DE202019005610U1 - Durchflusszellenvorrichtung und ihre Verwendung - Google Patents

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Abstract

Durchflusszellenvorrichtung, umfassend:
(a) einen ersten Behälter, der konfiguriert ist, eine erste Lösung aufzunehmen und ein erstes Einlassende und ein erstes Auslassende umfasst;
(b) einen zweiten Behälter, der konfiguriert ist, eine zweite Lösung aufzunehmen und ein zweites Einlassende und ein zweites Auslassende umfasst; und
(c) einen zentralen Bereich, umfassend ein drittes Einlassende und ein drittes Auslassende, wobei das dritte Einlassende durch mindestens ein Ventil fluidisch mit dem ersten Auslassende und dem zweiten Auslassende gekoppelt ist;
wobei eine Innenfläche des zentralen Bereichs mindestens eine hydrophile Polymerbeschichtungsschicht mit mehreren daran gekoppelten Oligonukleotidmolekülen umfasst;
wobei mindestens ein Oligonukleotidmolekül der mehreren ein Segment umfasst, das spezifisch an ein eukaryotisches genomisches Nukleinsäuresegment, ein prokaryotisches genomisches Nukleinsäuresegment, ein virales Nukleinsäuresegment oder ein Transkriptom-Nukleinsäuresegment hybridisiert; und
wobei ein Verhältnis eines Fluoreszenzsignals für Fluorophor-markierte komplementäre Oligonukleotide, die spezifisch an das mindestens eine Oligonukleotidmolekül der mehreren hybridisiert sind, zu einem Fluoreszenzsignal für Fluorophor-markierte Oligonukleotide, die nicht spezifisch an die Innenfläche gebunden sind, mindestens 2 : 1 in einem Fluoreszenzbild der Innenfläche beträgt, wenn das Fluorophor Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) ist und das Fluoreszenzbild unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskops aufgenommen wird, das mit einem für 532 nm Licht optimierten dichroitischen Spiegel mit 20-fachem Objektiv und einem für Cy3-Emission optimierten Bandpassfilter und einer Kamera unter nicht signalgesättigten Bedingungen ausgestattet ist, während die Oberfläche in 25 mM ACES, pH-7,4-Puffer, eingetaucht ist.

Description

  • QUERVERWEIS
  • Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/776.827 , eingereicht am 7. Dezember 2018, und der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/892.419 , eingereicht am 27. August 2019, die hierin mit in vollem Umfang durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • HINTERGRUND
  • Durchflusszellenvorrichtungen sind in der Chemie und Biotechnologie weit verbreitet. Insbesondere in Sequenzierungssystemen der nächsten Generation (NGS) werden solche Vorrichtungen verwendet, um aus biologischen Proben stammende Matrizen-Nukleinsäuremoleküle zu immobilisieren und dann einen sich wiederholenden Strom von Sequenzierung-durch-Synthese-Reagenzien einzuführen, um markierte Nukleotide an bestimmte Positionen in den Matrizensequenzen zu binden. Eine Reihe von Markierungssignalen wird detektiert und decodiert, um die Nukleotidsequenzen der Matrizenmoleküle erkennen zu lassen, z. B. immobilisierte und/oder amplifizierte Nukleinsäure-Matrizenmoleküle, die an eine Innenfläche der Durchflusszelle gebunden sind.
  • Typische NGS-Durchflusszellen sind mehrschichtige Strukturen, die aus planaren Oberflächensubstraten und anderen Durchflusszellenkomponenten hergestellt sind (siehe beispielsweise US-Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2018/0178215 A1), die dann durch mechanische, chemische oder Laserbindungstechniken verbunden werden, um Fluidströmungskanäle zu bilden. Solche Durchflusszellen erfordern typischerweise kostspielige mehrstufige Präzisionsherstellungstechniken, um die erforderlichen Entwurfsspezifikationen zu erreichen. Auf der anderen Seite sind kostengünstige und handelsübliche Kapillaren mit einem Lumen (Strömungskanal) in einer Vielzahl von Größen und Formen erhältlich, die jedoch im Allgemeinen nicht für eine einfache Handhabung und Kompatibilität mit dem wiederholten Wechseln zwischen Reagenzien geeignet sind, die für Anwendungen wie NGS erforderlich sind.
