KR20160138059A - 향상된 검정 감도를 위한 디지털 lspr - Google Patents

향상된 검정 감도를 위한 디지털 lspr Download PDF

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KR20160138059A
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KR1020167026487A
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다니엘 게리온
란돌프 스토러
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람다젠 코퍼레이션
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Abstract

분석물의 존재 검출 및/또는 분석물의 농도 결정과 관련된 시스템, 방법, 및 장치가 제공된다. 분석물은 LSPR-활성 표면 상에 제공될 수 있다. LSPR-활성 표면은 감도 향상 표지를 포함할 수 있다. 분석물은 LSPR-활성 표면 근처에서 국소 변화를 유도할 수 있다. LSPR-활성 표면은 반응이 발생하기 전, 동안 또는 후에 영상화 기기를 사용하여 영상화될 수 있다. 영상 내의 국소 관심 영역은 국소 변화를 검출하기 위해 분석될 수 있다.

Description

향상된 검정 감도를 위한 디지털 LSPR{DIGITAL LSPR FOR ENHANCED ASSAY SENSITIVITY}
교차 참조
본원은 본원에 참고로 포함된, 2014년 2월 26일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/966,576, 및 2015년 1월 28일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/108,979를 기초로 한 우선권을 주장한다.
특정 분자(예를 들어, 분석물 또는 마커)의 검출 및 정량 및/또는 분자 상호작용의 분석을 위해 설계된 계기의 정확도, 감도, 재현성, 및 사용 용이성은 생물의학 연구, 임상 진단, 환경 시험, 및 산업 공정 모니터링을 비롯한 다양한 분야에서 초미의 관심사항이다. 이들 관심사항은 예를 들어 생물의학 연구에서 관심 분자의 생산 및/또는 단리와 연관된 어려움 및 비용을 비롯한 다양한 인자 또는 의료 관리 분야에서 질환의 적절한 진단 및 치료에 대해 진단 시험 결과가 가질 수 있는 중대한 영향에 의해 촉발된다. 종종, 분자는 관심 샘플 내에 매우 낮은 농도로만 존재할 수 있고, 검출을 위해 극히 민감한 검정을 필요로 할 수 있다. 다양한 검정 절차 및 검출 기술이 존재하지만, 이들은 샘플 내에 미소량으로 존재하는 분석물을 검출하기에는 종종 불충분하다. 따라서, 검정 기기 및 계기, 특히 현장 시험 또는 의료 현장 진단 시험 적용을 위한 기기 등에 필요한 감도, 검출 한계, 정량, 및/또는 결과 획득시까지의 소요 시간의 개선에 대한 지속적인 필요성이 존재한다. 신호 증폭 및/또는 검출 기술은 상기 목적을 달성할 때 중요한 역할을 수행할 것이다.
발명의 개요
본원에서 개시되는 실시양태는 분석물의 검출 및/또는 정량을 위한 개선된 방법을 제공한다. 많은 실시양태에서, 검출 또는 정량은 광학 시스템 및 LSPR 센서의 도움을 통해 달성될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 샘플에서 분석물을 검출하는 방법이 제공된다. 이 방법은 국소(localized) 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면의 일련의 2개 이상의 영상을 캡쳐하고; 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고; 일련의 2개 이상의 영상에 걸쳐, 선택된 관심 영역 내의 색상의 변화를 측정하고; 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물을 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분석물 검출을 위한 검출 한계는 1 ng/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 분석물 검출을 위한 검출 한계는 1 pg/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 분석물 검출을 위한 검출 한계는 1 fg/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 방법은 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 색상의 변화는 대응하는 관심 영역 내의 화소의 RGB 값의 변화이다. 일부 실시양태에서, 측정된 색상의 변화는 센서 표면으로부터 반사된 광의 색상의 변화이다. 일부 실시양태에서, 각각의 선택된 관심 영역은 약 5 ㎛2 또는 그 미만의 센서 표면의 영역이다. 일부 실시양태에서, 각각의 선택된 관심 영역은 3x3 화소의 그리드이다. 일부 실시양태에서, 일련의 2개 이상의 영상은 국소 분석물-유도 변화가 발생하기 전 및 후에 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 분석물은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 1차 결합 성분, 분석물, 및 2차 결합 성분과 순차적으로 또는 동시에 접촉되고, 여기서 2차 결합 성분은 감도 향상 표지이다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하여 센서 표면 상에 침전물을 형성하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 및 형광 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유발하는 반응을 촉매한다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 금속 나노 입자와 센서 표면 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 대응하는 관심 영역은 무작위로 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 대응하는 관심 영역이 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 대응하는 관심 영역은 10개 이상의 대응하는 관심 영역이다. 일부 실시양태에서, 복수의 대응하는 관심 영역은 100개 이상의 대응하는 관심 영역이다. 일부 실시양태에서, 일련의 2개 이상의 영상의 캡쳐에 필요한 누적 시간(integration time)은 50 ms 미만이다. 일부 실시양태에서, 분석물은 샘플 내에 100 ng/mL 이하의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 샘플 내에 1 ng/mL 이하의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 샘플 내에 1 pg/mL 이하의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 방법은 방법의 결과를 포함하는 보고서를 접수하고, 보고된 결과를 기초로 하여 의료 관리 결정을 내리는 것을 추가로 포함하고, 여기서 샘플은 환자 샘플이다.
또 다른 측면에서, 샘플 내의 분석물을 검출하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면; 일련의 2개 이상의 영상을 캡쳐할 수 있는 광학 영상화 기기; 및 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고, 선택된 관심 영역 내의 색상의 변화를 측정하고, 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물을 검출할 수 있는 프로세서를 포함한다.
일부 실시양태에서, 분석물 검출을 위한 검출 한계는 1 ng/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 분석물 검출을 위한 검출 한계는 1 pg/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 분석물 검출을 위한 검출 한계는 1 fg/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 프로세서는 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 색상의 변화는 대응하는 관심 영역 내의 화소의 RGB 값의 변화이다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 불투명하고, 광을 반사한다. 일부 실시양태에서, 각각의 대응하는 관심 영역은 약 5 ㎛2 또는 그 미만의 센서 표면의 영역이다. 일부 실시양태에서, 각각의 대응하는 관심 영역은 3x3 화소의 그리드이다. 일부 실시양태에서, 일련의 2개 이상의 영상은 색상의 변화 전 및 후에 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 분석물은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 샘플 및 검정 시약을 센서 표면으로 전달하기 위한 유체 시스템을 추가로 포함하고, 여기서 검정 시약은 1차 결합 성분 및 2차 결합 성분을 포함하고, 2차 결합 성분은 감도 향상 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하여 센서 표면 상에 침전물을 형성하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 효소는 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 및 형광 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유발하는 반응을 촉매한다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 금속 나노 입자와 센서 표면 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자이다. 일부 실시양태에서, 프로세서는 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 무작위로 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세서는 복수의 대응하는 관심 영역을 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 대응하는 관심 영역은 10개 이상의 대응하는 관심 영역이다. 일부 실시양태에서, 복수의 대응하는 관심 영역은 100개 이상의 대응하는 관심 영역이다. 일부 실시양태에서, 광학 영상화 기기의 누적 시간은 50 ms 미만이다. 일부 실시양태에서, 분석물은 샘플 내에 100 ng/mL 이하의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 샘플 내에 1 ng/mL 이하의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 샘플 내에 1 pg/mL 이하의 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 환자 샘플을 포함하고, 분석물의 검출은 임상 진단 용도를 위해 사용된다.
또 다른 측면에서, 컴퓨터가 방법을 실행하도록 유도하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 방법은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면의 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고; 일련의 2개 이상의 영상에서 대응하는 관심 영역에 대한 색상을 비교함으로써 색상의 변화를 측정하고; 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물의 존재를 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 대응하는 관심 영역은 무작위로 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 관심 영역이 선택된다. 일부 실시양태에서, 색상의 변화는 대응하는 관심 영역 내의 화소의 RGB 값의 변화이다. 일부 실시양태에서, RGB 값의 변화는 측정된 다음 식에 따라 측정된다:
Figure pct00001
여기서, ΔR, ΔG, 및 ΔB는 영상 내의 적색, 녹색 및 청색 화소 값의 변화에 대응한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RGB 또는 회색톤(greyscale) 값의 변화의 분포에 대한 모멘트(moment)를 계산하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분석물에 의한 접촉에 대해 상이한 반응을 보이는 센서 표면의 영역을 상세하게 설명하기 위해 패턴 마이닝(mining) 알고리즘을 사용하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 샘플 내의 분석물의 농도를 결정하는 방법이 제공된다. 방법은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면 근처의 국소 분석물-유도 변화를 검출하고; 국소 분석물-유도 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 방법의 검출 한계는 1 fg/ml보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 분석물-유도 변화는 디지털 영상화 시스템을 사용하여 검출된다.
또 다른 측면에서, 샘플 내의 분석물의 검출 방법이 제공된다. 방법은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면의 일련의 2개 이상의 영상을 캡쳐하고; 국소 분석물-유도 변화를 검출하는 것을 포함하고, 여기서 변화는 일련의 2개 이상의 영상에서 검출가능하다.
일부 실시양태에서, 방법은 국소 분석물-유도 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화는 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 대응하는 관심 영역에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 관심 영역은 무작위로 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 관심 영역이 고려된다. 일부 실시양태에서, 대응하는 관심 영역은 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 동일한 좌표 세트(set of coordinate)를 갖는 하나 이상의 화소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 영역의 크기는 약 5 ㎛2 또는 그 미만의 센서 표면의 영역에 대응한다. 일부 실시양태에서, 분석물의 농도를 결정하기 위한 검출 한계는 1 fg/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화는 센서 표면 근처의 유전율(dielectric constant) 또는 센서 표면의 광학 특성의 변화이다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화는 센서 표면으로부터 반사된 광의 광학 특성의 변화이다. 일부 실시양태에서, 광학 특성의 변화는 광에 대한 흡수 최대점의 이동이다. 일부 실시양태에서, 센서 표면의 흡수 최대점은 센서를 이루는 물질의 유전율을 조정함으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 일련의 2개 이상의 영상은 광원, 렌즈, 거울, 필터, 광선 분할기(beam splitter), 프리즘, CCD 또는 CMOS 영상 센서를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 구성요소를 사용하여 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 일련의 2개 이상의 영상은 국소 분석물-유도 변화가 발생하기 전 및 후에 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 일련의 3개 이상의 영상은 국소 분석물-유도 변화가 발생하기 전, 동안 및 후에 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 1차 결합 성분, 분석물, 및 2차 결합 성분과 동시에 또는 순차적으로 접촉되고, 2차 결합 성분은 분석물 또는 분석물-1차 결합 성분 복합체에 결합할 수 있고, 2차 결합 성분은 감도 향상 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하여 센서 표면 상에 침전물을 형성하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 금속 나노 입자와 센서 표면 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자이다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유발하는 반응을 촉매한다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 자기 콜로이드, 또는 플라즈몬 콜로이드이다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화의 검출은 각각의 일련의 2개 이상의 영상을 복수의 관심 영역으로 나누고, 하나 이상의 관심 영역을 선택하고, 선택된 관심 영역 내의 일련의 영상에 걸쳐 RGB 및/또는 회색톤 강도 값의 변화를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RGB 및/또는 회색톤 강도 값의 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 영역은 3x3 화소의 그리드로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 영역은 무작위로 선택된다. 일부 실시양태에서, 분석물은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1차 결합 성분은 항체, 항체 단편, 앱타머, 분자 각인(molecularly imprinted) 중합체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 킬레이팅된 금속 이온, 예컨대 Ni-NTA, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 일부 실시양태에서, 2차 결합 성분은 항체, 항체 단편, 앱타머, 분자 각인 중합체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 킬레이팅된 금속 이온, 예컨대 Ni-NTA, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 귀금속, 비-귀금속, 금속, 금속-산화물, 금속-합금, 금속-도핑된 반도체, 비-금속 복합재, 또는 중합체를 포함하는 흡착된 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 흡착된 금 또는 금-캐핑된(capped) 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 중공(hollow) 또는 다공성 흡착된 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 코어/외피(shell) 구조를 갖는 흡착된 입자를 포함하고, 여기서 코어 및 외피 물질은 상이하다. 일부 실시양태에서, 입자의 직경은 약 5 nm 내지 2.5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 입자는 기계적, 진공, 또는 화학적 방법에 의해 패턴화되거나 증착된다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 금속 박막에 열을 인가하여 섬을 형성함으로써 생성된 나노 또는 마이크로-구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 석판(lithography) 및 식각(etching) 기술을 사용하여 생성된 나노 또는 마이크로-구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 나노-인쇄 기술을 사용하여 생성된 나노 또는 마이크로-구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 센서 표면의 일부에 걸쳐 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 샘플이 동시에 처리된다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 제2 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 샘플은 2개 이상의 상이한 종류의 분석물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 샘플 내의 분석물의 농도를 결정하기 위한 영상화 시스템이 제공된다. 시스템은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면; 및 국소 분석물-유도 변화를 검출할 수 있는 검출기; 및 분석물의 농도를 결정할 수 있는 프로세서를 포함하고, 여기서 검출 한계는 1 fg/ml보다 우수하다.
