JP7205973B2 - 表面プラズモン共鳴アッセイのためのセンサー表面 - Google Patents
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Description
表面を、少なくとも1種類の官能性基を有する1種以上のチオールC10-C30アルカン反応剤と反応させることによって、前記センサー表面上に自己組織化単分子層(SAM)を形成させることを含み、
1種以上のタンパク質抵抗性化合物が、前記官能性基の第一画分に結合され;
1種以上の捕捉用分子が、直接、又は前記タンパク質抵抗性化合物ではないリンカーを介して、前記センサー表面上の前記官能性基の第2画分に結合され、
ここで、前記捕捉用分子は、前記タンパク質抵抗性化合物には全く結合されない、方法を提供する。リガンドを固定化するための官能性基は、SAM上でのみ利用可能であり、タンパク質抵抗性化合物/マトリックス上では利用可能ではない。
センサー表面(チップ表面)上のCOOH基へのリガンドの固定化を可能にするさまざまなカップリング(結合)化学が数多く存在する。最も一般的な方法は、アミンカップリングを使用することであり、これにより、チップ表面上のカルボキシル基が、タンパク質(リガンド)の第一級アミン基との共有アミド結合に使用される。しかし、このプロセスは自発的には起こらず、カルボキシル基を活性化する必要がある。活性化は、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と、N-ヒドロキシ-コハク酸イミド(NHS)との混合物を用いて行われる。EDCは、カルボキシル基と反応し、反応性中間体を形成し、次にそれがNHSと反応して、活性NHSエステルを形成する。リガンドがセンサーチップ表面上を通過すると、(良好な脱離基である)このNHS部分が、リガンド上の第一級アミン基と自発的に反応し、リガンドとチップ表面との間の共有結合が形成される。ほとんどのタンパク質にはいくつかの第一級アミンを有しているため、リガンドの生物活性に深刻な影響を与えることなく固定化を達成することができる。
リガンドを固定化した後、過剰なNHS活性化カルボキシル基を、例えば、残留NHSエステルを除去するエタノールアミン又はNaOHを用いて不活性化して、アナライトの注入の間にタンパク質が表面にそれ以上全く固定化されないようにする。このプロセスは、正に帯電した表面及び負に帯電したリガンドを用いて実行することもできる。
この例では、図1を参照する。
金表面を有するガラスチップを含む基材を、25℃にて1mMのMHAを含む80%/20%のエタノール/水に浸漬し、一晩インキュベートした。金のチップを、以下の溶液:100%エタノール、80%エタノール、50%エタノール、20%エタノール、100%水で各5分間、前述した順序で洗浄した。
実施例1のチップを、プラスチック製のキャリア及びフードで組み立てた。その後、制御ソフトウェアの製造元の指示に従って、チップをBiacore 3000に装着した。SAM上のカルボキシル基を、30秒間、60秒間、90秒間、及び180秒間の間、水中の200mMのEDC及び50mMのNHSの混合液を用いて装置内で活性化した。
実施例1のチップを、プラスチック製のキャリア及びフードを用いて組み立てた。チップを、制御ソフトウェアの指示に従って、Biacore(登録商標)8Kに装着した。SAM上のカルボキシル基を、水中の200mMのEDC及び50mMのNHSの混合液を用いて30秒間、装置内で活性化した。
Claims (14)
- SPR(表面プラズモン共鳴)装置のためのセンサー表面を調製する方法であって、
センサー表面を、少なくとも1種類の官能性基を有する1種以上のチオールC10-C30アルカン反応剤と反応させることによって、前記センサー表面上に自己組織化単分子層(SAM)を形成させることを含み、
1種以上のタンパク質抵抗性化合物が、前記官能性基の第1画分に結合され;次いで、
1種以上の捕捉用分子が、直接、又は前記タンパク質抵抗性化合物ではないリンカーを介して、前記センサー表面上の前記官能性基の第2画分に結合され、
ここで、
前記捕捉用分子は、前記タンパク質抵抗性化合物には全く結合されず、
前記捕捉用分子は、タンパク質(リガンド)である、方法。 - 前記官能性基の第2画分は、前記官能性基の第1画分を介してタンパク質抵抗性化合物が結合された後に前記センサー表面上に残る前記官能性基に含まれ、前記官能性基の第1画分及び第2画分は、同じ種類であるか又は異なる種類である、請求項1に記載の方法。
- 前記センサー表面が、金又は銀でメッキされた表面である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記チオールC10-C30アルカン反応剤の前記官能性基が、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、ビニル基、カルボニル基、又はチオール基の1種以上である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記チオールC10-C30アルカン反応剤が、MHA(メルカプトヘキサデカン酸)又はその誘導体である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質抵抗性化合物が、ポリエチレングリコール又はその誘導体から選択される親水性ポリマーである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質抵抗性化合物が、分子量(Mw)2000~10000のポリエチレングリコール(PEG)である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記官能性基の第2画分は、捕捉用分子(リガンド)の結合前に活性化され、結合した捕捉用分子(リガンド)の量は、その活性化時間の長さに反比例し、かつ、
その活性化反応剤が、EDC/NHS、エピクロルヒドリン、又は二官能性反応剤から選択される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1~8のいずれか一項に記載の方法によって調製されたセンサー表面を使用してSPRアッセイを行う方法であって、
センサー表面上の捕捉用分子(リガンド)と相互作用する可能性のあるアナライトを添加する工程と、
速度論的アッセイ及び/又は濃度アッセイを実行する工程と
を含む、方法。 - SPR(表面プラズモン共鳴)装置のためのセンサー表面であって、
その上に利用可能な官能性基を有する自己組織化単分子層(SAM)を備えた基材を含み、
タンパク質抵抗性化合物が、前記官能性基の第1画分に結合しており、
捕捉用分子(リガンド)が、前記センサー表面上の前記官能性基の第2画分に結合しており、
ここで、前記捕捉用分子(リガンド)は、前記タンパク質抵抗性化合物には全く結合しておらず、
前記自己組織化単分子層(SAM)は、少なくとも1種類の官能性基を有する1種以上のチオールC 10 -C 30 アルカン反応剤から形成されたものであり、
前記タンパク質抵抗性化合物は、第一級アミン基を有するポリエチレングリコールの誘導体であり、
前記官能性基の第一画分は、カルボキシル基であり、
前記捕捉用分子(リガンド)は、タンパク質である、センサー表面。 - 前記タンパク質抵抗性化合物及び前記捕捉用分子が、同じ種類の官能性基に結合している、請求項10に記載のセンサー表面。
- 前記タンパク質抵抗性化合物及び前記捕捉用分子が、異なる種類の官能性基に結合している、請求項10に記載のセンサー表面。
- センサー表面は金メッキ表面であり、SAMは、MHA-SAMであり、タンパク質抵抗性化合物は、第一級アミン基を有するポリエチレングリコール(PEG)の誘導体である、請求項10~12のいずれか一項に記載のセンサー表面。
- 前記タンパク質抵抗性化合物は、0.5~5mMの濃度の分子量(Mw)5000のPEGである、請求項10~13のいずれか一項に記載のセンサー表面。
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