CN105358979A

CN105358979A - 借助靶向固定、表面放大、以及像素化读取和分析的分析物检测增强

Info

Publication number: CN105358979A
Application number: CN201480028669.XA
Authority: CN
Inventors: S·Y·周; L-C·周
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-02-24
Also published as: WO2014146115A3; WO2014145036A1; WO2014197097A3; CN105209884A; WO2014145798A2; US20190049385A1; WO2014197096A2; EP2969542A4; WO2014197096A3; CN105247349A; US20140264989A1; US20140265013A1; CN105229467A; WO2014145798A3; US20220205920A1; US20160025634A1; CN105246682A; EP2969542A2; WO2014197097A2; EP2972239A4

Abstract

本公开提供了，除其他事项外，样品分析方法，其包括：(a)使目标分析物与附接到板表面上的捕捉剂结合，其中所述板包括(i)包含增强信号的纳米结构的感测放大层和(ii)附接到所述感测放大层上的捕捉剂；(b)用读取装置读板，以产生代表各个结合事件的信号的图像；并且(c)对图像区域中的各个结合事件进行识别和计数，由此提供对所述样品中的一种或多种分析物的量的估计。还提供了用于实施所述方法的系统。

Description

借助靶向固定、表面放大、以及像素化读取和分析的分析物检测增强

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国政府的支持下由(美国)国防部高级研究计划局(DARPA)授予的基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。

交叉引用

本申请是2013年3月15日提交的美国申请系列号13/838,600(NSNR-003)的部分继续申请，所述申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请系列号61/622,226的权益，并且是2013年6月13日提交的美国专利申请系列号13/699,270的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的US2011/037455的§371申请案，并且要求2010年5月21日提交的美国临时申请系列号61/347,178的权益；

本申请也是2013年6月13日提交的美国申请系列号13/699,270(NSNR-001)的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的国际申请系列号US2011/037455的§371申请案，所述申请要求2010年5月21日提交的美国临时专利申请系列号61/347,178的权益；并且

本申请还要求以下申请的权益：2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,424(NSNR-004PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,096(NSNR-005PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/800,915(NSNR-006PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/793,092(NSNR-008PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,933(NSNR-009PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/794,317(NSNR-010PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,020(NSNR-011PRV)和2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,223(NSNR-012PRV)，所有这些申请通过提述并入本文用于所有目的。

背景

本发明涉及可改进对分析物的感测的方法和系统。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。

概述

以下简述并不意在包括本发明的所有特征和方面，也不意指本发明必须包括在此简述中论述的所有特征和方面。

本公开提供，除其他事项之外，可改进感测分析物的方法和系统。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。感测包括检测目标分析物的存在、定量目标分析物的浓度、和确定目标分析物的状态。所述方法使用(a)固体基片，其有一个表面被材料层覆盖，该材料层称为“感测放大层”或SAL，可显著放大在仅相距SAL表面微小距离(称为检测区)之内产生的待感测的信号；(b)目标分析物的固定，和(c)电磁信号的像素化读取和分析。所述SAL放大由固定在SAL表面上的分子产生的电磁信号(例如电信号、光信号)，而不放大或不显著放大所述分子的数目。这种放大，加上放大区的甚小深度(约100nm)，产生了下述优势：(i)高灵敏度(即，更好的检测限)，(ii)总读取时间成数量级的缩短，(iii)对于给定的检测性能而言，可使用灵敏度较低或较不昂贵的读取器，和(iv)线性放大和更高的动态范围。因此，还使用电场来辅助分子选择性、或结合、以及检测。

附图简述

本领域技术人员将会理解，如下所述的附图仅用于说明目的。所述附图并不意图以任何方式限制本文教导的范围。有些附图并未依比例给出。

图1是使用表面区放大、以及像素化读取和分析进行分析物检测增强的方法的流程图。

图2是通过靶向固定、表面放大、以及像素化读取和分析而实现的分析物检测增强方法的示意图。(A)固定在基片表面上的捕捉剂，所述基片的一个表面被材料层覆盖，所述材料层称为“感测放大层”或SAL。(B)分析物与SAL表面上的捕捉剂的特异性结合。(C)用读取装置读板，以产生代表各个结合事件的信号的图像。保持所述板和成像器的装置组件沿三个正交方向(x,y,z)中的至少一个控制或改变所述板与所述读取装置之间的相对位置，以便读取信号。

用于存储所述图像的数据存储装置和电子器件、以及包含用于对图像的某一区域中的各个结合事件进行识别和计数的程序的计算机，由此提供对所述样品中的一种或多种分析物的量的估计。

图3示意性地展示了示例性的分析物、具有“感测放大层”SAL的测定板结构。(A)分析物为带有检测标记物的蛋白质。(B)分析物为没有使用另外的检测标记物的蛋白质。(C)分析物为小分子。(D)分析物为DNA或RNA。MSA是可选的。捕捉剂可直接附接到SAL。(图形不是按比例的)

图4示意性地展示了电场辅助免疫测定的实施方案。在“感测放大层”(SAL)与对电极之间供应电压。所述SAL增强了局部电场和电场梯度，进而增强了测定特性，包括改进感测灵敏度和减少温育时间。

图5显示了使用像素测定求出分析物数量的算法的流程图。

图6：(A)在SAL上的荧光测定的示例像素读出2D图像的图解。(B)亮像素的时间荧光强度依赖性，二元开/关行为表明亮像素仅含有单个分子。

图7为显示人CEA癌生物标志物的四层夹心免疫测定的示例免疫测定的示意图。

图8显示亮像素数作为在不同的CEA分析物浓度下的像素信号强度的函数的直方图。将亮像素数对所述检测区内的总等离子热点数归一化。

图9示意性地展示了用于进行像素读取方法的检测/探测系统。

图10是显示在160秒内在交流电(DC)场中温育的10pM免疫测定的荧光强度的曲线图。虚线为在没有DC场条件下使用1小时温育时间进行的相同免疫测定的荧光信号强度。

图11：在一定偏压下，电场和电场梯度可帮助分析物的附接和对齐，进而可改进感测灵敏度。(a)带负电的IgG。尽管总电荷为负，但是在抗体上的电荷分布是不均匀的。(b)定向抗体的电化学沉积的示意图。金(Au)电极与DSU单分子层一起作用。

图12.柱上盘(DoP)结构(400)的示意图。(a)一般结构的概观。(b)一个实施方案的横截面，该实施方案中背面金属膜在立柱周围并且与立柱相邻，所述立柱是电介质或半导体。(c,d,e)另一个实施方案的横截面，该实施方案中金属膜是在所述盘的下面展开的膜片，但是所述立柱具有与所述盘不同的横向尺寸。

图13.具有分子连接层的盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)板的示意图。(A)没有免疫测定系统的D2PA板的概观。(b)在涂覆所述分子连接层(也称为“分子粘附层”)(160)之后的横截面。(c)在涂覆所述分子连接层之前和之后。

相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是，附图用于示出本公开中给出的构思，并且不是依比例给出的。

在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是，本发明的应用不限于下文描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。

