JP2002543429A - 金属表面上に生物分子アレイを合成する工程 - Google Patents

金属表面上に生物分子アレイを合成する工程

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JP2002543429A JP2000615815A JP2000615815A JP2002543429A JP 2002543429 A JP2002543429 A JP 2002543429A JP 2000615815 A JP2000615815 A JP 2000615815A JP 2000615815 A JP2000615815 A JP 2000615815A JP 2002543429 A JP2002543429 A JP 2002543429A
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ジー フルートス，アンソニー
エム ブロックマン，ジェニファー
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ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファウンデイション
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Abstract

(57)【要約】 開示は、大きな分子、細胞性／分子性及び細胞／細胞間相互作用のＳＰＲ画像化研究の使用に適切な多重構成の生物分子若しくは細胞性アレイを構築する工程である。手順の成功のカギは、金属基板上で自己アセンブルされた可逆的にω−機能性を有するアルカンチオールを修飾するための可逆的保護基の使用にかかっている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明分野 本発明は、核酸とタンパク質の相互作用若しくは抗原を伴う細胞間相互作用の
ような巨大分子間、細胞と巨大分子間、及び細胞間の相互作用の研究に使用する
金属表面の分子生物的若しくは細胞的アレイの組み立てを導く。
【０００２】 従来技術の詳細 ＤＮＡへのタンパク質の結合は、遺伝子発現の抑制と制御、複製及び組換えに
おいて、極めて重要な役割を担う。付け加えると、特定のオリゴヌクレオチド配
列を認識して修飾する酵素は、生物学的な核酸操作及び修復システムの重要な要
素である。どのようにしてそれらのタンパク質が特定のオリゴヌクレオチド配列
を認識するかについての増大した理解は、例えば、治療上のタンパク質発現の抑
制に使用されるなどの生物学的医学システムのデザインの助けとなるであろう。
このような理由のため、タンパク質核酸相互作用（例えば、タンパク質−ＤＮＡ
及びタンパク質−ＲＮＡの相互作用）の研究は、分子生物学の急速に成長してい
る分野であり、今日発展しているＮＭＲ及びＸ線の構造の決定方法により部分的
に助けられている。時を同じくして、大きなスケールの核酸シークエンシングの
努力から得られる利用可能なゲノム及びゲノム以外（例えば、リボソーマル）の
配列情報の量における爆発的な増大は、多量にある新しい配列データのタンパク
質結合部位のための調査を必要とする。本発明は、配列のスクリーニング若しく
は化学的に修飾された金属表面に固定された核酸分子の大きなアレイへのタンパ
ク質の構造的に特異的な結合をスクリーニングする迅速で効率的な方法として表
面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現像技術によるこの必要を表明する。
【０００３】 平坦な表面へのＤＮＡ分子のアレイの付着は、ハイブリダイゼーションにおけ
るＤＮＡ配列に対する吸着実験に（Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ５０２２−５
０２６）、遺伝的突然変異のスクリーニングに（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ
． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１： １１９４−１１９７）、及びＤ
ＮＡのコンピュターの適用（Ｆｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ４７４８−４７５７； 及び Ｆ
ｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ
． １２０： １０２７７−１０２８２）において今日採用されている。それら
のアレイは、蛍光的に標識された相補的なＤＮＡ配列を含む溶液にさらされ、洗
浄され、次いで蛍光画像化方法を用いて解析される。
【０００４】 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の技術は、表面に対して感受性であり、可逆的
な、タンパク質−核酸の相互作用のモニタリングにより適した光学的検出方法で
ある。例えば、商業的に成功した“ＢＩＡｃｏｒｅ”ＳＰＲ装置（Ｂｉａｃｏｒ
ｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）が、様々な酵素を伴う核酸分子の相互
作用の研究にかつて使用されていた。威力的であるが、“ＢＩＡｃｏｒｅ”ＳＰ
Ｒ装置は、画像化能力を有していない。多くのＤＮＡ配列を限定するこの厳しさ
は、一度の実験においてスクリーニングされ得る。
【０００５】 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、厚さ及び遊離電子金属（例えば、金、銀、
銅、カドミウム、アルミウム）と空気や水のような体積媒体間の界面での物質の
屈折率に対して感受性のある表面の光学技術である。表面プラズモン共鳴は、直
線的に極性で入射面に平行なレーザー光線が、薄い金属フィルムが塗布されたプ
リズム上に衝突する場合に発生する消失波の使用によって達成されるかもしれな
い。金属はまた、ガラスのような薄い透明な基板上に塗布されるであろうし、こ
のガラスは、プリズムを伴う光学的接触にもたらされる。ＳＰＲは、ちょうどプ
リズムの臨界角を過ぎた内部に反映された光の合計の縮小のように最も簡単に観
察される。最小の反射率のこの角度は（ＳＰＲ角度として与えられた）、物質が
金属層に吸着されるように高い角度に移動する。角度における移動は、吸着の厚
さの測定に変換され得るか若しくは複合的フレスネル計算（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆ
ｒｅｓｎｅｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ）による物質の追加が可能で、金属層
上において物質の存在を検出するために使用され得る。 生物学的、生化学的、若しくは化学的物質を試験するＳＰＲの使用において、レ
ーザー供給源からの光の光線は、プリズムを通過して、１つの外部表面が貴金属
の薄いフィルムで覆われ、次いで分析物と強く互いに影響する生物学的、生化学
的、若しくは化学的物質のような有機フィルムで覆われている透明な基板で、通
常ガラスで構成されるバイオセンサーに導かれる。有機フィルムは、増大された
厚さがＳＰＲ角度を移動することを引き起こすサンプル中で分析物と結合できる
抗体や抗原のような物質を含むことができる。ＳＰＲ角度の位置若しくはＳＰＲ
角度近隣の固定された角度における反射率をモニターすることによって、サンプ
ル中での分析物の存在が検出できる。生物学的若しくは生化学的若しくは化学物
質のバイオセンサーを伴いＳＰＲを使用するための様々な種類の装置が、“Ｓｅ
ｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，” Ｖｏｌ． ４， １９８３，
ｐａｇｅ ２９９にて見られるＬｉｅｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌの記事によって記
載されている。また、欧州特許出願番号０ ３０５ １０８及び米国特許番号５
，３７４，５６３も参照。
【０００６】 試験道具としての従来のＳＰＲの使用は、いつくかの利点と欠点を提供する。
例えば、比較的早く、標識の必要性がなく、部位の上で実行できる。しかしなが
ら、上述のように、“ＢＩＡｃｏｒｅ”のような商業的に入手可能な装置は、画
像化能力を提供しない。さらに、大量処理の使用者による高処理要求を達成する
ためには、簡単で、幅広い種類の化合物を同時に試験できるために、容易く修飾
若しくは適合できる実践的なバイオセンサーである必要性がある。
【０００７】 ＳＰＲの画像化において、光源は、ＳＰＲ角度に近い入射角でプリズム／薄い
金のフィルムとサンプルアセンブリを照らすために使用され、反射した光は、Ｓ
ＰＲ画像を合成する固定された角度のＣＣＤカメラで検出される。ＳＰＲ画像は
、サンプルの異なる部分からの様々な反射光の強度から上がってきて、そのよう
な多様性は、有機フィルムの厚さ若しくは修飾された金の表面で起こる吸着にお
ける屈折率の任意の変化によって合成される。ＳＰＲ画像が表面に隣接する（２
００ｎｍ以内）分子にのみ感受性があるため、溶液中に残存する未結合分子は、
ｉｎ ｓｉｔｕでの測定を妨げない。
【０００８】 金属をコーティングした表面につながれたオリゴヌクレオチドの強健で複製可
能なアレイの構成は、タンパク質−核酸結合の相互作用のＳＰＲ画像化用の必須
条件である。ＳＰＲ画像化技術を使用するために、貴金属表面上に核酸のアレイ
を構成することが必要であり、この理由のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような商業的に入手可能な
供給源からのガラススポッター上のＤＮＡアレイは、実現可能なオプションでは
ない。開始点として、置換されたアルカンチオールの自己アセンブルされた単一
層を用いると、他はすでに開発された一本鎖ＤＮＡ分子を化学的に修飾された金
の表面に付着するスキームである。例えば、米国特許番号５，６２９，２３１を
参照。しかしながら、主題の発明において、ＵＶフォトパターン化（ＵＶ ｐｈ
ｏｔｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）及び微接触印刷技術（ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ
ｐｒｉｎｔｉｎｇ）は、アルカンチオールが、金属表面上の部位に導かれる方
法で組み立てられることを可能にするように導かれ、そこにおいて、複数化合物
のアレイの合成を可能にする。斬新な表面の化学反応を伴うこれらの処理技術の
組み合わせは、ここに記載したように核酸アレイの製造を可能にする。
【０００９】 本発明の概要 開示は、金属基板上に、生物分子及び／若しくは細胞アレイを合成する複数段
階の化学的修飾方法であり、アレイは、表面プラズモン共鳴画像化を用いる生物
分子及び細胞相互作用の研究のために特異的に仕立て上げられる。この手法によ
るアレイの作製は、３つの特異的な要求を求め、いわゆる、（ｉ）生物分子が表
面に共有結合で付着して、ハイブリダイゼーション及びタンパク質の結合に対す
る活性とアクセスの可能性を残して；（ｉｉ）特定のアレイの位置において生物
分子若しくは細胞の水性溶液の“ピン止め”が可能になるように、アレイのバッ
クグラウンドが、初期段階において十分に疎水性であり；（ｉｉｉ）最終的なア
レイのバックグラウンドが、表面へのタンパク質分子の非特異的結合が阻害され
るように行動する。この作製スキームのカギとなる化合物は、付着してω修飾さ
れたアルカンチオールの単一層の表面の疎水性及び表面の蛋白質を抵抗するよう
にするポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基の付属を制御する可逆的な疎水
性の保護基の活用であり、好ましくはＦｍｏｃである。偏光―変調フーリエ変換
赤外線（ＰＭ−ＦＴＩＲ）分光学、接触角度、及びＳＰＲ測定が、表面の修飾方
法におけるそれぞれの段階を特徴づけるために使用され、及びにアレイのバック
グラウンドがタンパク質の非特異的結合を阻害することを確認するために使用さ
れる。最終試験として、２つの化合物に対する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ｓ
ＳＢ）の吸着を測定するＳＰＲ画像化実験、オリゴヌクレオチドアレイが、タン
パク質−核酸相互作用のモニタリングのためのこれらの表面の効用を実証する。
【００１０】 スポットのアレイを合成するためにここで開示している複数段階の方法が使用
される。複数段階の方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ ＳＰＲ画像化測定中において、疎
水性のバックグラウンドが最初に囲まれ、水性の生物分子若しくは細胞溶液を個
々のアレイ要素上へのピン止めを可能にし、次いで、疎水性バックグラウンドを
タンパク質の非特異的吸着に抵抗するものと交換し、上記疎水性バックグラウン
ドにおいて、タンパク質の非特異的吸着を抵抗する生物分子若しくは細胞の“海
”の中の“島”を産する。
【００１１】 好ましい実施態様において、アミン末端のアルカンチオール単一層が基層とし
て採用され、連続している疎水性でタンパク質の吸着に抵抗ある表面を合成する
ためにＦｍｏｃ及びＰＥＧの修飾物がそれぞれ使用される。好ましい実施態様に
おいて、化学的修飾段階は：（ｉ）蒸発させた金の薄いフィルム上の１１−メル
カプトウンデシルアミン（ＭＵＡＭ）単一層の吸着と自己アセンブル；（ｉｉ）
疎水性表面を合成するためにＦｍｏｃ保護基を伴うＭＵＡＭ単一層の反応；（ｉ
ｉｉ）水性溶液の滴をピンで止めることができる疎水性ＭＵＡＭ−Ｆｍｏｃバッ
クグラウンドに取り囲まれたＭＵＡＭ正方形（およそ７５０μｍｘ７５０μｍで
あり、これより小さいかより大きな正方形は到達可能である）のアレイを合成す
るためのＭＵＡＭの再吸着（ｉｖ）に続くアルカンチオールのフォトパターン化
した除去；（ｖ）少量（０．１μＬ）のチオール化ＤＮＡのカップリング反応に
続く、ヘテロな２官能クロスリンカー（好ましくはＳＳＭＣＣ）を伴うアミン末
端表面の反応によるＭＵＡＭ正方形上へのオリゴヌクレオチド配列の付着；（ｖ
ｉ）タンパク質吸着抵抗バックグラウンドを合成するためのＰＥＧ−ＮＨＳを伴
うＭＵＡＭのペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）反応（ｖｉｉ）によって
続くＦｍｏｃ保護基の除去。
【００１２】 偏光−変調ＦＴＩＲ分光、接触角度及び角度ＳＰＲ測定の走査の組み合わせが
表面の修飾工程を特徴づけるために使用される。オリゴヌクレオチドアレイ上へ
の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の吸着のＳＰＲ画像化測定は、タンパ
ク質及び他の分析物を備えた核酸相互作用を調査するこれら表面の効用を実証す
るために使用されるこの工程によって合成される。
【００１３】 主題の発明の主要な利点は、固定された生物分子若しくは細胞のアレイが、ア
レイにおける他の島とは異なる限られた分子若しくは細胞の各々の“島”におい
て構成されることを可能にする。これは、選択された分析物への非常に多くの異
なる分子の大規模で同時の分析又は細胞個々のアフィニティー及び／若しくは結
合特質を考慮に入れる。ここに記載された組み立て方法は、自動化に非常に適し
ており、ＳＰＲ実験は標準形態マイクロタイタ−プレート及び研究室の自動化装