일부 실시양태에서, 검출기는 디지털 영상화 기기를 포함한다.
또 다른 측면에서, 샘플 내의 분석물을 검출하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면; 및 일련의 2개 이상의 영상을 캡쳐하고 일련의 2개 이상의 영상에서 국소 분석물-유도 변화를 검출하는 광학 시스템을 포함한다.
일부 실시양태에서, 광학 시스템은 일련의 2개 이상의 영상을 처리하고 국소-분석물 유도 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하기 위한 프로세서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화는 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 대응하는 관심 영역에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 관심 영역은 무작위로 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 관심 영역이 고려된다. 일부 실시양태에서, 대응하는 관심 영역은 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 동일한 좌표 세트를 갖는 하나 이상의 화소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관심 영역의 크기는 약 5 ㎛2 또는 그 미만의 센서 표면의 영역에 대응한다. 일부 실시양태에서, 분석물의 농도를 결정하기 위한 검출 한계는 1 fg/mL보다 우수하다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화는 센서 표면 근처의 유전율 또는 센서 표면의 광학 특성의 변화이다. 일부 실시양태에서, 국소 분석물-유도 변화는 센서 표면으로부터 반사된 광의 광학 특성의 변화이다. 일부 실시양태에서, 광학 특성의 변화는 광에 대한 흡수 최대점의 이동이다. 일부 실시양태에서, 센서 표면의 흡수 최대점은 센서를 이루는 물질의 유전율을 조정함으로써 변형된다. 일부 실시양태에서, 광학 시스템은 광원, 렌즈, 거울, 필터, 광선 분할기, 프리즘, CCD 및/또는 CMOS 영상 센서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일련의 2개 이상의 영상은 국소 분석물-유도 변화가 발생하기 전 및 후에 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 일련의 3개 이상의 영상은 국소 분석물-유도 변화가 발생하기 전, 동안 및 후에 캡쳐된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 샘플 및 검정 시약을 센서 표면으로 전달하기 위한 유체 시스템을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정 시약은 1차 결합 성분 및 2차 결합 성분을 포함하고, 여기서 2차 결합 성분은 감도 향상 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 1차 결합 성분, 분석물, 및 2차 결합 성분과 동시에 또는 순차적으로 접촉된다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하여 센서 표면 상에 침전물을 형성하는 효소이다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 금속 나노 입자와 센서 표면 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자이다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 및 형광 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유발하는 반응을 촉매한다. 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지는 자기 콜로이드, 또는 플라즈몬 콜로이드이다. 일부 실시양태에서, 광학 시스템은 각각의 일련의 2개 이상의 영상을 복수의 관심 영역으로 나누고, 하나 이상의 관심 영역을 선택하고, 선택된 관심 영역 내의 일련의 영상에 걸쳐 RGB 및/또는 회색톤 강도 값의 변화를 측정할 수 있는 프로세서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로세서는 측정된 RGB 및/또는 회색톤 강도 값의 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 추가로 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 영역은 3x3 화소의 그리드로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 관심 영역은 무작위로 선택된다. 일부 실시양태에서, RGB 및/또는 회색톤 강도 값의 변화 규모는 샘플 내의 분석물의 농도와 밀접한 관계가 있다. 일부 실시양태에서, 분석물은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1차 결합 성분은 항체, 항체 단편, 앱타머, 분자 각인 중합체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 킬레이팅된 금속 이온, 예컨대 Ni-NTA, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 일부 실시양태에서, 2차 결합 성분은 항체, 항체 단편, 앱타머, 분자 각인 중합체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 킬레이팅된 금속 이온, 예컨대 Ni-NTA, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 귀금속, 금속, 금속-산화물, 금속-합금, 금속-도핑된 반도체, 비-금속 복합재, 또는 중합체를 포함하는 흡착된 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 흡착된 금 또는 금-캐핑된 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 중공 또는 다공성 흡착된 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 코어/외피 구조를 갖는 흡착된 입자를 포함하고, 여기서 코어 및 외피 물질은 상이하다. 일부 실시양태에서, 입자의 직경은 약 5 nm 내지 2.5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 입자는 기계적, 진공, 또는 화학적 방법에 의해 패턴화된다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 금속 박막에 열을 인가하여 섬을 형성함으로써 생성된 나노 또는 마이크로-구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 석판 및 식각 기술을 사용하여 생성된 나노 또는 마이크로-구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 나노-인쇄 기술을 사용하여 생성된 나노 또는 마이크로-구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 센서 표면은 센서 표면의 일부에 걸쳐 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 샘플이 동시에 처리된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 적어도 제2 분석물의 농도를 결정하도록 형성되고, 여기서 샘플은 2개 이상의 상이한 종류의 분석물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 컴퓨터가 방법을 실행하도록 유도하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면의 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 영상 화소를 포함하는 관심 영역을 선택하고; 일련의 2개 이상의 영상에서 대응하는 관심 영역에 대한 RGB 또는 회색톤 값을 비교함으로써 RGB 또는 회색톤 값의 변화를 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 그에 대한 구체적인 RGB 또는 회색톤 값의 변화가 측정되는 센서 표면의 완전한 영상에서 분석 영역의 수에 대한 막대 그래프를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분석물 농도를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RGB 값의 변화는 다음 식에 따라 측정된다:
Figure pct00002
여기서, ΔR, ΔG, 및 ΔB는 영상 내의 적색, 녹색 및 청색 성분의 변화에 대응한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RGB 또는 회색톤 값의 변화의 분포에 대한 모멘트를 계산하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 분석물에 의한 접촉에 대해 상이한 반응을 보이는 센서 표면의 영역을 상세하게 설명하기 위해 패턴 마이닝 알고리즘을 사용하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 샘플 내의 분석물의 농도를 결정하는 방법이 제공된다. 방법은 영상화 시스템으로 검출된 RGB 색상 변화인, 센서 표면 근처의 분석물-유도 변화를 검출하고; 단계(a)에서 검출된 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 방법의 검출 한계는 1 fg/ml 미만이다.
참고문헌의 원용
본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 그 각각의 간행물, 특허 및 특허 출원이 참고로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 나타낸 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부되는 청구의 범위에서 상세하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부되는 도면을 참고로 하여 보다 잘 이해될 것이다:
도 1은 실시양태에 따라 LSPR 센서와 함께 사용되는 ELISA 검정 포맷을 보여준다.
도 2는 실시양태에 따라 LSPR 센서와 함께 사용되는 플라즈몬-플라즈몬 커플링 샌드위치 검정을 보여준다.
도 3의 실시양태에 따라 2개의 상이한 농도에서 항원의 고정에 의해 검정 표면으로부터 반사되는 백색광의 소광(extinction)을 보여준다.
도 4는 실시양태에 따른 디지털 LSPR의 원리를 보여준다.
도 5는 실시양태에 따른 광학 시스템을 보여준다.
도 6은 실시양태에 따라 반응(예를 들어, ELISA 반응) 후의 센서 표면에서 유도되는 광의 흡수와 상이한, 반응 전의 센서 표면에서 유도되는 광의 흡수를 보여준다.
도 7은 실시양태에 따라 반응 발생 후에 얻은 LSPR 활성 표면의 영상을 보여준다.
도 8은 실시양태에 따라 막대그래프를 사용한, 검출 한계의 측면에서 전통적인 LSPR 검정 포맷에 대한 디지털 LSPR의 개념 및 그의 우수성의 비교를 보여준다.
도 9는 실시양태에 따라 디지털 LSPR을 사용하여 여러 표면 적용범위(coverage)에서 분석물의 검출을 보여준다.
도 10은 실시양태에 따라 여러 표면 적용범위에서 전통적인 LSPR과 디지털 LSPR 사이의 비교를 보여준다.
도 11은 실시양태에 따라 다양한 벌크(bulk) 굴절률 변화에 대응하는 적색 채널 값의 변화를 보여준다.
도 12는 실시양태에 따라 다양한 벌크 굴절률 변화에 대응하는 적색 채널 값의 변화를 보여준다.
도 13은 실시양태에 따라 전통적인 LSPR(예를 들어, 분광 검출)과 디지털 LSPR(영상화) 사이의 비교를 제시하는 표이다.
도 14는 8 비트 규모(r 값: 0 내지 255)로 영상 전과 후 사이의 적색 값의 상대적인 차이를 보여주는, 도 7의 영상에 대응하는 막대그래프를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 개시내용의 방법, 기기, 및 시스템은 샘플 내의 소량으로 존재하는 분석물의 검출 및 정량을 제공한다. 본 개시내용은 샘플 내에 소량으로 존재하는 분석물의 검출 및 정량을 언급할 수 있지만, 이것은 본원에서 언급되는 방법, 기기, 및 시스템의 능력을 언급하는 것으로서 이해되어야 하고, 이에 대한 제한이 아닌 것으로 이해된다. 따라서, 본 개시내용의 방법, 기기, 및 시스템은 샘플 내에 소량, 중간량 또는 다량으로 존재하는 분석물의 검출 및/또는 정량을 위해 사용될 수 있다. 분석물은 임의의 관심 분자일 수 있다. 분석물은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온일 수 있다. 분석물 존재는 다양한 센서를 사용하여 검출될 수 있다. 이전에, 분석물 분자의 센서 표면에 대한 결합을 광학적으로 검출하기 위해 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 이용하는 센서가 연구되었다.
표면 플라즈몬은 음의 유전율과 양의 유전율 물질 사이의 계면에 존재하는 간섭성(coherent), 비편재화된(delocalized) 전자 진동이다. 예를 들어, 표면 플라즈몬은 수용액에 노출된 금속-유전체 계면, 예컨대 금속 박막에 존재할 수 있다. 표면 플라즈몬 공명은 전자 진동이 입사광에 의해 유도될 때 발생할 수 있고, 여기서 입사 광자의 진동수는 금속 내에 분포하는 양 대전 핵에 의해 야기되는 회복력에 대해 진동하는 표면 전자의 천연 진동수와 일치한다. 국소 표면 플라즈몬 공명은 적절한 진동수의 광에 의한 여기시에 작은 금속 나노 입자의 표면 또는 나노구조 표면에서 발생할 수 있다.
LSPR 센서는 계면 바로 근처의 국소 환경에 대한 표면 플라즈몬 흡수 최대점의 위치의 과도한 감도에 의존한다. 특히, LSPR 센서에서의 신호 변환 메카니즘은 종종 LSPR-활성 표면 근처의 굴절률(또는 유전율)의 변화와 연관될 수 있다. LSPR 센서에서의 신호 변환 메카니즘은 센서 표면의 광학 특성의 변화(예를 들어, 광에 대한 흡수 최대점의 이동) 또는 LSPR-활성 표면으로부터 반사된 광의 광학 특성의 변화와 연관될 수 있다. LSPR-활성 표면은 LSPR 센서 표면을 의미할 수 있다. LSPR 센서 표면이 굴절률 n1의 필름 또는 용액과 접촉하도록 배치된 후, 굴절률 n2를 갖는 물질의 표면 상에 침적되면, 플라즈몬 흡수 최대점의 파장은 값 Δλ만큼 이동한다. 플라즈몬 이동을 다음 식(1)을 통해 굴절률의 변화 Δn = n2-n1와 연결시킬 수 있다:
Figure pct00003
(1)
여기서, m은 센서의 감도를 나타내는 상수이고, L은 굴절률 n2를 갖는 침적된 물질의 두께이고, δ는 소산(evanescent) 플라즈몬 필드의 감쇠(decay) 길이이다. 흡수 최대점의 이동을 모니터링하는 것 이외에, 일부 경우 센서 표면 근처의 굴절률(또는 유전율)의 변화는 다른 광학 특성, 예를 들어, 입사광의 반사각의 변화, 투과 또는 반사된 광의 강도의 변화, 표면으로부터 반사된 광의 편광의 변화 등의 모니터링에 의해 검출될 수 있다. 이어서, 아래에서 설명되는 바와 같이 임의의 다양한 광원 및 검출기를 사용하여 표면, 또는 표면에 의해 투과 또는 반사된 광의 광학 특성이 모니터링될 수 있다.