定义

在更详细地描述例示性实施方案之前，列出下述定义，以说明并界定说明书中使用的术语的含义和范围。

如本文中使用的术语“盘耦合柱上点天线阵列”(“disk-coupleddots-on-pillarantennaarray”)和“D2PA”是指在图12和13中展示的装置，其中阵列100包括：(a)基片110；和(b)位于基片的表面上的D2PA结构，其包括从基片表面伸出的一个或多个立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括柱体120、在所述立柱顶部的金属盘130、在所述立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的所述基片表面的相当大部分；布置在所述立柱侧壁上的金属点结构130。所述D2PA将邻近D2PA表面的光信号放大。所述D2PA增强邻近D2PA表面的区域中的局部电场和局部电场梯度。所述光信号包括光散射、光衍射、光吸收、非线性光产生和吸收、拉曼散射、色度、发光，其中发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。

D2PA阵列还可包括覆盖所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分的分子粘附层、和任选地特异性地与分析物结合的捕捉剂，其中所述捕捉剂连接到所述D2PA阵列的分子粘附层上。当所述分析物结合于捕捉剂时，纳米传感器可放大来自分析物的光信号。一个优选的SAL实施方案是，SAL的一个、几个或所有关键金属和介电部件的尺度小于感测中的光的波长。盘耦合柱上点天线阵列的物理结构的详情、用于制造它们的方法、用于将捕捉剂连接到盘耦合柱上点天线阵列上的方法和使用盘耦合柱上点天线阵列来检测分析物的方法描述于许多出版物中，包括WO2012024006、WO2013154770、Li等(OpticsExpress201119,3925-3936)、Zhang等(Nanotechnology201223:225-301)；和Zhou等(Anal.Chem.201284:4489)，通过提述将这些出版物的公开内容并入本文。

术语“分子粘附层”指具有确定厚度的一层或多层分子，其包括附接于纳米器件的内表面和能结合至捕捉剂的外表面。

术语“捕捉剂反应性基团”指分子中具有化学功能的部分，其对捕捉剂具有反应性，即，能与捕捉剂中的部分(例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团)反应生成稳定的强(例如共价)键。

如本文中使用的，术语“捕捉剂”指经由相互作用结合靶分析物的作用剂，该相互作用足以允许该作用剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作用通常由捕捉剂的亲和力区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。某些捕捉剂以小于约10^-6M(例如小于约10^-7M、小于约10^-8M、小于约10^-9M、小于约10^-10M、小于约10^-11M、小于约10^-12M、至低达10^-16M)的解离常数(K_D)特异性结合靶分子，而与其它分子没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质(例如抗体)和核酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA，包括适体)。

术语“特异性结合”和“选择性结合”指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的(例如有活性的)和不想要的(例如无活性的)靶分子，通常大于约10至100倍或更多(例如大于约1000或10,000倍)。

术语“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合物形式，即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸，通常不大于约10,000个氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨酸残基的融合物；带免疫学标签的蛋白质；具有可检测的融合配偶的融合蛋白，例如包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白；等等。这些术语还包括在细胞中经过翻译后修饰(例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等)的多肽，具有二级或三级结构的多肽，和与其它部分(例如其它多肽、原子、辅因子等)强结合(例如共价或非共价)的多肽。

术语“抗体”意图指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够结合抗原的单链抗体和噬菌体展示抗体。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度的聚合物，或合成生成的、能够与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交(例如能参与Watson-Crick碱基配对相互作用)的化合物(例如美国专利No.5,948,902及其引用的参考文献中记载的PNA)。

如本文中使用的，术语“互补”指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配对。在规范的Watson-Crick碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替换。如此，A与T互补，而G与C互补。通常，“互补”指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补，使得序列中的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不是完全互补(100％互补性)，但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然可以与非靶序列进行碱基配对时，可以计算百分比互补性以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。一般而言，50％或更低的互补性不引起非特异性结合。另外，70％或更低的互补性在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。

如本文中使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸构成的聚合物。

如本文中使用的，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。

如本文中使用的，术语“寡核苷酸”表示长约10个至200个核苷酸，直至300个核苷酸或更长，例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的，而且在某些实施方案中，长度小于300个核苷酸。

如本文中使用的，术语“附接”指一个分子与另一个分子的强(例如共价或非共价)键连接。

如本文中使用的，术语“表面附接”指分子强附接于表面。

如本文中使用的，术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物。在特定实施方案中，样品可以是自生物学样品获得的，生物学样品例如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕(nasaldrainage)和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液(rheum)、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中，样品可以是自受试者(例如人)获得的，而且可以在用于主题测定法之前进行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自组织样品提取蛋白质/核酸，提取方法是已知的。在特定实施方案中，样品可以是临床样品，例如自患者收集的样品。

术语“分析物”指能被捕捉剂结合和检测的分子(例如蛋白质、核酸、聚合物或其它分子、它们的复合物或颗粒)。

术语“测定”指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。

如本文中使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，包括定量和定性测定二者。

如本文中使用的，术语“发光标记物”指当处于外部激发下时能发出光的标记物。这可以是发光(luminescence)。荧光标记物(其包括染料分子或量子点)和冷发光标记物(例如电致发光或化学发光标记物)是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光(光子)、对于电致发光而言是电流，对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述的组合。

短语“带标记的分析物”指这样的分析物，该分析物被发光标记物可检测地标记，使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标记的(即，可以将分析物自身直接缀合于标记物，例如通过强的键，如共价或非共价键直接缀合于标记物)，或者，带标记的分析物可以是被间接标记的(即，分析物被次级捕捉剂所结合，而次级捕捉剂是被直接标记的)。

术语“杂交”指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而，术语“原位杂交”指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。

就核酸而言，术语“杂交”和“结合”可互换使用。

术语“捕捉剂/分析物复合物”是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在“特异性结合条件”或“适合于特异性结合的条件”下彼此特异性结合，其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发生结合的条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。此类条件(特别是就抗体及其抗原和核酸杂交而言)是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane(Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和Ausubel等,ShortProtocolsinMolecularBiology,5thed.,Wiley&Sons,2002)。

如本文中使用的，术语“特异性结合条件”指生成包含彼此特异性结合的成对分子的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如抗体/抗原)复合物，同时不利于并非彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合(全体)，而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。

对于核酸杂交，特异性结合条件可以如下实现：于42℃在50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖酐、和20μg/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育，接着于约65℃在0.1xSSC中清洗滤膜。

对于抗体结合抗原，特异性结合条件可以如下实现：在封闭溶液(例如含3％BSA或脱脂乳的PBS)中封闭含有抗体的基片，接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样品一起温育。在该温育之后，在清洗溶液(例如PBS+TWEEN20)中清洗基片并与捕捉第二抗体(检测抗体，它识别抗原中的另一位点)一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可检测标记物，例如荧光团，诸如IRDye800CW、Alexa790、Dylight800。再次清洗之后，可以检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号及降低背景噪声的参数。

术语“次级捕捉剂”(也可称作“检测剂”)指对抗原具有高度特异性亲和力的一组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物，例如酶、荧光标记物等强连接，或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所检测((Hermanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd.,2008)。

术语“生物素部分”指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至少10^-8M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头，例如─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素，其中n为3-12。

术语“链霉亲合素”指链霉亲合素和亲合素二者，以及它们的任何以高亲和力结合生物素的变体。

术语“标志物”指这样的分析物，它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状况相关。

术语“键”包括共价和非共价键，包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。

术语“放大”指信号的量级(magnitude)的增大，例如信号增大至少10倍、增大至少100倍、、增大至少1,000倍、增大至少10,000倍、或增大至少100,000倍。

