JP2004125625A - 表面プラズモン共鳴測定用バイオチップ - Google Patents

Abstract

【課題】バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得る。
【解決手段】生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に１０分間接触させた後に、リン酸緩衝液で１０分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であるＳＰＲ測定用バイオチップ

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
表面プラズモン共鳴によって物質間の相互作用を評価できるバイオチップに関する。特には、生体分子内のＣＯＯＨ等の官能基等を利用して生体分子をバイオチップに固定化しすることにより、表面プラズモン共鳴を測定した際にバックグランドとの差が明白になるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡや蛋白質などの生体分子の機能を調べるあるいは、発現遺伝子、蛋白質を明らかにする手段として、生体分子間の相互作用を評価する試みがなされている。その一つとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による相互作用解析法が挙げられる。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を共鳴角の変化で測定する方法である。
【０００３】
ＳＰＲの利点は、相互作用分析に蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質が不要な点とリアルタイムでの測定が可能な点である。ラベル物質を物質に導入するのは非常に煩雑かつ困難な場合があり、ラベル操作により物質の本来の機能、活性が失われる場合がある。
【０００４】
ＳＰＲで相互作用を観察するには分子を金属薄膜表面に固定化する必要がある。固相に生体分子を固定化する方法として、表面に導入した官能基を起点とし、共有結合、イオン結合によって固定化する手段などが挙げられる。
【０００５】
従来の技術では基板上の一点を測定するものがほとんどであるが、文献等にあるようにＳＰＲ技術を応用したＳＰＲイメージング法によって基板表面の局在部位におけるＳＰＲ変化を検出することが可能である（例えば、非特許文献１）。すなわち、基板上の異なる場所に複数の物質を固定化すれば、複数の物質の相互作用解析が同時に可能である。
【０００６】
ＳＰＲに用いられるチップも、基板全体に官能基を導入するものがほとんどであり、生体分子を固定化していない状態では固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。そのため、ＳＰＲイメージング法に適用すると、バックグラウンド部に存在する官能基へサンプルが非特異的吸着するのを無視できない場合がある。また、微少量だけ特定の位置に生体分子溶液をスポットする技術も必須であり、高価なスポッティング装置が必要となる。
【０００７】
米国特許では、固定化部位に生体分子を固定化し、バックグラウンド部に起点となる官能基あるいは結合分子が存在しない親水性高分子を固定化したアレイを作製する手段が開示されている例えば、特許文献１）。この発明では、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化する際にはバックグラウンド部は可逆性疎水性保護基が固定化されており、スポッティングが容易である。しかし、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化したのちに塩基性有機溶媒を用いて疎水性保護基を除去し、親水性高分子を固定化する操作が必要であり、非常に煩雑かつ、塩基性有機溶媒が生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。また、親水性高分子を固定化する際に固定化した生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。具体的には親水性高分子が固定化生体分子に結合し、生体分子の機能が損なわれる点である。
【０００８】
そこで、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるバイオチップが望まれている。
【０００９】
本発明はバックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する物質が固定化され、固定化部位には固定化させるための起点となる陽性荷電をもつ官能基を有する物質が固定化されているバイオチップを得ることを可能とする。
【００１０】
【非特許文献１】
Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９７年，６９巻，１４４９−１４５６
【特許文献１】
米国特許６１２７１２９号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体の活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得ることにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
【００１３】
１．生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に１０分間接触させた後に、リン酸緩衝液で１０分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であることを特徴とするＳＰＲ測定用バイオチップ。
【００１４】
２．固定化部位に導入されている官能基がアミノ基であることを特徴とする１に記載のバイオチップ。
【００１５】
３．バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されていることを特徴とする１もしくは２記載のバイオチップ。
【００１６】
４．金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１７】
５．表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングであることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のバイオチップ