  • KURZDARSTELLUNG
  • Hier werden neue Durchflusszellenvorrichtungen und -systeme zum Sequenzieren von Nukleinsäuren beschrieben. Die hierin beschriebenen Vorrichtungen und Systeme können eine effizientere Verwendung der Reagenzien erreichen und helfen, die Kosten und die Zeit des DNA-Sequenzierungsprozesses zu reduzieren. Die Vorrichtungen und Systeme können handelsübliche Kapillaren von der Stange oder einen Fluidchip im Mikro- oder Nanomaßstab mit einem ausgewählten Kanalmuster verwenden. Die hierin beschriebenen Durchflusszellenvorrichtungen und -systeme sind für eine schnelle DNA-Sequenzierung geeignet und können dazu beitragen, eine effizientere Verwendung teurer Reagenzien zu erreichen und die für die Probenvorbehandlung und -replikation erforderliche Zeit im Vergleich zu anderen DNA-Sequenzierungstechniken zu reduzieren. Das Ergebnis ist ein viel schnelleres und kostengünstigeres Sequenzierungsverfahren.
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf eine Durchflusszellenvorrichtung, umfassend: einen ersten Behälter, der eine erste Lösung enthält und ein Einlassende und ein Auslassende aufweist, wobei das erste Mittel vom Einlassende zum Auslassende in dem ersten Behälter fließt; einen zweiten Behälter, der eine zweite Lösung enthält und ein Einlassende und ein Auslassende aufweist, wobei das zweite Mittel vom Einlassende zum Auslassende in dem zweiten Behälter fließt; einen zentralen Bereich mit einem Einlassende, das durch mindestens ein Ventil fluidisch mit dem Auslassende des ersten Behälters und dem Auslassende des zweiten Behälters gekoppelt ist; wobei das Volumen der ersten Lösung, die vom Auslass des ersten Behälters zum Einlass des zentralen Bereichs fließt, geringer ist als das Volumen der zweiten Lösung, die vom Auslass des zweiten Behälters zum Einlass des zentralen Bereichs fließt
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf eine Durchflusszellenvorrichtung, umfassend: ein Gerüst; mehrere Behälter, die Reagenzien enthalten, die mehreren Reaktionen gemein sind, die mit der Durchflusszelle kompatibel sind; einen einzelnen Behälter, der ein reaktionsspezifisches Reagenz enthält; eine entfernbare Kapillare mit 1) einer ersten Membranventil-Absaugung von mehreren unspezifischen Reagenzien aus den mehreren Behältern und 2) einer zweiten Membranventil-Absaugung eines einzelnen Reagenzes aus einem Quellenbehälter in unmittelbarer Nähe des zweiten Membranventils.
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf eine Durchflusszellenvorrichtung, umfassend: eine Flammenarbeit; eine Vielzahl von Behältern, die Reagenzien enthalten, die mehreren Reaktionen gemein sind, die mit der Durchflusszelle kompatibel sind; einen einzelnen Behälter, der ein reaktionsspezifisches Reagenz enthält; eine entfernbare oder nicht entfernbare Kapillare mit 1) einer ersten Membranventil-Absaugung von mehreren unspezifischen Reagenzien aus mehreren Behältern und 2) einer zweiten Membranventil-Absaugung eines einzelnen Reagenzes aus einem Quellenbehälter in unmittelbarer Nähe des zweiten Membranventils. 3) optional eine Montageausführungsform, bei der Kapillaren über ein Indexmontagemedium an einem Glassubstrat befestigt/montiert werden.
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf eine Durchflusszellenvorrichtung, umfassend: a) eine oder mehrere Kapillaren, wobei die eine oder mehreren Kapillaren austauschbar sind; b) zwei oder mehr Fluidadapter, die an der einen oder den mehreren Kapillaren angebracht sind und so konfiguriert sind, dass sie mit einem Rohr zusammenpassen, das eine Fluidverbindung zwischen jeder der einen oder den mehreren Kapillaren und einem Fluidsteuersystem außerhalb der Durchflusszellenvorrichtung bereitstellt; und c) optional eine Patrone, die konfiguriert ist, mit der einen oder den mehreren Kapillaren zusammenzupassen, sodass die eine oder die mehreren Kapillaren in einer festen Ausrichtung relativ zur Patrone gehalten werden, und wobei die zwei oder mehr Fluidadapter optional in die Patrone integriert sind, optional eine Montageausführungsform, bei der Kapillaren über ein Index-Montagemedium an einem Glassubstrat befestigt/montiert werden
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäureprobe und einer zweiten Nukleinsäureprobe, umfassend: Abgeben von mehreren Oligonukleotiden an eine Innenfläche einer zumindest teilweise transparenten Kammer; Abgeben einer ersten Nukleinsäureprobe an die Innenfläche; Abgeben mehrerer unspezifischer Reagenzien durch einen ersten Kanal an die Innenfläche; Abgeben eines spezifischen Reagenzes durch einen zweiten Kanal an die Innenfläche, wobei der zweite Kanal ein geringeres Volumen als der erste Kanal aufweist; Visualisieren einer Sequenzierungsreaktion auf der Innenfläche der zumindest teilweise transparenten Kammer; und Ersetzen der zumindest teilweise transparenten Kammer vor einer zweiten Sequenzierungsreaktion.