术语“局部”是指“在某个位置”。

其他特异性结合条件是本领域已知的并且也可在本文中采用。

必须注意的是如本文中和在所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数指示物，除非上下文中另外清楚地指出，例如，当使用词语“单个”时。例如，提及“一种分析物”包括单种分析物和多种分析物，提及“一种捕捉剂”包括单种捕捉剂和多种捕捉剂，并且提及“一种检测剂”包括单种检测剂和多种检测剂。

示例性实施方案的详述

以下详述通过举例而不是以限制的方式展示了本发明的一些实施方案。

本发明涉及可改进对分析物的感测的方法和系统。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。目标分析物可以在溶液中或在空气或气相中。

感测包括对目标分析物的存在的检测、对目标分析物的浓度的定量、和对目标分析物的状态的确定。

如图1和图2中所示，在本发明的一个实施方案中，改进对溶液或气相中的分析物的感测的方法包括：

(a)获得板200，其包括基片202，该基片的一个表面被材料层覆盖，所述材料层称为“感测放大层”或SAL201，其包括纳米结构，所述纳米结构放大与SAL的表面仅相距微小距离之内(称为检测区)产生的待感测的信号；

(b)将捕捉剂203固定在SAL201表面上；

(c)使分析物204与SAL201表面上的捕捉剂结合；

(d)用读取装置205以像素化方式读取所述板，以产生代表各个结合事件的信号的图像；并且

(e)分析2D信号图，以对该图像的某个区域中的各个结合事件进行识别和计数，由此提供对所述样品中的一种或多种分析物的量的估计。

在步骤(c)之前，以上方法还可包括在目标分析物与所述捕捉剂结合之前或之后用标记物209标记所述目标分析物的步骤。

与集中式的信号读取(来自整个检测区的信号在一起测量)相比，像素化的读取拾取每个像素上的信号，并去除检测区中的强背景，从而导致更高的灵敏度(即，更好的检测限)和更宽的动态范围。使用SAL显著增强了像素化读取的优点，从而达到进一步更高的灵敏度和更宽的动态范围。

图3示意性地展示了示例性分析物、具有“感测放大层”SAL201和可选的分子间隔物/粘附层(MSA)208的测定板结构。(A)分析物为带有检测标记物209的蛋白质。(B)分析物为没有使用另外的检测标记物的蛋白质。(C)分析物为小分子。并且(D)分析物为DNA或RNA。MSA208是可选的。捕捉剂可直接附接到SAL上。

施加外电场

在其他实施方案中，在分析物的选择性结合过程中或在信号测量过程中施加偏压，产生电场和电场梯度，以改善(1)选择性和结合质量，(2)结合速度，和(3)检测信号，以及由此改善检测灵敏度(即，更好的检测限)和或检测速度。原因之一在于，电场和/或电场梯度可加速已被置于板表面上的溶液中的分析物向感测放大层上的捕捉剂移动，并且可使分析物和/或捕捉剂对齐到对结合和/或感测而言更好的位置。

在实施方案之一中，SAL201可用作一个电极，并且导电板206将用作第二电极。可使用电源360施加偏压(即电压差)。该偏压产生电场和电场梯度。将施加一直流(DC)电场。两个电极相距毫米量级，并且施加在所述电极之间的电压为0.1V到1000V(参见图4)，取决于所述电极之间的间距207。在一些情况下，可以使用交流(AC)电场，施加在所述电极之间的峰间电压为0.1V到1000V，并且频率为100Hz到1000MHz。对于使用介电泳(DEP)力，DC和AC两者均可起作用，因此我们可以要求保护AC。将使用的确切偏压取决于所要求的电场和/或电场梯度。

目标分析物表面浓度

所述方法可用于测量在固定的分析物空间上显著分离、或在固体表面基片上彼此重叠的情况下的分析物的浓度。

基片

上述基片202可以是任何形式，只要它在其表面上具有固相即可，因此其包括任何材料制成的刚性或柔性实心板或薄膜，只要所述材料及其形式不显著干扰感测即可。

表面放大

上述的“放大”是指放大由固定在SAL表面201上的分子203、204产生的电磁信号(例如电学的、光学的、以及它们的组合，并且处于不同的波长)，而不放大或不显著放大该分子的数目。

上述的“显著放大”意指所述放大是玻璃、塑料、或平坦金属膜的表面上的信号提高到至少100倍。

相距SAL201的表面的微小距离(要感测的信号在该距离内被放大)，即检测区的深度，为约150nm或更小，对于发光典型地为80nm或更小，并且对于拉曼散射为60nm或更小。

表面放大层(SAL)的优势

使用SAL的关键优势有几个。

(1)由于SAL仅放大在相距固定有分析物的表面的微小距离内(即，在检测区的深度内)产生的信号，检测区外的分子所产生的干扰信号对检测区内产生的信号的干扰将会更少；放大越高，干扰越少。因此，SAL将增加目标分析物的检测灵敏度，且放大越高，增加越高。

(2)SAL区放大还减少了对于给定的感测灵敏度或检测限的信号读取时间。这对于使用像素化读取具有显著的实际意义，因为这样的读取往往涉及1,000到10,000,000个的大量像素，因而在一个像素上的节省任何时间将导致1,000到10,000,000倍的时间节省。因此，所述SAL区放大将使以往不可能的像素化读取成为可能。

(3)SAL区放大还允许使用较低灵敏度的检测器，因此使得可能使用便携的和/或低成本的读取系统，进而显著增加本发明方法的广泛使用。

(4)SAL区放大与目标分析物大致成比例地放大信号(即，与分析物大致呈线性关系)，而不是在大多数基于对分子数目的放大的感测方法中的非线性关系。这导致更好的灵敏度和更宽的动态范围。

具有SAL的本发明在许多方面不同于现有技术，包括如下方面：(a)现有技术没有SAL。(b)现有技术使用ELISA或其他需要放大分子的数目来获得可检测信号的方法。而本发明并非如此。(c)一些现有技术在已将目标分析物固定在表面上之后附接纳米颗粒来放大信号。这些纳米颗粒位于信号产生分子的顶上。但是这样的方法的问题在于：(i)纳米颗粒可能阻断信号，(ii)由于纳米颗粒的大小，仅可使用有限数目的纳米颗粒，因此限制了可检测的分析物的浓度，以及(iii)就像有一小部分与地面接触的汽车轮胎一样，仅有小部分的纳米颗粒可以接近分析物而发挥效果，而其余部分的纳米颗粒阻止在其下面的分析物接触纳米颗粒。

感测放大层(SAL)

SAL201包括由可增强信号的金属材料和介电/半导体材料制成的纳米结构层。通常，SAL的外表面(SAL的内表面是与基片表面接触的表面)涂覆有分子粘附/间隔层，所述层具有以下两种功能或其中之一：(1)提供良好的粘附以便与捕捉剂结合，以及(2)作为间隔物，控制SAL中的金属与信号产生分子之间的距离以优化信号放大。一个优选的SAL实施方案是，SAL的一个、几个或所有关键金属和介电部件的尺寸小于感测中的光的波长。

用于SAL结构1的实施例

感测放大表面的一个实施方案包括一个或多个金属盘以及显著连续的金属膜，其中所述金属盘的相当大部分与所述金属膜分隔开，并且所述盘的间隔和尺寸小于在感测中使用的光的波长。

显示在图12中的实施方案400的几个例子包括基片410、基本上连续的金属膜420、从所述基片的表面伸出的一个或多个立柱，其中至少一个立柱包括柱体420、位于立柱顶部的金属盘430、和金属底板450。所述金属底板可以为A451型：在立柱的底部，覆盖立柱底部附近的基片表面的相当大部分；或B452型：在立柱下面延展的一片膜。所述盘的横向尺寸可比所述立柱大(这是优选的)，或所述立柱小或与所述立柱相同。

