CN117323879B - 一种多级分流的微混合器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多级分流的微混合器及其应用。该微混合器包括TeZla混合通道和出口通道，TeZla混合通道包含Z字型通道和特斯拉耳型混合器，使得流体高速经过时层流来不及拐弯形成对撞造成湍流，再通过特斯拉耳型混合器分流为大小两部分流体，以大部分回撞小部分，更好地打断层流并重聚，经多次循环以实现完全混合。出口通道包括观察通道和多组对称侧通道，可以完成多级不同倍数的液体流速下降。该微混合器具有混合时间短、流体速度需求低、兼具早期和长期时间窗口、稳定性高等特点，能够完成生物大分子折叠过程从数微秒级到亚秒级三个数量级的动力学信息的完全采集，在核酸和蛋白质的折叠动力学研究领域有广泛的应用前景。

Description

一种多级分流的微混合器及其应用
技术领域
本发明涉及生物分子折叠动力学表征技术领域，具体涉及一种多级分流的微混合器及其应用。
背景技术
生物分子的折叠动力学与其正确结构和功能的形成密切相关。研究详细的折叠景观可以帮助揭示生物分子的亚稳态构象，从而为折叠机制提供重要的信息，最终帮助药物设计。当折叠途径不正确时，错误折叠的蛋白质可能会导致严重的疾病，如克雅氏症、帕金森病或阿尔茨海默病。此外，核酸分子如G-四联体（G4）的折叠和展开状态在肿瘤和神经系统疾病中起着关键作用。一些研究表明，短寿命的非G4中间体或存在于DNA和RNA G4折叠过程早期阶段的一些初始G4结构可能是设计抗癌药物的潜在靶点。此外，一些非典型G4s的折叠中间体也可以被小分子靶向调节基因功能，使其成为药物设计新靶点。
研究生物分子的折叠动力学是一项重大挑战，因为动力学过程的复杂性和多相性，其时间尺度可以从微秒到秒不等。例如，人类端粒G4（htG4）的折叠被认为在K+和Na+等一价阳离子存在下经历了多相动力学过程：1）线性寡核苷酸转化为发夹结构；2）形成G-三联体（G3）中间体；3）折叠成最终的G4结构。据报道，发夹结构形成发生在10-100 µs的时间范围内，G3结构主要分布在毫秒级，整个G4折叠过程可以持续数秒甚至更长时间。为了观察在毫秒甚至微秒内发生的折叠动力学，在时间限制之前快速混合引发折叠反应的核酸和阳离子是至关重要的。因此，需要人工混合启动反应的圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）方法，虽然可以在很长的时间窗口内观察这一过程，但无法观察早期折叠动力学。
研究生物分子早期折叠动力学的方法多种多样。获得快速折叠动力学数据最常用的工具是停流（stopped-flow）仪器，它可以在几毫秒内混合溶液，并通过荧光，Förster共振能量转移（FRET），CD和其他方法跟踪随后的折叠过程。虽然停流方法提供了有关核酸和蛋白质折叠机制的宝贵信息，但由于时间分辨率不足，它们无法直接捕获亚毫秒和微秒内的早期折叠动力学。研究分子折叠动力学的一个有前途的替代方法是基于微流控的连续混合器，它可以实现溶液中未折叠的寡核苷酸或蛋白质与引发折叠的溶液的快速混合，微混合器的混合死时间可达数微秒，跟踪超快的动力学过程。其中湍流混合器因在溶液控制、成像过程和数据分析方面便利，而更常用。然而，产生高雷诺数（Re）来形成湍流状态，需要非常快的流速（ν），高达几十m/s，这使得在微通道中实现湍流变得具有挑战性。此外，由于微混合器的动力学研究是基于欧拉空间坐标与拉格朗日时间坐标之间的转换，因此需要长微通道进行观察以跟踪长折叠动力学（t = L/ν，其中ν通常为常数）。即使可以设计出相对较长的微通道，通道长度仍然受到微芯片尺寸和成像问题的限制。因此，监测长时间(即覆盖微秒到毫秒至更长时间)的快速折叠动力学仍然是一个重大挑战。