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf ein Verfahren zum Reduzieren eines Reagenzes, das in einer Sequenzierungsreaktion verwendet wird, umfassend: Bereitstellen eines ersten Reagenzes in einem ersten Behälter; Bereitstellen eines zweiten Reagenzes in einem ersten zweiten Behälter, wobei jeder des ersten Behälters und des zweiten Behälters fluidisch an einen zentralen Bereich gekoppelt ist und wobei der zentrale Bereich eine Oberfläche für die Sequenzierungsreaktion umfasst; und sequentielles Einführen des ersten Reagenzes und des zweiten Reagenzes in einen zentralen Bereich der Durchflusszellenvorrichtung, wobei das Volumen des ersten Reagenzes, das vom ersten Behälter zum Einlass des zentralen Bereichs fließt, geringer ist als das Volumen des zweiten Reagenzes, das aus dem zweiten Behälter zum zentralen Bereich fließt.
  • Einige Ausführungsformen beziehen sich auf ein Verfahren zum Erhöhen der effizienten Verwendung eines Reagenzes in einer Sequenzierungsreaktion, umfassend: Bereitstellen eines ersten Reagenzes in einem ersten Behälter; Bereitstellen eines zweiten Reagenzes in einem ersten zweiten Behälter, wobei jeder des ersten Behälters und des zweiten Behälters fluidisch an einen zentralen Bereich gekoppelt ist und wobei der zentrale Bereich eine Oberfläche für die Sequenzierungsreaktion umfasst; und Halten des Volumens des ersten Reagenzes, das vom ersten Behälter zum Einlass des zentralen Bereichs fließt, sodass es kleiner ist als das Volumen des zweiten Reagenzes, das vom zweiten Behälter zum zentralen Bereich fließt.
  • AUFNAHME DURCH BEZUGNAHME
  • Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hierin mit in ihrer Gesamtheit in demselben Umfang durch Bezugnahme aufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung, jedes Patent oder jede Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben wäre, um durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen zu werden. Im Falle eines Konflikts zwischen einem Begriff hierin und einem Begriff in einem aufgenommenen Verweis gilt der Begriff hierin.
  • Figurenliste
  • Die Patent- oder Anmeldedatei enthält mindestens eine farbig ausgeführte Zeichnung. Kopien dieses Patents oder der Patentanmeldungsveröffentlichung mit Farbzeichnung(en) werden vom Amt auf Anfrage und gegen Zahlung der erforderlichen Gebühr zur Verfügung gestellt.
  • Einige neuartige Merkmale der Erfindung sind in den beigefügten Patentansprüchen besonders dargelegt. Ein besseres Verständnis der Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung erhalten, die veranschaulichende Ausführungsformen darstellt, in denen die Prinzipien der Erfindung verwendet werden, und deren begleitende Zeichnungen:
    • 1 zeigt eine Ausführungsform einer einzelnen Kapillarflusszelle mit 2 Fluidadaptern.
    • 2 zeigt eine Ausführungsform einer Durchflusszellenpatrone, die ein Gehäuse, Fluidadapter und zwei Kapillaren umfasst.
    • 3 zeigt eine Ausführungsform eines Systems, das eine einzelne Kapillarflusszelle umfasst, die mit verschiedenen Fluidströmungssteuerungskomponenten verbunden ist, wobei die einzelne Kapillare mit der Montage auf einem Mikroskoptisch oder in einem kundenspezifischen Bildgebungsinstrument zur Verwendung in verschiedenen Bildgebungsanwendungen kompatibel ist.
    • 4 zeigt eine Ausführungsform eines Systems, das eine Kapillarflusszellenpatrone mit integrierten Membranventilen umfasst, um das Totvolumen zu minimieren und bestimmte Schlüsselreagenzien zu schonen.
    • 5 zeigt eine Ausführungsform eines Systems, das eine Kapillarflusszelle, einen Mikroskopaufbau und einen Temperatursteuermechanismus umfasst.
