JP2007282591A - スタスミンチップ及びこれを用いたスタスミン結合タンパク質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明は、タンパク質−タンパク質間相互作用を網羅的に解析するための手段を提供することを課題とするものであり、特に、プロテオーム解析において重要となる「細胞がある状態で特異的に発現しているタンパク質」を正確かつ効率的に検出する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
上記課題の解決手段として、チューブリン結合タンパク質として知られるスタスミンを本体とし、その両末端にヒスチジンタグとシステインタグを含む人工タンパク質からなるチップを提供する。ヒスチジンタグはＮｉと結合する性質を利用してチップの精製に用い、システインタグは表面にマレイミド基を露出させたマレイミド基板に特異的に結合する性質を利用してチップの固定化に用いるものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質−タンパク質間相互作用を検出するための方法に関し、詳しくは、スタスミンを有効成分とし、システインタグ（本出願において「システインタグ」とは、数残基の、好ましくは５または６残基のシステインからなるオリゴペプチドであって、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にペプチド結合によって結合したものを指す）とヒスチジンタグ（本出願において「ヒスチジンタグ」とは、数残基の、好ましくは５または６残基のヒスチジンからなるオリゴペプチドであって、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にペプチド結合によって結合したものを指す）を含むタンパク質チップを用い、スタスミンが特定のタンパク質と結合する性質を利用して、スタスミン結合性タンパク質（スタスミンに結合する性質をもったタンパク質）を検出する方法に関する。

２００３年にヒト染色体の全ゲノム配列が解読されて以来、次の課題として、ゲノムを構成する全遺伝子の産物である全タンパク質（プロテオーム）の網羅的かつ系統的な解析がスタートした。この解析はプロテオミクスと呼ばれ、ゲノムを構成する全遺伝子の発現を解析するとともに、その産物である全タンパク質の分離同定と定量解析を行い、それらの局在や翻訳後修飾を明らかにする「発現プロテオミクス」と、ゲノムを構成する遺伝子の産物であるタンパク質全ての機能を明らかにする「機能プロテオミクス」の２つの戦略が挙げられる。

プロテオミクスの流れとしては、（１）細胞、組織からタンパク質を抽出し、（２）タンパク質の分離・同定・定量を行い、（３）タンパク質の構造と機能を解析することで、（４）バイオインフォマティクスを利用して解析結果をデータベース化したり、創薬・早期診断など医療現場に応用することなどが考えられる。

この様な網羅的で総合的な生命現象の解析においては、ある細胞がある状態において特異的に発現している産物を検出することが重要である。遺伝子解析の分野では、マイクロアレイ技術を用い、細胞がある状態に特異的に発現している遺伝子を検出する方法が採られている。遺伝子のマイクロアレイにおいては、プローブとなる遺伝子産物を基板上に固定し、これに解析対象の細胞から抽出した遺伝子産物を結合させて化学発光や発色などの手法で検出する。

タンパク質解析分野においても、マイクロアレイと同様にタンパク質−タンパク質間相互作用を利用して、細胞がある状態で特異的に発現するタンパク質を検出する手法も有効である。この課題の解決手段として、従来、抗原抗体反応を利用したタンパク質の特異的検出方法が採られてきた。ここでプローブとなるタンパク質を基板上などに固定化する技術としては、プロテインＡなどを介して抗体を担体と結合させる方法や、ヒスチジンがニッケルと結合する性質を利用し、ヒスチジン数残基からなるタグをプローブとなるタンパク質に結合し、表面にニッケルを露出させた基板や担体を用いた「ヒスチジンタグ」などが開示されている（特許文献１−４，非特許文献１−３）。

