CN111381031B - 基于拴系颗粒的生物传感器及感测分析物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于拴系颗粒的生物传感器及感测分析物的方法，其中用于感测分析物的方法使用拴系颗粒运动。功能化颗粒[500]具有第一状态[504]和第二状态[502]，在所述第一状态中，所述功能化颗粒与所述表面结合，并且在所述第二状态中，所述功能化颗粒没有与所述表面结合，其中，所述功能化颗粒根据所述分析物的存在与不存在来在所述第一与第二状态之间切换，由此，根据所述分析物的存在改变所述功能化颗粒的运动特性。所述功能化颗粒的空间坐标参数由检测器[516]测量，并且处理器[518]根据所述测量的空间坐标参数的变化确定所述分析物的存在/浓度。

Description

基于拴系颗粒的生物传感器及感测分析物的方法
本申请是申请日为“2015年12月15日”、申请号为“201580075767.3”、 题为“基于拴系颗粒的生物传感器”的分案申请。
技术领域
本发明总体上涉及基于在由系链附接至表面的功能化颗粒的运动的变 化的基础上检测分析物的存在的生物传感器技术。
背景技术
生化标记的大部分生物感测原理已经发展成在体外诊断(in-vitrodiagnostics)中使用，在体外诊断中，采集样本(例如，血液、唾液、尿液、 粘液、汗液或脑脊液)并且将其传递至活体外的人工设备(例如，一次性塑料)。在这种生物感测试验中，可以应用宽范围的样本预处理步骤(例 如，分离或稀释步骤)，并且在试验中可以引入多种试剂(例如，针对目标放大、信号放大或清洗步骤)。体外生物感测试验的示例是：免疫测定、 核酸测试、电解质和代谢物的测试、电化学试验、酶活性试验、基于细胞 的试验等(参见蒂茨(Tietz)，临床化学和分子诊断学教科书(Textbook of Clinical Chemistry andMolecular Diagnostics)，2005)。
在体内生物化学感测中，传感器系统的至少一部分保持连接至或插入 人体，例如，在皮肤上、或在皮肤中、或在皮肤下、或者在身体的另一部 分上或中或下。由于生物传感器与活体之间的接触，体内生物化学感测对 生物相容性提出较高要求(例如，炎症过程应当被最小化)，并且传感器 系统应当在活体的复杂环境中可靠地操作。对监测应用而言，系统应当能 够随时间执行多于一个测量，并且系统应当是鲁棒的且易于穿戴。
体内生物化学感测的重要应用是连续葡萄糖监测(CGM)。商业连续 葡萄糖监测设备基于酶的电化学感测(参见例如，希欧(Heo)和武内 (Takeuchi)，Adv.Healthcare.Mat.，2013，第2卷，43-56页)。酶感测不如基于亲和性的感测通用。用于体内葡萄糖监测的商业系统可从德康医 疗(Dexcom)和美敦力公司(Medtronic)购得。当今CGM系统的缺点是 传感器响应示出了漂移，并且因此，系统需要通过体外血糖测试定期进行 再校准(关于综述，参见例如，希欧和武内，Adv.Healthcare.Mat.，2013， 第2卷，43-56页)。
本领域已知一些基于颗粒的生物感测技术，包括基于通过光学散射进 行检测的技术，例如，布鲁斯(Bruls)等人，实验室芯片(Lab Chip)， 2009。专利申请US 2012184048描述了一种用于在基于颗粒的生物感测系 统中表征不同键类型的方法。未结合颗粒以靶标依赖的方式与感测表面结 合，此后，执行结合-自由分离(清洗步骤)，并且随后，测量从结合颗粒 处散射的光的强度波动，以便表征键类型，例如，在特异性和非特异性结合颗粒之间进行区分。对未结合颗粒以及结合-自由分离过程的使用对体外 诊断是有用的。然而，对体内应用而言，未结合颗粒可能会带来安全风险， 并且很难在体内情形下实现结合-自由分离过程。
可以通过基于拴系颗粒运动(tethered particle motion，TPM)的生物感 测技术来避免以上难点。TPM技术基于对拴系到表面的颗粒的运动的测量。 示例是劳伦斯(Laurens)等人，Nucleic Acids Res.，2009.9；37(16)：5454-5464，其中，TPM实验基于与DNA系链结合的蛋白质报道，以便揭示蛋白质如 何改变DNA构造。在这种研究中，进行测量以避免将颗粒未经系链地结合 到表面上，因为以另一种方式而不是经由系链与表面结合的颗粒并不给出关于系链的信息。示例是：布卢姆伯格(Blumberg)等人，Biophysical，2005；89，1272-1281。
已经基于由系链附接的颗粒的运动依赖于分析物的存在而变化的原理 而发展了具有附接至表面的功能化系链的生物传感器。运动变化是由于系 链自身因为分析物的存在而发生的结构变化所导致的。还存在用于通过测 量独立于分析物的存在而栓系到表面的功能化颗粒的运动学属性来检测分 析物的技术。在这些技术中，重要的是避免颗粒键合到表面，因为位阻干 扰了受分析物影响的敏感性。
发明内容
一方面，本发明提供了一种基于检测由系链附接至表面的功能化颗粒 的运动变化的生物感测技术，其中，分析物的存在使所述颗粒在与所述表 面相结合与未结合状态之间变化。与已知的基于拴系颗粒的生物感测技术 (其中结合至表面是不期望的)形成对比，根据本发明，分析物使得拴系 颗粒在与表面相结合与未结合状态之间变化。这是与拴系颗粒运动研究方 面的明确教导避免与表面结合的传统观点之间的令人惊讶的对比。
本发明提供了一种用于敏感的、特异的、稳定的、生物相容的且灵活 的体内生物化学监测的生物感测技术。存在对这种生物感测技术的许多应 用，包括：用于糖尿病患者的连续葡萄糖监测，不需要定期重新校准传感 器系统；对可能在例如急救护理中变得不稳定的患者很重要的电解质和代 谢物监测；有助于例如在心脏病患者中监测肾功能的电解质测量；可以有助于监测心脏功能的蛋白质测量(例如，BNP是心力衰竭的关键标记)； 有助于监测药物摄入(顺应性)和药物动力学(旨在保持药物在期望的浓 度窗口内)的药物和/或药物代谢物测量；有助于监测药物有效性的药物反 应测量；以及监测疾病管理、治疗控制、顺应性监测。另外，所述方法还 可以非常普遍地应用于分子生物感测，例如，用于体外诊断、定点护理测 试、环境测试、食品检验、取证等。本发明还可以发现生物、生物医学和药物研究中的应用，例如用于监测对活细胞、组织、器官等的试验。分析 物可以是电解质、小分子、脂肪、糖类、多肽类、激素、蛋白质、寡核苷酸、DNA、RNA等。
一方面，本发明提供了一种用于使用拴系颗粒运动来感测分析物的方 法。所述方法包括：使包含所述分析物的基质与具有表面和系链分子的传 感器设备接触，所述系链分子在第一端结合至所述表面，并且在第二端结 合至功能化颗粒。所述功能化颗粒具有第一状态和第二状态，在所述第一 状态中，所述功能化颗粒与所述表面结合，并且在所述第二状态中，所述 功能化颗粒没有与所述表面结合，其中，所述功能化颗粒根据所述分析物的存在与不存在来在所述第一与第二状态之间切换，由此，根据所述分析 物的存在改变所述功能化颗粒的运动特性。所述方法包括：测量所述功能 化颗粒相对于所述表面的空间坐标参数；以及根据所述测量的空间坐标参 数的变化来确定所述分析物的存在/浓度。
在一些实施例中，可以通过以下步骤来测量所述空间坐标参数：照亮 所述功能化颗粒和/或所述表面；检测来自所述功能化颗粒和/或所述表面的 光学辐射；以及根据所述光学辐射确定所述功能化颗粒相对于所述表面的 位置、取向和/或速度。
在一些实施例中，可以通过以下步骤来测量所述空间坐标参数：激励 所述功能化颗粒和/或所述表面中的自由电荷载流子；以及检测来自所述功 能化颗粒和/或所述表面的光学辐射；其中，以所述功能化颗粒和/或所述表 面的等离子体共振附近的波长来执行所述激励和/或检测。可以通过确定所述检测到的光学辐射的变化来确定所述分析物的存在/浓度。可以通过激励 来自具有大于5nm的线宽的光源或来自超发光二极管的光来执行激励自由 电荷载流子。
在一些实施例中，可以根据颗粒定位分布的变化、定位图案面积的变 化或者颗粒定位之间的步长大小的变化来确定所述分析物的存在/浓度。
在一些实施例中，可以通过执行直方图和/或直方图处理以便抑制背景 噪声并增强特异性来确定所述分析物的存在/浓度。
附图说明
图1是根据本发明的实施例的拴系颗粒生物感测技术的基础部件的示 意图。
