ES2281424T3

ES2281424T3 - Micromatrices para llevar a cabo analisis proteomicos.

Info

Publication number: ES2281424T3
Application number: ES01946078T
Authority: ES
Inventors: Deborah Charych; Eric Beausoleil; Ronald N. Zuckermann
Original assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-05
Filing date: 2001-06-04
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2021-06-04
Also published as: WO2001094946A9; PT1297338E; ATE360207T1; WO2001094946A2; AU2001268173A1; DK1297338T3; JP2003536073A; WO2001094946A3; EP1297338A2; US20020055125A1; DE60127958D1; EP1297338B1

Abstract

Una matriz de agentes de unión a proteínas unidos de forma estable a la superficie de un soporte sólido, dicha matriz comprende: un sustrato sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana, el aluminio está recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente; un conjunto de agentes de unión a proteínas diferentes unidos a dicho sustrato, cada uno de dichos agentes de unión a proteínas comprende, un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de peptidomimético de unión a proteínas, y un segmento de unión que conecta y separa los segmentos de anclaje y los segmentos de peptidomimético

Description

Micromatrices para llevar a cabo análisis proteómicos.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al análisis de productos celulares y materiales de productos celulares. En una realización, la invención se dirige a las micro matrices proteómicas y métodos de usarlas para llevar a cabo análisis proteómicos.

En años recientes, la tecnología de micro matrices se ha desarrollado desde un subcampo especializado a una herramienta importante para estudios básicos y aplicados en la biología molecular, microbiología, fármacos, agricultura y muchas otras biotecnologías. La tecnología de micro matrices de ADN intenta unir el genoma de un organismo o célula a un fenotipo expresado o función proteica.

Las publicaciones superabundantes y de patentes sobre tecnología de micro matrices describen micro matrices de ADN (u otras formas de ácido nucleico, tal como ADNc o ARN), dispuestas sobre una superficie sólida tal como un portaobjetos de vidrio (a menudo referido como un "chip"). El ADN de la matriz está típicamente en forma de oligonucleótidos cortos (o sea, de alrededor de 8 a 25 bases) o clones más largos o productos PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (de alrededor de 500 a 2000 bases). Los primeros están típicamente sintetizados sobre el soporte sólido, mientras que los últimos están aplicados en forma de mancha por medio de un robot sobre un soporte sólido en un formato de matriz.

Mientras que hay publicaciones de matrices de péptidos y proteínas sobre superficies sólidas, estas han recibido considerablemente menos atención en comparación con las matrices de ADN. Esto es probablemente debido a la inestabilidad inherente de estos materiales en las zonas interfaciales, y en presencia de matrices biológicas complejas. Por ejemplo, es bien conocido, que muchas proteínas se desnaturalizan en contacto con superficies sólidas. Los péptidos, así como las proteínas, están también sujetos a hidrólisis por cualquier proteasa que pueda estar presente en la muestra biológica que se analiza. Además, las matrices de péptidos son típicamente sintetizadas in situ sobre superficies sólidas utilizando métodos fotolitográficos. Estas técnicas requieren el uso de máscaras caras hechas a la medida que tienen que ser diseñadas y fabricadas para cada chip. Además, la caracterización química de los péptidos sintetizados en la superficie es casi imposible de llevar a cabo debido a la pequeñísima cantidad de péptido generado.

El documento de patente internacional WO 98/31839 describe métodos generales para inmovilizar sustancias biológicas sobre un soporte sólido, en donde los sustratos pueden estar formados de oro o aluminio.

El documento de patente internacional WO 98/59360 describe sustratos para la preparación de matrices de moléculas biológicas que pueden estar cubiertos con óxidos de oro o silicio y derivatizados opcionalmente con otras moléculas bifuncionales tales como carbodiimida o N-hidroxisuccinimida.

El documento de patente internacional WO 92/10757 describe el acoplamiento de moléculas a un sustrato sólido por medio del uso de una unión tiol-avidina-biotina-avidina.

MacBeath et al., J. Am. Chem. Soc. (1999), Vol. 121, 7967-7968, describe la funcionalización de los portaobjetos de vidrio con aminopropiltrietoxisilano y maleimida. Se describe la generación de matrices de moléculas sobre cuentas distribuidas en pocillos individuales y la unión covalente a la superficie del portaobjetos.

El documento de patente de los Estados Unidos Nº 5.965.695 proporciona bibliotecas de peptoides que son útiles para la identificación de las interacciones de los receptores.

Actualmente, la forma más común de analizar el proteoma de muestras biológicas emplea electroforesis de gel de dos dimensiones ("2-D"). Este método es problemático porque los resultados son muy sensibles al protocolo experimental (por ejemplo, el tiempo de desarrollo del gel así como a otros parámetros). Por tanto, es muy difícil obtener datos reproducibles de los geles de 2D. También, la sensibilidad del tinte de plata usado en estos geles es limitada, y es menor que la de las etiquetas fluorescentes usadas en las tecnologías de la micro matriz.

Así, hay una imperante necesidad de desarrollar una tecnología eficaz de micro matriz que sea útil en el contexto de proteínas. En muchos casos, vías funcionales no pueden directamente ligarse a un gen particular. Las proteínas a menudo sufren una variedad de modificaciones postranslacionales, interacciones, o degradaciones que determinan finalmente la función. Incluso la evaluación aparentemente simple de la abundancia de una proteína no puede correlacionarse directamente con el nivel del ARNm correspondiente. La única solución es evaluar el estado de la célula, tejido u organismo al nivel de proteína. Por tanto, un formato de alto rendimiento que permita mostrar rápidamente los diferenciales de proteína en mezclas complejas tal como células, tejidos, suero etc., proporcionarían un recurso poderoso y complementario a la tecnología de la micro matriz de ADN.

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Compendio de la invención

Para lograr lo anterior, la presente invención proporciona matrices de unión a proteínas de peptidomiméticos, su producción, uso, y aplicación. Los elementos de la matriz de unión a proteínas de la invención incluyen un segmento de peptidomimético, un segmento de anclaje y un segmento de unión que conecta el segmento de peptidomimético y el segmento de anclaje. La invención contempla la síntesis de elementos de la biblioteca de la matriz de peptidomiméticos, la distribución, y aplicación de los elementos de la matriz a sustratos sólidos planos, el marcado de las mezclas complejas de proteína, y el análisis de los diferenciales de unión de las proteínas a la matriz. La invención también permite el enriquecimiento o purificación, y la secuenciación posterior o el análisis estructural de las proteínas que se identifican como diferenciales por el cribado de la matriz. Se proporciona también kits que incluyen las micro matrices proteómicas según la presente invención.

En un aspecto, la invención se refiere a una matriz de agentes de unión a proteínas unidos de forma estable a la superficie de un soporte sólido. La matriz incluye un sustrato sólido que tiene una superficie sustancialmente plana de aluminio recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 900 \ring{A} y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente, y un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas unidos al sustrato. Cada uno de los agentes de unión a proteínas incluye un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de unión a proteínas de peptidomimético unido, y un segmento de unión que conecta y separa el segmento de peptidomimético y el segmento de anclaje. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para fabricar una matriz que comprende un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie de un soporte sólido. El método envuelve preparar para la unión un sustrato sólido que tiene una superficie sustancialmente plana de aluminio recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 900 \ring{A} y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente, y poner en contacto un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas con el sustrato en condiciones suficientes para que los agentes de unión a proteínas se unan a la superficie del sustrato. Cada uno de los agentes de unión a proteínas incluye un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de peptidomimético de unión a la proteína, y un segmento de unión que conecta y separa el segmento de anclaje y el segmento de peptidomimético.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para fabricar una matriz que comprende un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie del soporte sólido. El método supone generar una biblioteca de agentes de unión a proteínas en los que cada uno incluye un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de peptidomimético de unión a la proteína, y un segmento de unión que conecta y separa el segmento de anclaje y el segmento de peptidomimético. Los agentes de unión a proteínas están distribuidos en la biblioteca en receptáculos de almacenamiento individuales para cada agente de unión a la proteína diferente, un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas se preparan para unirse a un sustrato sólido, se prepara un sustrato sólido que tiene una superficie sustancialmente plana de aluminio recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 900 \ring{A} y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente,, para unirse con un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas, y se prepara una matriz como se describe aquí.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método de llevar a cabo un ensayo diferencial de unión. El método conlleva marcar proteínas en una solución de muestra biológica que contiene proteínas, poner en contacto una alícuota de la solución de la muestra biológica que contiene las proteínas marcadas con una matriz como se describe aquí, y analizar la matriz para determinar diferenciales de unión de proteínas en la muestra a agentes de unión a proteínas de la matriz.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para usar en un ensayo de unión diferencial que se lleva a cabo como se describe aquí. El kit incluye una matriz que tiene un sustrato sólido que tiene una superficie sustancialmente plana de aluminio recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 900 \ring{A} y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente, con un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas unidas al sustrato. Cada uno de los agentes de unión a proteínas incluye un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de unión a proteínas de peptidomimético, y un segmento de unión que conecta y separa el segmento de anclaje y el segmento de peptidomimético.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una matriz mixta de agentes de unión a proteínas unidos de forma estable a la superficie del soporte sólido. La matriz incluye un sustrato sólido que tiene una superficie sustancialmente plana de aluminio recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 900 \ring{A} y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente, y un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas unidos al sustrato. Cada uno de los agentes de unión a proteínas incluye un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de proteína de peptidomimético, y un segmento de unión que conecta y separa el segmentos de anclaje y el segmento de peptidomimético. La matriz además incluye un conjunto de diferentes anticuerpos unidos al sustrato.

Estos y otros aspectos y ventajas de la presente invención serán presentados con más detalle en las especificaciones siguientes de la invención y en las figuras que acompañan e ilustran a modo de ejemplo los principios de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A y 1B describen esquemáticamente la estructura de un elemento de la matriz de agente de unión a proteínas y la parte de la matriz, respectivamente, según una realización de la presente invención.

Fig. 1C describe la estructura molecular de un segmento de unión de un agente de unión a proteínas compuesto de óxidos de etileno según una realización de la presente invención.

La Figura 2 esquemáticamente describe un procedimiento para fabricar una matriz que tiene un conjunto de diferentes agentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie de un soporte sólido según una realización de la presente invención.

La Figura 3 esquemáticamente describe la estructura molecular de seis elementos peptoides 12-mer de la matriz según una realización de la presente invención.

Las Figuras 4A y 4B describen esquemáticamente modos alternativos de unir un agente de unión a proteínas a un soporte sólido según una realización de la presente invención.

La Figura 5 describe esquemáticamente un procedimiento para llevar a cabo un ensayo de unión diferencial de las proteínas según una realización de la presente invención.

La Figura 6 describe esquemáticamente varios procedimientos para identificar y caracterizar proteínas según una realización de la presente invención.

La Figura 7A describe la fórmula química para una molécula NHS-LC-LC-biotina usada en una solución para recubrir portaobjetos de aluminio que se usan como sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 7B describe una representación de un portaobjetos de aluminio derivatizado con avidina aplicado con un agente de unión a proteínas biotinilado según una realización de la presente invención.

La Figura 8 describe un gráfico de resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño llevada a cabo para separar proteínas marcadas del tinte que no ha reaccionado antes de aplicar la muestra de la proteína marcada a una micro matriz según una realización de la presente invención.

Las Figs. 9A-9C describen barridos de los chips de la micro matriz que soportan una biblioteca de 1.000 agentes de unión a proteínas basados en peptoides usados para probar el concepto de la presente invención.

La Fig. 10 describe péptidos hexaméricos biotinilados (A a E) y la intensidad de la señal correspondiente obtenida cuando los péptidos biotinilados fueron aplicados en portaobjetos tratados con avidina, bloqueados con caseína, y enfrentados a anticuerpos antiglu marcados con Cy 5.

La Fig. 11 describe la dependencia de la intensidad de la señal con el modo de unión a la superficie de un péptido para dos modos de unión a la superficie según la presente invención.

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Descripción de las realizaciones específicas de la invención

Los materiales y técnicas asociadas y aparatos de la presente invención serán ahora descritos con referencia a varias realizaciones. Las propiedades importantes y características de las realizaciones descritas se ilustran en las estructuras del texto en los dibujos que acompañan. Mientras que la invención será descrita en conjunto con estas realizaciones, debería entenderse que la invención no se intenta que esté limitada a estas realizaciones. Por el contrario, se intenta cubrir alternativas, modificaciones, y equivalentes que pueden estar incluidas dentro del espíritu y alcance de la invención. En la descripción que sigue, se establecen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de la presente invención. La presente invención puede ponerse en práctica sin algunos o todos de estos detalles específicos. En otros ejemplos, operaciones de proceso bien conocidas no se han descrito en detalle para no obscurecer innecesariamente la presente invención.

En esta especificación y en las reivindicaciones incluidas, las formas singulares "un", "una", y "el", "la" incluyen referencias plurales a menos que en el contexto claramente se indique de otro modo. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por una persona conocedora de la técnica a la que esta invención pertenece.

Introducción

La presente invención proporciona matrices de unión a proteínas de peptidomiméticos, además de métodos para su fabricación, uso y aplicación. Los elementos de la matriz de unión a proteínas de la invención incluyen un segmento de peptidomimético (un ejemplo del mismo es un peptoide), unido a un soporte sólido usando un anclaje estable. En una realización, la invención proporciona la síntesis de la biblioteca de los elementos de la matriz de péptidomimético, la distribución, y la aplicación de los elementos de la matriz a sustratos sólidos planos, el marcado de mezclas complejas de proteínas, y el análisis de unión a proteínas única o el análisis de unión diferencial por contacto de la proteína pura marcada o las mezclas complejas de proteínas con la matriz de peptidomimético. Tal análisis puede conducir a la identificación de dianas terapéuticas nuevas que participan en enfermedades tales como el cáncer, VIH o la diabetes. Estas nuevas dianas pueden después utilizarse en los ensayos de cribado de alto rendimiento para encontrar nuevos candidatos a fármacos. La invención también permite el enriquecimiento o purificación, y consiguiente secuenciación o análisis estructural, de proteínas que se identifican como diferenciales por el cribado de la matriz. Las matrices pueden también usarse para identificar nuevos ligandos sintéticos para proteínas de interés (para purificación de proteínas o desarrollo de ensayos de alto rendimiento) o antígenos sintéticos para anticuerpos de interés. Pueden usarse también para encontrar nuevos inhibidores de enzimas u otros ligandos de gran afinidad para dianas de fármacos, o como apoyos para nuevas terapias. Se proporcionan también los kits que incluyen micro matrices proteómicas según la presente invención.