置（例えば、９６穴、３８４穴、及びさらに大きな形態）を用いて分析され得る
。
【００１４】 ここに記載のアレイは、多くの分析にとって有用であり、そこでは、生物分子
若しくは細胞とタンパク質、抗原、若しくは他の分子が相互作用を行い、例えば
、結合能力の決定、エピトープマッピング、制限部位マッピング、核酸における
短期の２次構造の結合効果測定等である。例えば、長さ若しくは１次配列による
ような、異なる機能で核酸の島のアレイを構築することによって、任意に得られ
た分析物に対する任意に得られた核酸配列の相互作用は、素早く、しかも完全に
調査される。同様にして、核酸における短期の２次構造の効果は、アレイを構築
することによって調査され、そのアレイは、核酸の島が、より安定した２次構造
を累進的に有する核酸配列を含む島の配列とは異なり、次いで、与えられた分析
物への露出後にアレイを走査する。
【００１５】 本発明の詳細な説明 略語及び市販供給先 下記の略語及び用語は、明細書及び請求項を通して使用される。その他すべて
の用語は、それらが含む標準的で、適切な技術において受容可能な意味を有する
。
【００１６】 “生物分子”＝生物学的物質において発見された任意の分子を明らかに含むが
、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、リン脂質などのような細胞壁化合
物、並びに標識生物分子や組換え生物分子などのそれらの修飾物及び合成形態に
限らない。
【００１７】 “ＢＳＡ”＝ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【００１８】 “ＤＭＦ”＝ジメチルホルムアミド “Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ”＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ）。
【００１９】 “金属基板”若しくは“金属フィルム”＝貴金属の薄いフィルム（金、銀、銅
、プラチナ等）。金が好ましい。
【００２０】 “ＭＵＡＭ”＝１１−メルカプトウンデシルアミン（ハーバード大学、ボスト
ン、マサチューセッツ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授の研究
室からの寛大な提供物）。
【００２１】 “ＮＨＳＳ”＝Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル。
【００２２】 “核酸”＝デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及び任意の供
給源からのペプチド核酸、並びにそれらの修飾形態を限定なく含み、標識された
（放射線、蛍光、その他）核酸、及びチオール基やビオチンタグのような結合す
る部分を含むように修飾された核酸。
【００２３】 “ＰＥＧ”＝ポリ（エチレングリコール）。
【００２４】 “ＰＥＧ−ＮＨＳ”＝メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸、Ｍ
Ｗ２００のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）
。
【００２５】 “ポリ（エチレングリコール）−修飾アルカンチオール”＝ＨＳ（ＣＨ２）１ １ （ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ博士の研究室より）。
【００２６】 “ＳＳＢ”＝一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００２７】 “ＳＳＭＣＣ”＝スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボン酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。
【００２８】 “ＴＡＥＡ”＝トリス（２−アミノエチル）アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。
【００２９】 “ＴＥＡ”＝トリエタノールアミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）。
【００３０】 “ω―修飾されたアルカンチオール”＝末端の炭素原子が、アミノ、水酸基、
カルボキシ、若しくはチオール部分のような化学的反応性部分の付加によって修
飾されたアルカンチオール。
【００３１】 上記の化学薬品、また受け取られるようにすべて使用された。溶媒は、研究用
の標準規格で、ミリポア（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ）によって濾過された水が、すべての水溶液及び洗浄に使用された。
【００３２】 核酸アレイを合成する金属基板の化学的修飾が７つの一般的な段階で進行する
。それらの段階は、図１に概略的に及び下記に例証され： （１）．金属基板上にω―修飾されたアルカンチオール単一層の自己アセンブ
リ。アルカンチオールへのω―修飾は、アルカンチオールのω―末端をさらなる
共有結合を可能にさせる任意の部分の付加であろう。そのような修飾は、限定し
ないが、アミングループの付加、水酸基、カルボニル基、若しくはアルカンチオ
ール鎖のω炭素へのチオール基を含んでいる。アルカンチオール単一層は、好ま
しくはアミノ−Ｃ８−Ｃ２４−アルカンチオールで、直鎖のアルカンが枝アルカ
ンに好ましく、最も好ましいω−修飾されたアルカンチオールは、ＭＵＡＭであ
る。
【００３３】 （２）．疎水性保護基を伴うω−修飾されたアルカンチオール表面の反応、最
も好ましいのはＦｍｏｃ。
【００３４】 （３）．露出した金属エリアのアレイを合成する表面のフォトパターン化。
【００３５】 （４）．露出した金属アレイ要素において充填するための追加のω−修飾され
たアルカンチオールを用いた再アセンブリ、そこでω−修飾されたアルカンチオ
ールの島が産する。
【００３６】 （５）．ω−修飾されたアルカンチオールの島に共有結合的に付加している生
物分子若しくは細胞。
【００３７】 （６）．アレイバックグラウンドから保護基の除去。
【００３８】 （７）．バックグラウンドを非特異的タンパク質結合に対して抵抗性にするた
めに、好ましくはＰＥＧである物質を伴うバックグラウンドの反応。
【００３９】 （上記の７段階の頭に付された括弧数字は、図１で使用の参照数字である） 最終産物の品質を確かめるために、上記の各々の段階は、ＰＭ−ＦＴＩＲＲＡ
Ｓ、接触角度測定、及びＳＰＲ角度操作を用いてモニターされるであろう。
【００４０】 上記の段階は、図１が言及している特定の参照を用いて、非常に詳細に記述さ
れる。
【００４１】 段階（１）。段階（１）において、好ましくはアミン末端化アルカンチオール
、最も好ましくはＭＵＡＭであるω−修飾されたアルカンチオールの単一層は、
薄い貴金属フィルムで覆われたシラン化基板（ガラス若しくは最終的な分析にお
いて使用される放射線の波長に対して透明な他の基板）上のエタノール溶液から
自己アセンブリされる。好ましい実施態様においては、厚さが約４５０Åの金の
フィルムが使用される。フィルムが一様に適用され、ＳＰＲ画像化分析の中で機
能するであろう限りでは、金属フィルムの厚さは過度に重要ではない。金上のω
−修飾されたアルカンチオールの自己アセンブリした単一層は、すでに詳しく記
述され、例えば、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ． １１７：３８３０−３８３４を参照、一般的に、非常に整って
形成する大部分である単一分子フィルムによって受け入れられる。しかしながら
、残されたものが延長して露出されると、アミノ修飾されたアルカンチオールの
末端のアミングループは、二酸化炭素と反応して表面にカルバメート塩を形成す
るであろう。結果として、アミノ末端化アルカンチオールが塗布された基板は注
意深く取り扱いされるべきで、二酸化炭素への露出は最低限にする。
【００４２】 中間赤外線領域におけるＭＵＡＭのＰＭ−ＦＴＩＲＲＡＳスペクトルは、図３
の（Ａ）にて示されている。１５４５ｃｍ−１における小さいピークは、ＮＨ３ ＋ の変形に当たる。このピークの表れは、エタノール及びミリポア水（ｐＨ〜６
）による洗浄後、末端アミングループの重要な部分が、プロトン化状態において
存在することを示している。１５４５ｃｍ−１ピークの強度における変動は、ｐ
Ｈが異なる溶液における表面の洗浄によって影響され得る。同じプロットにおけ
る１４６５及び１２５８ｃｍ−１のバンドは、ＣＨ２の切除及びアルカン鎖のね
じれ変形をそれぞれに当たる。２９２３ｃｍ−１におけるＣＨ２の非対称の伸縮
化モード（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｍｏｄｅ）及び２８５３ｃｍ−１におけるＣ
Ｈ２の非対称の伸縮化モード（スペクトルは示されていない）によるピークの波
長は、単一層が比較的規律正しい状態で存在することを示している。ＣＨ伸縮化
領域におけるスペクトルからの不在は、アミングループのＮ−Ｈ伸縮（〜３２０
０−３５００ｃｍ−１）によるバンドであり、このバンドはあまりにも弱くて検
出できないことが推測されている。末端アミングループにより、ＭＵＡＭ単一層
表面は完全に疎水性で、３６．２°±２．５°の接触角度の測定及びによって証
明され、単一層形成によって一貫している。Ｅｘ ｓｉｔｕにおけるＳＰＲの走
査は、ＭＵＡＭを伴い修飾された金の表面における１７．５ű０．４Åの厚さ
を測定するために使用され、この厚さは、表面にほぼ通常に適応させて完全に拡
張されると思われるＭＵＡＭ単一層を伴い一貫している。
【００４３】 段階（２）。アレイの組み立ての段階（２）において、ＭＵＡＭが塗布された
表面は、可逆的保護基と反応して疎水性表面を合成する。ＭＵＡＭの場合、アミ
ン修飾されたアルカンチオールである保護基は、適切にはアミノ保護基であり、
好ましくはＦｍｏｃである。Ｆｍｏｃは、かさばっており、疎水性で、不安定な
塩基で、固定層でのペプチド合成において日常的に使用されるアミン保護基であ
る。使用される保護基の選択は、アルカンチオールにさせるω−修飾の性質上の
大規模な手段に依存している。もし、ω−修飾がカルボキシル基の付加であるな
らば、疎水性カルボキシ保護基が利用されるであろう。同様にして、もし、ω−
修飾がヒドロキシル若しくはチオール基の付加であるならば、疎水性のヒドロキ
シ若しくはチオール保護基がそれぞれ使用されるであろう。アルカンチオール上
で使用されるω−修飾を保護するのに適切な任意の種類の疎水性の保護が本発明
において活用されるであろう。反応的な部分の任意で多数のそのような保護基で
あるアミン、水酸基、及びカルボキシ官能基が当業者によって知られている。例
えば、Ｆｍｏｃ及びトリチルの両者の塩化物誘導体が、可逆的に修飾するヒドロ
キシル末端化アルカンチオールとして使用できる。
【００４４】 Ｆｍｏｃのための特異的な化学反応が図２に示され、（２）を参照する。Ｆｍ
ｏｃのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ）は、ＭＵＡ
Ｍの末端アミン部分と反応して安定したカルバメート（ウレタン）結合を形成し
、表面に共有結合的にＦｍｏｃ基が付加している。ＭＵＡＭが被膜された金の基
板に結合しているＦｍｏｃの赤外線スペクトルは、図３のプロット（Ｂ）で示さ
れる。このスペクトルは、表面における反応が予測通りに進行することを証明し
ていることを提供する。１７２０、１５４４、及び１２６７ｃｍ−１における顕
著なピークは、ＭＵＡＭ表面にＦｍｏｃ基をつなぐカルバメート（ウレタン）結
合による。（１７２０ｃｍ−１におけるバンドは、カルボニル伸縮振動（アミド
Ｉ）に当たり、１５４４ｃｍ−１はＣＨＮ基振動に当たり、１２６７ｃｍ−１は
対になっているＣ−ＮとＣ−Ｏ伸縮に当たる（アミドＩＶ）。）１４５０ｃｍ− １ におけるピークは、フルオレニル基のＣ＝Ｃ環伸縮に帰着し、１１４７ｃｍ− １ におけるバンドの中心はＦｍｏｃ Ｃ−Ｏ−Ｃ（エーテル）伸縮に貢献する。
Ｆｍｏｃ−ＮＨＳとの反応後、アレイの表面の特質が際立って変化し、７４．４
°±２．５°の接触角度の測定によって確認されるように、表面が完全に疎水性
である。さらに、２２．８ű０．５Åへのフィルムの厚さの増大は、角度ＳＰ
Ｒの走査で測定される。
【００４５】 段階（３）。段階（３）において、金属基板へのω−修飾されたアルカンチオ
ールのしっかりと固定している結合は、露出された金属の配列された表面を産す
るために選択的に切り離される。紫外線のフォトパターンニングが配列された表
面を合成するのに好ましいが、配列された表面を合成するための手段は、信頼で
きて所望の配列を産する方法に限って言えば、重要ではない。例えば、微接触印
刷技術はまた、配列された表面を生じるために使用され得る。紫外線パターンニ
ング（ＵＶ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）を用いて、表面がクオーツマスク（ｑｕａ
ｒｔｚ ｍａｓｋ）を通して紫外線照射に露出され、光を酸化する金−硫黄結合
（ｐｈｏｔｏ−ｏｘｉｄｉｚｅｓ ｔｈｅ ｇｏｌｄ−ｓｕｌｆｕｒ）がアルカ
ンチオール単一層を表面にしっかり固定する。表面が次いで洗浄され、光が酸化
した（ｐｈｏｔｏ−ｏｘｉｄｉｚｅｄ）アルカンチオールが除去され、露出して
いる金属パッドの取り残されたアレイが疎水性のＭＵＡＭ＋Ｆｍｏｃバックグラ
ウンドによって囲まれている。フォトパターンニングを用いて、５０ｍｍほど小
さな寸法を備えた特徴が達成され、微接触印刷方法を用いると、１００ｍｍほど
小さな寸法を備えた特徴のアレイが達成可能である。
【００４６】 段階（４）。段階（４）において、表面が再びω−修飾されたアルカンチオー
ル溶液（好ましい実施態様においては、ＭＵＡＭのエタノール溶液）に露出され
、上記表面において、アルカンチオールが、疎水性のＦｍｏｃバックグラウンド
によって囲まれた親水性のＭＵＡＭパッドからなる表面を合成する露出している
金の領域に集まる。反応性のあるＭＵＡＭ領域とバックグラウンドの疎水性の違
いは、水性の生物分子若しくは細胞溶液の少量を個々のアレイ部位へのピン止め
にとって重要である。
【００４７】 段階（５）。段階（５）の工程において、生物分子若しくは細胞（好ましくは
、核酸）が、次いで共有結合的に表面に付加している。例証しているように、Ｍ
ＵＡＭの反応性パッドは、初期の段階で２官能リンカーの溶液に浸される。本発
明に使用するためには、リンカーの一方がω−修飾されたアルカンチオール表面
に、もう一方が所望のアレイを形成するために固定されている生物分子若しくは
細胞に結合することができるべきである。そのような特徴を有する任意の２官能
リンカーが、本発明において使用され得る。好ましい２官能リンカーは、ＳＳＭ
ＣＣで、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳＳ）エステルとマレイミ
ドの機能性を含むヘテロな２官能リンカーである。分子のＮＨＳＳエステル末端
は、ＭＵＡＭスポットのようなアミノ修飾した表面上の遊離しているアミングル
ープと反応して、チオールの方向に向かって反応性があるマレイミド基で末端化
されているパッドを合成する。５´末端にチオール修飾されたＤＮＡ配列の１ｍ
Ｍ溶液の少量（０．０８から０．１Ｌ）が、次いで、個別のアレイ部位にスポッ
トされ、表面に対して共有結合の付加を形成するために反応する。図２、参照番