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明はＳＰＲ測定用のバイオチップであり、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化し、相互作用解析や発現遺伝子、蛋白質などのスクリーニングに有効である。本発明の特性を持つバイオチップは生体分子もしくは生物分子集合体の固定化部位と、固定化部位以外のバックグラウンド部は明確に区別されており、固定化部位には好ましくは固定化させるための起点となる陽性荷電をもつ官能基を有する物質が固定化されていることが好ましい。生体分子もしくは生物分子集合体は陽性荷電をもつ官能基を起点として、共有結合、イオン結合などによって表面に固定化することができる。この場合、陽性荷電をもつ官能基にヘテロジニアスな架橋剤を用いるとより効果的に、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に導入できる。
【００１９】
本発明のバイオチップはＳＰＲイメージングなどの基板表面を解析する方法に適しており、複数の固定化部位に複数の物質を固定化し、同時に相互作用解析することが可能である。ＳＰＲで解析できるよう、基板は透明プラスチックあるいはガラスが好ましく、その表面には金属薄膜が形成されている。金属薄膜は特に金を蒸着した表面が好ましい。
【００２０】
陽性荷電をもつ官能基はアミノ基などが挙げられ、特に限定されるものではないが、官能基を導入する方法の例として、末端に陽性荷電をもつアルカンチオール物質を金蒸着表面に直接作用させ、金−硫黄結合によって直接的に陽性荷電をもつ物質を導入する方法が考えられる。
また、そのほかの方法としては、末端に陰性荷電をもつアルカンチオール物質を金蒸着表面に直接作用させ、金−硫黄結合によって陰性荷電を導入しておき、その後、陽性電荷部位を複数持つ化合物をイオン結合によって結合させ、陽性荷電物質を間接的に表面に導入する方法なども考えられる。
またさらには、反応性基を持つチオール物質を金蒸着表面に直接作用させ、金−硫黄結合によって反応性基を導入しておき、その後、反応性基と反応可能な基を持ちかつ陽性電荷を持つ化合物を反応させ、陰性荷電物質を表面に導入する方法なども考えられる。この際のチオール物質の反応性基と陽性電荷をもつ化合物の反応可能な基としては、水酸基、アミノ基、カルボン酸基、チオール基。グリシジル基、酸無水物基、イソシアネート基、ビニル基等があり、これらを適宜組み合わせて用いる。
【００２１】
このようにして導入されたバイオチップの固定化部位表面上のアミノ基等の陽性荷電をもつ官能基は生体分子もしくは生物分子集合体と効果的に結合させることができる。生体分子もしくは生物分子集合体を結合させる方法は、特に限定するものではないが、例えば生体分子が有するＣＯＯＨ基を活性化して表面に固定化することや、スクシンイミド基を有する架橋剤を用いて、生体分子を表面に固定化することができる。
【００２２】
バックグラウンドは非特異的吸着を抑制するため非イオン性物質が固定化されることが好ましい。例えば末端に水酸基あるいはポリエチレングリコールなどの親水性高分子をもつアルカンチオールを直接金表面に固定化する方法が挙げられる。また、官能基を末端にもつアルカンチオールを導入しておき、該官能基を利用して間接的に非イオン性物質を表面に固定化する方法も挙げられる。
【００２３】
固定化部位とバックグラウンド部を分ける手段としては光照射によるパターン化技術や、スタンプ技術などが挙げられる。例えば、光を照射してパターン化する手法では、紫外線により金−硫黄結合を酸化して洗浄除去し、新たにアルカンチオールを金表面に結合させることができる。
【００２４】
バイオチップはＳＰＲ装置にセットされ、緩衝液中にて観察される。緩衝液の屈折率によってＳＰＲ共鳴角が変化するため、測定は同一の緩衝液で実施される。緩衝液を導入した段階で、撮影する角度が設定される。バイオチップがＳＰＲ共鳴を起こし、反射光強度が極小となる入射角（ＳＰＲ共鳴角）から０．５度から１度小さい角度にて測定は実施されることが好ましい。本発明のバイオチップに対して、１ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ７．４のリン酸緩衝液に溶解した分子量２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を３０℃にてチップ表面に接触させると、イオン結合によってポリ−Ｌ−グルタミン酸が固定化部位に結合し、ＳＰＲ共鳴角が広角側にシフトするため、反射光強度が増大する。ここでいうリン酸緩衝液は１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを使用する。バックグラウンド部には非イオン性物質が固定化されているため、陰性荷電をもつ高分子の吸着は少ない。
【００２５】
ＳＰＲ装置にはスライド表面の解析が可能である白色光源を用いたＳＰＲイメージング装置を使用する。スライドからの反射像はＣＣＤカメラによって撮影するＳＰＲイメージングにより、経時的に画像が取り込まれる。取り込まれた画像から高分子を接触させる前の画像の差を演算処理によって得ることができる。分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に１０分間接触させた後に、リン酸緩衝液で１０分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナル増加と、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナル増加を比較する。比較対照はポリ−Ｌ−グルタミン酸を接触させる前の画像となる。この操作によって、ポリ−Ｌ−グルタミン酸を接触させる前と、１０分間接触させ後に１０分間洗い流した後のシグナル変化を比較することができる。なお、測定は実施例に示したようなフローセルを用いるが、フローセル内の容量と流量との関係がほぼ実施例と同じになるのであれば、実施例で示した形状のフローセルでなくても良い。
固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であると、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を導入するのが容易となるため好ましい。また、このシグナル比は３以上あることがより好ましい。なお、シグナル比を得る場合、比較される固定化部位とバックグラウンド部は基板上１ｍｍ以上離れないように設定する。画像をコンピュータで解析する方法として、例えば画像処理ソフトＶ＋＋（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｏｐｔｉｃｓ社）を用いてリアルタイムでシグナル変化を捉えることができる。
