PT1297338E - Microarrays para efectuar análises proteómicas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MICROARRAYS PARA EFECTUAR ANÁLISES PROTEÓMICAS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à análise de produtos celulares e materiais. Numa forma de realização é direccionada a microarrays proteómicos e métodos de utilização destes para efectuar análises proteómicas.

Recentemente, a tecnologia de microarray desenvolveu-se de um subcampo especializado para uma ferramenta importante para estudos básicos e aplicados em biologia molecular, microbiologia, farmácia, agricultura e muitas outras biotecnologias. A tecnologia de microarray de ADN tenta ligar o genoma de um organismo ou célula a um fenotipo expresso ou função proteica. A abundante literatura de publicações e patentes relacionadas com a tecnologia de microarray descreve arrays de ADN (ou outras formas de ácido nucleico, tais como ADNc ou ARN) , apresentadas numa superfície sólida, tal como uma lâmina de vidro (muitas vezes referida como um "chip"). 0 ADN arrayed está, tipicamente, na forma de oligonucleótidos curtos (e. g„, cerca de 8 a 25 bases) ou clones ma is longos ou produtos de PCR (cerca de 500 a 2000 bases). Os primeiros são tipicamente sintetizados no suporte sólido, enquanto os últimos são impressos roboticamente em pontos sobre um suporte sólido num formato de arrav. 1

Enquanto existem relatórios de arrays de péptidos e proteínas em superfícies sólidas, estes receberam consideravelmente menos atenção em comparação com os arrays de ADN. Isto deve-se, provavelmente, à instabilidade inerente destes materiais em interfaces e na presença de matrizes biológicas complexas. Por exemplo, é bem conhecido que muitas proteínas sofrem desnaturação após contacto com superfícies sólidas. Os péptidos, bem como as proteínas, são também submetidas a hidrólise por qualquer protease que possa estar presente na amostra biológica a ser analisada. Além disso, os arrays de péptidos são tipicamente sintetizados in situ em superfícies sólidas, utilizando métodos fotolitográficos. Estas técnicas necessitam da utilização de máscaras personalizadas dispendiosas, que devem ser concebidas e produzidas para cada chip. Além disso, a caracterização química dos péptidos sintetizados na superfície é quase impossível de se efectuar devido à quantidade ínfima de péptido produzida. 0 documento WO 98/31839 descreve métodos gerais para imobilizar substâncias biológicas num suporte sólido, em que os substratos podem ser constituídos por ouro ou alumínio. 0 documento WO 98/59360 descreve substratos para a preparação de arrays de moléculas biológicas que podem ser cobertos com ouro ou óxido de silício e, opcionalmente, derivatizadas com outras moléculas bifuncionais, tais como carbodiimida ou N-hidroxi-succinimida. O documento WO 92/10757 descreve a ligação de moléculas a um substrato sólido por utilização de uma ligação tiol-avidina-biotina-avidina. 2

McBeath et al.r J. Am. Chem. Soc. (1999), Vol. 121, 7967-7968, descreve a funcionalização de lâminas de vidro com aminopropiltrietoxisliano e maleimida. É revelada a produção de arrays de moléculas em esferas distribuídas em poços individuais e à ligação covalente à superfície da lâmina. A Patente US N° 5965695 proporciona bibliotecas de peptóides que são úteis na identificação da interacção de receptores.

Actualmente, o método mais comum para analisar o proteoma de amostras biológicas utiliza electroforese bi-dimensional ("2-D") em gel. Este método é problemático porque os resultados são muito sensíveis ao protocolo experimental (por exemplo, tempo de revelação do gel, bem como a outros parâmetros) . Assim, é muito difícil obter dados reprodutíveis a partir de géis 2-D. Também, a sensibilidade do corante de prata utilizado nestes géis é limitada e é inferior à dos marcadores fluorescentes utilizados nas tecnologias de microarray.

Assim, existe uma grande necessidade em desenvolver tecnologia de microarray eficaz que seja útil num contexto proteico. Em muitos casos, as vias funcionais não podem ser ligadas directamente a um gene em particular. As proteínas sofrem, muitas vezes, várias modificações, interacções ou degradações pós-tradução que determinam, fundamentalmente, a função. Mesmo a avaliação aparentemente simples da abundância de uma proteína não pode ser directamente correlacionada com o nível de ARNm correspondente. A única solução é avaliar o estado da célula, tecido ou organismo ao nível proteico. Por isso, um formato de elevada produtividade que permita a apresentação 3 rápida de diferenciais de proteínas em misturas complexas, tais como células, tecidos, soro, etc., poderia proporcionar um poderoso complemento e contrapartida à tecnologia de microarray de ADN.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Para alcançar o anterior, a presente invenção proporciona arrays de ligação de proteína peptidomiméticos, sua preparação, utilização e aplicação. Os elementos do array de ligação da proteína da invenção incluem um segmento peptidomimético, um segmento de âncora e um segmento de ligação que liga o peptidomimético e o segmento de âncora. A invenção contempla a síntese da biblioteca do elemento da biblioteca do array peptidomimético, distribuição e aplicação em pontos de elementos de 3.1'.7? ei \7 sopre 0 s subst ratos plan os sólide \ o /o / Πΐ3 Y. C 3. C ão de mi s t u r a s F -roteie as complexa anál: l. S G de liç íação difer enc .1 3 λ. de prol te ínas ao arrav. l\ invei ição tam' bém. permi te 0 enr iquec. im ento ou ρυ r i f. i. c a < vão e subs eque inte s equer iciamer ítO ou 3. Ώ 3. li se e strutu: ral de pre )teínas qu e ϊ são idf sntif içadas c orno dif erenc. ia is pel .0 ] 'ast.re.io do arr ay. São també im pr oporei ona dos ki t s inc lu indo mi cr 'oarrays proteóm ií cos de acord^ o com a pr ese nte inv ençâo Num a specto f 3. invençá o refei :e-se 8. i um arr ay d<: e agen- tes de líg ação 3. protei na ligaclos, de mot io et $táv< ei, à supe.i rfície de um sup orte O, ( ilido, 0 array .1 .: L 0 X U. -i- um. subs trato sóii ..do cc na uma s 1.] p erfíc. ie de 3 J. uraínio substa nc ia Imen te p .1.3*0 3T co OTl um ΓΘΥ estirm sn to de d: i. óx.ídO C ie silá ..cio, er α que 0 revest irae nto diô xi.do de sil íc io tem uma í espessu. ra d( e ce rCâ d. 3 200 Â até ce rC3. de 900 '5 A e é cap; Í3Z de pc )tencia 5 :: a amp li f ica' ção de um. si nal 4 fluorescente e uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferente s ligados ao substrato . Cada um. dos agentes de ligação de proteí .na inclui um o (ti q- ηο ζλ ^ ,-’Λ de ancoragem ligado, de um modo estável, a superfície σο subst rato, um, segmento de ligação de proteína peptídomimét: ..co e um segmento de união que liga e separa os segmentos de ancoragem . e peptídomimi ítico.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um método de preparar um array compreendendo uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido. 0 método envolve preparar, para ligação, um substrato sólido com uma superfície agentes de ligaça* :anc.i aumente planar, cc )ra um reve isuimento ae , em que o revestimento dióxido de silício tem erca de 200 À . até cerca. de 900 Ã e é capaz de meação de um sinal flu crescente í 2 colocar em pluralidade d< 2 agentes de ligação de prote í na ubstrato sob condições : suficientes para que os da proteína fiquem 1: i. gados a s uperfície do . dos agentes de ligação i de proteína inclui um ;gem ligado, ; de um modo estável, à superfi cie potênciar a do substrato, um segmento de ligação de proteína peptídcmimético e um segmento de ligação que liga e separa os segmentos de ancoragem e peptidomimético.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um método de preparar um array compreendendo uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido. 0 método envolve gerar uma biblioteca de agentes de ligação de proteína na qual cada um dos agentes inclui um segmento de ancoragem ligado, de um modo estável, à superfície do substrato, um segmento de ligação de 5 proteína peptidomimético e um segmento de união que liga e separa os segmentos de aneoragem e peptidomimético. Os agentes de ligação de proteína são distribuídos da biblioteca para receptáculos de armazenamento individuais oara cada agente de ligação de proteína diferente, são prepar ados uma plu ralida.de de agentes de ligação de prote ina para 1 igaçâo a un :i substrato sólido, é preparado um subst: rato sólido com uma su] oerfícíe de alumínio substancial mente plan ar, com. um revestimento de dióxído de silício, em. que o revestimento dióxído de silício tem uma espessura de cerca de 200 A até cerca de 900 Â e é capaz de potenciar a amplificação de um sinal fluorescente para ligação com uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes e é preparado um array como aqui descrito.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de efectuar um ensaio de ligação diferencial. O método envolve marcação de proteínas numa solução de amostra biológica contendo proteína, colocar em contacto uma alíquota da solução de amostra biológica contendo proteína marcada com um array como aqui descrito, e analisando o array para determinar a ligação diferencial de proteínas na amostra aos agentes de ligação da proteína do array.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit para utilização na execução de um ensaio de ligação diferencial, como aqui descrito. O kit inclui um array com um substrato sólido com uma superfície de alumínio substancialmente planar, revestida com um revestimento de dióxído de silício, em que o revestimento díóxido de silício tem uma espessura de cerca de 200 Â até cerca de 900 À e é capaz de potenciar a amplificação de um sinal fluorescente com uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes ligados ao substrato. Cada um dos agentes de 6 a incluí um segmento d.c ; ancoragem t ligado, de à superfíci .e do sufost rato, um segmento de a pepticomiiT lético e um segmento de união que egmentos de ancoragem e peptidomimético. ligação de proteí um modo estável, ligação de proteí liga e separa os í

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um array misto de agentes de ligação de proteína ligados, de um modo estável, à superfície de um suporte sólido. 0 array inclui um substrato sólido com uma superfície de alumínio substancialmente planar, com um revestimento de dióxido de silício, em que o revestimento dióxido de silício tem uma espessura de cerca de 200 Â até cerca de 900 Ã e é capaz de potenciar a amplificação de um srnal fluoresce ;nte e ’ uma plurali dade de age; ates ; de ligação de pr oteína diferente ís ligac ioa ao subs trato. Cada um dos agentes de li . g α Ç α 0 de proteí na inc.'. Luí um segn :íento de an< sor a içem ligado, de urr modo Θ 31 á V Θ λ. f à 3 UpG srfície do substrato, uru segmento de l.ígaç ão de proteína peptidc smimético e um. segment o d e união que liga Θ- S Gpd. T 3. 08 38 momentos ?. de ancor. agem e peptido mimético. 0 array incl Ί ai também. vário; s anticorp' os diferent .0 s ligados ao subst rato.

Estas e outras características e vantagens da presente invenção serão apresentadas em maior detalhe na seguinte descrição da invenção e figuras acompanhantes que ilustram, como forma de exemplo, os princípios da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Fig. IA e 1B representam esquematicamente a estrutura de um elemento do array do agente de ligação de proteína, e porção 7 do array respectivamente, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Fig. 1C representa a estrutura molecular de um segmento de união de agente de ligação de proteína constituído por óxidos de etileno, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 2 representa esquematicamente um processo de preparar um array com uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 3 representa esquematicamente as estruturas moleculares de seis elementos de array de peptóides 12-meros, de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

As Figuras 4A e 4B representam esquematicamente modos alternativos de ligação de um agente de ligação de proteína a um suporte sólido, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 5 representa esquematicamente um processo para efectuar um ensaio de ligação de proteína diferencial, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 6 representa esquematicamente vários processos para identificar e caracterizar proteínas identificadas de acordo com formas de realização da presente invenção. A Fig. 7A representa a fórmula química para uma molécula de NHS~LC~LC~biotina utilizada numa solução para revestir lâminas de alumínio a serem utilizadas como um substrato de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Fig. 7B representa uma representação de uma lâmina de alumínio derivatizada com avidina detectada com um agente de ligação de proteína biotinilado de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Fig. 8 representa um gráfico dos resultados da cromatografia de exclusão de tamanho efectuada para separar a proteína marcada do corante que não reagiu, antes da aplicação da amostra de proteína marcada num microarray de acordo com formas de realização da presente invenção.

As Figs. 9A-9C representam digitalizações de chips de microarray, contendo uma biblioteca de 1000 agentes de ligação de proteína com base em peptóide, utilizados para validar o conceito da presente invenção. A Fig. 10 representa péptidos hexaméricos biotinilados (A até E) e a intensidade de sinal correspondente obtida quando os péptidos biotinilados foram aplicados em pontos sobre lâminas tratadas com avidina, bloqueadas com caseína e sondadas com anticorpos anti-glu marcados com Cy5. A Fig. 11 representa a dependência da força do sinal do modo ligação à superfície de um péptido, para dois modos de ligação à superfície, de acordo com a presente invenção. 9

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

Os materiais e técnicas e aparelhos associados da presente invenção serão agora descritos com referência a várias formas de realização. As propriedades e caracteristicas importantes das formas de realização descritas são ilustradas nas estruturas no texto e nas figuras que acompanham. Embora a invenção seja descrita, em conjunto com estas formas de realização, deverá ser entendido que não se pretende que a invenção seja limitada por estas formas de realização. Pelo contrário, pretende-se que englobe alternativas, modificações e equivalentes, uma vez que podem ser incluídos no espírito e âmbito da invenção. Na seguinte descrição, os vários detalhes específicos são apresentados de modo a proporcionar um conhecimento exaustivo da presente invenção. A presente invenção pode ser aplicada sem alguns ou todos estes detalhes específicos. Noutros casos, passos de processos bem conhecidos não foram descritos em detalhe de modo a não tornar confusa, desnecessariamente, a presente invenção.