LSPR 센서는 다양한 신호 증폭 기술(예를 들어, ELISA 검정)과 함께 사용될 수 있다. 도 1은 실시양태에 따라 LSPR 센서와 함께 사용된 ELISA 검정 포맷을 보여준다. ELISA 검정 포맷은 검정 감도를 증가시키기 위해 신호 증폭에 의존하는 분석물의 검출을 위한 인기있는 검정 기술이다. 본원에서 개시되는 방법 및 시스템의 일부 실시양태에서, 나노구조 LSPR 센서 표면은 매우 낮은 검출 한계(예를 들어 fg/ml 범위)를 달성하기 위해 면역-침전 ELISA 검정 포맷 및 디지털 검출 방식과 조합된다. ELISA 검정에서, 관심 분석물(102)에 대해 작용하는 1차 항체는 센서 표면(104) 상의 분석물을 포획하기 위해 사용될 수 있고, 감도 향상 표지(106)에 접합된 2차 항체는 고정된 분석물에 결합할 수 있다. 감도 향상 표지는 예를 들어, 고정된 효소의 위치 근처에서 센서 표면 상에 침적물을 형성하는, 가용성 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. LSPR 센서는 침적물(108)의 형성에 의한 센서 표면에서의 변화(예를 들어, 굴절률, 유전율 등)를 검출할 때 이용될 수 있다. 개시된 방법 및 기기의 일부 실시양태에서, 감도 향상 표지로서 사용되는 효소는 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트(BCIP) 및 니트로-블루 테트라졸륨(NBT)의 혼합물의 불용성 생성물의 혼합물로의 전환을 촉매하는 알칼리성 포스파타제이다.
LSPR 표면에 얇은 면역-침전물이 형성되는 경우의 예측 피크 파장 이동에 대한 수치 값을 추정하는 것이 유익할 수 있다. 작은 침적물의 경우, 방정식(1)은 하기 방정식(2)로 선형화되어, 환산될 수 있다.
Figure pct00004
(2)
m/Δn = 200, n2 ~ 1.48 및 n1 = 1.33을 갖는 BCIP/NBT의 침적물에 대한 Δn = 0.15, δ ~ 30 nm 및 L = 5 nm를 사용하여, Δλ ~ 10 nm가 얻어진다. 따라서, 5 nm 침적물은 ~10 nm의 플라즈몬 파장 이동을 생성할 것으로 예측될 수 있다. 실제로, 50-80 nm 이하의 파장 이동이 관찰될 수 있다. LSPR 센서 표면에 대한 면역-침전 ELISA 검정 포맷의 실행은 몇몇 검정에 대한 검출 한계를 통상적인 ELISA를 사용하여 달성되는 것에 비해 약 10배 개선하는 것으로 밝혀졌다.
상기 논의된 바와 같이, 국소 굴절률 변화에 대해 민감한 것 이외에, 큰 국소 표면 플라즈몬 공명 이동을 생성할 수 있는 다른 변환 메카니즘이 존재할 수 있다. 예를 들어, 플라즈몬-플라즈몬 커플링이 또한 큰 국소 플라즈몬 공명 이동을 생성할 수 있다. 도 2는 실시양태에 따라 LSPR 센서와 함께 사용되는 플라즈몬-플라즈몬 커플링 샌드위치를 보여준다. 상기 실행에서, 플라즈몬 모이어티(201), 예를 들어 표면 플라즈몬을 유지할 수 있는 입자, 예컨대 콜로이드성 금 또는 은 입자가 감도 향상 표지로서 2차 항체(203)에 접합된다. 입자 플라즈몬과 센서 표면 플라즈몬 사이의 강력한 커플링은 2차 항체가 표면 상에 고정될 때 발생하고, 큰 플라즈몬 이동의 측정을 유도한다.
예시적인 예로서, 플라즈몬 입자, 예컨대 40 nm 금 콜로이드가 고려된다. 스트렙타비딘은 40 nm 금 콜로이드의 표면에 결합할 때, 금 콜로이드의 플라즈몬 위치의 대략 2 nm 이동을 유도한다. 이와 대조적으로, 스트렙타비딘이 40 nm 금 콜로이드에 부착되고 상기 생체분자-금 콜로이드 접합체가 제2 플라즈몬 입자와 접촉할 때, 콜로이드 입자 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링은 몹시 큰, 가능하게는 70 nm 초과의 플라즈몬 이동을 생성한다. 상기 현상은 용액 내의 콜로이드 입자의 쌍을 사용한 기술 문헌에, 및 용액 내의 한 콜로이드 입자 및 표면 상의 플라즈몬 파트너를 갖는 입체형태에 대해 보고된 바 있다.
상기 설명된 신호 증폭 메카니즘(즉, 국소 굴절률 변화를 야기하는 반응을 촉매하기 위한 감도 향상 표지로서 접합된 효소의 사용, 및 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 생산하기 위한 접합된 금속 나노 입자의 사용)은 수십 nm 규모에 도달할 수 있는 플라즈몬 이동을 유발한다. 향상된 국소 표면 플라즈몬 공명 이동은 생물검정에서 향상된 검출 한계(LOD)와 연관된다. 일반적으로, 나노구조의 LSPR 표면에 대해 수행된 ELISA 검정에 대한 LOD는 pg/mL 분석물(또는 그 미만) 범위이다. ~60 kDa의 평균 분석물에 대해, 상기 LOD는 용액 1 ml당 약 1010 분석물 분자에 대응한다.
센서로서 이용되는 대부분의 LSPR 계기는 아날로그 신호를 측정할 수 있다. 아날로그 신호는 기록된 신호가 표면 상의 다수의 분석물 분자의 결합에 의한 평균 신호임을 의미할 수 있다. 개개의 결합 이벤트는 시간 및 공간 측면에서 무작위 공정으로서 발생하고, 알려진 검출 방식에 의해 그 자체가 직접 검출가능하지 않을 수 있다. 시간이 흐르면서, 무작위성 때문에 표면 상의 고정된 분자의 잘 규정된 평균 수가 생성될 수 있다. 고정된 분자의 평균 수가 검출 한계를 초과할 때, 계기는 양의 판독치를 생성할 수 있다. 반대로, 고정된 분자의 평균 수가 검출 한계를 초과하지 않을 때(예를 들어, 분석물의 낮은 농도에 의해), 계기는 분석물의 존재에도 불구하고 음의 판독치를 생성할 수 있다.
도 3은 실시양태에 따라 2개의 상이한 농도에서 항원의 고정에 의해 검정 표면으로부터 반사되는 백색광의 소광을 보여준다. 아날로그 신호는 낮은(302) 및 높은(304) 항원 농도에 대해 측정된다(예를 들어, 분광 검출을 통해). 각각의 항원 농도에 대해, 검정 표면으로부터 백색광의 소광은 증폭 전 및 후에 측정된다. 높은 항원 농도에서, 증폭 전에 측정된 검정 표면으로부터 백색광의 소광(306)은 증폭 후에 측정된 검정 표면으로부터 백색광의 소광(308)과 분명하게 상이하다. 그러나, 낮은 항원 농도(108)의 경우, 증폭 전에 측정된 검정 표면으로부터 백색광의 소광(310)은 증폭 후에 측정된 것(312)과 구분하기 어렵다.
굴절률의 변화에 의한 또는 플라즈몬-플라즈몬 커플링에 의한 플라즈몬 이동은 LSPR 감지 영역의 크기에 의존하지 않을 수 있다(예를 들어, 식(1)에 제시된 바와 같이). 20 nm만큼 작은 LSPR 감지 영역이 성공적임이 입증되었다. 상기 작은 감지 영역을 사용할 때의 어려움은 수집된 광자의 수가 적다는 것일 수 있다. 따라서, 피크 이동을 측정하기 위한 아날로그 스펙트럼 분석은 1 min보다 훨씬 더 큰 긴 누적 시간을 필요로 할 수 있다. 정량적 검정에 필요한 정밀 측정을 위해, 신호 평균화(averaging)를 통해 광학 검출에서 고유한 노이즈(noise)를 감소시키기 위해 필요한 신호 측정의 수는 총 신호 수거 시간을 10 - 100분을 초과하도록 만들 수 있고, 그 이유는 신호 대 노이즈 비가 신호 샘플링 반복의 수로서 증가하기 때문이다(예를 들어,
Figure pct00005
).
제한된 수의 광자가 센서 표면으로부터 반사될 때(예를 들어, 분석물의 낮은 농도 또는 작은 센서 표면 때문에), 디지털 검출 방식(예를 들어, 디지털 LSPR)이 이용될 수 있다. 디지털 검출 방식을 사용하면, 개개의 결합 이벤트의 검출, 및/또는 국소 영역(작은 감지 영역)에서 결합 이벤트의 검출이 가능하다. 단일 분자의 그의 리간드에 대한 결합은 2진 또는 디지털 과정이다(예를 들어, 분자는 결합하거나 결합하지 않는다). 개개의 결합 이벤트를 검출하는 능력은 따라서 이전에 달성되지 않은 검정 감도의 달성을 가능하게 할 수 있다.
도 4는 실시양태에 따른 디지털 LSPR의 원리를 보여준다. 일부 실시양태에서, 분석물-유도 광학 특성(예를 들어 플라즈몬 공명 피크 파장의 이동)의 검출은 백색광 조명, LSPR 센서 표면의 확대된 영상을 형성할 수 있는 광학 시스템, 영상을 캡쳐하기 위한 컬러 또는 흑백 CCD 또는 CMOS 카메라, 및 영상의 각각의 화소에 대한 RGB 또는 회색톤 값의 변화를 측정하는 알고리즘을 이용할 수 있다. 디지털 LSPR에서, 불용성 생성물 또는 강한 플라즈몬-플라즈몬 커플링은 확대 하에 검출가능한 별개의 색상 이동을 갖는 국소 영역(예를 들어, 도 4의 검은 점)으로서 그 자체를 제시하는 LSPR-활성 표면의 굴절률의 국소 변화를 생성하거나 유도할 수 있다. 분석물의 농도가 높을 경우(예를 들어, pg/ml 범위), 고정된 분석물 분자의 표면 밀도는 전체 센서 표면(402)이 검은 점으로 덮이도록 하는 수준일 수 있고, 분석물은 전통적인 분광 수단 및 디지털 검출 방식에 의해 검출가능할 수 있다. 그러나, 표면에 의해 포획된 항원의 수가 작을 경우(예를 들어, 수 fg/ml 이하의 분석물 농도에서), 국소적인 색상 이동은 분광 수단에 의해 해상될 수 없지만, (404)에 제시된 바와 같이 디지털 방식으로 검출될 수 있다.