1. Matrices de agentes de unión a proteínas

Las matrices de peptidomiméticos según la presente invención se componen de un número de diferentes elementos de la matriz que comprende agentes de unión a proteínas unidos a la superficie del soporte sólido. Los elementos de la matriz de agentes diferentes de unión a proteínas incluyen cada uno un segmento de anclaje unido a la superficie del sustrato, un segmento de peptidomimético de unión a proteínas, y un segmento de unión que conecta y separa el segmento de anclaje y el segmento de peptidomimético. Un "peptidomimético" como se usa aquí se refiere a polímeros sintéticos no peptídicos u oligómeros que interaccionan detectablemente con proteínas o receptores en una manera análoga a interacciones físicas o químicas proteína-proteína o proteína-péptido en las condiciones del ensayo. El segmento de anclaje está típicamente unido a la superficie del sustrato de forma que la asociación entre el grupo de anclaje y la superficie del sustrato, y así la concentración y densidad del agente de unión a proteínas en la superficie del sustrato, se mantienen durante los procedimientos a los que la micro matriz está sujeta en sus condiciones normales de operación, por ejemplo, como se describe aquí. El número de especies químicas diferentes de agentes de unión a proteínas presentes en la superficie de la matriz es al menos 2, o al menos 10, o al menos 100, y puede ser mucho mayor, generalmente al menos alrededor de 1.000, o al menos 5.000 o alrededor de 50.000, por ejemplo, entre alrededor de 5.000 y alrededor de 10.000, como se define más tarde a continuación.

Las figuras 1A y 1B proporcionan una representación de uno de tales elementos de la matriz y una matriz de acuerdo con la invención. En la Fig. 1A, un elemento 100 de la matriz de unión a proteínas incluye tres segmentos: un segmento 102 de peptidomimético, un segmento 104 de anclaje, y un segmento 106 de unión. El elemento de la matriz está unido a un soporte sólido o sustrato 108 por un enlace entre su segmento de anclaje 104 y la superficie del sustrato 110. En algunos casos, el sustrato puede estar compuesto de un conjunto de capas 112ª, 112b, 122c formando un laminado. En la Fig. 1B, una matriz de unión a proteínas incluye un conjunto de diferentes elementos de la matriz 100, tal como se ilustra en la Fig. 1A, unido a un sustrato plano 108. Cada uno de estos componentes de la matriz se describe con mayor detalle separadamente a continuación.

A. Sustrato

El soporte sólido (Figuras. 1A y 1B, elemento 108) empleado en matrices según la presente invención puede variar grandemente dependiendo del uso que se intente para el producto que se va a producir. El soporte sólido puede ser cualquier material adecuado para unir el agente de unión a proteínas que sea también compatible con cualquiera de los métodos analíticos que se van a usar con la matriz. La compatibilidad puede determinarse usando métodos y materiales conocidos para aquellos que tienen conocimiento de la técnica química de superficies o materiales. En una realización, el soporte sólido comprende un material impermeable rígido. Materiales adecuados incluyen plásticos, tales como polímeros, por ejemplo cloruro de polivinilo, polietileno, poliestirenos, poliacrilatos, policarbonatos y copolímeros de los mismos, por ejemplo, cloruro de vinilo/polímero de propileno, cloruro de vinilo/polímero de acetato de vinilo, copolímeros de estireno, y similares. Materiales adecuados también incluyen vidrios, tales como aquellos formados de cuarzo, o silicio; y metales (que incluye aleaciones) por ejemplo, oro, platino, plata, cobre, aluminio, titanio, cromo y similares.

Como se indicó anteriormente, en muchas realizaciones de interés, el soporte o sustrato 108 será un conglomerado de dos o más capas diferentes de material, donde la composición incluye al menos un material de base, por ejemplo, como se representa por el elemento 112a en la Fig. 1A, y uno o más materiales de recubrimiento de superficies, como se representa por los elementos 112b y 112c en la Fig. 1A. Por ejemplo, una realización de interés incluye un material de base 112a tal como un vidrio, que está recubierto con una capa metálica 112b, por ejemplo, oro o aluminio recubierto con dióxido de silicio, o titanio recubierto con dióxido de silicio, y un compuesto orgánico funcionalizado, por ejemplo, tiol modificado con amina o silano modificado con amina, capa 112c. El soporte sólido plano puede ser de las dimensiones estándar 7,62 cm x 2,54 cm de los portaobjetos del microscopio o en la forma de oblea circular plana de 7,62 cm o 12,70 cm de diámetro, por ejemplo. Otras configuraciones serán aparentes a aquellos que tienen conocimiento de la técnica química de superficies y materiales.

El material de soporte sólido o sustrato puede tener una variedad de configuraciones diferentes, dependiendo del uso que se intente del material. Así, en el más amplio sentido el soporte o material de base puede estar en forma de placa, hoja, cono, tubo, pocillo, cuenta, nanopartícula (por ejemplo de alrededor de 5-100 nm), oblea, etc. En algunas realizaciones, el material de soporte de base es uno que tiene al menos una superficie sustancialmente plana, por ejemplo, como se encuentra en una plancha, placa, hoja, disco, etc. En algunas realizaciones, se emplean soportes que tienen una configuración sobre todo de placa o plancha, tal como una configuración rectangular o de disco.

En las realizaciones planas, rectangulares de las planchas anteriormente descritas, la longitud del soporte será generalmente de al menos alrededor de 1 cm y puede ser tan grande como alrededor de 40 cm o más, pero no excederá usualmente de alrededor de 30 cm y puede a menudo no exceder de alrededor de 20 cm. La anchura del soporte será generalmente de al menos alrededor de 1 cm y puede ser tan grande como alrededor de 40 cm, pero usualmente no excederá de alrededor de 30 cm y a menudo no excederá de alrededor de 20 cm. La altura del soporte estará generalmente en el intervalo de alrededor de 0,01 mm a alrededor de 10 mm, dependiendo al menos en parte del material del cual el sustrato rígido está fabricado y el espesor del material requerido para proporcionar la rigidez requerida. De particular interés en muchas realizaciones son los soportes que tienen las dimensiones de un portaobjetos de microscopio estándar. Un tamaño de sustrato típico es de alrededor de 2,54 cm x 7,62 cm y de alrededor de 1-2 mm de espesor. Sin embargo, cualquier dimensión adecuada puede emplearse.

Cuando el soporte es una cuenta, nanopartícula o micropartícula, el diámetro del soporte típicamente está en el intervalo de alrededor de 5 nm a alrededor de 1000 \mu, particularmente de alrededor de 10 nm a alrededor de 500 \mu.

Los agentes de unión a proteínas pueden o ser unidos directamente a la superficie sólida inorgánica de las capas 112a o112b (como se ilustra y describe en más detalle a continuación con referencia a la Fig. 4A) o ser unidos usando la capa orgánica funcionalizada de 112c (como se ilustra y describe en más detalle más tarde con referencia a la Figura 4B). En el último caso, los extremos no unidos al sustrato de las moléculas orgánicas en la capa se funcionalizan con un grupo reactivo que puede unirse al grupo de anclaje de un agente de unión a proteína posteriormente unido. Grupos reactivos adecuados terminales pueden ser, por ejemplo, maleimida, hidracida, aminooxi, un éster activado tal como N-hidroxisuccinimida, anhídrido, aldehído, bisulfuro, tiol, azida, fosfina o avidina, estreptavidina, neutravidina u otras formas alteradas de la proteína avidina que se une a la biotina, dependiendo del grupo funcional de anclaje.

En aquellas realizaciones en las que la superficie del material de soporte de la base, tal como vidrio, está recubierta con una capa fina de un metal, tal como aluminio, oro, o titanio, el espesor de la capa metálica estará generalmente en el intervalo de alrededor de 300 \ring{A} a alrededor de 10.000 \ring{A}, más particularmente de alrededor de 750 \ring{A} a alrededor de 2.000 \ring{A}, y aún más particularmente de alrededor de 1.000 \ring{A} a alrededor de 1.500 \ring{A}. La capa metálica puede estar depositada sobre la superficie del sustrato usando cualquier protocolo adecuado, incluyendo la deposición por rayos-e, deposición por vapor, chisporroteo y similares, como es sabido por aquellos conocedores de la técnica. Una capa metálica de adhesión puede estar presente entre la capa de metal y el sustrato, donde los metales de adhesión de interés incluyen titanio, cromo, y similares. Cuando está presente, la capa metálica de adhesión estará típicamente en un intervalo de espesor entre alrededor de 5. \ring{A} y alrededor de 100 \ring{A}, usualmente entre alrededor de 25 \ring{A} y alrededor de 75 \ring{A} y en muchas realizaciones estará alrededor de 50 \ring{A}. En algunas realizaciones, la capa de adhesión anteriormente descrita puede ser una capa de adhesión molecular. Ejemplos de materiales adecuados para formar capas de adhesión molecular según la presente invención incluyen mercaptopropiltrietioxisilano, y otros mercaptoalcoxisilanos, tales como mercaptopropiltrimetoxisilano, mercaptopropiltriclorosilano, u otras longitudes de cadena tales como mercaptohexiltrietoxisilano y otros mercaptohexilalcoxisilanos, como se conocen en la técnica. Cuando la capa de adhesión es una capa de adhesión molecular, el espesor de la capa de adhesión típicamente está en el intervalo de alrededor de 5 \ring{A} a alrededor de 50 \ring{A}.

El grupo de anclaje de un agente de unión a proteínas puede usarse para unir directamente el agente de unión a proteínas a la superficie de un sustrato inorgánico, por ejemplo, metal o vidrio. Por ejemplo, un grupo de anclaje de tiol puede usarse para unir directamente a metales tales como oro, plata, cobre o platino sin una capa intermedia funcionalizada (por ejemplo maleimida/amina/tiol). O, si el grupo de anclaje es un silano activado (o sea modificado para que sea reactivo con otras especies orgánicas, por ejemplo, silano hidrolizable o silano modificado que puede condensarse con hidroxilos u otros silanos para formar enlaces de siloxano), por ejemplo clorosilano o un alcoxisilano, el agente de unión a proteínas puede estar directamente unido al vidrio u otra superficie de óxidos, tales como óxido de titanio, óxido de silicio u óxido de aluminio. Otros silanos activados para este propósito incluyen trietoxisilano, triclorosilano, trimetoxisilano u otros trialcoxisilanos. Dentro de cada una de las clases, las longitudes de la cadena pueden ser desde tres átomos hasta alrededor de dieciocho átomos, por ejemplo.

Como será descrito en más detalle a continuación, en el caso de unión del agente de unión a proteínas directamente a la superficie inorgánica del sustrato, el segmento de unión del agente de unión a proteínas (entre el de peptidomimético y el de anclaje) debería ser suficientemente largo para mantener el de peptidomimético lo suficientemente lejos de la superficie dura del sustrato para que la superficie no interfiera con la unión a proteínas (subsiguientemente) en el de peptidomimético. La longitud puede ser de alrededor de 2 Angstrom a alrededor de 200 Angstrom, o de alrededor de 2 Angstrom a alrededor de 300 Angstrom, por ejemplo. Un segmento típico de unión puede tener una cadena principal de entre alrededor de 2 a alrededor de 30 átomos, preferiblemente de alrededor de 6 a alrededor de 12 átomos. El segmento de unión puede estar compuesto de, por ejemplo, cadenas alifáticas adecuadamente derivatizadas (por ejemplo, ácidos aminoalcanoicos, tales como ácido aminohexanoico), óxidos de etileno (por ejemplo, tales como se muestran en la Fig. 1C), sulfóxidos, o elementos peptoides o elementos de péptido cortos "no de unión" (ortogonales) que permanecen constantes para cada elemento de la matriz (por ejemplo, un heptámero de glicina), o alguna combinación de estos compuestos.

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Como se describió anteriormente, los agentes de unión a proteínas pueden también unirse usando una capa orgánica funcionalizada (Figura 1A, elemento 112c), tal como un tiol modificado con amina (aminotiol) (para el uso con algunas superficies de sustrato metálicas) o un silano modificado con amina (aminosilano) (para el uso con sustratos de superficies de vidrio, metálicas u otro óxido). Cuando se usa una tal capa orgánica, los extremos de las moléculas orgánicas de la capa están funcionalizados con un grupo reactivo que puede unirse de forma estable a la superficie de sustrato en un extremo, y a continuación al segmento de anclaje de un agente de unión a proteínas según la presente invención en el otro extremo. Grupos terminales adecuados incluyen, por ejemplo, maleimida que puede formar enlaces covalentes por reacción con un tiol presente en el anclaje. Una ventaja adicional de tales sistemas sintéticos de anclaje es su estabilidad, que confiere una vida larga de almacenaje. Otros posibles grupos terminales en el sustrato incluyen hidracida, que puede reaccionar para formar enlaces covalentes con restos de aldehído o cetona en el anclaje; aminooxi, que puede reaccionar para formar enlaces covalentes con restos cetona en el anclaje, aldehído, disulfuro, tiol, azida, fosfina.

En otra realización, proteínas tales como la avidina, estreptavina, u otras análogas pueden usarse como un recubrimiento para el soporte sólido. En este caso, la biotina se usa como el resto de anclaje del agente de unión a proteínas para formar un complejo estable de unión no covalente con avidina en la superficie. Sin desear estar ligado a ninguna teoría de acción particular, se cree que este formato muestra el agente de unión a proteínas en un ambiente particularmente biocompatible con las distancias deseables entre las moléculas mostradas y sus vecinas, y las distancias deseables entre las moléculas mostradas y la superficie sólida. Otros recubrimientos de proteínas pueden emplearse también, con la condición de que estén suficientemente unidos a grupos de anclaje de pequeñas moléculas. Estos pueden incluir anti-digoxigenina/digoxigenina, anti-dinitrofenol/dinitrofenol, o muchas otras parejas de proteína/pequeña molécula conocidas en la técnica. Avidina/biotina es de particular valor porque la interacción de la unión es extremadamente estable. Además, aumentos sustanciales de la señal se han observado para la inmovilización de la biotina/avidina comparada con otras técnicas de inmovilización adecuadas según la presente invención, por ejemplo 1000X mayor que tiol/maleimida. Macromoléculas adecuadas sintéticas pueden también usarse como miméticos de tales espaciadores de proteínas. Estos pueden incluir polímeros de gran peso molecular tales como polietileniminas, dendrímeros, ácidos poliacrílicos, polilisinas y similares.

