CN101817495B

CN101817495B - 微流控芯片及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101817495B
Application number: CN2010101321393A
Authority: CN
Inventors: 王柯敏; 羊小海; 于虹; 王青
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2010-03-25
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2030-03-25
Also published as: CN101817495A

Abstract

本发明属于微流控技术领域，具体公开了一种微流控芯片及其制备方法和应用，该芯片一侧设有多个进样孔，每个进样孔连通有一进样流道，各个进样流道交汇后与一主流道相连通，主流道上设有一狭窄流道，狭窄流道入口前填充有0.5～1.5mm的微珠，主流道的出口连通至芯片另一侧设置的废液池中；其制备方法主要是先制作一PDMS基片，再制作一带上凹槽的PDMS盖片，然后将基片和盖片贴合得到芯片半成品，再对芯片半成品中的各个流道进行改性处理，最后置入微珠并控制其装入量，完成制作。本发明微流控芯片的溶液混合效率高、溶液流速稳定、体积小、携带方便，其制作也相对简单容易，在检测三磷酸腺苷浓度的应用中具有不受环境湿度影响、灵敏度高、检测效果好等优点。

Description

微流控芯片及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微流控技术领域，尤其涉及一种以微流控技术为基础的芯片及其制备方法和在特定物质浓度检测中的应用。

背景技术

随着科学技术的不断进步，要求生化分析朝着体积更小、反应更快、灵敏度更高的方向发展。在这种要求的基础上，Manz和Widmer于20世纪90年代初首次提出微全分析系统(μ-TAS)的概念。在此后十余年中，该领域已发展为当前世界上最前沿的科技领域之一，其核心技术即是以微流控技术(Microfluidics)为基础的微流控芯片。微流控芯片技术由于具有微型化和集成化的特点，可将多步操作集中到一块芯片上，简化了操作过程，减少了样品消耗，近几年在各种生物小分子的快速灵敏分析方面得到了广泛关注。

当微流控芯片的通道尺寸小到微米级甚至是纳米级时，液体在芯片中的混合及在芯片中的驱动至关重要。要使化学反应进行得完全，其首要条件就是反应溶液的混合要完全。加速反应液在微流控芯片中混合的方式有很多种，包括可加速溶液混合的被动式混合方式，例如在通道中设计鱼骨状或锯齿状的障碍物、采用液滴式注入等；此外还包括采用外加动力(如磁场力、压力、声场力、电场力等)的主动式混合方式。然而，加速溶液在芯片中混合的现有方法存在诸多问题，例如芯片加工复杂、混合效率不高、需要外加动力、成本相对较高等。

现有可用于微流控芯片中流体驱动的驱动泵有很多种，如离心力驱动系统、压力驱动系统、气动微泵、静电微泵、热气动力微泵和压电微泵等，但绝大部分的驱动泵都是脱离微流控芯片而单独配置，然后再与微流控芯片连接，不仅加工复杂、成本高，而且与微全分析系统微型化、轻便化、集成化的趋势相悖，液体的流速也不易控制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种溶液混合效率高、溶液流速稳定、体积小、结构简单、携带方便的微流控芯片以及一种低成本、易操作的微流控芯片的制备方法，还提供一种不易受环境湿度影响、灵敏度高、检测效果好、且操作方便的微流控芯片在检测三磷酸腺苷浓度中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种微流控芯片，包括相互贴合的盖片和基片，所述微流控芯片一侧设有两个以上的进样孔，每个进样孔连通有一进样流道，各个进样流道交汇后与一主流道相连通，其特征在于：所述主流道上设有一收缩段形成一狭窄流道，所述狭窄流道入口前的主流道上填充有微珠，微珠段的长度为0.5～1.5mm，所述微珠的粒径大于所述狭窄流道的宽度以保证微珠不会从狭窄流道中渗出，所述主流道的出口连通至所述微流控芯片另一侧设置的废液池中。在该技术方案中，由于在所述的主流道上设置有一狭窄流道，而且在该狭窄流道前的主流道中装有一段孵育好的直径大于狭窄流道宽度的微珠，这样当多种混合液体以层流的状态流经微珠段时，混合液体形成湍流，加速了不同种液体的混合，缩短了不同种液体在微流控芯片中混合所需的时间。