Nesta descrição e reivindicações em anexo, as formas singulares "uma", "um" "a" e "o" incluem a referência plural, excepto quando o contexto claramente indica em contrário. Excepto definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. 10

Introdução A presente invenção proporciona arrays de ligação de proteína peptidomiméticos, para além de métodos para a sua preparação, utilização e aplicação. Os elementos de array de ligação de proteína da invenção incluem um segmento peptidomimético (um exemplo do qual é um peptóide), ligado a um suporte sólido utilizando uma âncora estável. Numa forma de realização, a invenção proporciona a síntese da biblioteca do elemento do array peptidomimético, distribuição e aplicação em pontos de elementos de array sobre os substratos planos sólidos, marcação de misturas proteicas complexas e a analise da ligação de proteínas isoladas ou ligação diferenciai de proteínas ao colocar em contacto proteína pura marcada ou misturas complexas de proteínas marcadas com o array peptidomimético. Tal análise pode conduzir à identificação de novos alvos terapêuticos envolvidos em doenças, tais como cancro, vIH ou diabetes. Estes novos alvos podem, depois, ser utilizados em ensaios de rastreio de elevada produtividade para identificar novos candidatos a fármacos. A invenção também permite o enriquecimento ou ρυrifi caça o e subse quente seqi nencí am> ento oi 1 3..Π3..Ι.1.3Θ 03Í" ar 3 J.. de pr ctei nas que são ídent ificada s come ) dl f. Θ .t. & 0 C j. cl í S pe lo ra s tre io c :e a. vray. Os arrays também podem C. p utrlizados pa ra ide ntí fica r novos ligandos sintèt ricos p31. 3 Proteínas de int p '✓'p sse (par :a pur ifl-CclÇãO dU prote ínas 0' U de s e η v o 1. v 1 j^g r> p q de ens aio s de * ele ívada ; produtrvida de) ou antigé nios sintéticos pa ra ant íco rpos de inte ;resse. Tat nbém p· odem s ;er utilizados pa ra ide ntí fica r nc o/os li oibidores c ie enzíi mas ou ou to :os ltgandos c om elevada afinidade para alvos de fármacos, ou como os passos iniciais para novos fármacos. São também proporcionados kíts incluindo microarrays proteómicos de acordo com a prpSprire invenção. 11 1. Arrays de Agente de Ligação de Proteína

Os arrays peptidomiméticos de acordo com a presente invenção são constituídos por vários elementos de array diferentes compreendendo agentes de ligação de proteína ligados à superfície de um suporte sólido. Cada um dos elementos de array do agente de ligação de proteína diferentes inclui um segmento de ancoragem ligado à superfície do substrato, um segmento de ligação de proteína peptidomimético e um segmento de união, ligando e separando os segmentos de ancoragem e peptidomimético. Um "peptidomimético", como aqui utilizado, refere-se a polímeros ou oligómeros sintéticos não peptídicos que interagem, de um modo detectável, com proteínas ou receptores de um modo análogo a interacções químicas e/ou físicas proteína-proteína ou proteína-péptido, sob as condições de ensaio. 0 segmento de ancoragem está tipicamente ligado à superfície do substrato, de modo a que a associação entre o grupo de ancoragem e a superfície do substrato e, assim, a concentração e densidade do agente de ligação de proteína na superfície do substrato é mantida durante o processamento ao qual o microarray é submetido sobre as suas condições de funcionamento normais, por exemplo, como aqui descrito. 0 número de espécies químicas diferentes de agente de ligação de proteínas presente na superfície do array é de, pelo menos, 2 ou, pelo menos, 10 ou, pelo menos, 100 e pode ser muito superior, sendo, geralmente, de pelo menos, cerca de 1000 ou, pelo menos, cerca de 5000 a cerca de 50000, por exemplo, entre cerca de 5000 e cerca de 10000, como descrito mais abaixo. 12

As Figs. IA e 1B proporcionam uma representação de um tal elemento de array e um array de acordo com a invenção. Na Fig. IA, um elemento 100 de array de ligação de proteina inclui três segmentos: um segmento 102 peptidomimético, um segmento 104 de âncora e um segmento 10 6 de união. O elemento de array está ligado a um suporte ou substrato 108 sólido através de uma ligação entre o seu segmento 104 de âncora e a superfície 110 do substrato. Em alguns casos, o substrato pode ser constituído por uma pluralidade de camadas 112a, 112b, 122c formando um laminado. Na Fig. 1B, um array de ligação de proteína inclui uma pluralidade de elementos 100 de array diferentes, tais como ilustrado na Fig. IA, ligados a um substrato 108 planar. Cada um destes componentes do array é descrito em maior detalhe, separadamente, abaixo. A. Substrato O suporte sólido (Fig. IA e 1B, elemento 108) empregue em arrays de acordo com a presente invenção varia muito, dependendo da utilização pretendida para o produto a ser produzido. O suporte sólido pode ser qualquer material adequado para ligar o agente de ligação de proteína que seja também compatível com quaisquer métodos analíticos com os quais o array é para ser utilizado. A compatibilidade pode ser determinada utilizando métodos e materiais conhecidos pelos especialistas em técnicas de química de materiais ou superfície. Numa forma de realização, o suporte sólido compreende um material rígido impermeável. Os materiais adequados incluem, plásticos, tais como polímeros, e. g., cloreto de polivinilo, polietileno, polistirenos, poliaerilatos, policarbonato e seus co-polímeros, e. g., polímero de cloreto de vinilo/propileno, polímero de cloreto de 13 vini 1.0 / 3 ceta to de vinilo, c O-p olrmeros est irónicos e C· ;T5 rp p Iban tes. Os mater ia is adequado s t ambém ir rcluem vidres, ta i s '“ΌΓΡΟ os for. -mados de quartzo ou sil ício; e metal. s (incluin dO liga S ) ; e, i g\, ouro, platina, pra r.ír., cobre, alumír iío, titânl o, cróm io e sem elhant.es.

Como indicado acima, em muitas formas de realização de interesse, o suporte ou substrato 108 será um compósito de duas ou mais camadas diferentes de material, onde a composição inclui, pelo menos, um material de base, e. g.s como representado pelo elemento 112a na Fia. IA e um ou mais materiais de revestimento de superfície, como representado pelos 112c na Fia IA, Por ç íxemplo, uma forma de ura ma te ri al 11.2a οθ ta.i com uma camada m etálica 112b, .do com d.i Lóxido de ; silício, ou je silício e uma camada 112 c tiol moc ii ficado com amino ou 0 suporte : sólido planar pode lâmina de : microsc ópio 3" x 1" hóstia circular com. um diâmetro ,s confiau] rações se dão evidentes j e elementos 112r realização de interesse inclui de 3" ou 5", por exemplo. Oir para os especialistas nas técnicas de química das materiais e superfícies. O material ou substrato de suporte sólido pode ter várias configurações diferentes, dependendo da utilização pretendida do material. Assim, no sentido mais amplo, o material de base ou suporte pode estar na forma de uma placa, folha, cone, tubo, poço, esfera, nanopartícula (e. g., cerca de 5-100 nm), hóstia, etc. Nalgumas formas de realização, o material do suporte de base é um que tem, pelo menos, uma superfície substancialraente 14 planar, e, g., como observado numa placa, lâmina, folha, disco, etc. Nestas formas de realização, são empregues suportes com. uma configuração global em placa ou lâmina, tal como uma configuração em. disco ou rectangular.

Nas formas de realização rectangulares, planares das lâminas acima descritas, o comprimento do suporte será, geralmente, de pelo menos, cerca de 1 cm e pode ser superior a cerca de 40 cm ou mais, mas normalmente não excede cerca de 30 cm e pode, muitas vezes, não exceder cerca de 20 cm. A largura do suporte será, geralmente, de pelo menos, cerca de 1 cm e pode ser superior a cerca de 40 cm, mas normalmente não excede cerca de 30 cm e, muitas vezes, não irá exceder cerca de 20 cm. Em geral, a altura do suporte irá variar desde cerca de 0,01 mm a cerca de 1.0 mm, dependendo, pelo menos em parte, do mater j. a j. a partir do qual c ) substrato ri.gi; do é produzido e a. espes s ura do material neces ;sária para prop orcionar a rigidez pr ete ndída. De particular interesse, em muitas formas de reali z a ç a o, são os suportes com as dímensôe s de uma lâmina de mi cro scópic > convencional, um . tamanho de sub strato normal é de cerca de 2 ,54 cm x 7,62 cm e cerca de 1-2 r nm de espessura. No sntarvto, podem ser empregues quaisquer dimensões adequadas

Onde o suporte é uma esfera, nanoparticula ou microparticula, o diâmetro do suporte varia, normalmente, de cerca de 5 nm a cerca de 1000 u, particularmente, de cerca de 10 nm a cerca de 500 u.

Os agentes de ligação de proteínas podem ser ligados directamente à superfície sólida inorgânica de camadas 112a ou 112b (como ilustrado e descrito em maior detalhe abaixo, com referência à Fig. 4A) ou ligados utilizando a camada orgânica 15 funcionalizada de 112c (como ilustrado e descrito em maior detalhe abaixo, com referência à Fig. 4B) . No último caso, o terminal não ligado ao substrato das moléculas orgânicas na camada são funcionalizados com um grupo reactivo que se pode ligar ao grupo de ancoragem de um agente de ligação de proteína que se liga subsequentemente. Os grupos reactivos terminais adequados podem ser, por exemplo, maleimida, hidrazida, aminoxilo, um éster activado, tal como N-hidroxissuccinimida, anidrido, aldeído, persulfureto, tiol, azida, fosfina ou avidina, estreptavidina, neutravidina ou outras formas alteradas da proteína avidina que se liga à biotina, dependendo do grupo funcional de âncora.

Nas formas de realização em que a superfície do material da base de suporte, tal como vidro, é revestido com uma fina camada de um metal, tal como alumínio, ouro ou titânio, a espessura da camada de metal irá, geralmente, variar desde cerca de 300  a cerca de 10000 Â, mais particularmente, desde cerca de 750  a cerca de 2000  e, ainda mais particularmente, desde cerca de 1000 A a cerca de IdOO A. A camada de metal pode ser depositada sobre a superfície do substrato utilizando qualquer protocolo adequado, incluindo deposição por feixe de electrões, deposição por vapor, deposição por pulverização catódica e semelhantes, sao cc -> ·η 0 ,·“ΐ -j as pelos amada de: m. etal de ato, onde os meta 0, cu δ semelha de : metal de adesâc à e de 100 k de 7: 5 A e, em mui ti Â. I Sm alg· umas forrt desci: ! .1.13. pG be ser ur especialistas na técnica. Pode existir adesão entre a camada de metal e o is de adesão de interesse incluem., ntes. Quanto presente, a espessura da ' irá, tipicamente, variar entre cerca , normalmente, entre cerca de 25 « e is foruiaS de realização, será de cerca ias de realização, a camada de adesão ia camada de adesão molecular. Exemplos 16 molecular, incluem. de materiais adequados para formar camadas de adesá de acordo com a presente invenção f rnercaptopropi itriet iox.í ssil ano e outros mercaptoal coxissi lanos tais como raercaptopropiltrimetoxissilano mercaptopropiltriclorossílano ou outros comprimentos de cadeia tais como mercapto-hexi11 ri etoxi s s ilano e outros mercapto hexilalcox issilanos, como SâO conhecidos na técnica Onde camada de adesão é ima cam 5. d. cl de adesão molecular, a espessur da camada de adesão varia, tí .picamente, desde cerca de 5  a cerca de 50 k. O grupo de ancoragem de um agente de ligação de proteína pode ser utilizado para ligar directamente o agente de ligação de proteína a uma superfície de substrato, e. g., vidro ou metal, inorgânico. Por exemplo, pode ser utilizado um grupo de ancoragem tiol para ligar directamente a metais, tais como ouro, prata, cobre ou platina sem uma camada funcionalizada interveniente (e. g., maleimida/amina/tiol). Ou, se o grupo de âncora é um silano activado íi. e., modificado para ser reactivo com outras espécies orgânicas, por exemplo, silano hidrolisável ou silano modificado que pode condensar com hidroxilos ou outros sílancs para formar ligações siloxano), e. g., clorossílano ou um alcoxissilano, o agente de ligação de proteína pode ser ligado directamente a superfícies de vidro ou outros óxidos, tais como óxido de titânio, óxido de silício ou óxido de alumínio. Outros silanos activados para este objectivo incluem, tr ietoxi ssilano, triclorossilano, trimetoxissilano ou outros Ο X .1.3 S J.d. Ti 0 S , Dentro de cada uma das classes, ideias pode ser, por exemplo, d< s três átomo o átomos. ité cerca de 17

Como será descrito em maior detalhe abaixo, no caso da ligação do agente de ligação de proteina directamente a uma superfície inorgânica do substrato, o segmento de ligação do agente de ligação de proteína (entre o peptidomimético e a âncora) deverá ser longo o suficiente para manter o peptidomimético suficientemente afastado da superfície dura do substrato, de modo a que a superfície não interfira com a ocorrência da ligação da proteína (subsequentemente) com o peptidomimético. 0 comprimento pode ser, por exemplo, desde cerca de 2 átomos a cerca de 200 átomos ou cerca de 2 Angstroms cere a de '5 Γ) 0 J \J J. mçstroms. Um s< agrr ;0'f ito de ur ,·-Λ +-. -*/ ·** ipi CG pode ter ta estrutu ra de entre cerca df 3 2 a c 0 r· r :a de 30 á-TT.1 ome as, de um ido p refer ido, cerca de 6 a ce.rc 3. de 12 át :.orr :OS . 0 3Θ gmento de lião pode ser composto, por exi em] pio f i ror c rade I 3.3 alifáticas légua damen te dei rivalizadas (e. O f áci .doí j ami ΠΟα x ..car )ÓÍ cos, tais uno á eido ami no- -hexanóico), óx.í .do s de eti .le; no (e. g. tais como ;re se ntado na F ig. 1C), sulfór d. d os 01 i e len οβ Γ itos pe pt idicos ou iptóí des < :urtos de "não liga )" (o rtego; na.' ;) 1 que F >ermanecem ;nsta ntes para cada elemento c lo s.x. ray ’ U g c , u: m h ep tãmero de .icin a) ou algurr ta combinação de stes cor npo: nen 5 t

Como indicado acima, os agentes de ligação de proteína podem também ser ligados utilizando uma camada orgânica funcionalizada (Fig. IA, elemento 112c), tal como um tiol modificado com amino (aminotiol) (para utilização com algumas superfícies de substrato metálicas) ou um silano modificado com amino (aminossilano) (para utilização com superfícies de substrato de vidro, metal ou outros óxidos). Quando é utilizada uma tal camada orgânica, o terminal das moléculas orgânicas da camada são funcionalizadas com um grupo reactivo que se pode ligar, de um modo estável, à superfície do substrato numa extremidade e ao segmento de âncora de um agente de ligação de 18 proteína que se ligue subsequentemente, de acordo com a presente invenção, na outra extremidade. Os grupos terminais adequados incluem, por exemplo, maleimida que pode formar uma ligação covalente após reacção com um tiol existente na âncora. Uma outra vantagem de tais sistemas de ancoragem sintéticos é a sua estabilidade, conferindo longo tempo de armazenamento. Outros possíveis grupos terminais no substrato incluem, hidrazida, que pode reagir para formar ligações covalentes com porções aldeído ou cetona na âncora; aminoxilo, que pode reagir para formar ligações covalentes com porções cetona na âncora, aldeído, persulfureto, tiol, azida, fosfina.

Noutra implementação, podem ser utilizadas proteínas, tais como avidina, estreptavidina ou outros análogos como um revestimento para o suporte sólido. Neste caso, é utilizada biotina como a porção de ancoragem do agente de ligação de proteína para formar um complexo de ligação não covalente estável com a avidina sobre a superfície. Sem desejar estar ligado a qualquer teoria em particular de acção, acredita-se que este formato apresenta o agente de ligação de proteína num ambiente particularmente biocompatível com distâncias consideráveis entre as moléculas expostas e as suas vizinhas e distâncias consideráveis entre as moléculas expostas e a superfície sólida. Podem também ser empregues outros revestimentos de proteína, desde que se liguem, de um modo suficiente, um grupo de ancoragem de um pequena molécula. Estes podem incluir a n t i - d. i g o x i g e n i n a / d i g oxigenina, anti-dinitrofenol/dinitrofenol, ou muitos outros pares de proteína/pequena molécula conhecidos na técnica. A avidina/biotina é de particular valor devido à sua interacção de ligação extremamente estável. Além disso, foram observados aumentos de sinal substanciais para a imobilização da 19 biotina/avidina em comparação com outras técnicas de imobilização adequadas, de acordo com a presente invenção, por exemplo, lOOOx superior a tiol/maleimida. Também podem ser utilizadas macromoléculas sintéticas adequadas como miméticos de tais espaçadores proteicos. Estes podem incluir polímeros de elevado peso molecular, tais como polietilenoímínas, dendrímeros, ácidos poliacrílicos, polilisinas e semelhantes.

Certamente, são também possíveis outras combinações de ligação adequadas deste tipo (nomeadamente, como acima indicado, suficientemente estável para manter a ligação durante o processamento ao qual o microarray é submetido sob as suas condições de funcionamento normais). Além disso, os especialistas nas técnicas de química de superfície irão entender que os grupos de ancoragem acima apresentados no peptóide podem actuar como grupos reactivos sobre a superfície e os grupos de superfície reactivos também podem actuar como grupos de ancoragem de peptidomimético.