图2A至图2B是根据本发明的实施例的拴系颗粒生物感测技术的未结 合状态和结合状态的示意图。
图3A至图3B是根据本发明的实施例的拴系颗粒生物感测技术的未结 合状态和结合状态的示意图。
图4A至图4B是根据本发明的实施例的拴系颗粒生物感测技术的未结 合状态和结合状态的示意图。
图5是根据本发明的实施例的用于使用光激励以及对拴系纳米颗粒的 等离子体共振位移进行的检测来感测目标分析物的存在的示意图。
图6A至图6B根据本发明的实施例展示了组合的显微镜学和光谱学方 法的两种实现方式。
图7是根据本发明的实施例的根据幂次定律的平均结合速率与分析物 浓度的曲线图。
图8A至图8B根据本发明的实施例分别示出了未结合拴系颗粒的示意 图以及在采样周期期间未结合拴系颗粒的x-y平面位置图。
图8C至图8D根据本发明的实施例分别示出了结合拴系颗粒的示意图 以及在采样周期期间结合拴系颗粒的x-y平面位置图。
图9A根据本发明的实施例示出了用于颗粒运动测量的生物感测装置。
图9B根据本发明的实施例示出了被分析用于确定颗粒运动图案的一 系列颗粒位置图像。
图10根据本发明的实施例示出了颗粒的指示未结合与两个结合状态 之间的转变的顺序运动图案。
图11A根据本发明的实施例示出了步长(或面积)函数相对于时间的 曲线图，所述曲线图指示了用于检测结合状态与未结合状态之间的变化的 两个阈值。
图11B根据本发明的实施例示出了与针对不同时间窗口对位置点的收 集相关联的凸包。
具体实施方式
本发明的实施例由与用于体内应用的生物传感器的设计有关的若干见 解推动：(i)由于颗粒的可检测性、稳定性和生物功能化选项，因此使用 颗粒是有益的；(ii)有益的是使用拴系颗粒而不是未结合的颗粒；以及(iii) 可能有益的是在生物感测技术中使系链功能化和结合功能化分离。
根据本发明的实施例，提供了拴系颗粒技术，其中，颗粒与表面的交 互扮演主要角色。系链的功能是保持颗粒靠近表面，并且其是对颗粒与表 面之间的产生生物感测信息的目标调制交互的测量。
图1中展示了根据本发明的实施例的生物感测技术的基础部件。生物 传感器设备具有暴露于包含目标分析物110的基质的表面100。系链分子 102在第一端结合至表面100并且在第二端结合至利用部分106而被功能化 的颗粒104。表面100使用另一个部分108功能化。替代性地，部分106 或者部分108可以缀合至系链。选择对这两个部分的功能化以使得目标分 析物110将与其键合。这些部分与颗粒以及与基质的缀合和链接完成，其方式为使得部分具有分析物特定生物结合活性。图2A至图2B展示了图1 的系统的两种状态，所述两种状态取决于目标分析物110的存在。在图2A 中所示出的状态中，分析物110不存在，并且拴系颗粒104自由移动，受 限于系链。在图2B中所示出的状态中，分析物110存在，并且结合至部分 106和108，导致拴系颗粒104与表面100结合。因此，根据分析物110的 存在，功能化颗粒104的运动在结合状态与未结合状态之间变化。假如部 分106或者部分108缀合至系链，则将分析物110与部分106和108结合 使功能化颗粒104的运动在具有更自由运动状态(称为‘未结合’或‘颗 粒没有与表面结合’)与具有不自由运动状态(称为‘结合’或‘颗粒与表面结合’)之间变化。
在此实施例的示例实现方式中，可以使用耦合至颗粒104以及基质100 的抗体或其片段来测量具有两个表位的目标分析物110。替代性地，当部分 106和部分108表示抗体特定表位(例如，多肽表位、模拟表位)或天然蛋 白时，可以启用抗体检测，从而使得抗体可以通过将其两个抗原结合域与 部分106和部分108结合来形成夹心复合物(图2B)。替代性地，可以由 分析物诱发与分子对(部分106和部分108)的结合(如两个金属结合域之 间的金属结合，或核受体配体结合域中的配体诱发辅因子复原)。
图3A至图3B中展示了本发明的另一个实施例。在此实施例中，如图3A中所示出的，部分106和部分108被选择用于当目标分析物110不存在 时彼此结合，从而使得拴系颗粒104处于结合状态。在目标分析物存在的 情况下，如图3B中所示出的，部分106和部分108不与彼此结合，因为替代地优先与分析物结合，从而使得拴系颗粒104处于未结合状态。部分106 和部分108可以是分析物结合分子和分析物类似物。
在此实施例的示例实现方式中，可以测量具有一个表位的目标分析物 110，例如，使用颗粒上的至少一个特定捕获分子以及基质上的目标类似物， 反之亦然。
根据图4A至图4B中所示出的另一个实施例，部分106未被包括在内。 在此实施例中，目标分析物110引起颗粒104的位阻的变化。在图4A中所 示出的状态中(其中，分析物不存在)，拴系颗粒104处于较少阻碍状态。 在图4B中所示出的状态中，由于分析物110与部分108的结合，因此拴系 颗粒104处于较大阻碍状态下。在此实施例的变体中，部分108未被包括 在内，而是替代地部分106被包括在内，其他操作原理相同。
在此实施例的示例实现方式中，可以经由位阻测量目标分析物110， 其中，目标与颗粒和/或基质的结合改变可由颗粒访问的参数空间。
在本发明的实施例中的任何实施例中，还可以间接通过中间反应的级 联来执行对分析物的检测。例如，酶与分析物反应，并且生成产物，所述 产物与颗粒和/或基质表面上的生物化学部分反应，并且由此改变单独分子 颗粒系链表面系统的坐标参数。在本说明书的上下文中，对分析物的检测可以是直接或间接的，并且，在间接检测的情况下，分析物生成的产物扮 演被检测的分析物的角色。
通常，在根据本发明的实施例的用于检测在液体或其他基质中的分析 物的生物感测设备中，所述设备包括由至少一个系链连接的至少两个物体 (即，表面和颗粒，其中，表面还可以被具体化为颗粒)。系链保持两个 物体靠近在一起，这对遭遇频率和有效浓度以及对准确的光检测是有利的。
颗粒优选地具有小于5微米的最长尺寸。更优选地，颗粒直径在3nm 与5μm之间的范围内。优选的颗粒具有较强光特性，如例如，具有等离子 体共振特性的金属纳米颗粒，或者具有强荧光性或散射特性的颗粒。合适 的颗粒材料的示例是有机材料(例如，聚合物)、无机材料(例如，硅)、 金属(例如，黄金)或其组合。
使用颗粒的优点包括稳定性和高光学信号。两个物体中的至少一个在 其表面上设有至少一个生物化学部分。生物化学部分给物体生物化学特异 性。
在操作中，测量表示两个物体相对于彼此的相对位置的坐标参数。不 失一般性，可以在一个物体(即，表面)相对于被描述为在运动中的另一 个物体(即，颗粒)的静止参考系中描述实施例。表面还可以包括弯曲表 面，凸面或凹面，例如，具有颗粒的表面。分析物当存在时与两个物体中 的一个或两个结合，改变拴系颗粒的可能运动。因此，空间坐标参数属性 在分析物存在的情况下变化。因此，根据所测量的坐标参数属性变化来确 定分析物的存在和/或浓度。
空间坐标参数可以是例如颗粒在空间(xyz)中的位置、颗粒相对于表 面的取向、和/或其时间相关性(包括其时间倒数，如颗粒的角速度和颗粒的线速度)。坐标参数的属性可以是例如空间和/或速度分布函数的属性。 优选地，光学地测量坐标参数以及至少两个物体相对于彼此的坐标参数的 变化。
优选地，使用单颗粒分辨率执行检测，以便能够独立地测量不同颗粒 的时间相关行为。这将允许人们在独立颗粒上执行信号处理(例如，以便 形成结合和未结合状态的直方图)并且应用具有高统计的过滤算法(例如， 以便分离特异性和非特异性结合)。单分子分辨率允许高敏感性以及对低 浓度的检测。当达到基本单分子极限时，则从分子结合和/或转换过程中收 集最大数据，给出最佳统计和最佳精度。
优选地，所述设备包括同一表面上的许多拴系颗粒，以便收集统计并 且由此提高可靠性、敏感性和速度。
实施例还可以包括防污涂料、凝胶生物感测、中和层、过滤函数、选 择性渗透层、空间复用、基于颗粒的复用、校准、控制、光学检测可能性。 实施例可以包括用于阻止并减少不期望的过程并且增加信号生成的效率、 稳定性和选择性的测量。
本发明的实施例将允许对复杂液体(例如，血液、唾液、间隙皮肤液 体)中的分析物浓度进行实时探测。对高分析敏感性而言，单分子分辨率 应当可实现。此外，可以通过从非特异性交互中隔离特异性来达到高特异性。这可以允许复杂液体中的直接实时系列测量，理想地不需要重复采样 或中间过滤步骤。
所提出的生物传感器的重要优点是，其基于生物化学亲和性，所述生 物化学亲和性使其通用并且使众多可能性试验成为可能。