上述的技术方案中，所述微流控芯片包括相互贴合的盖片和基片，所述盖片下方开设有一上凹槽，所述废液池设于基片开设的下凹槽中并与上凹槽相对应，所述上凹槽上方的盖片上通过布设蒸发孔与外界相连通，所述上凹槽中填充有吸水材料。在该改进后的微流控芯片中，通过采用在微流控芯片的盖片上布设蒸发孔、填充吸水材料(例如吸水膜)的方式，将基于毛细作用和蒸发作用的“微泵”集成于上述的微流控芯片上，该“微泵”的作用机理是：随着微流控芯片中的液体从所述蒸发孔中不断蒸发，吸水膜则从所述废液池中不断吸收液体，这促使所述主流道中的液体不断向废液池中流动，从而实现了对微流控芯片中液体的驱动。

上述的微流控芯片中，所述进样孔的孔径优选为1.8～2.2mm，所述蒸发孔的孔径优选为3.8～4.2mm，所述狭窄流道的宽度优选为14～16μm，所述进样流道和主流道的宽度优选为140～180μm。所有尺寸上的改进都是根据微流控芯片的大小及液体流速的要求经过反复实验后确定出来。

上述的微流控芯片中，可以根据具体应用实践的不同而选择不同的微珠，但优选为牛血清蛋白包被聚苯乙烯材料或二氧化硅材料制作成的微珠，所述微珠的粒径优选为18～30μm。该优选的微珠具有粒径均匀、刚性较好的特点。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)基片的制作：将聚二甲基硅氧烷(简称PDMS)前聚体和固化剂混合均匀得到PDMS体系，真空脱泡后，将PDMS体系浇注在预制好的硅质阳模板上(阳模板按照上述微流控芯片的结构要求设计制作)，烘干、固化后取出，自阳模板剥离得到PDMS基片；

(2)盖片的制作：另取一载玻片并在其一端铺一块垫片，所述垫片周围距离载玻片边缘留有充分的余地，然后另取PDMS体系浇注于载玻片上，固化后从载玻片上剥离，并在所述垫片成型的上凹槽底部开设多个通孔，最后用吸水膜填充所述上凹槽即得到PDMS盖片；

(3)贴合封装：将上述制得的PDMS基片和PDMS盖片进行清洗后立即不可逆贴合，得到芯片半成品；

(4)流道改性：在上述芯片半成品中设置的各个流道内依次引入NaOH溶液、聚凝胺(简称PB)水溶液和硫酸葡聚糖(简称DS)水溶液进行洗涤，每种溶液洗涤完后均用流水冲洗流道，完成流道改性；

(5)置入微珠：用缓冲液将备好的微珠洗净，然后将微珠置于牛血清蛋白(简称BSA)中孵育，孵育完成后装入芯片半成品内设置的主流道中，控制微珠的装入量使其在所述主流道上长度达到0.5～1.5mm，完成微流控芯片的制作。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的微流控芯片在检测三磷酸腺苷(简称ATP)浓度中的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：在所述微流控芯片的一个进样孔中加入检测试剂，在另一进样孔中加入待测ATP溶液，然后在所述主流道的出口处进行荧光监测，并记录稳定后的相对荧光强度值F₀，再根据当前操作条件下建立的相对荧光强度F与待测三磷酸腺苷溶液浓度C的关联方程，测定出待测三磷酸腺苷溶液的浓度值C₀，所述应用的检测下限为20nM，线性检测范围为20～500nM。