在使用400nm到1,000nm的光波长(可见光到近红外)进行感测的一个实施方案中，所述间隔为0.5到30nm，并且盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，取决于在感测中使用的光波长。这样的实施方案的一个例子显示在图12中。在所有实施方案中的金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。

所述感测放大表面的另一个实施方案包括一个或多个在基片上的金属盘，并且盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，在两个邻近的盘之间的间隙为至少0.5到30nm。

用于SAL结构2的实施例D2PA

参考图13，D2PA板是具有被称为“盘耦合柱上点天线阵列”(D2PA)100的表面结构的板，其包括：(a)基片110；和(b)基片表面上的D2PA结构，其包括从基片表面伸出的一个或多个立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括柱体120、位于所述立柱顶部的金属盘130、位于所述立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的基片表面的相当大部分；布置在所述立柱侧壁上的金属点结构140。所述D2PA将邻近D2PA表面的光信号放大。所述D2PA增强邻近该D2PA表面的区域中的局部电场和局部电场梯度。

所述光信号包括光散射、光衍射、光吸收、非线性光产生和吸收、拉曼散射、色度、和发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。

一般形状和尺寸。在一些实施方案中，所述立柱的一个或多个部分的尺寸、或者两个部件之间的距离可以小于被放大的光的波长。例如，柱体120的横向尺寸、柱体120的高度、金属盘130的尺寸、金属点结构140之间的任何间隙之间的距离、金属点结构140与金属盘130之间的距离可以小于被放大的光的波长。在一些实施方案中，不使用金属点，只有所述金属盘和所述金属底板被间隙分隔开。

如图13中所示，可以阵列的形式将立柱安排在基片上。在特定情况下，阵列中最接近的立柱可以相隔小于所述光的波长的距离。所述立柱阵列可以是周期性的或非周期性的。

用于所有带立柱的SAL的立柱基片顶层上的柱体可以由绝缘材料形成，但可以是半导体。用于形成立柱的示例性材料是电介质：二氧化硅、氮化硅、氧化铪(HfO)、氧化铝(AlO)或半导体：硅、砷化镓(GaAs)、和氮化镓(GaN)。一旦形成，所述立柱可具有柱形的(直的)、倾斜的、弯曲的、或其任何组合形状的侧壁。立柱的顶面的形状可以是圆形、尖的(金字塔状)、多边形、椭圆形、长条形、多边形、其他类似形状或其组合。每个立柱的高度可从5nm到300nm中选择。

每个立柱的横向尺寸应当小于被放大的光波长，并且应当根据要放大的光波长从5nm到8,000nm中选择。阵列中的立柱之间的间距可以是周期性或非周期性的。优选的间距应当小于被放大的光波长。对于某些应用，周期性周期是优选的，并且所述周期被选择为使光吸收和辐射最大化，所述光吸收和辐射依赖光波长。阵列中邻近立柱之间的间距(跨距)可为4nm到4000nm。

用于所有具备金属盘的SAL的金属盘。所述金属盘阵列可以是周期和非周期性的。每个立柱顶部的金属盘可具有圆形、尖端(如金字塔或锥体的形式)、多边形、椭圆形、长条形、多边形的形状、其他类似形状或其组合。每个盘的形状可与其他盘相同、相似或不同。金属盘横向尺寸和厚度应当小于放大的光波长。取决于放大的光波长，每个盘的横向尺寸可选自4nm到1500nm，并且盘的厚度为1nm到500nm。对于400nm到1100nm的光波长范围的优选金属材料厚度为5nm到80nm。为了使用不同的金属材料厚度，需要调整立柱高度以实现在所述盘与所述底板之间的预期间隙。每个盘的形状与它所布置在其上的相关立柱的顶面的形状可以相同，或者比所述顶面的形状小，或者比所述顶面的形状大，或者与所述顶面的形状不同。形状差可依赖于工作波长在0到200nm之间变化。

用于所有SAL的金属底板：金属底板与金属盘协作形成光空穴。在该实施方案中，金属底板在基片上定义一金属层，对每个立柱有一个孔。孔的大小应小于放大的光波长。金属底板的厚度选择为1nm到2000nm，其优选厚度在10nm-200nm的范围内。金属底板的材料可选自与用来形成上述金属盘的相同的材料组，但是对于给定的D2PA结构，用于形成金属底板的材料与用来形成盘的材料可以相同或不同。任一前述权利要求的D2PA纳米器件，其中所述立柱具有柱形的、倾斜的、或弯曲的侧壁表面。

用于所有具备金属点的SAL的金属点。布置在所述金属盘与所述金属底板之间的每个立柱的侧壁上的金属点具有大致为球形、盘状、多边形、长条形的形状、其他形状或其组合。立柱上的金属点可以全部具有大致相同的形状，或可以个别地变化。金属点的尺寸应当小于被放大的光波长，并且依赖于被放大的光波长，优选在3nm到600nm之间，并且可以在三个维度上不同。在一些实施方案中，相邻金属点之间的间隙以及盘与邻近金属点之间的间隙在0.5nm到200nm之间。对于许多应用，小的间隙是优选的，以实现更强的信号增强。立柱上的每个金属点之间的间隙可以变化。

用于所有SAL的金属材料：用于金属盘、底板、和点的金属材料选自(a)单元素金属，如金、银、铜、铝、镍；(b)单种金属的单分子层和/或多层的组合；(c)金属合金；(d)半导体，(e)任何其他在被放大的光波长下产生等离子体的材料，或(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合。每个金属盘、底板、和点使用彼此相同的金属材料，或使用不同的金属材料。

用于所有SAL的基片。所述基片为D2PA提供物理支持，并且可以为任何材料，只要它不产生对D2PA放大的化学和电磁干扰即可。所述基片还可以处于许多种不同的形式：薄膜(膜)和厚板，柔性和刚性。所述基片可由电介质(例如SiO₂)制成，虽然可以使用其他材料，例如硅、GaAs、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。

对可见光和近红外范围的光波长(400到1000nm)的优选D2PA实施方案。D2PA的关键元件的所有尺寸均小于所述光的波长。所述金属材料选自金、银、铜、和铝及其合金。在配置为用于增强波长约800nm的光的一个实施方案中，所述D2PA纳米结构可以包括：周期性的非金属(例如，电介质或半导体)立柱阵列(200nm跨距和约100nm直径)、每个立柱顶部的金属盘、立柱底部的金属底板、随机定位于立柱壁上的金属纳米点、以及这些金属部件之间的纳米间隙。所述金属盘具有约120nm直径，且略大于所述立柱的直径，因此具有突出部分。所述盘阵列和底板(两者均为40nm厚)形成一3D空穴天线，其可高效地竖向和横向捕获激发光。所述立柱的高度为约50nm，因此所述金属盘与所述金属底板之间的最近距离为约10nm。该最近距离，常称为“纳米间隙”，优选尽可能地小，以实现更高的增强。每个立柱具有约3到30个纳米点，取决于立柱的几何形状和制造加工条件；并且立柱的密度为2.5×10⁹个立柱/cm²。对于这个光波长范围优选的金属材料厚度为5nm到80nm。为了使用不同的金属材料厚度，需要调整立柱高度以实现所述盘与所述底板之间的预期间隙。同样，在一些实施方案中，不使用金属点，所述金属盘和所述金属底板仅被间隙所分隔开。