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种多级分流的微混合器及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一目的在于提供一种多级分流的微混合器，所述微混合器包括入口通道、TeZla混合通道、出口通道、过渡区、进液口和出液口，所述入口通道和所述出口通道分别设在所述TeZla混合通道的两侧，所述进液口通过所述入口通道与所述TeZla混合通道相连通，所述出液口通过所述出口通道与所述TeZla混合通道相连通；
所述过渡区设置所述进液口和所述入口通道之间，所述过渡区内设置有微过滤器，用于防止灰尘阻塞在所述TeZla混合通道；
所述TeZla混合通道包括至少三个串联的TeZla单元，每个所述TeZla单元包括相互连通的一个Z字型通道和特斯拉耳型混合器，所述Z字型通道包括层流部、拐弯部和湍流部，所述层流部与所述特斯拉耳型混合器分别设置在所述湍流部的两侧，所述特斯拉耳型混合器与所述湍流部相连通；
所述出口通道包括观察通道和多组对称侧通道，所述观察通道与出液口相连通；多组所述对称侧通道相互连通均匀间隔设置在所述观察通道上，实现溶液多级分流，获得观测时间窗口。
进一步的，沿所述观察通道内溶液的运动轨迹，多组所述对称侧通道的侧通道的长度依次减小。
进一步的，所述拐弯部的弯折夹角30-40°。
进一步的，所述特斯拉耳型混合器的宽通道入口端与所述湍流部之间的夹角为50-60°。
进一步的，所述特斯拉耳型混合器的宽通道的通道宽度为28~40 μm。
进一步的，所述Z字型通道的通道宽度为14~20 μm。
进一步的，所述对称侧通道的长度不大于2000 μm。
进一步的，所述观察通道与所述对称侧通道宽度一致，均为50~100 μm。
进一步的，所述对称侧通道与所述观察通道的夹角为90°。
进一步的，所述微过滤器内设置有多层微筛。
本发明的第二目的在于提供一种微流控芯片，包括盖片和基片，所述盖片设置在基片上，所述盖片上设置有上述的微混合器。
进一步的，所述微混合器的通道高度为25-30 µm。所述基片选自选自硅片、石英玻璃、聚二甲基硅氧烷PDMS、聚氨酯PU、聚乙烯PE、聚碳酸酯PC-聚苯乙烯PS、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、环氧树脂中的至少一种。
本发明的第三目的在于提供上述的微流控芯片在表征生物分子折叠动力学或监测生化反应动力学中的应用中。
本发明的第四目的在于提供一种表征人类端粒G四联体的折叠动力学方法，将FRET标记的htG4寡核苷酸与KCl或NaCl溶液在上述的微流控芯片中混合，通过共聚焦光学成像系统拍摄溶液的运动轨迹，在空域上沿观察通道的位置绘制FRET值；在时域上观察通道中的速度变化，绘制FRET值关于时间的图像；经数据分析得到htG4的折叠全过程。
与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
（1）本发明提供的多级分流的微混合器包括入口通道、TeZla混合通道、出口通道、过渡区、进液口和出液口，入口通道和出口通道对称设在TeZla混合通道的两侧，进液口通过入口通道与TeZla混合通道相连通，出液口通过出口通道与TeZla混合通道相连通；出口通道实现经多级分流降速，完成了如同切换倍数物镜的显微镜类似功能，在微秒和亚毫秒级别时间单位，可以提供0.5 μs左右的时间分辨率；同时在亚秒级时间观察窗口提供0.1ms左右时间分辨率，用于实现高时间分辨率和长时间观测窗口的生物分子折叠动力学检测。