Numa forma de realização da presente invenção, as lâminas de alumínio podem ser revestidas com uma camada de dióxido de silício ou monóxido de silício com uma espessura de entre cerca

de T. í\ S.Í \J ‘1J 0 A a ce -C c 3 de 2! j00 ã ·· A espes ;su.ra é esco.1 .hida p «ara cor responder a, apr oxir na d aroentí ri -1 1/4 [ d.O compri .mento c ie onda da luz de emiss âo ou exci ta( 3âo. i. JTC13 C3 .Π"· 3.0. d. de um . trialc oxissi1 ano de amin ioalqui ..lo, l. cc imo triet :ox iss ilano de a.rr i.i noprop ilo (AI ’S) , tr i clor oss.r ia :ΠΟ, tr: ;.me toxis: 3 i .1 ano e < gualquei : ou ít.ro tr i alce XI3SI.1 .ano ò. v_- re" 7Θ s tida 30 bre d. camada do óx :.ido. Ά .iém dí s so, també m pode: T: S er ut.il.: out ros ar ninossil .anos, por ΘΧΘ mplo /~> ,-ΛΐΤΐ' / \— pos1 :.os com g rupos a Iqu: ilo ; na is 1. ongos, tais c :om.o oct ilo, deci lo, he.: sade CÍ J LO, 0 L.C . , ( gue ] podem formar C3IU3.d3 de sil ano ma is o.rdi anad as con: \o ser .3. QV.Í dente L para O S o g p ecialis : t 3 S 20 nas técnicas c ie química i de siq Der de silano pod< e ser de5' de cerc. 3. C mo d o mais pre ferido, c< arca de r. pre ferido, C G ,T :ca de 7 , k 3. C Θ r ca uma Ccí]TLcí dc H GG APS que tem urr •a sup erfície \S de AI modifr! C> ,"3 | fun cicnali zada ,s com um grupo rea< de âncora fu n cional de um. ag? ?nt for ma de ΓΘ3 .11. Z cLÇclG } o grup 0 Noutra fo rma de realí zacão, 0 pro teí na. inte .1 ; ΤΓ-α.'.. rcwo ·' 3. vi. desta camada A espessura a cerca de 100 A, de um ;rca de 50 A, ainda mais com aramo podem ser que se irá ligar ao grupo ligação de proteína. Numa .onal pode ser maleimida. o funcional pode ser uma substrato que apresenta avidina é descrita com referência Figs. 7A e 7B no Exemplo 3, abaixo.

Noutra forma de realização, uma lâmina de substrato com superfície revestida com ouro (ou uma lâmina com a superfície revestida com qualquer metal capaz de formar ligações metal-tiol, tal como Ag, Pt ou Cu) pode ser revestida com uma camada de aminotiol que é funcionalizada com um grupo que se irá ligar ao grupo de âncora funcional de um agente de ligação de proteína, tal como maleimida. No entanto, o grupo de âncora funcional e o grupo reactivo de ligação à superfície devem ser escolhidos de modo a apresentar reactividades ortogonais. Como acima indicado, estes grupos de âncora e ligação ao substrato podem ser permutados, como será facilmente evidente para o especialista na técnica.

Em geral, a camada 112c orgânica funcionalizada é caracterizada por ter uma superfície hidrofílica substancialmente uniforme. Por uniforme entende-se que a superfície da camada não inclui praticamente irregularidades, tais como fendas, furos, A espessura da camada 112c pode 21 variar consider avelmente, onde a espessura pode se: r inferior a cerca de 5000 A, normalmente, menos de cerca 2000 Â, mas pode ser muito mais baixa, particu mamente, desde cerc a de 5 Â a cerca de 100 Â, ou entre cerca de 20 Ã a cerca de 50 Ά

Pelo menos nas formas de realização onde o material de suporte inclui uma camada de metal debaixo de uma camada orgânica funcionalizada, e. g., quando o material de suporte é uma camada tiol modificada com. amino sobre uma lâmina de microscópi o r f;V0St ic ia com ouro, cc amo ó.( ··scri o ac ima, a espessu ra da cara a da org ânica s escolhida de modo a que a c 3]TL3CÍ3 .12c sei 3 f pelo me no O suf ic ientemente és; ")GSS3 para se parar, 0/3 3033 O y porção marcac ia com fluorescên cia que possa Θ S tar presente na superf i c .1 e uma distância suf. .ciente da p., 3i 1. a da me tálica da superf icie do subs trato, de ao d o a. que nâ 0 OC 0T033. o desv IO sígnif icat ivo do s irral (i. e “ f desv; .0 GO si n al de rnaqnitu de sufici ente pa ra dis sipar, efic 3 ZÍT ente, a det ecç ão sig; ri fica ti va do si nal) m Nestas formas de ,r ealiz ação, 3. camada orqâni C3. funcionalizada pode ter um espessura que tem, pelo menos, cerca

de 30 A, normal; mente, pelo menos, cerca de 50 *A r\ e, mais nor malmente, ps :2.0 menos, cerca de 1 00 A. Alternat ivaim ente, em /~i Ci C V.- Ui V.1 os onde : não oc :orre o desv io, a 1 .âmina pode ser tra ta da com uma solução alt :.amí snte sa] lina. tal cor ao cloreto de s ódio 0,75 M, cit rato de c; · 1-· 1 òdi ^ η π p v.·1 '.v f 'J w 5 m (ver, e, g., Pub 1 ica çâo PCT N° WO 01/01142) ,

Nas formas de realização onde o array é empregue com um alvo marcado com fluorescência, como descrito em maior detalhe abaixo, a espessura da camada funcionalizada de tiol modificada com amino pode ser escolhida para proporcionar a amplificação máxima dos sinais emitidos e reflectidos. Ver, e. g., Patente U. S. N° 5055265. Em tais formas de realização, a espessura da 22 camada orgânica será de cerca de 1/4 do comprimento de onda da luz emitida pelo marcador. Embora a espessura exacta da camada orgânica venha a variar dependendo do marcador em particular com o qual é para ser empregue, a espessura varia, geralmente, desde

cerca de, 50 Â a cerca de 300 Á, i lormalraente, desde cerca de 100 Â p r< p y a cerca de 2 ca de 150 Â. 00 A e, mais normal .mente, desdt ? cerca de 15 A

Numa forma de realização, a camada 112c tiol modificada com amino funcionalizada inclui, pelo menos, uma monocamada auto-organizada (SAM). Como tal, quando a camada pode incluir mais do que uma monocamada auto-organizada, a camada orgânica funcionalizada pode incluir uma ou mais monocamadas auto-organizadas diferentes enxertadas, sequencialmente, uma nas outras (ver, e. g,, Publicação PCT N° WO 01/01142), B. Agentes de Ligação de Proteína

Como acima indicado, os agentes de ligação de proteína da presente invenção são constituídos por três segmentos: um peptidomimético, uma âncora e um elemento de ligação, ligando o peptidomimético e a âncora.

Um "peptidomimético" como aqui utilizado, refere-se a polímeros ou oligómeros sintéticos não peptídicos que interagem, de um modo detectável, com proteínas ou receptores de um modo análogo a interacções físico-químicas proteína-proteína ou proteína-péptido sob condições de ensaio. Os peptidomiméticos são geralmente resistentes a proteases e incluem, por exemplo, espécies oligoméricas, tais como peptóides, beta-péptidos e outros como descrito em A. E. Barron & R. N. Zuckermann, 23 .y j oinspir ed pol yme ri c mate .tT .1.3.1. s: ~l n--.be twee V. prozeins a. nd pl ciSt l CS f Ci rr Op 3 r· Chem Bio.‘ L 1999, 3 (6) : 681-7 e K Ki rchenba um, R. N. Zuck cnnanr β K.. A. Dil 1, J. ’)QS igning polyme Λ? S th e mimic ' bic 'w.oíi seu. les. Curr Ορ i. π C‘ i- iem Bi.0 1 19 99 9 (4): 530-5 Θ mo léculas cíc y C 3. S rest] citas, tai S ·: somo pé ptid .os e heterocicl es cí clicos. En \ a. Iguns casos, o p ept idom imét 3 r'( 3 pode tamb ém mi metizar 0 enro 1amen to das prot eír ias nat urai s. Geralmente, os pe ptidomi méti cos d e a cordo V-· ·./ m a pr( asem :e invenção n ão co mpreendem ma: Ls GO çu; Ti cei rca d e 500-meros, ma 3 O ... Pa rticula rmen V i~i -----f não ma is do que Γ’ erca de 100-mero k-: e ti picamen te, não m.a is do que cer ca de r. f)... v/ mero 3 1 e, normalment (ti ce rca de 10 ; ?. ce V' r\ Λ. \.· (,χ de 20-me: ros, ma i s part :icu] .ar; mente, cerca de 12 a ct ;.rca de j 6-me ros. pprj < 3 i d θ.ΐ. cí.. ndo os P arâmetros aq· U .L. P-r oporeionado ' & ϊ uni especial 1 8. téc n.i co c será capaz de es C O 1 Π 3 um comp r irr Lento de p epti do;t iimé ;tico ap rop ;riad.o para u ma determinada aplicação sem alterar o método.

Exemplos de bibliotecas de peptidomiméticos e sua concepção e síntese podem ser encontrado em Fahad Al-Obeidi, et al., Peptida and Peptidomimetic Librarias, Molecular Biotechnology 1998,9: 205-223; Victor J. Hruby et al., Synthesis of oligopepti.de and. peptidominetic librarias, Curr Opin Chem Biol 1997,1: 114-119; e Amy S. Ripka et al., Peptidonzimetic Design, Curr Opin Chem Biol 1998,2: 441-452.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, o segmento peptidomimético do agente de ligação de proteína é um peptóide. O termo "peptóide", como aqui utilizado, refere-se a polímeros compreendendo amidas substituídas em Na, como descrito nas Patentes U.S. N° 5831005, 5877278, 5977301, 5871387, 5986695, 5719049, e Publicações PCT N° de Série 96/15143 e 93/09117. 24 0 segmento de ancoragem proporciona a ligação estável do elemento de array à superfície estável. Este grupo funcional é escolhido para ser reactivo em relação a um grupo complementar que é apresentado pela superfície sólida e ortogonal para (i. e., substancialmente não reaetiva com) as cadeias laterais presentes n o ligando. Uma característ ica impor tante do grupo de ancoragem é que a sua reacção com a s uperfície ê suficientemente fácil, pelo que é eonc. luída dentro do tempo de vida médio de uma gota que é depositada pelo marcador de array robótico sobre a superfície. Por exer nplo, se a superf i c u e apresenta uma maleimida, um grupo de ancoragem adequado é um tiol e são necessários, aproximadamente, 15-20 minutos a cerca de 60% de humidade para a conclusão da reacção de ligação antes da evaporação dos 10 μΐ, aproximadamente, da gota. Certamente, o tempo de vida da gota varia com a temperatura, humidade e outras condições, permitindo maís ou menos tempo para a reacção ocorrer. Como indicado acima, são possíveis outras combinações de superfície exposta/âncora, incluindo um grupo de superfície hidrazina com um grupo de ancoragem aldeído ou cetona. Ου, o grupo de ancoragem. pode também ser uma molécula de bi.otína, que se irá ligar, fortemente (ainda não de modo covalente) a uma superfície que apresenta uma proteína avidina. O grupo de ancoragem pode ser ligado ao peptidomimético em qualquer uma das extremidades (no caso de um peptóide, no terminal C- ou N-) . Pode ser ligado como um sub-monómero (e, g,, uma amina substituída) ou como uma modificação de uma cadeia lateral de peptidomimético (e. g., peptóide) após a síntese. Alternativamente, noutro exemplo, o grupo de ancoragem pode estar presente como um elemento de ligação que liga o peptóide a um suporte sólido em forma de esfera, após o qual é sintetizado. 25 na juntamente de aneoragem

Este elemento de ligação pode ser clivado da re com o peptóide, para proporcionar um grupo fac íImente dlsoon ível. ra enr 1' c. <. ce rca de 2 8. i ce roa de 6 a C ^ T ca de SP r con st itu ido , pc 9 * ; áci .dos ami noa 1c; \ } / óx: idos de et: Ller IO, pep tól. de 3 c urt os de "r con stante s par a c a da ei 0 segmento de ligação do agente de ligação de proteína é escolhido para proporcionar a separação suficiente entre a superfície sólida e o segmento peptidomimético para facilitar a interacção entre o peptidomimético e os componentes da solução de analito (solução com a qual o microarray será colocada em contacto), por exemplo ao proporcionar a separação entre a superfície do substrato e o peptidomimético, de modo a que a superfície não interfira com a ocorrência da ligação da proteína (subsequentemente), no acesso ao peptidomimético, para um local de ligação de proteína ao ligando peptidomimético apresentado na superfície, especialmente para proteínas com bolsas de ligação profundas. 0 elemento de ligação pode também servir para separar os peptidomiméticos uns dos outros na superfície, mitigando, deste modo, um possível impedimento estérico entre o ligando e a bolsa de ligação da proteína. 0 segmento de ligação típico pode ter uma estrutura entre cerca de 2 a cerca de 200 átomos, de um ) átomos. Um segmento de ligação pode ser constituído, por exemplo, por cadeias aliraticas (e. q,, ácioos aminoalcanòicos, tais como ácido ulfóxidos ou elementos 'não ligação" ("ortogonal") ;entc do array ou alguma combinação destes componentes. Numa forma de realização, pode ser utilizado um elemento de ligação de 2 carbonos. Noutra forma de realização, podem ser utilizados três óxidos de etilenc. Um exemplo de peptóide curto de "não ligação" é um 2-meros a 12-raeros, por exemplo, um 4-meros de metoxietilo de cadeias laterais que permanece constante para cada acente de ligação de 26 p r o t e í n a, e n qu a n t o elemento de ligação pepti 12-meros, por exemplo, um pept idomiraét ico é dico ortogonal adequado é 5-meros de glicina. segmenuo variável um 2-rae

Um os a

Em algumas formas de realização, onde está presente uma camada orgânica sobre a superfície do substrato, pode ser introduzida uma funcionalidade de espaçador na camada orgânica. Nestes casos, o espaçador na camada de superfície do substrato e o elemento de ligação no agente de ligação de proteína podem contribuir, colectivamente, para o espaçamento desejado do peptidomimético à superfície dura do substrato. Além disso, a mitigação do impedimento estérico também pode ser alcançada pela selecção de um revestimento da superfície que apresenta um formato particularmente biocompatível, tal como uma proteína avidina (associada com um grupo de ancoragem de biotina ao agente de ligação de proteína). A Fig. 3 ilustra um exemplo de um pequeno conjunto de elementos 300 de array, em que os segmentos 302 de ligação de proteína peptidomimético são peptóides 12-meros, o elemento 304 de ligação é uma cadeia alifática curta e o grupo 306 de ancoragem é um tiol. Os segmentos peptidomiméticos representados na Fig. 3 ilustram um subconjunto da gama de propriedades de afinidade alcançáveis utilizando peptóides como o segmento peptidomimético, de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

Como acima mencionado, o número de tipos diferentes de agentes de ligação presente na superfície do array é de, pelo menos, dois. Por "diferentes", significa que a sequência das unidades monoméricas entre dois peptidomiméticos diferentes de dois agentes de ligação de proteína diferentes não é a mesma. 27

Embora o número de diferentes espécies de agentes de ligação de proteína presentes na superfície do array seja de, pelo menos, 2, pelo menos, cerca de 10, pelo menos, cerca de 50 ou, pelo menos, cerca de 100, é tipicamente muito superior, sendo, geralmente, de pelo menos, cerca de 1000, normalmente, pelo menos, cerca de 5000 e, mais normalmente, pelo menos, cerca de 10000. O número pode ser tão elevado como 500000 ou superior, mas tipicamente não excede cerca de 100000 e, normaimente, não excede cerca de 50000.