号（５）を参考。この技術を用いて、生物分子のすべてのホスト及び／若しくは
細胞のすべてが、異なるアレイ部位にスポットすることができる。
【００４８】 チオール−ＤＮＡがＳＳＭＣＣを介してＭＵＡ／ＰＬ（１１−メルカプトウン
デカン酸／ポリ−Ｌ−リシン）二重層に結合するこの付加スキームの多様性は、
この研究室内で広範囲に使用された。米国特許出願番号５，６２９，２１３を参
考。他の研究者は、機能的な表面を調製するために金に対するチオール末端化Ｄ
ＮＡ分子の直接的な自己アセンブリを使用したが、しかしこの方法は、オリゴヌ
クレオチド分子の自己アセンブリのための唯一弱い力が存在し、したがってＤＮ
Ａが露出した金の表面に対して非特異的に吸着できる欠点を有する。
【００４９】 ここで、２官能リンカーが５´末端にチオール修飾されたオリゴヌクレオチド
配列をアミノアルカンチオールの反応性パッドに付加するために使用される。２
官能リンカーは、好ましくはアミンに向けた機能的な反応性及びアミノアルカン
チオールに向けた機能的な反応性を有する。表面は、まず最初にリンカーの溶液
に浸され、分子の一方がアミノアルカンチオール表面と反応する。余分なリンカ
ーが、洗浄して洗い流され、次いでアレイ表面が、２官能リンカーのもう一方が
反応して核酸と表面単一層間に共有結合を形成する５´末端にチオール修飾され
たＤＮＡでスポットされる。
【００５０】 段階（６）。段階（６）において、Ｆｍｏｃとしてここに描写されている保護
基がアレイ表面から除去される。この作業は、好ましくは、ＤＭＦ中で、２次ア
ミン、ＴＡＥＡの１Ｍ溶液に浸すことによって完遂される。多くの基礎的な２次
アミンが表面からＦｍｏｃを除去するために使用することができ、例えば、エタ
ノールアミン及びピペリジンの１Ｍ溶液が同じ成功率において使用することがで
きる。ＴＡＥＡが、ジベンゾフルベンの副産物を効果的に除去して、アレイ表面
から効率的に洗浄されるので、脱保護剤として、特異的にＴＡＥＡが選択された
。この脱保護段階後、アレイバックグラウンドは、再度、元のω−修飾されたア
ルカンチオール表面に戻る。脱保護されたＭＵＡＭ表面のスペクトルの好ましい
実施態様が図３のプロット（Ｃ）にて示され、脱保護されたＭＵＡＭ表面のスペ
クトルと元のＭＵＡＭのスペクトルが強い類似性であることに注意。カルバメー
ト結合による顕著なバンドはもはや出現せず、Ｆｍｏｃ保護基が表面から完全に
除去されたことを示している。脱保護された表面はまた、ＳＰＲ走査で計測され
、測定された厚さは開始時のＭＵＡＭ表面で測定された値の±１Å以内で、これ
は、Ｆｍｏｃ保護基が表面から完全に除去されたことを示す追加の証明の提供と
なる。
【００５１】 段階（７）。アレイ組み立ての最終段階において、ω−修飾されたアルカンチ
オールバックグラウンドが化合物と反応して、タンパク質の非特異的結合に抵抗
性のあるバックグラウンドを合成する。この目的のための好ましい化合物は、Ｐ
ＥＧ−ＮＨＳであるが、選択的にω−修飾されたアルカンチオール表面に結合し
、非選択的タンパク質結合を阻害する任意の化合物を使用することができる。ア
レイ表面に結合している生物分子若しくは細胞に対するタンパク質の結合の効率
的なモニターのために、アレイのバックグラウンドがタンパク質分子の非特異的
吸着を禁止ことが重要である。著しい量のそのような非特異的結合は、特定のア
レイ位置で結合する蛋白質の小量の測定を不明瞭にする。
【００５２】 タンパク質の非特異的結合に抵抗するバックグラウンドを合成するために、図
２、参照番号（７）で示されるようにＭＵＡＭ表面がＰＥＧ−ＮＨＳと反応した
。Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ＋ＭＵＡＭ反応の場合のように、ＰＥＧ−ＮＨＳは、ＭＵＡ
Ｍの末端アミングループと反応してアミド結合を形成し、ＰＥＧポリマー鎖が共
有結合的に表面に付加する。好ましいＰＥＧ−ＮＨＳポリマーは２０００の平均
分子量で、１つの分子に対して１つのＮＨＳエステル部位を有し、一点での付加
を可能にする。ＰＥＧ−ＮＨＳと反応したＭＵＡＭ表面のスペクトルを集めたも
のが、図３のプロット（Ｄ）にて示されている。１６６０ｃｍ−１及び１５７６
ｃｍ−１にて現れるピークは、それぞれ、アミドＩ及びＩＩのバンドに当てはま
る。１４５７ｃｍ−１及び１２５０−１２６０ｃｍ−１のバンドは、ＭＵＡＭア
ルキル鎖とエチレングリコール（ＥＧ）基の両者を含むＣＨ２基の切除及びねじ
れた変形に帰着する。１３５２ｃｍ−１のバンドは、ＥＧ ＣＨ２基の縦ゆれモ
ード（ｗａｇｇｉｎｇ ｍｏｄｅ）により、１１４８ｃｍ−１のバンドの中心は
、エチレングリコールユニットのＣ−Ｏ−Ｃ（エーテル）伸縮による。ＰＥＧ−
ＮＨＳでの脱保護された表面の反応後、表面は親水性を維持し、３７．３°±２
．６°の接触角度を測定する。２３．８ű０．８Åの全厚みが、ＰＥＧ−ＮＨ
Ｓでの反応後のＭＵＡＭ単一層フィルムにおいて測定された。ＰＥＧの唯一６Å
の増加が、ＭＵＡＭのアミングループのほんのわずかな部分を修飾し、オリゴ（
エチレングリコール）鎖が表面に水平に横たわっていることを示唆している。
【００５３】 ＳＰＲ画像化実験（実施例２及び図７を参考）が二重構成表面（Ｃ１８−チオ
ール／ＭＵＡＭ＋ＰＥＧ）に対するＢＳＡの非特異的吸着を測定するために使用
され、ＭＵＡＭ＋ＰＥＧが効果的にタンパク質の非特異的吸着に対して抵抗性が
あることをはっきりと明らかに示された。
【００５４】 実施例 下記の実施例は、本発明について、より多くの完全な理解を単独で提供するこ
とが含まれている。実施例は、あらゆる様式において、ここに開示され、請求さ
れた本発明の範囲を限定しない。
【００５５】 すべての実施例における標準工程： ＰＭ−ＦＴＩＲにおいて使用される金の基板及び接触角度測定器は購入され（
Ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｆｉｌｍｓ）、走査若しくは画像化ＳＰＲ
装置にて使用されるものは、Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ． ６８：８５−８８によって報告されているのと類似の方法である
（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ）によってシ
ラン化（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ）することによる顕微鏡のスライドカバーへの蒸気
沈着によって調製された。
【００５６】 すべてのオリゴヌクレオチドは、ウィスコンシン大学のバイオテクノロジーセ
ンターにおいてＡＢＩ社（Ｆｏｓｔｅｒ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＤＮＡ合
成機を用いて合成された。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，
Ｖｉｒｇｉｎｉａ）の“５´−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６”及びＡ
ＢＩ社の“６−ＦＡＭ”が、５´末端へのチオール修飾及び５´末端へのフルオ
レセイン修飾したオリゴヌクレオチドにそれぞれ使用され、“Ｓｐａｃｅｒ Ｐ
ｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８”（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が、エ
チレングリコールスペーサー領域への付加に使用された。チオール修飾されたオ
リゴヌクレオチドが、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の製品添付文書にしたがっ
て脱保護された。（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ． （１９９０）
“ＤＮＡの修飾及び標識のためのユーザーガイド”）。使用前に、各々のオリゴ
ヌクレオチドが、逆層バイナリー勾配溶出ＨＰＬＣ（島津製作所（Ｃｏｌｕｍｂ
ｉａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）“ＳＣＬ−１０ＡＶＰ”）にて精製され、ＤＮＡの
濃度がＨＰ８４５２ＡＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒ
ｄ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて確定された。
【００５７】 実施例１のＳＳＢ実験にて使用されたＤＮＡ分子の配列は、下記である： Ｄ１＝５´ＨＳ（ＣＨ２）６（Ｔ）１６ＡＣＣＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡ（
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１） Ｄ２＝５´ＨＳ（ＣＨ２）６（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２４ＧＣＴＴＡＴＣＧＡＧＣ
ＴＴＴＣＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２） Ｄ２の相補鎖＝５´ＦＡＭ−ＣＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＡＡＧＣ（ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ：３） ＳＰＲ画像化実験のＢＳＡ及びＳＳＢにおいて使用したバッファーは、２０ｍ
Ｍリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ，
及び５ｍＭ塩化マグネシウムを含み、ｐＨ７．４に調製された。
【００５８】 アレイ組み立ての複数段階：きれいな金の基板が、吸着及びアミノアルカンチ
オール単一層の自己アセンブリを可能にするために、ＭＵＡＭの１ｍＭエタノー
ル溶液に、少なくとも１時間浸される。基板が、エタノールと水で洗浄され、窒
素蒸気の下で乾燥され、次いでＦｍｏｃ−ＮＨＳ溶液（ＤＭＳＯと１００ｍＭ
ＴＥＡバッファーが１対１の比率でｐＨ７）にて反応させた。サンプルは、表面
から未反応のＦｍｏｃ−ＮＨＳを除去するためにＤＭＳＯに簡単に染み込ませ、
次いで、水銀−キセノンアークランプ（ｍｅｒｃｕｒｙ−ｘｅｎｏｎ ａｒｃ
ｌａｍｐ）からのクオーツマスクを通した紫外線光をサンプルに照射することに
よってサンプルをフォトパターン化した。結果的に、エタノールと水によるサン
プルの洗浄が、浸された表面からアルカンチオールを取り除いた。サンプルが、
再度エタノールＭＵＡＭ溶液に浸され、結果としてアレイのＭＵＡＭ要素が疎水
性のＭＵＡＭ＋Ｆｍｏｃバックグラウンドによって囲まれた。次いで、一本鎖で
、５´末端がチオール修飾されたＤＮＡは従来使用されていた方法がわずかに修
飾された付加スキームを用いてアレイ部位に固定された。要約すると、アミンで
末端化されたＭＵＡＭアレイ要素が、ヘテロな２官能リンカーであるＳＳＭＣＣ
の１ｍＭ溶液（１００ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７）の０．１μＬでスポットされ、チ
オール活性で、マレイミドが末端化された表面を合成する。５´末端にチオール
修飾されたＤＮＡ配列は、次いで、特定のアレイ部分へ１ｍＭ ＤＮＡを含む溶
液の０．１μＬ粒を伴うサンプルを滴下し、溶媒の蒸発を防ぐために湿った環境
下において少なくとも２時間反応によって、それらのマレイミドが末端化された
アレイの要素に共有結合して付加された。ＤＮＡ溶液へ浸した後、未結合のＤＮ
Ａ配列を除去するために、表面が水によって洗浄してバッファーに染み込ませた
。次いで、アレイをＤＭＦ中のＴＡＥＡの１Ｍ溶液に１０分間、浸すことによっ
てＦｍｏｃがバックグラウンドから除去された。脱保護された表面が水で洗浄さ
れ、結果としてアレイのバックグラウンドをペギレート（ｐｅｇｙｌａｔｅ）す
るために４ｍＭのＰＥＧ−ＮＨＳ（１００ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ８）で反応させ、
タンパク質の非特異的結合に対して抵抗性を与える。
【００５９】 ＰＭ−ＦＴ−ＩＲＲＡＳ測定：ＰＭ−ＦＴ−ＩＲＲＡＳスペクトルが、狭いバ
ンドのＨｇＣｄＴｅ検出部（中間赤外線領域のスペクトル、２０００−１０００
ｃｍ−１）若しくはＩｎＳｂ検出部（ＣＨ伸縮領域のスペクトル、３４００−２
６００ｃｍ−１）を装備するＭａｔｔｓｏｎ ＲＳ−１分光計で集光された。光
学的体裁及び従来から発展したリアルタイムインターフェログラムサンプリング
方法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｇｒａｍ ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ）が記載されているので、ここにおいて詳しく述べる必要はない。
ＰＭ−ＦＴ−ＩＲＲＡＳの差異の反射率値（％Ｒ／Ｒ）が、従来のＩＲＲＡＳデ
ータとの比較のために吸着ユニットに変換される。スペクトルは、２ｃｍ−１の
分離度において集められた平均１０００の走査である。
【００６０】 接触角度測定：水の接触角度が標準で既知の手順によって実験室の常温にて測
定された。表面上に１０μＬの小滴がＧｉｌｓｏｎピペットによって分注されて
、角度の測定が直ちに記録された。Ｆｍｏｃ及びＰＥＧの機能性のある表面にお
ける記録された接触角度値は、４つの個々に調製されたサンプルにおいて測定さ
れた１２の異なる測定値の平均で、ＭＵＡＭにおける値は、１０の異なるサンプ
ルにおいて測定された３０の測定値の平均である。
【００６１】 走査する角度のＳＰＲ測定：ｅｘ−ｓｉｔｕの光学的な技術の走査するＳＰＲ
は、４７５Åの金が蒸気沈着したＢＫ７カバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）にアセ
ンブルされたＭＵＡＭ，ＭＵＡＭ＋Ｆｍｏｃ、及びＭＵＡＭ＋ＰＥＧの厚さ（前
述にて報告されている）を決定するために使用された。ＳＰＲ実験の詳細及び厚
さの計算は、いずれかにおいて報告されている。概略すると、サンプルアセンブ
リ（ＢＫ７プリズム／金／薄いフィルム／空気）からのｐ−極性化されたＨｅＮ
ｅレーザー光線（６３２．８ｎｍ）の反射率（Ｒ）がＳＰＲ曲線（％Ｒ対角度）
を合成するための入射角度の機能としてモニターされた。反射率における急激な
低下が、重要角度（〜４４）をちょうど過ぎてから起こる。最低限の正しい位置
が、金の表面において吸着された物質の厚さ及び屈折率によって決定される。４
層複合フレネルの計算（４−ｐｈａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｒｅｓｎｅｌ ｃ
ａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）が、ここで測定される全ての薄いフィルムで推測される
１．４５のフィルムの厚さ及び屈折率を決定するために使用される。
【００６２】 ＳＰＲ画像化装置：Ｉｎ ｓｉｔｕのＳＰＲ画像化装置が前述の形式に修飾さ
れて、Ｊｏｒｄａｎ ＆ Ｃｏｒｎ （１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．
６９（７）： １４４９−１４５６； Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７
） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９：４９４８−４９５６； Ｊｏｒｄａｎ ｅ
ｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９（２４）：４９３９
−４９４７； Ｆｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， ｓｕｐｒａ，
を参考、ＨｅＮｅレーザー及び光線の増幅器がコリメート化した（ｃｏｌｌｉｍ
ａｔｅｄ）白色光源／バンドパスフィルターの組み合わせに取って代わった。近
赤外線（ＮＩＲ）ＳＰＲ画像化の内容におけるこの修飾のより徹底した議論が調
製段階においていずれかに報告されている。Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９
９９）を参考。要約すると、コリメート化した光の多色光線が、ＳＰＲ角度に近
い固定された入射角度においてＳＦ１０プリズム／金／薄いフィルム／バッファ
ーアセンブリを明るくするために使用された。反射光が１０ｎｍのバンドパスフ
ィルター（８３０ｎｍ）を通過して、安価なＣＣＤカメラにて集光された。サン
プルにおける様々な位置において測定された反射光強度の違いが画像を合成し、
金の表面における物質結合の厚さ若しくは屈折率における違いの直接的な結果で
ある。図６に示されている画像は、４５０Åの金が沈着したＳＦ１０基板でサン
プルを構成するための集められたｉｎ ｓｉｔｕである。ＮＩＨ画像化バージョ
ン１．６１ソフトウェアを用いてデータの構築が行われた。
【００６３】 実施例１：一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ配列のアレイに対する一本鎖ＤＮＡ結合タ
ンパク質の結合のＳＰＲ画像化測定： 核酸アレイがタンパク質と核酸の結合をモニターするためにＳＰＲを画像化す
る連結において使用できることを論証するために、一本鎖ＤＮＡ（Ｄ１、ＳＥＱ
．ＩＤ．ＮＯ：１）及び二本鎖ＤＮＡ（Ｄ２及びＤ２に対して相補鎖、ＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯＳ．２及び３の各々）を含むチェッカーボード表面が上記に記載され
た方法によって構築された。次いで、アレイ表面への一本鎖ＤＮＡ結合タンパク
質であるＳＳＢの結合がＳＰＲによってモニターされた。その名前が意味するよ
うに、ＳＳＢ（全分子量が７５，０００Ｄで、４つの同等なサブユニットのテト
ラマー）は、しっかりと、選択的に、及び協力的に一本鎖ＤＮＡに結合して、Ｄ
ＮＡの複製、修復、及び組換えにおいて中心的な役割を果す。図６は、表面のＳ
ＳＢへの露出の直前と直後に集積された２つの画像の違いを示している。画像上
で浮きあがっているエリアは、表面に対するタンパク質の吸着における％Ｒ変化
の測定である。タンパク質が結合するアレイの位置は、一本鎖ＤＮＡ配列で修飾
された領域と対応する。
【００６４】 図５は、実験中に集められた画像から得られる様々なラインプロファイルを示
している。量的情報量を提供するそれらの“ラインプロファイル”が、画像を横
切って引かれた選択された長方形領域におけるピクセルの各々のカラムにおいて
測定された％Ｒ値を平均し、カラムの側面位置に対する平均値をプロットするこ
とによって構築された。実線は、２本の５´末端にチオールが修飾された一本鎖
ＤＮＡ配列であるＤ１及びＤ２が、アレイ表面上のチェッカーボードパターンに
固定されている開始時の表面を示している。その２つのＤＮＡプローブ鎖の配列
は、上記に記載されている。各々の配列が５´−チオール修飾、スペーサー領域
、及び１６塩基長の可変配列を含んでいる。可変領域がＤＮＡ計算，Ｆｒｕｔｏ
ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ｓｕｐｒａ，の目的のために発達したライブ
ラリーから特定的に選択され、それらの可変領域とその相補鎖は、クロスハイブ
リダイゼーションを示さない。ステアリンの障害がハイブリダイゼーションの吸
着工程を妨げないように、ＤＮＡを十分に表面から遠ざけて位置するために、ス
ペーサー領域が組み込まれる。１５Ｔのスペーサー領域がＤ１に使用されたが、
配列Ｄ２は同じ長さのＥＧスペーサーを代わりに含んだ。ＳＳＢがポリＴ配列に
強固に結合すると知られている事実を与えられて、この配列が必要性であった。
ダッシュ線は、Ｄ２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）に対して１６塩基長の相補鎖を
含む溶液に表面をｉｎ ｓｉｔｕで浸した効果を示している。Ｄ２の場所におい
て発生した％Ｒの測定可能な変化は、相補的な配列のハイブリダイゼーションの
吸着が発生したことを示唆し、Ｄ１の場所におけるシグナルの上昇は見られない
。点線は、ＳＳＢの２００ｎＭ溶液に浸した後の表面を示している。予期したよ
うに、タンパク質が一本鎖のアレイの位置に強固に結合しただけでなく、二本鎖
の配列を含む位置にもわずかに結合した。ＳＳＢは二本鎖ＤＮＡには結合しない
ため、Ｄ２位置におけるシグナルの増加は、不完全なハイブリダイゼーションの
結果として、その位置において存在する一本鎖ＤＮＡに対するＳＳＢの結合に起
因すると考えられる。アレイのバックグラウンドが相補的ＤＮＡ分子と一本鎖結
合タンパク質の両者の非特異的結合に対して成功裡に抵抗性を備え、高いバック
グラウンドのシグナルの干渉なしに％Ｒにおけるわずかな変化の測定を可能にす
ることは、注意すべき重要なことである。
【００６５】 この実施例は核酸−タンパク質相互作用を調査するために使用することができ
る本発明によるアレイの組み立てを示している。
【００６６】 実施例２：ＰＥＧで阻害する非特異的タンパク質結合の論証： ここにおいて、Ｃ１８アルカンチオールのアレイのスポットが、上記に記載の
技術を用いてＭＵＡＭ＋ＰＥＧバックグラウンド上にアセンブルされた。次いで
、アレイがＢＳＡに対して浸され、実施例１にて記述しているように、反射率が
測定された。結果が、図７に示されている。図７において、実線がＢＳＡに露出
する前のアレイの反射率を示し、ダッシュの線がＢＳＡに浸された後の存在反射
率を示す。
【００６７】 いくらかのＢＳＡがＭＵＡＭ＋ＰＥＧバックグラウンドに吸着するため、非常
に多量のＢＳＡが未処理のＣ１８スポットに吸着する。それゆえ、この実施例は
ＰＥＧがバックグラウンド表面に対するタンパク質の非特異的結合を阻害するた
めに使用することができることを示している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明による複数要素のＤＮＡアレイを構築するための組み立てスキ
ームの概要の説明である。きれいな金の表面がアミン末端化アルカンチオールと
反応し、結果として疎水性表面を合成するために保護基と反応する。この表面は
、次いで、クオーツマスクを通してＵＶ照射に露光され、表面の特定エリアから
アルカンチオール＋保護基を除去するために溶剤で洗浄され、露出した金のパッ
ドを残す。サンプル表面上のそれらの露出した金のエリアは、アルカンチオール
で満たされ、結果として疎水性保護基のバックグラウンドに囲まれたアルカンチ
オールパッドのアレイとなる。核酸溶液は、次いでピペットによって、特定のア
レイ部位まで運ばれ、２官能リンカーを介して表面と共有結合する。最後の２段
階において、アレイのバックグラウンドの保護基は除去され、バックグラウンド
への分析物タンパク質の非特異性の結合を禁止する官能基と入れ替わる。
【図２】 図２は、アレイのバックグラウンドの可逆的修飾において含まれる表面反応の
スキームを示す段階を描いている。開始時のアミン末端化アルカンチオール表面
は、Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ保護基と反応し、カルバメート結合を形成して、疎水性Ｆ
ｍｏｃ末端化表面を合成する。核酸の固定後、表面は脱保護され、結果として、
元のアルカンチオール表面に戻る。最後のアレイの組み立て段階において、脱保
護されたアルカンチオール表面は、ＰＥＧ−ＮＨＳと反応して（バックグラウン
ドへの分析物タンパク質の非特異性の結合を防ぐ）アレイの表面にＰＥＧが共有
結合で付加するアミド結合を形成する。
【図３】 図３は、アレイのバックグラウンドの修飾に含まれる表面における中間赤外線
領域のＰＭ−ＦＴＩＲＲＡＳスペクトルを描写する。（Ａ）開始時のＭＵＡＭ表
面。（Ｂ）Ｆｍｏｃ−ＮＨＳとの反応後、カルバメート結合及びＦｍｏｃ環伸縮
（ｒｉｎｇ ｓｔｒｅｔｃｈ）を示すバンドは、スペクトルに現われる。（Ｃ）
表面が脱保護され、ＡとＣのスペクトルの類似性によって証明されるように、Ｍ
ＵＡＭ表面に戻る。（Ｄ）ＰＥＧ−ＮＨＳとの反応後、それらと同様にアミド結
合もエチレングリコール基と関連した示されるバンドが現れる。
【図４】 図４は、ＤＮＡの場合において、アレイの部位の固定化している生物分子を含
む表面反応スキームを示す段階を描写する。ＳＳＭＣＣのような２官能リンカー
が、チオール修飾されたＤＮＡとＭＵＡＭパッドを結合するために使用される。
【図５】 図５は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びオリゴヌクレオチド配列
Ｄ１とＤ２を含む二重化合物ＤＮＡアレイ上への一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（
ＳＳＢ）の吸着にて示される一連のスペクトル線の形状を描写する。実線は、交
互になっているＤＮＡプローブのスポットＤ１及びＤ２からなる開始時表面にて
測定された反射率である。ダッシュ線は、表面をＤ２に対する相補物を含む溶液
に浸した後に測定した％Ｒである。明白なのは相補的ＤＮＡ配列の結合上の位置
Ｄ２の％Ｒの増加である。点とダッシュの線は、表面をＳＳＢの２００ｎＭ溶液
に浸した後の測定した％Ｒである。測定可能な結合がアレイのＤ２位置（二本鎖
ＤＮＡを含んでいる）にて発生している間、タンパク質は明らかに一本鎖配列Ｄ
１により十分に結合する。
【図６】 図６は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が一本及び二本鎖オリゴヌク
レオチド配列のチェッカーボードアレイに結合していることを示しているｉｎ
ｓｉｔｕでのＳＰＲ相違画像を描写する。ＳＳＢに対する表面の露出の前後にお
いて直ちに集積された画像は、示された画像を合成するために引き抜かれた。一
本鎖ＤＮＡと共有結合をしているアレイの位置へのタンパク質の重要な結合が起
こる一方で、二本鎖ＤＮＡ配列を含むアレイ位置での結合はほとんど起こらない
。
【図７】 図７は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がパターン化されたＣ１８／ＭＵＡＭ
＋ＰＥＧ表面へのｉｎ ｓｉｔｕでの吸着を示す一連のスペクトル線の形状を描
写する。実線は、ペギレート化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）したＭＵＡＭバックグラ
ウンドによって囲まれるＣ１８の３５０ｎｍのアレイ表面にて測定された％Ｒで
ある。点線は、表面を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液への露出後に測定された％Ｒで
ある。ＭＵＡＭ−ＰＥＧ領域におけるほとんど低い％Ｒの変化は、ペギレート化
したバックグラウンドが、ＢＳＡの非特異的結合の抵抗においてＣ１８よりも効
率性が非常に高いことを示している。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月１７日（２００１．３．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 金属表面上に生物分子アレイを合成する工程
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明分野 本発明は、核酸とタンパク質の相互作用若しくは抗原を伴う細胞間相互作用の
ような巨大分子間、細胞と巨大分子間、及び細胞間の相互作用の研究に使用する
金属表面の分子生物的若しくは細胞的アレイの組み立てを導く。
【０００２】 従来技術の詳細 ＤＮＡへのタンパク質の結合は、遺伝子発現の抑制と制御、複製及び組換えに
おいて、極めて重要な役割を担う。付け加えると、特定のオリゴヌクレオチド配
列を認識して修飾する酵素は、生物学的な核酸操作及び修復システムの重要な要
素である。どのようにしてそれらのタンパク質が特定のオリゴヌクレオチド配列
を認識するかについての増大した理解は、例えば、治療上のタンパク質発現の抑
制に使用されるなどの生物学的医学システムのデザインの助けとなるであろう。
このような理由のため、タンパク質核酸相互作用（例えば、タンパク質−ＤＮＡ
及びタンパク質−ＲＮＡの相互作用）の研究は、分子生物学の急速に成長してい
る分野であり、今日発展しているＮＭＲ及びＸ線の構造の決定方法により部分的
に助けられている。時を同じくして、大きなスケールの核酸シークエンシングの
努力から得られる利用可能なゲノム及びゲノム以外（例えば、リボソーマル）の
配列情報の量における爆発的な増大は、多量にある新しい配列データのタンパク
質結合部位のための調査を必要とする。本発明は、配列のスクリーニング若しく
は化学的に修飾された金属表面に固定された核酸分子の大きなアレイへのタンパ
ク質の構造的に特異的な結合をスクリーニングする迅速で効率的な方法として表
面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現像技術によるこの必要を表明する。
【０００３】 平坦な表面へのＤＮＡ分子のアレイの付着は、ハイブリダイゼーションにおけ
るＤＮＡ配列に対する吸着実験に（Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ５０２２−５
０２６）、遺伝的突然変異のスクリーニングに（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ
． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１： １１９４−１１９７）、及びＤ
ＮＡのコンピュターの適用（Ｆｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ４７４８−４７５７； 及び Ｆ
ｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ
． １２０： １０２７７−１０２８２）において今日採用されている。それら
のアレイは、蛍光的に標識された相補的なＤＮＡ配列を含む溶液にさらされ、洗
浄され、次いで蛍光画像化方法を用いて解析される。
【０００４】 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の技術は、表面に対して感受性であり、可逆的
な、タンパク質−核酸の相互作用のモニタリングにより適した光学的検出方法で
ある。例えば、商業的に成功した“ＢＩＡｃｏｒｅ”ＳＰＲ装置（Ｂｉａｃｏｒ
ｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）が、様々な酵素を伴う核酸分子の相互
作用の研究にかつて使用されていた。威力的であるが、“ＢＩＡｃｏｒｅ”ＳＰ