（2）本发明的TeZla混合通道包括至少三个串联的TeZla单元，每个TeZla单元包括相互连通的一个Z字型通道和特斯拉耳型混合器，Z字型结构在高流速下使得层流来不及拐弯，受到对撞导致流体扰动形成湍流，紧随其后的特斯拉混合器的耳型结构将之前被扰动的流体分流为大小两部分，重聚时以大部分液体流回对撞小部分液体以增加扰动，且整体平均宽度变小增加流速促进扩散效果，经多次循环后可以使两个入口中的溶液混合均匀。
（3）本发明的出口通道包括观察通道和多组对称侧通道，多组对称侧通道相互连通均匀间隔设置在观察通道上，溶液经多组对称通道分流后分别降速，从而实现溶液多级分流，获得更长的观测时间窗口。
（4）本发明的微混合器，在入口处设置为过滤器可以有效防止碎屑，避免堵塞，同时微过滤器区域总体积较大，可提供较大的缓冲能力，使本发明的微混合器稳定性更好，使用寿命更长。
（5）本发明提供的微流控芯片包含本发明的微流控通道，其结构简单，易制备，混合效率好、混合时间短，极大地节省人力、物力和成本，适用范围广。
（6）本发明提供的表征生物分子折叠动力学或生化反应动力学的应用，利用本发明的微流控芯片处理，兼顾了早期高分辨动力学观察和长期时间窗口，能够完成生物大分子近全程的折叠动力学观察以及蛋白质-小分子相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、蛋白质变性复性、酶催化等生化反应动力学的监测。
附图说明
图1为本发明的一种多级分流的微混合器的结构示意图，由带有微滤器的入口、TeZla混合通道和带有对称分流通道及出液口的出口通道组成；
图2为本发明的微流控芯片结构分解图，图中A为本发明的一种多级分流的微混合器的设计图；图中B为微过滤器设计放大图，其中三组尺寸递减的方形结构阵列，形成了宽度递减的三级微通道；图中C为第一处分流侧通道处设计放大图，其中通道宽度为50 μm，通道夹角为90°；图中D为TeZla混合通道设计图，其中包含三组TeZla混合单元，每个混合单元由一个Z型混合结构和特斯拉耳型结构组成；
图3为本发明的一种多级分流的微混合器实物的显微照片，主图为实物的40倍光学显微照片，①~④分别为：①微过滤器、②分流通道交叉口、③混合区域、④出口的扫描电子显微照片；
图4a为装配好的微流控芯片示意图；
图4b为充填墨水的微流控芯片的照片；
图5为TeZla混合通道的浓度分布和流速分布模拟，浓度分布模拟中，TeZla混合通道两侧入口的浓度分别设为0和1，在TeZla混合通道末端得到均一浓度为0.5（灰度一致），流速分布模拟中，箭头方向显示液体流动方向，箭头密度显示流速快慢；
图6为出口通道的流速模拟图，各区域内流速为4 m/s，1 m/s，0.2 m/s，0.02 m/s；对应观察时间为500 μs，2000 μs，10 ms，250 ms；
图7为本发明的多级分流的微混合器出口通道观测时间与无分流直通道观测时间对比图，图中A具有侧通道的出口通道能够监测0-262.5 ms时间窗口，B中无侧通道的出口通道监测时间窗口（2.75 ms）的约100倍；
图8A为0.01 mL/min、0.03 mL/min、0.08 mL/min、0.12 mL/min流速下混合器内的流动分布图；P1-P8为沿TeZla混合通道选择的位置，用于计算混合效率；右图显示了特殊微结构设计导致的Z型拐弯处和特斯拉耳型结构内流动变形和流动界面拉伸；
图8B为不同流速下P8时观察通道内磺酰罗丹明B的荧光分布图；
图8C为混合效率随流速和沿通道位置的相图；
图8D为不同速率下P8下混合效率的定量计算图，在0.12 mL/min的流速下混合效率达到0.908；
图8E为0.01 mL/min，0.03 mL/min，0.05 mL/min，0.08 mL/min，0.1 mL/min，0.12mL/min流速下混合器中KI猝灭荧光素反应的荧光分布图；
图8F为不同流速下P8的归一化荧光强度，荧光强度低于0.3即认为混合均匀；