Desde luego, otras combinaciones adecuadas de unión de este tipo (o sea, como se anotó anteriormente, suficientemente estables para mantener el enlace durante los procedimientos a los que la micro matriz está sujeta en sus condiciones normales de operación) son también posibles. Además, aquellos que tienen conocimiento de las técnicas de la química de superficies entenderán que la lista anterior de grupos de anclaje en el peptoide pueden funcionar como grupos reactivos en la superficie, y los grupos reactivos de superficie pueden también funcionar como grupos de anclaje de peptidomiméticos.

En una realización de la presente invención, los portaobjetos de aluminio pueden estar recubiertos con una capa de dióxido de silicio o monóxido de silicio que tiene un espesor de entre alrededor de 500 \ring{A} a alrededor de 2.000 \ring{A}. El espesor se elige para que aproximadamente corresponda a ¼ de la longitud de onda de la luz de emisión o excitación. Una capa de un aminoalquiltrialcoxisilano, tal como aminopropiltrietoxisilano (APS), tricloroxilano, trimetoxisilano, y cualquier otro trialcoxisilano está recubierta sobre la superficie del óxido. Además, otros aminoxilanos podrían también usarse, por ejemplo, compuestos que tienen grupos alquilo más largos, tales como octilo, decilo, hexadecilo, etc., que pueden formar capas de xilano más ordenadas como se apreciará por aquellos que tienen conocimiento de las técnicas de la química de superficies. El espesor de esta capa de silano puede ser de alrededor de 3 \ring{A} a alrededor de 100 \ring{A}, más preferiblemente de alrededor de 5 \ring{A} a alrededor de 50 \ring{A}, aún más preferiblemente alrededor de 7 \ring{A} a alrededor de 20 \ring{A}. Un ejemplo adecuado es una capa de APS que es alrededor de 7 \ring{A} de espesor. Las superficies de Al modificadas con amina pueden estar funcionalizadas con un grupo reactivo que se unirá al grupo funcional de anclaje en un agente de unión a proteínas. En una realización, el grupo funcional puede ser maleimida. En otra realización, el grupo funcional puede ser una proteína completa tal como la avidina. Una implementación de un sustrato con avidina se describe con referencia a las Figuras. 7A y 7B en el ejemplo 3, a continuación.

En otra realización, un sustrato de portaobjetos de superficie de oro (o un portaobjetos de superficie de cualquier metal capaz de formar enlaces metal-tiol, tal como Ag, Pt, o Cu) puede ser recubierto con una capa de aminotiol que está funcionalizado con un grupo que se unirá al grupo de anclaje funcional en un agente de unión a proteínas, tal como maleimida. Sin embargo, el grupo funcional de anclaje y el grupo reactivo unido a la superficie deberían escogerse para que tengan reactividades ortogonales. Como se hizo notar anteriormente, estos anclajes y grupos unidos al sustrato pueden ser intercambiables como será fácilmente comprendido por aquellos con conocimiento de la técnica.

En general, la capa orgánica funcionalizada 112c se caracteriza por tener una superficie hidrófila sustancialmente uniforme. Por uniforme queremos decir que la superficie de la capa no incluye sustancialmente ninguna irregularidad, tales como huecos, agujeritos, etc. El espesor de la capa 112c puede variar considerablemente, donde el espesor puede ser menor de alrededor de 5.000 \ring{A}, usualmente menos de alrededor de 2.000 \ring{A}, pero puede ser mucho menor, particularmente de alrededor de 5 \ring{A} a alrededor de 100 \ring{A}, o entre alrededor de 20 \ring{A} a alrededor de 50 \ring{A}.

En al menos aquellas realizaciones donde el material de soporte incluye una capa metálica debajo de una capa orgánica funcionalizada, por ejemplo, donde el material de soporte es una capa de tiol modificado con amina sobre un portaobjetos de microscopio recubierto de oro como se describió anteriormente, el espesor de la capa orgánica se elige de forma que la capa 112c sea al menos suficientemente gruesa para separar cualquier resto marcado fluorescentemente que pueda estar presente en la superficie a suficiente distancia de la capa metálica sobre la superficie del sustrato de manera que no ocurra una disminución significativa de la señal (o sea, la disminución de la señal de magnitud suficiente para efectivamente impedir la detección significativa de la señal). En estas realizaciones, la capa orgánica funcionalizada puede tener un espesor que es al menos de alrededor de 30 \ring{A}, usualmente al menos de alrededor de 50 \ring{A} y más usualmente de al menos 100 \ring{A}. Alternativamente, en casos donde la disminución no ocurre, el portaobjetos puede tratarse con una solución de alta concentración salina tal como cloruro sódico 0.75 M, citrato sódico 0,085 M (véase, por ejemplo, PCT Publication Nº WO 01/01142).

En aquellas realizaciones en donde la matriz se emplea con la diana marcada fluorescentemente, como se describe en más detalle a continuación, el espesor de la capa de tiol funcionalizado modificado con amina puede elegirse para proporcionar una amplificación máxima de la señal emitida y reflejada. Véase por ejemplo el documento de patente de Estados Unidos Nº. 5.055.265. En tales realizaciones, el espesor de la capa orgánica será de alrededor de ¼ de la longitud de onda de la luz emitida por la etiqueta. Mientras que el espesor exacto de la capa orgánica variará dependiendo de la etiqueta particular con que se va a emplear, el espesor generalmente está en el intervalo de alrededor de 50 \ring{A} a alrededor de 300 \ring{A}, usualmente de alrededor de 100 \ring{A} a alrededor de 200 \ring{A} y más usualmente de alrededor de 125 \ring{A} a alrededor de 150 \ring{A}.

En una realización, la capa de tiol funcionalizado modificado con amina 112c incluye al menos una monocapa (SAM) autoensamblada. Como tal, la capa orgánica funcionalizada puede incluir uno o más monocapas diferentes autoensambladas injertadas secuencialmente una en otra, cuando la capa incluye más de una monocapa autoensamblada (véase por ejemplo PCT Publication Nº. WO/01/01142).

B. Agentes de unión a proteínas

Como se indicó anteriormente, los agentes de unión a proteínas de la presente invención están compuestos de tres segmentos: un peptidomimético, un anclaje, y una unión que conecta el peptidomimético y el anclaje.

Un "peptidomimético" como se usa aquí se refiere a polímeros sintéticos no peptídicos u oligómeros que interaccionan detectablemente con proteínas o receptores en una manera análoga a las interaccionas quimicofísicas de proteína-proteína o proteína-péptido en las condiciones del ensayo. Los peptidomiméticos son generalmente resistentes a proteasas, e incluyen, por ejemplo, especies oligoméricas tales como peptoides, beta-péptidos, y otras como se describen en A. E. Barron & R.N. Zuckermann, Bioinspired polimeric materials; in-between proteins and plastics, Curr Opin Chem Biol 1999, 3(6):681-7 y K. Kirchenbaum, R. N. Zuckermann y K. A. Dill, Designing polymers that mimic biomolecules, Curr Opin Chem Biol 1999, 9(4):530-5 y moléculas cíclicas impedidas tales como péptidos cíclicos y heterociclos. En algunos casos, el peptidomimético puede también mimetizar el plegado de las proteínas naturales. Los peptidomiméticos según la presente invención comprenden generalmente no más de alrededor de 500 mers, más particularmente no más de alrededor de 100 mers, típicamente no más de alrededor de 50 mers, y usualmente alrededor de 10 a alrededor de 20 mers, más particularmente alrededor de 12 a alrededor de 16 mers. Dados los parámetros proporcionados aquí, una persona con conocimiento de la técnica podría elegir una longitud de peptidomimético apropiada para una aplicación dada sin indebida experimentación.

Ejemplos de bibliotecas de peptidomiméticos y su diseño y síntesis pueden encontrarse en Fahad Al-Obeidi, et al., Peptide and Peptidomimetic Libraries, Molecular Biotechnology 1998, 9: 205-223; Victor J. Hruby et al., Síntesis of oligopeptide and peptidomimetic libraries, Curr Opin Chem Biol 1997, 1:114-119; y Amy S. Ripka et al., Peptidomimetic Design, Curr Opin Chem Biol 1998, 2:441-452.

En una realización preferida de la presente invención, el segmento de peptidomimético del agente de unión a proteínas es un peptoide. El término "peptoide" como se usa aquí se refiere a polímeros que comprenden N^{\alpha}-aminas sustituidas como se describe en los documentos de patentes de Estados Unidos números 5.831.005, 5.877.278, 5.977.301, 5.871.387, 5.986.695, 5.719.049 5.977.301, 6.211.468 y PCT Publications Nºs de serie 96/15143 y 93/09117.

El segmento de anclaje proporciona la unión de forma estable del elemento de la matriz a la superficie sólida. Este grupo funcional se elige para que sea reactivo para un grupo complementario que se muestra en la superficie sólida y es ortogonal a (o sea, sustancialmente no reactivo con) las cadenas laterales presente en el ligando. Un rasgo importante del grupo de anclaje es que su reacción con la superficie sea suficientemente fácil para que sea completa dentro del tiempo de la media de la vida de una gotita que es depositada por el aplicador robótico de la matriz sobre la superficie. Por ejemplo, si la superficie muestra una maleimida, un grupo de anclaje adecuado es un tiol y se requiere aproximadamente 15-20 minutos a alrededor del 60% de humedad para que se complete la reacción de unión antes de que se evaporen gotas de 10 nl aproximadamente. Desde luego, la vida de las gotitas varía con la temperatura, la humedad y otras condiciones, permitiendo más o menos tiempo para que la reacción tenga lugar. Como se indicó anteriormente, otras combinaciones de superficie/anclaje son posibles, incluyendo un grupo de superficie de hidracida con un grupo de anclaje de aldehído o cetona. O, el grupo de anclaje puede también ser una molécula de biotina, que se unirá fuertemente (aunque no covalentemente) a una superficie que muestra una proteína de avidina.

El grupo de anclaje puede estar unido al peptidomimético en cualquiera de los extremos (en el caso de un peptoide, en el extremo C- o en el extremo N-). Se puede unir o como un submonómero (por ejemplo, una amina sustituida), o como una modificación de una cadena lateral de peptidimimético (o sea, peptoide) después de la síntesis. Alternativamente, en otro ejemplo, el grupo de anclaje puede estar presente como una unión que conecta el peptoide a un soporte sólido de cuentas sobre el que se sintetiza. Esta unión puede romperse de la resina junto con el peptoide, para proporcionar un grupo de anclaje disponible al momento.

El segmento de unión de la molécula del agente de unión a proteínas se elige para proporcionar una separación entre la superficie sólida y el segmento de peptidomomético suficiente para facilitar la interacción entre el peptidomimético y los componentes de la solución del analito (solución con la que la micro matriz será puesta en contacto), por ejemplo proporcionando una separación entre la superficie del sustrato y el peptidomimético de forma que la superficie no interfiera con la unión a proteínas que ocurre (subsecuentemente) al acceso del peptidomimético a un lugar de unión a proteínas al ligando peptidimimético mostrado en la superficie, especialmente para proteínas con cavidades profundas de enlace. La unión puede también servir para separar los peptidomiméticos en la superficie uno de otro, por lo tanto mitigando el posible impedimento estérico entre el ligando y la cavidad de unión a proteínas. Un segmento de unión típico puede tener una cadena principal de entre alrededor de 2 a alrededor de 200 átomos, preferiblemente de alrededor de 6 a alrededor de 30 átomos. El segmento de unión puede estar compuesto de, por ejemplo, cadenas alifáticas (por ejemplo, ácidos aminoalcanoicos, tales como el ácido aminohexanoico), óxidos de etileno, sulfóxidos, o elementos peptoides o elementos de péptido corto "no de unión" ("ortogonales") que permanecen constantes para cada elemento de la matriz, o alguna combinación de estos compuestos. En una realización, una unión de 2 carbonos puede usarse. En otra realización, tres óxidos de etileno pueden usarse. Un ejemplo de un peptoide corto no de unión es un 2-mer a 12-mer, por ejemplo un 4-mer de cadenas laterales de metoxietilo que permanece constante para cada agente de unión a proteínas, mientras que el segmento de peptidomimético es variable. Un enlazador peptídico ortogonal adecuado es un 2-mer o 12-mer, por ejemplo un 5-mer de glicina.

En algunas realizaciones, cuando hay una capa orgánica sobre la superficie del sustrato, puede construirse una funcionalidad espaciadora en la capa orgánica. En tales casos, el espaciador en la capa de la superficie del sustrato y la unión en el agente de unión a proteínas pueden contribuir colectivamente al espaciado deseado del peptidomimético de la superficie dura del sustrato. Además, el mitigar el impedimento estérico puede también alcanzarse por la selección de un recubrimiento de superficie que presente un formato particularmente biocompatible, tal como una proteína de avidina (acoplada con un grupo de anclaje de biotina en el agente de unión a proteínas).

La Fig. 3 ilustra un ejemplo de un pequeño conjunto de elementos de la matriz 300 en donde los segmento de unión a proteínas de peptidomimético 302 son peptoides de 12 mer, la unión 304 es una cadena alifática corta, y el grupo de anclaje 306 es un tiol. Los segmentos de peptidomimético descritos en la Fig. 3 ilustran un subconjunto del intervalo de propiedades de afinidad alcanzables usando peptoides como el segmento de peptidomomético, de acuerdo con una realización de la presente invención.