【００２６】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例］
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ、同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。０．２Ｍ　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）、アミノ基末端ポリエチレングリコール分子量５０００（ｍＰＥＧ−Ａｍｉｎｅ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、ウシオ電機製１０００Ｗ高圧水銀ランプにて一時間照射してパターン化を行った。
【００２８】
フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が１００個並んだものである。照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，　Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、光を照射した部分に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。こうして作製したバイオチップは固定化部位にアミノ基をもち、バックグラウンド部に非イオン性のＰＥＧが固定化されている。
【００２９】
このバイオチップをＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、固定化部位のＳＰＲ共鳴角から１度入射角が小さい角度で観察した。観察は１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３０℃で実施した。１ｍｇ／ｍｌの分子量３０００−１５０００のポリ−Ｌ−グルタミン酸（シグマ社製）を接触させる前と接触させてから１０分、前記の緩衝液を１０分流した後の写真を連続的に５秒おきに撮影し、固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果を図１に示す。
【００３０】
固定化部位３点、バックグラウンド部３点の合計６点にて反射光強度の経時変化を求め、三箇所のシグナル比を得た。結果は５．２０、３．９３、１９．２で、平均は９．４６であり２を上回っていた。
【００３１】
なお、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液は１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用い、バイオチップとの接触はこの溶液中に３０℃で１０分間接触させ、その後、同じｐＨ７．４のリン酸緩衝液で３０℃１０分間洗い流した。バイオチップとの接触・洗浄はフローセルを用い、フローセルはＰＯＭ製で図４で示したものを用いた。具体的にはフローセルの溝部に線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのシリコンゴム製Ｏリングをセットし、さらにこの上にバイオチップを金蒸着面がフローセルと向き合うようにして重ね、フーローセル−バイオチップの間隔が２００μ程度になるようにして固定した。フローセルの注入部および排出部にチューブを接続し、緩衝液ポンプにてポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液および緩衝液を導入した。導入流量はいずれも２００μｌ／ｍｉｎで行った。
測定温度は２５℃で行った。
【００３２】
また、ポリ−Ｌ−グルタミン酸の接触前と緩衝液流入後の画像の差をとった結果を図２（概略図）に示す。色が濃くなっている部分は反射光強度が上がっていることを示す。
この画像の差の濃淡を、点線で観察したグラフを図３に示す。この図からもバックグラウンド部のシグナルと固定化部位のシグナルのシグナル比が２以上であることを察することができる。
【００３３】
［比較例］
実施例と同様の金蒸着基板を８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、全面に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、基板全体にアミノ基を導入した。この表面に実施例と同様に１ｍｇ／ｍｌの分子量３０００−１５０００のポリ−Ｌ−グルタミン酸（シグマ社製）を接触させたところ、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は基板全体に結合するため、シグナルの比は１．００となる。この場合のバイオチップは固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のＳＰＲ用バイオチップは生体分子もしくは生物分子集合体がバックグラウンド部には非特異的吸着することががほとんどなく、効率よく活性を保ったまま結合部位には吸着し、ＳＰＲを測定した際にバックグランドとの差が明白になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られた、ＳＰＲにて固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果の図
【図２】実施例でのポリ−Ｌ−グルタミン酸接触前と緩衝液流入後の画像の差をとった結果図
【図３】図２の画像の差の濃淡を点線部で観察したグラフ
【図４】実施例で用いたフローセルの上面および断面（上面図の点線部分の断面）図

Claims (5)

1. 生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に１０分間接触させた後に、リン酸緩衝液で１０分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であるＳＰＲ測定用バイオチップ
2. 固定化部位に導入されている官能基がアミノ基であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ
3. バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されていることを特徴とする請求項１もしくは２記載のバイオチップ
4. 金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
5. 表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ

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