图9为缺少特斯拉混合器的结构的混合能力表征对比图，缺失特斯拉耳型结构或仅2组TeZla结构的混合通道都无法完成出口处荧光分布一致；
图10为考察制备的微流控芯片中出口通道的分流效果结果图，图中A为侧流道的理论流量分布，B为三个交叉口气泡流分布，由于速度下降，在路口可以看到更多的气泡，C为三次试验中各出液水量的定量测量；
图11为研究G-四联体在TeZla混合器中折叠动力学的系统装置图，由机械注射泵以0.12 mL/min流速，以匀速向两个入液口注射FRET标记的G4寡核苷酸溶液和一价阳离子（Na+，K+）溶液，同时利用共聚焦光学成像系统扫描出口通道内FITC（绿色，~520 nm）和TRITC（红色，~590 nm）的荧光图像进行处理；
图12A为不同条件下观察通道内htG4折叠过程的拼接图，O0-O4分别表示观测窗口起始点、三个交点和观测窗口终点；
图12B为由图12A得出的FRET效率与空间位置或折叠动力学时间的关系图；
图12C为由图12B的指数拟合得到的动力学参数图；
图12D为 htG4在K+（上）和Na+（下）溶液中的折叠路径演示图。
图中：1、微混合器；11、入口通道；12、TeZla混合通道；121、TeZla单元；122、Z字型通道；1221、层流部；1222、拐弯部；1223、湍流部；123、特斯拉耳型混合器；13、出口通道；131、观察通道；132、对称侧通道；14、过渡区；141、微过滤器；15、进液口；16、出液口。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种多级分流的微混合器。
参考图1，本发明提供的一种多级分流的微混合器1包括入口通道11、TeZla混合通道12、出口通道13、过渡区14、进液口15和出液口16，入口通道11和出口通道13对称设置在TeZla混合通道12的两侧，进液口15通过入口通道11与TeZla混合通道12相连通，出液口16通过出口通道13与TeZla混合通道12相连通；过渡区14设置进液口15和入口通道11之间，用于防止灰尘阻塞在TeZla混合通道；TeZla混合通道12包括至少三个串联的TeZla单元121，每个TeZla单元包括相互连通的一个Z字型通道122和特斯拉耳型混合器123，Z字型通道122包括层流部1221、拐弯部1222和湍流部1223，层流部1221与特斯拉耳型混合器宽通道1212分别设置在湍流部1223的两侧，特斯拉耳型混合器123与湍流部1223相连通，出口通道13包括观察通道131和多组对称侧通道132，观察通道131与出液口15相连通；多组对称侧通道132相互连通均匀间隔设置在观察通道131上，实现溶液多级分流，获得观测时间窗口。利用Z字型结构在高流速下使得层流来不及拐弯，受到对撞导致流体扰动形成湍流，紧随其后的特斯拉混合器的耳型结构将之前被扰动的流体分流为大小两部分，重聚时以大部分液体流回对撞小部分液体以增加扰动，且整体平均宽度变小增加流速促进扩散效果，三次循环后可以使两个入口中的溶液混合均匀。溶液经多组对称通道分流后分别降速，从而实现溶液多级分流，获得更长的观测时间窗口。
在一些实施方式中，为了提高进样效率，可以设置多个入口通道11。
在一些实施方式中，为了实现显著的分流降速，产生更长的观测时间，沿观察通道内溶液的运动轨迹，多组对称侧通道的侧通道的长度依次减小。
在一些实施方式中，为了使溶液产生明显的流体畸变，拐弯部1222的弯折夹角可以为30-40°，特斯拉耳型混合器123的宽通道入口端与湍流部1223之间的夹角可以为50-60°。
在一些实施方式中，为了实现更好的混合效果，特斯拉耳型混合器123的宽通道的通道宽度为28-40 μm，所述Z字型通道122的通道宽度为14-20 μm。