在上述的应用中，所述应用过程中的温度优选控制为37℃，蒸发面积优选控制为188.5mm²，环境湿度可以控制在25％～85％。本发明的微流控芯片对ATP浓度的检测不受环境湿度的限制，在25％～85％的环境湿度下均可实现对ATP的检测，这就使得检测操作更为简单，微流控芯片的使用更为方便。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的微流控芯片中通过设计一段狭窄流道并引入微珠使芯片中的流体形成湍流，加速了不同种液体的混合，提高了芯片中溶液的混合效率，缩短了各种溶液混合所需时间，这也为缩短流道长度、减小芯片体积、提高溶液反应的灵敏度提供了有利条件。在改进后的微流控芯片中还将混合结构和驱动结构集成到了一块微流控芯片中，使微流控芯片的体积更小，使用更为方便，操作简单，不需要外接其他的驱动装置，且芯片中液体流速稳定，易于调节。本发明的微流控芯片的制备方法也相对简单，加工容易，能够批量化、产业化生产，成本低。此外，利用本发明的微流控芯片可以方便、快捷、准确地用于ATP的定量检测，且检测不易受环境湿度的影响，灵敏度高，检测效果好。

附图说明

图1为本发明实施例1的微流控芯片的结构示意图；

图2为图1中A处的局部放大图；

图3为图1中B-B处的剖视图；

图4为本发明实施例1中考察溶液混合效果时CCD拍摄位置的分布示意图；其中a、b、c分别示出了三处不同的拍摄位置；

图5为本发明实施例1中考察溶液混合效果时CCD在图4的a处拍摄的照片；

图6为本发明实施例1中考察溶液混合效果时CCD在图4的b处拍摄的照片；

图7为本发明实施例1中考察溶液混合效果时CCD在图4的c处拍摄的照片；

图8为本发明实施例1中相对湿度对芯片中溶液流速影响的考察结果图；

图9为本发明实施例1中蒸发面积对芯片中溶液流速影响的考察结果图；

图10为本发明实施例2中采用的NTFS方法进行ATP检测的原理图；

图11为本发明实施例2中采用的NTFS方法进行ATP检测时的流速优化结果图；

图12为本发明实施例2中采用的NTFS方法进行ATP检测时测定的相对荧光强度与ATP浓度关系的标准曲线。

图例说明：

1、盖片 11、进样孔

12、上凹槽 13、蒸发孔

14、吸水膜 2、基片

21、进样流道 22、主流道

23、狭窄流道 24、微珠

25、下凹槽 3、废液池

具体实施方式

实施例1：

一种如图1～图3所示的本发明的微流控芯片，包括相互贴合的盖片1和基片2，该微流控芯片左侧设有两个进样孔11，孔径为2mm，每个进样孔11连通有一进样流道21，各个进样流道21交汇后与一主流道22相连通，进样流道21和主流道22的宽度均为150μm，主流道22上设有一收缩段形成一狭窄流道23，狭窄流道23的宽度为15μm，该狭窄流道23入口前的主流道22上填充有1mm长的微珠24，微珠24为牛血清蛋白包被二氧化硅材料制作成的微珠，微珠24的粒径为20μm；基片2上开设有一下凹槽25作为废液池3，主流道22的出口连通至该废液池3中，废液池3上方的盖片1上对应开设有一上凹槽12，上凹槽12上方的盖片1上通过布设蒸发孔13与外界相连通，蒸发孔13的孔径为4mm，盖片1的上凹槽12中填充有吸水膜14(定量滤纸)。

本实施例的微流控芯片是按以下步骤制作：

(1)基片的制作：将PDMS前聚体和固化剂按10∶1的质量比混合均匀得到PDMS体系，真空脱除气泡后，将PDMS体系浇注在预制好的硅质阳模板上(阳模板按照上述微流控的结构和尺寸预先制作好)，然后置于烘箱中75℃温度下烘干40min左右，固化后取出，自阳模板剥离得到带下凹槽25(即作为废液池3用)的PDMS基片2；