    • 6 zeigt ein nicht einschränkendes Beispiel für die Temperaturregelung der Kapillarflusszellen unter Verwendung einer Metallplatte, die in Kontakt mit der Flusszellenpatrone gebracht wird.
    • 7 zeigt einen nicht einschränkenden Ansatz zur Temperatursteuerung der Kapillarflusszellen, der einen berührungslosen Wärmesteuerungsmechanismus umfasst.
    • 8 zeigt die Visualisierung der Clusteramplifikation in einem Kapillarlumen.
    • 9A-9C veranschaulichen nicht einschränkende Beispiele für die Herstellung von Durchflusszellenvorrichtungen: 9A zeigt die Herstellung einer einteiligen Glasdurchflusszelle; 9B zeigt die Herstellung einer zweiteiligen Glasdurchflusszelle; und 9C zeigt die Herstellung einer dreiteiligen Glasdurchflusszelle.
    • 10A-10C veranschaulichen nicht einschränkende Beispiele für Glasdurchflusszellenkonstruktionen: 10A zeigt eine einteilige Glasdurchflusszellenkonstruktion; 10B zeigt eine zweiteilige Glasdurchflusszellenkonstruktion; und 10C zeigt eine dreiteilige Glasdurchflusszellenkonstruktion.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Hier werden Systeme und Vorrichtungen beschrieben, um eine große Anzahl verschiedener Nukleinsäuresequenzen aus z. B. amplifizierten Nukleinsäurearrays in Durchflusszellen oder aus einer Anordnung von immobilisierten Nukleinsäuren zu analysieren. Die hierin beschriebenen Systeme und Vorrichtungen können auch nützlich sein, z. B. bei der Sequenzierung für die vergleichende Genomik, der Verfolgung der Genexpression, der Analyse von Mikro-RNA-Sequenzen, der Epigenomik sowie der Charakterisierung der Aptamer- und Phagendisplay-Bibliothek und anderen Sequenzierungsanwendungen. Die Systeme und Vorrichtungen hierin umfassen verschiedene Kombinationen von optischen, mechanischen, fluidischen, thermischen, elektrischen und Computervorrichtungen/-aspekten. Die Vorteile, die durch die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen, -patronen und -systeme gewährt werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: (i) verringerte Komplexität und Kosten der Herstellung von Vorrichtungen und Systemen, (ii) signifikant niedrigere Verbrauchskosten (z. B. im Vergleich zu jenen für derzeit verfügbare Nukleinsäuresequenzierungssysteme), (iii) Kompatibilität mit typischen Oberflächenfunktionalisierungsverfahren für Durchflusszellen, (iv) flexible Flusskontrolle in Kombination mit mikrofluidischen Komponenten, z. B. Spritzenpumpen und Membranventilen usw., und (v) flexiblen Durchsatz des Systems.
  • Hierin werden Kapillarflusszellenvorrichtungen und Kapillarflusszellenpatronen beschrieben, die aus handelsüblichen Einwegkapillaren mit einem Lumen (z. B. einem einzelnen Fluidströmungskanal) hergestellt sind, die auch Fluidadapter, Patronengehäuse, eine oder mehrere integrierte Komponenten zur Fluidströmungssteuerung oder eine beliebige Kombination davon umfassen können. Hierin werden auch Systeme auf der Basis von Kapillarflusszellen offenbart, die eine oder mehrere Kapillarflusszellenvorrichtungen, eine oder mehrere Kapillarflusszellenpatronen, Fluidströmungssteuerungsmodule, Temperatursteuermodule, Bildgebungsmodule oder eine beliebige Kombination davon umfassen können.
  • Die Konstruktionsmerkmale einiger offenbarter Kapillarflusszellenvorrichtungen, - patronen und -systeme umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, (i) eine einheitliche Strömungskanalkonstruktion, (ii) versiegeltes, zuverlässiges und sich wiederholendes Wechseln zwischen Reagenzströmen, das mit einem einfachen Lade-/Entlademechanismus implementiert werden kann, sodass die Fluidschnittstellen zwischen dem System und den Kapillaren zuverlässig abgedichtet werden, was den Austausch der Kapillaren und die Wiederverwendung des Systems erleichtert und eine präzise Steuerung der Reaktionsbedingungen wie Temperatur und pH-Wert ermöglicht, (iii) austauschbare einzelne Fluidströmungskanalvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen mit mehreren Strömungskanälen, die austauschbar verwendet werden können, um einen flexiblen Systemdurchsatz bereitzustellen, und (iv) Kompatibilität mit einer Vielzahl von Nachweisverfahren wie der Fluoreszenzbildgebung.