间隔物厚度的实施例：将金属与产生光信号的分子分开的间隔物的厚度对于荧光而言为3nm到50nm(对于约800nm的光波长，优选为5nm)；并且对于表面增强拉曼散射(SERS)而言为1到15nm。所述厚度依赖于光的波长。

分子粘附层和捕捉剂的附接

在一个实施方案中，SAL和捕捉剂之间存在着分子粘附层(也称为“分子连接层”)(MAL)。分子粘附层用作两个目的。首先，分子粘附层充当间隔物。为了获得最佳的荧光，不能使发光标记物(例如，荧光团)太靠近金属表面，因为非辐射过程可使荧光淬灭。发光标记物也不能离开金属表面太远，因为这可能减弱放大。理想的是，所述发光标记物应当距金属表面一个最佳距离。其次，分子粘附层为捕捉剂附接到SAL层上提供良好的粘附。通过在分子粘附层的分子提供反应性基团实现粘附，所述反应性基团在一侧与捕捉剂具有高亲和力，在另一侧与SAL层具有高亲和力。

所述分子粘附层可具有许多不同的构造，包括(a)交联分子的自组装单分子层(SAM)，(b)多分子层薄膜，(c)(a)和(b)的结合，以及(d)捕捉剂本身。

用于将捕捉剂连接到具有或没有分子连接层的金属表面上的不同方法描述于WO2013154770中，就这样的方法通过提述将该文献并入本文。例如，在一些情况下，可首先将所述金属表面接合到具有规定长度(例如，0.5nm到50nm长)的分子的一端(例如，经由硫醇或硅烷头部基团)，并且可经由捕捉剂反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、或碘代乙酰基)将所述捕捉剂连接到所述分子的另一端。在某些情况下可使用具有通过硫-金键结合到金表面上的–SH头部基团、以及与伯胺反应的NHS-酯末端基团的二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)。

容器。可将具有SAL的板布置在容器中，例如多孔板的孔中。具有SAL的板还可以是多孔板的孔的底部或壁。具有SAL的板可布置在微流体通道(具有1到1000微米的通道宽度)或纳米流体通道(小于1微米的通道宽度)中或这样的通道的内壁的一部分中。

信号和像素化读取

上述信号可直接来自分析物，或来自附接到分析物上的标记物，或其组合。所述信号可以是电磁信号，包括不同频率的电信号和光信号、光强度、荧光、色度、发光(电致发光和化学发光)、拉曼散射、时间分辨信号(包括闪烁)。所述信号还可以是由于在板与读取装置之间的局部电相互作用、局部机械相互作用、局部生物相互作用、或局部光学相互作用所致的力。所述信号还包括信号的空间分布(即，位置)、时间分布和频谱分布。检测信号还可以是吸收。

在光学检测(即，借助电磁辐射进行的检测)中，可以使用的方法包括远场光学法、近场光学法、落射荧光显微术、共聚焦显微术、双光子显微术、和全内反射显微术，其中目标分析物用电磁辐射发射体标记，而且这些显微术中的信号可以通过SML放大。

所述读取将利用适当的检测系统以便对信号进行顺序检测或并行检测或它们的组合。在顺序检测中，一次检测一个或几个像素，并利用扫描仪使检测移动到SAL的其他区域。在并行检测中，使用多像素检测器阵列，如成像照相机(例如电荷耦合器件(CCD))，来在同一时间获取或检测来自不同像素的信号。所述扫描仪可以是单路径或多路径的，每个路径有不同的像素大小。图2C示意性地展示了在x、y、z台上的像素化读取。

要调整用于读取/检测的像素大小，以在光学分辨率与总读取时间之间平衡。像素大小越小，读取/扫描SAL的全部或部分所耗费的时间越长。典型的像素大小为1μm到10μm大小。像素具有不同的形状：圆形、方形和矩形。像素大小的下限由显微系统的光学分辨率所决定，而确定像素大小的上限是为了避免由于成像器的不均匀光学响应(光学像差、照明均匀性等等)所致的读取错误。

读取系统

读取系统包括(a)包括感测放大层的板，所述感测放大层包括增强信号的纳米结构和附接于所述放大层200的捕捉剂；(b)读取装置205，用于产生从所述板的表面放出的信号的图像，其中信号代表各个目标分析物结合事件；(c)保持所述板和所述成像仪的装置组件300；(d)用于存储所述图像的数据存储装置和电子器件301；和(e)包含用于对图像区域中的各个结合事件进行识别和计数的程序的计算机。

装置组件300在三个(x,y,z)正交方向中的至少一个方向上控制或改变在所述板与所述读取装置之间的相对位置，以便读取信号。所述装置组件可包括扫描仪301。扫描仪301可以在三个(x,y,z)正交方向中的至少一个方向上进行扫描。读取装置302为CCD相机。读取装置302还可以是包含一个或多个其他光学器件的光检测器，所述光学器件选自滤光器303、分光计、透镜304、光圈、分束器305、反射镜306、偏振镜307、波片、和快门。读取装置收集所述信号的位置、局部强度、局部频谱和局部拉曼光谱特征。

例如，对于光学信号检测，可将滤光器303、光分束器305、光纤、光检测器(例如PMT、APD)、成像照相机(例如CCD)和分光计连同由装置组件301提供的扫描仪偶联于使用远场共聚焦设置或宽视野设置的显微镜系统。

在共聚焦设置中，通过一次记录一个或几个像素的亮度、时序变化和频谱变化，并且对整个感兴趣的SAL区域进行光栅扫描，来进行读取。在宽视野设置中，使用照相机来一次记录SAL区域的全部或部分的亮度以及时序变化。需要适当的滤光器和光束操纵器(偏振镜、分束器、光纤等)来保证仅收集和检测期望的信号。图9示意性地展示了该系统的部件的一种安排。

像素化分析

分析以像素化方式检测到的信号，以确定特定的一个像素或几个像素处的特定分子的数目和/或类型，进而用来定量所述目标分析物的类型和/或浓度。

所述分析包括分析信号的空间、时序、频谱信息。所述分析包括统计分析、比较、整合及其他。图5显示了这种方法的一个实施方案的流程图。一些分析的例子在下文提供。

分析方法1包括(1)确定局部背景信号强度，(2)确定针对一种标记物、两种标记物等的局部信号强度；和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

背景信号是指在除了所述样品不含任何目标分析物之外与其他样品完全相同的条件下产生的信号。

分析1是基于使用EM-CCD来记录空间分布生物测定信号强度。当在D2PA传感器上的离散热点(亮像素)被成像时使用该分析。

(1)确定局部背景信号强度。为了确定背景信号，使用参考样品。这种参考样品是没有固定任何分析物的D2PA传感器，并且使用相同的仪器设置在用于D2PA上的生物测定的相同实验条件下对其成像。然后将图像的所有像素的强度绘制在直方图中，该直方图给出在某一信号强度下像素的数目。然后将具有最多的对应像素数的信号强度确定为背景信号背景。此背景强度连同它们的标准偏差(s.d.)，被用来确定阈值，定义阈值以区分局部背景和局部热点，即阈值＝背景+n*s.d。这里n为整数，用作修正所述阈值的参数。通常，在本文中n设置为等于3、5、或7。