Ｒ装置は、画像化能力を有していない。多くのＤＮＡ配列を限定するこの厳しさ
は、一度の実験においてスクリーニングされ得る。
【０００５】 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、厚さ及び遊離電子金属（例えば、金、銀、
銅、カドミウム、アルミウム）と空気や水のような体積媒体間の界面での物質の
屈折率に対して感受性のある表面の光学技術である。表面プラズモン共鳴は、直
線的に極性で入射面に平行なレーザー光線が、薄い金属フィルムが塗布されたプ
リズム上に衝突する場合に発生する消失波の使用によって達成されるかもしれな
い。金属はまた、ガラスのような薄い透明な基板上に塗布されるであろうし、こ
のガラスは、プリズムを伴う光学的接触にもたらされる。ＳＰＲは、ちょうどプ
リズムの臨界角を過ぎた内部に反映された光の合計の縮小のように最も簡単に観
察される。最小の反射率のこの角度は（ＳＰＲ角度として与えられた）、物質が
金属層に吸着されるように高い角度に移動する。角度における移動は、吸着の厚
さの測定に変換され得るか若しくは複合的フレスネル計算（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆ
ｒｅｓｎｅｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ）による物質の追加が可能で、金属層
上において物質の存在を検出するために使用され得る。 生物学的、生化学的、若しくは化学的物質を試験するＳＰＲの使用において、レ
ーザー供給源からの光の光線は、プリズムを通過して、１つの外部表面が貴金属
の薄いフィルムで覆われ、次いで分析物と強く互いに影響する生物学的、生化学
的、若しくは化学的物質のような有機フィルムで覆われている透明な基板で、通
常ガラスで構成されるバイオセンサーに導かれる。有機フィルムは、増大された
厚さがＳＰＲ角度を移動することを引き起こすサンプル中で分析物と結合できる
抗体や抗原のような物質を含むことができる。ＳＰＲ角度の位置若しくはＳＰＲ
角度近隣の固定された角度における反射率をモニターすることによって、サンプ
ル中での分析物の存在が検出できる。生物学的若しくは生化学的若しくは化学物
質のバイオセンサーを伴いＳＰＲを使用するための様々な種類の装置が、“Ｓｅ
ｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，” Ｖｏｌ． ４， １９８３，
ｐａｇｅ ２９９にて見られるＬｉｅｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌの記事によって記
載されている。また、欧州特許出願番号０ ３０５ １０８及び米国特許番号５
，３７４，５６３も参照。
【０００６】 試験道具としての従来のＳＰＲの使用は、いつくかの利点と欠点を提供する。
例えば、比較的早く、標識の必要性がなく、部位の上で実行できる。しかしなが
ら、上述のように、“ＢＩＡｃｏｒｅ”のような商業的に入手可能な装置は、画
像化能力を提供しない。さらに、大量処理の使用者による高処理要求を達成する
ためには、簡単で、幅広い種類の化合物を同時に試験できるために、容易く修飾
若しくは適合できる実践的なバイオセンサーである必要性がある。
【０００７】 ＳＰＲの画像化において、光源は、ＳＰＲ角度に近い入射角でプリズム／薄い
金のフィルムとサンプルアセンブリを照らすために使用され、反射した光は、Ｓ
ＰＲ画像を合成する固定された角度のＣＣＤカメラで検出される。ＳＰＲ画像は
、サンプルの異なる部分からの様々な反射光の強度から上がってきて、そのよう
な多様性は、有機フィルムの厚さ若しくは修飾された金の表面で起こる吸着にお
ける屈折率の任意の変化によって合成される。ＳＰＲ画像が表面に隣接する（２
００ｎｍ以内）分子にのみ感受性があるため、溶液中に残存する未結合分子は、
ｉｎ ｓｉｔｕでの測定を妨げない。
【０００８】 １９９６年５月にＴａｒｌｏｖに発行された米国特許出願番号５，５１４，５ ０１は、基板上の異なるチオール化した分子の２つの次元の空間の分配パターン を合成する方法を記載している。この方法において、第一のチオール化した化合 物の自己アセンブルした単一層の表面は、所望のパターンにより分配された高周 波電磁放射線を伴う酸素の存在下において照らされる。上記の照らされた基板は 、次いで第２のチオール化した化合物の溶液に浸され、単一層の照らされた部分 における第一のチオール化した化合物の分子は、上記の第２のチオール化した化 合物の分子と交換される。
【０００９】 １９９４年の１１月に発行され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに割り当てられた国際公開番号９４／２ ７１３７に、固形状のアッセイにおいて光学的基板の有用性が記載されている。 ここにおいて、捕獲分子が光学的基板に吸着される。公報に記載されているよう に、捕獲分子は、光のシグナルの手段によって検出される対応する分析物を捕獲 するために適するべきである。光学的基板は、基板に対する少量の非特異的結合 を受容することを許容する化合物で塗布された領域を含んでいる。
【００１０】 金属をコーティングした表面につながれたオリゴヌクレオチドの強健で複製可
能なアレイの構成は、タンパク質−核酸結合の相互作用のＳＰＲ画像化用の必須
条件である。ＳＰＲ画像化技術を使用するために、貴金属表面上に核酸のアレイ
を構成することが必要であり、この理由のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような商業的に入手可能な
供給源からのガラススポッター上のＤＮＡアレイは、実現可能なオプションでは
ない。開始点として、置換されたアルカンチオールの自己アセンブルされた単一
層を用いると、他はすでに開発された一本鎖ＤＮＡ分子を化学的に修飾された金
の表面に付着するスキームである。例えば、米国特許番号５，６２９，２３１を
参照。しかしながら、主題の発明において、ＵＶフォトパターン化（ＵＶ ｐｈ
ｏｔｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）及び微接触印刷技術（ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ
ｐｒｉｎｔｉｎｇ）は、アルカンチオールが、金属表面上の部位に導かれる方
法で組み立てられることを可能にするように導かれ、そこにおいて、複数化合物
のアレイの合成を可能にする。斬新な表面の化学反応を伴うこれらの処理技術の
組み合わせは、ここに記載したように核酸アレイの製造を可能にする。
【００１１】 本発明の概要 開示は、金属基板上に、生物分子及び／若しくは細胞アレイを合成する複数段
階の化学的修飾方法であり、アレイは、表面プラズモン共鳴画像化を用いる生物
分子及び細胞相互作用の研究のために特異的に仕立て上げられる。この手法によ
るアレイの作製は、３つの特異的な要求を求め、いわゆる、（ｉ）生物分子が表
面に共有結合で付着して、ハイブリダイゼーション及びタンパク質の結合に対す
る活性とアクセスの可能性を残して；（ｉｉ）特定のアレイの位置において生物
分子若しくは細胞の水性溶液の“ピン止め”が可能になるように、アレイのバッ
クグラウンドが、初期段階において十分に疎水性であり；（ｉｉｉ）最終的なア
レイのバックグラウンドが、表面へのタンパク質分子の非特異的結合が阻害され
るように行動する。この作製スキームのカギとなる化合物は、付着してω修飾さ
れたアルカンチオールの単一層の表面の疎水性及び表面の蛋白質を抵抗するよう
にするポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基の付属を制御する可逆的な疎水
性の保護基の活用であり、好ましくはＦｍｏｃである。偏光―変調フーリエ変換
赤外線（ＰＭ−ＦＴＩＲ）分光学、接触角度、及びＳＰＲ測定が、表面の修飾方
法におけるそれぞれの段階を特徴づけるために使用され、及びにアレイのバック
グラウンドがタンパク質の非特異的結合を阻害することを確認するために使用さ
れる。最終試験として、２つの化合物に対する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ｓ
ＳＢ）の吸着を測定するＳＰＲ画像化実験、オリゴヌクレオチドアレイが、タン
パク質−核酸相互作用のモニタリングのためのこれらの表面の効用を実証する。
【００１２】 スポットのアレイを合成するためにここで開示している複数段階の方法が使用
される。複数段階の方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ ＳＰＲ画像化測定中において、疎
水性のバックグラウンドが最初に囲まれ、水性の生物分子若しくは細胞溶液を個
々のアレイ要素上へのピン止めを可能にし、次いで、疎水性バックグラウンドを
タンパク質の非特異的吸着に抵抗するものと交換し、上記疎水性バックグラウン
ドにおいて、タンパク質の非特異的吸着を抵抗する生物分子若しくは細胞の“海
”の中の“島”を産する。
【００１３】 好ましい実施態様において、アミン末端のアルカンチオール単一層が基層とし
て採用され、連続している疎水性でタンパク質の吸着に抵抗ある表面を合成する
ためにＦｍｏｃ及びＰＥＧの修飾物がそれぞれ使用される。好ましい実施態様に
おいて、化学的修飾段階は：（ｉ）蒸発させた金の薄いフィルム上の１１−メル
カプトウンデシルアミン（ＭＵＡＭ）単一層の吸着と自己アセンブル；（ｉｉ）
疎水性表面を合成するためにＦｍｏｃ保護基を伴うＭＵＡＭ単一層の反応；（ｉ
ｉｉ）水性溶液の滴をピンで止めることができる疎水性ＭＵＡＭ−Ｆｍｏｃバッ
クグラウンドに取り囲まれたＭＵＡＭ正方形（およそ７５０μｍｘ７５０μｍで
あり、これより小さいかより大きな正方形は到達可能である）のアレイを合成す
るためのＭＵＡＭの再吸着（ｉｖ）に続くアルカンチオールのフォトパターン化
した除去；（ｖ）少量（０．１μＬ）のチオール化ＤＮＡのカップリング反応に
続く、ヘテロな２官能クロスリンカー（好ましくはＳＳＭＣＣ）を伴うアミン末
端表面の反応によるＭＵＡＭ正方形上へのオリゴヌクレオチド配列の付着；（ｖ
ｉ）タンパク質吸着抵抗バックグラウンドを合成するためのＰＥＧ−ＮＨＳを伴
うＭＵＡＭのペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）反応（ｖｉｉ）によって
続くＦｍｏｃ保護基の除去。
【００１４】 偏光−変調ＦＴＩＲ分光、接触角度及び角度ＳＰＲ測定の走査の組み合わせが
表面の修飾工程を特徴づけるために使用される。オリゴヌクレオチドアレイ上へ
の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）の吸着のＳＰＲ画像化測定は、タンパ
ク質及び他の分析物を備えた核酸相互作用を調査するこれら表面の効用を実証す
るために使用されるこの工程によって合成される。
【００１５】 主題の発明の主要な利点は、固定された生物分子若しくは細胞のアレイが、ア
レイにおける他の島とは異なる限られた分子若しくは細胞の各々の“島”におい
て構成されることを可能にする。これは、選択された分析物への非常に多くの異
なる分子の大規模で同時の分析又は細胞個々のアフィニティー及び／若しくは結
合特質を考慮に入れる。ここに記載された組み立て方法は、自動化に非常に適し
ており、ＳＰＲ実験は標準形態マイクロタイタ−プレート及び研究室の自動化装
置（例えば、９６穴、３８４穴、及びさらに大きな形態）を用いて分析され得る
。
【００１６】 ここに記載のアレイは、多くの分析にとって有用であり、そこでは、生物分子
若しくは細胞とタンパク質、抗原、若しくは他の分子が相互作用を行い、例えば
、結合能力の決定、エピトープマッピング、制限部位マッピング、核酸における
短期の２次構造の結合効果測定等である。例えば、長さ若しくは１次配列による
ような、異なる機能で核酸の島のアレイを構築することによって、任意に得られ
た分析物に対する任意に得られた核酸配列の相互作用は、素早く、しかも完全に
調査される。同様にして、核酸における短期の２次構造の効果は、アレイを構築
することによって調査され、そのアレイは、核酸の島が、より安定した２次構造
を累進的に有する核酸配列を含む島の配列とは異なり、次いで、与えられた分析
物への露出後にアレイを走査する。
【００１７】 本発明の詳細な説明 略語及び市販供給先 下記の略語及び用語は、明細書及び請求項を通して使用される。その他すべて
の用語は、それらが含む標準的で、適切な技術において受容可能な意味を有する
。
【００１８】 “生物分子”＝生物学的物質において発見された任意の分子を明らかに含むが
、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、リン脂質などのような細胞壁化合
物、並びに標識生物分子や組換え生物分子などのそれらの修飾物及び合成形態に
限らない。
【００１９】 “ＢＳＡ”＝ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）。
【００２０】 “ＤＭＦ”＝ジメチルホルムアミド “Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ”＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ）。
【００２１】 “金属基板”若しくは“金属フィルム”＝貴金属の薄いフィルム（金、銀、銅
、プラチナ等）。金が好ましい。
【００２２】 “ＭＵＡＭ”＝１１−メルカプトウンデシルアミン（ハーバード大学、ボスト
ン、マサチューセッツ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ教授の研究
室からの寛大な提供物）。
【００２３】 “ＮＨＳＳ”＝Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル。
【００２４】 “核酸”＝デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及び任意の供
給源からのペプチド核酸、並びにそれらの修飾形態を限定なく含み、標識された
（放射線、蛍光、その他）核酸、及びチオール基やビオチンタグのような結合す
る部分を含むように修飾された核酸。
【００２５】 “ＰＥＧ”＝ポリ（エチレングリコール）。
【００２６】 “ＰＥＧ−ＮＨＳ”＝メトキシポリ（エチレングリコール）プロピオン酸、Ｍ
Ｗ２００のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）
。
【００２７】 “ポリ（エチレングリコール）−修飾アルカンチオール”＝ＨＳ（ＣＨ２）１ １ （ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＨ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ博士の研究室より）。
【００２８】 “ＳＳＢ”＝一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００２９】 “ＳＳＭＣＣ”＝スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボン酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。