これまでの手法はいずれも、個々のタンパク質をターゲットとし、これを特異的に検出するといった手法が中心であったが、プロテオミクスを進めるためには、数多の発現タンパク質を種々の性質に従って「ふるいにかける」ことを可能とする様なプローブの開発が待たれていた。
特開２００５−０３５８９１ タンパク質精製デバイスおよびタンパク質の精製方法 特開２００５−１６４３８８ タンパク質チップおよびそれを用いたバイオセンサー 特開２００５−１７２６３７ ポリペプチドとレセプターとの相互作用を検出する方法、該検出する方法を用いてリガンドまたはリガンド変異体をスクリーニングする方法および該検出する方法を用いる診断方法 特開２００５−５１２０１９ プロテオームチップを用いるタンパク質活性の包括的分析 Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８（２０）：８９７２−６． Ｏｌｓｅｎ Ｊ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３（１）：８２−９２． ＭａｃＢｅａｔｈ Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：７９６７．

本発明は上述の現状に鑑み、タンパク質−タンパク質間相互作用を網羅的に解析するための手段を提供することを目的とするものであり、特に、プロテオーム解析において重要となる「細胞がある状態で特異的に発現しているタンパク質」を正確かつ効率的に検出する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記視点からタンパク質の網羅的な発現解析を行う中で、チューブリン結合タンパク質として発見されたスタスミン（Ｓｔａｔｈｍｉｎ）に着目し、このタンパク質が上記課題を解決するためのプローブとなりうる事実を見出して、本発明を完成した。スタスミンは、様々な細胞外刺激を細胞内で伝達するとともに、細胞増殖に必要な細胞分裂に関わる微小管形成などを調節する極めて重要なリン酸化タンパク質の一種であり、中枢神経の発生や形態形成に重要な役割を果たすことやヒトの白血病細胞で特異的に増加するなど、種々の条件下で異なった調節的役割を演じる事が報告されている。また、細胞内で複数のタンパク質と特異的に結合し、「タンパク質クラスター」を形成することも明らかにされてきている。しかしこれまでは、スタスミンが形成する「タンパク質クラスター」を網羅的に解析する手段が無く、特に超微量で定量解析するためのチップ技術の開発が待たれていた。すなわち本発明は、システインタグを利用し、スタスミンを有効成分とするタンパク質検出用のチップを提供し、またこのチップを用いたスタスミン結合タンパク質の検出方法を提供するものである（図１参照）。

本発明の第１の態様は、スタスミンを有効成分とする、タンパク質検出用チップを提供する。

本発明の第２の態様は、スタスミンと、スタスミンの一方の末端に結合したシステインタグを含むポリペプチドで構成される、請求項１に記載のスタスミン結合性タンパク質の検出用チップを提供する。

本発明の第３の態様は、スタスミンと、スタスミンの一方の末端に結合したシステインタグと、システインタグと反対側の末端に結合したヒスチジンタグを含むポリペプチドで構成される、請求項１に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップを提供する。

本発明の第４の態様は、スタスミンと、スタスミンに結合した検出用の蛍光タンパク質と、Ｃ末端側に結合したシステインタグと、Ｎ末端側に結合したヒスチジンタグを含むポリペプチドで構成される、請求項３に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップを提供する。

本発明の第５の態様は、検出用の蛍光タンパク質がＧＦＰまたはＥＧＦＰである、請求項４に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップを提供する。

本発明の第６の態様は、アミノ酸配列が配列番号１に示す配列かまたはこの一部のアミノ酸を置換して得られる配列であって、Ｎ末端側からヒスチジンタグ、ＥＧＦＰ、スタスミン、システインタグの順にペプチドが結合した、スタスミン結合性タンパク質検出用チップを提供する。

本発明の第７の態様は、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップをコードしたＤＮＡを提供する。

本発明の第８の態様は、塩基配列が配列番号３に示す配列かまたはこの一部の塩基を置換して得られる配列よりなる、スタスミン結合性タンパク質検出用チップをコードしたＤＮＡを提供する。

本発明の第９の態様は、請求項７または請求項８に記載のＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを提供する。

本発明の第１０の態様は、請求項３から請求項６のうちいずれか１項に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップを精製する方法であって、ヒスチジンタグがＮｉに結合する性質を利用することを特徴とする、スタスミン結合性タンパク質検出用チップの精製方法を提供する。

本発明の第１１の態様は、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載のチップを利用した、スタスミン結合タンパク質の検出方法を提供する。