As regiões da superfície, que rodeiam os elementos do array de ligação de proteína, podem ser modificadas, de modo a minimizar a ligação não específica de fundo de proteínas, permitindo que sejam analisadas amostras complexas (e. q., lisados ou so ro) num u n i c o passo, A superfície pode ser quimicamente b.' Laqueada c om. terminais hidrofílícos, tais c '.orno álcoois, hidrocsrbonetos, aminoácidos, sulfóxídos, acrilami ..das ou éteres. Exem pios de gr upos terminais álcool são, por exemj )!o, mercaptoetanol, mercapto- hexanol, merca pto-octanol, no caso de uma superfície Z. T. 5. t ãd.cl com maleimid a. Estes bloqueiam 3. S ma1e imi da s que não reagi . li οίΓΓΙ .0 d òU]p&I*. j_. ície. A superfície pode também ser bloqueada utilizando proteínas, tais como soluções de albumina de soro bovino ("BSA") G u albumina de : soro humano ("HSA") : a 1-10% em solução sali .na tamponada cor u fosfatos ou leite era pó magro a 1-10% ou case: i.na a 1-10%, gelar tina ou. outras proteínas de bloqueio adequadas. : Sm alguns casos, é vantajosa a adição d( a detergentes á solução de proteína de bloqueio. Por exemplo, a adição de Tween-20 * ou Triton X-100 a 0,01%-0,5% (partícul armente 0,05%), SDS a 0, 1-2% é bem conhecida nas r.écnicas de química de superfície G: Γ eve.laçáo do en saio. 28 C. Características Gerais do Array

Tipicamente, o array é caracterizado por apresentar uma pluralidade de pontos de agente de ligação de proteína num substrato sólido, onde cada ponto é caracterizado por apresentar um ou mais, normalmente, uma pluralidade de agentes de ligação de proteínas idênticos ligados à superfície do suporte. 0 número de pontos distintos na superfície do array pode ou não ser igual ao número de agentes de ligação de proteína no array, e. g., o mesmo agent e dt í ligação de i proteír ia pode estar presente em d oi ou ma i s pon tos na s súper f íc ie do ar ray. Numa for: ma de real .1 zaç ã.O cada a gente de liga ção í de proteína está presenti e em dupli cado n p γ~ y- y, τ r d.l. χ.Α.γ , Depe nder ido C 13 Π 3. tur eza dos agentes cie 1.: igaçâo, o Γ-3.Πί3. X) h da su perf í cie do sup ort e, os métodos de preparaçã Ο Θ u t i 1 i z 3 Ç 30 pret :endi da d· o a rray, o número de pontos disti ntos m superf ície do a rra y po( de variar n tio „ Quanao a superf ície d1 suport :m 3. S dime nsõ es de UIÍ13 .J. ã] !.L1. Π3 de microscó p.l1 ^ΌΓιν^Π ciona 1 ( cerc a õí 3" x 1 "), o númen o de pon : tOS n. superf ície do Sljpo rte σ, p y Í5 i"i Λ -í r Cl f .i. J. :amente, de p elo menos ~Z> í\ A p, W ú.‘ normal mente , pe ílo i renos f ΐ ? w 'J w 3 / mais normalmc ?nte, pelo men OS cerca de 1 r\ f\ a ; ... Γ. A 300 . 0 número pode ser tác 3 elevado Q U.ci ‘0 L1 100000 ou s uperior, ma s ti; picamentí s não excede cerca de 7 !Γ. A ;'s, A ·.·' \J w O normal mente , nã 0 ΘΧ cede cerca de bC ! 0 0 0 .

Tipicamente, o diâmetro de cada ponto irá variar desde cerca de 100 pm a cerca de 300 pm, normalmente, desde cerca de 200 pm a cerca de 300 pm. O espaço entre quaisquer dois pontos será, geralmente, entre cerca de 1 pm e cerca de 50 pm. A densidade dos pontos varia, geralmente, desde cerca de 1 a cerca de 5000 pontos/cm2, normalmente, desde cerca de 100 a 2000 pontos/cm2. Tipicamente, os pontos estão dispostos ao longo da superfície da camada de espaçamento na forma de uma padrão. O 29 padrão pode estar na forma de filas e colunas organizadas de pontos, e. g., uma grelha de pontos, ao longo da superfície do substrato, uma série de filas curvilíneas ao longo da superfície do substrato, e. g., uma série de círculos ou semicírculos concêntricos de pontos e semelhantes. Para aumentar mais a densidade, os pontos podem também ser dispostos de um modo hexagonal. Estão ainda dentro do âmbito da presente invenção outras disposições de pontos. 2. Métodos de Preparação de Arrays de Agente de Ligação de Proteína da Presente Invenção

Os arrays da presente invenção podem ser preparados utilizando qualquer protocolo conveniente. Um protocolo de interesse envolve 1) a obtenção de um suporte í sói i do com uma superfíci e activac la para a ligação de um agente de 11gação d e proteína; e 2) co ntactc de dois ou mai s agentes de ligação de proteína diferente s com a superfície do suporte, sob condições, em que o s agentes de ligação de proteí na se ass· OCÍc im, de modo estável, com a sup· erfície do suporte. A. Preparação do Suporte Sólido 0 suporte sólido pode ser preparado utilizando qualquer metodologia conveniente, metodologia a qual irá variar dependendo da natureza do suporte sólido em particular. De acordo com uma forma de realização da invenção, um suporte de vidro é revestido com uma camada de metal, e, g,, alumínio ou ouro. Para preparar um suporte sólido de vidro revestido com uma camada de metal, a superfície de vidro é revestida com uma 30 coore.

Camada . na do meta1, titânio ou alumínio, e Ç-i numa espessura c: orno desc: camada de metal pode se r depositada sol bre a s S úíÍDS l. 1.·3. lO / uti Usando qua iquer protocolo convenie protocolos convenientes incluem, depos: ição po electrões, deposição por vapor, deposição por uoerfície do catódica e semelhantes e são conhecidas pelos especialistas técn ica. Ver, e . g., Moteshar i. et aí., J. Am . Chem. Soc. (1998) 120: 1328-1336/ Bai n et aí. , J. Am. Chem. Soc. (1989) ii-i: “ ·] rs fr., -7164; Lee e t a 1 . Langmui r (1998) 14: 64. 19-6423; Folkers et aí., Langmuir ( 1992) 8 : 13 3 0 - 1341. Onde conveniente, pode estar pres' ente uma ca ma da de metal de adesão entre a camada de metal e o S11 b S t .T cl t O f onde os metal s de adesão de interesse incluem, titânio, crómio e semelhantes, depositados numa espessura como acima descrita. Além disso, podem ser depositadas camadas soJDrepostas de óxido, tais como dióxído de silício ou monóxido de silício por deposição por feixe de electrões ou deposição pulverização catódica, sobre a camada metálica.

Num exemplo, após a preparação de um substrato de ouro, se o grupo de ancoragem do agente de ligação de proteína é um tiol e o grupo de ligação é suficientemente longo (como acima explicado), os arrays de acordo com a presente invenção podem ser formados por aplicação em pontos de agentes de ligação de proteína exibindo tiol em ouro limpo, sem revestimento. A superfície de ouro do substrato pode ser limpa utilizando uma solução de limpeza de ácido crómico (e. g., óxido crómico ou dicromato de sódio em ácido sulfúrico, por exemplo, Nochromix, disponível de Fisher (Dicromato de sódio a 50-80% em ácido sulfúrico 12 N)) e enxaguada com água de nível de HPLC. Isto tem a vantagem de reduzir o número de passos de funcionalização da superfície. 31

Noutra forma de realização, onde o grupo de ancoragem do agente de ligação da proteína é um silano modificado funcionalizado (e. g., silanos mono-, di- ou tri-funcionais, tais como clorossilano, um alcoxissilanc·, dicloro ou díalcoxissilano, ou tricloro ou trialcoxissilano), o grupo de ancoragem pode ser ligado directamente às superfícies contendo óxido, tais como vidro, óxido de titânio ou óxido de alumínio. Os arrays de acordo com estas formas de realização da presente invenção podem ser formados por aplicação em pontos de agentes de ligação de proteína exibindo silano sobre a superfície do substrato oxidado. Um substrato de vidro apresenta hidroxilos de superfície disponíveis para esta ligação. As superfícies de substrato de metal podem ser oxidadas, por exemplo, através de tratamento químico ou térmico. Por exemplo, o alumínio pode ser oxidado electroquimicamente, termicamente ou quimicamente (e. g., com H2O2) , como é bem conhecido na técnica. Além disso, pode ser depositada uma camada de dióxido de silício ou óxido de titânio sobre o alumínio. Pode também estar presente um óxido como uma camada fina de origem, tal como ocorrer com o alumínio ou silício. Este óxido de origem pode, depois, ser derivatizado pelo amino-silano.

Ainda noutra forma de realização da invenção, uma superfície de substrato de metal, e. g., ouro ou alumínio, é inicialmente funcionalizada com moléculas orgânicas funcionalizadas que formam monocamadas ordenadas. Os terminais das moléculas orgânicas são funcionalizados com um grupo reactivo que se pode ligar a um grupo de ancoragem adequado de um agente de ligação de proteína. Os grupos terminais adequados podem ser, por exemplo, maleimida, hidrazida, aminoxilo, um éster activado, tal como N-hidroxissucinimida, anidrido, 32 aldeído, persulfureto, tiol, azida, fosfina ou avidina, dependendo do grupo funcional de âncora.

Numa forma de realização, as moléculas orgânicas funcionalizadas são moléculas de tiol modificadas com amino. De modo a funcionalizar a superfície do metal com as moléculas de tiol, o substrato com a superfície pode ser imerso numa solução do tiol modificado com amino; a solução de tiol modificado com amino pode, depois, ser depositada sobre a superfície do substrato. Podem ser empregues outros protocolos convenientes. Tipicamente, o substrato de ouro é imerso na solução de tiol modificado com amino sob condições e durante um período de tempo suficiente para as moléculas de tiol modificadas com amino de organizarem numa monocamada sobre a superfície do substrato. A temperatura à qual o contacto é efectuado varia, tipicamente, desde cerca de ]. 0 0 r·· v.. α cerca d< 3 1 Λ 0 w U C, no rrt lei Iment e, desde cerca de 15 0 t.-\, ^ eer ca de 80 °C. o oont η Ί" r\ C.\ manti d.c / durante um períod o de t :empo s u.f ici ente pa.i ií cl· a mo nocam ac 3a auto 1 c srganizada se formar sobre a supe 3 rf.ic.ie de ou ro, 0: id. 0 o contacto é, típica mente. mant.i do dr :rante, Pe- 1.0 13' enos, c Ο Γ-Λ rca c 3e 20 minutos, normal mente, pelo menos n cerca 0' e '! hora s; pi ·- f mai s normalmente, pelo m .enos, cerca : de 16 horas.

Alternativamente, o aminotiol também pode ser depositado por deposição por vapor num forno de vácuo ou por revestimento por centrifugação. Por exemplo, pode ser preparada uma solução de tiol a 1-10% (i 2. OU , è) de tiol r rum sí alver ite volátil, tal C 0 mo is opropanol, metan o.l ou TnF. As .1. âm.i. .nas podem ser Γ' pi nt r.í f uc radas a ce rca de 000-8000 rpn s (e. g., 5000 rpm) rara pr oporcic xoar uma deposí çâ .o uniforme do tiol Depois, uma mo lécula heterobif uncíona -j (e, g.t (N-ma .leirn idometil) -c: leio- he xano-1- •carboxilat o de C» uccinimidilo (SMS ... i ou LC (c; adeia 33 longa) ...... SMCC), que é um éster activado numa extremidade e uma maleimida na outra extremidade, é colocada em contacto com o para proporcionar a sup· e r f r c i e t e r mi. nada em também podem ser utilizados outros elementos de reticul ação heterobifunciona i s com e spa ç a do re s de diferentes comprimentos (e. g., um espaçador de óxido de etileno longo (e. g., 2-4 unidades) entre um éster NfíS numa extremidade e uma maleimida na outra extremidade. Como indicado acima, o espaçador no substrato tem. o mesmo objectivo que o "elemento de ligação" no agente de ligação de proteína.

Noutra forma de realização, podem ser utilizadas lâminas de alumínio. 0 alumínio metálico pode ser depositado por deposição por feixe de electrões sobre um substrato de vidro limpo. 0 revestido com dióxido de silício (Si02) ou .o num espessura que é igual ou inferior a 1/4 onda da luz de emissão ou ex c i t a. ç á o. Po d em ser ras de óxido de cerca de 600 a 1000 Angstroras, eliminam a ne* cessidade de d 1.1 u í c áo do ó x i d o monoxioo uma vez que es·· antes de efectuar as experiências de ligação. A superfície de alumínio/óxido pode ser tratada com um silano modificado com amino. Por exemplo, as lâminas de alumínio revestidas de fresco com uma camada de 800-1400 Angstrom de dióxido de silício podem ser imersas, imediatamente, num banho de trietoxissilano de aminopropilo a 3%-40% em isopropanol, que foi previaraente filtrada através de urna membrana de filtro 0,2 μΜ e silanizada durante ma is de uma 1 hora, seguida por enxaguamento e secagem. Alternativamente, as lâminas de alumínio revestidas com silano (APS) estão disponíveis de Amersham-Pharmacia, Amersham,

Inglaterra (e descritas no Pedido de Patente Internacional N° WO 98/58304), him alguns casos, tais lâminas disponíveis comerciaimente podem necess.ir.ar uma redução da. espessura da 34 e cerca de 1000 A, e cerca de 1000 Â, . iqação, de modo a camada de mais parti antes; de óxido paia entre cerca de 200 A oulaumente, entre cerca de 900 A se efectuar ura experiência de melhor ar as proporções de sina] .. para ru.j.cío. As superfícies de Ai modifí cadas com. arai no finn-io y. odern ser fun< sionalízadas com SMCC para p >roporcionar uma superfíci ..e que aprese nte grupos funcl .onais maleim LÍc.a. Aqui, novsmení-e o si,lano pode • ser depositada 5 por vapor ou revestido por centrai :ugação, como descrito acima . Po r exempl o, pode ser preparada u ]t a s o .1. u ç â o de silano a 1-10% (e. g. , 5%) num solvente volát il, tal como ísopropanol, me ! t a η o j. ou THF„ As lâminas poderá ser centrifugadas a 1000-8000 rpm (e, g., 5U00 .rpm) para proporcionar uma deposição uniforme do si lano. Depois, uma molécula heterobifuncionai (e, q., 4-(N~ maleimiaoraerii}-c i clo~hexano-1-carboxi1ato de succinimidilo (SmCC) ou LC-SMCC)), que é um. éster activado numa extremidade e uma ma lei mia a na outra extremidade, é colocada era contacto com o grupo aramo para proporcionar a superfície terminada em maleimida. Também podem ser utilizados outros elementos de ligação de retrcuisção heterobifuncionais com espaçadores de diferentes comprimentos (e, g., um espaçador de óxido de et.ίleno longo (e. g., 2-4 unidades) entre um éster NUS numa extremidade e uma maleimida ou biotina na outra extremidade. Como indicado acima, o espaçador no substrato tem o mesmo objectivo que o "elemento de iigação" no agente de ligação de proteína.

Ainda de acordo com esta forma de realização, verificou-se que a amplificação do sinal fluorescente utilizado nos ensaios efectuados com microarrays, de acordo com a presente invenção, pode ser potenciada por causticação das lâminas de alumínio ponteadas e funcionalizadas disponíveis comercialmente (Amersham) de modo a reduzir a espessura da camada de óxido para cerca de 200 Â a cerca de 900 Â, de um modo preferido, cerca de 35 500 Â, Por exemplo, pode ser aplicada uma solução de causticação com cerca de 0,1-0,2% de SDS/5X SSC (0,75 M NaCI/citrato de sódio 0,085 M) e, opcionalmente, EDTA 5 mM a cerca de 50-80 °C, de um modo preferido, cerca de 60 °C durante cerca de duas a quatro horas. Como indicado acima, a deposição manual de uma camada de dióxido de silício com um espessura adequada pode eliminar a necessidade de reduzir a espessura da lâmina.