  • Obwohl die offenbarten einzelnen Strömungszellenvorrichtungen und -systeme, Kapillarflusszellenpatronen, Kapillarflusszellen-basierten Systeme, Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellenvorrichtungen und Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellensysteme hauptsächlich im Zusammenhang mit ihrer Verwendung für Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen beschrieben werden, können verschiedene Aspekte der offenbarten Vorrichtungen und Systeme nicht nur auf die Nukleinsäuresequenzierung angewendet werden, sondern auch auf jede andere Art der chemischen Analyse, biochemischen Analyse, Nukleinsäureanalyse, Zellanalyse oder Gewebeanalyse. Es versteht sich, dass verschiedene Aspekte der offenbarten Vorrichtungen und Systeme einzeln, gemeinsam oder in Kombination miteinander bewertet werden können.
  • Definitionen: Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten Fachbegriffe dieselbe Bedeutung, wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Offenbarung gehört, allgemein verstanden wird.
  • Wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet, enthalten die Singularformen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ Pluralreferenten, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Jeder Verweis auf „oder“ soll hierin „und/oder“ umfassen, sofern nicht anders angegeben.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „etwa“ eine Zahl auf diese Zahl plus oder minus 10 % dieser Zahl. Der Begriff „etwa“ bezieht sich im Zusammenhang mit einem Bereich auf diesen Bereich minus 10 % seines niedrigsten Werts und plus 10 % seines größten Wertes.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck „mindestens eines von“ im Kontext einer Reihe Listen, die ein einzelnes Mitglied der Reihe, zwei Mitglieder der Reihe bis einschließlich aller Mitglieder der Reihe allein oder in einigen Fällen in Kombination mit nicht gelisteten Komponenten beinhalten.
  • Wie hierin verwendet, ist die Fluoreszenz „spezifisch“, wenn sie von Fluorophoren herrührt, die an die Oberfläche anelliert oder auf andere Weise an diese gebunden sind, beispielsweise durch eine Nukleinsäure mit einer Region der umgekehrten Komplementarität zu einem entsprechenden Segment eines Oligos auf der Oberfläche und an dieses entsprechende Segment anelliert sind. Diese Fluoreszenz steht im Gegensatz zur Fluoreszenz, die von Fluorophoren herrührt, die durch einen solchen Anellierungsprozess nicht an die Oberfläche oder in einigen Fällen an die Hintergrundfluoreszenz der Oberfläche gebunden sind.
  • Nukleinsäuren: Wie hierin verwendet, ist eine „Nukleinsäure“ (auch als „Polynukleotid“, „Oligonukleotid“, Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) bezeichnet) ein lineares Polymer aus zwei oder mehr Nukleotiden, die durch kovalente internukleosidische Bindungen oder Varianten oder funktionelle Fragmente davon verbunden sind. In natürlich vorkommenden Beispielen von Nukleinsäuren ist die Internukleosidbindung typischerweise eine Phosphodiesterbindung. Andere Beispiele umfassen jedoch gegebenenfalls andere Internukleosidbindungen, wie beispielsweise Phosphorthiolatbindungen, und können eine Phosphatgruppe umfassen oder nicht. Nukleinsäuren umfassen doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA, DNA/RNA-Hybride, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Hybride zwischen PNAs und DNA oder RNA und können auch andere Arten von Nukleinsäuremodifikationen enthalten.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Nukleotid“ auf ein Nukleotid, ein Nukleosid oder ein Analogon davon. In einigen Fällen ist das Nukleotid ein N- oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase (z. B. ein Desoxyribonukleosid, das 2-Desoxy-D-Ribose enthält, oder ein Ribonukleosid, das D-Ribose enthält). Beispiele für andere Nukleotidanaloga umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide und dergleichen.