(2)盖片的制作：另取一块清洁的载玻片并在其一端铺一块垫片(垫片尺寸为15mm×25mm×0.5mm)，垫片周围距离载玻片边缘留有充分的余地，然后另取PDMS体系浇注于载玻片上，烘箱中75℃温度下烘干40min左右，固化后从载玻片上剥离，并用打孔器在所述垫片成型的上凹槽12底部打3×5个直径为4mm的通孔作为蒸发孔13，最后用厚度为0.5mm的吸水膜14填充所述上凹槽12得到PDMS盖片1；

(3)贴合封装：将上述制得的PDMS基片2和PDMS盖片1置于等离子清洗器中清洗2min后立即不可逆贴合，得到芯片半成品，保存备用；

(4)流道改性：在上述芯片半成品中设置的各个流道内引入0.1mol/L的NaOH溶液洗涤5min，然后用水冲洗各流道5min；再在各流道内引入5％的PB水溶液，保持溶液流动处理2min，再用水冲洗各流道5min；最后在各流道内引入3％的DS水溶液进行洗涤2min，同样再用流水冲洗流道15min，完成流道改性；

(5)置入微珠：取10μL二氧化硅制作的微珠24于1ml Ep管中，用缓冲液洗涤三次并离心，然后将微珠置于90μL 2％的牛血清蛋白中孵育，于4℃恒温金属浴中孵育12h(转速600rpm)，缓冲液洗涤三次并离心，然后装入芯片半成品内设置的主流道22中，控制微珠24的装入量使微珠段在主流道22上长度达到1mm，完成微流控芯片的制作。

微流控芯片中溶液混合效果考察：

在温度为37℃和环境湿度为40％的条件下，取20μL 10^-5mol/L的荧光素钠溶液和20μL超纯水，分别置于本实施例微流控芯片的两个进样孔11中，稳定10min后对微流控芯片中的溶液进行观察，并用CCD对芯片的不同部位进行拍照，拍照位置如图4所示，照片拍摄结果如图5～图7所示。

由图4～图7可见，当混合溶液刚进入微流控芯片时处于层流状态，两种溶液仅靠分子扩散进行混和，混合效率很低；当混合溶液流经微珠段后，溶液已经达到了均匀的混合，说明微珠的存在确实加速了两种溶液的混合，缩短了混合所需的时间，提高了不同溶液的混合效率。

微流控芯片中溶液流速的考察：

微流控芯片的流速与环境的相对湿度、蒸发面积和温度有关，而本实施例的微流控芯片可用于检测ATP，ATP检测实验要求实验温度为37℃，因此在本实施例中只考虑相对湿度和蒸发面积对溶液流速的影响。

我们采用10^-5mol/L的荧光素钠溶液作为示踪物质对不同条件下的流速进行考察，考察的具体操作步骤如下：

(1)相对湿度对流速的影响：在Leica DMI 4000B荧光倒置显微镜载物台上安装ThermoControl Unit温度控制板，将本实施例的微流控芯片贴于温度控制板上，用一个直径为10cm的培养皿罩住温度控制板并进行密封，使培养皿内部形成一个独立空间，实验时先向微流控芯片中引入二次水，排净通道和废液池内的空气并使吸水膜完全浸润，然后用恒湿剂控制培养皿内部的相对湿度；温度恒定为37℃，蒸发面积固定为188.5mm²的条件下，分别采用乙酸钾、氯化镁、碳酸钾、溴化钠、亚硝酸钠、氯化钠和氯化钾的饱和溶液作为相对湿度为25％、32.5％、43％、57.5％、64％、75％和85％的恒湿剂，稳定10min后，各取20L 10^-5mol/L的荧光素钠溶液，分别置于两个进样孔中，开始用Imaging CCD对不含微珠的部位进行示踪物质的连续拍照，用Simple PCI 6.0图像处理软件计算示踪物质流速，结果如图8所示，由图8可见，随着相对湿度的增加，溶液的流速是逐渐减小的。