本発明の第１２の態様は、表面にマレイミド基を露出させた基板をチップの担体とし、システインタグがマレイミド基に共有結合で固定化されることを特徴とする、請求項１１に記載のスタスミン結合タンパク質検出方法を提供する。

本発明を利用する事により、スタスミンと結合するタンパク質を効率的に検出するためのデバイスを利用することが可能となり、また、このデバイスを用いたスタスミン結合タンパク質の網羅的解析、ひいては細胞内シグナル伝達機能の新たな解析が可能となる。特にスタスミンはがん細胞で発現が亢進していることから、本発明を利用してスタスミンと結合するタンパク質を検出しこれを解析することは、細胞のがん化など細胞増殖に関する疾患の病体解明や治療に対して極めて大きな意義を持つものである。

以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、スタスミンを有効成分とし、スタスミンが特定のタンパク質と結合する性質を利用した、スタスミン結合性タンパク質検出用チップを提供する。スタスミンはチューブリン結合タンパク質として発見されたが、本発明者らによって種々のタンパク質と様々な相互作用を行うことが明らかになりつつあり、特に細胞のがん化とも関連が指摘されている。本発明は、このスタスミンをプロテオーム解析における特異的タンパク質検出用のデバイスとして利用するものであり、これは細胞のがん化機構などの解明やがんの診断法・治療法の開発に道を拓くものである。

本発明の第２から第６の態様では、前記第１の態様に記載のチップにおいて、チップを構成するタンパク質が、スタスミンと、基板などに固定するために用いるシステインタグと、チップを標識するために用いる蛍光タンパク質（例えばＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ＝ＧＦＰまたはこれを一部改変して得られたＥＧＦＰなど）と、大量発現系などで生産したチップを精製するためのヒスチジンタグより構成される、スタスミン結合性タンパク質検出用チップを提供する。本発明におけるスタスミン結合性タンパク質検出用チップは、複数の領域を持つ人工タンパク質であって、検出用の本体であるスタスミンを中心に、一方の末端、好ましくはＣ末端側にシステインタグを含み、好ましくはスタスミンに隣接して（数残基のアミノ酸を間に挟むなどして）、これと立体障害を起こさず蛍光標識を可能とする蛍光タンパク質を含み、システインタグと反対側の末端（好ましくはＮ末端側）にヒスチジンタグを含んだタンパク質であって、更に好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸からなり、Ｎ末端側から、ヒスチジンタグ、ＥＧＦＰ、スタスミン、システインタグの順に並んだ人工タンパク質である（図１、図３参照）。

本発明の第７から第９の態様においては、本発明の第１から第６の態様に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップをコードしたＤＮＡ、並びに前記ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを提供する。本発明のチップはまず、各タンパク質領域をコードしたＤＮＡの塩基配列として設計され、好ましくは配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとして設計される。本発明の実施に当たっては、このＤＮＡをベクター中に組み込み、大腸菌等を用いて大量発現させ、発現産物を回収して精製を行い、これを基板上に固定化して利用すれば良い。ここにおいて、発現させるためのベクターの種類（プラスミドベクターやウィルスベクター）は、大量発現に用いる細胞（例えば大腸菌）内で大量発現を可能にするものであればどの様なものでも良く、何ら本発明を限定するものでは無い。大量発現に用いる細胞も、細菌、真菌類、酵母等通常の大量発現系で用いられる生物であれば問題なく、本発明を限定するものでは無い。

本発明の第１０の態様においては、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップを精製する方法を提供する。上述の通り本発明のチップは、好ましくは精製のためにヒスチジン数残基（好ましくは５または６残基）よりなるヒスチジンタグを含んでいる。大腸菌などにチップとなるタンパク質を大量発現させた際、それを効率的に精製回収することが必要となるが、本態様では精製に、ヒスチジンがＮｉと結合する性質を利用したヒスチジンタグを用いる。例えば大量培養した大腸菌を適当な処理液で溶解し、溶液をＮｉビーズに懸濁させるかまたはＮｉカラムを通すことによって、ヒスチジンタグを含むチップタンパク質を吸着させ、洗浄などで他の余分なタンパク質を除去し、その後ヒスチジンとＮｉとの結合を切り離すような処理（例えば、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ処理など）を行うことによって、ヒスチジンタグを持つチップタンパク質を濃縮・精製することができる。これにより、大腸菌などが産生したチップタンパク質を効率的に精製することが可能となる。