  • Nukleinsäuren können gegebenenfalls an eine oder mehrere Nicht-Nukleotideinheiten wie Markierungen und andere kleine Moleküle, große Moleküle (wie Proteine, Lipide, Zucker usw.) und feste oder halbfeste Träger gebunden sein, beispielsweise durch kovalente oder nichtkovalente Bindungen entweder mit dem 5'- oder 3'-Ende der Nukleinsäure. Markierungen umfassen jede Einheit, die unter Verwendung einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren nachweisbar ist, und machen somit das gebundene Oligonukleotid oder die gebundene Nukleinsäure ähnlich nachweisbar. Einige Markierungen senden elektromagnetische Strahlung aus, die optisch erkennbar oder sichtbar ist. Alternativ oder in Kombination umfassen einige Markierungen eine Massenmarkierung, die das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure in Massenspektraldaten sichtbar macht, oder eine Redoxmarkierung, die das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure durch Amperometrie oder Voltametrie nachweisbar macht. Einige Markierungen umfassen eine magnetische Markierung, die die Trennung und/oder Reinigung des markierten Oligonukleotids oder der markierten Nukleinsäure erleichtert. Das Nukleotid oder Polynukleotid ist oft nicht an eine Markierung gebunden, und das Vorhandensein des Oligonukleotids oder der Nukleinsäure wird direkt nachgewiesen.
  • Durchflusszellenvorrichtungen: Hierin offenbart sind Durchflussvorrichtungen, umfassend einen ersten Behälter, der eine erste Lösung enthält und ein Einlassende und ein Auslassende aufweist, wobei das erste Mittel vom Einlassende zum Auslassende in dem ersten Behälter fließt; einen zweiten Behälter, der eine zweite Lösung enthält und ein Einlassende und ein Auslassende aufweist, wobei das zweite Mittel vom Einlassende zum Auslassende in dem zweiten Behälter fließt; einen zentralen Bereich mit einem Einlassende, das durch mindestens ein Ventil fluidisch mit dem Auslassende des ersten Behälters und dem Auslassende des zweiten Behälters gekoppelt ist. In der Durchflusszellenvorrichtung ist das Volumen der ersten Lösung, die vom Auslass des ersten Behälters zum Einlass des zentralen Bereichs fließt, geringer als das Volumen der zweiten Lösung, die vom Auslass des zweiten Behälters zum Einlass des zentralen Bereichs des Behälters fließt.
  • In den in der Vorrichtung beschriebenen Behältern können verschiedene Reagenzien untergebracht werden. In einigen Aspekten unterscheidet sich die erste Lösung, die im ersten Behälter untergebracht ist, von der zweiten Lösung, die im zweiten Behälter untergebracht ist. Die zweite Lösung umfasst mindestens ein Reagenz, das einer Vielzahl von Reaktionen im zentralen Bereich gemein ist. In einigen Aspekten umfasst die zweite Lösung mindestens ein Reagenz, das aus der Liste ausgewählt ist und aus einem Lösungsmittel, einer Polymerase und einem dNTP besteht. In einigen Aspekten umfasst die zweite Lösung kostengünstige Reagenzien. In einigen Aspekten ist der erste Behälter über ein erstes Ventil fluidisch mit dem zentralen Bereich gekoppelt, und ist der zweite Behälter über ein zweites Ventil fluidisch mit dem zentralen Bereich gekoppelt. Das Ventil kann ein Membranventil oder andere geeignete Ventile sein.
  • Die Konstruktion der Durchflusszellenvorrichtung kann eine effizientere Verwendung der Reaktionsreagenzien als bei anderen Sequenzierungsvorrichtungen erreichen, insbesondere bei kostspieligen Reagenzien, die in einer Vielzahl von Sequenzierungsschritten verwendet werden. In einigen Aspekten umfasst die erste Lösung ein Reagenz und die zweite Lösung umfasst ein Reagenz und das Reagenz in der ersten Lösung ist teurer als das Reagenz in der zweiten Lösung. In einigen Aspekten umfasst die erste Lösung ein reaktionsspezifisches Reagenz und die zweite Lösung umfasst ein unspezifisches Reagenz, das allen im zentralen Bereich ablaufenden Reaktionen gemein ist und bei dem das reaktionsspezifische Reagenz teurer ist als das unspezifische Reagenz. In einigen Aspekten ist der erste Behälter in unmittelbarer Nähe des Einlasses des zentralen Bereichs positioniert, um das Totvolumen für die Abgabe der ersten Lösungen zu verringern. In einigen Aspekten befindet sich der erste Behälter näher am Einlass des zentralen Bereichs als der zweite Behälter. In einigen Aspekten ist das reaktionsspezifische Reagenz in unmittelbarer Nähe des zweiten Membranventils konfiguriert, das Totvolumen im Verhältnis zur Abgabe der mehreren unspezifischen Reagenzien aus den mehreren Behältern zum ersten Membranventil zu verringern.