在一种特异性实现方式中，感测系统可以用于执行连续分析物监测(如 葡萄糖监测)，例如，采用与颗粒或基质上的葡萄糖结合蛋白质的竞争格 式(例如，载脂蛋白葡萄糖氧化酶、或周质运输蛋白、或另一种葡萄糖结 合分子)。
本发明的商业用途包括体内生物感测还有体外生物感测。本发明的实 施例可以应用于基于颗粒标签并且具有单颗粒和单分子分辨率的下一代生 物传感器的开发。
替代性地，在医疗过程期间感测设备可以是反馈系统的部分，例如， 内窥镜上或其中的传感器、管子、针、纤维、导管、碎片。
生物传感技术还与体外诊断测试(特别是定点护理测试)有关，其中， 其在特异性分子结合过程导致可由光学装置检测的信号的情况下是有利的， 需要极少的进一步化学/生物化学/流体处理。
在本发明的另一方面中，感测技术用于体内、离体、或体外用途。在 本发明的另一方面中，感测技术用于在人类受试者或非人类受试者上应用， 例如，兽医用途，或者用于测试其他生物系统。在本发明的另一方面中， 感测技术是与受试者或生物系统接触的一次性探针的部分。
在本发明的另一方面中，感测技术涉及一次性标本盒(例如，芯片上 实验室标本盒)，或者在基于实验室的测试中使用的一次性用品，或者另 一种一次性用品，如管子、针、纤维、导管、碎片。在本发明的另一方面 中，一次性用品或探针或标本盒附接至仪器或分析器，以便向一次性用品、探针或标本盒供电并且/或者制动它们并且/或者读出它们。在本发明的另一 方面中，仪器适合于处理来自探针或标本盒的信号，并且/或者在仪器与探 针或标本盒之间传达数据，并且/或者在仪器与例如信息系统或通信网络之 间传达数据。
感测系统可以是疾病管理系统的部分，所述疾病管理系统可以包括(生 物)化学和/或物理感测、用于数据收集和处理的系统、以及用于物理和/ 或(生物)化学制动的系统。所述系统可以以闭环形式与治疗系统连接， 例如，服用药物的设备(例如，糖尿病情况下的胰岛素)或者以其他方式影响身体的设备(例如，给器官提供物理刺激的设备，例如，电的)。
图5是示意图，展示了用于光激励以及检测拴系颗粒500的空间坐标 参数的设备和技术，所述拴系颗粒的空间运动特性响应于目标分析物的存 在而在未结合状态500与结合状态504之间变化。
所述设备可以表示不同配置，例如：(i)拴系到基质的等离子体颗粒， 由此，颗粒的等离子体共振根据相对于基质的坐标参数变化，或者(ii)拴 系到牢牢附接至基质的等离子体颗粒的散射颗粒，由此，等离子体共振依赖于散射颗粒相对于等离子体颗粒的坐标而变化。而且，拴系到等离子体 颗粒的等离子体颗粒是可能实现的，其中，等离子体共振依赖于两个颗粒 之间的空间坐标变化而变化。
在以下内容中，数据被描述用于将抗体与附接至玻璃基质的等离子体 纳米棒结合，其中，抗体的结合改变纳米棒的等离子体共振。所述数据说 明可以如何记录单独结合事件(无论是抗体或在溶液中自由的其他颗粒或 拴系颗粒)以及可以随时间并行地监测多少传感器。
拴系颗粒500被固定到流动池508中的盖玻片上。来自激光器512的 照明光束510在池508的壁中经历全内反射，并且激励颗粒500中的等离 子体。拴系纳米颗粒的光学散射信号514指向光检测器516，其中，其呈现 抵制暗背景，确保高信噪比。等离子体位移然后将导致检测到的信号强度 的变化。处理器518分析来自检测器516的信号以便确定颗粒500的指示 目标分析物的存在的空间坐标参数。
检测器516可以是能够使许多单独拴系颗粒成像的电子倍增电荷耦合 设备(EM-CCD)。替代性地，为了达到微秒积分时间，单个拴系颗粒的 经散射的强度可以投射到模拟光电二极管上。
分析物生物感测技术允许对极小目标浓度的敏感性检测。通过允许单 分子检测其具有显著敏感性。选择性明显高于总体平均方法，因为单分子 分辨率允许在每分子的基础上的特异性(强壮、长寿命的)与非特异性(虚 弱、短寿命的)交互之间的区别。
本发明的实施例可以使用暗场散射光谱学技术。具体地，其可以使用 利用明亮的低时间相干性光源(优选地具有大于5nm的线宽(例如，超发 光二极管))的技术，以便动态地测量等离子体颗粒的等离子体共振波峰 的变化。
用于散射物体(如金属纳米颗粒)的大多数检测方法使用暗场照明来 获得其中物体具有比背景更高的强度的图像。对小颗粒(直径<100nm的 黄金)而言，散射信号减小为半径的六次幂，并且迅速变得被背景淹没。 因此，使更小的物体成像需要高辐照度来获得足够信号。
通常使用非相干白光源(发射带宽>1000nm)执行散射物体的成像 和/或光谱学。其允许散射物体的成像针对同质且低背景，并且其可以用于 通过使用同一照明器确定许多不同波长处的散射信号来提取宽带散射光谱。 通常采用的光源为白炽灯(例如，卤素)或弧放电源(例如，氙)。这些光源的主要缺点是它们延长的发射面积(>1mm2)，所述延长的发射面积 不允许光束的深聚焦来实现样本的高辐照度。
用于克服此确定的一种方法是通过使用窄带且相干光源(如激光)。 高相干性和低带宽(通常<1nm)允许光束的深聚焦来实现样本的高辐照 度。然而，相干激光辐照具有局限性，因为(1)干涉条纹引起不均匀照明 图案以及(2)小的虚假反射以及光学装置中的光泄漏引起图像中的背景假 象。这种假象显著降低信噪比，并且由于光学装置的振动和热漂移，可以 在时间上波动。
在这种生物感测应用中，已知白光源或激光对测量光谱位移有用。白 光源展现比纳米颗粒的线宽Γ大得多的光谱宽度B(即，B>>Γ)，并且因 此允许立刻使用分光仪测量整个光谱。然后，通过分析随后的光谱来提取 光谱的位移。另一方面，还使用比颗粒的线宽窄得多的源(例如，激光(B<<Γ))测量光谱位移。当物体的光谱移位时，时间相关散射信号将改变。 然而，因为超发光二极管(SLD)展现类似于纳米颗粒的线宽的光谱宽度 (即，B～Γ)，所以使用SLD对纳米颗粒进行动态光谱位移测量是不期望的。光学相干断层扫描还使用SLD进行照明，但是不存在测量样本的光谱 变化的意图。尽管使用具有不同等离子体共振的颗粒，但是共振波长是固 定的并且不随时间变化。因此，使用SLD对等离子体的动态行为进行测量 是不期望的，因为选择具有仅比探测到的共振的线宽稍窄的带宽的光源是不直观的。
金属纳米颗粒的线宽通常为40nm到50nm。白光源(如卤素灯)具 有比纳米颗粒宽得多的线宽。激光具有比纳米颗粒窄得多的线宽，而典型 SLD的线宽通常为15nm到30nm，取决于比得上纳米颗粒的线宽的发射 波长。
图6A至图6B展示了使用用于使散射物体602时间相关地成像的明亮 且低相干光源(超发光二极管(SLD)600)的组合显微镜学和光谱学的两 种实现方式。在本发明的实施例的生物感测技术中，时间相关信号表示散 射物体的指示分析物存在的等离子体共振波峰的位移。当SLD的亮度类似 于常见二极管激光器时，SLD光604相比于激光的更短的相干波长显著减 少由干扰引起的假象。
光束的低相干和中间带宽(例如，在近红外波长处15nm到30nm) 导致均匀照明和低背景强度。高亮度和小发射面积(例如，当耦合至单模 光纤时，小于30μm2)确保高辐照度。来自使用超发光二极管照亮的物体 的散射信号相比于背景很高，并且在短以及长时标上稳定。
在图6A中，SLD 600在超过液体池606的玻璃-水界面处的全内反射 角度的角度下照亮样本602。在此实现方式中，光604经由玻璃棱镜608 耦合至样本602。在替代性实现方式中，图6B中所示出的，光604经由物 镜610的后孔径耦合至样本602。因为图6A中的实现方式使激励和发光路 径分离，所以其导致比图6B中的实现方式更低的背景和更高的信噪比。图 6B中的实现方式可以在样本上的空间将用于其他目的(例如，温度调节的 技术部件)时有用。在两种实现方式中，因为照明角度大于池606的玻璃- 水界面处的全内反射角度，所以反射全部激励光。颗粒602的存在扰乱全 内反射，导致由物镜部分地收集并发送至成像传感器614的经散射的光612 的某一强度。经反射的光束由光束挡块阻挡，并且将剩余经散射的光发送 至成像检测器614，优选地具有足够动态范围和波长敏感性的相机，以便实 现单分子分辨率。在另一个实施例中，样本602可以安装在光学探针(例 如，光纤或波导)上，以便允许在复杂生物环境中直接进行测量。然后由 处理器616分析来自检测器614的信号以便确定目标分析物存在。