本発明の第１１、１２の態様においては、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のチップを利用した、スタスミン結合タンパク質の検出方法を提供する。マイクロアレイ的手法を用いてタンパク質の検出を行う際には、担体にプローブを固定することが必要となるが、本発明においては、その固定化のためにシステインタグを用いる（図２参照）。ＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ−Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）などでコートしたガラス板などの上にマレイミド基を露出させたマレイミド基板を作製し、精製したチップのシステインタグとマレイミド基とを反応させて共有結合で固定化し、これを検出用のチップとして対象となる細胞から抽出したタンパク質を反応させるというものである。本発明の利用により、例えば、Ａ，Ｂそれぞれ異なる状態にある細胞から全タンパク質を抽出し、これを前記チップに反応させることで、Ａ状態においてスタスミンと結合するタンパク質群、Ｂ状態においてスタスミンと結合するタンパク質群がそれぞれ得られ、これを比較するといった解析が可能となる。担体の材質などは、マレイミド基板を結合して露出させられるものであれば何でも良く、例えばガラス基板、シリコンコートしたダイヤモンド基板、ＤＬＣでコートしたガラス基板などが挙げられるが、これらはいずれも本発明を限定するものでは無い。

（タグ付きスタスミン発現ベクターの構築） システイン−ヒスチジンのダブルタグ付きスタスミンを作製するため、大腸菌用スタスミン発現ベクターを構築した。図３ａ上段に示すダブルタグ付きＥＧＦＰ（改変型ＧＦＰ）発現ベクターを作製し、これをもとにＥＧＦＰ遺伝子と５残基のシステインをコードする領域の間に読み枠を合わせ、図３ａ下段の様にスタスミン遺伝子を組み込んだ。このベクター（６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ−５×Ｃｙｓ）がコードするタンパク質は図３ｂ下段の様にＮ末端部から順番に６残基のヒスチジン、ＥＧＦＰ、スタスミン、５残基のヒスチジンから構成される融合（リコンビナント）タンパク質であり、分子量の理論値は４５ｋＤａであった。対照として用いるダブルタグ付きＧＦＰ（図３ｂ上段）の分子量の理論値は２６ｋＤａであった（配列番号１−４参照）。

（スタスミンチップの作製と精製−５０ｍｌスケール） 上述の方法で作製したタグ付きスタスミン発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株にて発現させた。発現プラスミドを保有した大腸菌ＢＬ２１株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ入り（以下Ａｍｐ５０と略す）ＬＢ平板培地にて１晩、３７℃にて培養し、新鮮な細胞を用意した。この培養から菌を１かき掻き取り、Ａｍｐ５０含有５０ｍｌ Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ，グリセロール添加、５ｍｉｎオートクレーブ済、５００ｍｌ三角フラスコ使用）にて１昼夜、２００ｒｐｍ、２８℃で振とう培養した。培養した大腸菌を液ごと５０ｍｌチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、予め冷やしておいたローター及び遠心機にて７０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ（４℃）遠心し、菌体をペレットとして回収した。ここにＰＢＳ３０ｍｌを加えて懸濁し、遠心回収（４℃，７０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した。得られたペレットにＰＢＳ１ｍｌを加えて再懸濁し、１５ｍｌチューブに移した。−８０℃に移して凍結サンプルとし、使用するまで保存した。

上述の凍結サンプルを溶かし、１．２５ｍｌＰＢＳ、２５０μｌの１０×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、２．５μｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５ｕｎｉｔ／μｌ）を添加して、ｔｏｔａｌ２．５ｍｌとなったサンプルをよく懸濁した。このサンプルを室温にて約３０分間、振とうし、この間に菌液の粘性がいったん高くなってその後低くなるのを確認した。３０分経っても菌液の粘性が高いときは、更に等量のＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、粘性が低くなるまで（３０分を目安に）振とうした。この間、Ｎｉビーズ溶液１ｍｌを１５ｍｌチューブに分注し、３ｍｌ洗浄液（１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有ＰＢＳ）に懸濁後、６００ｒｐｍ、３ｍｉｎ遠心してビーズを洗浄し、これを２回くり返した。洗ったビーズを３ｍｌＰＢＳに懸濁させた。