Como se mencionó anteriormente, el número de diferentes tipos de agentes de unión presentes en la superficie de la matriz es al menos dos. Por "diferente", se entiende que la secuencia de unidades monoméricas entre dos peptidomiméticos diferentes de dos agentes de unión a proteínas diferentes no es la misma. Mientras que el número de especies diferentes de agentes de unión a proteínas presentes en la superficie de la matriz es al menos 2, al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 50, o al menos alrededor de 100, es típicamente mucho mayor, generalmente siendo al menos alrededor de 1.000 usualmente al menos alrededor de 5.000 y más usualmente al menos alrededor de 10.000. El número puede ser tan alto como 500.000 o mayor, pero típicamente no es mayor de alrededor de 100.000 y usualmente no es mayor de 50.000.

Las regiones de la superficie que rodean a los elementos de unión a proteínas de la matriz pueden modificarse para minimizar la unión no específica de fondo de las proteínas, permitiendo que las muestras complejas (por ejemplo lisados o suero) sean examinadas en una sola etapa. La superficie puede ser bloqueada químicamente con terminaciones hidrófilas tales como alcoholes, carbohidratos, aminoácidos, sulfóxidos, acrilamidas, o éteres. Ejemplos de grupos terminales de alcohol son, por ejemplo, mercaptoetanol, mercaptohexanol, mercaptooctanol, en el caso de la superficie tratada con maleimida. Estos bloquean las maleimidas no reaccionadas de la superficie. La superficie puede también bloquearse usando proteínas tales como soluciones al 1%-10% de albúmina de suero bovino ("BSA") o albúmina de suero humano ("HSA") en tampón salino de fosfato, o leche en polvo no grasa al 1%-10% o caseína al 1%-10%, gelatina u otra proteína de bloqueo adecuada. En algunos casos, la adición de detergentes a la solución de la proteína de bloqueo es ventajosa. Por ejemplo, la adición de Tween-20 al 0,01%-0,5% o Triton X-100 (particularmente 0,05%), SDS al 0,1-2% son bien conocidas en el desarrollo del ensayo en las técnicas de química de superficie.

C. Características generales de la matriz

Típicamente, la matriz se caracteriza por tener un conjunto de muestras del agente de unión a proteínas sobre un sustrato sólido, en donde cada muestra se caracteriza por tener una o más, usualmente un conjunto, de agentes de unión idénticos unidos a la superficie del soporte. El número de muestras distintas sobre la superficie de la matriz puede o no ser el mismo que el número de agentes de unión a proteínas diferentes en la matriz, por ejemplo, el mismo agente de unión a proteínas puede estar presente en dos o más muestras en la superficie de la matriz. En una realización, cada agente de unión a proteínas se presenta por duplicado en la matriz. Dependiendo de la naturaleza de los agentes de unión, el tamaño de la superficie del soporte, el método de fabricación y el uso pretendido de la matriz, el número de muestras distintas en la superficie de la matriz puede variar grandemente. Cuando la superficie del soporte tiene las dimensiones de un portaobjetos de microscopio estándar (alrededor de 7,62 cm x 2,54 cm), el número de muestras sobre la superficie del soporte será típicamente al menos de alrededor de 3.000, usualmente al menos de alrededor de 6.000 y más usualmente al menos de alrededor de 10.000-50.000. El número puede ser tan alto como 100.000 o mayor, pero típicamente no es mayor de alrededor de 75.000 y usualmente no es mayor de alrededor de 50.000.

El diámetro de cada muestra típicamente estará en el intervalo de alrededor de 100 \mum a alrededor de 300 \mum, usualmente de alrededor de 200 \mum a alrededor de 300 \mum. El espacio entre cualquiera de dos muestras dadas será generalmente entre alrededor de 1 \mum y alrededor de 50 \mum. La densidad de las muestras generalmente está en el intervalo de alrededor de 1 a alrededor de 5.000 muestras/cm^{2}, usualmente de alrededor de 100 a 2.000 muestras/cm^{2}.Típicamente, las muestras se disponen a través de la superficie de la capa de espaciadores en forma de un patrón. El patrón puede estar en forma de filas y columnas organizadas de muestras, o sea como una rejilla de muestras a través de la superficie del sustrato, una serie de filas curvilíneas a través de la superficie del sustrato, por ejemplo, como una serie de círculos concéntricos o semicírculos de muestras, y similares. Para aumentar más la densidad, las muestras pueden también disponerse hexagonalmente. También otras disposiciones de las muestras están dentro del alcance de la presente invención.

2. Métodos de hacer matrices de agente de unión a proteínas de la presente invención

Las matrices de la presente invención pueden prepararse usando cualquier protocolo conveniente. Un protocolo de interés supone 1) procurarse un soporte sólido que tenga una superficie activada de unión de un agente de unión a proteínas; y 2) poner en contacto dos o más agentes de unión a proteínas diferentes con la superficie de soporte en condiciones tales que los agentes de unión a proteínas lleguen a estar asociados de forma estable con la superficie del soporte.

A. Fabricación del soporte sólido

El soporte sólido puede fabricarse usando cualquier metodología conveniente, cuya metodología variará dependiendo de la naturaleza particular del soporte sólido. Según una realización de la invención un soporte de vidrio se recubre con una capa metálica, por ejemplo, aluminio u oro. Para preparar un soporte sólido de vidrio recubierto con una capa metálica, la superficie de vidrio se recubre con una capa fina del metal, por ejemplo, oro, plata, platino, cobre, titanio, o aluminio, etc. con un espesor como se describió anteriormente. La capa metálica puede depositarse sobre la superficie del sustrato usando cualquier protocolo conveniente, donde los protocolos adecuados incluyen deposición de corriente de electrones, deposición de vapor, sputtering y similares, y son conocidos para aquellos conocedores de la técnica. Véase por ejemplo, Moteshari et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120:1328-1336; Bain et al., J. Am. Chem. Soc. (1989) 111:7155-7164; Lee et al. Langmuir (1998) 14:6419-6423; Folkers et al., Langmuir (1992) 8:1330-1341. Cuando sea conveniente, una capa metálica de adhesión puede estar presente entre la capa de metal y el sustrato, donde los metales de adhesión de interés incluyen titanio, cromo, y similares, depositada con un espesor como se describió anteriormente. Además, sobrecapas de óxido tal como dióxido de silicio o monóxido de silicio pueden ser depositadas por corriente de electrones o deposición por sputtering sobre la parte superior de la capa metálica. En un ejemplo, después de la preparación de un sustrato de oro, si el grupo de anclaje del agente de unión a proteínas es un tiol y el grupo de unión es suficientemente largo (como se explico anteriormente), las matrices según la presente invención pueden formarse por muestreo de los agentes de unión a proteínas con tiol en oro puro limpio. La superficie de oro del sustrato puede limpiarse usando solución de limpiar de ácido crómico (por ejemplo, óxido de cromo o dicromato de sodio en ácido sulfúrico, por ejemplo Nochromix, comercializado por Fisher (50-80% dicromato sódico en ácido sulfúrico 12N)) y lavada con agua grado HPLC. Esto tiene la ventaja de reducir el número de etapas de funcionalización de la superficie.

En otra realización, cuando el grupo de anclaje del agente de unión a proteínas es un silano funcionalizado modificado (por ejemplo, mono-, di-, o tri- silanos funcionalizados, tales como clorosilano, un alcoxisilano, dicloro o dialcoxi silano, o tricloro o trialcoxisilano), el grupo de anclaje puede estar unido directamente a las superficies que contienen óxido tal como vidrio, óxido de titanio u óxido de aluminio. Pueden formarse matrices según estas realizaciones de la presente invención por muestreo de los agentes activos de unión a proteínas con silano en la superficie del sustrato oxidado. Un sustrato de vidrio tiene hidroxilos de superficie disponibles para esta unión. Las superficies de sustrato metálico pueden oxidarse, por ejemplo por tratamiento térmico o químico. Por ejemplo, el aluminio puede oxidarse electroquímicamente, térmicamente o químicamente (por ejemplo, con H_{2}O_{2}), como es bien conocido en la técnica. Además, una capa de dióxido de silicio u óxido de titanio puede depositarse sobre el aluminio. Un óxido puede también estar presente como una capa nativa fina, tal como ocurre con el aluminio o el silicio. Este óxido nativo puede ser derivatizado después por el silano de amina.

En todavía otra realización de la invención, una superficie de sustrato metálico, por ejemplo oro o aluminio, se funcionaliza primeramente con moléculas orgánicas funcionalizadas que forman monocapas ordenadas. Los extremos de las moléculas orgánicas se funcionalizan con un grupo reactivo que puede unirse a un grupo de anclaje adecuado de un agente de unión a proteínas. Los grupos terminales adecuados pueden ser, por ejemplo, maleimida, hidracida, aminooxi, un éster activado tal como N-hidroxisuccinimida, anhídrido, aldehído, disulfuro, tiol, azida, fosfina o avidina, dependiendo del grupo funcional de anclaje.

En una realización las moléculas orgánicas funcionalizadas son moléculas de tiol modificadas con amina. Para funcionalizar la superficie metálica con las moléculas de tiol, el sustrato que tiene la superficie metálica puede sumergirse en una solución de tiol modificado con amina; la solución de tiol modificado con amina después puede depositarse en la superficie del sustrato. Pueden emplearse otros protocolos convenientes. Típicamente, el sustrato de oro se sumerge en la solución de de tiol modificado con amina en condiciones y por un periodo suficiente para que las moléculas de tiol modificado con amina se ensamblen en una monocapa sobre la superficie del sustrato. La temperatura a la que el contacto se lleva a cabo típicamente está en el intervalo de alrededor de 10ºC a alrededor de 100ºC, usualmente de alrededor de 15ºC a alrededor de 80ºC. El contacto se mantiene por un periodo suficiente de tiempo para que se forme la monocapa autoensamblada sobre la superficie de oro, donde el contacto se mantiene típicamente por al menos alrededor de 20 minutos, usualmente al menos alrededor de 4 horas, y más usualmente al menos alrededor de 16 horas.

Alternativamente, el aminotiol puede también depositarse por deposición de vapor en un horno de vacío o por recubrimiento giratorio. Por ejemplo, puede prepararse una solución al 1-10% (por ejemplo, 5%) de tiol en un disolvente volátil tal como isopropanol, metanol, THF. Los portaobjetos pueden girarse a alrededor de 1000-8000 rpm (por ejemplo, 5000 rpm) para proporcionar una deposición homogénea del tiol. Después, una molécula heterobifuncional (por ejemplo, 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimilo (SMCC) o LC (cadena larga)- SMCC) que es un éster activado en un extremo y una maleimida en el otro se ponen en contacto con el grupo amino para crear la superficie terminada de maleimida. Otros entrecruzadores heterobifuncionales podrían también usarse con diferentes longitudes de espaciadores (por ejemplo, un espaciador de óxido de etileno largo (por ejemplo, 2-4 unidades) entre un éster de NHS en un extremo, y una maleimida en el otro extremo. Como se indicó anteriormente, el espaciador sobre el sustrato sirve los mismos propósitos que "conector" en el agente de unión a proteínas.

En otra realización, pueden usarse portaobjetos de aluminio. El metal de aluminio puede depositarse por deposición de corriente de electrones sobre el sustrato de vidrio limpio. El aluminio es a continuación recubierto con dióxido de silicio (SiO_{2}) o monóxido de silicio en un espesor que es el mismo o más delgado que ¼ de la longitud de onda de la luz de emisión o excitación. Puede utilizarse un espesor del óxido de alrededor de 600 a 1000 Angstroms así se elimina la necesidad de hacer más fina la capa de óxido antes de llevar a cabo los experimentos de unión. La superficie de aluminio/óxido puede tratarse con silicio modificado de amina. Por ejemplo, portaobjetos de aluminio recientemente recubiertos con una capa de 800-1.400 Angstroms de dióxido de silicio, pueden sumergirse inmediatamente en un baño de aminopropil trietoxisilano del 3%-40% en isopropanol, que ha sido previamente filtrado a través de un filtro de membrana de 0,2 \muM, y silanizados hasta 1 hora, seguido de lavado y secado. Alternativamente, los portaobjetos de aluminio recubiertos de silano (APS) están comercializados por Amersham-Pharmacia, Amersham, Inglaterra (y descritos en la solicitud de patente internacional Nº WO 98/53304). En algunos casos, tales portaobjetos comercialmente disponibles pueden requerir hacer más fina la capa de óxido hasta entre alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 1.000 \ring{A}, más particularmente entre alrededor de 900 \ring{A} y alrededor de 1.000 \ring{A}, antes de llevar a cabo el experimento de unión para mejorar la relación señal/ruido. Las superficies de Al modificadas de amino finales pueden funcionalizarse con SMCC para producir una superficie que presenta grupos funcionales de maleimida. Aquí otra vez, el silano puede también ser depositado por vapor o recubierto por recubrimiento giratorio, como se describió anteriormente. Por ejemplo, puede prepararse una solución de silano del 1-10% (por ejemplo, 5%) en un disolvente volátil tal como isopropanol, metanol, THF. Los portaobjetos pueden girarse a 1.000-8.000 rpm (por ejemplo, 5.000 rpm) para proporcionar una deposición homogénea del silano. Después una molécula heterobifuncional (por ejemplo, 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC o LC-SMCC) que es un éster activado en un extremo y una maleimida en el otro se pone en contacto con el grupo amino para crear la superficie terminada de maleimida. Podrían también usarse otros entrecruzadores heterobifuncionales con diferentes espaciadores (por ejemplo, un espaciador de óxido de etileno largo (por ejemplo, 2-4 unidades) entre un éster de NHS en un extremo, y una biotina o maleimida en el otro extremo. Como se indicó anteriormente, el espaciador en el sustrato sirve los mismos propósitos que "el conector" en el agente de unión a proteínas.

Además según esta realización se ha encontrado que la amplificación de la señal fluorescente usada en las pruebas hechas con las micro matrices según la presente invención puede aumentarse grabando los portaobjetos de aluminio obtenibles comercialmente funcionalizados y aplicados (Amersham) para reducir el espesor de la capa de óxido a alrededor de 200 \ring{A} a alrededor de 900 \ring{A}, preferiblemente alrededor de 500 \ring{A}. Por ejemplo, puede aplicarse una solución de grabar de SDS de alrededor de 0,1-0,2%/SSC 5X (NaCl 0,75 M/citrato sódico 0,85 M) y opcionalmente EDTA 5 mM a alrededor de 50-80 grados, preferiblemente a alrededor de 60ºC durante alrededor de dos a cuatro horas. Como se ha indicado anteriormente, la deposición manual de una capa de dióxido de silicio de espesor adecuado puede eliminar la necesidad de hacer más fina la capa del portaobjetos.