【００３０】 “ＴＡＥＡ”＝トリス（２−アミノエチル）アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。
【００３１】 “ＴＥＡ”＝トリエタノールアミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）。
【００３２】 “ω―修飾されたアルカンチオール”＝末端の炭素原子が、アミノ、水酸基、
カルボキシ、若しくはチオール部分のような化学的反応性部分の付加によって修
飾されたアルカンチオール。
【００３３】 上記の化学薬品、また受け取られるようにすべて使用された。溶媒は、研究用
の標準規格で、ミリポア（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ）によって濾過された水が、すべての水溶液及び洗浄に使用された。
【００３４】 核酸アレイを合成する金属基板の化学的修飾が７つの一般的な段階で進行する
。それらの段階は、図１に概略的に及び下記に例証され： （１）．金属基板上にω―修飾されたアルカンチオール単一層の自己アセンブ
リ。アルカンチオールへのω―修飾は、アルカンチオールのω―末端をさらなる
共有結合を可能にさせる任意の部分の付加であろう。そのような修飾は、限定し
ないが、アミングループの付加、水酸基、カルボニル基、若しくはアルカンチオ
ール鎖のω炭素へのチオール基を含んでいる。アルカンチオール単一層は、好ま
しくはアミノ−Ｃ８−Ｃ２４−アルカンチオールで、直鎖のアルカンが枝アルカ
ンに好ましく、最も好ましいω−修飾されたアルカンチオールは、ＭＵＡＭであ
る。
【００３５】 （２）．疎水性保護基を伴うω−修飾されたアルカンチオール表面の反応、最
も好ましいのはＦｍｏｃ。
【００３６】 （３）．露出した金属エリアのアレイを合成する表面のフォトパターン化。
【００３７】 （４）．露出した金属アレイ要素において充填するための追加のω−修飾され
たアルカンチオールを用いた再アセンブリ、そこでω−修飾されたアルカンチオ
ールの島が産する。
【００３８】 （５）．ω−修飾されたアルカンチオールの島に共有結合的に付加している生
物分子若しくは細胞。
【００３９】 （６）．アレイバックグラウンドから保護基の除去。
【００４０】 （７）．バックグラウンドを非特異的タンパク質結合に対して抵抗性にするた
めに、好ましくはＰＥＧである物質を伴うバックグラウンドの反応。
【００４１】 （上記の７段階の頭に付された括弧数字は、図１で使用の参照数字である） 最終産物の品質を確かめるために、上記の各々の段階は、ＰＭ−ＦＴＩＲＲＡ
Ｓ、接触角度測定、及びＳＰＲ角度操作を用いてモニターされるであろう。
【００４２】 上記の段階は、図１が言及している特定の参照を用いて、非常に詳細に記述さ
れる。
【００４３】 段階（１）。段階（１）において、好ましくはアミン末端化アルカンチオール
、最も好ましくはＭＵＡＭであるω−修飾されたアルカンチオールの単一層は、
薄い貴金属フィルムで覆われたシラン化基板（ガラス若しくは最終的な分析にお
いて使用される放射線の波長に対して透明な他の基板）上のエタノール溶液から
自己アセンブリされる。好ましい実施態様においては、厚さが約４５０Åの金の
フィルムが使用される。フィルムが一様に適用され、ＳＰＲ画像化分析の中で機
能するであろう限りでは、金属フィルムの厚さは過度に重要ではない。金上のω
−修飾されたアルカンチオールの自己アセンブリした単一層は、すでに詳しく記
述され、例えば、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ． １１７：３８３０−３８３４を参照、一般的に、非常に整って
形成する大部分である単一分子フィルムによって受け入れられる。しかしながら
、残されたものが延長して露出されると、アミノ修飾されたアルカンチオールの
末端のアミングループは、二酸化炭素と反応して表面にカルバメート塩を形成す
るであろう。結果として、アミノ末端化アルカンチオールが塗布された基板は注
意深く取り扱いされるべきで、二酸化炭素への露出は最低限にする。
【００４４】 中間赤外線領域におけるＭＵＡＭのＰＭ−ＦＴＩＲＲＡＳスペクトルは、図３
の（Ａ）にて示されている。１５４５ｃｍ−１における小さいピークは、ＮＨ３ ＋ の変形に当たる。このピークの表れは、エタノール及びミリポア水（ｐＨ〜６
）による洗浄後、末端アミングループの重要な部分が、プロトン化状態において
存在することを示している。１５４５ｃｍ−１ピークの強度における変動は、ｐ
Ｈが異なる溶液における表面の洗浄によって影響され得る。同じプロットにおけ
る１４６５及び１２５８ｃｍ−１のバンドは、ＣＨ２の切除及びアルカン鎖のね
じれ変形をそれぞれに当たる。２９２３ｃｍ−１におけるＣＨ２の非対称の伸縮
化モード（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｍｏｄｅ）及び２８５３ｃｍ−１におけるＣ
Ｈ２の非対称の伸縮化モード（スペクトルは示されていない）によるピークの波
長は、単一層が比較的規律正しい状態で存在することを示している。ＣＨ伸縮化
領域におけるスペクトルからの不在は、アミングループのＮ−Ｈ伸縮（〜３２０
０−３５００ｃｍ−１）によるバンドであり、このバンドはあまりにも弱くて検
出できないことが推測されている。末端アミングループにより、ＭＵＡＭ単一層
表面は完全に疎水性で、３６．２°±２．５°の接触角度の測定及びによって証
明され、単一層形成によって一貫している。Ｅｘ ｓｉｔｕにおけるＳＰＲの走
査は、ＭＵＡＭを伴い修飾された金の表面における１７．５ű０．４Åの厚さ
を測定するために使用され、この厚さは、表面にほぼ通常に適応させて完全に拡
張されると思われるＭＵＡＭ単一層を伴い一貫している。
【００４５】 段階（２）。アレイの組み立ての段階（２）において、ＭＵＡＭが塗布された
表面は、可逆的保護基と反応して疎水性表面を合成する。ＭＵＡＭの場合、アミ
ン修飾されたアルカンチオールである保護基は、適切にはアミノ保護基であり、
好ましくはＦｍｏｃである。Ｆｍｏｃは、かさばっており、疎水性で、不安定な
塩基で、固定層でのペプチド合成において日常的に使用されるアミン保護基であ
る。使用される保護基の選択は、アルカンチオールにさせるω−修飾の性質上の
大規模な手段に依存している。もし、ω−修飾がカルボキシル基の付加であるな
らば、疎水性カルボキシ保護基が利用されるであろう。同様にして、もし、ω−
修飾がヒドロキシル若しくはチオール基の付加であるならば、疎水性のヒドロキ
シ若しくはチオール保護基がそれぞれ使用されるであろう。アルカンチオール上
で使用されるω−修飾を保護するのに適切な任意の種類の疎水性の保護が本発明
において活用されるであろう。反応的な部分の任意で多数のそのような保護基で
あるアミン、水酸基、及びカルボキシ官能基が当業者によって知られている。例
えば、Ｆｍｏｃ及びトリチルの両者の塩化物誘導体が、可逆的に修飾するヒドロ
キシル末端化アルカンチオールとして使用できる。
【００４６】 Ｆｍｏｃのための特異的な化学反応が図２に示され、（２）を参照する。Ｆｍ
ｏｃのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ）は、ＭＵＡ
Ｍの末端アミン部分と反応して安定したカルバメート（ウレタン）結合を形成し
、表面に共有結合的にＦｍｏｃ基が付加している。ＭＵＡＭが被膜された金の基
板に結合しているＦｍｏｃの赤外線スペクトルは、図３のプロット（Ｂ）で示さ
れる。このスペクトルは、表面における反応が予測通りに進行することを証明し
ていることを提供する。１７２０、１５４４、及び１２６７ｃｍ−１における顕
著なピークは、ＭＵＡＭ表面にＦｍｏｃ基をつなぐカルバメート（ウレタン）結
合による。（１７２０ｃｍ−１におけるバンドは、カルボニル伸縮振動（アミド
Ｉ）に当たり、１５４４ｃｍ−１はＣＨＮ基振動に当たり、１２６７ｃｍ−１は
対になっているＣ−ＮとＣ−Ｏ伸縮に当たる（アミドＩＶ）。）１４５０ｃｍ− １ におけるピークは、フルオレニル基のＣ＝Ｃ環伸縮に帰着し、１１４７ｃｍ− １ におけるバンドの中心はＦｍｏｃ Ｃ−Ｏ−Ｃ（エーテル）伸縮に貢献する。
Ｆｍｏｃ−ＮＨＳとの反応後、アレイの表面の特質が際立って変化し、７４．４
°±２．５°の接触角度の測定によって確認されるように、表面が完全に疎水性
である。さらに、２２．８ű０．５Åへのフィルムの厚さの増大は、角度ＳＰ
Ｒの走査で測定される。
【００４７】 段階（３）。段階（３）において、金属基板へのω−修飾されたアルカンチオ
ールのしっかりと固定している結合は、露出された金属の配列された表面を産す
るために選択的に切り離される。紫外線のフォトパターンニングが配列された表
面を合成するのに好ましいが、配列された表面を合成するための手段は、信頼で
きて所望の配列を産する方法に限って言えば、重要ではない。例えば、微接触印
刷技術はまた、配列された表面を生じるために使用され得る。紫外線パターンニ
ング（ＵＶ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）を用いて、表面がクオーツマスク（ｑｕａ
ｒｔｚ ｍａｓｋ）を通して紫外線照射に露出され、光を酸化する金−硫黄結合
（ｐｈｏｔｏ−ｏｘｉｄｉｚｅｓ ｔｈｅ ｇｏｌｄ−ｓｕｌｆｕｒ）がアルカ
ンチオール単一層を表面にしっかり固定する。表面が次いで洗浄され、光が酸化
した（ｐｈｏｔｏ−ｏｘｉｄｉｚｅｄ）アルカンチオールが除去され、露出して
いる金属パッドの取り残されたアレイが疎水性のＭＵＡＭ＋Ｆｍｏｃバックグラ
ウンドによって囲まれている。フォトパターンニングを用いて、５０ｍｍほど小
さな寸法を備えた特徴が達成され、微接触印刷方法を用いると、１００ｍｍほど
小さな寸法を備えた特徴のアレイが達成可能である。
【００４８】 段階（４）。段階（４）において、表面が再びω−修飾されたアルカンチオー
ル溶液（好ましい実施態様においては、ＭＵＡＭのエタノール溶液）に露出され
、上記表面において、アルカンチオールが、疎水性のＦｍｏｃバックグラウンド
によって囲まれた親水性のＭＵＡＭパッドからなる表面を合成する露出している
金の領域に集まる。反応性のあるＭＵＡＭ領域とバックグラウンドの疎水性の違
いは、水性の生物分子若しくは細胞溶液の少量を個々のアレイ部位へのピン止め
にとって重要である。
【００４９】 段階（５）。段階（５）の工程において、生物分子若しくは細胞（好ましくは
、核酸）が、次いで共有結合的に表面に付加している。例証しているように、Ｍ
ＵＡＭの反応性パッドは、初期の段階で２官能リンカーの溶液に浸される。本発
明に使用するためには、リンカーの一方がω−修飾されたアルカンチオール表面
に、もう一方が所望のアレイを形成するために固定されている生物分子若しくは
細胞に結合することができるべきである。そのような特徴を有する任意の２官能
リンカーが、本発明において使用され得る。好ましい２官能リンカーは、ＳＳＭ
ＣＣで、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳＳ）エステルとマレイミ
ドの機能性を含むヘテロな２官能リンカーである。分子のＮＨＳＳエステル末端
は、ＭＵＡＭスポットのようなアミノ修飾した表面上の遊離しているアミングル
ープと反応して、チオールの方向に向かって反応性があるマレイミド基で末端化
されているパッドを合成する。５´末端にチオール修飾されたＤＮＡ配列の１ｍ
Ｍ溶液の少量（０．０８から０．１Ｌ）が、次いで、個別のアレイ部位にスポッ
トされ、表面に対して共有結合の付加を形成するために反応する。図２、参照番
号（５）を参考。この技術を用いて、生物分子のすべてのホスト及び／若しくは
細胞のすべてが、異なるアレイ部位にスポットすることができる。
【００５０】 チオール−ＤＮＡがＳＳＭＣＣを介してＭＵＡ／ＰＬ（１１−メルカプトウン
デカン酸／ポリ−Ｌ−リシン）二重層に結合するこの付加スキームの多様性は、
この研究室内で広範囲に使用された。米国特許出願番号５，６２９，２１３を参
考。他の研究者は、機能的な表面を調製するために金に対するチオール末端化Ｄ
ＮＡ分子の直接的な自己アセンブリを使用したが、しかしこの方法は、オリゴヌ
クレオチド分子の自己アセンブリのための唯一弱い力が存在し、したがってＤＮ
Ａが露出した金の表面に対して非特異的に吸着できる欠点を有する。
【００５１】 ここで、２官能リンカーが５´末端にチオール修飾されたオリゴヌクレオチド
配列をアミノアルカンチオールの反応性パッドに付加するために使用される。２
官能リンカーは、好ましくはアミンに向けた機能的な反応性及びアミノアルカン
チオールに向けた機能的な反応性を有する。表面は、まず最初にリンカーの溶液
に浸され、分子の一方がアミノアルカンチオール表面と反応する。余分なリンカ
ーが、洗浄して洗い流され、次いでアレイ表面が、２官能リンカーのもう一方が
反応して核酸と表面単一層間に共有結合を形成する５´末端にチオール修飾され
たＤＮＡでスポットされる。
【００５２】 段階（６）。段階（６）において、Ｆｍｏｃとしてここに描写されている保護
基がアレイ表面から除去される。この作業は、好ましくは、ＤＭＦ中で、２次ア
ミン、ＴＡＥＡの１Ｍ溶液に浸すことによって完遂される。多くの基礎的な２次
アミンが表面からＦｍｏｃを除去するために使用することができ、例えば、エタ
ノールアミン及びピペリジンの１Ｍ溶液が同じ成功率において使用することがで
きる。ＴＡＥＡが、ジベンゾフルベンの副産物を効果的に除去して、アレイ表面
から効率的に洗浄されるので、脱保護剤として、特異的にＴＡＥＡが選択された
。この脱保護段階後、アレイバックグラウンドは、再度、元のω−修飾されたア
ルカンチオール表面に戻る。脱保護されたＭＵＡＭ表面のスペクトルの好ましい
実施態様が図３のプロット（Ｃ）にて示され、脱保護されたＭＵＡＭ表面のスペ
クトルと元のＭＵＡＭのスペクトルが強い類似性であることに注意。カルバメー
ト結合による顕著なバンドはもはや出現せず、Ｆｍｏｃ保護基が表面から完全に
除去されたことを示している。脱保護された表面はまた、ＳＰＲ走査で計測され
、測定された厚さは開始時のＭＵＡＭ表面で測定された値の±１Å以内で、これ
は、Ｆｍｏｃ保護基が表面から完全に除去されたことを示す追加の証明の提供と
なる。
【００５３】 段階（７）。アレイ組み立ての最終段階において、ω−修飾されたアルカンチ
オールバックグラウンドが化合物と反応して、タンパク質の非特異的結合に抵抗
性のあるバックグラウンドを合成する。この目的のための好ましい化合物は、Ｐ
ＥＧ−ＮＨＳであるが、選択的にω−修飾されたアルカンチオール表面に結合し
、非選択的タンパク質結合を阻害する任意の化合物を使用することができる。ア
レイ表面に結合している生物分子若しくは細胞に対するタンパク質の結合の効率
的なモニターのために、アレイのバックグラウンドがタンパク質分子の非特異的
吸着を禁止ことが重要である。著しい量のそのような非特異的結合は、特定のア
レイ位置で結合する蛋白質の小量の測定を不明瞭にする。
【００５４】 タンパク質の非特異的結合に抵抗するバックグラウンドを合成するために、図
２、参照番号（７）で示されるようにＭＵＡＭ表面がＰＥＧ−ＮＨＳと反応した
。Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ＋ＭＵＡＭ反応の場合のように、ＰＥＧ−ＮＨＳは、ＭＵＡ
Ｍの末端アミングループと反応してアミド結合を形成し、ＰＥＧポリマー鎖が共
有結合的に表面に付加する。好ましいＰＥＧ−ＮＨＳポリマーは２０００の平均
分子量で、１つの分子に対して１つのＮＨＳエステル部位を有し、一点での付加