Como indicado acima, quando a superfície do substrato apresenta um monocamada auto-orqanizada orgânica, após auto-organização da monocamada inicial, podem ser exertadas uma ou mais camada adicionais na monocamada inicial, em que a(s) camada(s) adicional(is) são constituídas por moléculas, e. q., slquilos, com funcionalidade que proporciona a sua ligação cova lente as funcionalidade da superfície da monocamada inicialmente depositada, e. g., funcionalidade amino quando a monocamada inicialmente depositada é caracterizada pelo presença de funcionalidades carboxilo. Alternativamente, podem ser preparados espaçadores com múltiplos componentes antes da ligação à superfície. B. Síntese dos Agentes de Ligação de Proteína

Como acima indicado, os agentes de ligação de proteína da presente invenção são constituídos por três segmentos: um peptidomimético, uma âncora e um elemento de ligação que liga o peptidomimético e a âncora.

Os peptidomiméticos podem apresentar várias estruturas e características poliméricas não peptídicas desde que consigam mimetizar os efeitos biológicos dos péptidos naturais. 36

Referências a estruturas peptidomiméticas foram proporcionadas acima. Numa forma de realização da presente invenção, o segmento peptidomimético do agente de ligação de proteína é um peptóide.

Podem ser sintetizadas bibliotecas de peptóides utilizando técnicas de síntese de fase sólida robóticas, tais como as desenvolvidas pela Chiron Corporation of Emeryville, CA. A diversidade da biblioteca pode ser controlada pela natureza e disposição dos submonómeros amina (ácido broraoacético e aminas substituídas) utilizados na síntese de peptóides, como descrito nos documentos de patente u.S. acima incorporados. Como ilustrado na Fig. 2, as bibliotecas podem ser preparadas de acordo com. um processo 200, utilizando a síntese 202 misturar e separar ou síntese paralela, uma vez que peptóides í sintetizados, mas apen as uma espécie que existem vários determinada esfera (i. e., cada esfera possui um único composto, repetido muitas vezes). A quantidade de composto por esfera pode variar desde cerca de 1-100 nanomoles, sendo muito típico 20-40 nanomoles. São normalmente obtidas cerca de 40 nanomoles por esfera. Os peptóides sintetizados, ainda ligados à resina, podem depois ser distribuídos por placas 204 de 96 poços (ou outras placas de múltiplos poços, tais como placas de 384 poços ou 1024 poços), utilizando, por exemplo, tecnologia de sel.ecçâo cri ta no pec íido de Patente U.S. referenei rima. A utili zação d le resina de "es fera gran ; de cí arca de 500 μ) permite a dístri ..buíção de ;tera por poço.

Os peptóides podem depois ser secos, clivados da resina (e. g., com cerca de TFA a 20-95% em diclorometano; sendo 95% típico), re-dissolvidos em acetonitrilo/água, filtrados ou centrifugados, secos e re-dissolvidos em 50% de DMSO/50% de 37

Tampão. Também podem ser utilizados outros sistemas de solvente/tampão, tais como 50% de DMF ou 50% de NMP sendo o restante PBS, TBS, Borato, Tris-HCl, etc. Em alguns casos, também pode ser adicionado um agente redutor, tal como tris-carboxietilfosfina (TCEP), aos poços da placa de aplicação em pontos para inibir a oxidação dos tióis dos peptóides, de modo a estes reterem a sua reactividade em relação às maleimidas da superfícies do substrato. Nos casos onde é adicionado TCEP aos poços, devem ser evitados tampões de fosfatos, tais como PBS e serão preferidos tampões, tais como TBS. Esta solução final está pronta para a aplicação em pontos.

Numa forma de realização da presente invenção, a concentração dos peptóides nos poços da placa de aplicação em pontos deve estar na gama de cerca de 0,5-2 mM, em que 2 mM é preferida. Para a aplicação em pontos no suporte 206 sólido planar preparado, os peptóides são filtrados ou centrifugados, secos e ressupensos, como descrito com maior detalhe abaixo. É útil que o material a identificar na lâmina esteja em excesso em relação à quantidade de sonda em solução a ser aplicada no microarray. Esta é uma quantidade que proporciona um sinal de fluorescência de saturação, de modo a que alterações na intensidade do sinal são devido, substancialmente, aos níveis de proteína.

Os grupos de ancoragem e elemento de ligação podem ser ligados ao peptóide através do terminal C ou do terminal N. Podem ser ligados como um submonómero (e. g., como descrito na Patente (J.S. N° 5877278) durante a síntese do peptóide, como descrito acima nos documento de patente, ou com passos de junção de aminoácidos actívados ín como modificação do 38 m os processos conhecidos psptóide após a síntese, de acordo pelos especialistas na técnica.

Para a ligação ao terminal N, o peptóide pode ser sintetizado numa resina e, depois, os grupos âncora e o elemento de ligação podem ser adicionados antes da molécula inteira ser clivada. Por exemplo, os peptóide podem ser preparados em resina Rink de poliestireno de amida, como ilustrado e descrito no Pedido co-pendente N° 09/704-122. O processo de síntese é também referi do em Figl iozzi, I 3. t*: 1-, Goldsmíth, r ·. O ; Ng, S. C., Banvil le, Q O « 's.· . f Zuekerma: n.n, I 1. N . Metods Er 'zymol „ 19 9 b, 267: 137-44 •n Aindí i f ci ] ntes da < cl iva .gem, podem ser adiei onados i um ou ma i s íe. 9' / do.i _s a quí itro, cie um modo p >refer ido, qu atro) submon orne: ro s de grupos de líg. ação hidro fílicí ss (e. rt * f metoxí eti lamm .8) 8 o termin; al N do p •eptóide. De; pois, é adiei onada uma cisteamina protegida com tritilo de modc proporcionar um grupo de ancor agem tíol. 0 peptóide co: m grupos de : ancora gem. e o C.\ ] C.\ η"; c·. nto de li: gação ligados pode, depoi .s, ser c ]. ia. /a oo 0.a res ina, por exe mplo, utilizando TFA a 95% (v/v) em dicloj ::ome tano (ch2c: 1-2) . A sol uç a o resultante está, as £ 3irn, proa . 18 para aj )lic ação (em p )Ont os) na s laminas de microarray, de acori do com a i ? res ente invenção,

Noutra forma de realização, uma beta alanina protegida com FMOC é ligada ao terminal N do peptóide por activação in situ com Hobt e DIC, como é conhecido pelos especialistas nas técnicas de síntese peptídica. A beta alanina actua como uma molécula adaptadora entre o peptóide e o elemento de ligação peptídico. Após a ligação da beta alanina, um aminoácido protegido com FMOC num elemento de ligação peptidico (e. g., glicólico), por exemplo, é ligado ao terminal N da beta alanina. 39

Finalmente, é adicionada biotina ao terminal N por junção peptidica. 0 grupo de ancoragem tiol ou biotina também pode ser ligado à extremidade do peptóide ao terminal C. Por exemplo, o ácido 4-(difenil-hidroximetil)benzóico (disponível da Fluka) é tratado com cloridrato de cistamina na presença de um catalisador ácido. Posteriormente, a amina resultante é protegida como o derivado N- (9-flurenilmetoxicarbonilo) [N-FM.OC) e o FMOC-NH-CH2CH2-S-Tr-COOH resultante é associado às Esferas Grandes de aminometilo (400-500 mícrones, Polymer Labs). O peptóide é sintetizado na amina desprotegida como descrito acima e o tratamento com TFA resulta na clivagem do peptóide modificado com tiol da resina, enquanto o grupo de protecção tritilo permanece na resina. C. Contacto do Suporte Sólido com os Agentes de Ligação de Proteína

Após preparação do substrato e agentes de ligação de proteína, como descrito acima, dois ou mais agentes de ligação de proteína de interesse que são para ser ligados à superfície para produzir o array, são colocados em contacto com a superfície do substrato funcionalizada, ou de outro modo, preparada (limpa, oxidada, etc.). Por contacto entende-se que os agentes de ligação são colocados em proximidade com a superfície de modo a que fiquem ligados ou associados, de um. modo substanciaimente, estável com a superfície da camada do substrato.

No contacto dos agentes de ligação com a superfície do substrato, podem ser empregues quaisquer meios convenientes para 40 o contacto da superfície com os agentes de ligação que resultem no padrão desejado de pontos do agente de ligação, como descrito o men Cl· onaao acirm: r qua lq uer mé ítodo i g a ç a 0 e a si iperf luçào iquosa í e. ’í / no J j : V de água /DíMSC o conts !.Ct.O, 1 em q\ acima, e. g., por apxicacao em pontos, como mencionaoo acima, o termo je em grande proximidade o agente de ligação e a superfl g., ou semelhantes) do agente de ligação durante o contacto, em que a solução pode compreender um ou ma is componentes para além de água e o age ;nte de liaacáo, e. g.f agem semelhantes. Outros sistemas incluem, 50/5 NMP/PBS, DMF/ 'PBS ou todos esti es solventes 'ampâo, sais e 'TES, DMf/TBS, mistura 50/50 também pode ser ajustada. Por exemplo, quando é . um 8 ΌΘΓΟ emcage ;m ma das gotas poderr i. ser .e ms sis ele vada c ici SO.. O p ;“\ r] ,Ο Ο (Ώ r con trola ite, o contacto é < : de dif er entes agen da super ficie do £ : de agente de ]. si L CfciÇãC .oca.] . izaçao *0 d .1; ‘0 perfí elevada da solução aquosa, os gotas podem ser ma ais e.levada da soiuça x>de ser controlada,

Tipicamente, deposição discretas diferente própria L

Os agentes de ligação podem ser depositados na superfície de suporte utilizando quaisquer meios convenientes, e. g., por pipetagem. Têm sido desenvolvidos vários dispositivos e protocolos para depositar soluções aquosas em localizações exactas de uma superfície do suporte e podem ser empregues nos presentes métodos. Tais dispositivos incluem, dispositivos de impressão de "jacto de tinta", deposição mecânica ou dispositivos de pipetagem e semelhantes. Ver, e. g., Patente U.S. N° 4877745; 5338688; 5474796; 5449754; 5658802; 5700637; e 41 5807552. Os dispositivos robóticos para depositar, de um modo preciso, volumes aquosos em localizações discretas de uma superfície do suporte, i. e., arrayers, estão também disponíveis comercialmente de vários vendedores, incluindo: Genetic Microsystems; Molecular Dynamics; Cartesian Technologies; Beecher Instruments; Genomic Solutions; e BioRobotics. Alternativamente, pode ser utilizada a tecnologia de jacto de bolha recentemente descrita por Okamoto, Suzuki e Yam.amoto, Nature Biotechnology, vol. 18 (Abril, 2000), 438.

Como indicado acima, uma característica importante de um processo de acordo com a presente invenção é que a reacção entre o grupo de ancoragem no agente de ligação de proteína e a superfície do substrato de ser suficientemente simples, de modo a estar concluída dentro do tempo de vida médio de uma gota que é depositada pelo aplicador de pontos de array róbotico sobre a superfície. Por exemplo, se a superfície é funcionalizada e apresenta uma maleimida, um grupo de ancoragem adequado é um tiol e são necessários, aproximadamente, 15-20 minutos a cerca de 60% de humidade para a conclusão da reacção de ligação. Como indicado acima, são possíveis outras combinações de apresentação de superfície/âncora, incluindo as que formam ligações estáveis, ainda que não covalentes, tais como avidina e biotina. D. Bloqueio do Chip

Após aplicação em pontos da biblioteca do peptóide no substrato do array (chip), a restante superfície não revestida do chip pode ser funcionalizada com uma molécula que apresenta um terminal hidrofílico. Prevê-se que estes terminais hidrofílicos reduzam ou eliminem a ligação não específica de 42 proteínas na mistura complexa. A porção hidrofílica pode consistir em álcoois, sulfóxido, hidrocarbonetos, acrilamidas, com terminal hidrofílico, tais como álcoois, hidrocarbonetos, aminoácidos, sulfóxidos, acrilamidas e éteres ou outro grupo com ligação reduzida a proteínas. A molécula de apresentação hidrofílica é ancorada ao chip do mesmo modo que o peptóide que já foi aplicado em pontos. Por exemplo, os chips ponteados com a biblioteca peptóide podem ser quimicamente bloqueados com cisteína, mercaptoetanol ou outro tiol hidrofílico adequado. Os chips também podem ser bloqueados com proteína, tal como BSA a síí :.e raagr o em pó a 1 /*·. caseína a 1% c lu srant e, p -elo ho ra, en; dos · com á gua e secos . Outro; 5 age ntes de possívels 8 â 0 indi .cad os ac ima. Os agentes de 1 iloqu Θ.Ί.0 al pliçado s no S Chã ’ n por tr teíos berr i conhec i dos ρβ.ΙΓΗ OS ; t a s na técnii -Ca r taí s COil no mergu. ihar os Cí). 11 as n uma. à ; rn agen te d; 3 biC que .IO / p' intar a : superfic i e do 'S ch 'ípS o.l' ução ó.í a agg de b.l .oqu' eio ou p >or reve • 3 time nt o por centr.í fuaacão. E. Sumário

As Figs. 4A e 4B ilustram, resumidamente, processos para preparar arrays de agente de ligação de proteína para algumas formas de realização da invenção, de acordo com os processos acima descritos. Na Fig. 4A, é representado um processo (400) para preparar um array, no qual os agentes de ligação de proteína são ligados, directamente, à superfície inorgânica de um substrato planar, sem revestimento. É proporcionado um substrato 412 planar com uma superfície de alumínio ou ouro (410). A superfície é preparada para ligação (limpa) como acima descrito. Os agentes 422 de ligação de proteína com um grupo 434 43 de ancoragem tiol são aplicados em pontos no substrato 412 (420) . li ma ve z conc iluída a líaac ão dos agentes de ligação de proteína, é aplicado um agente 432 de bloqueio, no meadamente, um grupo hi drofí Líco, ta.l. como um álcool ou uma proteína, na superfíci .e do substr ato 412, onde não está ligado agente 422 de ligação c ie pro teína ! f\ o. r·, \ \ ‘i -J P' } .

Na Fig. 4B é representado um processo (450) para preparar um array, no qual os agentes de ligação de proteína são ligados à superfície de um substrato planar via uma camada de superfície orgânica. É proporcionado um substrato 462 planar com uma superfície de alumínio ou ouro (460) . A superfície é preparada para ligação por aplicação de uma camada 464 funcionalizada de tiol modificado com amino ou silano modificado com amino, como descrito acima. A camada 464 inclui uma funcionalidade 466 tiol ou silano que se liga à superfície de ouro ou alumínio do substrato 462 e uma funcionalidade 468 de ligação, tal como maleimida, para uma subsequente ligação do agente de ligação de proteína. Os agentes 472 de ligação de proteína, com uma funcionalidade 474 no grupo de ancoragem complementar à funcionalidade 468 de ligação da camada de superfície do substrato, são aplicados em pontos no s ubstrato (470) . Uma vez concluída a ligação do s agentes de .1 Cí 3. Ç d. O de proteína, é aplicado um. agente 432 de bloqueio, nomeadam •ente, um gr upo h.ídrof ílic •0, ta.l como um álcool ou uma p: rateina, à superfície do substrato, onde não est .á ligado o age ante 4 72 de ligação de proteína (480). 44 3. Métodos de Utilização de Arrays do Agente de Ligação da Proteína da Presente Invenção

Os presentes arrays encontram utilização em várias aplicações diferentes nos quais são detectados processos de ligação entre agente de ligação ligados à superfície do array e analito(s) de interesse numa amostra de teste. Por outras palavras, os arrays da presente invenção encontram utilização em ensaios de ligação. Em tais aplicações, o agente de ligação ligado ao suporte actua, geralmente, como um "alvo" para a "sonda" do analito na amostra de teste. A sonda do analito é tipicamente marcada, e. g., onde o marcador pode ser um marcador direc tarne: nt e d< 310 C T.. 3. νθ .1. \ f a, g., isótopo rac iioactivo, marcador flúor esee: nt e, n larcador quí miolumin escente, et c.) ou um marcador indir- ectai rue nte detectávei (e. g. ,, membr 0 de um si .s tema. de produ· ÇâO d e s inal, tal como im i ligand 0 para um anticorpo marca- '•S Γ\ ^λ- t O: ide o marcador pode se =r enzimic itic •o que co: nverte um SUbSt. rato num. produto c: romogéni co, etc - / onde o anticorpo marcado pode ser um anticorpo secundário marcado) de modo a que os processos de ligação podem ser facilmente detectados.