在一些实施方式中，为了实现更好的分流效果，对称侧通道132的长度不大于2000μm，观察通道131与对称侧通道132宽度一致，均为50-100 μm，对称侧通道132与观察通道131的夹角为90°。
在一些实施方式中，为了防止微混合器堵塞，微过滤器141内设置有多层微筛。
实施例2
本实施例提供了一种微流控芯片，其包括盖片和基片，盖片设置在基片上，盖片上设置有微混合器，所提供的微流控芯片结构分解图如图2所示，图中A为微混合器的设计图；图中B为微过滤器设计放大图，其中三组尺寸递减的方形结构阵列，形成了宽度递减的三级微通道；图中C为第一处分流侧通道处设计放大图，其中通道宽度为50 μm，通道夹角为90°；D为TeZla混合通道设计图，其中包含三组TeZla混合单元，每个混合单元由一个Z型混合结构和特斯拉耳型结构组成。
本实施例的微流控芯片的制备方法包括如下步骤：
（1）掩膜的设计
使用绘图软件AutoCAD绘制微混合器的图案，将图案转移至镀铬玻璃板上，而后在紫外光照射下，将掩模上的图案转移至光刻胶上。
微混合器的尺寸为：入口处微过滤器内通道分三层微筛，筛孔尺寸为56 μm，28 μm和14 μm；入口通道、出口通道的宽度为50 μm；TeZla混合通道的主通道宽度为14 μm，Z字型角度为35°，特斯拉耳型结构分流处宽度为28 μm，夹角为55°，回到主通道处的宽度为14 μm；出口通道中主通道分段长度分别为2000 μm，2000 μm，2000 μm和5000 μm，三组侧通道长度分别为2000 μm，1555 μm，1111 μm。
（2）PDMS薄层的制备
用软光刻技术制作SU-8阳模。将SU-8光刻胶（3025）在洗净烘干的硅片上甩开均匀（800 rpm 40 s，4500 rpm 60 s），于热平板上前烘除去光刻胶中的溶剂（65℃ 10 min，90℃ 25 min），进行光刻（6 s，5 mJ/cm2），然后置于热平板进行后烘（65 ℃ 2 min，90 ℃ 8min），经过PGMEA显影和异丙醇定影后，在热平板上进行坚模（135 ℃ 120 min），即可得到具有微结构的阳模。制作出阳模后，利用快速成型方法将阳模的结构复制到PDMS薄片上。即将PDMS与固化剂10:1混合后去除气体得到前聚体，将前聚体倒于阳模上，利用烘箱75℃加热2 h，将固化的PDMS揭起即可获得PDMS薄片，厚度约为5 mm。如图3所示，为PDMS薄片上的微混合器结构的显微照片。
（3）PDMS薄层与玻片基底结合形成微流控芯片
使用1 mm直径手动打孔器，在进样口和出样口处打孔。将PDMS薄片用酒精洗净氮气吹干确保清理干净碎屑，将玻片基底也用酒精冲洗干净后吹干，再将二者放进等离子清洗器中处理（800 V 70 s）后，对准后将PDMS薄层有结构的一面贴紧玻片键合，65℃加热2 h后得到PDMS芯片。微流控芯片的图片如图4a和4b所示，其中图4b为充填墨水的微混合器的照片。
（4）微混合器的组装
为了将样品液体导入芯片进行混合，需要将导管与之连接。首先将约25 cm硅胶软管两端分别与不锈钢管和平头针管相连接，用酒精、水依次洗净后用氮气吹干净，将不锈钢管另一端插入PDMS层上入口处已打的孔，利用AB胶将PDMS薄片到硅胶软管整体全部粘住后65℃加热2 h固化AB胶确保无漏液可能，最后将平头针管对注射器一头连接上滤头。另一方面，出液口处连接的软管长度为10 cm，亦连接不锈钢管和平头针管，不需AB胶进行固化。
为了更好阐述本发明提供的多级分流的微混合器的性能特征，本申请人进行了如下研究：
1、模拟微混合器的混合效果和分流能力的研究
对TeZla混合通道12进行模拟：如图5所示的速度分布表明，特斯拉和Z字形结构显著增加了流体界面之间的流体扰动和畸变。如图5所示浓度分布所示，每个入口流速设为0.12 mL/min时，通过TeZla混合通道的两种溶液在40 µs内，两端不同颜色的模拟液体最终形成均一的颜色，表示已经混合完全。
