Val Asp Arg Asp Glu Ala Trp Val
1               5
<210>163
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>163
Thr Leu Arg Asp Lys Ala Ser Gly Val
1               5
<210>164
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>164
Lys Met Asp Ala Glu His Pro Glu Leu
1               5
<210>165
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>165
Ala Leu Asp Val Ile Val Ser Leu Leu
1               5
<210>166
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>166
Tyr Ala Gln Ser Gln Gly Trp Trp Thr
1               5
<210>167
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>167
Lys Leu Arg Ser Thr Met Leu Glu Leu
1               5
<210>168
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>168
Tyr Leu Ile Val Asp Arg Asp Glu Ala
1               5
<210>169
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>169
Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val
1               5
<210>170
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>170
Gly Met Asp Leu Val Arg Leu Gly Leu
1               5
<210>171
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>171
Lys Val Thr Glu Gly Val Arg Cys Ile
1               5
<210>172
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>172
Cys Ile Asp Ser Glu Phe Phe Leu Thr
1               5
<210>173
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>173
Thr Val Gln Thr Met Met Asn Thr Leu
1               5
<210>174
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>174
Glu Met Gly Ala Asn Glu His Gly Val
1               5
<210>175
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>175
Phe Ile Phe Val Asp Asp Val Lys Leu Val
1               5                   10
<210>176
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>176
Leu Ile Val Asp Arg Asp Glu Ala Trp Val
1               5                   10
<210>177
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>177
Phe Leu Thr Thr Ala Ser Gly Val Ser Val
1               5                   10
<210>178
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>178
Thr Met Leu Glu Leu Glu Lys Gln Gly Leu
1               5                   10
<210>179
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>179
Ala Leu Leu Gly Met Asp Leu Val Arg Leu
1               5                   10
<210>180
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>180
Ala Ile Met Ile Ser Arg Pro Ala Trp Leu
1               5                   10
<210>181
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>181
Gly Val Cys Ile Asp Ser Glu Phe Phe Leu
1               5                   10
<210>182
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>182
Lys Leu Val Pro Lys Thr Gln Ser Pro Cys
1               5                   10
<210>183
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>183
Phe Asn Phe Ser Glu Val Phe Ser Pro Val
1               5                   10
<210>184
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>184
Tyr Ile Ser Ile Asp Gln Val Pro Arg Thr
1               5                   10
<210>185
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>185
Gly Glu Gly Glu Phe Asn Phe Ser Glu Val
1               5                   10
<210>186
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>186
Trp Ala Ala Glu Lys Val Thr Glu Gly Val
1               5                   10
<210>187
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>187
Val Leu Pro Gln Asn Arg Ser Ser Pro Cys
1               5                   10
<210>188
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>188
Ala Ala Ala Pro Pro Ser Tyr Cys Phe Val
1               5                   10
<210>189
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>189
Thr Met Met Asn Thr Leu Arg Asp Lys Ala
1               5                   10
<210>190
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>190
Glu Val Gly Asp Leu Phe Tyr Asp Cys Val
1               5                   10
<210>191
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>191
Ala Glu Met Gly Ala Asn Glu His Gly Val
1               5                   10
<210>192
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>192
Gly Leu Val Val Phe Gly Lys Asn Ser Ala
1               5                   10
<210>193
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>193
Gln Leu Ser Leu Thr Thr Lys Met Asp Ala
1               5                   10
<210>194
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的肽序列
<400>194
Arg Ser Ile Phe Lys Pro Phe Ile Phe Val
1               5                   10

Claims (36)