(2)蒸发面积对流速的影响：将温度控制板置于倒置荧光显微镜载物台上，并将本实施例的微流控芯片置于温控板上，在固定温度为37℃、环境相对湿度在64％(利用亚硝酸钠作为恒湿剂)的条件下，采用PDMS基片封闭蒸发孔，分别测试蒸发孔数量为3、6、9、12、15个时流道中液体的流速。实验时先向芯片中引入二次水，排净通道和废液池内的空气并使吸水膜完全浸润，稳定10min后，各取20μL 10^-5mol/L的荧光素钠溶液，分别置于两个进样孔中，开始用Imaging CCD对不含微珠的部位进行示踪物质的连续拍照，用Simple PCI 6.0图像处理软件计算示踪物质流速，结果如图9所示，由图9可见，随着蒸发面积的增加，溶液的流速是逐渐增大的。

实施例2：

利用核酸片段传感技术(Nucleotide Frag-mentation Sense，简称NTFS)在本发明实施例1制作的微流控芯片中检测不同浓度的ATP。

NTFS方法的基本原理如图10所示，该方法借助了T4DNA连接酶对ATP的高度依赖性；当没有ATP存在的情况下，核酸片段A(Oligo A)和核酸片段B(Oligo B)无法完全和分子信标的环状部位结合，不能使分子信标充分的打开，没有荧光增强信号产生。在ATP存在的条件下，T4DNA连接酶腺苷化形成连接酶-AMP复合物而被激活，激活的连接酶以分子信标为模板，将两条短片段DNA进行连接，连接产物将分子信标打开，产生荧光增强信号。

利用NTFS方法检测ATP浓度的具体步骤为：

(1)溶液的配制：

检测试剂的配制：各取10μL浓度均为10μmol/L的分子信标(MB)、两条DNA片段A和B(其中片段A 5′磷酸化，并与MB环部的5′端的10个碱基互补；片段B，与MB环部的3′端的9个碱基互补)置于Ep管中，并加入70μL缓冲液。混合均匀后平均分成4管备用。实验前每管加入0.25μL T4DNA连接酶。

ATP的配制：称取0.0292g ATP置于1mL的Ep管中，加入1mL缓冲液配成浓度为50mmol/L的溶液。实验前采用逐级稀释的方法配制成一系列浓度的ATP溶液。

(2)流速的优化：在温度为37℃和蒸发面积为188.5mm²的条件下，在培养皿中放入不同的饱和盐溶液作为恒湿剂，考察该微流控芯片在相对湿度为25％～85％之间七种不同相对湿度控制的流速下，ATP与检测试剂的混合和反应情况，并用缓冲液取代ATP进行各自流速下的对照实验。通过CCD对倒置荧光显微镜上的微流控芯片流道出口末端进行实时荧光监测并拍照。由图11并结合图8可以看出，在不同流速下，检测到的荧光强度的增加值相差不大，这表明在七种不同流速下溶液的混合和反应差别不大，即使在相对湿度最小时(即该微流控芯片中溶液能达到最快流速时)，溶液在该微流控芯片中也能达到充分的混合和反应，即在温度固定为37℃、蒸发面积固定为188.5mm²、环境湿度在25％～85％之间时，利用本发明的微流控芯片均能达到对ATP的检测。换言之，在本发明的微流控芯片中对ATP进行检测，不受环境湿度的限制，在25％～85％的环境湿度下均可实现对ATP的检测，这就使得检测操作更为简单，微流控芯片的使用更为方便。

(3)标准曲线的测定：在温度控制板的温度保持在37℃、蒸发面积为188.5mm²、房间内空气湿度约为40％的条件下，进行标准曲线的测定；在一个进样孔中加入上述配制的检测试剂，在另外一个进样孔中从缓冲液开始，从低浓度到高浓度依次加入ATP溶液(终浓度分别为：0nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、300nM、500nM、1000nM)。稳定一段时间后，在所述主流道的出口处监测并记录样品荧光强度的变化，根据所得的数据绘制标准曲线如图12所示。由图12可以看出，随着ATP浓度的提高，相对荧光强度不断增大，检测下限约为20nM，线性检测范围为20～500nM。