  • Zentraler Bereich: Der zentrale Bereich kann ein Kapillarröhrchen oder einen Mikrofluidik-Chip mit einem oder mehreren Mikrofluidik-Kanälen umfassen. In einigen Ausführungsformen ist das Kapillarröhrchen ein Standardprodukt. Das Kapillarröhrchen oder der Mikrofluidik-Chip können ebenfalls von der Vorrichtung entfernt werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kapillarröhrchen oder der Mikrofluidik-Kanal eine Oligonukleotidpopulation, die darauf gerichtet ist, ein eukaryotisches Genom zu sequenzieren. In einigen Ausführungsformen kann das Kapillarröhrchen oder der Mikrofluidik-Kanal im zentralen Bereich entfernbar sein.
  • Kapillarflusszellenvorrichtungen: Hierin offenbart sind Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen, die eine einzelne Kapillare und einen oder zwei Fluidadapter umfassen, die an einem oder beiden Enden der Kapillare angebracht sind, wobei die Kapillare einen Fluidströmungskanal mit spezifizierter Querschnittsfläche und Länge bereitstellt und wo die Fluidadapter so konfiguriert sind, dass sie mit Standardrohren zusammenpassen, um bequeme, austauschbare Fluidverbindungen mit einem externen Fluidströmungssteuerungssystem bereitzustellen.
  • 1 zeigt ein nicht einschränkendes Beispiel einer einzelnen Glaskapillar-Durchflusszellenvorrichtung, die zwei Fluidadapter umfasst - wobei jeweils einer an jedem Ende des Glaskapillarstücks angebracht ist - die zur Verbindung mit einem Standard-OD-Fluidrohr ausgelegt sind. Die Fluidadapter können an der Kapillare unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken angebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Presspassung, Klebeverbinden, Lösungsmittelbinden, Laserschweißen usw. oder eine beliebige Kombination davon.
  • Im Allgemeinen weist die in den offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen verwendete Kapillare (und die nachstehend zu beschreibenden Durchflusszellenpatronen) mindestens einen internen, axial ausgerichteten Fluidströmungskanal (oder „Lumen“) auf, der über die gesamte Länge der Kapillare verläuft. In einigen Aspekten kann die Kapillare zwei, drei, vier, fünf oder mehr als fünf interne, axial ausgerichtete Fluidströmungskanäle (oder „Lumen“) aufweisen.
  • Eine Anzahl spezifizierter Querschnittsgeometrien für eine einzelne Kapillare (oder ein Lumen davon) stimmt mit der Offenbarung hierin überein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf kreisförmige, elliptische, quadratische, rechteckige, dreieckige, abgerundete quadratische, abgerundete rechteckige oder abgerundete dreieckige Querschnittsgeometrien. In einigen Aspekten kann die einzelne Kapillare (oder ein Lumen davon) eine bestimmte Querschnittsabmessung oder einen Satz von Abmessungen aufweisen. Beispielsweise kann in einigen Aspekten die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens (z. B. der Durchmesser, wenn das Lumen kreisförmig ist, oder die Diagonale, wenn das Lumen quadratisch oder rechteckig ist) im Bereich von etwa 10 µm bis etwa 10 mm liegen. In einigen Aspekten kann die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens mindestens 10 µm, mindestens 25 µm, mindestens 50 µm, mindestens 75 µm, mindestens 100 µm, mindestens 200 um, mindestens 300 µm, mindestens 400 µm, mindestens 500 µm, mindestens 600 µm, mindestens 700 µm, mindestens 800 µm, mindestens 900 µm, mindestens 1 mm, mindestens 2 mm, mindestens 3 mm, mindestens 4 mm mindestens 5 mm, mindestens 6 mm, mindestens 7 mm, mindestens 8 mm, mindestens 9 mm oder mindestens 10 mm betragen. In einigen Aspekten kann die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens höchstens 10 mm, höchstens 9 mm, höchstens 8 mm, höchstens 7 mm, höchstens 6 mm, höchstens 5 mm, höchstens 4 mm, höchstens 3 mm, höchstens 2 mm, höchstens 1 mm, höchstens 900 µm, höchstens 800 µm, höchstens 700 µm, höchstens 600 µm, höchstens 500 µm, höchstens 400 µm, höchstens 300 µm, höchstens 200 µm, höchstens 100 µm, höchstens 75 µm, höchstens 50 µm, höchstens 25 µm oder höchstens 10 µm betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Aspekten die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens im Bereich von etwa 100 µm bis etwa 500 µm liegen. Fachleute werden erkennen, dass die größte Querschnittsabmessung des Kapillarlumens einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 124 µm.