菌液の抽出液を８００ｍｌずつ１．５ｍｌチューブ２本に分注し、１５０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ遠心（４℃）して、上清のみを新しい１５ｍｌチューブに移した。上述のビーズを再度遠心してペレットにし、ＰＢＳを捨てて、抽出液上清をビーズの入ったチューブに移した。４℃にて１５分間、Ｎｉビーズ−タンパク質溶液混合チューブをゆっくりと振とうし、ＮｉビーズにＨｉｓタグ付きタンパク質を吸着させた。

Ｎｉビーズ−タンパク質溶液をプラスチックカラム（ミニカラム、アシスト社）に移し、タンパク質を吸着したビーズを自然落下にてこし取り、回収した。このカラムにトッププラグを付け、４ｍｌの洗浄液を加え、エンドキャップを付けて上下を逆さにし、撹拌後に両キャップを外してビーズを自然落下にて洗浄した。一連の操作を５回くり返した。

５００−１０００μｌの洗浄液にカラム内のビーズを懸濁させ、１．５ｍｌチューブに移した。必要に応じ、１００μｌ×５本または５００μｌ×１本に分注した。チューブを３０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ遠心し（４℃）、上清を捨ててビーズのみとした。Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ含有ＴＢＳ）をビーズの体積と等量加えてよく混ぜ、−８０℃にて保存した。

（スタスミンチップの作製と精製−２００ｍｌスケール） 発現プラスミドを保有した大腸菌ＢＬ２１株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ入り（以下Ａｍｐ５０と略す）ＬＢ液体培地３．５ｍｌ中にて１晩、３７℃にて培養し、新鮮な液体培養細胞を用意した。この培養から菌液２ｍｌを、Ａｍｐ５０含有２００ｍｌＬＢ培地（２ｌ三角フラスコ使用）にてまず２００ｒｐｍ、３７℃で２時間培養し、その後続けて１昼夜、２００ｒｐｍ、２８℃で培養した。培養した大腸菌を液ごと５００ｍｌ遠心ボトル（Ｎａｌｇｅｎ）に移し、予め冷やしておいたローター及び遠心機にて７０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ（４℃）遠心し、菌体をペレットとして回収した。ここにＰＢＳ１２０ｍｌを加えて懸濁し、遠心回収（４℃，７０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した。得られたペレットにＰＢＳ４ｍｌを加えて再懸濁し、５０ｍｌチューブに移し再度ペレットを遠心回収（４℃，７０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）した。−８０℃に移して凍結サンプルとし、使用するまで保存した。

上述の凍結サンプルを溶かし、１０ｍｌＰＢＳ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸを添加して、よく懸濁した。このサンプルを１ｍｌずつ１５ｍｌチューブに取り分け超音波破砕し、その後４℃にて約３０分間約３０分間振とうした。この間、Ｎｉビーズ溶液４ｍｌを１５ｍｌチューブに分注し、１２ｍｌ洗浄液（１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有ＰＢＳ）に懸濁後、６００ｒｐｍ、３ｍｉｎ遠心してビーズを洗浄し、これを２回くり返した。洗ったビーズを３ｍｌ洗浄液に懸濁させた。

菌液の抽出液を８００ｍｌずつ１．５ｍｌチューブ８本に分注し、１５０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ遠心（４℃）して、上清のみを新しい１５ｍｌチューブに移した。上述のビーズを再度遠心してペレットにし、ＰＢＳを捨てて、抽出液上清をビーズの入ったチューブに移した。４℃にて１５分間、Ｎｉビーズ−タンパク質溶液混合チューブをゆっくりと振とうしてＮｉビーズにＨｉｓタグ付きタンパク質を吸着させた。