1.选自下列的基本上纯的多肽：
(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由SEQ ID NO：2，4或6中任一氨基酸序列组成的多肽等同的生物活性。
2.分离的多核苷酸，其编码权利要求1的多肽。
3.载体，其含有权利要求2的多核苷酸。
4.宿主细胞，其携有权利要求2的多核苷酸或权利要求3的载体。
5.产生权利要求1的多肽的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)培养权利要求4的宿主细胞；
(b)使宿主细胞表达所述多肽；和
(c)收集所表达的多肽。
6.抗体，其与权利要求1的多肽结合。
7.多核苷酸，它与权利要求2的多核苷酸或其互补链互补，并且含有至少15个核苷酸。
8.反义多核苷酸或小的干扰RNA，其针对权利要求2的多核苷酸。
9.权利要求8的反义多核苷酸，其选自含有核苷酸序列SEQ ID NO：23，25，27，29或31的核苷酸。
10.权利要求8的小的干扰RNA，其有义链选自含有核苷酸序列SEQID NO：112，113和114的核苷酸。
11.诊断细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)检测样本的生物样品中编码氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6的基因的表达水平；和
(b)将对表达水平的评价与疾病相关联。
12.权利要求11的方法，其用选自下列的任一种方法检测表达水平：
(a)检测编码氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6的mRNA；
(b)检测含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6的蛋白质；和
(c)检测含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6的蛋白质的生物活性。
13.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步骤：
(a)使受试化合物与选自下列的多肽接触：
(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(3)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性；
(b)检测所述多肽与受试化合物之间的结合活性；和
(c)选择与所述多肽结合的化合物。
14.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步骤：
(a)使候选化合物与表达一或多种由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸的细胞接触；和
(b)选择与缺乏受试化合物时检测到的表达水平相比，能降低一或多种由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸的表达水平的化合物。
15.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步骤：
(a)使受试化合物与选自下列的多肽接触：
(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(3)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性；
(b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和
(c)选择与缺乏受试化合物时检测到的生物活性相比，能抑制所述多肽生物活性的化合物。
16.权利要求15的方法，其中生物活性是细胞-增殖活性。
17.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步骤：
(a)在受试化合物的存在下，使选自下列的多肽与AIP1接触：
(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2；
(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：2组成的蛋白质等同的生物活性；和
(3)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：2组成的多肽等同的生物活性；
(b)检测所述多肽与AIP1之间的结合；和
(c)选择能抑制所述多肽与AIP1之间的结合的受试化合物。
18.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步骤：
(a)在受试化合物存在的条件下，使选自下列的多肽与NOTCH2或STRIN接触：
(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：6；
(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(3)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：6组成的多肽等同的生物活性；
(b)检测多肽与NOTCH2或STRIN之间的结合；和
(c)选择能抑制多肽与NOTCH2或STRIN之间的结合的受试化合物。
19.筛选治疗细胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步骤：
a)使候选化合物与已导入载体的细胞接触，所述载体含有一或多种标记基因的转录调节区和在转录调节区控制之下表达的报道基因，其中一或多种标记基因含有选自SEQ ID NO：1，3或5任一的核苷酸序列，
b)测定所述报道基因的活性；和
c)选择与对照相比能降低所述报道基因的表达水平的化合物。
20.权利要求11至19中任一项的方法，其中细胞-增殖性疾病是癌症。
21.治疗细胞增殖性疾病的组合物，所述组合物含有药物有效量的针对编码选自下列之多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为活性成分并含有可药用载体：
(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
22.治疗细胞增殖性疾病的组合物，所述组合物含有药物有效量的抗选自下列之多肽的抗体作为活性成分并含有可药用载体：
(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
23.治疗细胞增殖性疾病的组合物，所述组合物含有药物有效量的通过权利要求13至19任一方法选择的化合物作为活性成分并含有可药用载体。
24.权利要求21至23之一的组合物，其中细胞增殖性疾病是癌症。
25.治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的针对编码选自下列之多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA的步骤：
(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
26.治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的抗选自下列之多肽的抗体的步骤：
(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
27.治疗细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用药物有效量的通过权利要求13至19中任一项的方法选择的化合物的步骤。
28.权利要求25至27中任一项的组合物，其中细胞增殖性疾病是癌症。
29.治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用药物有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码所述多肽的多核苷酸的步骤：
(a)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽或其片段，所述多肽由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
30.权利要求29的治疗或预防癌症的方法，其中所述多肽选自含有氨基酸序列SEQ ID NO：80，97，108，124和164的多肽。
31.诱导抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括，使选自(a)-(c)的多肽与抗原呈递细胞接触，或将编码所述多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞的步骤：
(a)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽或其片段，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
32.权利要求31的诱导抗肿瘤免疫力的方法，其中所述多肽选自含有氨基酸序列SEQ ID NO：80，97，108，124和164的多肽。
33.权利要求31的诱导抗肿瘤免疫力的方法，其中所述方法还包括给受试者施用抗原呈递细胞的步骤。
34.治疗或预防癌症的药物组合物，所述组合物含有药物有效量的选自(a)-(c)的多肽或编码所述多肽的多核苷酸作为活性成分并含有可药用载体：
(a)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6；
(b)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6且其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的蛋白质等同的生物活性；和
(c)多肽或其片段，其由能在严紧条件下与由核苷酸序列SEQ ID NO：1，3或5组成的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，其中所述多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2，4或6组成的多肽等同的生物活性。
35.权利要求33的药物组合物，其含有药物有效量的含有选自氨基酸序列SEQ ID NO：80，97，108，124和164的多肽。
36.权利要求34的药物组合物，其中多核苷酸被掺入表达载体。
CN200910165163A 2002-06-06 2003-06-03 与人结肠癌相关的基因和多肽 Pending CN101613405A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38698502P 2002-06-06 2002-06-06
US60/386,985 2002-06-06
US60/415,209 2002-09-30
US60/451,013 2003-02-28