본원에서 언급되는 디지털 검출 방식에서, 1-5 nm의 국소 분광 이동은 컬러 영상에서 캡쳐될 수 있는 국소 색상 변화와 동등하고, 화소에 대한 RGB 또는 회색톤 값의 변화를 통해 정량될 수 있다. 예를 들어, 약 5 nm의 국소 분광 이동은 센서 표면의 확대된 영상에서 고정된 분석물 분자의 위치에 대응하는 하나 이상의 화소에 대한 약 1 내지 3(255 중에서)의 RGB 값의 변화와 밀접하게 관련될 수 있다. 개개의 영상 센서 화소에 대해 색상 또는 강도를 측정하는 것은 그에 대해 충돌하는 광의 전체 스펙트럼을 측정하는 것보다 더 적은 광자를 필요로 할 수 있다. 따라서, 디지털 색상 및/또는 강도 검출은 전통적인 스펙트럼 검출에 비해 신속한 샘플링 속도를 제공하는 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 디지털 및 스펙트럼 검출 방법은 둘 모두 유사한 정보(예를 들어, 분광 이동)를 포함한다. 따라서, 디지털 검출은 광자 수가 제한되는 ㎛2 범위 이하의 감지 영역에 대해, 5 nm보다 큰 공명 피크 이동을 검출하기 위한 우수한 방법을 제공할 수 있다.
디지털 검출 방식은 LSPR 센서를 사용할 수 있다. LSPR 센서는 LSPR 활성 표면을 포함할 수 있다. LSPR 활성 표면은 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 임의의 표면일 수 있다. LSPR 센서 내의 표면 플라즈몬의 편재는 금속 나노 입자 또는 나노구조의 금속 표면의 사용에 의해 유도된다. 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진, 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 적합한 센서 표면을 제조하기 위한 다양한 방법이 존재한다(예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 다께이(Takei) 등의 US 특허 6,331,276 참조). 나노구조의 LSPR 센서를 제조하기 위해 필요한 성분은 기재, 금속 층 또는 필름, 나노 입자 또는 나노구조, 및/또는 다른 유전 또는 절연재를 포함할 수 있다.
LSPR 활성 표면은 센서 기재를 포함할 수 있다. 나노구조의 LSPR 센서 기재는 유리, 용융 실리카, 규소, 세라믹, 금속, 또는 중합체 물질을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기재 물질은 후면으로부터 광이 조사될 수 있도록 센서 표면이 광학적으로 투명한 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 센서 표면은 전면으로부터 광이 조사되고, 기재 물질의 투명도 또는 불투명도는 중요하지 않다. 일부 실시양태에서, 센서 표면을 통해 투과되는 광의 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서 표면으로부터 반사된 광의 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 센서 표면으로부터 반사된 광의 특성을 측정하는 것이 분석물에 대한 플라즈몬 반응의 측면에서 센서 표면을 통해 투과되는 광을 측정하는 것보다 우수할 수 있다. 일반적으로, 나노구조의 LSPR 센서를 제조하기 위해 사용되는 기재는 적어도 하나의 편평한 표면을 가질 것이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 기재는 굽은 표면(예를 들어, 볼록 표면 또는 오목 표면, 또는 일부의 다른 기하구조의 표면)을 가질 수 있다.
나노구조의 LSPR 센서는 하나 이상의 금속 층 또는 금속 박막을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 1, 2, 5, 10, 15, 20개, 또는 그 초과의 금속 층이 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층 또는 필름에 사용하기 위한 바람직한 금속은 귀금속, 예컨대 금, 은, 백금, 팔라듐 등일 것이다. 일부 실시양태에서, 비-귀금속, 예를 들어 구리가 사용될 수 있다. 귀금속 사용의 한 이점은 전도대 전자(conductance band electron)의 높은 이동성에 의해 표면 플라즈몬 활성을 지지하는 그의 능력일 수 있다. 일부 귀금속의 경우, 추가의 이점은 화학적 부식 또는 산화에 저항하는 능력이다. 금속 층 또는 금속 박막은 본원에서 언급되는 바람직한 금속의 임의의 혼합물 및/또는 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 금속층은 금의 한 층, 구리의 한 층, 및 은과 백금의 혼합물의 한 층을 포함할 수 있다. 금속 층 또는 필름은 열, 전기도금, 스퍼터(sputter) 코팅, 화학 기상 증착, 진공 증착 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 박막의 두께는 5 내지 500 nm일 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노구조의 LSPR 센서는 유전(절연) 물질의 하나 이상의 층을 포함할 것이다. 유리, 세라믹, 규소, 또는 중합체 물질, 예컨대 폴리이미드, 복소 고리 방향족 중합체, 폴리(아릴 에테르), 플루오로중합체, 또는 극성 기가 결여된 탄화수소 중합체를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 매우 다양한 물질이 유전 물질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 중합체 층 또는 박막은 용액 캐스팅(casting) 및 스핀(spin) 코팅, 화학 기상 증착, 플라즈마 보강 화학 기상 증착 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노구조의 LSPR 센서의 표면 플라즈몬 공명 특성(예를 들어, 공명 파장, 흡수 최대점 등)은 2개의 금속 층 사이에 절연층을 형성하기 위해 사용되는 물질의 두께 또는 유전율을 조정함으로써 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노구조의 또는 마이크로구조의 표면은 입자(예를 들어, 나노 입자 또는 미립자)를 기재 표면에 흡착 또는 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 입자는 짧은 나노와이어, 중공, 다공성 등의 형태의 구형, 비-구형, 정육면체, 직육면체, 피라미드, 원통형, 원추형, 타원형, 별-형태를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 종류 및 임의의 형태일 수 있다. 나노 입자는 직경이 5 내지 500 nm인 입자일 수 있다. 미립자는 직경이 500 내지 2,500 nm인 입자일 수 있다. 금속, 귀금속, 금속-산화물, 금속-합금, 금속-도핑된 반도체, 비-금속 복합재, 중합체, 금 또는 은 콜로이드, 유전 나노 입자 및 마이크로입자, 반도체 나노 입자, 및 하이브리드 구조, 예컨대 코어-외피 나노 입자를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 많은 상이한 입자 종류가 사용될 수 있고, 이중 많은 입자는 상업적으로 이용가능하거나 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하이브리드 구조는 상이한 물질로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 코어-외피 나노 입자는 고체 외부 외피 및 액체 내부 코어로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노구조의 LSPR 표면은 나노 입자(예를 들어, 비-금속 나노 입자)를 기재 표면에 흡착 또는 부착시키고 부착된 입자를 금속 박막으로 코팅 또는 부분적으로-코팅하여 캐핑된-입자 표면, 예를 들어 금-캐핑된 입자 표면을 생성시킴으로써 제조된다. 나노 입자는 금속 박막의 하나 이상의 층으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 나노 입자는 금속 박막의 약 1, 2, 5, 10, 20개 또는 그 초과의 층으로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 금속 박막에 사용하기 위한 바람직한 금속은 귀금속, 예컨대 금, 은, 백금, 팔라듐, 구리 등일 것이다. 금속 박막은 본원에서 언급되는 바람직한 금속의 임의의 혼합물 및/또는 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 금속 박막은 금의 한 층, 구리의 한 층, 및 은과 백금의 혼합물의 한 층을 포함할 수 있다. 코팅의 두께는 5 nm 내지 200 nm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노구조의 표면은 전체 기재 표면을 덮을 수 있다. 다른 실시양태에서, 나노구조의 표면은 기재 표면의 일부만을 덮을 수 있고, 기재 표면에 걸쳐 미리 규정된 패턴으로 분포될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노구조의 LSPR 표면을 생성하기 위해 표면에 흡착 또는 부착된 나노 입자를 이용하기보다는, 나노구조의 표면은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 기계적, 진공, 또는 화학적 방법에 의해 패턴화될 수 있다). 나노구조, 예컨대 원통형 칼럼 또는 기둥, 직사각형 칼럼 또는 기둥, 원통형 또는 직사각형 나노웰 등은 석판, 식각, 및/또는 인쇄와 같은 기술을 사용하여 다양한 기재 물질로 제조될 수 있다. 예를 들어, 나노구조는 사진석판 및 습식 화학적 식각, 반응성 이온 식각, 또는 깊은 반응성 이온 식각, 집속 이온빔 밀링(focused ion beam milling), 섬을 형성하기 위한 금속 박막에 대한 열의 인가, 딥-펜(dip-pen) 나노 석판, 나노-인쇄 등을 사용하여 제조될 수 있다.
상기 언급된 나노구조의 치수는 수 nm 내지 수백 nm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노구조의 표면은 전체 기재 표면을 덮을 수 있다. 다른 실시양태에서, 나노구조의 표면은 기재 표면의 일부만을 덮을 수 있고, 기재 표면에 걸쳐 미리 규정된 패턴으로 분포할 수 있다. 센서 표면은 센서 표면의 전부 또는 일부에 걸쳐 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있다. 나노구조의 표면은 고밀도 또는 저밀도일 수 있다. 저밀도의 나노구조의 표면을 갖는 센서 표면을 통해 투과되는 광의 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 고밀도의 나노구조의 표면을 갖는 센서 표면으로부터의 반사되는 광의 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 고밀도의 나노구조를 갖는 표면은 광을 효율적으로 흡수하고 산란시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서 표면을 통해 투과되는 광의 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서 표면으로부터 반사된 광의 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 센서 표면으로부터 반사된 광의 특성을 측정하는 것이 분석물에 대한 플라즈몬 반응의 측면에서 센서 표면을 통해 투과되는 광을 측정하는 것보다 우수할 수 있다.
LSPR 활성 표면은 다양한 방법 및/또는 단계로 생성될 수 있다. 예시적인 예로서, 본원에서 언급되는 한 종류의 LSPR 활성 표면을 생성하는 방법은 1) 5-500 nm의 두께로 Au의 박막의 침적, 2) 나노미터 크기 실리카 또는 중합체 입자(~10 내지 2500 nm 크기)의 무작위, 조밀한(close-packed) 입체형태로의 화학적 침적, 및 3) Au의 하나 이상의 층(~5 내지 200 nm 두께)을 사용한 실리카 또는 중합체 입자의 캐핑(capping)을 포함할 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 나노구조의 LSPR 센서를 검출기로서 사용하여, 샌드위치 면역검정, 효소-연결 면역흡착(ELISA) 검정, 전기화학적 검정 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 검정 포맷이 실시될 수 있다. 많은 상기 검정 포맷은 센서 표면에 대한 관심 분석물의 결합 특이성을 부여하기 위해 친화도 시약(또는 결합 성분), 예를 들어 항체의 사용을 필요로 한다.
다양한 샘플에서 분석물의 검출 및 정량을 위한 검정은 나노구조의 LSPR 센서 또는 나노구조의 LSPR 센서를 포함하는 기기를 사용하여 실행할 수 있다. 샘플의 예는 공기, 기체, 물, 토양, 또는 산업 공정 스트림 샘플, 및 생물학적 샘플, 예컨대 조직, 세포, 또는 임의의 체액, 예컨대 혈액, 땀, 눈물, 소변, 또는 타액을 포함한다.
펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 분석물(마커, 바이오마커)의 검출 및 정량을 위한 검정은 나노구조의 LSPR 센서를 사용하여 실시될 수 있다.
항체, 항체 단편, 앱타머, 분자 각인 중합체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 킬레이팅된 금속 이온, 예컨대 Ni-NTA, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 다양한 친화도 시약, 친화도 태그, 또는 1차 결합 성분이 높은 특이성 및 높은 친화도로 표적 분석물을 인식하고 결합하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 1차 결합 성분은 검정 수행 전에 센서 표면 상에 미리 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 1차 결합 성분은 센서 표면이 샘플과 접촉하기 전에 샘플과 혼합될 수 있다(예를 들어, 검정 절차의 일부로서).