(2)对于单个亮像素(I_x,y>阈值)，使用两步法确定标记物的局部信号强度。首先，使用样品的时间演化成像来发现具有单个标记物(分析物)的热点。成像的总时间处于几十秒量级，而分辨时间在几十微秒量级。对于单种分析物的热点，观察到热点荧光强度的清楚的开/关二元行为。显示如此行为的像素首先被计数为单标记物/分析物。因此，记录它们在图像上的坐标和强度。然后，将这些热点的平均强度用作D2PA测定上的单一标记物的亮度。

其次，未显示出这种二元行为的亮像素因而指示多个标记物/分析物。然后，我们将它们的信号强度与单个标记物的平均亮度比较，以便对局部热点中的标记物数目进行计数。作为替代，基于泊松统计学原理，利用另一个简化的程序。在分析物的低浓度(<1pM)，少量分析物固定在高密度的等离子热点(约2.5X10⁷mm^-2)中的概率遵守泊松分布，这意味着两种以上的分析物位于同一个等离子热点中的概率是低的。例如，在目标分析物为1fM时，两种以上的标记物位于我们的成像区域(含有多于56,250个D2PA结构)内的概率小于0.01％(估计)。因此，可以假定所有未显示单标记物行为的亮热点仅仅含有两种标记物。

(3)在完成(1)和(2)之后，然后可以将热点像素坐标、强度和相应的标记物数目的清单制表。通过对每个亮像素的标记物数目求和，可以获得标记物的总数。

分析方法2包括(1)确定局部背景信号频谱，(2)确定针对一种标记物、两种标记物等的局部信号频谱；和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

分析2是基于使用高分辨率分光计联合共聚焦显微镜设备来记录生物测定信号频谱的空间分布。

(1)为了确定背景信号，使用参考样品。这种参考样品是没有固定任何分析物的D2PA传感器，并且使用相同的仪器设置在用于D2PA上的生物测定的相同实验条件下对其成像。然后使用共聚焦显微镜来测量局部生物测定信号频谱。检测区域由在高分辨率分光计前的针孔大小和显微镜物镜的数值孔径决定。共聚焦显微镜对整个D2PA传感器进行光栅扫描，以获得背景信号频谱I的空间分布(x,y,λ)。然后绘制直方图，其给出具有一定谱矩(∫I(λ)dλ)的像素的数目。与分析1的步骤(1)类似，将具有最多像素的谱矩用作背景信号，并且用它们的标准偏差来确定阈值：I(λ)_阈值＝I(λ)_背景+n*s.d(λ)。这里n为整数，用作修正所述阈值的参数。通常，在本工作中n被设置为等于3、5、或7。(2)为了收集单个亮像素的频谱，使用了偶联至高分辨率分光计的共聚焦显微镜设备。类似于步骤(1)进行读出。由于单个分子的频谱只有使用高灵敏度CCD以数秒的曝光时间才能可靠地检出，其不能提供足够的时间分辨率来确定热点中的单个标记物的二元行为。因此，为了确定在亮像素处的标记物的数目，我们将比较不同的亮像素之间的谱矩。由于D2PA传感器的巨大放大，单个或多个标记物可以与背景区分开来。由此，可确定热点内的分析物的数目。

(3)在完成(1)和(2)之后，然后可以将热点像素坐标、谱矩和相应的标记物数目的清单制表。通过对每个亮像素的标记物数目进行求和，可以获得标记物的总数。

分析3(通过像素化SERS信号的感测)包括(1)确定“表面增强拉曼散射”(SERS)特征的局部背景信号，(2)确定针对一个标记物、两个标记物等的局部SERS信号；和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

分析3是基于使用高分辨率分光计联合共聚焦显微镜设备来记录生物测定SERS光谱的空间分布。

(1)为了确定背景信号，使用参考样品。这种参考样品是没有固定任何分析物的D2PA传感器，并且使用相同的仪器设置在用于D2PA上的生物测定的相同实验条件下对其成像。然后使用共聚焦显微镜来测量局部生物测定SERS光谱。检测区域由在高分辨率分光计前面的针孔大小和显微镜物镜的数值孔径决定。共聚焦显微镜对整个D2PA传感器进行光栅扫描，以获得背景信号频谱I的空间分布(x,y,cm^-1)。对于某一生物分子，然后绘制直方图，该直方图给出具有该分子的独特SERS特征强度I(cm^-1)的像素的数目。类似于分析1的步骤(1)，将具有最多像素的谱矩用作背景信号，并且用它们的标准偏差来确定阈值：I(cm-1)阈值＝I(cm^-1)背景+n*s.d(cm^-1)。这里n为整数，用作修正所述阈值的参数。通常，在本文中n被设置为等于3、5、或7。

(2)为了定位热点，使用共聚焦显微镜设备以类似于(1)的方式对整个D2PA传感器进行光栅扫描。与分析1和分析2不同，SERS是无标记的检测法，并且单分子SERS信号不显示二元行为。因此，为了确定亮像素处的标记物的数目，我们将比较在各个亮像素之间的SERS信号I(cm^-1)。由于D2PA传感器的巨大放大，单个或多个分析物可以与背景区分开来。然后，可确定热点内分析物的数目。

(3)在完成(1)和(2)之后，然后可以将热点像素坐标、SERS特征强度和相应的标记物数目的清单制表。通过对每个亮像素的标记物数目求和，可以获得标记物的总数。

实施例

根据以下实施例，可进一步理解本发明教导的多个方面，这些实施例决不应当被视为限制本发明教导的范围。

实施例1.等离子纳米结构上的单分子发射体和闪烁事件的观察

我们测量了生物测定的来自单标记IgG分子的荧光增强，所述IgG分子被放置在D2PA的“热点”(即局部电场最强的区域)。当这些IgG分子彼此远离(即，IgG浓度很低)并且使用灵敏的CCD照相机时，这样的单分子荧光是可见的。

具体而言，我们使用了100pM的IgG浓度来研究单分子荧光，该浓度提供的两个固定的IgG之间的平均距离为约420nm。我们使用装备40×物镜(数值孔径＝0.6)的倒置显微镜(Nikon，USA)对免疫测定的二维荧光进行映像。使785nm的激光束均匀扩展，以照亮D2PA板上的一片50μmx50μm区域。通过具有512x512像素分辨率(因此对于给定的激光扫描区域为每像素约390nm)的电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD，Andor)连续采集图像。CCD像素的大小对在光衍射极限(通过瑞利判据确定为0.8μm)处成像的荧光强度分布过采样。

从在D2PA板上的100pM荧光标记IgG的荧光成像我们观察到随机分布在均匀背景中的迥异的荧光“亮点”(图6A)。作为时间的函数的各个亮斑的荧光强度显示出具有二元分步行为(闪烁事件)(图6B)，表明位于D2PA的热点处或其附近的单分子首先发射荧光，然后发生光漂白(闪灭)。

为了估计热点处的单分子的荧光增强因子g_热点，我们使用了两种方法。对于方法1，g_热点为D2PA的“热点”处的单分子荧光信号S_热点与参考样品上的每个分子的平均荧光信号(等于参考样品上的面积平均荧光强度I_参考平均除以参考样品上的每单位面积的平均IgG分子n_参考平均)之比。根据图6(a)，S_热点＝1,200个计数，I_参考平均＝3,088个计数/μm²，且n_参考平均＝7.22x10⁵个分子/μm²，I_参考 _激发＝1.74mW，且I_激发.D2PA＝110μW。我们求出荧光增强为g_热点＝4.4X10⁶，这比大多数报道的“热点”中单分子的荧光增强高3个数量级。