Ｎｉビーズ−タンパク質溶液をプラスチックカラム（エコノカラム、バイオラッド社）に移し、タンパク質を吸着したビーズを自然落下にてこし取り、回収した。このカラムにトッププラグを付け、２０ｍｌの洗浄液を加え、エンドキャップを付けて上下を逆さにし、撹拌後に両キャップを外してビーズを自然落下にて洗浄した。一連の操作を５回くり返した。

〜２５００μｌの洗浄液にカラム内のビーズを懸濁させ、１．５ｍｌチューブに移した。必要に応じ、１００μｌ×２５本または５００μｌ×５本に分注した。チューブを３０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ遠心し（４℃）、上清を捨ててビーズのみとした。Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ含有ＴＢＳ）をビーズの体積と等量加えてよく混ぜ、−８０℃にて保存した。

（ビーズからのリコンビナントタンパク質の抽出） ４００−５００μｌのタンパク質吸着ビーズを室温にて溶解し、ビーズ１００μｌに対し１ｍｌのＰＢＳを加えて３回洗浄（３０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃）した。ここに５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ含有ＰＢＳをビーズと等量加え、懸濁した。室温にて３０分間回転し、ビーズからタンパク質を遊離させた。この間、濃縮スピンカラム（ＹＭ−１０，ミリポア社）を用意し、２００μｌＰＢＳでｐｒｅｗａｓｈ（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、室温）した。ビーズと抽出液をカラムに通し、自然落下にて約５００μｌのタンパク質溶液を回収した。タンパク質溶液５００μｌをＹＭ−１０カラムに移し、１２０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、室温にて遠心して約５０μｌまで濃縮した。濃縮カラムに４５０μｌＰＢＳを添加し（この段階の推定Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度は２５ｍＭ）、ピペッティングにて混合した。この液を更にＹＭ−１０カラムに移し、上記の操作を２回くり返してＩｍｉｄａｚｏｌｅの最終濃度を１ｍＭ以下とした。約５０μｌのタンパク質溶液を１．５ｍｌチューブに移した。

（リコンビナントタンパク質の定量） 濃縮して得られた上記タンパク質溶液から１μｌおよび０．１μｌを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動しゲルをＣＢＢ染色した。リコンビナントタンパク質、非特異的抽出タンパク質の精製回収程度を確認し、また１／１００希釈液、１／２００希釈液をＬｏｗｒｙ法にて定量した。Ｎｉビーズによる精製の結果を図３に示す。６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−５×Ｃｙｓ、６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ−６×Ｃｙｓとも、Ｎｉビーズにより精製されることが確認された。リコンビナントタンパク質の濃度は１−１０ｍｇ／ｍｌ程度であった。タンパク質溶液は、ＧＦＰの場合で４℃にて約１ヶ月は保存可能であった。

（スタスミンチップタンパク質の基板上への固定化） Ｎｉビーズで精製したタンパク質は、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅで抽出した。タンパク質量は５−７ｍｇ／ｍｌ程度、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅの最終濃度は１ｍＭ以下とした。タンパク質溶液とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００を１：１となるよう混合し、ＤＬＣでコートしたガラス基板にマレイミド基を結合させたマレイミド基板に８μｌずつスポッティングし、暗所にて乾燥を避け、一晩静置した。

上記の各基板を２４ｗｅｌｌマルチプレートに置き、２００μｌＰＢＳで５分間洗浄し、これを３回くり返した。その後５００μｌＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄し、これを２回くり返した。洗浄後、スライドグラス上または９６穴マルチプレートの蓋上にＰＢＳとともに基板を乗せ、カバーグラスをかけて観察用とした。検出はＰｒｏＸＰＲＥＳＳ（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用い、Ｃｙ２セッティング，１ｓｅｃ露光にて検出した。また作成したタンパク質チップは、ＰＢＳ中に浸漬して４℃にて保存した。