일부 실시양태에서, 다양한 친화도 시약, 친화도 태그, 또는 2차 결합 성분은 또한 높은 특이성 및 향상된 감도를 나노구조의 LSPR 센서의 성능에 부여하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 결합 성분은 검정 감도를 보다 증가시키기 위해 감도 향상 표지에 접합될 수 있다. 본원에서 개시되는 방법 및 기기에 사용하기 적합한 2차 결합 성분의 예는 항체, 항체 단편, 앱타머, 분자 각인 중합체 비드, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 킬레이팅된 금속 이온, 예컨대 Ni-NTA, 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 감도 향상 표지의 예는(i) 비-검출가능한 반응물의 검출가능한 반응 산물, 예를 들어 나노구조의 LSPR 센서 표면 상에 침적물을 형성하는 불용성 침전물로의 전환을 촉매하는 효소, 및(ii) 센서 표면과의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자 또는 마이크로입자를 포함한다. 감도 향상 표지는 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 자기 콜로이드, 및 플라즈몬 콜로이드를 포함하고 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택된 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유도하는 반응을 촉매할 수 있다. 감도 향상 표지로서 사용하기 적합할 수 있는 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 센서 표면 상에 침적물을 형성할 수 있는 불용성 침전물로 효소에 의해 전환하기 적합할 수 있는 반응물의 예는 알칼리성 포스파타제에 의해 불용성 침전물로 전환되는 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트(BCIP) 및 니트로-블루 테트라졸륨(NBT), 또는 이들의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 설명되는 방법 및 시스템은 광학 시스템과 커플링된 LSPR 가능 표면을 사용할 수 있다. 광학 시스템은 디지털 영상화 시스템을 의미할 수 있다. 도 5는 실시양태에 따른 광학 시스템을 보여준다. 광학 시스템은 광원(502), 대물 렌즈(504), 거울, 필터, 광선 분할기, 프리즘, 검출기(예를 들어, CCD, CMOS 센서)(506), 및/또는 검출기에 대해 유지될 수 있는 지지대(stage)를 포함할 수 있다. 광원은 LED, 레이저, 할로겐원, 또는 다른 광원일 수 있다. 광원은 신호의 증폭이 발생하기 전 및 후에 센서 표면에서 광을 유도할 수 있다(예를 들어 플라즈몬-플라즈몬 커플링 또는 ELISA 반응). 광원은 광을 기재측 또는 센서 표면측으로부터 유도할 수 있다. 도 6은 실시양태에 따라 반응(603) 후에 센서 표면에서 유도되는 광의 흡수와 상이한, 반응(601)(예를 들어, ELISA 반응) 전에 센서 표면에서 유도되는 광의 흡수를 보여준다. LSPR 활성 표면 상의 침전물의 침적에 의해, 흡수 피크는 반응 전의 약 550 nm로부터 반응 후의 약 600 nm로 이동한다.
광원은 광이 일반적으로 LSPR 표면에 90도로 입사하도록 배치될 수 있다. 유사하게, 검출기는 표면으로부터 90도로 반사되는 광을 검출하도록 위치할 수 있다. 광원은 광이 일반적으로 LSPR 표면에 사각으로 입사하도록 배치될 수 있다. 광은 좁고 평행하도록 형성될 수 있다. 유사하게, 검출기는 표면으로부터 사각으로 반사되는 광을 검출하도록 배치될 수 있다. 광원의 광학 채널 또는 광섬유를 통해 유도될 수 있다. 광학 채널 또는 광섬유는 이어서 광이 광학 채널 또는 광섬유를 빠져나가 LSPR 표면에 요구되는 각도로 입사하도록 위치할 수 있다.
검출기는 플라즈몬-플라즈몬 커플링 또는 ELISA 반응 전 및 후에 광학 흡수 피크의 이동을 검출할 수 있다. 검출기는 광의 임의의 광학 특성, 예컨대 흡수 피크, 반사된 광의 각도, 및 광의 편광 특성을 검출할 수 있다. 검출기는 영상 센서를 포함할 수 있다. 영상 센서는 CCD 센서, CMOS 센서, 또는 NMOS 센서일 수 있다. 영상 센서는 센서 표면의 일련의 영상을 캡쳐할 수 있다. 일련의 영상은 회색톤 영상일 수 있다. 일련의 영상은 RGB 영상일 수 있다. 일련의 영상은 검정이 분석물을 사용하여 완료되기 전, 동안 및 후에 캡쳐된 영상에 대응하는 영상 프레임을 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 일련의 영상은 분석물에 의한 변화가 일련의 저속 촬영 영상에 걸쳐 검출될 수 있도록 충분히 상세할 수 있다. 일련의 영상은 약 1000개의 영상, 500개의 영상, 400개의 영상, 300개의 영상, 200개의 영상, 100개의 영상, 50개의 영상, 10개의 영상, 5개의 영상, 4개의 영상, 3개의 영상, 또는 2개의 영상 또는 그 초과의 영상을 포함할 수 있다. 영상 센서는 미리 규정된 캡쳐 속도로 일련의 영상 프레임을 캡쳐할 수 있다. 캡쳐 속도의 역은 1 밀리초/프레임, 2 밀리초/프레임, 5 밀리초/프레임, 10 밀리초/프레임, 20 밀리초/프레임, 또는 50 밀리초/프레임일 수 있다. 영상 센서는 화소 크기 및 화소 수의 측면에서 상이할 수 있다. 영상 해상도는 화소 크기 및 화소 수에 의해 결정될 수 있다. 영상 센서의 화소 수는 약 0.5 메가 화소, 1 메가 화소, 4 메가 화소, 10 메가 화소, 20 메가 화소, 50 메가 화소, 80 메가 화소, 100 메가 화소, 200 메가 화소, 500 메가 화소, 또는 1000 메가 화소 또는 그 초과일 수 있다. 영상 센서에 대응하는 화소 크기는 약 5 마이크로미터, 3.5 마이크로미터, 2 마이크로미터, 1 마이크로미터, 0.5 마이크로미터, 또는 0.1 마이크로미터 또는 그 미만일 수 있다.
대물 렌즈는 센서 표면의 확대 영상을 제공할 수 있다. 대물 렌즈는 센서 표면에 대해 줌인하기 위해 긴 작동 거리(예를 들어, 2-5 mm)를 가질 수 있다. 긴 작동 거리는 샘플-처리(예를 들어, 유체를 사용한)를 수용하기 위한 충분한 간격을 제공할 수 있다. 대물 렌즈는 근접장 영상화를 위해 최적화될 수 있다. 확대 영상은 센서 표면의 약 5x, 10x, 20x, 50x, 100x, 또는 200x 또는 그 초과의 확대 영상을 제공할 수 있다. 대물 렌즈의 확대 영상은 영상 프레임의 각각의 화소가 화소 크기보다 훨씬 더 작은 표면 영역에 대응하도록 할 수 있다. 예를 들어, 10x 대물 렌즈 하에서 영상을 캡쳐하는 화소 크기가 5 마이크로미터인 영상 센서는 0.25 ㎛2의 센서 표면에 대응하는 화소를 갖는 영상을 생성할 것이다. 상기 확대는 효소 활성 또는 플라즈몬-플라즈몬 커플링에 대응하는 LSPR 표면 상의 국소 영역이 분명하게 구별가능하고 계수되도록 할 수 있다.
광학 시스템에 의해 획득된 일련의 영상은 알고리즘을 사용하여 분석될 수 있다. 알고리즘은 컴퓨터 판독가능 매체에 저장될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 기기(예를 들어, 컴팩트 디스크, 플로피 디스크, usb 플래시 드라이브, 하드 디스크 드라이브 등)에 의해 판독되거나 처리될 수 있는 포맷으로 데이타를 저장할 수 있는 임의의 매체일 수 있다. 본원에서 언급되는 알고리즘은 분석물에 의해 접촉에 대한 상이한 반응을 보이는 센서 표면의 영역을 상세하게 설명하기 위해 패턴 마이닝 알고리즘을 포함할 수 있다. 패턴 마이닝 알고리즘은 영상에 대한 특정 패턴을 결정(예를 들어, 그에 대한 영상 화소가 특정한 규정된 범위 내의 적색 화소 값의 변화를 겪은 LSPR 센서 표면의 영역을 결정)하기 위해 RGB 또는 회색톤 값의 변화를 처리할 수 있다.
알고리즘은 분석을 위한 영상 프레임 내의 무작위 화소 좌표를 선택할 수 있다. 화소는 관심 영역을 포함할 수 있다. RGB 영상 내의 각각의 화소는 대응하는 적색, 녹색, 및 청색 값을 나타냄으로써 설명될 수 있다. 도 7은 실시양태에 따라 반응이 발생한 후에 얻은 LSPR 활성 표면의 영상을 보여준다. 좌표(x: 24, y: 193)에서의 무작위 화소는 232, 132, 및 79의 RGB 값을 보여준다. 반응이 발생하기 전에 얻은 LSPR 활성 표면의 영상에 대해 좌표(x: 24, y: 193)에서의 무작위 화소는 상이한 RGB 값을 보여줄 수 있다. 반응이 발생하기 전 및 후에 얻은 영상에 대해 좌표(x:24, y: 193)에서의 무작위 화소는 대응하는 관심 영역을 포함할 수 있다. 회색톤 영상 내의 각각의 화소는 강도 정보에 의해 설명될 수 있다. RGB 영상은 회색톤 영상보다 더 많은 정보를 포함할 수 있다. 알고리즘은 전자기 스펙트럼의 단일 밴드 내의 각각의 화소에서 광의 강도를 측정함으로써 RGB 영상을 회색톤 영상으로 전환할 수 있다. 특정 파장에서 강도의 변화는 필터를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 강도의 변화는 장파장 투과(longpass), 단파장 투과(shortpass), 또는 대역통과(bandpass) 필터를 사용하여 측정될 수 있다. 무작위 화소 좌표(예를 들어, 관심 영역)는 일련의 2 이상의 저속 촬영 영상에 걸쳐 강도(예를 들어, 회색톤 영상에서) 또는 RGB 값(또는 강도/RGB 값의 변화)의 결정을 위해 분석될 수 있다. 별법으로, 무작위 화소 좌표 주위의 국소 영역이, 일련의 2개 이상의 저속 촬영 영상에 걸쳐 강도 또는 RGB 값(또는 강도/RGB 값의 변화)의 결정을 위해 분석될 수 있다. 화소 주위의 국소 영역은 무작위 화소 좌표의 중앙에 위치하거나 이와 중첩되는 화소의 그리드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 국소 영역은 무작위 화소 좌표의 중앙에 위치하거나 이와 중첩되는 3x3, 4x4, 5x5, 6x6, 7x7,8x8, 9x9, 10x10, 15x15, 25x25, 50x50, 100x100, 또는 그 초과의 그리드일 수 있다. 국소 영역은 관심 영역을 포함할 수 있다. 무작위로 선택된 화소에 대응하는 동일한 좌표 또는 무작위로 선택된 화소의 좌표 주위의 동일한 국소 영역을, 광학 시스템에 의해 캡쳐된 일련의 영상 내에 변화가 있는지 분석할 수 있다. 일련의 영상은 대응하는 관심 영역 내의 변화에 대해 분석될 수 있다. 관심 영역은 약 100 ㎛2, 50 ㎛2, 25 ㎛2, 10 ㎛2, 5 ㎛2, 4 ㎛2, 3 ㎛2, 2 ㎛2, 1 ㎛2, 0.5 ㎛2, 또는 0.25 ㎛2 또는 그 미만의 LSPR 센서 표면의 영역에 대응할 수 있다.
별법으로, 일련의 영상 내의 각각의 영상은 복수의 관심 영역으로 나눌 수 있다. 관심 영역은 화소, 또는 본원에서 언급되는 화소의 그리드일 수 있다. 알고리즘은 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고, 선택된 관심 영역 내의 일련의 영상에 걸쳐 RGB 및/또는 회색톤 강도 값의 변화를 측정할 수 있다.
일련의 영상은 본원에서 언급되는 분석을 기초로 하여 비교될 수 있다. 비교는 일련의 영상 내의 대응하는 관심 영역 사이에 통계상 유의한 차이가 존재하는지 결정하였다. 비교는 반응(예를 들어, ELISA 반응) 전 및 후의 관심 영역의 RGB 또는 강도 값을 비교하는 것을 수반할 수 있다. 비교는 반응 전, 동안 및 후의 관심 영역의 RGB 또는 강도 값을 비교하는 것을 수반할 수 있다. 비교는 일련의 영상에 걸쳐 변화를 결정하는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, RGB 값의 변화는 하기 식에 따라 결정될 수 있다:
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여기서, Δx는 x 성분의 값의 변화이고, x=R, G, B이다. 별법으로, RGB 값의 단일 성분의 변화가 결정될 수 있다(예를 들어, D = ΔR, 여기서 ΔR은 적색 채널의 값의 변화이다). 강도의 변화는 식 D = ΔI에 따라 결정될 수 있고, 여기서 ΔΙ는 일련의 영상에 걸쳐 무작위로 선택된 화소에 대한 강도 값의 변화이다. 변화는 LSPR 활성 표면에 대해 플라즈몬-플라즈몬 커플링 또는 ELISA 반응(예를 들어, 분석물의 결합) 전 및 후에 얻은 영상을 비교함으로써 분석될 수 있다. 변화는 LSPR 활성 표면에 대해 플라즈몬-플라즈몬 커플링 또는 ELISA 반응(예를 들어, 분석물의 결합) 전, 동안 및 후에 얻은 영상을 비교함으로써 분석될 수 있다. 제시된 화소 또는 화소 주위의 국소 영역에 대한 작은 변화(예를 들어, 평균적으로 하나 미만의 광자 수)는 변화가 다중 영상 세트에서 관찰될 경우 통계상 유의할 수 있다. 상기 과정은 충분한 수의 대응하는 관심 영역이 분석되도록 복수의 관심 영역에서 이루어질 수 있다. 따라서, 다수 또는 복수의 관심 영역(예를 들어, 단일 영상 내의)이 동시에 또는 순차적으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 약 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 또는 10000개 또는 그 초과의 관심 영역이 조사될 수 있다.