试验可以涉及例如：结合试验、竞争试验、置换试验、夹心试验、酶 试验、目标和/或信号放大的试验、多步试验、分子级联的试验等。试验可 以涉及识别具有不同性质的部分，例如，多肽类、蛋白质、核酸类、糖类 等。实施例可以包括各种校准方法、控制、复用等。实施例可以包括用于 阻止并减少不期望的过程(例如，生成背景信号的非特异性过程)并且增加信号生成的效率、稳定性和选择性的测量。
本发明的实施例包括用于使用大量纳米级检测器来生物感测基质中的 分析物的系统和技术，所述纳米级检测器的光学特性在分析物存在的情况 下单独地改变。在优选实施例中，例如，等离子体生物传感器基于在暗场 显微镜学设置内同时且实时监测的具有单分子敏感性的几百个单独金拴系 纳米颗粒。
等离子体生物传感器可以包括在暗场显微镜学设置内同时且实时监测 的具有单分子敏感性的几百个单独的金拴系纳米颗粒。这种方式允许在不 需要对分析物进行任何标记的情况下对单分子交互进行统计分析。等待时 间分布是浓度相关的，并且服从泊松统计。在一个实施例中，同时探测几 百个纳米颗粒的能力提供具有7倍程浓度动态范围的传感器，并且将使能 对分子交互中的不均匀性的研究。
单分子检测相比于总体平均技术具有独特优点，因为其产生分子特性 的统计分布而不是平均值，并且揭示稀有且异步的事件。本发明的优选实 施例包括用于使用标准显微镜安排下的全内反射激励来实时监测几百个单 分子等离子体拴系纳米颗粒的技术。
在图6A至图6B中所示出的实施例中的一种实现方式中，超发光二极 管为Superlum，具有中心波长795nm，带宽14nm，最大功率35mW。检测器614为电荷耦合设备(CCD)，例如，在样本表面上具有面积50x 50μm2。
在旋涂期间可以通过浓度来控制基质上的颗粒的密度，以便在显微镜 的100x100μm2视场中产生150到250个颗粒。每个颗粒位置展现出由以 下各项造成的不同经散射的强度：(a)颗粒体积的不可避免的分散以及导 致辐照波长处的不同散射截面的纵横比；以及(b)每个颗粒在部分极化的 倏逝场(evanescent field)中的不同取向。为了确保这种技术探测单个纳米 棒，记录所有颗粒的白光散射光谱。少于10％的颗粒是成簇的，这些颗粒 在分析中被丢弃。
将超发光二极管(SLD)用作光源对于实现足够的信噪比(S/N)而言 是重要的。来自白炽灯的光的弱空间相干性提供不充分的强度来使小颗粒 成像，而激光照明的高时间相干性导致引起信号波动的干扰假象。SLD是 生成放大的自发发射的半导体高增益设备。在此应用中，SLD的低时间相 干性显著减少干扰假象，而高空间相干性确保高照明强度。这导致受散粒 噪声限制的信号的积分时间为100ms。
在典型单分子实验中，使用注射泵使分析物进入流动池。CCD相机用 于记录时间相关的经散射的信号(由每个参考系中的每个点的二维高斯拟 合)。然后，使用步长寻找算法，将与拴系纳米颗粒运动变化相关联的等 离子体位移观察为作为时间的函数的标准的经散射的强度的步进式变化。信号的步进式变化指示信号抗体的随机结合(抗体浓度10nM)。步进式 变化的符号取决于相对于辐照源波长的等离子体波长。步长的幅值从1％到5％变化，步长大小的变化指示位置和取向的差异。分析物结合所引起的信号的符号取决于相对于SLD波长的等离子体波长。对具有比SLD波长更短 的等离子体波长的颗粒而言，等离子体的红移引起经散射信号的增大，而 具有比SLD波长更长的等离子体波长的颗粒展现出相反的行为。一小部分 颗粒不展现信号的步进式变化，因为等离子体波长接近SLD波长。出于所 述原因，分析可以排除具有在775nm与815nm之间的等离子体共振的颗 粒。其还可以排除具有S/N<2(被定义为分析物注入之前信号的步长大小 与标准偏差之间的比率)的步长，我们将所述步长归因于背景或结合到靠 近颗粒的玻璃表面的分析物的漂移。
根据发现适合于数据的步长，处理器可以估计τ的值——步长之间的平 均等待时间。如图7的曲线图中所示出的，等待时间的分布服从泊松统计， 具有按照幂次定律取决于分析物浓度的平均结合率。
通过将每个参考系中颗粒的衍射受限点与二维高斯相拟合来获得检测 到的经散射的强度。针对更明亮的颗粒，S/N(被定义为在150秒上信号的 平均与标准偏差之间的比率)增大。S/N接近具有一些过量噪声的散粒噪声 限制，所述过量噪声可能由SLD强度波动以及样本的轻微机械漂移引起。 根据这些测量，我们推断，可以使用具有超过105计数/s的累积强度的颗粒 的3到5的S/N来检测1％的步进式信号变化。
可以确定分析物浓度的精度受计数统计的限制。例如，需要在限定的 时间窗口内检测至少100个分子，以便具有约1/√100＝10％的浓度确定精 度。小颗粒在其表面上具有有限数量的受体分子，因此单独颗粒仅可以捕 捉有限数量的分析物分子。此外，在非常低的分析物浓度限制下，存在单 个颗粒将不会捕捉甚至单个分析物分子的高可能性，即使在很长的培养时 间内。为了解决此问题，根据本发明的优选实施例的生物感测系统具有至少100个拴系纳米颗粒，并且在单独颗粒上记录时间轨迹。颗粒的数据由 处理器组合以便确定分析物浓度。对低分析物浓度而言，优选地，从至少 1000个颗粒中组合数据，更优选地，至少10000个颗粒。
由于纳米颗粒在制造工艺期间的变化，其可以具有可变的不同大小， 导致不一致光谱特性。为了解决此问题，优选的是，使用具有等离子体共 振的固有窄分布的颗粒(例如，金双锥体)。发明人已经发现双锥体方式解决方案的消光谱的总体线宽接近50nm的单颗粒线宽，而金纳米棒的总 体线宽通常为约200nm。这指示单独双锥体光学地更均匀。为了解决此问 题，还优选的是，使用具有多个波长的生物感测系统。优选的解决方案是 记录许多不同波长处的时间轨迹，例如，使用波长可调谐超发光二极管。
有利的是，使生物感测系统具有大量颗粒。然而，小型化系统中，仅 有限的表面面积是可用的。此外，因为光学系统需要能够记录单独物体的 时间轨迹，所以表面上的颗粒的密度有限。为了解决此问题，优选的是具 有这样的系统：其中，多于预定小部分的颗粒以至少光学系统的衍射极限 与最邻近的颗粒分离。解决此问题的另一种方法是使用表面上的颗粒的有序图案而不是随机分布。优选地，表面上的颗粒的图案与数字相机芯片上 的像素的图案共形。数字相机通常具有矩形像素；对具有矩形像素的相机 芯片而言，颗粒优选地位于矩形网格上。解决此问题的另一种方法是使用 其中单个颗粒映射到数字相机芯片的单个像素上的光学系统。优选地，单 个颗粒给出单个像素上的信号，所述信号至少是由相邻颗粒引起的所述像 素上的信号的5倍高。解决此问题的另一种方法是使用具有不同光谱特性、 在表面上以交替方式图案化、具有低于衍射极限的最小间隔的颗粒。由于 不同光谱特性，可以选择颗粒的子总体并且可以将时间轨迹记录在具有单颗粒分辨率的不同子总体上，即使它们以小于衍射长度间隔。
在具有光学检测和单颗粒分辨率的基于颗粒的生物感测技术中，重要 的是标识和忽略作为噪声源的不期望的颗粒状物体。这种颗粒状物体可能 与样本污染或样本中的聚合物有关，或者由于感测颗粒的生物化学特性(例 如，表面功能化)、颗粒特性(例如，形状、光学特性)、或具有其他颗粒的颗粒的配置(例如，多颗粒聚合物或者无法光学地溶解的多个接近颗 粒)。为了解决此问题，这些颗粒的光谱特性可以被记录并与参考数据进 行比较。可以例如使用宽带光源和可调谐滤波器或者使用具有可调谐波长 的源来记录光谱特性。光谱特性可以用于标识例如由颗粒特性(例如，形状)或颗粒配置(例如，颗粒簇)引起的不可靠物体。单独拴系颗粒由单 独窄洛伦兹光谱表征，允许我们基于光谱的线形和线宽来丢弃簇。而且， 纳米颗粒簇的散射光谱展现双峰或没有明显峰。这些簇可以很容易与单独颗粒的光谱区分并且从数据分析中丢弃。
解决此问题的另一种技术是将单独物体的信号时间轨迹与多个其他物 体的时间轨迹进行比较。可以例如基于噪声特性、漂移、步长大小、步长 数量、长时间的累积信号等来拒绝具有强烈偏移多个其他物体的特性的物 体。