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB038189437A Division CN100532549C (zh) 2002-06-06 2003-06-03 与人结肠癌相关的基因和多肽

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101613405A true CN101613405A (zh) 2009-12-30

Family

ID=29736242

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910165163A Pending CN101613405A (zh) 2002-06-06 2003-06-03 与人结肠癌相关的基因和多肽
CN200910165164A Pending CN101613406A (zh) 2002-06-06 2003-06-03 与人结肠癌相关的基因和多肽
CNA200910133014XA Pending CN101533029A (zh) 2002-06-06 2003-06-04 与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽
CNA038189429A Pending CN1675360A (zh) 2002-06-06 2003-06-04 与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽
CNA2009101330154A Pending CN101532060A (zh) 2002-06-06 2003-06-04 与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910165164A Pending CN101613406A (zh) 2002-06-06 2003-06-03 与人结肠癌相关的基因和多肽
CNA200910133014XA Pending CN101533029A (zh) 2002-06-06 2003-06-04 与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽
CNA038189429A Pending CN1675360A (zh) 2002-06-06 2003-06-04 与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽
CNA2009101330154A Pending CN101532060A (zh) 2002-06-06 2003-06-04 与肝细胞癌或结直肠癌相关的基因和多肽

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20060019252A1 (zh)
EP (1) EP1532245B1 (zh)
JP (2) JP2006505247A (zh)
KR (1) KR20060069207A (zh)
CN (5) CN101613405A (zh)
AU (1) AU2003240221A1 (zh)
CA (1) CA2488621A1 (zh)
ES (1) ES2361541T3 (zh)
SI (1) SI1513934T1 (zh)
WO (1) WO2003104276A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104302782A (zh) * 2012-02-28 2015-01-21 诺华股份有限公司 利用rnf43突变状态选择wnt信号转导抑制剂给药的癌症患者
CN106714831A (zh) * 2014-04-21 2017-05-24 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新的抗‑rnf43抗体和使用方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006141297A (ja) * 2004-11-19 2006-06-08 Eiken Chem Co Ltd 血管新生を検出するためのマーカー
DK2325306T3 (en) 2005-02-25 2014-03-03 Oncotherapy Science Inc Peptide vaccines against lung cancers expressing TTK, URLC10 or KOC1 polypeptide
WO2007127002A2 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Cell Signaling Technology, Inc. Protein markers of responsiveness to type iii receptor tyrosine kinase inhibitors
JP2007282591A (ja) * 2006-04-19 2007-11-01 Yamaguchi Univ スタスミンチップ及びこれを用いたスタスミン結合タンパク質の検出方法
JP2010521180A (ja) * 2007-03-14 2010-06-24 ノバルティス アーゲー 癌を処置、診断または検出するためのａｐｃｄｄ１阻害剤
WO2010051534A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for apcdd1 mediated regulation of hair growth and pigmentation and mutants thereof
TWI500932B (zh) 2008-12-05 2015-09-21 Oncotherapy Science Inc Ｗｄｒｐｕｈ抗原決定位胜肽以及含此胜肽之疫苗
WO2010093066A1 (en) * 2009-02-10 2010-08-19 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University Ppia marker for diagnosis of liver cancer and antibody, and screening method of compounds useful for inhibiting liver cancer
US8372819B2 (en) * 2010-04-11 2013-02-12 Salk Institute For Biological Studies Methods and compositions for targeting skip
CA2805270C (en) * 2010-06-04 2021-03-09 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Treatment of inflammatory disorders
WO2012019061A2 (en) * 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
EP2757157A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-23 Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) Modulation of mitophagy and use thereof
US11097005B2 (en) 2014-12-15 2021-08-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Use of cadherin-11 antagonists to treat metabolic disorders and/or increase insulin sensitivity