도 14는 복수의 대응하는 관심 영역에 대한 2개의 영상(예를 들어, 반응 전 및 후의) 사이에 측정된 적색 강도 값의 변화에 대한 막대그래프를 보여준다. 막대그래프는 8 비트 규모로 2개의 영상 사이의 적색 값의 상대적인 차이를 보여주고, 여기서 적색 강도 값은 0 내지 255 범위이다. 제시된 화소(또는 화소 주위의 국소 영역)에 대한 1-3의 RGB 값의 변화 또는 회색톤 값의 변화는 약 5 nm의 국소 분광 이동에 대응할 수 있다. 알고리즘은 RGB 또는 회색톤 강도 값의 변화의 분포에 대한 모멘트를 추가로 결정할 수 있다. 제1 모멘트는 평균 값을 제공할 수 있는 반면, 제2 모멘트는 분포의 폭을 제공할 수 있다. 일반적으로, 보다 높은 수준의 모멘트는 보다 높은 수준의 분포 대칭성을 나타낼 수 있고, 가치있는 정보를 포함할 수 있다. LSPR 활성 표면과 본원에서 언급되는 영상화 시스템의 조합은 알고리즘이, 광자가 제한될 수 있는 경우에 보다 높은 감도 및 효율로 분석물 및 샘플을 검출 및 분석할 수 있도록 만들 수 있다.
알고리즘은 RGB 및/또는 강도 값 또는 일련의 영상에 걸쳐 결정된 RGB 및/또는 강도 값의 변화를 기초로 하여 막대그래프를 추가로 생성할 수 있다. 막대그래프는 샘플 내의 분석물의 존재에 대한 정보를 제공할 수 있다. 도 8은 실시양태에 따라 막대그래프를 사용한, 검출 한계의 측면에서 전통적인 LSPR 검정 포맷에 대한 디지털 LSPR의 개념 및 그의 우수성의 비교를 보여준다. 제시된 케이스 1, 2, 및 3에서, 센서 표면에 고정된 마커(분석물) 분자의 수는 통상적인 스펙트럼 분석의 검출 수준 미만이다. 이것은 칼럼 A에서 제시되고, 여기서 아날로그 신호(예를 들어, 표면의 색상)는 세 케이스 사이의 구별을 허용하지 않는다. 칼럼 B는 LSPR 활성 센서 표면의 하위섹션의 영상을 보여준다. 상이한 색상의 희미한 점은 케이스 2 및 3에서 분명하게 식별될 수 있지만, 케이스 1에서 그렇지 않다. 전체 영상의 몇 개의 무작위로 선택된 화소(또는 화소 주위의 국소 영역)에 대한 많은 점을 분석하고, 막대그래프(예를 들어, 점의 수에 대응하는 x-축 및 RGB 값의 변화에 대응하는 y-축)로 표시하면, 세 케이스 사이에 분명한 차이가 존재한다.
알고리즘은 검출 한계(LOD)를 결정할 수 있다. 예를 들어, 반응 전 판독의 막대그래프(예를 들어, 대조 막대그래프)는 분석물의 다양한 알려진 양 또는 농도에 대해 반응 후 판독의 막대그래프와 비교될 수 있다. 통계상 유의한 차이가 존재할 경우, 알고리즘은 분석물이 존재한다고 결정할 수 있다. 알고리즘이 통계상 유의한 차이를 결정할 수 없는 분석물의 알려진 양 또는 농도가 검출 한계일 수 있다. 본원에서 설명되는 LSPR-활성 표면을 이용하는 디지털 검출 방식에서, 10-6만큼 낮거나 이보다 더 낮은 표면 적용범위(표면 적용범위는 잠재적인 이용가능한 결합 부위의 총수에 대한 점유된 결합 부위의 비로 규정됨(실시예 2 참조))가 검출될 수 있다. 이것은 특정 가정 하에 fg/mL(또는 그 미만)의 분석물 농도의 검출로 해석된다(예를 들어, 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온 모델을 사용하고 1 nM의 결합 친화도를 가정하여 계산). 검정 파라미터의 추가의 최적화, 예를 들어 센서 표면에 대한 1차 결합 성분의 밀도의 최적화, 샘플 인큐베이션 시간 등, 및 검출 파라미터, 예를 들어 센서 표면을 비추기 위해 사용되는 광의 강도 및/또는 파장, 낮은 노이즈 검출기의 선택 등의 최적화는 fg/ml 미만보다 훨씬 더 낮은 달성가능한 검출 한계를 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 한계는 1 mg/ml, 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1 pg/ml, 100 fg/ml, 10 fg/ml, 1 fg/ml, 또는 0.1 fg/ml보다 우수할 수 있다. 따라서, 본원에서 개시되는 시스템 및 방법은 약 100 mg/ml, 10 mg/ml, 1 mg/ml, 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1 pg/ml, 100 fg/ml, 10 fg/ml, 1 fg/ml, 또는 0.1 fg/ml 또는 그 미만의 양으로 샘플에 존재하는 분석물을 검출할 수 있다.
의료 현장 진단(예를 들어 임상 진단)을 위한 기기는 약 200 ng/mL, 100 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 또는 1 pg/mL 또는 이보다 우수한 감도를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 의료 현장 진단은 샘플 내에 1 pg/mL 미만의 양으로 존재하는 분석물을 검출하는 능력을 필요로 할 수 있다. 본원에서 개시되는 시스템 및 방법은 높은 감도, 및 의료 현장 진단을 위한 기기의 소형화를 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 센서 표면 상의 고밀도의 나노 구조(예를 들어, 광 반사율을 측정하기 위한), 및 감도 향상 표지(예를 들어, 효소, 금속 나노 입자 등), 및 본원에서 언급되는 디지털 검출 방식의 조합은 임상 진단 용도에 필요한 감도의 달성을 가능하게 할 수 있다. 본원에서 개시되는 시스템 및 방법에서 분석되는 영상의 캡쳐에 필요한 누적 시간은 약 1 ms, 5 ms, 10 ms, 20 ms, 30 ms, 40 ms, 50 ms, 100 ms, 또는 200 ms 또는 그 미만일 수 있다.
알고리즘은 샘플 내의 분석물의 농도를 결정할 수 있다. 분석물의 몇몇의 알려진 농도 및 이들이 생성하는 대응하는 신호가 측정되고, 검정 곡선의 생성을 위해 사용될 수 있다. 분석물은 본원에서 설명되는 바와 같이 검출될 수 있고, 후속적으로 측정된 신호는 샘플 내의 분석물의 농도를 결정하기 위해 검정 곡선과 비교될 수 있다.
본 개시내용의 방법, 장치, 및 시스템은 하나 이상의 LSPR 센서와 완전히 또는 부분적으로 통합된 유체 시스템을 이용할 수 있다. 유체 시스템은 분석물 및/또는 검정 시약이 존재하는 샘플을 센서 표면으로 전달하도록 배열될 수 있다. 유체 시스템은 펌프, 밸브, 유체 채널, 막, 유동 셀, 반응 웰 또는 챔버, 및/또는 검정 수행에 필요한 시약을 보관하는 저장소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 시스템 성분의 전부 또는 일부는 LSPR 센서 칩(chip) 또는 기기를 생성하기 위해 LSPR 센서와 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 시스템 성분의 전부 또는 일부는 LSPR 센서 칩 또는 기기가 그와 접하는 외부 하우징(housing) 또는 계기 내에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 시스템은 하나 이상의 유체 작동 메카니즘을 포함할 수 있다. 개시된 방법, 기기, 및 시스템에 사용하기 적합한 유체 작동 메카니즘의 예는 하나 이상의 반응 웰 또는 시약 저장소에 대한 정압 또는 부압, 동전기력(electrokinetic force), 전기습윤력(electrowetting force) 등의 인가를 포함한다. 정압 또는 부압은 예를 들어 저장소로부터 유체 채널을 통해 센서 표면으로 시약의 유동을 작동시키기 위해 저장소에 커플링된 기계적 작동기 또는 피스톤의 사용을 통해 직접 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기계적 작동기 또는 피스톤은 저장소를 밀봉하기 위해 사용되는 가요성 막에 대해 힘을 가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정압 또는 부압은 예를 들어 하나 이상의 저장소에 연결된 압축 기체 배관 또는 진공 배관의 사용을 통해 간접적으로 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펌프는 유체 유동을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 LSPR 센서 칩이 그와 접하는 하우징 또는 계기 내에 위치하는 펌프일 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 이들은 센서 칩이 통합된 미세제조된 펌프일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 시스템은 저장소와 채널 사이의 유체 유동을 전환하기 위한 하나 이상의 밸브를 포함할 수 있다. 이들은 LSPR 센서 칩이 그와 접하는 하우징 또는 계기 내에 위치하는 밸브일 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 이들은 센서 칩이 통합된 미세제조된 펌프일 수 있다.
본원에서 개시되는 LSPR 센서 칩은 검정이 이루어지는 LSPR 센서가 존재하는 하나 이상의 반응 웰을 가질 수 있다. 유체 작동 메카니즘 및 유체 시스템에서 사용되는 제어 성분, 예를 들어 펌프 및 밸브의 조합은 상이한 저장소로부터의 유체가 특정 검정을 수행하기 위해 필요한 순서로 반응 웰 내로 도입되는 것을 허용한다. 유체 시스템은 상이한 저장소로부터 유체를 임의의 순서로, 연속적으로(예를 들어, 순차적으로), 또는 동시에 도입할 수 있다. 예를 들어, 2차 항체 접합체를 이용하는 검정을 위해, 샘플이 반응 웰 내에 도입된 후, 희석제 저장소로부터 희석제가 반응 웰을 세정하기 위해 도입될 수 있다. 다음으로, 2차 항체 접합체가 2차 항체 접합체 저장소로부터 반응 웰 내로 도입될 수 있다. 이어서, 희석제는 다시 반응 웰을 세정하기 위해 도입될 수 있다. 이어서, 시약, 예컨대 효소에 의해 불용성 침전물로 전환되는 효소 기질이 시약 저장소로부터 반응 웰 내로 도입될 수 있다. 따라서, 2차 항체 접합체를 이용하는 LSPR 센서 칩은 샘플 저장소(또는 샘플은 샘플 저장소가 없는 반응 웰에 직접 침적될 수 있고; 추가로 샘플 저장소는 샘플과 혼합되는 희석제를 포함할 수 있음), 희석제 저장소, 2차 접합된 항체 저장소, 시약 저장소, 및 폐기물 저장소를 포함할 수 있다. 접합된 2차 항체는 효소, 자기 비드, 금속 비드, 콜로이드, 또는 나노 입자, 유리 비드, 질량 태그 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 다양한 표지 또는 태그와 접합된 항체, 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플이 단일 반응 혼합물에서 1차 및/또는 접합된 2차 항체와 혼합되고, 변형된 또는 비변형된 센서 표면과 직접 접촉되는 단일 단계 검정이 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, LSPR 센서 칩은 복수의 반응 웰을 가질 수 있고, 여기서 각각의 반응 웰은 센서를 포함한다. 일부 실시양태에서, LSPR 센서 칩은 센서의 어레이를 포함하는 단일 반응 웰을 가질 수 있다. LSPR 센서는 상이한 종류의 검정이 각각의 반응 웰에서 실행될 수 있도록 다중-패널이거나 다중화될 수 있다. 따라서, 상이한 반응 웰은 반응 웰에 고정된 상이한 항체, DNA 검정을 실시하기 위한 DNA, RNA, 박테리아 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LSPR 센서는 단일 센서 표면 상에 고정된 다수의 1차 항체 또는 다른 1차 결합 성분을 가질 수 있다. LSPR 센서 칩은 하나 초과의 분석물을 동시에 검출 및/또는 정량할 수 있다.