传感器的动态范围具有低和高浓度极限。由于结合速率低，因此低分 析物浓度限制统计。对低浓度而言，最小可得到浓度由视场中的颗粒数量确定。2D高斯拟合算法目前需要10x 10像素的感兴趣区域来获得放大率 为60x的准确拟合。具有超过5百万像素的分辨率的高端科学相机在最佳条件下具有视场中的50个估计数量的颗粒。然后，最低可得到浓度c≈0.5 pM。更高的分析物浓度展现增大的结合速率，针对所述增大的结合速率， 需要更高的帧速率(即，更短的积分时间)来解决所有单分子结合事件。 基于泊松分布的等待时间，50/τ的帧速率将确保还解决了分布中的短时间。 通过将入射强度从64W/cm2增大到1kW/cm2，积分时间减小至6ms，S/N 仅适度减小。可以达到的最大帧速率根本上受限于纳米颗粒的光热加热。 对生物样本的研究而言，最大可允许温度上升为大约10K，我们估计其达到10kW/m2的入射强度。这意味着，20fps的帧速率是可达到的，不引起 分析物的热损伤。这种高帧速率准许访问低亲和性交互或高达约5μM的分 析物浓度。
用于使用单分子分辨率进行感测的探针(例如，金属纳米颗粒、电介 质共振器、固态纳米孔)由于每探针低数量的结合位点通常展现有限的动 态范围，禁止累加低分析物浓度处的足够的统计。在本发明的实施例中，通过许多传感器的平行探测来克服这种限制，给出特别投射的7倍程浓度 动态范围。提取分子交互参数分布的能力使能够在未标记的分子群中调查 不均匀性。简单且便宜的光学布局允许使用显微镜容易地实现传感器。
高分析物浓度将给出具有高结合速率的结合事件。这使得以所测量的 时间轨迹处理单独结合事件变得复杂。而且，低亲和性交互可以引起难以 解决的短寿命状态。为了解决此问题，优选的是，使用具有高帧速率的光 学系统。优选地，帧速率或倒数积分时间大于100s-1，更优选地大于1000s-1。
因为当蛋白质加热延长的时间段时其结构和活性可能受损，所以颗粒 的温度是重要的。大多数球状蛋白质展现从40℃到80℃范围的熔解温度， 取决于pH和缓冲条件。基于理论模型，估计需要超过10kWcm-2的入射强 度来使颗粒温度升高多于10K。
可以使用具有高功率的光源来实现高信噪比和高帧速率。然而，高光 学功率可以给出样本流体中不可接受的温度上升，由此，影响生物化学材 料。为了监测此潜在问题，光学温度计可以与系统结合。例如，可以使用 相敏相机或监测金属颗粒发射的蓝移来实现。为了维持可接受的温度，可 以调节入射功率。
来自颗粒的光学信号的漂移由于结合和未结合事件使对信号的观察变 得复杂。为了解决此问题，优选的是，使用内部参考来连续地或周期性地 校准光学信号，例如，给出稳定光学散射信号、不具有共振特性并且不具 有对分子结合的敏感性的颗粒或表面上具有光学活性的另一个基准物体。 来自参考颗粒的信号将是系统的照明和检测状态的光学参考。参考信号可以由处理器用来纠正来自生物感测颗粒的光学信号的由光学系统的部件中 的漂移引起的波动以及光源强度的波动。在表面上使用多个参考颗粒将进 一步提高校准。参考或基准标记的示例是聚苯乙烯球、纳米构造表面结构、 PDMS岛状物。光学信号波动可以由光路长度(例如，垂直于成像平面(z 轴))的变化引起。为了解决此问题，优选的是，系统中具有有效z轴反 馈和控制。
分析物复用(即，同时测量不同分析物)对增加的生物医学敏感性和 特异性是有利的。为了提供这种复用，一些实施例使用其表面上具有不同 受体的颗粒。出于计数统计和精度的原因，颗粒的数量应当为至少等于每 个分析物100个，并且对于具有低结合事件速率(例如，因为其具有低浓度或者由于受体的亲和性和密度)的分析物当必要时应当更高。光学系统 的最小帧速率由具有最高(未)结合事件速率的分析物确定。而且，一些 实施例使用具有不同光学特性的颗粒，从而使得可以混合不同颗粒。颗粒 优选地具有可以被光学地区分并且其表面上具有不同受体的至少两个子总 体。还在这种情况下，出于计数统计和精度的原因，颗粒的数量优选地为 至少每个分析物100个，并且对于具有低结合事件速率(例如，因为其具 有低浓度或者由于受体的亲和性和密度)的分析物更高。光学系统的最小 帧速率由具有最高事件速率的分析物确定。
根据本发明的一些实施例，拴系颗粒运动(TPM)系统可以由将半径 500nm的纳米颗粒(例如，微球体或纳米珠粒)附接至基质的50nm长双 链DNA(dsDNA)系链形成。在典型TPM系统中，随时间跟踪此颗粒的平面内运动，从而使得获得珠粒运动的二维投影。当这种珠粒在若干随后 时间间隔Δt内重复地成像时，所有图像的组合结果导致运动图案。本发明 的TPM方法相比于传统TPM方式的区别特征是系统被设计以使得颗粒可以与表面结合(例如，通过使用互补结合分子来涂覆珠粒和基质两者)的 事实。因此，具有经由系链与基质的一级键的拴系颗粒可以形成与基质的 次要二级键。当形成这种二级键时，运动图案显著改变，并且可以改变其 振幅和/或对称性。此外，结合和未结合状态受目标分析物存在的影响，从 而使得可以通过测量颗粒运动特性的变化来确定分析物存在。运动图案的临时变化指示旨在探测的生物标记或分析物存在，并且因此，这些变化是 此生物标记的浓度的测量值。
图8A是未结合状态下的拴系颗粒的示意图，而图8C是结合状态下的 拴系颗粒的示意图。如图8B的图中所示出的，当每个点与颗粒在表面的 x-y平面中的位置相对应时，未结合拴系颗粒在采样周期期间具有围绕中心 轴(圆心)的对称分布。如图8D的图中所示出的，结合的拴系颗粒在采样 周期期间具有围绕中心轴(圆心)的非对称分布。
本发明的实施例通常可以使用具有附接至表面(基质)的一端以及具 有附接至另外的自由珠粒(颗粒)的另一端的各种类型的聚合物(系链) 中的任何聚合物。系链可以是例如双链DNA、单链DNA或RNA或多肽或 另一种聚合物。然而，能够将颗粒附接至表面的任何聚合物——或甚至任 何高分子——原则上可以用于TPM。优选地，本发明的TPM系统使用具有大约50nm的持续长度的双链DNA(dsDNA)。
更长的系链具有颗粒的结合与未结合状态之间的运动差异大(因此更 容易在结合与未结合状态之间进行区分)以及在颗粒与表面之间探测宽交 互区域(因此更有效地使用生物功能化表面区域)的优点。更短的系链具有颗粒与表面之间的交互速率(命中率、有效浓度)高的优点。有用系链 长度在几纳米到几微米范围内，例如，5nm到10微米。
为了在实验时间尺度上观察拴系颗粒运动，颗粒的大小优选地小于几 微米。可以使用若干类型的颗粒，包括：金属颗粒(例如，黄金)、有机 或无机材料颗粒、聚苯乙烯颗粒以及氟球体。将金属颗粒与聚苯乙烯颗粒 进行比较，金属颗粒的优点是对光的强散射。另一方面，聚苯乙烯颗粒在 光钳实验中频繁使用，并且当包括磁芯时能够磁性控制颗粒。
更大的颗粒具有更高的光学信号和更低的运动模糊(因此更高的定位 准确度)的优点。更小的颗粒具有更高的扩散性以及针对颗粒与表面之间 的更高的交互速率的更快速运动的优点，从而使得由于分析物调节的键引 起的移动性变化具有更高的时间分辨率。有用颗粒大小在几纳米到几微米 范围内，例如，5nm到10微米。
在优选实施例中，由暗场显微镜跟踪颗粒的位置，这导致平行于基质 的颗粒中心X和Y坐标的数据，即，珠粒的2D投射运动。在一些实施例 中，还可以例如使用衍射信号来跟踪颗粒的Z坐标。
在一些实施例中，使用由具有许多磁性氧化铁(Fe2O3)谷粒的聚合物 基质组成的磁性颗粒。可以使用磁铁来致动磁性颗粒，并且可以使用标准 光学显微镜来检测磁性颗粒。
在一个实施例中，用于表征系统的动力学的参数是描述颗粒位置的平 面内向量R→(t)的自相关，
<R→(t)·R→(t+τ)>
特征时间τ1被定义为与描述珠粒位置的平面内向量R→(t)的自相关函 数相关联的时间。例如，在一些实施例中，τ1的值为(0.09±0.01)s，或 者更一般地，τ1可以在0.1s到0.3s范围内。
可以用于生物传感器中的结合部分是例如：蛋白质、抗体、抗体片段、 重组蛋白质、糖类、分子印迹聚合物、小分子、核酸、DNA、适体、多价 结合剂及其组合。
结合部分耦合至颗粒以及优选地在两个物体交互的区域中(即，在颗 粒和表面具有非零命中率的区域中)的表面。部分可以被定位成靠近或远 离系链附接点。未结合与结合之间的运动图案的变化取决于结合发生的位 置。例如，在两个对应的系链附接点处碎片之间的结合给出小居中运动图 案，而在颗粒和基质上的交互区域的外围处碎片之间的结合给出偏离中心运动图案。假如部分108缀合在系链上(或者在系链的表面端或者在系链上的其他地方)并且部分106缀合至颗粒(参见图1的标号)，则106与 108之间的结合可以给出围绕系链附接至表面的点居中的运动图案，所述运动图案现在具有比在这些部分之间的结合不存在的情况下的颗粒运动图案 更小的尺寸，所述更小的尺寸涉及缩短有效系链长度。假如部分106缀合 在系链上(或者在系链的颗粒端或者在系链上的其他地方)并且108缀合 至表面，则106与108之间的结合可以给出居中运动图案，以及偏离中心运动图案，取决于部分108在表面上的位置。因此，结合状态下的图案受 颗粒和基质上的结合剂的位置以及分析物结合的位置的影响。因此，可能 有利的是，拥有具有可能的结合运动图案的查找表，并且使所测量的运动 图案与查找表中的数据相关联，以便使用良好的敏感性检测颗粒结合的发 生。