对于第二种方法，用D2PA板的每分子的平均荧光强度(I_D2PA.平均/n_D2PA.平均)除以荧光增强因子(EF)来推算出参考的每分子的平均荧光增强。对于I_D2PA.平均＝19个计数，EF＝7,220并且n_平均约7.22个分子/μm²，我们求出g_热点＝3.28x10⁶。两种方法对于计算单分子荧光增强给出一致的结果。两种方法的平均值给出g_热点约4x10⁶。

实施例2.闪烁单分子发射体的数字计数

在D2PA传感器上进行的免疫测定中，如果生物标志物位于LSP热点上，其荧光信号将被增强4×10⁶倍，从而提供了使用CCD相机的单分子检测灵敏度。这种对来自LSP热点的单发射体的增强均匀地分布在较大的面积(例如晶片的大小)上，从而让我们能够根据单分子发射体在D2PA表面上的表面分布计算出单分子发射体浓度。

在低浓度时(<1pM)，生物标志物数目(和生成的荧光团数目)与D2PA纳米柱数之比很小，因此单个D2PA纳米柱可能仅有一个或没有荧光团。对于具有单个荧光团的纳米柱，每个D2PA纳米柱上的等离子热点的高密度保证了荧光信号将被放大并可检测，而不论单分子在立柱上的确切位置如何。因此D2PA可提供整个传感器表面上的单分子信号映像。

使用装备有扫描半导体激光器的标准倒置显微镜成像系统测试该新方法。基于D2PA的等离子共振和选定荧光标记物的吸收光谱来选择激发激光器。通过使用2D扫描振镜系统，所述激光束对显微镜物镜的整个视野(FOV)进行光栅扫描。对于本报告，FOV为200μm×200μm。

我们的方法包括这些步骤：

·在倒置显微镜下，获取2PA传感器表面的时间序列荧光图像，其显示了FoV中的荧光热点的分散分布，以及它们的时间依赖性荧光强度。

·将所述倒置显微镜的XY载物台平移到附近区域并重复步骤1，直到整个D2PA传感器表面(3mm×3mm)被成像时为止。需要对所述整个传感器表面成像而不是仅对少数个别图像取样，因为在极低浓度(<10aM)下，不是每个图像都具有可检测的荧光热点。

ο为了仅对单分子发射体进行计数，我们仅对展示了闪烁事件的热点进行计数。这通过观察每个热点随着时间推移的荧光强度而实现—二元步骤行为是单分子发射体的特征行为。

ο对于高分析物浓度(>1pM)，表面上的热点因太接近而不能彼此区分。因而计数是不合适的。在这种情况下，通过对整个样品表面进行积分而获得总荧光强度。

ο对于较低的浓度，计数是可能的，因为热点分布稀疏。在这种情况下，通过对所有图像的热点计数求和而获得总热点数。

·绘制响应曲线(信号作为分析物浓度的函数)。对于较高浓度使用积分的荧光强度信号，使用总热点数作为较低分析物浓度下的信号。

通过仅对荧光热点数(来自生物标志物或非特异性结合分子)进行计数，可排除来自CCD背景读取ICCD的噪声。在极低浓度下的常规免疫测定中，ICCD占据主导地位。因此，背景信号及其标准偏差σ显著降低。在所述新方法中，背景噪声仅仅来自非特异性结合的分子，其可进一步通过适当洗涤、封闭和检测抗体的选择而最小化。另外，与，对荧光热点进行计数内在地比测量荧光强度具有更小的信号标准差，因为它忽略了单个热点之间的信号差异。

实施例3：乳腺癌生物标志物CEA免疫测定的数字计数

作为示范，我们检测了临床相关的癌症生物标志物CEA并且获得了低达10^-19M的检测灵敏度。

D2PA纳米器件上的CEA免疫测定的准备。D2PA免疫测定板由两个部件组成：(1)上述D2PA等离子子纳米结构和(2)蛋白A层位于二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)顶上的混合自组装层。DSU分子通过在一端提供牢固结合金的硫化物，而在另一端提供良好结合蛋白A氨基的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基，而提供蛋白A与金表面的牢固交联。这些分子层(蛋白A和DSU)具有两个功能：(1)具有6.5nm的组合厚度，它们将充当可抑制金属的荧光淬灭效应的间隔物层；并且(2)由于抗体将通过其Fc区域结合蛋白A，在D2PA上的分子层可增加抗体定向和固定的质量，这将进一步改善抗体的捕获效率。

为了在D2PA上涂覆DSUSAM和蛋白A，将新制造的D2PA基片切成5mmx5mm的小片并且浸入到0.5mMDSU(Dojindo，Japan)溶于1,4-二噁烷(Sigma-Aldrich)的溶液中，并且在室温下在密封容器中温育过夜。在温育之后，在1,4-二噁烷中充分地冲洗D2PA基片并且用氩气干燥。我们立即将这些DSU涂覆的D2PA基片置于标准96孔板(Pierce,USA)的分开的孔中。然后将它们浸入到溶有10μg/mL蛋白A(RocklandImmunochemicals)的100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH＝7.2，Sigma-Aldrich)中，并且在密封条件下在4℃冰箱中温育过夜。然后我们吸出溶液，并且用洗涤溶液(R&DSystems)将各个D2PA板洗涤3次，每次15分钟，以去除未结合的蛋白A。然后在去离子水流中轻轻冲洗所述板，以去除所含的任何盐。在用氩气干燥之后，D2PA免疫测定板已准备好用于立即进行免疫测定测试，或者被储存在-20℃下备用。如图11中所示，在某些情况下，可使用电场使抗体移动到DSUSAM。

CEA免疫测定(图7)是从商业免疫测定试剂盒(R&DSystems，USA)改良的间接夹心荧光免疫测定。首先通过将D2PA免疫测定板浸入到100μL的浓度为180μg/mL的捕获抗体溶液中温育2小时，来将捕获抗体(小鼠抗人CEA)固定。然后我们吸出溶液并用洗涤缓冲液洗涤所述板，随后通过浸入100μL的封闭溶液(R&DSYSTEMS)中并在室温下温育1小时来封闭每块板。在相同的吸出/洗涤过程之后，再将每个孔中的D2PA板浸入100μL的在PBS溶液中的浓度为11pM到1.1aM的CEA标准品(R&DSystems)中(稀释因子为2)。然后将它们在室温下温育2小时。在另一次洗涤之后，将100μL的浓度为200ng/mL的生物素化检测抗体(山羊抗人CEA)添加到每个板中，并在室温下温育1小时。然后，我们再次重复吸出/洗涤过程，并向每个D2PA板加入50μL经稀释的浓度为50ng/mL的IRDye800CW标记的链霉亲和素(RocklandImmunochemicals)，并在室温下温育1小时。在最后洗涤之后，在去离子水中轻轻冲洗D2PA板，并用氩气干燥。在进行免疫测定之后立即对板进行光学测量。

结果.对于D2PA板上的改良的三层夹心CEA测定，当使用常规酶标仪(面积平均荧光强度)时，我们在具有8数量级动态范围的缓冲液中分别获得28aM(约0.8fg/mL)的LoD(图8A)。新测定的LoD比标准玻璃板上进行的相同测定好170,000倍；比当前最好的CEA免疫测定(例如，随机金岛)灵敏20倍；并且比血浆中的典型CEA水平(4ng/mL)灵敏5-6个数量级。参见图8。