（スタスミン特異的抗体による基板上へのスタスミン固定化の確認） 基板上に固定化したスタスミンを、スタスミン特異抗体と蛍光二次抗体を用いて検出した。図４に示す通り、約５ｍｍ角のマレイミド基板前面にＨｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ−Ｃｙｓを固定化したＥＧＦＰ−スタスミンチップ（Ｎｏ．２，３）、Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｃｙｓを固定化したＧＦＰチップ（Ｎｏ．４）及びコントロールとして基板のみ（Ｎｏ．１）をそれぞれ作製した。対照のＮｏ．１はＧＦＰ蛍光を発せず、Ｎｏ．２−４のチップではＧＦＰ蛍光を発することを確認した（図４上段と同様）。各チップをブロッキング後、Ｎｏ．３，４に対して抗スタスミン抗体を１時間常温にて反応させた。スタスミン抗体の結合を可視化するため、蛍光プローブであるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５融合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮｏ．３，４に反応させた。Ｎｏ．２にも二次抗体の非特異的吸着のコントロールとして、同二次抗体のみを反応させた（図４下段）。抗体反応後チップを洗浄し、その後ＰｒｏＸＰＲＥＳＳを用いて検出を行った。その結果、Ｃｙ２セッティングで検出されるＧＦＰ蛍光は、Ｎｏ．２，３，４で再確認され（図４上段の黒く染まった部分）、Ｃｙ３セッティングにては、抗スタスミン抗体の結合を示すＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５蛍光が、Ｎｏ．３でのみ検出された（図４下段の黒く染まった部分）。Ｎｏ．２ とＮｏ．４をコントロールとして、Ｎｏ．３にはＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ融合タンパク質が固定化されていることが確認された。これらの結果から、スタスミンが基板上に固定されていると結論された。

（質量分析による基板上へのスタスミン固定化の確認） 抗体による検出に加え、作製したＥＧＦＰ−スタスミンチップとＥＧＦＰチップを質量分析にかけ、基板上に固定化されたタンパク質の同定を行った。ＬＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により、表１に示すとおり、ＥＧＦＰ−スタスミン固定化チップ１枚から、スタスミンの全アミノ酸の３１％をカバーする５つのペプチド断片（配列番号５−９参照）と、ＥＧＦＰの１ペプチド断片（配列番号１０参照）が同定された。ＥＧＦＰチップからは、前記ＥＧＦＰの１ペプチド断片（配列番号１０）が同定された。コントロールのチップからは、いずれの断片も検出されなかった。これらの結果から、ＥＧＦＰ−スタスミンチップとＥＧＦＰチップには、それぞれデザインされた通りのタンパク質が固定化されていると結論された。

本発明の提供するスタスミンチップを利用することにより、細胞が発現している全タンパク質の中からスタスミンと反応・結合して「タンパク質クラスター」を形成するタンパク質を効率的に検出することが可能となる。本発明は、タンパク質の網羅的解析のための有用なツールを提供するものであり、スタスミンチップの医学・医療への応用により、特に細胞のがん化機構の解析など、革新的な研究分野の発展や新しい診断・治療法の開発に道を拓くものである。