颗粒和基质上的结合部分的最佳密度取决于试验类型以及分析物浓度。 例如，在具有非常低的分析物浓度的夹心试验中，有益的是，在颗粒和基 质上具有高密度的结合部分，以便具有良好的动力学和良好的敏感性。高 密度可以例如在103部分/μm2与105部分/μm2之间。在竞争性试验中，对应 的结合部分中的至少一个结合部分应当具有低表面密度，以便避免颗粒与 表面之间太强的多价结合，否则，分析物分子无法有效地取代结合，以便使颗粒处于未结合状态。具有其中结合部分之一存在于低数量中的系统的一种方法是其中部分106或部分108缀合至系链的实施例。系链上的部分 的数量可以通过化学制备方法很好的控制，并且可以例如被控制成用于每 个系链仅具有一个结合部分，这在竞争性试验中可能是有利的。
表面上的颗粒之间的间隔应当足够大以使得颗粒不阻碍彼此的运动， 并且足够大以使得颗粒可以独立于彼此被检测，并且足够小以使得大量颗 粒可以固定在感测表面上用于最佳统计。
根据本发明的实施例，生物传感器的制备可以分成若干步骤。第一步 是清洁裸露样本。在第二步期间，表面和颗粒被功能化。第三步是将功能 化颗粒耦合至功能化表面。第四步可以是例如通过使用保护性含糖或者当 流体添加到传感器时溶解的另一种亲水性涂层来涂覆表面而保存表面用于 进一步使用。替代性地，传感器表面可以涂覆有保护生物化学部分并且当传感器与流体样本接触时使分析物通过的水凝胶。存在更多本领域熟知的方法和程序来制备生物传感器设备。
根据本发明的生物感测系统可以用于体外应用或体内应用或更一般地 用于测试人体。其可以用作医疗设备的部分，如导管、碎片、管子、针、 纤维、芯片、电线。其可以用于支撑医疗或者用作用于在身体内或身体上 进行监测的设备的部分。其可以以一次性形式使用，如标本盒、管子、滴 定板。
在体内应用中，探针可以经由过滤模块(例如，使有兴趣的分析物通 过并且阻碍其他部件通过的涂层)和/或经由当与活动系统接触时确保生物相容性和良好的操作的材料与生物系统交互。
实施例可以包括各种附加特征，包括各种形式的复用，例如：分析物 复用、空间复用、光谱复用、探测功能复用。实施例可以包括平行化探测， 用于统计或动态范围(例如，不同探测功能化，在位置和/或光学性质中复用)。针对在复杂生物系统中特别重要的特异性和/或敏感性，实施例可以 包括：各种探针涂层、探针覆盖物、用于将探针嵌入和定位在基质中的各 种方法和材料、分析物分离部件、细胞分离部件。
实施例可以包括分析器或读出仪器，所述分析器或读出仪器将激励发 送到传感器(例如，光学的、电的、声学的)中和/或从传感器处接收信号 并执行信号处理。分析器还可以用于将信号传输至其他仪器和/或远程通信、 处理和/或存储系统。
在一个特定实施例中，生物传感器基于具有单颗粒和单分子敏感性的 在暗场显微镜学设置内实时且同时监测的成百上千个单独颗粒。所述技术 允许在不需要对分析物进行任何标记的情况下对单分子交互进行统计分析。 同时探测几百个纳米颗粒的能力提供具有大动态范围的传感器。生物传感 器是通过实时监测许多单颗粒传感器来克服现有技术的限制的生物感测系统的部分。
数据采集
为了在试验中获得关于颗粒运动的信息，跟踪颗粒运动。优选地但非 必要地使用暗场光学显微镜对颗粒成像。
将原始相机图像数据处理到所有颗粒在视场中的运动图案中。例如， 通过计算运动图案的协方差矩阵的特征向量的长度的平方根，确定沿着短 轴和长轴的数据点的标准偏差。运动图案的对称性被定义为次要振幅与主 要振幅之比。主要运动振幅和运动图案的对称性可以用于为运动图案排序 并且用于根据时间跟踪颗粒行为。完成进一步数据处理以便揭示结合和未 结合事件的数量，并且由此降低分析物浓度。
图9A中展示了根据一个实施例的一种用于颗粒运动测量的装置。颗粒 900通过40nm的dsDNA系链902拴系至基质。分子系链在一端使用生物 素功能化以便与涂覆在颗粒900上的链霉亲和素901结合，并且在另一端 使用德克萨斯红906功能化以便与表面耦合的抗德克萨斯红抗体904结合。 在暗场显微镜安排下使用白光源908和CCD相机910记录颗粒运动。成像 装置包括光束挡块912和透镜914、916、918。由相机910捕获的图像被处 理器911分析。如图9B中所示出的，收集一系列图像920，并且对其进行 分析以便在每个帧中定位颗粒。相应运动图案被构造成点状图922。
短系链902保持颗粒900靠近基质905，并且由此确保颗粒基质交互 的高频采样。通过对颗粒点状图922进行分析，可以以几纳米定位准确度 来分解各种运动图案。偏移运动图案与系链的数量和取向的变化、颗粒粗 糙度以及颗粒与表面之间的结合相关联。
作为说明性具体示例，我们现在描述一种特定实施方式。为了提供功 能化基质905，通过在丙酮、异丙醇和甲醇浴中进行5分钟声处理来清洁玻 璃盖玻片(Menzel-德国)。在每一步之间使用温和的氮气流干燥 基质，并且将其在真空下存储在干燥器中直到使用。使用粘合剂层将体积 为23μL的流体细胞(格雷斯生物实验室(GraceBiolabs))附接至功能化 基质。通过将抗德克萨斯红抗体物理吸附至玻璃来执行对基质的功能化。 抗体在PBS中被稀释到期望的浓度(8ng/mL到5000ng/mL)，并且在流 体细胞中培养60分钟，随后在PBS中使用1wt％BSA的5分钟培养来进 行基质阻挡。在每个培养步骤之后使用1mL PBS冲洗流体细胞。
为了提供具有DNA的颗粒功能化，以每个颗粒10到2000个dsDNA 的比率使用120bpdsDNA培养链霉亲和素涂覆的超顺磁颗粒(MyOne Streptavidin C1，生命技术公司)。已经在商业上从艾拉生物技术(Ella Biotech)(马丁雷德(Martinsried)，德国)获得了一端上具有生物素分 子并且另一端上具有德克萨斯红染料分子的长度为120bp的双链DNA。在 60分钟培养期间PBS缓冲剂中颗粒浓度为8.3pM。在培养期间，DNA上 的生物素部分与链霉亲和素分子结合。这种偶联反应的效率通过上清液试验被确定为大约70％。上清液试验使用DNA插入染料SYBRGreen(参见 更详细的补充数据)的荧光信号来量化反应上清液中的未结合DNA浓度。 在磁分离之后，在PBS中清洗颗粒，并且最后悬浮于PBS中的1wt％BSA 中，达到140fM的最终浓度。
dsDNA功能化颗粒通过在流体细胞中培养经稀释的颗粒5分钟来与抗 体涂覆的基质结合。DNA系链的德克萨斯红端与基质上的德克萨斯红抗体 结合，并且创建如图1中所展示的颗粒拴系基质系统。样本被颠倒并存储 10到30分钟以便通过沉降从基质中移除未结合颗粒。
使用对抗生物素的抗体功能化具有500nm直径的光滑聚苯乙烯(PS) 颗粒(Microparticle GmbH，德国)。使用与MyOne颗粒(参见上文)相 同的协议采用120bp dsDNA功能化颗粒。因为质量密度更低并且直径小于 MyOne颗粒的直径，所以PS颗粒的沉降更慢。因此，PS颗粒使用15分钟 的培养时间。
如图9A中所展示的，在反向尼康(Nikon)Ti-E显微镜(尼康仪器欧 洲BV(NikonInstruments Europe BV)，荷兰)上研究样本。以200x的总 放大倍数观察颗粒，并且使用暗场冷凝器照亮颗粒；颗粒呈现为低强度背 景上的亮点。具有415x 415μm2的视场(FOV)可以包含几个颗粒到几千 个颗粒之间。如图9B中所展示的，以30Hz的采样速率记录颗粒60秒。
在处理器911进行的后处理中，使用基于低通小波的频率滤波器来移 除背景光。通过计算经散射的光点的强度中心来确定单独颗粒的位置。其 他可能的处理技术包括例如傅里叶、小波和阈值滤波。随后帧中的颗粒位 置相关以便产生轨迹每个颗粒减去平均绝对位置/>以便产生相对轨迹/>
在显微镜上的实验期间发生轻微样本漂移。通过标识充当参考的静态 颗粒群来纠正样本的漂移。静态颗粒被定义为具有通过在相对轨迹中的最 大差中应用阈值(对于所有i≠j)来标识的类似运动 轨迹的颗粒。选择阈值p以便最小化由漂移纠正引起的估计误差：/>其中，N(p)是针对所选择的阈值被分类为静态的颗粒数量。根 据这些静态颗粒的平均运动来确定样本的漂移，并且应用低通小波滤波器 来抑制高频噪声和布朗运动贡献。然后针对观察到的样本漂移来纠正根据 原始数据确定的轨迹。