Como se indicó anteriormente, cuando la superficie del sustrato tiene una monocapa autoensamblada orgánica, siguiendo el autoensamblaje de la monocapa inicial, una o más monocapas adicionales pueden injertarse entre la monocapa original, donde la capa(s) adicionales están hechas de moléculas, por ejemplo alquilos, que tienen funcionalidades que proporcionan su unión covalente a las funcionalidades de la superficie de la monocapa depositada inicialmente, por ejemplo funcionalidades de amino donde la monocapa depositada inicialmente se caracteriza por la presencia de funcionalidades de carboxi. Alternativamente, pueden construirse espaciadores multicomponente antes de la unión a la superficie.

B. Síntesis de los agentes de unión a proteínas

Como se indicó anteriormente, los agentes de unión a proteínas según la presente invención se componen de tres segmentos: uno de peptidomimético, uno de anclaje, y una unión que une el de peptidomimético y el de anclaje.

Los peptidomiméticos pueden tener una variedad de estructuras poliméricas no peptídicas y una variedad de características siempre que puedan mimetizar los efectos biológicos de los péptidos naturales. Las referencias a las estructuras peptidomiméticas han sido proporcionadas anteriormente. En una realización de la presente invención, el segmento de peptidomimético del agente de unión a proteínas es un peptoide.

Las bibliotecas de peptoides pueden sintetizarse usando técnicas de síntesis en fase sólida robotizadas, tales como aquellas desarrolladas por Chiron Corporation de Emeryville, California. La diversidad de la biblioteca puede controlarse por la naturaleza y disposición de los submonómeros de amina (ácido bromoacético y aminas sustituidas) usados en la síntesis de peptoides, como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos incorporados anteriormente.

Como se ilustra en la Fig. 2, pueden prepararse bibliotecas según un proceso 200 usando síntesis de mezcla y ruptura 202, o síntesis paralelas, tales que haya una multiplicidad de peptoides sintetizados, pero solamente una especie de peptoide en cada cuenta (es decir, cada cuenta tiene un compuesto único, repetido muchas veces). La cantidad de compuesto por cuenta puede estar en el intervalo de alrededor de 1-100 nanomoles, y 20-40 nanomoles es lo más típico. Corrientemente se obtienen alrededor de 40 nanomoles por cuenta. Los peptoides sintetizados, todavía unidos a la resina, pueden entonces distribuirse en placas de 96 pocillos (u otras placas multipocillos, tales como placas de 384 pocillos o 1024 pocillos) 204 usando, por ejemplo, tecnología de recogida de cuentas descrita en el documento de patente de Estados Unidos nombrado últimamente. El uso de resinas de "cuentas grandes" (que tienen un diámetro de alrededor de 500 \mu) permite la distribución de una cuenta por pocillo.

Los peptoides pueden entonces ser secados, separados de la resina (por ejemplo, con alrededor de 20-95% de TFA en diclorometano; 95% es lo típico), disueltos de nuevo en acetonitrilo/agua, filtrados o centrifugados, secados y disueltos de nuevo en DMSO al 50%/tampón al 50%. Otros sistemas de disolvente/tampón pueden también usarse tales como DMF al 50% o NMP al 50% y el resto es PBS, TBS, borato, tris-HCl, etc. En algunos casos, puede también añadirse un agente reductor tal como tris-carboxietilfosfina (TCEP) a los pocillos de la placa de aplicación para inhibir la oxidación de los tioles de los peptoides de manera que mantengan su reactividad con las maleimidas en la superficie del sustrato. En los casos en que se añade TCEP a los pocillos, hay que evitar los tampones de fosfato tales como PBS, y se prefieren tampones tales como TBS. Esta solución final está lista para su aplicación.

En una realización de la presente invención, la concentración de peptoides en los pocillos de la placa de aplicación debería estar en el intervalo de alrededor de 0,5-2 mM, y se prefiere 2 mM. Para aplicación sobre el soporte sólido plano preparado 206, los peptoides se filtran o centrifugan, se secan, y se suspenden de nuevo, como se describe en más detalle a continuación. Es útil que el material que se aplica sobre el portaobjetos esté en exceso en relación a la cantidad de sonda en solución que se va a aplicar a la micro matriz. Es ésta una cantidad que da una señal fluorescente saturada, de manera que los cambios en la intensidad de la señal se deban sustancialmente a las concentraciones de proteínas.

Los grupos de anclaje y de unión pueden estar unidos al peptoide en cualquiera de los extremos C- o N-. Pueden unirse tanto como un submonómero (por ejemplo como se describe en el documento de patente de Estados Unidos Nº 5.877.278) durante la síntesis del peptoide como se describió anteriormente en el documento de patente, o con etapas de acoplamiento de aminoácidos activados in situ, como una modificación del peptoide después de la síntesis, según los procedimientos conocidos a aquellos con conocimiento de la técnica.

Para una unión en el extremo N-, puede sintetizarse el peptoide en una resina y después pueden añadirse los grupos de anclaje y unión antes de separar toda la molécula. Por ejemplo, los peptoides pueden prepararse en una resina de poli estireno de amida de Rink como se ilustra y describe en la solicitud compañera pendiente Nº 09/704.422. El procedimiento sintético se describe también en Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Methods Enzymol. 1996, 267:437-447. También pueden añadirse antes de la separación, uno o más (por ejemplo, dos a cuatro, preferiblemente cuatro) grupos hidrófilos submonómeros de unión (por ejemplo, metoxietilamina) al extremo N- del peptoide. A continuación, se añade una cisteamina protegida con tritilo para proporcionar un grupo de anclaje de tiol. El peptoide con grupos de unión y anclaje unidos puede ser a continuación separado de la resina, por ejemplo usando TFA al 95% (v/v) en diclorometanol (CH_{2}Cl_{2}). La solución obtenida está entonces lista para su aplicación a la superficie de la micro matriz según la presente invención.

En otra realización, se une una beta-alanina protegida con FMOC al extremo N-del peptoide por medio de la activación in situ con Hobt y DIC, como es conocido a aquellos versados en la técnica de síntesis de peptoides. La beta-alanina funciona como una molécula adaptadora entre el peptoide y el conector del peptoide. Después de la unión de la beta-alanina, se une un aminoácido protegido con FMOC a un péptido (por ejemplo, glicólico) de unión, por ejemplo, se une al extremo N- de la beta-alanina. Finalmente, se añade biotina al extremo N- con técnicas de acoplamiento de péptidos.

Los grupos de anclaje de tiol o biotina pueden también unirse al final del peptoide al extremo C-. Por ejemplo, se trata el ácido 4-(difenilhidroximetil)benzoico (obtenible comercialmente de Fluka) con el hidrocloruro de cistamina en presencia de un catalizador ácido. A continuación se protege la amina obtenida como el derivado N-(9-flurenilmetoxicarbonil) (N-FMOC), y el compuesto FMOC-NH-CH_{2}CH_{2}-S-Tr-COOH se une a aminometil-cuentas grandes (400-500 micras, Polymer Labs). Se sintetiza el peptoide en la amina desprotegida como se describió anteriormente, y con tratamiento con TFA se obtiene la separación del peptoide modificado con tiol de la resina, mientras que se abandona el grupo protector tritilo en la resina.

C. Puesta en contacto del soporte sólido con los agentes de unión a proteínas

Después de la preparación del sustrato y de los agentes de unión a proteínas, como se ha descrito anteriormente, dos o más agentes de unión a proteínas de interés diferentes que se van a unir a la superficie para producir la matriz se ponen en contacto con la superficie del sustrato funcionalizado, o de otra manera preparado (limpiado, oxidado etc). Por contacto se quiere decir que los agentes de unión se sitúan en la proximidad de la superficie de manera que se convierten en algo sustancialmente unido o enganchado de manera estable a la superficie de la capa del sustrato.

Para poner en contacto los agentes de unión con la superficie del sustrato, puede emplearse cualquier manera conveniente de poner en contacto la superficie con los agentes de unión que resulte en el patrón deseado de muestras del agente de unión, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, por aplicación. Como se ha descrito anteriormente, el término contacto se usa aquí para referirse a cualquier método que pone al agente de unión muy cerca de la superficie de soporte. Generalmente, se emplea una solución acuosa (por ejemplo agua, agua/disolvente orgánico (tal como agua/DMSO 50/50, o similares) del agente de unión durante el contacto donde la solución puede comprender uno o más componentes además del agua y el agente de unión, por ejemplo agentes tampones, sales y similares. Otros sistemas incluyen NMP/TBS 50/50, DMF/TBS 50/50, NMP/PBS 50/50, DMF/PBS 50/50, o todos estos disolventes junto con el agua. La mezcla 50/50 puede también ajustarse. Por ejemplo, cuando se usa un porcentaje más alto de solución acuosa, los tamaños de las gotas pueden ser menores debido a la tensión superficial más alta de la solución. Puede controlarse el tamaño de la gota (y por lo tanto la densidad) hasta cierto grado de esta manera. Típicamente, se consigue el contacto depositando soluciones de los distintos agentes de unión en posiciones discretas de la superficie de soporte, de manera que cada tipo diferente de agente de unión se deposita en su propia posición única en la superficie del sustrato.

Los agentes de unión pueden depositarse en la superficie de soporte usando cualquier medio conveniente, por ejemplo con una pipeta. Se han desarrollado un número de dispositivos y protocolos para depositar soluciones acuosas en posiciones precisas de una superficie de soporte y pueden emplearse en los métodos presentes. Dichos dispositivos incluyen dispositivos de impresión de "chorro de tinta", la deposición mecánica o dispositivos de aplicación con pipetas y similares. Véanse por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos números 4.877.745; 5.338.688; 5.474.796; 5.449.754; 5.658.802, 5.700.637; y 5.807.552. Pueden obtenerse comercialmente dispositivos robóticos para depositar con precisión volúmenes acuosos en posiciones definidas de una superficie de soporte, o sea matrices de un número de firmas, incluyendo: Genetic Microsystems; Molecular Dynamics; Cartesian Technologies; Beecher Instruments, Genomic Solutions; y BioRobotics. Alternativamente, puede usarse la tecnología de chorro de burbuja descrita recientemente por Okamoto, Suzuki y Yamamoto, Nature Biotechnology, vol. 18 (abril, 2.000), 438.

Como se ha indicado anteriormente, un aspecto importante del procedimiento según la presente invención es que la reacción entre el grupo de anclaje en el agente de unión a proteínas y la superficie del sustrato debe ser los suficientemente sencilla para que se complete en la vida media de una gotita depositada por el muestreador robótico de matriz en la superficie. Por ejemplo, si la superficie está funcionalizada y muestra una maleimida, un grupo de anclaje adecuado es un tiol y se requieren aproximadamente 15-20 minutos a alrededor de 60% de humedad para completar la reacción de unión. Como se ha indicado anteriormente, otras combinaciones de superficie/anclaje son posibles, incluyendo las que forman enlaces estables, aunque no sean covalentes, tales como la avidina y biotina.

D. Bloqueo del chip

Después de la aplicación de la biblioteca peptoide al sustrato de la matriz (chip), la superficie remanente, no recubierta del chip puede ser funcionalizada con una molécula que muestra un extremo hidrófilo. Se anticipa que estos extremos hidrófilos reducen o eliminan la unión no específica de las proteínas en las mezclas complejas. La parte hidrófila puede consistir en alcoholes, sulfóxidos, carbohidratos, acrilamidas, con extremos hidrófilos tales como alcoholes, carbohidratos, aminoácidos, sulfóxidos, acrilamidas, y éteres u otros grupos de poca unión a proteínas. La molécula que muestra el extremo hidrófilo está anclada al chip de la misma manera que el peptoide que ya se ha aplicado. Por ejemplo, chips aplicados con la biblioteca de peptoides pueden ser bloqueados químicamente con cisteína, mercaptoetanol u otro tiol hidrófilo adecuado. Los chips pueden ser también bloqueados con proteínas tales como BSA/PBS al 2%, leche desnatada seca al 10% o caseína al 1% durante al menos 1 hora, lavados con agua y secados. Otros agentes bloqueantes posibles se indicaron anteriormente. Los agentes bloqueantes pueden aplicarse a los chips de forma bien conocida por aquellos versados en la técnica, tal como sumergiendo los chips en una solución de un agente
bloqueante, pintando la superficie de los chips con una solución de un agente bloqueante, o por revestimiento giratorio.

E. Compendio

Las figuras 4A y 4B ilustran brevemente los procedimientos para fabricar matrices de agentes de unión a proteínas para algunas realizaciones de la invención según los procedimientos descritos anteriormente. En la figura 4A, se muestra un procedimiento (400) para hacer una matriz en la que los agentes de unión a proteínas están unidos directamente a la superficie inorgánica de un sustrato plano sin nada (410). Se proporciona un sustrato plano 412 con una superficie de oro o aluminio. La superficie se prepara para la unión (limpieza) como se ha descrito anteriormente. Los agentes de unión a proteínas 422 con un grupo tiol de anclaje 434 se aplican al sustrato 412 (420). Una vez se ha completado la unión de los agentes de unión a proteínas, se aplica un agente bloqueador 432, a saber un grupo hidrófilo, tal como un alcohol, o una proteína a la superficie del sustrato 412 donde no hay ningún agente de unión a l proteínas 422 unido (430).

En la figura 4B, se muestra un procedimiento (450) para hacer una matriz en la que los agentes de unión a proteínas están unidos a la superficie de un sustrato plano por medio de una capa superficial orgánica. Se proporciona un sustrato plano 462 con una superficie de oro o aluminio (460). Se prepara la superficie para la unión aplicando un tiol funcionalizado modificado con amina o una capa de silano modificado con amina 464, como se describe anteriormente. La capa 464 incluye una funcionalidad tiol o silano 466 que se une a la superficie de oro o aluminio del sustrato 462 y una funcionalidad de unión 468, tal como una maleimida, para un agente de unión a proteínas unido a continuación. Se aplican sobre el sustrato (470) los agentes de unión a proteínas 472 con la funcionalidad de grupo de anclaje 474 complementaria a la funcionalidad de unión 472 de la capa superficial del sustrato 468. Una vez que la unión de los agentes de unión a proteínas está completa, se aplica un agente bloqueante 482, a saber un grupo hidrófilo, tal como un alcohol, o una proteína a la superficie del sustrato donde no hay ningún agente de unión a proteínas 472 unido (480).