を可能にする。ＰＥＧ−ＮＨＳと反応したＭＵＡＭ表面のスペクトルを集めたも
のが、図３のプロット（Ｄ）にて示されている。１６６０ｃｍ−１及び１５７６
ｃｍ−１にて現れるピークは、それぞれ、アミドＩ及びＩＩのバンドに当てはま
る。１４５７ｃｍ−１及び１２５０−１２６０ｃｍ−１のバンドは、ＭＵＡＭア
ルキル鎖とエチレングリコール（ＥＧ）基の両者を含むＣＨ２基の切除及びねじ
れた変形に帰着する。１３５２ｃｍ−１のバンドは、ＥＧ ＣＨ２基の縦ゆれモ
ード（ｗａｇｇｉｎｇ ｍｏｄｅ）により、１１４８ｃｍ−１のバンドの中心は
、エチレングリコールユニットのＣ−Ｏ−Ｃ（エーテル）伸縮による。ＰＥＧ−
ＮＨＳでの脱保護された表面の反応後、表面は親水性を維持し、３７．３°±２
．６°の接触角度を測定する。２３．８ű０．８Åの全厚みが、ＰＥＧ−ＮＨ
Ｓでの反応後のＭＵＡＭ単一層フィルムにおいて測定された。ＰＥＧの唯一６Å
の増加が、ＭＵＡＭのアミングループのほんのわずかな部分を修飾し、オリゴ（
エチレングリコール）鎖が表面に水平に横たわっていることを示唆している。
【００５５】 ＳＰＲ画像化実験（実施例２及び図７を参考）が二重構成表面（Ｃ１８−チオ
ール／ＭＵＡＭ＋ＰＥＧ）に対するＢＳＡの非特異的吸着を測定するために使用
され、ＭＵＡＭ＋ＰＥＧが効果的にタンパク質の非特異的吸着に対して抵抗性が
あることをはっきりと明らかに示された。
【００５６】 実施例 すべての実施例における標準工程： ＰＭ−ＦＴＩＲにおいて使用される金の基板及び接触角度測定器は購入され（
Ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｆｉｌｍｓ）、走査若しくは画像化ＳＰＲ
装置にて使用されるものは、Ｇｏｓｓ ｅｔ ａｌ （１９９１） Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ． ６８：８５−８８によって報告されているのと類似の方法である
（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ）によってシ
ラン化（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ）することによる顕微鏡のスライドカバーへの蒸気
沈着によって調製された。
【００５７】 すべてのオリゴヌクレオチドは、ウィスコンシン大学のバイオテクノロジーセ
ンターにおいてＡＢＩ社（Ｆｏｓｔｅｒ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＤＮＡ合
成機を用いて合成された。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，
Ｖｉｒｇｉｎｉａ）の“５´−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６”及びＡ
ＢＩ社の“６−ＦＡＭ”が、５´末端へのチオール修飾及び５´末端へのフルオ
レセイン修飾したオリゴヌクレオチドにそれぞれ使用され、“Ｓｐａｃｅｒ Ｐ
ｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ １８”（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が、エ
チレングリコールスペーサー領域への付加に使用された。チオール修飾されたオ
リゴヌクレオチドが、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の製品添付文書にしたがっ
て脱保護された。（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ． （１９９０）
“ＤＮＡの修飾及び標識のためのユーザーガイド”）。使用前に、各々のオリゴ
ヌクレオチドが、逆層バイナリー勾配溶出ＨＰＬＣ（島津製作所（Ｃｏｌｕｍｂ
ｉａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）“ＳＣＬ−１０ＡＶＰ”）にて精製され、ＤＮＡの
濃度がＨＰ８４５２ＡＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒ
ｄ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて確定された。
【００５８】 実施例１のＳＳＢ実験にて使用されたＤＮＡ分子の配列は、下記である： Ｄ１＝５´ＨＳ（ＣＨ２）６（Ｔ）１６ＡＣＣＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡ（
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１） Ｄ２＝５´ＨＳ（ＣＨ２）６（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２４ＧＣＴＴＡＴＣＧＡＧＣ
ＴＴＴＣＧ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２） Ｄ２の相補鎖＝５´ＦＡＭ−ＣＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＡＡＧＣ（ＳＥＱ．Ｉ
Ｄ．ＮＯ：３） ＳＰＲ画像化実験のＢＳＡ及びＳＳＢにおいて使用したバッファーは、２０ｍ
Ｍリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ，
及び５ｍＭ塩化マグネシウムを含み、ｐＨ７．４に調製された。
【００５９】 アレイ組み立ての複数段階：きれいな金の基板が、吸着及びアミノアルカンチ
オール単一層の自己アセンブリを可能にするために、ＭＵＡＭの１ｍＭエタノー
ル溶液に、少なくとも１時間浸される。基板が、エタノールと水で洗浄され、窒
素蒸気の下で乾燥され、次いでＦｍｏｃ−ＮＨＳ溶液（ＤＭＳＯと１００ｍＭ
ＴＥＡバッファーが１対１の比率でｐＨ７）にて反応させた。サンプルは、表面
から未反応のＦｍｏｃ−ＮＨＳを除去するためにＤＭＳＯに簡単に染み込ませ、
次いで、水銀−キセノンアークランプ（ｍｅｒｃｕｒｙ−ｘｅｎｏｎ ａｒｃ
ｌａｍｐ）からのクオーツマスクを通した紫外線光をサンプルに照射することに
よってサンプルをフォトパターン化した。結果的に、エタノールと水によるサン
プルの洗浄が、浸された表面からアルカンチオールを取り除いた。サンプルが、
再度エタノールＭＵＡＭ溶液に浸され、結果としてアレイのＭＵＡＭ要素が疎水
性のＭＵＡＭ＋Ｆｍｏｃバックグラウンドによって囲まれた。次いで、一本鎖で
、５´末端がチオール修飾されたＤＮＡは従来使用されていた方法がわずかに修
飾された付加スキームを用いてアレイ部位に固定された。要約すると、アミンで
末端化されたＭＵＡＭアレイ要素が、ヘテロな２官能リンカーであるＳＳＭＣＣ
の１ｍＭ溶液（１００ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ７）の０．１μＬでスポットされ、チ
オール活性で、マレイミドが末端化された表面を合成する。５´末端にチオール
修飾されたＤＮＡ配列は、次いで、特定のアレイ部分へ１ｍＭ ＤＮＡを含む溶
液の０．１μＬ粒を伴うサンプルを滴下し、溶媒の蒸発を防ぐために湿った環境
下において少なくとも２時間反応によって、それらのマレイミドが末端化された
アレイの要素に共有結合して付加された。ＤＮＡ溶液へ浸した後、未結合のＤＮ
Ａ配列を除去するために、表面が水によって洗浄してバッファーに染み込ませた
。次いで、アレイをＤＭＦ中のＴＡＥＡの１Ｍ溶液に１０分間、浸すことによっ
てＦｍｏｃがバックグラウンドから除去された。脱保護された表面が水で洗浄さ
れ、結果としてアレイのバックグラウンドをペギレート（ｐｅｇｙｌａｔｅ）す
るために４ｍＭのＰＥＧ−ＮＨＳ（１００ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ８）で反応させ、
タンパク質の非特異的結合に対して抵抗性を与える。
【００６０】 ＰＭ−ＦＴ−ＩＲＲＡＳ測定：ＰＭ−ＦＴ−ＩＲＲＡＳスペクトルが、狭いバ
ンドのＨｇＣｄＴｅ検出部（中間赤外線領域のスペクトル、２０００−１０００
ｃｍ−１）若しくはＩｎＳｂ検出部（ＣＨ伸縮領域のスペクトル、３４００−２
６００ｃｍ−１）を装備するＭａｔｔｓｏｎ ＲＳ−１分光計で集光された。光
学的体裁及び従来から発展したリアルタイムインターフェログラムサンプリング
方法（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｇｒａｍ ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ）が記載されているので、ここにおいて詳しく述べる必要はない。
ＰＭ−ＦＴ−ＩＲＲＡＳの差異の反射率値（％Ｒ／Ｒ）が、従来のＩＲＲＡＳデ
ータとの比較のために吸着ユニットに変換される。スペクトルは、２ｃｍ−１の
分離度において集められた平均１０００の走査である。
【００６１】 接触角度測定：水の接触角度が標準で既知の手順によって実験室の常温にて測
定された。表面上に１０μＬの小滴がＧｉｌｓｏｎピペットによって分注されて
、角度の測定が直ちに記録された。Ｆｍｏｃ及びＰＥＧの機能性のある表面にお
ける記録された接触角度値は、４つの個々に調製されたサンプルにおいて測定さ
れた１２の異なる測定値の平均で、ＭＵＡＭにおける値は、１０の異なるサンプ
ルにおいて測定された３０の測定値の平均である。
【００６２】 走査する角度のＳＰＲ測定：ｅｘ−ｓｉｔｕの光学的な技術の走査するＳＰＲ
は、４７５Åの金が蒸気沈着したＢＫ７カバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）にアセ
ンブルされたＭＵＡＭ，ＭＵＡＭ＋Ｆｍｏｃ、及びＭＵＡＭ＋ＰＥＧの厚さ（前
述にて報告されている）を決定するために使用された。ＳＰＲ実験の詳細及び厚
さの計算は、いずれかにおいて報告されている。概略すると、サンプルアセンブ
リ（ＢＫ７プリズム／金／薄いフィルム／空気）からのｐ−極性化されたＨｅＮ
ｅレーザー光線（６３２．８ｎｍ）の反射率（Ｒ）がＳＰＲ曲線（％Ｒ対角度）
を合成するための入射角度の機能としてモニターされた。反射率における急激な
低下が、重要角度（〜４４）をちょうど過ぎてから起こる。最低限の正しい位置
が、金の表面において吸着された物質の厚さ及び屈折率によって決定される。４
層複合フレネルの計算（４−ｐｈａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｒｅｓｎｅｌ ｃ
ａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）が、ここで測定される全ての薄いフィルムで推測される
１．４５のフィルムの厚さ及び屈折率を決定するために使用される。
【００６３】 ＳＰＲ画像化装置：Ｉｎ ｓｉｔｕのＳＰＲ画像化装置が前述の形式に修飾さ
れて、Ｊｏｒｄａｎ ＆ Ｃｏｒｎ （１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．
６９（７）： １４４９−１４５６； Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７
） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９：４９４８−４９５６； Ｊｏｒｄａｎ ｅ
ｔ ａｌ． （１９９７） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６９（２４）：４９３９
−４９４７； Ｆｒｕｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， ｓｕｐｒａ，
を参考、ＨｅＮｅレーザー及び光線の増幅器がコリメート化した（ｃｏｌｌｉｍ
ａｔｅｄ）白色光源／バンドパスフィルターの組み合わせに取って代わった。近
赤外線（ＮＩＲ）ＳＰＲ画像化の内容におけるこの修飾のより徹底した議論が調
製段階においていずれかに報告されている。Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９
９９）を参考。要約すると、コリメート化した光の多色光線が、ＳＰＲ角度に近
い固定された入射角度においてＳＦ１０プリズム／金／薄いフィルム／バッファ
ーアセンブリを明るくするために使用された。反射光が１０ｎｍのバンドパスフ
ィルター（８３０ｎｍ）を通過して、安価なＣＣＤカメラにて集光された。サン
プルにおける様々な位置において測定された反射光強度の違いが画像を合成し、
金の表面における物質結合の厚さ若しくは屈折率における違いの直接的な結果で
ある。図６に示されている画像は、４５０Åの金が沈着したＳＦ１０基板でサン
プルを構成するための集められたｉｎ ｓｉｔｕである。ＮＩＨ画像化バージョ
ン１．６１ソフトウェアを用いてデータの構築が行われた。
【００６４】 実施例１：一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ配列のアレイに対する一本鎖ＤＮＡ結合タ
ンパク質の結合のＳＰＲ画像化測定： 核酸アレイがタンパク質と核酸の結合をモニターするためにＳＰＲを画像化す
る連結において使用できることを論証するために、一本鎖ＤＮＡ（Ｄ１、ＳＥＱ
．ＩＤ．ＮＯ：１）及び二本鎖ＤＮＡ（Ｄ２及びＤ２に対して相補鎖、ＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯＳ．２及び３の各々）を含むチェッカーボード表面が上記に記載され
た方法によって構築された。次いで、アレイ表面への一本鎖ＤＮＡ結合タンパク
質であるＳＳＢの結合がＳＰＲによってモニターされた。その名前が意味するよ
うに、ＳＳＢ（全分子量が７５，０００Ｄで、４つの同等なサブユニットのテト
ラマー）は、しっかりと、選択的に、及び協力的に一本鎖ＤＮＡに結合して、Ｄ
ＮＡの複製、修復、及び組換えにおいて中心的な役割を果す。図６は、表面のＳ
ＳＢへの露出の直前と直後に集積された２つの画像の違いを示している。画像上
で浮きあがっているエリアは、表面に対するタンパク質の吸着における％Ｒ変化
の測定である。タンパク質が結合するアレイの位置は、一本鎖ＤＮＡ配列で修飾
された領域と対応する。
【００６５】 図５は、実験中に集められた画像から得られる様々なラインプロファイルを示
している。量的情報量を提供するそれらの“ラインプロファイル”が、画像を横
切って引かれた選択された長方形領域におけるピクセルの各々のカラムにおいて
測定された％Ｒ値を平均し、カラムの側面位置に対する平均値をプロットするこ
とによって構築された。実線は、２本の５´末端にチオールが修飾された一本鎖
ＤＮＡ配列であるＤ１及びＤ２が、アレイ表面上のチェッカーボードパターンに
固定されている開始時の表面を示している。その２つのＤＮＡプローブ鎖の配列
は、上記に記載されている。各々の配列が５´−チオール修飾、スペーサー領域
、及び１６塩基長の可変配列を含んでいる。可変領域がＤＮＡ計算，Ｆｒｕｔｏ
ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ｓｕｐｒａ，の目的のために発達したライブ
ラリーから特定的に選択され、それらの可変領域とその相補鎖は、クロスハイブ
リダイゼーションを示さない。ステアリンの障害がハイブリダイゼーションの吸
着工程を妨げないように、ＤＮＡを十分に表面から遠ざけて位置するために、ス
ペーサー領域が組み込まれる。１５Ｔのスペーサー領域がＤ１に使用されたが、