针对1μm的磁性颗粒，定位准确度被确定为小于3nm。由于磁性和 PS颗粒的光学散射信号是可比较的，因此期望PS颗粒的定位准确度非常 类似。
图10展示了颗粒的一系列不同时间相关运动图案。图示示出了在圆盘 运动图案与多条带运动图案之间交替的颗粒的累积位置分散图。图示示出 了八个连续时间间隔。在每个帧中，用灰色指示新收集的点，并且用黑色 指示之前收集的点。首先在帧1中观察颗粒，以便展现指示颗粒的未结合 状态的圆盘图案。帧2中的条带图案指示颗粒在第一位置处与表面结合的 状态，并且帧3中不同取向的条带指示颗粒在第二位置处与表面结合的状态。这些结合与未结合状态在随后的帧4、5、6、7、8中结合。这种实验 演示了可以测量颗粒和表面的不同结合状态之间的转变。所述状态是可逆 且可重复的。所述状态指示除了主要拴系之外的次要结合存在。
感兴趣颗粒是示出了运动图案变化并且与运动随时间的变化类型相对 应的颗粒。通过分析这些颗粒的运动，可以确定颗粒处于结合状态或自由 状态的时间跨度。我们现在提供分析时间相关的运动的两种方法的描述： 步长大小函数和面积函数。
步长大小可以用于量化拴系颗粒的散布性运动。具体地，通过计算拴 系颗粒在某一时间间隔内行进的绝对距离(步长大小)来确定散布性运动。 步长大小被计算为Stepsize(t)＝|r(t+Δt)-r(t)|，其中，r是向量。作为时间 的函数的步长大小示出了大量变化(布朗运动的本质方面)。结果是步长 大小的宽分布。可以通过在某一时间窗口期间对步长大小求平均并且沿着 时间轴移动此窗口来抑制步长大小的变化量。步长大小内的下降指示结合 事件。为了减少步长大小数据内的波动量，在窗口上对步长大小求平均。 为了量化波动，计算每个窗口内的步长大小的标准偏差。当增大窗口大小 时，波动量如期望的减少。然而，增大窗口大小还导致时间分辨率的降低。 因此存在统计波动量与时间分辨率之间的权衡。优选的平均时间窗口例如 取决于颗粒大小。例如，对1微米直径颗粒而言，优选的是0.1s到10s的平均窗口大小。
为了增加自由状态与结合状态下的颗粒的步长大小之间的对比度，在 其中计算步长大小的时间间隔发生变化。在结合状态下，运动不受限于在 其中计算步长大小的时间间隔，但是其受限于由于分子键引起的运动自由 度的限制。步长大小的对比度(作为时间间隔Δt的函数)被定义为自由状 态下的平均步长大小除以结合状态下的平均步长大小。对比度根据Δt增大， 但是时间分辨率将随Δt降低。由于自由状态下的颗粒受限于系链，因此对比度将收敛于最大值。
当颗粒在结合状态下时，颗粒的运动相比于自由状态下颗粒的运动受 到更强的限制。颗粒的步长大小和颗粒探测的面积两者在结合状态下减小。 如图11B中所示出的，为了表示颗粒探测的作为时间的函数的面积，针对 移动窗口计算凸包。这叫做面积函数。可以针对窗口大小的范围计算面积函数。随着窗口大小从若干分之一秒增大到几秒，在更多数据点上计算面 积，并且自由状态下的面积函数增大。然而，当系统在结合状态下时，面积增大相当少。这是因为，在结合状态下，颗粒需要更少的时间来探测其 可用相位空间。因此，在比系统需要探测相位空间的时间更长的时间内计 算面积将导致更大的面积。对自由状态而言，系统仍然在这样的体系中： 当增大窗口大小时，颗粒探测更大的面积。自由状态与结合状态之间的对比度根据窗口大小增大。再次，增大窗口大小的副作用是损失时间分辨率。 可以在算法中使用与步长大小相同的窗口大小以便区分结合状态和未结合 状态。图11B展示了面积函数的更大的变化与远离窗口中的现有数据点的 数据点的添加或去除相关联。当拴系颗粒形成分子键时，步长大小和面积 函数的减小不总是相等。这种减小取决于分子键相对于系链的位置。
分析颗粒运动的目的是在观察到的拴系颗粒运动中辨别结合事件。
在已经执行了原始数据分析之后，所有颗粒的轨迹已知。对于这些轨 迹，与单个拴系颗粒相对应的轨迹是特别感兴趣的。第一步是过滤出所有 不感兴趣运动图案。通过在次要振幅和运动图案的对称性两者上设置阈值， 可以过滤出一大组不感兴趣运动图案。所使用的阈值优选地如下：对短系 链系统而言，对称性>0.75，并且50nm<次要振幅<175nm；并且对长 系链系统而言，对称性>0.85，并且125nm<次要振幅<225nm。但是， 这些阈值仅是指示，并且针对相关系统可以被优化。可以丢弃满足选择标 准的环型和钟型运动图案，但是这并不绝对必要。
对于每个所选轨迹，计算作为时间的函数的拴系颗粒系统的状态(由 状态向量表示)。状态向量被定义为零和一的列表，其中，一与结合状态 下的系统相对应，并且零与自由状态相对应。所述算法首先通过查看步长 大小函数和面积函数两者来计算对状态向量的粗略估计。使用每个函数分 析运动，并且通过设置两个阈值确定系统的状态，如图11A中所示出的上 阈值和下阈值，图11A是相对于时间的步长(或面积)函数的曲线图。下 阈值之下的函数的转变用于检测状态从自由到结合的变化(结合事件)。 上阈值之上的函数的转变用于检测状态从结合到自由的变化(未结合事件)。 使用两个不同阈值，从而使得状态检测对统计波动不太敏感，因为仅检测到非常大的增大或减小。仅在两个函数与将处于结合状态的系统有关的帧 中，将状态向量设置为一。选择两个函数的上阈值和下阈值，从而使得下 阈值处于比结合状态的水平更高的水平，并且上阈值低于自由状态下的水 平大约1西格玛。因为系统的规模不同，所以两个模型系统的阈值不同。 第三且最后一步是确定每个结合周期的准确的起始帧和结束帧。
系统还可以配备有用于向颗粒施加力的方法，例如，基于磁力、光力 或声学力。施加力可以帮助在结合颗粒与未结合颗粒之间进行区分，或者 影响结合状态与未结合状态之间的动力学和/或平衡，由此，提高生物感测 的敏感性、特异性和/或速度。
本发明的各种单独实施例中所描述的特征不必是排外的，并且通常可 以与彼此结合使用。这种特征和实施例还包括以下美国临时专利申请中所 描述的材料：提交于2014年12月16日的62/092751、提交于2014年12 月16日的62/092763以及提交于2015年3月12日的62/132096，所有以 上美国临时专利申请均通过引用结合在此。

Claims (44)

1.一种用于使用拴系颗粒运动来感测分析物的生物传感器设备，所述生物传感器设备具有表面和系链分子，所述系链分子在第一端结合至所述表面并且在第二端结合至颗粒以形成拴系颗粒，其中，所述颗粒用第一分子功能化或所述表面用第二分子功能化，所述第一分子和所述第二分子能够结合分析物，
其中，所述拴系颗粒具有其中该拴系颗粒处于较大阻碍状态下的状态和其中所述拴系颗粒处于较少阻碍状态下的状态，其中，所述拴系颗粒根据所述分析物的存在与不存在来在所述两个状态之间切换，
由此所述颗粒的运动特性取决于所述分析物的存在而变化，从而使得通过测量所述颗粒在空间坐标参数上相对于所述表面的变化来感测所述分析物。
2.如权利要求1所述的生物传感器设备，其特征在于，所述表面是基质的表面或第二颗粒的表面。
3. 如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，所述颗粒具有在5 nm到10 µm范围内的尺寸。
4. 如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，所述系链分子具有在5 nm到10 µm范围内的长度。
5.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，该生物传感器设备包括结合至至少100个对应系链分子的第二端的至少100个颗粒，该至少100个对应系链分子在第一端结合至所述表面。
6. 如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，该生物传感器设备在415 ×415 µm2的区域中包含几个到几千个颗粒。
7. 如权利要求1或2所述的生物传感器设备，进一步包括具有衍射极限的光学系统，其中所述生物传感器设备包括拴系颗粒：
-该拴系颗粒通过至少所述光学系统的衍射极限与最邻近的拴系颗粒分离；和/或
-该拴系颗粒具有在所述表面上以交替方式图案化的不同光谱特性，该拴系颗粒具有低于所述衍射极限的最小间隔。