对出口通道13进行模拟：从图6的速度分布图中可以看出，箭头的尺度在三个分流处都发生了变化，表明速度在逐渐降低。为了定量表征每个阶段的速度，本申请人沿观测通道计算了四个相交点的平均速度，每个路口后的速度分别下降约4倍、5倍和10倍。如图7所示，微混合器出口通道观测时间与无分流直通道观测时间对比图，图中A的设计为观测通道的每个部分分别产生约0.5、2、10和250 ms的观测时间窗，总观测时间为262.5 ms；相比之下，图中B的设计为相同尺寸但没有侧通道的直线观测通道只能产生2.75 ms的时间窗，大约缩短了100倍。
2、考察制备的微流控芯片中混合通道的混合效果
本申请人使用了磺酰罗丹明B（发红色荧光）和荧光素（发绿色荧光）水溶液对微流控芯片的混合效果进行了初步的表征。结果如图8A表明：当流速为0.01 mL/min（Re =22.0）时，溶液在通道内呈层流流动；当流速增加到0.03 mL/min（Re = 66.1）时，流体受到轻微扰动。当速率进一步提高到0.08 mL/min（Re = 176.2）时，在Z字形区域明显观察到流体畸变，这表明能有效地促进混合。当流速增加到0.12 mL/min（Re = 264.3）时，两种溶液流过特斯拉耳型结构后出现了更多的界面，由于Z字形而产生的流体畸变更为明显。在此条件下，TeZla混合通道出口处的溶液荧光分布均一。如图8B所示，不同流速下通道内的荧光分布也表明，当流速为0.12 mL/min及以上时，TeZla混合通道出口处（图8A P8）的混合均匀。然而如图9所示，在这种情况下，只有三个Z字型单元或两个TeZla单元的类似缺失型对照组混合器无法实现磺酰罗丹明B和荧光素液体的完全混合，混合器末端显示荧光分布不均一。
为了定量分析TeZla的混合性能，根据公式计算混合效率(Cm):
,
其中X i与X̅分别为特图片中对应位置的荧光值和平均值，N为对应分析区域的像素个数。C m的取值范围为0 ~ 1，C m≥ 0.9表示微混合器内混合均匀。图8C显示了混合效率随流速和通道位置的相图。图8D清楚地表明，当流量增加到0.12 mL/min时，在P8时C m大于0.9。通过共聚焦Z轴层叠图像和P8（C m= 0.928）处提取的截面进一步证明了TeZla的优异混合性能。
除了用磺酰罗丹明B和荧光素两色荧光的混合实验，本申请人还对TeZla进行了碘化钾淬灭荧光素反应，以测试其性能。如图8E所示，流速的增加促进了荧光强度的有效猝灭。当流速达到0.12 mL/min时，观察通道内出现荧光强度较弱的均匀溶液，说明混合完全。荧光猝灭效率可以用Stern-Volmer方程来评估：
,
其中I 0和I分别为无猝灭剂和有猝灭剂时的荧光强度；K SV为Stern-Volmer常数（9.608 ± 0.273），[Q]为碘化钾浓度。由式可知，在观测通道前方完全混合时，0.5 M KI只能检测到初始荧光强度的30%。因此，图8F的结果证实了两种溶液在0.12 mL/min的混合通道中实现了完全混合。
根据上述结果，确定TeZla微混合器的混合死区时间为t = Vmix/F，其中t为混合死时间，Vmix为混合通道体积（0.08 nL），F为两个入口的总流速（2 × 0.12 mL/min）。因此，混合时间计算为40 µs。
3、考察制备的微流控芯片中出口通道的分流效果