本発明に係るスタスミンチップの概念図を示す。 システインタグを利用したスタスミンチップの基板への固定方法の模式図を示す。ＤＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｄ−Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）でコートしたガラス基板上にマレイミド基を持つ化合物を結合させ、マレイミド基を表面上に露出させる。マレイミド基はＳＨ基と特異的に反応して共有結合を形成する性質を有しており、タンパク質ではＳＨ基を持つシステインと特異的に反応して共有結合を形成する。この性質を利用し、末端にシステインタグを結合したタンパク質を基板と反応させることによって、基板上に安定して固定化されたタンパク質チップを作ることが可能となる。 （Ａ）本発明のスタスミンチップを作成するために、基板に固定化するスタスミン融合蛋白質を発現させるためのベクターの設計を示す。上段が対照に用いたダブルタグ付きＥＧＦＰ（６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−５×Ｃｙｓ）を発現させるためのプラスミドベクターｐ６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−５×Ｃｙｓ示し、下段がスタスミンドメインを含む融合タンパク（６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ−５×Ｃｙｓ）を発現させるためのプラスミドベクターｐ６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ−５×Ｃｙｓをそれぞれ示す。図中黒塗りの小さなボックスはスタスミン遺伝子の挿入に用いた制限酵素サイト（ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ）を表す。（Ｂ）基板に固定化させるために設計されたタンパク質の構成を示す。上段はＡ上段、下段はＡ下段にそれぞれ対応する。ＨｉｓをＨで、ＣｙｓをＣで略して表す。スタスミン融合タンパク質（下段）の理論上の分子量は約４５ｋＤａである。 発現させたタンパク質のＮｉビーズによる精製の結果を示す。左側の数字は分子量（ｋＤａ）を表し、レーンＭはマーカーを示す。中２つのレーンは対照（６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−５×Ｃｙｓ）であり、左側が精製前、右側が精製後のサンプルである。右２つのレーンはスタスミンチップ（６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎ−５×Ｃｙｓ）であり、左側が精製前、右側が精製後である。どちらもＮｉビーズによる精製で、設計した通りの分子量のバンドを得ることができた（図中星印）。 作製したチップ上のタンパク質を、ＧＦＰ自家蛍光と蛍光抗体処理により検証した。写真上段（ＧＦＰ）はＧＦＰ蛍光の有無を示し、Ｃｙ２セッティングで検出されるＧＦＰ蛍光は、コントロール（Ｎｏ．１）では検出されなかったのに対してＮｏ２−４では検出され、基板上にＧＦＰを含有するタンパク質が固定化していることが確認された。写真下段は抗スタスミン抗体による検出結果を示す。一次抗体として抗スタスミン抗体処理を行い（Ｎｏ．３，４）、次いで二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体処理を行った（Ｎｏ．２−４）。Ｎｏ．１，２はそれぞれの抗体処理のコントロールである。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５蛍光を検出するＣｙ３セッティングにて、Ｎｏ．３でのみ、抗スタスミン抗体結合を示す蛍光シグナルが検出されたことから、Ｎｏ．３にはスタスミンを含むタンパク質が固定化されていることが確認された。ＧＦＰ自家蛍光の検出結果と合わせると、Ｎｏ．３にはＥＧＦＰ−Ｓｔａｔｈｍｉｎの融合タンパク質が、Ｎｏ．４はＥＧＦＰがそれぞれ基板に固定化されていることが実証された。

Claims (12)

1. スタスミンを有効成分とする、タンパク質検出用チップ。
2. スタスミンと、スタスミンの一方の末端に結合したシステインタグを含むポリペプチドで構成される、請求項１に記載のスタスミン結合性タンパク質の検出用チップ。
3. スタスミンと、スタスミンの一方の末端に結合したシステインタグと、システインタグと反対側の末端に結合したヒスチジンタグを含むポリペプチドで構成される、請求項１に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップ。
4. スタスミンと、スタスミンに結合した検出用の蛍光タンパク質と、Ｃ末端側に結合したシステインタグと、Ｎ末端側に結合したヒスチジンタグを含むポリペプチドで構成される、請求項３に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップ。
5. 検出用の蛍光タンパク質がＧＦＰまたはＥＧＦＰである、請求項４に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップ。
6. アミノ酸配列が配列番号１に示す配列かまたはこの一部のアミノ酸を置換して得られる配列であって、Ｎ末端側からヒスチジンタグ、ＥＧＦＰ、スタスミン、システインタグの順にペプチドが結合した、スタスミン結合性タンパク質検出用チップ。
7. 請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップをコードしたＤＮＡ。
8. 塩基配列が配列番号３に示す配列かまたはこの一部の塩基を置換して得られる配列よりなる、スタスミン結合性タンパク質検出用チップをコードしたＤＮＡ。
9. 請求項７または請求項８に記載のＤＮＡを組み込んだ発現ベクター。
10. 請求項３から請求項６のうちいずれか１項に記載のスタスミン結合性タンパク質検出用チップを精製する方法であって、ヒスチジンタグがＮｉに結合する性質を利用することを特徴とする、スタスミン結合性タンパク質検出用チップの精製方法。
11. 請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載のチップを利用した、スタスミン結合タンパク質の検出方法。
12. 表面にマレイミド基を露出させた基板をチップの担体とし、システインタグがマレイミド基に共有結合して固定化されることを特徴とする、請求項１１に記載のスタスミン結合タンパク質検出方法。

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