Em particular, os arrays de acordo com a presente invenção são úteis na realização de análises proteómicas de amostras proteicas complexas. Como aqui utilizado, os proteómicos são a separação e/ou quantificação e/ou identificação de uma ou mais proteínas numa amostra. A amostra pode ser derivada de uma célula (e. g., proteínas do citosol da célula, membrana ou extra-celulares), tecidos (e. g., dissecados ou microdissecados com laser), fluidos corporais (tais como urina, sangue, fluído espinal) ou qualquer outra amostra contendo proteínas. Os resultados de tal sepa ração/quantificação/i denti fica ção podem produzir novos alvos da proteína para o rastreio de fármacos. 45 proteínas para diagnóstico ou novos .ligando s sintéticos par ensaios ou purificação de proteína. Os arrays podem ser utilizados de um modo m uito eficaz, em diferentes ensaios de ligação de proteína. Por exemplo, podem ser efectuaoas duas { ry> \ \.· w. mais) marc,: ações com co r fluorescente de misturas protei . c s s complexas e : 3. cl D cl ,J. .1. 80 Q a ligação difer encial de proteínas ao array por iraagiologia de fluorescência. Como descrito abaixo, os arrays podem ser utilizados em combinação com outras técnicas, para identificar, sequenciaz e estruturaImente caracterizar, de um. modo diferencial, as proteínas ou péptidos expressos de interesse. Os ârrays podem, ser efectuadcs em paralelo com arrays de ADN e os resultados de .ligação diferenciais comparados para identificar correlações entre a actrvidade dos genes e a expressão proteica. Também podem ser preparados e utilizados arrays mistos, em que as moléculas que constituem o array incluem, anticorpos, etc., para se efectuar ensaios de ligação.

Podem ser utilizadas várias técnicas para se efectuarem ensaios de ligação diferenciais utilizando arrays, de acordo com a presente invenção {"microarrays proteómicos"), Algumas destas técnicas, como utilizadas em formas de realização da presente invenção, são descritas abaixo: A. Marcação da Proteína

As amostras proteicas complexas são marcadas utilizando técnicas convencionais, muitas das quais tendo sido desenvolvidas para análise em gel 2-D de misturas proteicas. Por exemplo, a amostra A pode ser marcada com um corante Cianina 3 ("Cy 3") (λ.ΓίΧ = 550nm/Àf.;V< = 57Qnra) e a amostra E é marcada com um corante Cianina 5 (Cy 5} (Xex = 650/aSV5 - 670 nm) reactivo com 46 amina (os corantes disponíveis de Amersham-Pharmacia) . As amostras A e B podem ser, por exemplo, de tecidos ou linhas celulares normais ou doentes, tratadas ou não tratadas, etc., respectivamente. 0 corante que não reagiu pode ser separado da proteína marcada utilizando métodos convencionais, tais como filtração em gel, diálise, etc. Certamente, como indicado acima, vários marcadores diferentes são bem conhecidos pelos especialistas na técnica incluindo, mas não limitado a, isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), isotiocianato de fluoresceina (FITC) e éster de succidimidilo, seus derivados ou qualquer outra molécula corante que possa reagir com proteínas via as cadeias laterais dos aminoácidos, tais como cadeias laterais amina (lisina), cadeias laterais tiol (cisteína) ou outro grupo funcional adequado. B. Ensaio de Ligação e Leitura do Chip

As amostras de proteína marcada são incubadas com o chip de microarray proteómico durante períodos de tempo e sob várias condições de pH, conteúdo em sal e temperatura que se prevê que modulem a afinidade de várias proteínas para os elementos do array. Geralmente, as amostra são colocadas em contacto com o microarray por introdução de um volume apropriado da amostra fluida na superfície do array, onde a introdução pode ser por submersão da superfície com a amostra, deposição da a; mo s l. r a superfície, < s. g,, com jm pipeta, imers. ão da total . idade do ar na amostra e sernelhant es. Em muitas rOíTílctS ΟΘ reali . Z S Ç S O y solução é de] positada na superfície e, d< ''n y\ /”·. "i c? .--n τη y™ •^N·’ -J- v_‘ / v_. rei m i d a com. lamela de cobertura ou numa câmara selada. 47

Por exemplo, pode ser aplicada uma alíquota de 25 yL -100 yL (tipicamente, 50 pL) de cada solução de sonda à superfície de um chip com as dimensões de uma lâmina de microscópio convencional, e uma lamela de cobertura limpa colocada por cima, comprimindo a solução de sonda sobre a su perfíci e do cl í.ip ·) As sol uções : de pr oteína podem, er 1 L ã o, ser Γ' --Λ -incubadas com -*\ rb Su.· J . tip durante, pelo m· enos, 1 hora ou < de um. dia pa ra o outro. Ap; -*> c; -/ V-' ir ícubaçã· 0 lamela de cobertura · e r eme iv.i.da e 0 chip 1 .avado, po jr exemplo em PBS Ix /Tveen a u f 0 •J '“ο Γ\ Ί 1 V-· C* outro ta mpâo a; iequado cont endo t ensio activo. 0 chi p pode se rr lavado ut ilízanc io vária Cl C~< ndições 5 que díminu lem ou aument arn 0 rigor. Es tas c· ondições pc >dem r ovame snte s er pe rsonal.í zac ias para pe rmitir, por e :xe mp. 0 f 3 rete nção ds s, ape nas, a. s ; pre >teínas li gadas r nuito fc ).rt •.emente. ' 3u, c :omo o caso pi ode gai :ant :.ir , pode se r util .izada i mm 3 J.riVclCje] m me ΠΟ 8 Γ1 gorosa para pe. rrai .tir a. vi suaiiza .Ç3.0 cle pr Oti sinas J. igada ís, comparat.lv. amente, Gv i u m modo ma is fr, aco. A es< colha é provável mente detern ri. na ida pela r> mplexid iade e di rsidade do array pept 1. domimét 1 r i ,-λ • v-· ( i n rr • * 0 » t pe ptoíde) que é > ap.i resenta 0 0 o chip e na tureza da rr mistura pr ot ei ca.. Os chi Ips 1 . avados são depois secos, por ç jxen rpl o, sob um a corre :nte de i ire jon ou Asç sto.

Após lavagem adequada, o chip é medido num digitalizador de array, tal como são bem conhecidos na técnica. A proporção de Cy 3 para Cy 5 para cada ponto é determinada utilizando software disponível comercialmente. São observados pontos que apresentam uma proporção consideravelmente superior a ou inferior a um, e consideradas como sendo "diferenciais". A Fig. 5 ilustra, resumidamente, um processo para se efectuar um ensaio de ligação proteómico diferencial utilizando arrays de agente de ligação de proteína para uma forma de 48 realização da invenção, de acordo com os processos descritos e com a obtenção de acima. Na Fia. sso (10 0) inici. duas amostras bi ológi cas para comparar, e. g., um a linha 502a celular "não tr aLSd?. " e uma 1 .inha 502b cel uiar ' "tratada". Os lisados 504a, b celul .ares são isolados da s amostr as de linhas celulares. Os li s a dos são marc a dos, por exei nplo, c • lisado 504a celular "não tr atado" é marcado com u ;m. c orante fluorescente verde, enquarc Ί- r> o lis ;ado 504b celular v 'não t r a t a d o " é ma r c a d o com um corar íte fluo rescente vermelho. P\ C; amo st ras 506a, b marcadas são, Qt epois, co-incul nadas num chi p 508 de array de ligação de proteína, de acordo com a presente invenção, e. g., um array de peptóides. A proteína nas amostras pode ser desnaturada ou nativa. Por exemplo, com a adição de SDS a 1-2%, as proteínas nas amostras podem ser desnaturas e os agregados ou interaeções hidrofóbicas minimizados ou eliminados. Alternativamente, os agregados, que podem ser importantes na elucidação das vias de ligação proteína-proteína, e as proteínas podem ser mantidos nos seus estados nativos e os resultados estudados. 0 chip é depois medido num digitalizador de array. C. Sequenciamento da Biblioteca A sequência do peptidomimético que se liga a uma proteína expressa, de um modo diferencial, pode ser determinada por técnicas de sequenciamento da biblioteca. Isto pode ser alcançado, por exemplo, através de métodos de EM/EM que permitem a fragmentação do peptóide ao longo da estrutura amida. Estes métodos são descritos na Publicação PCT N° WO 00/72004. A partir da massa do produto de fragmentação, pode ser determinada a sequência do peptóide isolado. 49 D. Processamento Pós-Ãrray: Isolamento, Purificação e Identificação da Proteina

Uma vez determinada uma proteina ou conjunto de proteínas como sendo diferenciais entre as amostras A e B, podem ser isoladas através da preparação de suportes cromatográficos constituídos pelo mesmo peptidomimético (e, g., peptóide) identificado no chip.

De acordo com uma forma de realização dessa descrição, uma sequência peptóide que produz um diferencial no chip pode ser sintetizada em resinas hidrofílicas que são "mascaradas" hidrofobicamente durante a síntese do peptóide. Após a síntese, a resina é "desmascarada" para revelar grupos hidrofílicos compatíveis com soluções biológicas. Uma tal resina é imediatamente disponível para experiências de ligação/isolamento de proteína.

Uma vez isolada a proteína, a sua sequência pode ser determinada utilizando técnicas convencionais, tais como espectrometria de massa MALDI/TOF ou digestão com tripsina. A Fig. 6 ilustra, resumidamente, aspectos do processamento pós-array, de acordo com os processos descritos acima e abaixo. Na Fig. 6, o processo (600) inicia-se com a preparação de colunas 602 de separação cromatográfica, utilizando agentes 601 peptidomiméticos, e. g., peptóides, identificados como de interesse num ensaio de ligação diferencial proteómico efectuado utilizando um microarray de acordo com a presente invenção. Uma alíquota da amostra complexa corrida originalmente no microarray é, depois, corrida através da coluna. A proteína de interesse 50 liga-se, de um modo preferencial, à coluna e é assim separada dos outros componentes da amostra. A proteína ligada é eluída e pode, depois, ser utilizada em análises 604 posteriores, tais como sequenciamento da proteína, determinação da estrutura terciária, etc. Além disso, os dados relacionados com a identificação da proteína pode ser introduzidos em bases de dados bioinformáticos para investigação posterior.

Alternativamente, o mesmo peptóide que ligou a proteína expressa, de um modo diferencial, pode ser ser aplicado em pontos, repetidamente, num chip e incubado com uma aliquota do mesmo lisado. A mesma proteína deverá ligar-se ao array, mas numa área muito maior que apenas um ponto no chip original. Pode depois ser utilizada espectrometria de massa com desabsorção por laser para determinar a sequência da proteína, directamente, a partir do chip. E. Outras Aplicações

As utilizações previstas para chips de microarray proteómicos, de acordo com a presente invenção, são amplas. Em geral, as aplicações têm em comum a identificação de uma proteína ou conjunto de proteínas que são sobre-expressas ou sub-expressas num mistura complexa em relação a outra (ou presente/ausente, tal como no caso de uma proteína de diagnóstico). Será evidente para os especialistas na técnica que formas de realização da presente invenção são compatíveis com uma grande variedade de formatos de ensaio, incluindo ensaio de sanduíche, tal como ELISA. 51

Como descrito acima, podem ser utilizados mícroarrays proteómicos para determinar a expressão diferencial de proteínas em soluções complexas ao marcar, alternativamente (e. g., Cy 3 pa ra uma amostra 0 Q y 5 p383 3 outi :a) as > duas 0 u ms lis s oluções de pi :ot.e ína a Ç; 3 r Gin COR iparada í.3 . Os chip S pGd.i em ser uti pa ra de scobri r nove alvos ias pro te ína s pc • ra post. eriores en sai 0 s de ra c-|“ γ eio de elevada pro* dut iv.i ..da de. N outr a ap licação pa rti C U. J. arment e Σ *\J V_. C 83 , a rem T- odologia i >ode s Ο γ uti .1 iza< da para pu ri f í ca. r uma proteí .na recoml cl nanti e que P Cl obre-e. xpres isa num ho spe dei ro em pa rtic· alar ' f 131: 3 como leve CiUrS ou bac :ulov: í. ru s. A am .ost que cc ;ntí :Κί a pro teína e: gores 38 Θ compa.· rad ía c c im a amostra qu não a co ntém f atravé 3 de co- .1.1 Q 3 Ç c A ·_/ da S 3 mostras al ter nat ivamen 1- Ox marc :ada s no r f iip e ; proc ruranel o dife ;renc: lais. 0 pr oee 8 8 0 ider ;tíí pe ptóide 8 no array que se li o. am com af ini da d θ θ Θ spe ci.fi' CIClc ide ra .·.! ·,/ VA 'J V.- .J. a pi :ote.rn, a expr essa Sst-OS me smo 8 Ϊ oeptóií des C "5 O 8 < epoi s VA nados para p- rodu sir resinas cr orna tog ráfica s p 3 1. 3 Γ\ isola rm ento e pi jri fie ao. ao - da p roteína recombinante de interesse.

De um modo análogo, os chips de microarray proteómico podem ser utilizados para identificar marcadores de proteína no plasma e soro que podem ser diagnóstico de estados de doença em particular, tais como cancro, VIH ou diabetes, ou para identificar novos alvos para rastreio de fármacos. Também, uma vez tendo sido identificado um conjunto de ligandos para um grupo de proteína em particular, é possível monitorizar a expressão dos níveis destas proteínas para decifrar os mecanismos de acção do fármaco. Quanto a isto, os novos ligandos podem ser utilizados com sondas da abundância de proteína, de um modo análogo pelos quais os anticorpos são actualmente utilizados para determinar a abundância de proteína. Além disso, ao examinar as proteínas de estirpes virulentas e não virulentas 52 de bactérias ou vírus, é possível determinar factores de virulência únicos que resultam em doença infecciosa. Uma vez identificados estes factores de virulência, estas proteínas podem ser utilizadas como alvos para rastreio de novos fármacos antibacterianos ou antivirais. Alternativamente, os chips proporcionados pela presente invenção podem também ser utilizados para descobrir vários péptidos, antigénios ou miméticos de proteína. Por exemplo, novos miméticos de moléculas de adesão celular, candidatos a miméticos de fármacos ou miméticos de proteína que podem ser utilizados como suportes cromatográficos. Além disso, o material aplicado em pontos no chip pode, ele próprio, ser candidato a potencial fármaco ou actua como um suporte inicial para a concepção de candidatos a novos fármacos. Em tais formas de realização, podem ser efectuados ensaios de elevada produtividade para identificar potenciais agentes terapêuticos, directamente, no chip.