3. Métodos para usar las matrices de agentes de unión a proteínas de la invención

Las matrices de la invención encuentran uso en una variedad de diferentes aplicaciones en las que se detectan eventos de unión entre los agentes de unión unidos a la superficie de la matriz y los analito(s) de interés en una muestra de prueba. En otras palabras, las matrices de la invención encuentran uso en ensayos de unión. En dichas aplicaciones, el agente de unión unido al soporte actúa generalmente como una "diana" para el analito "sonda" en la muestra de prueba. El analito sonda está típicamente marcado, por ejemplo donde la marca puede ser una etiqueta directamente detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimiluminiscente, etc.) o una etiqueta detectable indirectamente (por ejemplo un miembro de un sistema que produce una señal, tal como un ligando para un anticuerpo marcado, donde la etiqueta puede ser una enzima que convierte un sustrato a un producto cromogénico, etc., donde el anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo marcado de forma secundaria) de manera que los eventos de unión puedan ser fácilmente detectados.

En particular, las matrices según la presente invención son útiles para realizar análisis proteómicos de muestras complejas de proteínas. Como se usa aquí, análisis proteómicos es la separación y/o cuantificación y/o identificación de una o más proteínas en una muestra. La muestra puede derivarse de una célula (por ejemplo, el citosol de la célula, las proteínas de la membrana o extracelulares), tejidos (por ejemplo, diseccionados o microdiseccionados con láser), fluidos corporales (tales como la orina, sangre, líquido espinal) o cualquier otra muestra que contenga proteínas. Los resultados de dicha separación/cuantificación/identificación pueden producir dianas de proteínas nuevas para el cribado de fármacos, proteínas para diagnosis, o ligandos sintéticos nuevos para ensayos o para la purificación de proteínas. Las matrices pueden usarse muy eficazmente en ensayos de unión diferencial de proteínas. Por ejemplo pueden hacerse, dos (o más) marcajes en color fluorescente de mezclas complejas de proteínas, y llevarse a cabo el análisis de unión diferencial de proteínas a la matriz por técnicas de imagen de fluorescencia. Como se describe a continuación, las matrices pueden usarse junto con otras técnicas para identificar, secuenciar y caracterizar estructuralmente proteínas o péptidos de interés expresados diferencialmente. Las matrices pueden realizarse en paralelo con micro matrices de ADN y compararse los distintos resultados de unión para identificar correlaciones entre la actividad de los genes y la expresión de las proteínas. También pueden prepararse matrices mixtas, en donde las moléculas que forman una matriz incluyen anticuerpos, etc y usarse para hacer ensayos de unión.

Pueden usarse una variedad de técnicas para realizar pruebas de unión diferencial usando matrices según la presente invención ("micro matrices proteómicas"). Algunas de estas técnicas, como se usan en realizaciones de la presente invención, se describen a continuación:

A. Marcado de proteínas

Las muestras complejas de proteínas se marcan usando técnicas estándares, muchas de las cuales se han desarrollado para el análisis por gel bidimensional de mezclas de proteínas. Por ejemplo, la muestra A puede marcarse con un tinte reactivo de amina Cianina 3 ("Cy 3") (\lambda_{ex} = 550 nm/\lambda_{em} = 570 nm), y la muestra B se marca con un tinte reactivo de amina Cianina 5 (Cy 5) (\lambda_{ex} = 650 nm/\lambda_{em} = 670 nm) (los tintes reactivos están comercializados por Amersham-Pharmacia). Las muestras A y B pueden ser, por ejemplo, de tejidos o líneas celulares, respectivamente, normales o enfermos, tratados o sin tratar etc. El tinte no reaccionado puede separarse de la proteína marcada usando métodos estándares tales como filtración con geles, diálisis etc. Por descontado, como se ha mencionado anteriormente, hay una variedad de marcadores diferentes, como es bien conocido por aquellos versados en la técnica, incluyendo pero no limitados a, tetrametilrodamina-isotiocianato (TRITC), fluoresceína-isotiocianato (FITC), y derivados del éster de succidimidilo de los mismos, o cualquier otra molécula de tinte que pueda hacerse reaccionar con las proteínas por medio de cadenas laterales de aminoácidos tales como cadenas laterales de amina (lisina), cadenas laterales de tiol (cisteína) u otros grupos funcionales adecuados.

B. Ensayo de unión y lectura del chip

Se incuban muestras de proteína marcadas con el chip de micro matriz proteómica durante periodos de tiempo, y en una variedad de condiciones de pH, contenido salino y temperatura anticipadas para modular la afinidad de varias proteínas a los elementos de la matriz. Generalmente, las muestras se ponen en contacto con la micro matriz por medio de la aplicación de un volumen apropiado de la muestra de fluido a la superficie de la matriz, donde la aplicación puede consistir en la inundación de la superficie con la muestra, aplicación de la muestra a la superficie, por ejemplo con una pipeta, inmersión de toda la matriz en la muestra, y similares. En muchas realizaciones, se deposita la solución sobre la superficie y después se la cubre como un sándwich bajo un cubreobjetos o en una cámara cerrada.

Por ejemplo, una alícuota de 25 \mul-100 \mul (típicamente 50 \mul) de cada solución sonda puede aplicarse a la superficie de un chip típico de tamaño de portaobjetos de microscopio, y un cubreobjetos limpio se coloca encima, formando un sándwich de la solución sonda en la superficie del chip. Las soluciones de proteínas pueden después coincubarse con el chip durante al menos 1 hora, o durante la noche. Después de la incubación, se quita el cubreobjetos del chip y se lava el chip, por ejemplo, con 1X PBS/Tween al 0,05% u otro tensioactivo adecuado que contenga un tampón. El chip puede lavarse usando una variedad de condiciones que disminuyan o aumenten los condicionantes. Estas condiciones pueden, de nuevo, hacerse a medida para permitir, por ejemplo, la retención de sólo las proteínas más fuertemente unidas. O, como el caso pueda permitir, puede usarse un lavado menos demandante para permitir la visualización de las proteínas unidas más débilmente comparativamente. La elección probablemente será determinada por la complejidad y diversidad de la matriz peptidomimética (o sea peptoide) que se despliega sobre el chip y la naturaleza de la mezcla de las proteínas. Los chips lavados se secan a continuación, por ejemplo, con un flujo de argón o nitrógeno.

Después de un lavado adecuado, el chip se lee en un escáner de matriz, tales como son bien conocidos en la técnica. La proporción de Cy 3 a Cy 5 en cada muestra se determina usando programas comercializados. Se observan las muestras que muestran una proporción considerablemente mayor de o menor de uno, y se consideran "diferenciales".

La figura 5 ilustra brevemente un procedimiento para conducir un ensayo proteómico de unión diferencial usando matrices de agentes de unión a proteínas en una realización de la invención según los procedimientos descritos anteriormente. En la figura 5, el procedimiento (500) empieza con la obtención de dos muestras biológicas que se comparan, por ejemplo una línea celular "no tratada" 502a y una línea celular "tratada" 502b. Los lisados celulares 504a,b se aíslan de las muestras de línea celular. Los lisados se marcan, por ejemplo, el lisado celular "no tratado" 504a se marca con un tinte verde fluorescente mientras que el lisado celular "tratado" 504b se marca con un tinte rojo fluorescente. Las muestras marcadas 506a,b se coincuban a continuación en un chip de matriz de unión a proteína 508 según la presente invención, es decir, una matriz de peptoides. La proteína en las muestras puede estar desnaturalizada o ser nativa. Por ejemplo, añadiendo SDS de 1-2% las proteínas en las muestras pueden ser desnaturalizadas lo que minimiza o elimina los grupos de interacciones hidrófobas. Alternativamente, los grupos, que pueden ser importantes para elucidar los caminos de las uniones proteína-proteína, y las proteínas pueden mantenerse en su estado nativo y estudiarse los resultados. El chip se lee entonces en un escáner de matriz.

C. Secuenciación de las bibliotecas de secuencias

La secuencia del peptidomimético que se une a una proteína expresada diferencialmente puede determinarse por medio de técnicas de secuenciación de bibliotecas. Esto puede conseguirse, por ejemplo, con métodos MS/MS que permiten la fragmentación del peptoide a lo largo de la cadena principal de la amida. Estos métodos se describen en la publicación PCT del documento de patente internacional número WO 00/72004. La estructura y secuencia del peptoide aislado puede determinarse por la masa del producto de fragmentación.

D. Procesos posteriores a la matriz: aislamiento, purificación e identificación de las proteínas

Una vez que se determina que una proteína o grupo de proteínas es diferencial entre las muestras A y B, puede aislarse preparando soportes cromatográficos compuestos del mismo peptidomimético (o sea peptoide) identificado en el chip.

Según una realización de la solicitud, una secuencia de peptoide que produce un diferencial en el chip puede sintetizarse en resinas hidrófilas que son "enmascaradas" hidrofóbicamente durante la síntesis del peptoide. Después de la síntesis, la resina se "desenmascara" para revelar grupos hidrófilos compatibles con las soluciones biológicas. Dicha resina está inmediatamente lista para experimentos de unión de proteínas/aislamiento.

Una vez que se aísla la proteína, su secuencia puede determinarse usando técnicas estándares tales como espectrometría de masas MALDI/TOF o digestión con tripsina.

La figura 6 ilustra brevemente aspectos de los procesos posteriores a la matriz según los procedimientos descritos anteriormente y a continuación. En la figura 6, el proceso (600) empieza con la preparación de columnas cromatográficas de separación 602 usando agentes peptidomiméticos 601, o sea, peptoides, identificados como de interés en un ensayo de unión proteómico diferencial realizado usando una micro matriz proteómica según la presente invención. Una alícuota de la compleja muestra originalmente analizada en la micro matriz se analiza con la columna. La proteína de interés se une preferentemente a la columna y es separada por lo tanto de los otros componentes de la muestra. La proteína unida se eluye y puede entonces usarse en análisis adicionales 604, tales como secuenciación de proteínas, determinación de estructura terciaria, etc. Además, los datos relacionados con la identificación de la proteína pueden entrarse en bases de datos de bioinformática para investigaciones adicionales.

Alternativamente, el mismo peptoide que se une a la proteína expresada diferencialmente podría aplicarse repetitivamente en un chip e incubarse con una alícuota del mismo lisado. La misma proteína debería unirse a la matriz, pero en un área mucho mayor que sólo la prueba del chip original. Puede usarse entonces la espectrometría de masas con desorción de láser para secuenciar la proteína directamente desde el chip.

E. Otras aplicaciones

Los usos anticipados de los chips de micro matrices proteómicos según la presente invención son amplios. En general, las aplicaciones tienen en común la identificación de una proteína o grupo de proteínas que están sobreexpresadas o subexpresadas en una mezcla compleja en relación a otra (o presentes/ausentes, tal como en el caso de una proteína de diagnóstico). Aquellos versados en la técnica reconocerán que las realizaciones de la presente invención son compatibles con una amplia variedad de formatos de ensayo incluyendo ensayos de sándwich, tales como ELISA.

Como se describió anteriormente, las micro matrices proteómicas pueden usarse para determinar la expresión diferencial de proteínas en soluciones complejas por medio del marcado alternativo (por ejemplo, Cy 3 para una muestra y Cy 5 para otra) de las dos o más soluciones de proteínas que se comparan. Los chips pueden usarse para encontrar dianas de proteína nuevas para futuros ensayos de cribado de alto rendimiento. En otra aplicación particularmente poderosa, puede usarse la metodología para purificar una proteína recombinante que está sobreexpresada en un hospedador particular tal como una levadura o baculovirus. La muestra que contiene la proteína expresada se compara a la muestra que no la tiene por counión de las muestras marcadas alternativamente en el chip, y la búsqueda de los diferenciales. El procedimiento identifica peptoides en la matriz que se unen con afinidad y especificidad razonables a la proteína expresada. Estos mismos peptoides se usan entonces para generar resinas cromatográficas para el aislamiento y purificación de la proteína recombinante de interés.

De forma análoga, los chips de micro matrices proteómicas pueden usarse para encontrar marcadores de proteínas en el plasma o suero que pueden ser diagnósticos de estados de enfermedad específicos tales como el cáncer, VIH, o diabetes, o para encontrar nuevas dianas para el cribado de fármacos. También, una vez que se ha identificado un grupo de ligandos para grupos particulares de proteínas, es posible monitorizar los niveles de expresión de estas proteínas a fin de descifrar los mecanismos de acción de los fármacos. En relación a esto, pueden usarse los nuevos ligandos como sondas de abundancia de proteínas, análogo a la manera en que los anticuerpos se usan actualmente para determinar la abundancia de proteínas. Además, examinando las proteínas de cepas de bacterias o virus virulentos y no virulentos, pueden determinarse factores únicos de virulencia que ocasionan una enfermedad infecciosa. Una vez que estos factores de virulencia se identifican, pueden usarse estas proteínas como dianas para el cribado de nuevos fármacos antibacterianos o antivirales. Alternativamente, los chips proporcionados por la presente invención pueden también usarse para descubrir una variedad de miméticos de péptidos, antígenos o proteínas. Por ejemplo, moléculas miméticas de adhesión celular nuevas, candidatos de fármacos miméticos, o miméticos de proteínas que pueden usarse como soportes cromatográficos. Además, los materiales aplicados al chip pueden ser ellos mismos candidatos a fármacos potenciales o funcionar como un soporte inicial en el diseño de nuevos candidatos a fármacos. En dichas realizaciones, ensayos de alto rendimiento para identificar agentes terapéuticos potenciales pueden hacerse directamente sobre el chip.