일부 실시양태에서, LSPR 센서 칩은 하나 이상의 샘플 또는 시약 저장소를 포함할 수 있다. LSPR 센서 칩은 하나 초과의 샘플에서 하나 초과의 분석물을 동시에 검출 및/또는 정량할 수 있다. 저장소 내의 시약은 유체 채널을 통해 센서 표면 상에 도입될 수 있다. 저장소는 샘플, 시약, 희석제, 접합된 항체, 입자 또는 비드, 및/또는 검정 실시에 따른 폐기 생성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, LSPR 센서 칩은 희석제를 보관하기 위한 하나 이상의 저장소, 항체 접합체를 보관하기 위한 하나 이상의 저장소, 완충제 또는 다른 검정 시약을 보관하기 위한 하나 이상의 저장소, 및/또는 비드를 보관하기 위한 하나 이상의 저장소를 포함할 수 있다. 비드 저장소는 자기 비드, 귀금속 비드, 코어 외피 비드, 플라즈몬 콜로이드, 및/또는 유리 비드를 포함할 수 있다. 또한, LSPR 센서 칩은 또한 하나 이상의 폐기물 저장소를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 저장소는 약 0.1 mm 깊이 및 약 10 mm 직경을 가질 수 있거나, 또는 부피가 1 nL 내지 3 mL가 되도록 하는 치수이다.
일부 실시양태에서, 반응 웰 또는 샘플 저장소의 상부에 배치된 필터로서 기능하는 막이 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정되는 샘플은 샘플을 필터의 상부에서 반응 웰 위에 직접 침적함으로써 LSPR 센서 표면 상에 침적될 수 있다. 필터는 크기에 따라 원치 않는 입자를 여과하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 필터는 보다 작은 크기의 입자만 반응 웰을 통해 여과되도록 허용하는 적절한 크기의 세공을 포함할 수 있다. 원치 않는 입자는 세포, 염 결정, 불용성 침전물, 또는 검정을 저해하거나 유체 채널을 막을 수 있는 다른 입자를 포함할 수 있다. 샘플은 막에 의해 분리될 수 있는 하나 이상의 관심 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 상이한 종류의 분자는 상이한 반응 웰을 통해 여과될 수 있고, 상이한 다공성의 막은 샘플 내의 하나 초과의 분석물의 동시 분석을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 반응 웰 대신에 또는 반응 웰에 추가하여 샘플을 저장소 상에 침적함으로써 도입된다. LSPR 센서는 특히 샘플을 수용하도록 조정된 하나 이상의 저장소를 포함할 수 있다. 샘플 저장소는 여과가 요구되는지의 여부에 따라 저장소의 상부에 위치하는 막을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
일반적으로, 반응 웰, 샘플 및 시약 저장소, 및 유체 채널은 유리, 용융-실리카, 규소, 폴리카르보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 시클릭 올레핀 공중합체(COC) 또는 시클릭 올레핀 중합체(COP), 폴리디메틸실록산(PDMS), 또는 다른 엘라스토머 물질을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 다양한 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 제조 기술은 CNC 기계 가공, 사진석판 및 식각, 레이저 광박리, 사출 성형, 고온 엠보싱(hot embossing), 다이 절단 등을(선택된 물질에 따라) 포함하고 이로 제한되지 않는다.
유체 채널의 크기 및 형태, 및 하나 이상의 반응 웰 또는 저장소에 인가된 압력은 반응 웰 내로의 유동이 층류가 되도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 채널의 길이는 약 1 mm 내지 약 100 mm일 수 있고, 가장 큰 단면 치수는 약 10 ㎛ 내지 약 5 mm일 수 있다.
실시예
실시예 1
벌크 굴절률 변화에 반응한 적색 채널 변화
10x 배율의 대물렌즈가 표면으로부터 ~7 mm (및 유동 셀 커버로부터 ~3-4 mm)에 위치하는 ThorLabs CMOS 카메라(DCC1645C-HQ)를 사용하여 LSPR 센서를 영상화하였다. 유동 셀에서, 상이한 용액을 연속적으로 펌핑하였다(물, 5% EG, 10% EG, 및 20% EG). 각각의 용액에 대해, 일련의 영상을 얻고 분석하였다. 각각의 일련의 영상에 대해, 화소를 무작위로 선택하고, 무작위로 선택된 화소의 중앙에 위치하는 3x3 화소를 적색 채널 값의 변화에 대해 분석하였다. 컬러 CMOS 센서로부터 수집된 센서 표면 원 데이타는 벌크 굴절률이 물로부터 5% 에틸렌 글리콜(EG), 10% EG, 및 20% EG로 연속적으로 변할 때 적색 채널이 전체 영상의 3x3 화소 하위 섹션에 대해 어떻게 변하는지 보여준다(도 11에 제시된 바와 같이). 패널 A는 하나의 무작위로 선택된 화소에 대한 원 신호를 보여주는 반면, 패널 B는 단시간의 무작위 변동을 제거하기 위해 평균화 필터를 통해 얻은 동일한 신호를 보여준다. 급등은 새로운 에틸렌 용액이 첨가될 때의 변동에 대응한다. 급등 후의 평탄부(plateau)는 용액에 대한 평형 값에 대응한다.
영상에 대한 무작위로 선택된 화소는 도 12에 도시된 용액의 변화에 반응한다. 이 점을 확인하기 위해, 다수의 화소에 대한 분석된 데이타를 기초로 하여 막대그래프를 생성하였다. 적색 채널 값의 변화를 x-축에, 적색 채널 값의 대응하는 변화에 대해 전체 영상에 걸친 발생 수는 y-축에 제시하였다. 적색 채널 값의 변화는 도 12의 우측에서 볼 수 있는 바와 같이 분명하게 구별가능하였다. 5% EG의 막대그래프로부터 분명하게 알 수 있는 바와 같이, 평균 255 중에서 1 미만의 수의 변화가 검출가능하다. 사실상, 하위 단위 화소 변화가 상기 방법에 의해 검출될 수 있고, 그 이유는 방법이 영상의 다수의 화소의 통계적 분석에 의존하기 때문이다.
이와 함께, 50/50 광선 분할기를 검출 경로에 삽입함으로써 분광 검출을 수행하였다. 한 부분은 CMOS 카메라로 보내고, 다른 부분은 2048 화소 분광계(아반테스(Avantes)의 AvaSpec)로 보냈다. ~460 nm 내지 720 nm의 전체 스펙트럼을 기록하고 분석하였다. 디지털 검출(영상화) 및 분광 검출(전통적인 방법)에 의해 얻은 값을 도 13에 도시된 바와 같이 비교하였다.
실시예 2
다양한 표면 적용범위에서 분석물의 검출을 기초로 한 검출 한계 결정
도 9는 실시양태에 따라 디지털 LSPR을 사용하여 여러 표면 적용범위에서 분석물의 검출을 보여준다. 개념 증명 실험에서, 표면은 비오티닐화된 IgG 및 천연 IgG를 다양한 비로, 그러나 총 항체 농도는 1 mg/mL(비오티닐화된 IgG + 천연 IgG)로 고정된 상태로 동시에 흡착시킴으로써 제조하였다. 10-6, 3x10-6, 8x10-6, 10-5, 10-4, 및 10-3의 비를 구체적으로 제조하였다. 총 농도는 표면을 포화시키기에 충분히 컸다. 비오티닐화된 IgG의 표면 적용범위는 비오티닐화된 IgG 대 총 항체의 비에 대응하는 것으로 가정되었다. 따라서, 10-6의 표면 적용범위는 비오티닐화된 IgG 및 천연 IgG의 동시 흡착 동안 106개의 천연 IgG당 1개의 비오티닐화된 IgG가 존재함을 의미하였다. 상기 모델 표면은 실제 검정에서의 항원의 적용범위를 모방한다. LSPR 표면 상의 비오티닐화된 항체는 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 증폭 방식, 이어서 BCIP/NBT 발색을 사용하여 검출되었다. BCIP/NBT의 부가 전 및 후의 동일한 영역의 영상을 PBS에서 수집하였다. 무작위로 선택된 관심 영역의 RGB 값을 분석하고, 컬러 영상의 적색 성분의 값의 변화를 막대그래프로 표시하였다. 각각의 농도에 대해, 흑색으로 표시된 막대그래프는 반응 전 판독에 대응하고, 회색으로 표시된 막대그래프는 효소 반응 후에 측정된 값에 대응한다. 흑색으로 표시된 막대그래프를 다수의 표면 적용범위에 대해 회색으로 표시된 막대 그래프와 비교하였다. 도 9는 막대그래프 분포가 그의 제1(평균) 및 제2 모멘트(폭) 값의 통계상 유의한 차이를 보이기 때문에, 10-6의 낮은 표면 적용범위(표면 적용범위는 잠재적인 이용가능한 결합 부위의 총수에 대한 점유된 결합 부위의 비로 규정됨)가 검출될 수 있음을 입증한다.
분광 검출(아날로그 검출)을 디지털 검출과 함께 수행하였다. 10-3 내지 10-7의 여러 표면 적용범위(즉, 포화된 표면 상의 비오티닐화된 IgG vs 천연 IgG의 수)에서 모델 표면의 비오티닐화된 IgG의 검출을 위한 검정을 비교하였다. 아날로그 검출은 도 10에 도시된 바와 같이 10-4 내지 4x10-5의 표면 적용범위에서 LOD에 도달하였다. 사실상, 반응 전 및 후의 4x10-5 적용범위에서 표면에 대한 스펙트럼은 거의 구분될 수 없었고, 2x10-6의 적용범위에서 대부분 중첩되었다. 이와 대조적으로, 10-5 및 10-6의 표면 적용범위에 대한 디지털 판독은 반응 전 및 후의 판독치의 차이를 보여주었다.
실시예 3(예측)
핵산 표적 분자의 검출
일부 실시양태에서, 개시된 디지털 LSPR 방법 및 시스템은 생물학적 또는 환경 샘플에서 표적 핵산 서열의 검출을 위해 사용될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 하나 이상의 표적 핵산 서열의 일부에 상보성인 LSPR 센서 표면 상에 포획 프로브를 생각할 수 있다. 표면 상의 프로브의 고정은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다양한 기술에 의해, 예를 들어 귀금속 표면 상의 티올화된 올리고뉴클레오티드(또는 필요에 따라 적합한 링커 분자)의 패턴화된, 자가조립된 단일층을 사용하여 달성될 수 있다. 표면은 이어서 존재할 경우 표적 핵산 분자가 센서 표면에 포획되고 고정되도록 상보성 서열의 혼성화를 촉진하는 조건 하에 관심 샘플과 접촉될 수 있다. 이어서, 센서 표면은 세정되고 하나 이상의 고정된 표적의 먼 말단의 일부에 상보성인 검출 프로브를 포함하는 용액과 접촉될 수 있다. 검출 프로브는 존재할 경우 고정된 표적에 대한 검출 프로브의 혼성화를 촉진하는 조건 하에 LSPR 센서 표면과 함께 인큐베이팅된 후, 센서 표면은 임의의 비-혼성화된 검출 프로브 분자를 제거하기 위해 세정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 검출 프로브는 감도 향상 표지, 예컨대 상기 논의된 바와 같이 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하는 효소로 표지되어, 본원에서 개시되는 디지털 영상화 기술을 사용하여 검출될 수 있는 국소 굴절률 변화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 프로브는 본원에서 개시되는 디지털 영상화 기술을 사용하여 검출될 수 있는 국소 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도하는, 상기 논의된 바와 같은 금속 나노 입자로 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 2 이상의 표적 핵산 분자가 검출되어야 할 때, 포획 프로브는 2 이상의 표적 분자의 검출이 서로 구별될 수 있도록 센서 표면 상의 특정 공간 패턴으로 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 프로브는 2 이상의 표적 분자의 검출이 서로 구별될 수 있도록 LSPR 센서 표면의 광학 특성의 구별가능한 변화를 생성하는 2 이상의 상이한 감도 향상 표지로 표지될 수 있다.