本申请人开发了一种基于气泡的方法来定性地可视化流速：使用注射泵向微芯片的两个入液口分别注入少量空气和1%牛血清白蛋白（BSA）溶液，待流动稳定后即可得到稳定的气泡流动。如图10所示，为考察制备的微流控芯片中出口通道的分流效果结果图，图中A为侧流道的理论流量分布图；图中B显示了三个路口的气泡分布，从第一个路口到第三个路口，气泡数量逐渐增加，对应于观测通道中的速度降低。进一步，从两个入液口注液体，在每个出液口收集液体，并定量测量出液口的液体量（O1, O2和O3两个对应的出口合并）；图中C为归一化后三次试验在O1-O4（V1-V4）的平均体积及对应的平均总体积（Q1-Q4）。每个交叉口后的体积分别为0.255、0.055和0.005，对应于相应阶段的速度降低约4倍、5倍和10倍。这些实验结果与图6的模拟结果高度一致，表明多级分流降速的宽观测时间窗口（如图7所示）对于研究大分子折叠动力学应该是可靠的。
实施例3
采用实施例2制备的微流控芯片表征人类端粒G-四联体（htG4）的折叠动力学。
人类端粒G-四联体（htG4）的折叠途径因其与癌症发展和抗癌药物设计的相关性而被广泛研究。然而，与对折叠途径的全面研究相比，由于时间分辨率要求高，直接研究htG4早期折叠动力学的研究鲜有报道。
本申请人使用本发明的微流控芯片来研究htG4的折叠全过程，构建的系统装置如图11所示，由流体系统、微流控芯片、共聚焦光学成像系统和数据处理系统组成，流体装置由机械注射泵、注射器和连接微流控芯片的管道组成，两个注射器中分别装载5’-FITC，3’-TAMRA标记的G4寡核苷酸溶液和一价阳离子（Na+，K+）溶液，由机械注射泵以0.12 mL/min流速匀速注入微芯片中。共聚焦光学成像系统为方形虚线框显示，激光激发光源发射波长为488 nm的连续激光，经由激光源小孔后，被二色镜反射，由物镜聚焦至微流控芯片观察通道成像区，激发FITC产生绿色荧光，并通过FRET效应使TAMRA产生红色荧光，发射光经过物镜、二色镜后被检测器小孔筛选后，由检测器接收并转化为电信号传输至数据处理系统。
采用本发明的微流控芯片表征htG4的折叠全程动力学荧光图像如图12A至图12D所示。
htG4形成序列(TTAGGG)4分别在5'和3'端用一对FRET探针（FAM，绿色荧光/TAMRA，红色荧光）标记。将FRET标记的htG4寡核苷酸与KCl或NaCl在本发明的微混合器中混合，开始折叠过程，在共聚焦显微镜上拍摄荧光素和磺酰罗丹明B通道的荧光图像并拼成大图（图12A）。根据空间即沿观察通道的位置绘制FRET值，如图12B的左图所示。此外，基于观察通道中的速度变化，绘制了FRET值关于时间的图像（图12B）。
考虑到钠钾离子的浓度远大于寡核苷酸的浓度，G4的折叠过程可视为伪一级反应，将100/200 mM K+/Na+的折叠动力学数据集分别拟合为O0-O2和O2-O4的单指数和双指数函数。弛豫时间分别命名为τ1（来自单指数曲线拟合），τ2和τ3（来自双指数曲线拟合）。图12C显示τ1的分布在几十微秒的范围内，表明O0-O2中的动力学过程可能是预折叠寡核苷酸形成发夹结构，时间尺度与前人研究报道的发夹形成一致。对于O2-O4的动力学曲线，τ2和τ3的时间尺度在10-1000 ms之间，这与文献报道的G3和G4形成的时间尺度一致。
基于图12A-12C的结果和之前的报道，本申请人揭示了htG4寡核苷酸折叠途径的全过程（图12D）。在没有Na+/K+离子的情况下，由于核苷酸内部磷酸阴离子的内部静电斥力，寡聚核苷酸以相对延伸的构象存在。在加入一价阳离子（K+或Na+）后，由于电荷中和效应，寡核苷酸迅速坍塌成紧凑的结构，其发生的时间尺度超出了本发明的混合器的分辨率（纳秒到微秒）。随后，坍塌的结构依靠分布在坍塌结构内部的内部氢键，在数十微秒内迅速形成发夹。在这个过程中，阳离子结合稳定了形成的发夹结构。此后，发夹结构在几十毫秒内进一步折叠成亚稳态G3中间体，随后在亚秒时间尺度内形成G4结构。
本发明不仅可以用于核酸的折叠动力学的表征，也可以用于蛋白质折叠和去折叠的表征，还可以用于蛋白质-小分子相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、蛋白质变性复性、酶催化等生化反应动力学的监测。另外，本发明的TeZla混合通道部分作为能力优越的微混合器，也可用于各种微量珍贵样本的快速制备。