(4)检测方法的准确性：配制ATP的标准溶液，在与上述步骤(3)测定标准曲线相同的条件下，在一个进样孔中加入上述配制的检测试剂，在另外一个进样孔中从缓冲液开始，从低浓度到高浓度依次加入配制好的ATP标准溶液(终浓度分别为：40nM、80nM、140nM、180nM、250nM、350nM)稳定一段时间后，在主流道的出口处监测并记录ATP标准溶液荧光强度的变化，并对应标准曲线读出利用本方法测定的ATP浓度，与标准浓度作比较即可得出该检测方法的准确性，如下表1所示。由表1可以看出，每一种ATP标准溶液的检测相对偏差均小于5％，可见本发明的检测方法具有很高的准确性。

表1：实施例2中本发明方法检测ATP标准溶液的准确性对照表

标准浓度(nM)	40	80	140	180	250	350
							测量浓度(nM)	38.82	83.45	146.38	172.94	244.99	335.95
相对偏差(％)	-2.96	4.31	4.56	-3.92	-2.01	-4.01

Claims

1.一种微流控芯片，其一侧设有两个以上的进样孔，每个进样孔连通有一进样流道，各个进样流道交汇后与一主流道相连通，其特征在于：所述主流道上设有一收缩段形成一狭窄流道，所述狭窄流道入口前的主流道上填充有微珠，微珠段的长度为0.5～1.5mm，所述微珠的粒径大于所述狭窄流道的宽度，所述主流道的出口连通至所述微流控芯片另一侧设置的废液池中；

所述微流控芯片包括相互贴合的盖片和基片，所述盖片下方开设有一上凹槽，所述废液池设于基片开设的下凹槽中并与上凹槽相对应，所述上凹槽上方的盖片上通过布设蒸发孔与外界相连通，所述上凹槽中填充有吸水材料。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述进样孔的孔径为1.8～2.2mm，所述蒸发孔的孔径为3.8～4.2mm，所述狭窄流道的宽度为14～16μm，所述进样流道和主流道的宽度为140～180μm。

3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于：所述微珠为牛血清蛋白包被聚苯乙烯材料或二氧化硅材料制作成的微珠，所述微珠的粒径为18～30μm。

4.一种如权利要求1～3中任一项所述的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)基片的制作：将聚二甲基硅氧烷前聚体和固化剂混合均匀得到PDMS体系，真空脱泡后，将PDMS体系浇注在预制好的硅质阳模板上，烘干、固化后取出，自阳模板剥离得到PDMS基片；

(2)盖片的制作：另取一载玻片并在其一端铺一块垫片，所述垫片周围距离载玻片边缘留有余地，然后另取PDMS体系浇注于载玻片上，固化后从载玻片上剥离，并在所述垫片成型的上凹槽底部开设多个通孔，最后用吸水膜填充所述上凹槽得到PDMS盖片；

(4)流道改性：在上述芯片半成品中设置的各个流道内依次引入NaOH溶液、聚凝胺水溶液和硫酸葡聚糖水溶液进行洗涤，每种溶液洗涤完后均用流水冲洗流道，完成流道改性；

(5)置入微珠：用缓冲液将备好的微珠洗净，然后将微珠置于牛血清蛋白中孵育，孵育完成后装入芯片半成品内设置的主流道中，控制微珠的装入量使其在所述主流道上长度达到0.5～1.5mm，完成微流控芯片的制作。

5.一种如权利要求1或2所述的微流控芯片在检测三磷酸腺苷浓度中的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：在所述微流控芯片的一个进样孔中加入检测试剂，在另一进样孔中加入待测三磷酸腺苷溶液，然后在所述主流道的出口处进行荧光监测，并记录稳定后的相对荧光强度值F₀，再根据当前操作条件下建立的相对荧光强度F与待测三磷酸腺苷溶液浓度C的关联方程，测定出待测三磷酸腺苷溶液的浓度值C₀，所述应用的检测下限为20nM，线性检测范围为20～500nM。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用过程中温度控制为37℃，蒸发面积控制为188.5mm²，环境湿度控制在25％～85％。