일반적으로, 포획 및 검출 프로브는 약 20 내지 약 40개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 포획 및/또는 검출 프로브의 길이는 이보다 짧거나 길 수 있고, 예를 들어, 프로브의 길이는 10개 뉴클레오티드, 또는 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, 포획 및 검출 프로브의 설계를 위한 설계 목적 중의 하나는 혼성화된 프로브-표적 서열의 안정성 및 특이성을 최적화하는 것일 것이다. 일부 실시양태에서, 포획 및/또는 검출 프로브의 길이는 검출 프로브의 감도 향상 표지를 가능한 한 LSPR 센서 표면에 보다 근접하게 위치하도록 하기 위해 표적 뉴클레오티드 서열의 길이에 따라 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획 및 검출 프로브는 예를 들어 검출 프로브를 포획 프로브에 혼성화하는 것과 매우 근접하여 위치하는 고정된 표적 서열의 섹션에 혼성화하도록 설계함으로써, 혼성화된 검출 프로브의 감도 향상 표지가 표적 핵산 서열의 길이와 무관하게 LSPR 센서 표면에 매우 근접하여 유지되도록 설계될 수 있다.
상기 방법에 대한 잠재적인 적용의 예는 특정 유전자 서열 또는 그의 단편의 검출, 특정 mRNA 또는 마이크로RNA 서열의 검출 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
실시예 4(예측)
핵산 서열결정
일부 실시양태에서, 개시된 디지털 LSPR 방법 및 시스템은 예를 들어 합성에 의한 서열결정(sequencing-by-synthesis) 방식을 사용하여 핵산 분자의 서열결정을 위해 사용될 수 있다. 서열결정되는 주형 분자는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다양한 기술을 사용하여, 예를 들어 센서 표면 상에 고정된 범용(universal) 어댑터 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화, 또는 이와의 라이게이션에 의해 센서 표면 상에 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 어댑터 올리고뉴클레오티드는 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 포함할 수 있고, 고상 증폭 기술(예를 들어 브리지(bridge) 증폭)을 사용하여 공간적으로 분리된 주형 분자 집단을 생성할 수 있다. 범용 서열결정 프라이머는 이어서 서열결정 반응을 개시하기 위해 주형 분자와 혼성화된다. 이어서, 폴리머라제 및 표지된 dNTP(예를 들어, dNTP는 LSPR 센서 표면과 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도하는 금속 나노 입자로 표지된다)는 단계적인 방식(즉, 사이클당 하나의 표지된 dNTP 사용)으로 센서 표면과 접촉하고, 센서 표면의 광학 특성은 염기가 제시된 폴리머라제 반응 단계에서 부가되었는지 결정하기 위해 상기한 디지털 영상화 기술을 사용하여 모니터링된다. 일부 실시양태에서, 신호의 변화는 표지된 뉴클레오티드의 연속적인 부가에 의해 발생하는 누적 "배경" 신호의 존재 하에 모니터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, dNTP는 나노 입자 표지가 각각의 폴리머라제 반응 사이에서 성장하는 올리고뉴클레오티드 가닥으로부터 제거되어 "배경 신호"의 축적을 최소화하고 단일 염기 부가에 대한 감도를 개선하도록, 절단가능한 부착 화학을 사용하여 금속 나노 입자로 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 높은 처리율은 본원에서 개시되는 디지털 영상화 기술의 사용과 동시에 많은 고정된 주형 분자(또는 주형 분자 클러스터)의 위치에서 발생하는 반응을 동시에 모니터링함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 달성될 수 있는 잠재적인 판독 길이(read-length)는 효율적인 플라즈몬-플라즈몬 커플링에 대한 거리 의존성에 의해 영향받을 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고 설명되었지만, 상기 실시양태가 단지 예시를 위해 제시된 것임은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 많은 변경, 변화, 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 것이다. 본원에서 설명되는 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실행시에 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 규정하고, 이들 청구범위 및 그의 균등물 내의 방법 및 구조는 그에 의해 포함됨이 의도된다.

Claims (55)

  1. 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면의 일련의 2개 이상의 영상을 캡쳐하고;
    일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고;
    일련의 2개 이상의 영상에 걸쳐, 선택된 관심 영역 내의 색상의 변화를 측정하고;
    측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물을 검출하는 것
    을 포함하는, 샘플 내의 분석물을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분석물 검출을 위한 검출 한계가 1 ng/mL보다 우수한 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 분석물 검출을 위한 검출 한계가 1 pg/mL보다 우수한 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 분석물 검출을 위한 검출 한계가 1 fg/mL보다 우수한 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 색상의 변화가 대응하는 관심 영역 내의 화소의 RGB 값의 변화인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 측정된 색상의 변화가 센서 표면으로부터 반사된 광의 색상의 변화인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 각각의 선택된 관심 영역이 약 5 ㎛2 또는 그 미만의 센서 표면의 영역인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 각각의 선택된 관심 영역이 3x3 화소의 그리드인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 일련의 2개 이상의 영상이 국소 분석물-유도 변화가 발생하기 전 및 후에 캡쳐되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 분석물이 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 센서 표면이 1차 결합 성분, 분석물, 및 2차 결합 성분과 순차적으로 또는 동시에 접촉되고, 2차 결합 성분이 감도 향상 표지인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 감도 향상 표지가 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하여 센서 표면 상에 침전물을 형성하는 효소인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 감도 향상 표지가 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 및 형광 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유발하는 반응을 촉매하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 감도 향상 표지가 금속 나노 입자와 센서 표면 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 대응하는 관심 영역이 무작위로 선택되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 복수의 대응하는 관심 영역이 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 복수의 대응하는 관심 영역이 10개 이상의 대응하는 관심 영역인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 복수의 대응하는 관심 영역이 100개 이상의 대응하는 관심 영역인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 일련의 2개 이상의 영상의 캡쳐에 필요한 누적 시간이 50 ms 미만인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 분석물이 샘플 내에 100 ng/mL 이하의 양으로 존재하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 분석물이 샘플 내에 1 ng/mL 이하의 양으로 존재하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 분석물이 샘플 내에 1 pg/mL 이하의 양으로 존재하는 것인 방법.
  24. 제1항, 제13항, 제15항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 결과를 포함하는 보고서를 접수하고, 보고된 결과를 기초로 하여 의료 관리 결정을 내리는 것을 추가로 포함하고, 여기서 샘플이 환자 샘플인 방법.
  25. 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면;
    일련의 2개 이상의 영상을 캡쳐할 수 있는 광학 영상화 기기; 및
    일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고, 선택된 관심 영역 내의 색상의 변화를 측정하고, 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물을 검출할 수 있는 프로세서
    를 포함하는, 샘플 내의 분석물을 검출하기 위한 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 분석물 검출을 위한 검출 한계가 1 ng/mL보다 우수한 것인 시스템.
  27. 제25항에 있어서, 분석물 검출을 위한 검출 한계가 1 pg/mL보다 우수한 것인 시스템.
  28. 제25항에 있어서, 분석물 검출을 위한 검출 한계가 1 fg/mL보다 우수한 것인 시스템.
  29. 제25항에 있어서, 프로세서가 측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물의 농도를 결정할 수 있는 것인 시스템.
  30. 제25항에 있어서, 색상의 변화가 대응하는 관심 영역 내의 화소의 RGB 값의 변화인 시스템.
  31. 제25항에 있어서, 센서 표면이 불투명하고 광을 반사하는 것인 시스템.
  32. 제25항에 있어서, 각각의 대응하는 관심 영역이 약 5 ㎛2 또는 그 미만의 센서 표면의 영역인 시스템.
  33. 제25항에 있어서, 각각의 대응하는 관심 영역이 3x3 화소의 그리드인 시스템.
  34. 제25항에 있어서, 일련의 2개 이상의 영상이 색상의 변화 전 및 후에 캡쳐되는 것인 시스템.
  35. 제25항에 있어서, 분석물이 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA 분자, RNA 분자, 바이러스, 박테리아, 세포, 지질 분자, 탄수화물 분자, 유기 소분자, 약물 분자, 또는 이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
  36. 제25항에 있어서, 샘플 및 검정 시약을 센서 표면으로 전달하기 위한 유체 시스템을 추가로 포함하고, 여기서 검정 시약은 1차 결합 성분 및 2차 결합 성분을 포함하고, 2차 결합 성분은 감도 향상 표지를 포함하는 것인 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 감도 향상 표지가 반응물의 불용성 생성물로의 전환을 촉매하여 센서 표면 상에 침전물을 형성하는 효소인 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 효소가 무기 화합물, 유기 화합물, 화학발광 화합물, 및 형광 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체, 생체중합체, 화합물, 또는 효소 반응 산물의 침적을 유발하는 반응을 촉매하는 것인 시스템.
  39. 제36항에 있어서, 감도 향상 표지가 금속 나노 입자와 센서 표면 사이의 플라즈몬-플라즈몬 커플링을 유도할 수 있는 금속 나노 입자인 시스템.
  40. 제25항에 있어서, 프로세서가 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 무작위로 선택할 수 있는 것인 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 프로세서가 복수의 대응하는 관심 영역을 선택할 수 있는 것인 시스템.
  42. 제41항에 있어서, 복수의 대응하는 관심 영역이 10개 이상의 대응하는 관심 영역인 시스템.
  43. 제41항에 있어서, 복수의 대응하는 관심 영역이 100개 이상의 대응하는 관심 영역인 시스템.
  44. 제25항에 있어서, 광학 영상화 기기의 누적 시간이 50 ms 미만인 시스템.
  45. 제25항에 있어서, 분석물이 샘플 내에 100 ng/mL 이하의 양으로 존재하는 것인 시스템.
  46. 제25항에 있어서, 분석물이 샘플 내에 1 ng/mL 이하의 양으로 존재하는 것인 시스템.
  47. 제25항에 있어서, 분석물이 샘플 내에 1 pg/mL 이하의 양으로 존재하는 것인 시스템.
  48. 제25항, 제37항, 제39항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 환자 샘플을 포함하고, 분석물의 검출이 임상 진단 용도를 위해 사용되는 것인 시스템.
  49. 국소 표면 플라즈몬 공명을 유지할 수 있는 센서 표면의 각각의 일련의 2개 이상의 영상에서 하나 이상의 대응하는 관심 영역을 선택하고;
    일련의 2개 이상의 영상에서 대응하는 관심 영역에 대한 색상을 비교함으로써 색상의 변화를 측정하고;
    측정된 색상의 변화를 기초로 하여 분석물의 존재를 결정하는 것
    을 포함하는 방법을 컴퓨터가 실행하도록 유도하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체.
  50. 제49항에 있어서, 하나 이상의 대응하는 관심 영역이 무작위로 선택되는 것인 컴퓨터 판독가능 매체.
  51. 제50항에 있어서, 복수의 관심 영역이 선택되는 것인 컴퓨터 판독가능 매체.
  52. 제49항에 있어서, 색상의 변화가 대응하는 관심 영역 내의 화소의 RGB 값의 변화인 컴퓨터 판독가능 매체.
  53. 제52항에 있어서, RGB 값의 변화가 다음 식에 따라 측정되는 것인 컴퓨터 판독가능 매체:
    Figure pct00007

    여기서, ΔR, ΔG, 및 ΔB는 영상 내의 적색, 녹색 및 청색 화소 값의 변화에 대응한다.
  54. 제49항에 있어서, RGB 또는 회색톤 값의 변화의 분포에 대한 모멘트를 계산하는 것을 추가로 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체.
  55. 제49항에 있어서, 분석물에 의한 접촉에 대해 상이한 반응을 보이는 센서 표면의 영역을 상세하게 설명하기 위해 패턴 마이닝 알고리즘을 사용하는 것을 추가로 포함하는 컴퓨터 판독가능 매체.
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