Numa forma de realização, os microarrays proteómicos da invenção são corridos em paralelo com arrays de ADN e os resultados de ligação diferencial derivados de cada um são comparados para identificar correlações na actividade genética e expressão proteica. Por exemplo, são efectuados ensaios de ligação diferencial para amostras biológicas complexas tanto no array proteómico como no array de ADN. Alíquotas separadas das amostras são marcadas e colocadas em contacto com um microarray proteómico, de acordo com a presente invenção, e um microarray de ADN, tal como são bem conhecidos na técnica. A expressão proteica diferencial evidenciada pelos resultados de ligação no array proteómico, quando comparado com os do array de ADN, podem elucidar relações entre a expressão proteica e as famílias de genes cuja activação é necessária para essa expressão. 53

Noutra forma de realização da presente invenção, é proporcionado um chip de "array misto" da presente invenção. 0 peptóide ou outros elementos de peptidomiméticos ligados a superfícies do chip podem ser misturados com anticorpo ou elementos de ligação de proteína, de modo a que ambos os tipos de elementos de ligação estejam presentes no mesmo chip. Os anticorpos podem actuar como controlos positivos ou como meio de monitorizar os níveis de proteínas específicas na mistura a ser analisada. Os peptóides proporcionarão dados dos diferenciais em proteínas desconhecidas, enquanto os pontos do anticorpo no chip proporcionarão dados dos níveis diferenciais de proteínas conhecidas. Por exemplo, se uma célula é tratada com um certo fármaco, os níveis de proteína podem subir ou descer. Se essas proteínas possuem anticorpos conhecidos, é possível monitorizar a variação destas com diferenciais de anticorpos, enquanto em simultâneo, procurando variações em proteínas desconhecidas, com os diferenciais de peptóides.

Num exemplo desta técnica, são preparadas soluções de anticorpo nas mesmas placas de microtitulação que as soluções de peptóide, mas em poços diferentes. Os peptóides já estão funcionalizados com os grupos de ancoragem tiol. Os anticorpos são feitos reagir com um agente redutor para reduzir as ligações persulfureto na região charneira e Fc do anticorpo (por exemplo, como descrito em Levison, Μ. E., et al, (1969), Experentia, vol 25, 126-127 e Blauenstein, P., et ai, (1995), Eur. J. Nuclear Med., vol 22, 690-698), produzindo, assim, um tiol no anticorpo. Isto permite a aplicação em. pontos do peptóide e anticorpo na mesma sessão de aplicação em pontos, criando, deste modo, um chip "misto''. Alternativamente, os anticorpos podem, ser ligados a Proteína A ou Proteína G imobilizada nas superfícies do chip, enquanto os peptóides são ligados a avidina ou estreptavidina, 54 apres entando uma supe: ff Í! cie mista p >ara c3O.rGS0T 3taçâo . Ou, os ant.íc: orpos podem simpl. esm ientí s ser bi oti nliados e apl. ícados em ponto s juntamente com os pep tóides 0' J P éptidos ' bíotin liados em .·-< h 7 ύ~) cj L-/J revestidos c· om av idi ns o Outra técnica i qu e pt d de ser com; ciní 3. d a com as tèi cnicas de mi cro array proteói rico da p.i ::esente invi enção é a té ;cní ca de análi s e e s t r u t u r a 1 ma cr omc :Ί ©C3 alar de í ;m/:e !M., Deste modo, pode s , O y utili zada a corabin ação de téc nicas pai -3. tdentific ar uma proteí na de i 3 iteresse, enr iquec er e isolá-la, 3 equenciaa : a p: trotei na e elucidar aspectos da sua estrutura proteica terciária.

Os dados referentes à identificação e processamento pós- array de proteínas de interesse também pc >dem ser introduzidos em bases de dados bioinformáticos. Os dados podem ser ai correlacionados cc >m outros dados biol .ógicos para posterio r investigação. 4. Kits São também proporcionados kits pela presente invenção para efectuar ensaios de ligação proteómicos, utilizando os arrays da descrição. Tais kits, de acordo com a presente invenção, incluem, pelo menos, um array de acordo com a invenção. Os kits podem ser configurados para objectivos de diagnóstico ou analíticos e podem, também, incluir um ou mais reagentes adicionais, empregues no método para o qual o array é intencionado. Por exemplo, o kit pode incluir vários recipientes, marcadores, soluções tampão, utensílios e qualquer outro material necessário para se efectuar um ensaio de ligação proteómico. Os kits de acordo com a presente invenção também 55 podem ser configurados para receber amostras para análise e, deste modo, realizar os passos necessários para um ensaio de ligação de acordo com a invenção sem posterior manipulação do utilizador.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos proporcionam detalhes referentes à síntese e características dos arrays proteómicos, de acordo com a presente invenção, seus componentes e aplicações. Deverá ser entendido que, o que se seque é apenas representativo e que a invenção não é limitada pelo detalhe apresentado nestes exemplos.

Exemplo 1: Preparação de placas de microtitulação contendo um composto por poço

Preparação de uma (1) placa de 96 poços, contendo 96 compostos isolados (0,8 mM) numa solução DMSO/PBS 1:1: Um frasco siliconizado (8 mL, 2 dram) foi carregado com uma biblioteca de um composto/esfera sintetizada sobre suporte sólido macro-esfera de poliesterireno Rink (66 mg, -1320 esferas, 40 nanomole/esfera, 0,75 mmol/g, 425-500 ym, Polymer Laboratories) que contém um total de 121 possíveis compostos. As esferas foram imersas em dicloroetano (DCE, 4 mL) durante 24 horas e peneiradas sobre malha de aço inoxidável (600 yra). Utilizando a massa espessa das esferas em diclorometano, foram escolhidas, individualmente, 96 esferas e transferidas para uma placa de polipropileno de 96 poços (200 yL, fundo cónico) de modo a se obter uma esfera por poço em todos os 96 poços. A 56 placa de 96 poços resultante, (a placa avó) foi transferida para um evaporador de vácuo rápido Savant AES200 equipado com um rotor de transporte de placa de 96 poços e foi removido o restante DCE. Foi depois adicionado o cocktail de clivagem {TEA/TES/H20/DCE, 46:2:2:50,75 yL) a cada poço da placa contendo esfera. Depois de uma hora, a placa foi transferida para um evaporador de vácuo rápido para remover a maioria dos voláteis da placa. Cada poço foi tratado com acetonitrilo (Cn-CN, 10 p.L) e agitado durante 10 mín, utilizando um agitador de placas de microtitulação. A placa foi transferida para um evaporador de vácuo rápido e os restantes voláteis foram removidos da placa durante 10 minutos. Cada composto isolado em cada um dos poços foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DM30, 25 pL) e transferido un ia i ria ca de filtro de 96 poço, 3 COT' • sti. tu ido de itl reno, equ iipado com uma membrana de poi. Lprop.i leno um } a rt. P'J . a ca cie filtro c ie 9 6 poços foi colocada sobre uma de : PO.1. ip rop.i .leno de 96 poços (200 uL, fundo C.Ó nico) e o ito foi trai is.ferido para um :.a centrif uga B eckr nan G S-6R ima.' da di; ira nte 5 minutos a 3000 RPM (-2000 G) a 1

Este processo proporcionou a placas "mãe" constituídas por 96 soluções de DMSO filtradas (1,6 mM) de um composto em 96 poços. Para forma a 'placa filha'’ (utilizada na aplicação em pontos), foi transferida uma alíquota de cada solução de DMSO (5 yL) para uma placa de polipropileno de 96 poços (200 pL, fundo cónico). Depois, cada poço na placa "filha" foi misturado com solução PBS desgaseifiçada (5 pL) e armazenado a -20 “C. Alternativamente, cada composto em cada poço pode ser dissolvido em 20 uL de 50% de DMSO/água. No caso de uma placa com um fundo cónico, a placa pode ser centrífugada a 1800 rpm durante 5 minutos para imobilizar a esfera no fundo do poço cónico, 57 seguida por transferência de uma placa filha que está pron 10 yL do sobrenadante límpido a para a aplicação em pontos. para O mesmo pode ser efectuado para 384 esferas em placas de 384 poços ou 1024 esferas em placas de 1024 poços, etc. Para a aplicação em pontos, pode ser utilizado qualquer dispositivo de aplicação em pontos adequado, tais como um spotter Molecular

Dynamics Generation poços). II (para 96 poços) ou Generation III (384

Exemplo 2: Funcionalização de suportes sólidos para aplicação em pontos

Foram utilizadas lâminas de microscópio de ouro ou alumínio reflector como substratos para aplicação em pontos uma biblioteca de peptóides. Num exemplo, o peptóide é funcionalizado com um grupo terminal tiol e a superfície é funcionalizada com uma meleimida. Após aplicação em pontos, o tiol no peptóide reage com a meleimida na superfície para formar uma ligação tioéter covalente. As superfícies de ouro activadas com maleimida foram preparadas como abaixo: 1) as lâminas de microscópio revestidas com ouro (1200 Angstroms Au, 30-50 Angstroms Ti ou Cr) foram limpas com solução de limpeza de Ácido crómico durante 15 minutos e enxaguadas com água de grau HPLC. 2) as lâminas de ouro foram imersas em tiol modificado com amino 1-5 nM (1-Mercaptoundecildietoxiami na; um alquiloC-li, dois óxidos de etileno e uma amina; alternativamente, num tal composto podem ser utilizados grupos alquiloC-2 a C-20 e/ou grupos etoxilo ou trietoxilo) durante 1-24 horas à temperatura ambiente ou a 4 5 ou 60 °C, As lâminas foram enxaguadas quatro vezes em etanol absoluto e secas sob um fluxo de Azoto. 3) As 58 lâminas de ouro modificadas com amino foram imersas numa solução de 4 - (N~r naleimídorm: 2ti1)- ciclo-hexa no- 1- csrboxilato de succinimidi .lo (SMCC) (50-100 μ.Μ) para νΛ -y --Λ ν' 1 .-\ IP ^ V' uma superfície que apresente os grupos funcí onais maleimída .

As lâminas de aluminio foram preparadas ou adquiridas de

Ame rshara-Ph a rmacia, revestidas com uma camada de 1000 1400 Angstrom de óxido de silício e uma camada de aminopropissilano (APS) . As superfícies de AI modificadas com amino são funcionalizadas com SMCC como descrito acima.

Em alguns casos, depois da aplicação em pontos da biblioteca peptóide, as lâminas de alumínio foram causticadas numa solução de SDS a 0,1%/SSC 5x a 60 °C durante 2 horas. As lâminas causticadas exibem uma espessura de camada reduzida (200-900 Angstroms) para permitir a amplificação dos sinais do Cy5 e Cy3.

Exemplo 3: Derivatização de superfícies de Alumínio/SíCq com 3 V1. d.-Ί. Π 3

As lâminas de aluminio revestidas cora aminossilano foram imersas numa solução de NHS-LC-LC-biotina ("LC" refere-se a 6-amino-hexanoilo e "NHS" refere-se a N-hidroxisuccinimidilo) (disponível comercialmente de Pierce), representada na Fig. 7A, que estava a 0,39 mM em tampão PBS. As lâminas foram revestidas durante 1,5 horas com agitação a 80 rpm. Após ligação da biotina, as lâminas foram enxaguadas com água, depois imersas numa solução de avidina, estreptavidina ou neutravidina 1 yg/mL - 1 rag/mL em tampão PBS durante 2 horas com agitação a 70 rpm. As lâminas foram enxaguadas com água e prontas para aplicação em 59 pontos com péptidos ou peptóides biotinilados. A Fig. 7B mostra uma representação de uma lâmina de alumínio derivatizada com avidina, ponteada com um agente de ligação de proteína biotinilado, de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

Os vários passos de modificação de superfície foram seguidos utilizando elipsometria para observar alterações de espessura. Um aumento de espessura de d 0 d 5 angstroms foi registado, de um modo reprodutível, após a adição de avidina às c a m a d a s d a, s u p e r f í c .1. e.

Exemplo 4: Marcação da Proteína numa coluna com 5 cm d i uma carga de 1 tr i.L, íracçõe

As soluções de proteína foram ajustadas para uma concentração de 1 mg/mL em carbonato de sódio 0,1 M, pH 9,3 e um volume de 0,1-1 mL, e misturadas com corante cianina reactivo com amina foifuncional ou mono-funcional (Cy3 ou Cy5, Amersham Pharmacia). A proteína foi purificada a partir do corante que não reagiu por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando um empacotamento Sepliadex G-25 comprimento, 1,7 cm de diâmetro c. de 0,5 mL e um factor de diluição de A Fig. 8 proporciona um gráfico dos resultados ilustrando que a cromatografia de exclusão de tamanho dos componente separa, de um modo eficaz, a proteína marcada do corante que não reagiu. O gráfico mostra os diferentes perfis de eluição para a proteína (padrão BSA) e moléculas de corante. 60

Exemplo 5: Experiência de ligação ao chip

Em alguns casos, os chips ponteados com a biblioteca peptóide são quimicamente bloqueados com cisteina, mercaptoetanol ou outro tiol hidrofilico adequado. Os chips são bloqueados com proteína, tal como BSA a 2%/PBS, leite em pó magro a 10% ou caseína a 1% durante, pelo menos, I hora, enxaguados com água e secos. A solução de sonda de proteína marcada ê diluída em conformidade (tipicamente, para 20-1000 ng de proteína total) com a solução de bloqueio (para as lâminas de AI causticadas foram observados limites de detecção de algumas picogramas). É aplicada uma alíquota de 30-100 yL da solução de sonda na superfície do chip e colocada uma lamela de cobertura limpa em cima, formando uma sanduíche da solução de sonda na superfície do chip. A solução de proteína é incubada com o chip durante, pelo menos, 1 hora. A lamela coberta é removida em PBS lx/Tween a 0,05% ou outro tampão adequado contendo tensioactivo. 0 chip é depois lavado em PBS lx/Tween a 0,05% ou outro sistema tampão/tensioactivo adequado. Os chips são, depois enxaguados com água, secos sob um fluxo de Árgon ou Azoto e analisados.

Exemplo 6: Chip da Amostra

Foi preparado um chip de microarray com uma biblioteca de 1000 agentes de ligação de proteína com base em peptóide, de acordo com a presente invenção. Foi adicionada estreptavidina a célu las induz idas para exp ressar prot eínas na v ia wnt e no lisa do célula; : de controlo e a totalicac ie da mister 3, ΠΊ 3. T. C <3 d 3. 1 com Cy3 (controlo) ou Cy5 (wnt). A mistura foi, depois incubada i com O chip (6, 3 ng de i proteína t Gtal/chip; 31 pg de & S Τ'. I. eptavídma / h - . / L .ÍJ-l .p) , que possuía urr i. peptóide apresentando 61 biotina no seu canto supe rior esqui ardo. As Fígs, 9A e 9B mostram 1 / 6 do ck.i '.p in cubado. Cot n.o apresen tado, pa ra além dos ρο ntos de ρ ρ ρ t :óide biotii .na, muita s outros pontos de peptói de 3 estão l.ígr idas à prot .eína no ij .sado. Ao comparai :: os sinais re 1ativos r] .·-> o canais de ( 3y5 e Cy3, podem, ser identif: i. ca do s difere :enc lais. A Fig. 9C mo st :ra Yz d< a um ch iip de controlo apei tas de

Exemplo /: Chip de Demonstração

Como ilustrado na Fig. 10, foram sintetizados péptidos hexaméricos de afinidades diferentes e conhecidas para o anticorpo "anti-glu" com um grupo de ancoragem de biotina e elemento de ligação glicilo heptamérico. Para demonstrar o conceito da presente invenção, os péptidos biotinilados foram aplicados em pontos em lâminas tratadas com avidina, como descrito na presente revelação. As lâminas foram bloqueadas com caseína e sondadas com anticorpos anti-glu marcados com Cy5. As gradações na intensidade do sinal correlacionam-se com as diferenças conhecidas (e. g., determinado por ELISA directa) em afinidade entre os péptidos e sua sonda de anticorpo cognato.