配列Ｄ２は同じ長さのＥＧスペーサーを代わりに含んだ。ＳＳＢがポリＴ配列に
強固に結合すると知られている事実を与えられて、この配列が必要性であった。
ダッシュ線は、Ｄ２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）に対して１６塩基長の相補鎖を
含む溶液に表面をｉｎ ｓｉｔｕで浸した効果を示している。Ｄ２の場所におい
て発生した％Ｒの測定可能な変化は、相補的な配列のハイブリダイゼーションの
吸着が発生したことを示唆し、Ｄ１の場所におけるシグナルの上昇は見られない
。点線は、ＳＳＢの２００ｎＭ溶液に浸した後の表面を示している。予期したよ
うに、タンパク質が一本鎖のアレイの位置に強固に結合しただけでなく、二本鎖
の配列を含む位置にもわずかに結合した。ＳＳＢは二本鎖ＤＮＡには結合しない
ため、Ｄ２位置におけるシグナルの増加は、不完全なハイブリダイゼーションの
結果として、その位置において存在する一本鎖ＤＮＡに対するＳＳＢの結合に起
因すると考えられる。アレイのバックグラウンドが相補的ＤＮＡ分子と一本鎖結
合タンパク質の両者の非特異的結合に対して成功裡に抵抗性を備え、高いバック
グラウンドのシグナルの干渉なしに％Ｒにおけるわずかな変化の測定を可能にす
ることは、注意すべき重要なことである。
【００６６】 この実施例は核酸−タンパク質相互作用を調査するために使用することができ
る本発明によるアレイの組み立てを示している。
【００６７】 実施例２：ＰＥＧで阻害する非特異的タンパク質結合の論証： ここにおいて、Ｃ１８アルカンチオールのアレイのスポットが、上記に記載の
技術を用いてＭＵＡＭ＋ＰＥＧバックグラウンド上にアセンブルされた。次いで
、アレイがＢＳＡに対して浸され、実施例１にて記述しているように、反射率が
測定された。結果が、図７に示されている。図７において、実線がＢＳＡに露出
する前のアレイの反射率を示し、ダッシュの線がＢＳＡに浸された後の存在反射
率を示す。
【００６８】 いくらかのＢＳＡがＭＵＡＭ＋ＰＥＧバックグラウンドに吸着するため、非常
に多量のＢＳＡが未処理のＣ１８スポットに吸着する。それゆえ、この実施例は
ＰＥＧがバックグラウンド表面に対するタンパク質の非特異的結合を阻害するた
めに使用することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明による複数要素のＤＮＡアレイを構築するための組み立てスキ
ームの概要の説明である。きれいな金の表面がアミン末端化アルカンチオールと
反応し、結果として疎水性表面を合成するために保護基と反応する。この表面は
、次いで、クオーツマスクを通してＵＶ照射に露光され、表面の特定エリアから
アルカンチオール＋保護基を除去するために溶剤で洗浄され、露出した金のパッ
ドを残す。サンプル表面上のそれらの露出した金のエリアは、アルカンチオール
で満たされ、結果として疎水性保護基のバックグラウンドに囲まれたアルカンチ
オールパッドのアレイとなる。核酸溶液は、次いでピペットによって、特定のア
レイ部位まで運ばれ、２官能リンカーを介して表面と共有結合する。最後の２段
階において、アレイのバックグラウンドの保護基は除去され、バックグラウンド
への分析物タンパク質の非特異性の結合を禁止する官能基と入れ替わる。
【図２】 図２は、アレイのバックグラウンドの可逆的修飾において含まれる表面反応の
スキームを示す段階を描いている。開始時のアミン末端化アルカンチオール表面
は、Ｆｍｏｃ−ＮＨＳ保護基と反応し、カルバメート結合を形成して、疎水性Ｆ
ｍｏｃ末端化表面を合成する。核酸の固定後、表面は脱保護され、結果として、
元のアルカンチオール表面に戻る。最後のアレイの組み立て段階において、脱保
護されたアルカンチオール表面は、ＰＥＧ−ＮＨＳと反応して（バックグラウン
ドへの分析物タンパク質の非特異性の結合を防ぐ）アレイの表面にＰＥＧが共有
結合で付加するアミド結合を形成する。
【図３】 図３は、アレイのバックグラウンドの修飾に含まれる表面における中間赤外線
領域のＰＭ−ＦＴＩＲＲＡＳスペクトルを描写する。（Ａ）開始時のＭＵＡＭ表
面。（Ｂ）Ｆｍｏｃ−ＮＨＳとの反応後、カルバメート結合及びＦｍｏｃ環伸縮
（ｒｉｎｇ ｓｔｒｅｔｃｈ）を示すバンドは、スペクトルに現われる。（Ｃ）
表面が脱保護され、ＡとＣのスペクトルの類似性によって証明されるように、Ｍ
ＵＡＭ表面に戻る。（Ｄ）ＰＥＧ−ＮＨＳとの反応後、それらと同様にアミド結
合もエチレングリコール基と関連した示されるバンドが現れる。
【図４】 図４は、ＤＮＡの場合において、アレイの部位の固定化している生物分子を含
む表面反応スキームを示す段階を描写する。ＳＳＭＣＣのような２官能リンカー
が、チオール修飾されたＤＮＡとＭＵＡＭパッドを結合するために使用される。
【図５】 図５は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びオリゴヌクレオチド配列
Ｄ１とＤ２を含む二重化合物ＤＮＡアレイ上への一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（
ＳＳＢ）の吸着にて示される一連のスペクトル線の形状を描写する。実線は、交
互になっているＤＮＡプローブのスポットＤ１及びＤ２からなる開始時表面にて
測定された反射率である。ダッシュ線は、表面をＤ２に対する相補物を含む溶液
に浸した後に測定した％Ｒである。明白なのは相補的ＤＮＡ配列の結合上の位置
Ｄ２の％Ｒの増加である。点とダッシュの線は、表面をＳＳＢの２００ｎＭ溶液
に浸した後の測定した％Ｒである。測定可能な結合がアレイのＤ２位置（二本鎖
ＤＮＡを含んでいる）にて発生している間、タンパク質は明らかに一本鎖配列Ｄ
１により十分に結合する。
【図６】 図６は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が一本及び二本鎖オリゴヌク
レオチド配列のチェッカーボードアレイに結合していることを示しているｉｎ
ｓｉｔｕでのＳＰＲ相違画像を描写する。ＳＳＢに対する表面の露出の前後にお
いて直ちに集積された画像は、示された画像を合成するために引き抜かれた。一
本鎖ＤＮＡと共有結合をしているアレイの位置へのタンパク質の重要な結合が起
こる一方で、二本鎖ＤＮＡ配列を含むアレイ位置での結合はほとんど起こらない
。
【図７】 図７は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がパターン化されたＣ１８／ＭＵＡＭ
＋ＰＥＧ表面へのｉｎ ｓｉｔｕでの吸着を示す一連のスペクトル線の形状を描
写する。実線は、ペギレート化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）したＭＵＡＭバックグラ
ウンドによって囲まれるＣ１８の３５０ｎｍのアレイ表面にて測定された％Ｒで
ある。点線は、表面を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液への露出後に測定された％Ｒで
ある。ＭＵＡＭ−ＰＥＧ領域におけるほとんど低い％Ｒの変化は、ペギレート化
したバックグラウンドが、ＢＳＡの非特異的結合の抵抗においてＣ１８よりも効
率性が非常に高いことを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フルートス，アンソニー ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92705 サンタ・アナ サンドハースト・ プレイス 13521 (72)発明者 ブロックマン，ジェニファー エム アメリカ合衆国 コネティカット州 06340 グロトン メリディアン・ストリ ート・エクステンション 600 アパート メント 1427 Ｆターム(参考） 4B024 AA19 GA01 GA11 HA11 4B029 AA07 AA23 CC03 CC08 FA15

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）金属基板上にω−修飾されたアルカンチオール単一層
    が沈着することと； （ｂ）疎水的な保護基が前記単一層と反応することと； （ｃ）露出された金属基板のアレイを合成するために前記単一層を配列化するこ
    とと； （ｄ）露出された金属基板の部分にω−修飾されたアルカンチオールが沈着し、
    該部分において脱保護されてω−修飾されたアルカンチオールのスポットである
    個別のアレイを産することと； （ｅ）脱保護されてω−修飾されたアルカンチオールのスポットである前記個別
    の部分に生物分子若しくは細胞が付加し、該部分において生物分子若しくは細胞
    が固定された個別のスポットのアレイを産することと； （ｆ）前記（ｂ）段階の保護基を除去することと；及び （ｇ）非特異的なタンパク質の結合に対して抵抗性を有する単一層を製造するこ
    と からなる前記金属基板上に生物分子若しくは細胞アレイを製造する方法。
  2. 【請求項２】 前記段階（ａ）において、アミノ−Ｃ８−Ｃ２４−アルカン
    チオールが前記金属基板に沈着する特徴を有する請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記段階（ａ）において、ＭＵＡＭが前記金属基板に沈着す
    る特徴を有する請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 前記段階（ｂ）において、Ｆｍｏｃが単一層と反応される特
    徴を有する請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 前記段階（ｃ）において、前記単一層が紫外線照射への選択
    的な露光によってパターン化される特徴を有する請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 前記段階（ｄ）において、露出した金属基板の前記部分にお
    いてＭＵＡＭが沈着される特徴を有する請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 前記段階（ｅ）において、核酸分子が、２官能リンカーを用
    い、個別の脱保護してω−修飾されたアルカンチオールのスポットに付加される
    特徴を有する請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 前記段階（ｅ）において、ＤＮＡ分子が、個別の脱保護して
    ω−修飾されたアルカンチオールのスポットに付加される特徴を有する請求項１
    の方法。
  9. 【請求項９】 前記段階（ｅ）において、ＲＮＡ分子が、個別の脱保護して
    ω−修飾されたアルカンチオールのスポットに付加される特徴を有する請求項１
    の方法。
  10. 【請求項１０】 前記段階（ｅ）において、ヘテロな２官能リンカーが使用
    される特徴を有する請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 前記段階（ｅ）において、ＳＳＭＣＣがリンカーとして使
    用される特徴を有する請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 前記段階（ｆ）において、２次アミンを伴う前記単一層の
    処理によって前記保護基が除去される特徴を有する請求項１の方法。
  13. 【請求項１３】 前記段階（ｆ）において、ＴＡＥＡ、エタノールアミン、
    及びピペリジンからなるグループから選択される溶液の処理によって前記保護基
    が除去される特徴を有する請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 前記段階（ｇ）において、前記単一層が、ＰＥＧ部分を該
    単一層に付加することによって非特異的タンパク質の結合に対して抵抗させる特
    徴を有する請求項１の方法。
  15. 【請求項１５】 前記段階（ａ）において、ω−修飾アルカンチオールの単
    一層が金の基板上に沈着している特徴を有する請求項１の方法。
  16. 【請求項１６】 前記段階（ａ）において、アミノ−Ｃ８−Ｃ２４−アルカ
    ンチオールが前記金の基板上に沈着する特徴を有する請求項１５の方法。
  17. 【請求項１７】 前記段階（ａ）において、ＭＵＡＭが前記金の基板上に沈
    着する特徴を有する請求項１５の方法。
  18. 【請求項１８】 前記段階（ｂ）において、Ｆｍｏｃが前記単一層と反応さ
    れる特徴を有する請求項１５の方法。
  19. 【請求項１９】 前記段階（ｃ）において、前記単一層が紫外線照射への選
    択的な露光によってパターン化される特徴を有する請求項１５の方法。
  20. 【請求項２０】 前記段階（ｄ）において、露出した金の基板の前記部分に
    おいてＭＵＡＭが沈着される特徴を有する請求項１５の方法。
  21. 【請求項２１】 前記段階（ｅ）において、核酸分子が、２官能リンカーを
    用い、個別の脱保護してω−修飾されたアルカンチオールのスポットに付加され
    る特徴を有する請求項１５の方法。
  22. 【請求項２２】 前記段階（ｅ）において、ヘテロな２官能リンカーが使用
    される特徴を有する請求項１５の方法。
  23. 【請求項２３】 前記段階（ｅ）において、ＳＳＭＣＣがリンカーとして使
    用される特徴を有する請求項２２の方法。
  24. 【請求項２４】 前記段階（ｆ）において、２次アミンを伴う前記単一層の
    処理によって前記保護基が除去される特徴を有する請求項１５の方法。
  25. 【請求項２５】 前記段階（ｇ）において、前記単一層が、ＰＥＧ部分を該
    単一層に付加することによって非特異的タンパク質の結合に対して抵抗させる特
    徴を有する請求項１５の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１を参照した方法により合成したアレイであって、
    金属基板上の生物分子若しくは細胞のアレイ。
  27. 【請求項２７】 請求項１５を参照した方法により合成したアレイであって
    、金の基板上の生物分子若しくは細胞のアレイ。
  28. 【請求項２８】 ω−修飾されて、アルカンチオールが塗布された金属基板
    上に共有結合した多数の個別の生物分子若しくは細胞のスポットからなるアレイ
    であって、非特異的なタンパク質結合に対して抵抗性のあるバックグラウンドの
    物質によって個別のスポットがお互いに分離している金属基板上の生物分子若し
    くは細胞のアレイ。
  29. 【請求項２９】 前記スポットがＤＮＡスポットである特徴を有する請求項
    ２８のアレイ。
  30. 【請求項３０】 前記スポットがＲＮＡスポットである特徴を有する請求項
    ２８のアレイ。
  31. 【請求項３１】 前記バックグラウンド物質がＰＥＧの部分からなる特徴を
    有する請求項２８のアレイ。
  32. 【請求項３２】 各々の生物分子若しくは細胞のスポットとω−修飾されて
    アルカンチオールが塗布された金属基板との間に挿入した２官能リンカーからな
    る特徴を有する請求項２８のアレイ。
  33. 【請求項３３】 前記金属基板が金である特徴を有する請求項２８のアレイ
    。
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