En una realización, las micro matrices proteómicas de la invención se desarrollan en paralelo con matrices de ADN, y los resultados de unión diferencial derivados de cada uno se comparan para identificar correlaciones entre la actividad genética y la expresión de las proteínas. Por ejemplo, se hacen ensayos de unión diferencial para muestras complejas biológicas tanto en micro matrices proteómicas como de ADN. Se marcan alícuotas separadas de las muestras y se ponen en contacto con una micro matriz proteómica según la presente invención y una micro matriz de ADN, tal como son bien conocidas en la técnica. La expresión diferencial de proteína evidenciada por los resultados de unión en la matriz proteómica cuando se compara con aquellos de la matriz de ADN puede elucidar relaciones entre la expresión de la proteína y las familias de genes cuya activación se requiere para esa expresión.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un chip de "matriz mixta" de la presente invención. Peptoides u otros elementos de unión peptidomiméticos unidos a la superficie del chip pueden mezclarse con anticuerpos o elementos de unión a proteínas de manera que ambos tipos de elementos de unión están presentes en el mismo chip. Los anticuerpos pueden servir como controles positivos, o como un medio de monitorizar las concentraciones de proteínas específicas en la mezcla que se está analizando. Los peptoides proporcionarían datos sobre diferenciales de proteínas desconocidas, en donde las pruebas de anticuerpo en el chip proporcionarían datos sobre concentraciones diferenciales de proteínas conocidas. Por ejemplo, si se trata una célula con un cierto fármaco, las concentraciones de proteínas pueden cambiar hacia arriba o hacia abajo. Si esas proteínas tienen anticuerpos conocidos, es posible monitorizar el cambio de estas con diferenciales de anticuerpos, mientras al mismo tiempo, se buscan cambios en proteínas desconocidas, con los diferenciales de peptoides.

En un ejemplo de esta técnica, se preparan soluciones de anticuerpos en las mismas placas de microtítulo que las soluciones de peptoides, pero en pocillos diferentes. Los peptoides están ya funcionalizados con grupos de anclaje de tiol. Se hacen reaccionar los anticuerpos con un agente reductor para reducir los enlaces disulfuro en las regiones de bisagra y Fc del anticuerpo (por ejemplo, como se describe en Levison, M.E., et al, (1969), Experientia, vol 25, 126-127 y Blauenstein, P. et al, (1995), Eur. J. Nuclear Med., vol 22, 690-698), produciendo así un tiol en el anticuerpo. Esto permite la aplicación tanto del peptoide como del anticuerpo en la misma sesión de prueba, creando por tanto un chip "mixto". Alternativamente, los anticuerpos pueden estar unidos a la Proteína A o la Proteína G inmobilizadas en las superficies del chip, mientras que los peptoides se unen a la avidina o la estreptavidina, presentando una superficie mixta de muestra. O, los anticuerpos pueden ser simplemente biotinilados y aplicados junto con peptoides biotinilados o péptidos en chips recubiertos de avidina.

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Otra técnica que puede combinarse con las técnicas de micro matrices proteómicas de la presente invención es la técnica de análisis estructural macromolecular MS/MS. De esta forma, la combinación de técnicas puede usarse para identificar una proteína de interés, enriquecerla y aislarla, secuenciar la proteína, y elucidar aspectos de su estructura terciaria proteica.

Los datos relacionados con la identificación y el procesamiento posterior a la matriz de las proteínas de interés pueden también entrarse en bases de datos bioinformáticas. Los datos pueden correlacionarse con otros datos biológicos contenidos allí en investigaciones adicionales.

4. Kits

También se proporciona por la invención en cuestión kits para realizar ensayos de unión proteómicos usando las matrices en cuestión. Dichos kits según la presente invención incluirán al menos una matriz según la invención. Los kits pueden ser configurados para fines analíticos o de diagnóstico, y pueden incluir además uno o más reactivos adicionales empleados en el método para el que se destina la matriz. Por ejemplo, el kit puede incluir varios receptáculos, etiquetas, soluciones de tampón, herramientas y cualquier otro material necesario para conducir un ensayo proteómico de unión. Los kits según la presente invención pueden también configurarse para recibir muestras para análisis y después realizar las etapas necesarias para un ensayo de unión según la invención sin necesidad de manipulaciones adicionales por el usuario.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos proporcionan detalles en relación a la síntesis y características de las matrices proteómicas según la presente invención, sus componentes, y aplicaciones. Debe entenderse que lo siguiente es solamente representativo, y que la invención no está limitada por los detalles presentados en estos ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación de placas de microtítulo que contienen un componente por pocillo

Preparación de una (1) placa de 96 pocillos que contienen 96 compuestos únicos (0,8 mM) en una solución 1:1 de DMSO/PBS: Un frasco siliconizado (8 ml, 2 dram) se cargó con una biblioteca de un compuesto/cuenta sintetizado en cuentas grandes en el soporte sólido de poli estireno de Rink (66 mg, \sim1320 cuentas, 40 nanomoles/cuenta, 0,75 mmoles/g, 425-500 \mum, Polymer Laboratories) que contiene un total de 121 compuestos posibles. Se hincharon las cuentas en dicloroetano (DCE, 4 ml) durante 24 horas y se cribaron con una malla de acero inoxidable (600 \mum). Se cogieron 96 cuentas individualmente de la lechada de dicloroetano y las cuentas obtenidas se colocaron en una placa de polipropileno de 96 pocillos (200 \mul, de fondo cónico) obteniéndose una cuenta por pocillo en los 96 pocillos. La placa obtenida de 96 pocillos (la placa "abuela"), se transfirió a un evaporador de vacío speed-vac Savant AES200 equipado con un rotor transportador de placa de 96 pocillos y el resto del DCE se eliminó de la placa. Se añadió entonces a cada pocillo de la placa que contenía una cuenta una mezcla de ruptura (TFA/TES/H2O/DCE, 46:2:2:50, 75 \mul). Después de una hora se transfirió la placa al evaporador de speed-vac para eliminar la mayor parte de los elementos volátiles de la placa. Se trató cada pocillo con acetonitrilo (CH_{3}CN, 10 \mul) y se agitó durante 10 minutos usando un agitador de placas de microtítulo. Se transfirió la placa a un evaporador de speed-vac y el resto de los elementos volátiles se eliminaron de la placa durante 10 minutos. Se disolvió cada compuesto en cada pocillo en dimetilsulfóxido (DMSO, 25 \mul) y se cambiaron a una placa de filtro de 96 pocillos hecha de poli estireno, equipada con una membrana de polipropileno (0,45 \mum). Se colocó la placa de filtro de 96 pocillos sobre una placa de 96 pocillos de polipropileno (200 \mul, fondo cónico) y el ensamblaje se transfirió a una centrífuga GS-6R de Beckman programada durante 5 minutos a 3.000 rpm (\sim2.000 g) a 15º.

Este procedimiento proporcionó la placa "madre" compuesta de 96 soluciones de DMSO filtradas (1,6 mM) de cada compuesto en los 96 pocillos. Para formar la "placa hija" (usada para las pruebas), se transfirió una alícuota de cada solución de DMSO (5 \mul) a una placa de 96 pocillos de polipropileno (200 \mul, fondo cónico). A continuación, cada pocillo en la placa hija se mezcló con una solución desgasificada de PBS (5 \mul) y la placa se almacenó a -20ºC. Alternativamente, cada compuesto en el pocillo puede disolverse en 20 \mul de DMSO/agua al 50%. En el caso de una placa de fondo cónico, puede centrifugarse la placa a 1.800 rpm durante 5 minutos para inmovilizar la cuenta en el fondo del pocillo cónico, seguido de la colocación de 10 \mul del sobrenadante transparente en la placa hija que está lista para la prueba.

Puede hacerse lo mismo con 384 cuentas en placas de 384 pocillos, o 1.024 cuentas en placas de 1.024 pocillos, etc. Para la aplicación, puede usarse cualquier dispositivo de aplicación adecuado, tales como los aplicadores de Molecular Dynamics Generation II (para 96 pocillos) o Generation III (384 pocillos).

Ejemplo 2 Funcionalización de los soportes sólidos para la aplicación

Se usaron portaobjetos de microscopio reflexivos de oro o aluminio como sustratos para la aplicación de una biblioteca de peptoides. En un ejemplo, el peptoide se funcionaliza con un grupo terminal de tiol y la superficie se funcionaliza con una maleimida. Después de la aplicación, el tiol del peptoide reacciona con la maleimida de la superficie para formar una unión covalente tioéter. Se prepararon superficies de oro activadas con maleimida como sigue: 1) se limpiaron portaobjetos de microscopio recubiertos de oro (1.200 Angstroms Au, 30-50 Angstroms Ti o Cr) con una solución limpiadora de ácido crómico durante 15 minutos y se lavaron con agua de grado HPLC. 2) se sumergieron las placas de oro en un tiol 1-5 mM modificado con una amina (1-mercaptoundecildietoxiamina, un alquilo C-11, dos óxidos de etileno, y una amina, alternativamente, grupos alquilo C-2 a C-20 y/o grupos etoxi o trietoxi podrían usarse en dicho compuesto) durante 1-24 horas a temperatura ambiente o a 45 o 60ºC. Se lavaron los portaobjetos cuatro veces en etanol absoluto y se secaron con un flujo de nitrógeno. 3) Los portaobjetos de oro modificados con grupos amino se sumergieron en una solución de 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) (50-100 \mum) para obtener una superficie que presentara los grupos funcionales de maleimida.

Los portaobjetos de aluminio se fabricaron o se obtuvieron de Amersham-Pharmacia, recubiertas con una capa de 1.000-1.400 Angstrom de óxido de silicio, y una capa de aminopropilsilano (APS). Las superficies de Al modificadas con grupos amino se funcionalizan con SMCC como se describió anteriormente.

En algunos casos, después de la aplicación de la librería peptoide, se grabaron los portaobjetos de aluminio en una solución de SDS al 0,1%/5X SSC a 60 grados C durante 2 horas. Los portaobjetos grabados muestran un espesor reducido de la capa de óxido (200-900 Angstrom) para permitir la amplificación de ambas señales la Cy 5 y la Cy 3.

Ejemplo 3 Derivatización de las superficies de Aluminio/SiO_{2} con avidina

Se sumergieron portaobjetos de aluminio recubiertos de aminosilano en una solución de NHS-LC-LC-biotina ("LC" se refiere a 6-aminohexanoil y "NHS" se refiere a N-hidroxisuccinimidil) (comercializado por Pierce), representado en la fig. 7A, que era 0,39 mM en tampón de PBS. Se recubrieron los portaobjetos durante 1,5 horas con agitación a 80 rpm. Después de la unión de la biotina, los portaobjetos se lavaron con agua, después se sumergieron en una solución de 1 \mug/ml-1 mg/ml de avidina, estreptavidina o neutravidina en tampón de PBS durante 2 horas, agitando a 70 rpm. Se lavaron los portaobjetos con agua y estuvieron ya listos para la aplicación de péptidos o peptoides biotinilados. La fig. 7B muestra una representación de un portaobjetos de aluminio derivatizado con avidina aplicado con un agente de unión a proteínas biotinilado según una realización de la presente invención.

Se siguieron las varias etapas de modificación de la superficie usando elipsometría para determinar los cambios de espesor. Un cambio de aumento de espesor de 40-45 Angstrom se registró de forma reproducible después de la adición de la avidina a las capas superficiales.

Ejemplo 4 Marcado de las proteínas

Se ajustaron las soluciones de proteínas a una concentración de 1 mg/ml en carbonato sódico 0,1 M, pH 9,3 y a un volumen de 0,1-1 ml, y se mezclaron con tinte reactivo de amina de cianina bifuncional o monofuncional (Cy 3 o Cy 5, Amersham Pharmacia). Se purificó la proteína del tinte no reaccionado por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando un soporte de Sephadex G-25 en una columna de 5 cm de largo y 1,7 cm de diámetro con una carga de 1 ml, fracciones de 0,5 ml, y un factor de dilución de 3,5.

La figura 8 proporciona un gráfico de los resultados ilustrando que la cromatografía de exclusión de tamaño de los componentes separa eficientemente la proteína marcada del tinte no reaccionado. El gráfico muestra los diferentes perfiles de elución de las moléculas de proteína (estándar BSA) y tinte.

Ejemplo 5 Experimentos de unión al chip

En algunos casos, los chips aplicados con la biblioteca de peptoides son bloqueados químicamente con cisteína, mercaptoetanol u otros tioles hidrófilos adecuados. Los chips se bloquearon con proteínas tales como BSA al 2%/PSB, leche seca desnatada al 10% o caseína al 1% durante al menos 1 hora, se lavaron con agua y se secaron. La solución sonda de proteína marcada se diluye adecuadamente (típicamente a 20-1.000 ng de proteína total) con la solución de bloqueo (para los portaobjetos de Al grabados se han observado límites de detección de unos pocos picogramos). Se aplica a la superficie del chip una alícuota de 30-100 \mul de la solución sonda, y se pone un cubreobjetos limpio encima, formando un sándwich de la solución sonda en la superficie del chip. La solución de proteína se incuba con el chip durante al menos 1 hora. El cubreobjetos se elimina en 1X PBS/Tween al 0,05% u otro tensioactivo que contenga un tampón adecuado. A continuación se lava el chip en 1X PBS/Tween al 0,05% u otro sistema tensioactivo/tampón adecuado. Los chips se lavan adicionalmente con agua, se secan con un flujo de argón o nitrógeno y se escanean.

Ejemplo 6 Chip de muestra

Se preparó un chip de micro matriz portador de una biblioteca de 1.000 agentes de unión a proteínas basados en peptoides según la presente invención. Se introdujo estreptavidina en células inducidas para expresar proteínas en el camino wnt y en lisados de células de control y la mezcla se marcó con Cy 3 (control) o Cy 5 (wnt). Se incubó entonces la mezcla con el chip (6,3 ng de proteína total/chip; 31 pg de estreptavidina/chip), que tenía un peptoide mostrando biotina en su esquina izquierda superior. Las figuras 9A y 9B muestran 1/6 del chip incubado. Como se muestra, además de las muestras de peptoide de biotina, muchas otras muestras de peptoides se están uniendo a la proteína del lisado. Comparando las señales relativas de los canales Cy 5 y Cy 3, pueden identificarse diferenciales. La figura 9C muestra ½ de un chip de control de estreptavidina (31 pg de estreptavidina/chip). Las manchas de peptoide de biotina son visibles en la esquina izquierda superior.