Exemplo 8: Comparação de Sistemas de Ligação à Superfície A Fig. 11 representa a dependência da força do sinal no modo de ligação à superfície de um agente de ligação de proteína a uma substrato. Neste exemplo, são observados aumentos no sinal de 1000X para a imobilização de biotina/avidina quando comparado estreptavidina (31 pg de e pontos de peptóide biotina no streptavindina/c/iip) . São canto superior esquerdo. 62 com tiol/maleimida (resultados do sinal indicados acima de descrição de ligação à superfície e estrutura molecular).

Exemplo 9: Preparação de Superfície da Lâmina Revestida com Proteína para Apresentação de Anticorpo

Para preparar superfícies laterais modificadas com Proteína A ou Proteína G, uma lâmina revestida com avidina (preparada como acima) foi imersa numa solução de Proteína A ou Proteína G biotinilada (0,5-1 mg/mL em tampão PBS, adquirido de Pierce, numero dos produtos 29989zz e 29988zz) durante 2 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram depois enxaguadas com água destilada desionizada e seca com um fluxo de Árgon ou Azoto.

Conclusão

Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe com os objectivos de clarificar a compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser efectuadas dentro do âmbito da invenção. Note-se que existem muitas vias alternativas para implementar tanto o processo como o dispositivo da presente invenção. Consequentemente, as presentes formas de realização são para ser consideradas como ilustrativas e não limitantes, e a invenção não é limitada aos detalhes aqui apresentados.

Lisboa, 27 de Abril de 2007 63

Claims (56)

1. REIVINDICAÇÕES Array de agentes de ligação de estável, à superfície de um array compreendendo: proteína ligados, de um modo suporte sólido, o referido um 3 ubst rato sólido com sub St anci a Ime nte planar, o 3T0VP c‘ t l.me •nto de dióxido 3TOV0 3 t ime nto de dióxido esp 0 C‘ sura de cerca de 20 nm de PO tenc iar a amp1ifica ç ão .i]tLâ súper fica í. Θ CL CD iminio 3.1' umínio re ve s st ido cc ora um de si 11 .cio t em qi ie o de silic. lo ar >resenta uma até cerca de 90 nm e é capa z de um sinal fluorescente; um ta plural idade de a d.í ferentes 1igados \ 30 ag entes de .1 igação de ρ protein; ; um doí igentes de ligação de referido substrato, cac roteina compreendendo, um segmento de ancoragera ligado, de um modo estável, à superfície do substrato, um. segmento de ligação de proteína peptidomimético e um segmento de união que liga e separa os segmentos de anccragem e peptidomimético. Array da reivindicação 1, em que o referido substrato é um de vidro, plástico ou metal. Array da reivindicação 1, em que o referido segmento peptidomimético é um peptóide. 4. Array da reivindicação 1, em que o referido segmento de união é seleccionado do grupo consistindo de cadeias alifáticas C2-C100, óxido de polietileno e oligómeros peptidomiméticos ou peptidicos ortogonais.
2. 5. Array da reivindicação 1, em que o referido segmento de ancoragem é um tiol.
3. 6. Array da reivindicação 1, em que o referido segmento de ancoragem é biotina.
4. 7. Array da reivindicação 1, em que a referida superfície do substrato metálico é, ainda, revestida com uma funcionalizada de um tiol modificado com amino e um siloxano debaixo do referido segmento de ancoragem.
5. 8. Array da reivindicação 7, em que o referido aminotiol ou aminossilano é funcionalizado com uma maleimida.
6. 9. Array da reivindicação 8, em que o referido segmento de ancoragem é um tiol.
7. 10. Array da reivindicação 7, em que o referido aminotiol ou aminossilano é funcionalizado com um de hidrazida, aminoxilo, N-hidroxissuccinimida, anidrido, aldeído, persulfureto, tiol, azida e fosfina.
8. 11. Array da reivindicação 7, em que a referida superfície do substrato metálico é, ainda, revestida com uma proteína avidina debaixo do referido segmento de ancoragem. 2
9. 12. Array da reivindicação 11, em que a referida proteína avidina é seleccionada do grupo consistindo de avidina, estreptavidina, neutravidina e análogos.
10. 13. Array da reivindicação 11, em que o referido grupo de ancoragem é biotina.
11. 14. Array da reivindicação 11, em que a referida proteína avidina é ligada à superfície do substrato metálico via uma porção NHS-LC-LC-biotina.
12. 15. Array de agentes de ligação de proteína associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido, o referido array compreendendo: um subst: rato sólido, cc )m uma supe rfície cie alumínio sub stanci almei _ite planar, o alumínic ) reve st ide com um rev estime nto de dióxií jo de si 1 ...1 cio, em. que o rev estime nto de dióxid o de silí cio a ore se :nta uma espessura de cerca de 20 nm até cerca de 90 nm e é capaz de potenciar a amplificação de um sinal fluorescente e em que a superfície é, ainda,revestida com um aminotiol ou aminossilano funcionalizado com maleimida; proteína da um dos uma pluralidade de agentes de ligação de diferentes ligados ao referido substrato, ca agentes de ligação de proteína compreendendo, :.o tiol ligado, de um rato de apresentação um segmento de ancoragem de substra modo estável, â superfície do subs de maleimida, 3 um segmento de ligação de proteína peptóide, e um segmento de união alifático que liga e separa os segmentos de ancoragem e peptidoraimético.
13. 16. Array da reivindicação 15, em que o referido aminotiol ou aminossilano funcionalizado com maleimida compreende um espaçador.
14. 17. Array de agentes de ligação de proteína associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido, o referido array compreendendo: suostrato só li o" ,·-ο o νϋ ufíla SUpC.T. f í c i .e de alumínio te p lanar, o a ir ;m ínio re' vestido com um de dióxido ΟΘ si li r·· *í r\ . .j. \j , em que o de dióxido de silíc. io aoresenta uma :erca de 20 nm até cerca de 90 nm e é capaz a amp bi. i. £ i cação d.O um si nal fluorescente e um em que a superfície é, ainda, revestida com um aminotiol ou aminossilano funcionalizado com avidina; uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes ligados ao referido substrato, cada um dos agentes de ligação de proteína compreendendo, um segmento de ancoragem. de substrato de biotina ligado, de um modo estável, à superfície do substrato de apresentação de avidina, um segmento de ligação de proteína peptóide, e 4 um segmento de união peptidico ortogonal que liga e separa os segmentos de ancoragem e peptidomimético.
15. 18. Array da reivindicação 15, em que o referido aminossilano ou aminotiol funcionalizado com avidina compreende uma porção NHS-LC-LC-biotina.
16. 19. Método de preparar um array compreendendo uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes, associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido, o referido método compreendendo: Preparar, para lig ação, uíi i substrato sóii do com uma superfíei e de ali im.in.io í subs tanc ialmente planar, o alumínio r@y@3tid0 com. um revestimento de dióxido de si licio, em que o revestin: lento de dióxido de silício apresenta uma espes sura de cerca de 20 nm a té cerca de 9 0 r*m e é ; capaz de potência r a amplificação de um sinal fluoresce nte; colocar em contacto uma pluralidade de diferentes agentes de ligação de proteína com o referido substrato, sob condições suficientes para os referidos agentes de ligação de proteína ficarem ligados à referida superfície do substrato, cada um dos agentes de ligação de proteína compreendendo, um segmento de ancoragem de substrato um segmento de ligc de proteína peptidomimétic 5 um segmento de união que liga e separa os segmentos de ancoragem e peptidomimético; pelo qual. é produzido o referido array.
17. 20. Método da reivindicação 19, em que o referido contacto compreende a aplicação, em pontos, de uma gota de uma solução de cada um dos referidos agentes de ligação de proteina, numa localização diferente na referida superfície do substrato, sob condições tais que a ligação dos agentes de ligação de proteína à superfície do substrato está concluída antes da gota evaporar.
18. 21. Método da reivindicação 20, em que a referida superfície do substrato compreende um revestimento de ouro e a preparação para a ligação compreende limpar o referido revestimento de ouro.
19. 22. Método da reivindicação 21, em que o referido segmento de ancoragem é um tiol.
20. 23. Método da reivindicação 20, em que a referida superfície do substrato compreende um revestimento de metal seleccionado de ouro e alumínio e a preparação para ligação compreende limpar e revestir o referido revestimento de metal com um aminotiol ou aminossilano funcionalizado.
21. 24. Método da reivindicação 23, em que o referido aminotiol ou aminossilano é aminopropilsilano.
22. 25. Método da reivindicação 24, em que o aminopropilsilano é funcionalizado com uma maleimida. 6
23. 26. Método da reivindicação 25, em que o referido segmento de ancoragem é um tiol.
24. 27. Método da reivindicação 23, em que o referido segmento de ancoragem é biotina.
25. 28. Método da reivindicação 23, em que o referido aminotiol ou aminossilano é funcionalizado com um de hidrazida, aminoxilo, N-hidroxissucciniraida, anidrido, aldeído, persulfureto, tiol, azida e fosfina.
26. 29. Método da reivindicação 23, em que a referida superfície do substrato metálico é, ainda, revestida com uma proteína avidina debaixo do referido segmento de ancoragem.
27. 30. Método da reivindicação 29, em que a referida proteína avidina é seleccionada do grupo consistindo de avidina, estreptavidina, neutravidina e análogos.
28. 31. Método da reivindicação 29, em que o referido segmento de ancoragem é biotina.
29. 32. Método da reivindicação 29, em que a referida proteína avidina é ligada à superfície do substrato metálico via uma porção NHS-LC-LC-biotina.
30. 33. Método da reivindicação 19, em que o referido segmento peptidomimético é um peptóide.
31. 34. Método da reivindicação 19, em que o referido segmento de união é seleccionado do grupo consistindo de cadeias 7 alifáticas C2-C100, óxido de polietileno e oligómeros peptidomiméticos ou peptídicos ortogonais.
32. 35. Método de preparação um array compreendendo uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes, associados, de um modo estável, com a superfície de um suporte sólido, o referido métodos compreendendo: igaçáo de proteína, gerar uma biblioteca de agentes compreendendo, um segmento de ancoragem de substrato um segmento peptidomimético, e um segmento de união que liga e separa os segmentos de ancoragem e peptidomimético; distribuir os agentes de ligação de proteína da referida biblioteca, em receptáculos de armazenamento individuais para cada agente de ligação de proteína diferente; preparar uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes para ligação a um substrato sólido; preparar um substrato sólido, com. uma superfície de alumínio substancialmente planar, para liaacão com uma pluralidade dos referidos agentes de ligação de proteína diferentes, o alumínio revestido com um revestimento de dióxido de silício, em que o revestimento de dióxido de silício apresenta uma espessura de cerca de 20 nm até cerca de 90 nrn e é capaz de potênciar a amplificação cie um sinal fluorescente; pelo qual. é produzido o referido array.
33. 36. Método da reivindicação 35, em que a referida superfície do substrato compreende um revestimento de metal seleccionado de ouro e alumínio e a preparação para ligação compreende limpar e revestir o referido revestimento de metal com um aminotiol ou aminossilano funcionalizado.
34. 37. Método da reivindicação 36, em que o aminotiol ou aminossilano é funcionalizado com uma maleimida.
35. 38. Método da reivindicação 37, em que o referido segmento de ancoragem é um tiol.
36. 39. Método da reivindicação 36, em que a referida superfície do substrato metálico é, ainda, revestida com uma proteína avidina debaixo do referido segmento de ancoragem.
37. 40. Método da reivindicação 39, em que o referido segmento de ancoragem é biotina.
38. 41. Método para efectuar um ensaio de ligação diferencial, compreendendo: marcação fluorescente de proteínas numa solução de amostra biológica contendo proteína; 9 colocar em contacto uma alíquota da referida solução de amostra biológica contendo proteína marcada com um array, de acordo com a reivindicação 1; analisar o array para determinar a ligação diferencial de proteínas na amostra aos agentes de ligação de proteína do array.
39. 42. Método da reivindicação 41, em que o referido segmento peptidomimético é um peptóide.
40. 43. Método da reivindicação 42, em que cada um dos referidos agentes de ligação de proteína corresponde a um receptáculo de fonte diferente, contendo esse agente.
41. 44. Método da reivindicação 43, compreendendo, ainda, seleccionar um agente de ligação de proteína de interesse com base nos resultados do ensaio de ligação diferencial.
42. 45. Método da reivindicação 44, compreendendo, ainda, sequenciar o segmento peptidomimético do agente de ligação de proteína seleccionado.
43. 46. Método da reivindicação 44, compreendendo, ainda, submeter o segmento peptidomimético do agente de ligação de proteína seleccionado a análise estrutural por espectroscopia de massa.
44. 47. Método da reivindicação 44, compreendendo ainda o enriquecimento da solução de amostra biológica contendo proteína com uma proteína que se liga, de um modo preferido, ao agente de ligação de proteína seleccionado, 10 por aplicação de uma segunda aliquota da solução de amostra biológica contendo proteína a uma coluna de separação, a referida coluna de separação compreendendo um suporte cromatográfico apresentando o agente de ligação de proteína seleccionado.
45. 48. Método da reivindicação 47, compreendendo, ainda, sequenciar a referida proteína enriquecida.
46. 49. Método da reivindicação 47, compreendendo, ainda, submeter a proteína enriquecida a análise estrutural por espectroscopia de massa.
47. 50. Método da reivindicação 41, compreendendo, ainda, colocar em contacto uma aliquota da referida solução de amostra biológica contendo ADNc ou ARN mensageiro marcado com um array de ADN, analisar o array de ADN para determinar a ligação diferencial de ácidos nucleicos, na amostra, a elementos do array de ADN, e comparar os resultados da ligação diferencial dos dois arrays para identificar correlações na actividades dos genes e expressão proteica.
48. 51. Método da reivindicação 41, em que os marcadores fluorescentes são corantes reactivos com amina.
49. 52. Método da reivindicação 51, em que o marcador fluorescente é um ou mais de Cianina 3 e Cianina 5.
50. 53. Kit para utilização na realização de um ensaio de ligação diferencial de acordo com a reivindicação 41, o referido kit incluindo um array de acordo com a reivindicação 1. 11
51. 54. Kit da reivindicação 53, compreendendo, ainda, um ou mais reagentes para efectuar um ensaio de ligação diferencial compreendendo uma pluralidade de marcadores fluorescentes para proteínas.
52. 55. Kit da reivindicação 54, em que os marcadores fluorescentes são corantes reactivos com amina.
53. 56. Kit da reivindicação 55, em que os corante reactivos com amina são Cianina 3 e Cianina 5.
54. 57. Array misto de agentes de ligação de proteína ligados, de um modo estável, à superfície de um suporte sólido, o referido array compreendendo: um substrato sólido, com uma superfície de alumínio substancialmente planar revestida com. um revestimento de díóxido de silício, em que c revestimento de dióxido de silício apresenta uma espessura de cerca cie 20 nm. até cerca de 90 nm e é capaz de potênciar a amplificação cie um. sinal fluorescente; uma pluralidade de agentes de ligação de proteína diferentes ligados ao referido substrato, cada um dos referidos agentes de ligação de proteína compreendendo, um. segmento de ancoragera ligado, de ura modo estável, â superfície do substrato, um segmento de ligação de proteína peptidomimético e um segmento de união que liga e separa os segmentos de ancoragem e peptidomimético; e 12 uma pluralidade de anticorpos diferentes ligados ao referido substrato.
55. 58. Sistema para efectuar um ensaio de ligação diferencial, o referido sistema compreendendo: um array de acordo com a reivindicação 1; uma ou mais proteínas marcadas com fluorescência ligadas a um ou mais agentes de ligação de proteína; e um analisador de array por varrimento de fluorescência.
56. 59. Sistema da reivindicação 58, em que o marcador fluorescente é um ou mais de Cianina 3 ou Cianina 5. Lisboa, 27 de Abril de 2007 13