KR102429243B1 (ko) 2018-03-13 2022-08-05 엘지전자 주식회사 냉장고
JP7220515B2 (ja) 2018-03-27 2023-02-10 フクシマガリレイ株式会社 冷蔵庫
CN109293746A (zh) * 2018-09-20 2019-02-01 山西医科大学 一种多肽、多肽组合物在治疗结肠癌中的应用
CN109320592A (zh) * 2018-09-20 2019-02-12 山西医科大学 用于治疗结肠癌的多肽、多肽组合物及其应用
KR102073144B1 (ko) * 2018-12-13 2020-02-04 주식회사 엘베이스 올리고펩티드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN112980951A (zh) * 2021-02-01 2021-06-18 深圳市人民医院 线粒体蛋白slc25a24在结直肠癌诊断、预后判断中的应用
CN117069821A (zh) * 2023-07-14 2023-11-17 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 靶向人pkm1蛋白的nudt13多肽及其在制备药物中的应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993002227A1 (en) 1991-07-15 1993-02-04 Eco-Tec Limited Process and apparatus for treating fluoride containing acid solutions
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5285485A (en) 1993-02-01 1994-02-08 General Electric Company Composite nuclear fuel container and method for producing same
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1090118A2 (en) 1998-06-26 2001-04-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human signal peptide-containing proteins
CA2361743A1 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Michael G. Walker Genes associated with diseases of the colon
WO2001009345A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Nouveaux genes codant des proteines kinase et des proteines phosphatase
US6908748B2 (en) * 1999-07-29 2005-06-21 Kenji Sobue Genes associated with the maintenance of differentiation of smooth muscle cells
WO2001009316A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Nouveaux genes codant la proteine kinase / proteine phosphatase
WO2001009318A1 (fr) * 1999-07-29 2001-02-08 Helix Research Institute Genes associes au cancer du foie
CA2492070A1 (en) * 1999-12-01 2001-06-07 Kevin P. Baker Lung tumor marker pro4329 polypeptides and nucleic acids encoding the same
CN1170848C (zh) * 2000-04-17 2004-10-13 上海市肿瘤研究所 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列
EP1513934B1 (en) 2002-06-06 2011-03-02 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to human colon cancers

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104302782A (zh) * 2012-02-28 2015-01-21 诺华股份有限公司 利用rnf43突变状态选择wnt信号转导抑制剂给药的癌症患者
CN106714831A (zh) * 2014-04-21 2017-05-24 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新的抗‑rnf43抗体和使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1532245B1 (en) 2014-12-31
CN1675360A (zh) 2005-09-28
WO2003104276A3 (en) 2005-03-31
US20100291567A1 (en) 2010-11-18
CN101533029A (zh) 2009-09-16
JP2009278976A (ja) 2009-12-03
AU2003240221A8 (en) 2003-12-22
JP2006505247A (ja) 2006-02-16
WO2003104276A9 (en) 2004-05-27
US20080207549A1 (en) 2008-08-28
CN101613406A (zh) 2009-12-30
US20060019252A1 (en) 2006-01-26
WO2003104276A2 (en) 2003-12-18
JP5167464B2 (ja) 2013-03-21
CN101532060A (zh) 2009-09-16
EP1532245A2 (en) 2005-05-25
KR20060069207A (ko) 2006-06-21
AU2003240221A1 (en) 2003-12-22
US8124341B2 (en) 2012-02-28
SI1513934T1 (sl) 2011-06-30
ES2361541T3 (es) 2011-06-17
CA2488621A1 (en) 2003-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100532549C (zh) 与人结肠癌相关的基因和多肽
CN100434439C (zh) 与人髓细胞白血病相关的基因和多肽
CN101613405A (zh) 与人结肠癌相关的基因和多肽
CN1703524B (zh) 与人胰腺癌相关的基因和多肽
CN101068935B (zh) 与乳腺癌相关的基因和多肽
KR20050067409A (ko) 전립선암에 관련된 유전자 및 폴리펩티드
CN101278060B (zh) 作为乳腺癌标志的基因galnt6和针对基因galnt6的小干扰rna
TWI324608B (en) Genes and polypeptides relating to human colorectal cancers

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20091230