综上所述，采用本发明的微流控芯片观察生物大分子折叠动力学或监测生化反应动力学的优势，来自于微过滤器提供的稳定性，TeZla混合器对微流体快速混合能力，以及出口通道的对液体精确的分流能力。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多级分流的微混合器，其特征在于：所述微混合器（1）包括入口通道（11）、TeZla混合通道（12）、出口通道（13）、过渡区（14）、进液口（15）和出液口（16），所述入口通道（11）和所述出口通道（13）分别设在所述TeZla混合通道（12）的两侧，所述进液口（15）通过所述入口通道（11）与所述TeZla混合通道（12）相连通，所述出液口（16）通过所述出口通道（13）与所述TeZla混合通道（12）相连通；所述过渡区（14）设置所述进液口（15）和所述入口通道（11）之间，所述过渡区（14）内设置有微过滤器（141），用于防止灰尘阻塞在所述TeZla混合通道；所述TeZla混合通道（12）包括至少三个串联的TeZla单元（121），每个所述TeZla单元包括相互连通的一个Z字型通道（122）和特斯拉耳型混合器（123），所述Z字型通道（122）包括层流部（1221）、拐弯部（1222）和湍流部（1223），所述层流部（1221）与所述特斯拉耳型混合器（123）分别设置在所述湍流部（1223）的两侧，所述特斯拉耳型混合器（123）与所述湍流部（1223）相连通；所述出口通道（13）包括观察通道（131）和多组对称侧通道（132），所述观察通道（131）与出液口（16）相连通；多组所述对称侧通道（132）相互连通均匀间隔设置在所述观察通道（131）上，实现溶液多级分流，获得观测时间窗口。
2.如权利要求1所述的微混合器，其特征在于，沿所述观察通道（131）内溶液的运动轨迹，多组所述对称侧通道（132）的侧通道的长度依次减小。
3.如权利要求1所述的微混合器，其特征在于，所述拐弯部（1222）的弯折夹角30-40°，所述特斯拉耳型混合器（123）的宽通道入口端与所述湍流部（1223）之间的夹角为50-60°。
4. 如权利要求1所述的微混合器，其特征在于，所述特斯拉耳型混合器（123）的宽通道的通道宽度为28~40 μm，所述Z字型通道（122）的通道宽度为14~20 μm。
5. 如权利要求1所述的微混合器，其特征在于，所述对称侧通道（132）的长度不大于2000 μm，所述观察通道（131）与所述对称侧通道（132）宽度一致，均为50~100 μm，所述对称侧通道（132）与所述观察通道（131）的夹角为90°。
6.如权利要求1所述的微混合器，其特征在于，所述微过滤器（141）内设置有多层微筛。
7.一种微流控芯片，其特征在于，包括盖片和基片，所述盖片设置在基片上，所述盖片上设置有权利要求1-6中任一项所述的微混合器。
8. 如权利要求7所述的一种微流控芯片，其特征在于，所述微混合器的通道高度为25~30 µm。
9.如权利要求7-8中任一项所述的微流控芯片在表征生物分子折叠动力学或监测生化反应动力学中的应用。
10.一种表征人类端粒G四联体的折叠动力学方法，其特征在于，将FRET标记的htG4寡核苷酸与KCl或NaCl溶液在权利要求7-8中任一项所述的微流控芯片中混合，通过共聚焦光学成像系统拍摄溶液的运动轨迹，在空域上沿观察通道的位置绘制FRET值；在时域上观察通道中的速度变化，绘制FRET值关于时间的图像；经数据分析得到htG4的折叠全过程。
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