在使用常规测量方法之后，我们应用了新方法，使用数字计数来测量相同的测定。图8B和8C是在处于不同浓度的CEA免疫测定的单视野(FOV)中的表面热点分布。可以清楚地看到随机分布的发射体的表面密度与CEA的浓度成比例。

还注意到在>1pM的高浓度，例如11pM和2.2pM，一些热点聚集成簇，因此难于区分。在这些情况下，我们对总荧光热点簇强度积分，而不是进行数字计数。参见图8。

应用

主题传感器的应用包括但不限于：(a)检测、纯化和定量与某些疾病(例如感染性和寄生虫疾病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神病症和器官疾病，例如肺病、肾病)的阶段相关的化合物或生物分子；(b)检测、纯化和定量来自环境(例如水、土壤、或生物学样品，例如组织、体液)的微生物，例如病毒、真菌和细菌；(c)检测、定量对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学样品，例如有毒废物、炭疽；(d)定量医学或生理学监控器中的生命参数，例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数；(e)检测和定量来自生物样品(例如细胞、病毒、体液)的特定DNA或RNA；(f)测定和比较染色体和线粒体中的DNA中的遗传序列用于基因组分析；或(g)检测反应产物，例如在药品合成或纯化过程中。

可以在各种样品基质中进行检测，诸如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、咳出痰、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。

Claims

1.样品分析方法，其包括：

(a)使目标分析物与附接于板表面的捕捉剂结合，其中所述板包括(i)包含增强信号的纳米结构的感测放大层、和(ii)附接于所述感测放大层的捕捉剂；

(b)用读取装置读所述板，以产生代表各个结合事件的信号的图像；并且

(c)对所述图像的区域中的各个结合事件进行识别和计数，由此提供对所述样品中的一种或多种分析物的量的估计。

2.权利要求1的方法，其中所述目标分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、或具有不同形状的纳米颗粒。

3.任一前述权利要求的方法，其中所述捕捉剂与目标分析物特异性地结合。

4.任一前述权利要求的方法，其中所述图像显示所述信号的位置、局部强度、和局部频谱。

5.任一前述权利要求的方法，其中所述信号是选自下组的发光信号：荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光信号。

6.任一前述权利要求的方法，其中所述信号为拉曼散射信号。

7.任一前述权利要求的方法，其中所述信号是由于所述板与所述读取装置之间的局部电相互作用、局部机械相互作用、局部生物相互作用、或局部光学相互作用所致的力。

8.任一前述权利要求的方法，其中在步骤(b)之前，所述方法进一步包括在目标分析物与所述捕捉剂结合之前或之后用标记物标记所述目标分析物的步骤。

9.任一前述权利要求的方法，其中所述读取步骤(b)通过在所述信号放大层与另一个电极之间施加偏压来进行，由此提供更高的灵敏度。

10.任一前述权利要求的方法，其中所述识别和计数步骤(c)包括：(1)确定背景信号的局部强度，(2)确定一个标记物、两个标记物、三个标记物、和四个或更多个标记物的局部信号强度，和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

11.任一前述权利要求的方法，其中所述识别和计数步骤(c)包括：(1)确定背景信号的局部频谱，(2)确定一个标记物、两个标记物、三个标记物、和四个或更多个标记物的局部信号频谱，和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

12.任一前述权利要求的方法，其中所述识别和计数步骤(c)包括：(1)确定背景信号的局部拉曼特征，(2)确定一个标记物、两个标记物、三个标记物、和四个或更多个标记物的局部信号拉曼特征，和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

13.任一前述权利要求的方法，其中所述识别和计数步骤包括确定局部强度、频谱、和拉曼特征中的一者或多者。

14.任一前述权利要求的方法，其中通过向所述板施加电场，由此使分析物向所述感测放大层移动，而加速所述结合步骤(a)。

15.任一前述权利要求的方法，其中所述感测放大层包括D2PA。

16.任一前述权利要求的方法，其中所述感测放大层包括一个或多个金属盘以及显著平坦的金属膜，其中所述金属盘的相当大部分与所述金属膜有间隔，并且所述盘的间隔和尺寸小于在感测中使用的光的波长。

17.权利要求16的方法，其中所述金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。

18.权利要求16的方法，其中所述间隔为0.5到30nm，并且所述盘具有在20nm到250nm范围的平均横向尺寸。

19.任一前述权利要求的方法，其中所述感测放大层具有将所述捕捉剂与所述感测放大层连接的分子连接层。

20.任一前述权利要求的方法，其中所述信号为光信号。

21.任一前述权利要求的方法，其中所述信号由荧光标记物产生，所述荧光标记物是在所述分析物与所述捕捉剂结合之前或之后与结合的分析物缔合的。

22.任一前述权利要求的方法，其中，读取步骤(c)中被读取而形成信号的图像的两个邻近信号之间的平均距离大于10nm。

23.任一前述权利要求的方法，其中所述信号为由拉曼散射产生的信号。

24.任一前述权利要求的方法，其中所述捕捉剂是抗体。

25.任一前述权利要求的方法，其中所述捕捉剂是多核苷酸。

26.一种系统，其包括：

(a)板，其包括：包含增强信号的纳米结构的感测放大层，和附接于所述所述放大层的捕捉剂；

(b)用于产生从所述板的表面放出的信号的图像的读取装置，其中信号代表各个目标分析物结合事件；

(c)保持所述板和所述成像仪的装置组件；

(d)用于存储所述图像的数据存储装置和电子器件；和

(e)包含用于对所述图像的区域中的各个结合事件进行识别和计数的程序的计算机。

27.权利要求26的系统，其中所述装置组件在三个(x,y,z)正交方向中的至少一个方向上控制或改变所述板与所述读取装置之间的相对位置，以便读取信号。

28.权利要求26或27的系统，其中所述读取装置是电荷耦合器件照相机。

29.权利要求26-28中任一项的系统，其中所述读取装置是包含一个或多个其他光学器件的光检测器，所述光学器件选自滤光器、分光计、透镜、光圈、分束器、反射镜、偏振镜、波片、和快门。

30.权利要求26-29中任一项的系统，所述读取装置收集所述信号的位置、局部强度、局部频谱和局部拉曼特征。

31.权利要求26-30中任一项的系统，其中所述程序包括用于下述的程序：(1)确定背景信号的局部强度或频谱或拉曼特征，(2)确定一个标记物、两个标记物、三个标记物、和四个或更多个标记物的局部信号强度或频谱或拉曼特征，和(3)确定成像区域中的标记物的总数。

32.权利要求26-31中任一项的系统，其中所述识别和计数包括确定局部强度、频谱和拉曼特征中的任一者、一些或全部。

33.权利要求26-32中任一项的系统，其中所述系统包括用于激发所述板的表面上的标记物的光、电、或化学品的来源。

34.权利要求26-33中任一项的系统，其中所述系统包括电极，所述电极用于在所述电极与所述感测放大层之间施加电压以产生电场和/或电场梯度，所述电场和/或电场梯度(a)使已被置于板表面上的溶液中的分析物向位于感测放大层上的捕捉剂移动。

35.权利要求26-34中任一项的系统，其中所述系统包括电极，所述电极用于在所述信号放大层与另一个电极之间施加偏压，以进一步改善灵敏度。

36.权利要求26-35中任一项的系统，其中所述读取装置是电探针或机械探针或生物探针，所述探针采集所述板与读取装置之间的位置、局部电相互作用、局部机械相互作用、局部生物相互作用、和局部光学相互作用。