Ejemplo 7 Chip de demostración

Como se ilustra en la figura 10, se sintetizaron péptidos hexaméricos de afinidades diferentes y conocidas al anticuerpo "anti-glu" con un grupo de anclaje de biotina y un enlazador heptamérico de glicilo. Para probar el concepto de la presente invención, se aplicaron los péptidos biotinilados a portaobjetos tratados con avidina como se describió en este documento. Se bloquearon los portaobjetos con caseína y se examinaron con anticuerpos anti-glu marcados con Cy 5. Las gradaciones de intensidad de señal están correlacionadas con las diferencias conocidas (esto es, medidas directamente con ELISA) en afinidad entre los péptidos y su sonda de anticuerpo análogo.

Ejemplo 8 Comparación de sistemas de unión a la superficie

La figura 11 muestra la dependencia de la intensidad de la señal con la forma de unión de un agente de unión a proteínas a la superficie de un sustrato. En este ejemplo, se observan aumentos de la señal de 1000X para la inmovilización biotina/avidina cuando se la compara con el sistema tiol/maleimida (los resultados de la señal están mostrados sobre la descripción de la unión a la superficie y la estructura molecular).

Ejemplo 9 Preparación de la superficie de un portaobjetos recubierta de proteínas para mostrar anticuerpos

Para preparar superficies laterales modificadas con Proteína A o Proteína G, se sumergió un portaobjetos recubierto de avidina (preparado como se describió anteriormente) en una solución de Proteína A o Proteína G biotinilada (0,5-1 mg/ml en tampón de PBS, comercializado por Pierce, números de producto 29989zz y 29988zz) durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación se lavaron los portaobjetos con agua destilada desionizada y se secaron con nitrógeno o argón.

Conclusión

Aunque la presente invención se ha descrito en bastante detalle con el fin de clarificar la comprensión, será aparente que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de la invención. Debería también notarse que hay muchas formas alternativas de implementar tanto los procedimientos como los aparatos de la presente invención. Según esto, las presentes realizaciones deben considerarse como ilustrativas y no restrictivas, y la invención no debe limitarse a los detalles aquí expuestos.

Claims

1. Una matriz de agentes de unión a proteínas unidos de forma estable a la superficie de un soporte sólido, dicha matriz comprende:

un sustrato sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana, el aluminio está recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente;

un conjunto de agentes de unión a proteínas diferentes unidos a dicho sustrato, cada uno de dichos agentes de unión a proteínas comprende,

un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato,

un segmento de peptidomimético de unión a proteínas, y

un segmento de unión que conecta y separa los segmentos de anclaje y los segmentos de peptidomimético

2. La matriz de la reivindicación 1, en donde dicho sustrato es vidrio, plástico o metal.

3. La matriz de la reivindicación 1, en donde dicho segmento peptidomimético es un peptoide.

4. La matriz de la reivindicación 1, en donde dicho segmento de unión se selecciona del grupo que consiste en cadenas alifáticas C2-C100, óxido de polietileno, y peptidomiméticos ortogonales o oligómeros de péptidos.

5. La matriz de la reivindicación 1, en donde dicho segmento de anclaje es un tiol.

6. La matriz de la reivindicación 1, en donde dicho segmento de anclaje es la biotina.

7. La matriz de la reivindicación 1, en donde dicha superficie de sustrato metálico se recubre además con un tiol modificado con amina funcionalizado y un siloxano modificado con amina funcionalizado por debajo del segmento de anclaje.

8. La matriz de la reivindicación 7, en donde dicho aminotiol o aminosilano está funcionalizado con una maleimida.

9. La matriz de la reivindicación 8, en donde dicho segmento de anclaje es un tiol.

10. La matriz de la reivindicación 7, en donde dicho aminotiol o aminosilano está funcionalizado con una hidracida, aminooxi, N-hidroxisuccinimida, anhídrido, aldehído, disulfuro, tiol, azida y fosfina.

11. La matriz de la reivindicación 7, en donde dicha superficie de sustrato metálico se recubre además con una proteína de avidina por debajo de dicho segmento de anclaje.

12. La matriz de la reivindicación 11, en donde dicha proteína de avidina se selecciona del grupo que consiste en avidina, estreptavidina, neutravidina y análogos.

13. La matriz de la reivindicación 11, en donde dicho grupo de anclaje es la biotina.

14. La matriz de la reivindicación 11, en donde dicha proteína de avidina se une a la superficie del sustrato metálico con un resto NHS-LC-LC-biotina.

15. Una matriz de agentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie de un soporte sólido, dicha matriz comprende:

un soporte sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana, el aluminio está recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal fluorescente, y en donde la superficie está además recubierta con un aminotiol o aminosilano funcionalizados con maleimida;

un segmento de anclaje al sustrato de tiol unido de forma estable a la superficie del sustrato que presenta la maleimida,

un segmento de peptoide de unión a proteínas, y

un segmento alifático de unión que conecta y separa los segmentos de anclaje y los segmentos de peptidomiméticos

16. La matriz de la reivindicación 15, en donde dicho aminotiol o aminosilano funcionalizado con maleimida comprende un espaciador.

17. Una matriz de agentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie de un soporte sólido, dicha matriz comprende:

un soporte sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana, el aluminio está recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal de fluorescencia, y en donde la superficie está además recubierta con un aminosilano o aminotiol funcionalizados con avidina;

un conjunto de agentes de unión a proteínas diferentes unidos a dicho sustrato, cada uno de dicho agente de unión a proteínas comprende,

un segmento de anclaje al sustrato de biotina unido de forma estable a la superficie del sustrato que presenta la avidina,

un segmento de peptoide de unión a proteínas, y

un segmento de péptido ortogonal de unión que conecta y separa los segmentos de anclaje y de peptidomiméticos

18. La matriz de la reivindicación 15, en donde dicho aminosilano o aminotiol funcionalizados con avidina comprende un resto NHS-LC-LC-biotina.

19. Un método para fabricar una matriz que comprende un conjunto de agentes diferentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie de un soporte sólido, dicho método comprende:

preparar para la unión un sustrato sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana, el aluminio está recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal de fluorescencia;

poner en contacto un conjunto de agentes de unión a proteínas diferentes con dicho sustrato en condiciones suficientes para que dichos agentes de unión a proteínas se unan a dicha superficie del sustrato, cada uno de dichos agentes de unión a proteínas comprende,

un segmento de anclaje al sustrato,

un segmento de peptidomimético de unión a proteínas, y

según lo cual se produce dicha matriz.

20. El método de la reivindicación 19, en donde dicho poner en contacto comprende depositar una gotita de una solución de cada uno de dichos agentes de unión a proteínas en un lugar diferente de dicha superficie del sustrato en condiciones tales que la unión de los agentes de unión a proteínas a la superficie del sustrato está completada antes de que la gotita se evapore.

21. El método de la reivindicación 20, en donde dicha superficie del sustrato comprende un recubrimiento de oro y la preparación para la unión comprende limpiar dicho recubrimiento de oro.

22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho segmento de anclaje es un tiol.

23. El método de la reivindicación 20, en donde dicha superficie del sustrato comprende un recubrimiento de metal seleccionado de oro y aluminio, y la preparación para la unión comprende limpiar y recubrir dicho recubrimiento de metal con un aminotiol o aminosilano funcionalizados.

24. El método de la reivindicación 23, en donde dicho aminotiol o aminosilano es el aminopropilsilano.

25. El método de la reivindicación 24, en donde dicho aminopropilsilano está funcionalizado con una maleimida.

26. El método de la reivindicación 25, en donde dicho segmento de anclaje del sustrato es un tiol.

27. El método de la reivindicación 23, en donde dicho segmento de anclaje es la biotina.

28. El método de la reivindicación 23, en donde dicho aminotiol o aminosilano está funcionalizado con una hidracida, aminooxi, N-hidroxisuccinimida, anhídrido, aldehído, disulfuro, tiol, azida y fosfina.

29. El método de la reivindicación 23, en donde dicha superficie de sustrato metálico se recubre además con una proteína de avidina por debajo de dicho segmento de anclaje.

30. El método de la reivindicación 29, en donde dicha proteína de avidina se selecciona del grupo que consiste en avidina, estreptavidina, neutravidina y análogos.

31. El método de la reivindicación 29, en donde dicho grupo de anclaje es la biotina.

32. El método de la reivindicación 29, en donde dicha proteína de avidina se une a la superficie del sustrato metálico con un resto NHS-LC-LC-biotina.

33. El método de la reivindicación 19, en donde dicho segmento de peptidomimético es un peptoide.

34. El método de la reivindicación 19, en donde dicho segmento de unión se selecciona del grupo que consiste en cadenas alifáticas C2-C100, óxido de polietileno, y peptidomiméticos ortogonales u oligómeros de péptidos.

35. Un método para fabricar una matriz que comprende un conjunto de agentes diferentes de unión a proteínas asociados de forma estable con la superficie de un soporte sólido, dicho método comprende:

generar una biblioteca de agentes de unión a proteínas, que comprenden,

un segmento de anclaje al sustrato,

un segmento de peptidomimético, y

un segmento de unión que conecta y separa los segmentos de anclaje y los segmentos de peptidomimético;

distribuir los agentes de unión a proteínas de dicha biblioteca en receptáculos individuales de almacenaje para cada agente de unión a proteínas diferente;

preparar un conjunto de dichos agentes diferentes de unión a proteínas para unión a un sustrato sólido;

preparar un sustrato sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana para la unión con un conjunto de dichos agentes diferentes de unión a proteínas, el aluminio está recubierto con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal de fluorescencia;

según lo cual se produce dicha matriz.

36. El método de la reivindicación 35, en donde dicha superficie del sustrato comprende un recubrimiento de metal seleccionado del oro y aluminio, y la preparación para la unión comprende limpiar y recubrir dicho recubrimiento de metal con un aminotiol o aminosilano funcionalizados.

37. El método de la reivindicación 36, en donde dicho aminotiol o aminosilano está funcionalizado con una maleimida.

38. El método de la reivindicación 37, en donde dicho segmento de anclaje del sustrato es un tiol.

39. El método de la reivindicación 36, en donde dicha superficie de sustrato metálico se recubre además con una proteína de avidina por debajo de dicho segmento de anclaje.

40. El método de la reivindicación 39, en donde dicho grupo de anclaje es la biotina.

41. Un método para realizar un ensayo de unión diferencial, que comprende:

marcar con fluorescencia las proteínas en una solución de una muestra biológica que contiene proteínas;

poner en contacto una alícuota de dicha solución de muestra biológica que contiene proteínas con una matriz marcada según la reivindicación 1;

analizar la matriz para determinar la unión diferencial de las proteínas en la muestra a los agentes de unión a proteínas en la matriz.

42. El método de la reivindicación 41, en donde dicho segmento de peptidomimético es un peptoide.

43. El método de la reivindicación 42, en donde cada uno de dichos agentes diferentes de unión a proteínas corresponde a un receptáculo diferente que contiene ese agente.

44. El método de la reivindicación 43, que comprende además seleccionar un agente de unión a proteínas de interés basado en los resultados del ensayo de unión diferencial.

45. El método de la reivindicación 44, que comprende además secuenciar el segmento de peptidomimético del agente de unión a proteínas seleccionado.

46. El método de la reivindicación 44, que comprende además someter al segmento de peptidomimético del agente de unión a proteínas seleccionado a análisis estructural por espectroscopia de masas.

47. El método de la reivindicación 44, que comprende además enriquecer la solución de muestra biológica que contiene proteínas con una proteína que se una preferentemente al agente de unión a proteínas seleccionado aplicando una segunda alícuota de la solución de muestra biológica que contiene proteínas a una columna de separación, dicha columna de separación comprende un soporte cromatográfico que muestra el agente de unión a proteínas seleccionado.

48. El método de la reivindicación 47, que comprende además secuenciar dicha proteína enriquecida.

49. El método de la reivindicación 47, que comprende además someter a la proteína enriquecida a análisis estructural por espectroscopia de masas.

50. El método de la reivindicación 41, que comprende además poner en contacto una alícuota de dicha solución de muestra biológica que contiene ADNc marcado o ARN mensajero marcado con una matriz de ADN, analizar la matriz de ADN para determinar la unión diferencial de los ácidos nucleicos en la muestra a los elementos de la matriz de ADN, y comparar los resultados de unión diferencial de las dos matrices para identificar correlaciones con la actividad genética y la expresión de proteínas.

51. El método de la reivindicación 41, en donde las marcas fluorescentes son tintes reactivos de amina.

52. El método de la reivindicación 51, en donde la marca fluorescente es una o más de Cianina 3 y Cianina 5.

53. Un kit para uso en la realización de un ensayo de unión diferencial según la reivindicación 41, dicho kit incluye una matriz según la reivindicación 1.

54. El kit de la reivindicación 53, que comprende además uno o más reactivos para realizar un ensayo de unión diferencial que comprende un conjunto de marcas fluorescentes para proteínas.

55. El kit de la reivindicación 54, en donde las marcas fluorescentes son tintes reactivos de amina.

56. El kit de la reivindicación 55, en donde los tintes reactivos de amina son la Cianina 3 y la Cianina 5

57. Una matriz mixta de agentes de unión a proteínas unidos de forma estable con la superficie de un soporte sólido, dicha matriz comprende:

un sustrato sólido que tiene una superficie de aluminio sustancialmente plana, recubierta con un recubrimiento de dióxido de silicio, en donde el recubrimiento de dióxido de silicio tiene un espesor de alrededor de 20 nm a alrededor de 90 nm y es capaz de aumentar la amplificación de una señal de fluorescencia;

un conjunto de agentes diferentes de unión a proteínas unidos a dicho sustrato, cada uno de dicho agente de unión a proteínas comprende,

un segmento de anclaje unido de forma estable a la superficie del sustrato, un segmento de peptidomimético de unión a proteínas, y

un segmento de unión que conecta y separa los segmentos de anclaje y los segmentos de peptidomiméticos; y

un conjunto de distintos anticuerpos unidos a dicho sustrato.

58. Un sistema para realizar un ensayo de unión diferencial, dicho sistema comprende:

una matriz según la reivindicación 1;

una o más proteínas marcadas con fluorescencia unidas a uno o más de los agentes de unión a proteínas; y

un escáner de fluorescencia de matriz.

59. El sistema de la reivindicación 58, en donde la marca fluorescente es una o más de la Cianina 3 y la Cianina 5.