8.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，所述生物传感器设备执行结合试验、竞争试验、置换试验、夹心试验、酶试验、目标和/或信号放大的试验、多步试验或分子级联的试验。
9.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，所述第一分子与所述颗粒以及所述第二分子与所述表面的缀合和链接以这样的方式完成，使得所述第一分子和所述第二分子具有分析物特定结合活性。
10.如权利要求9所述的生物传感器设备，其特征在于，所述分析物特定结合活性是分析物特定生物结合活性。
11.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，耦合至所述颗粒的所述第一分子或耦合至所述表面的所述第二分子具有在103到105分子/µm2范围内的密度。
12.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，所述第一分子和所述第二分子是蛋白质、碳水化合物、糖类、分子印迹聚合物、小分子、核酸、适体、多价结合剂或其组合。
13.如权利要求12所述的生物传感器设备，其特征在于，所述蛋白质是抗体、抗体片段或重组蛋白质。
14.如权利要求12所述的生物传感器设备，其特征在于，所述核酸是DNA分子。
15.如权利要求12所述的生物传感器设备，其特征在于，所述第一分子和所述第二分子是用于电解质、代谢物、小分子、高分子、脂肪、糖类、多肽类、激素、药物、蛋白质、寡核苷酸、DNA、RNA、纳米颗粒、细胞、细胞片段或其组合的结合分子。
16.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，其特征在于，该生物传感器设备适于进行复用。
17.如权利要求16所述的生物传感器设备，其特征在于，所述复用为分析物复用、空间复用、光谱复用和/或探测功能复用。
18. 如权利要求1或2所述的生物传感器设备，用于：
-体内生物感测或体外生物感测；或
-体外诊断测试、定点护理测试、连续监测、环境测试、食品检验、取证、或生物、生物医学和药物研究、或用于监测对活细胞、组织或器官的实验。
19.如权利要求18所述的生物传感器设备，其特征在于，所述体外生物感测为离体生物感测。
20.如权利要求1或2所述的生物传感器设备，用作内窥镜上或内窥镜中或作为内窥镜一部分的传感器、管子、针、纤维、碎片或一次性探针或一次性标本盒。
21.如权利要求20所述的生物传感器设备，其特征在于，所述管子是导管。
22.一种用于使用拴系颗粒运动来感测分析物的生物传感器设备，所述生物传感器设备具有表面和系链分子，所述系链分子在第一端结合至所述表面并且在第二端结合至颗粒以形成拴系颗粒，其中，所述颗粒用第一分子功能化，且所述表面用第二分子功能化，
其中，所述拴系颗粒具有第一状态，在该第一状态中，通过将所述分析物结合至第一分子和第二分子或通过将第一分子和第二分子互相结合，将所述拴系颗粒结合至所述表面；且
其中，所述拴系颗粒具有第二状态，在该第二状态中，所述拴系颗粒没有结合至所述表面，其中，所述拴系颗粒自由移动，该移动受限于结合至所述表面的所述系链分子，
其中，所述拴系颗粒根据所述分析物的存在与不存在来在所述第一与第二状态之间切换，
由此所述颗粒的运动特性取决于所述分析物的存在而变化，从而使得通过测量所述颗粒在空间坐标参数上相对于所述表面的变化来感测所述分析物。
23.如权利要求22所述的生物传感器设备，其特征在于，所述表面是基质的表面或第二颗粒的表面。
24. 如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，所述颗粒具有在5 nm到10 µm范围内的尺寸。
25. 如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，所述系链分子具有在5nm到10 µm范围内的长度。
26.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，该生物传感器设备包括结合至至少100个对应系链分子的第二端的至少100个颗粒，该至少100个对应系链分子在第一端结合至所述表面。
27. 如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，该生物传感器设备在415× 415 µm2的区域中包含几个到几千个颗粒。
28. 如权利要求22或23所述的生物传感器设备，进一步包括具有衍射极限的光学系统，其中所述生物传感器设备包括拴系颗粒：
-该拴系颗粒通过至少所述光学系统的衍射极限与最邻近的系链的颗粒分离；和/或
-该拴系颗粒具有在所述表面上以交替方式图案化的不同光谱特性，该拴系颗粒具有低于所述衍射极限的最小间隔。
29.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，所述生物传感器设备执行结合试验、竞争试验、置换试验、夹心试验、酶试验、目标和/或信号放大的试验、多步试验或分子级联的试验。
30.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，所述第一分子与所述颗粒以及所述第二分子与所述表面的缀合和链接以这样的方式完成，使得所述第一分子和所述第二分子具有分析物特定结合活性。
31.如权利要求30所述的生物传感器设备，其特征在于，所述分析物特定结合活性是分析物特定生物结合活性。
32.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，耦合至所述颗粒的所述第一分子或耦合至所述表面的所述第二分子具有在103到105分子/µm2范围内的密度。
33.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，所述第一分子和所述第二分子是蛋白质、碳水化合物、糖类、分子印迹聚合物、小分子、核酸、适体、多价结合剂或其组合。
34.如权利要求33所述的生物传感器设备，其特征在于，所述蛋白质是抗体、抗体片段或重组蛋白质。
35.如权利要求33所述的生物传感器设备，其特征在于，所述核酸是DNA分子。
36.如权利要求33所述的生物传感器设备，其特征在于，所述第一分子和所述第二分子是用于电解质、代谢物、小分子、高分子、脂肪、糖类、多肽类、激素、药物、蛋白质、寡核苷酸、DNA、RNA、纳米颗粒、细胞、细胞片段或其组合的结合分子。
37.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，其特征在于，该生物传感器设备适于进行复用。
38.如权利要求37所述的生物传感器设备，其特征在于，所述复用为分析物复用、空间复用、光谱复用和/或探测功能复用。
39. 如权利要求22或23所述的生物传感器设备，用于：
-体内生物感测或体外生物感测；或
-体外诊断测试、定点护理测试、连续监测、环境测试、食品检验、取证、或生物、生物医学和药物研究、或用于监测对活细胞、组织或器官的实验。
40.如权利要求39所述的生物传感器设备，其特征在于，所述体外生物感测为离体生物感测。
41.如权利要求22或23所述的生物传感器设备，用作内窥镜上或内窥镜中或作为内窥镜一部分的传感器、管子、针、纤维、碎片或一次性探针或一次性标本盒。
42.如权利要求41所述的生物传感器设备，其特征在于，所述管子是导管。
43.一种生物感测系统，包括如权利要求1-42中任一项所述的生物传感器设备，其中所述生物感测系统进一步包括数字相机，该数字相机具有像素的图案，其中所述生物传感器设备包括在所述表面上图案化的拴系颗粒，其中在所述表面上的所述拴系颗粒的图案与所述数字相机芯片上的所述像素的图案共形。
44. 一种用于使用拴系颗粒运动来感测分析物的方法，所述方法包括：
使包含所述分析物的基质与如权利要求1所述的生物传感器设备相接触；以及
检测所述颗粒的运动特性，该运动特性取决于所述分析物的存在而变化，其中所述运动特性包括所述颗粒相对于所述表面的空间坐标参数。
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