  • Die Länge der einen oder mehreren Kapillaren, die zur Herstellung der offenbarten Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder -flusszellenpatronen verwendet werden, kann im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 5 cm oder mehr liegen. In einigen Fällen kann die Länge der einen oder mehreren Kapillaren weniger als 5 mm, mindestens 5 mm, mindestens 1 cm, mindestens 1,5 cm, mindestens 2 cm, mindestens 2,5 cm, mindestens 3 cm, mindestens 3,5 cm, mindestens 4 cm, mindestens 4,5 cm oder mindestens 5 cm betragen. In einigen Fällen kann die Länge der einen oder mehreren Kapillaren höchstens 5 cm, höchstens 4,5 cm, höchstens 4 cm, höchstens 3,5 cm, höchstens 3 cm, höchstens 2,5 cm, höchstens 2 cm, höchstens 1,5 cm, höchstens 1 cm oder höchstens 5 mm betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Länge der einen oder mehreren Kapillaren im Bereich von etwa 1,5 cm bis etwa 2,5 cm liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Länge der einen oder mehreren Kapillaren einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 1,85 cm. In einigen Fällen können Vorrichtungen oder Patronen mehrere von zwei oder mehr Kapillaren umfassen, die die gleiche Länge haben. In einigen Fällen können Vorrichtungen oder Patronen mehrere von zwei oder mehr Kapillaren unterschiedlicher Länge umfassen.
  • Kapillaren haben in einigen Fällen eine Spalthöhe von etwa oder genau 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 350, 400 oder 500 µm oder einen beliebigen Wert, der in den dadurch definierten Bereich fällt. Einige bevorzugte Ausführungsformen haben Spalthöhen von etwa 50-200 µm, 50-150 µm oder vergleichbare Spalthöhen. Die Kapillaren, die zum Aufbau der offenbarten Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen verwendet werden, können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glas (z. B. Borosilikatglas, Kalknatronglas usw.), Quarzglas (Quarz), Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET), Polydimethylsiloxan (PDMS) usw.), Polyetherimid (PEI) und Perfluorelastomer (FFKM) als eher chemisch inerte Alternativen. PEI liegt in Bezug auf Kosten und Kompatibilität zwischen Polycarbonat und PEEK. FFKM ist auch als Kalrez oder eine beliebige Kombination davon bekannt.
  • Die Kapillaren, die zum Aufbau der offenbarten Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen verwendet werden, können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die Wahl der Herstellungstechnik häufig von der Wahl des verwendeten Materials abhängt und umgekehrt. Beispiele für geeignete Kapillarherstellungstechniken umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Extrusion, Ziehen, CNC-Bearbeitung und -Bohren, Laser-Photoablation und dergleichen. Vorrichtungen können gegossen oder spritzgegossen werden, um eine beliebige dreidimensionale Struktur zur Anpassung an eine einteilige Durchflusszelle herzustellen.
  • Beispiele für kommerzielle Anbieter, die Präzisionskapillarrohre anbieten, umfassen Accu-Glass (St. Louis, MO; Präzisionsglaskapillarrohre), Polymicro Technologies (Phoenix, AZ; Präzisionsglas- und Quarzglas-Kapillarrohre), Friedrich & Dimmock, Inc. (Millville, NJ; kundenspezifisches Präzisionsglaskapillarrohr) und Drummond Scientific (Broomall, PA; OEM-Kapillarrohr aus Glas und Kunststoff).
  • Durchflusszellenvorrichtungen für Mikrofluidik-Chips: Zu den hierin offenbarten gehören auch Durchflusszellenvorrichtungen, die einen oder mehrere Mikrofluidik-Chips und einen oder zwei Fluidadapter umfassen, die an einem oder beiden Enden der Mikrofluidik-Chips angebracht sind, wobei der Mikrofluidik-Chip einen oder mehrere Fluidströmungskanäle mit bestimmter Querschnittsfläche und Länge bereitstellen, und wobei die Fluidadapter so konfiguriert sind, dass sie mit dem Mikrofluidik-Chip zusammenpassen, um bequeme, austauschbare Fluidverbindungen mit einem externen Fluidströmungsteuerungssystem bereitzustellen.
  • Ein nicht einschränkendes Beispiel einer Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellenvorrichtung, die zwei Fluidadapter umfasst - wobei jeweils einer an jedem Ende des Mikrofluidik-Chips angebracht ist (z. B. den Einlass der Mikrofluidik-Kanäle). Die Fluidadapter können an dem Chip oder Kanal unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken angebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Presspassung, Klebebinden, Lösungsmittelbinden, Laserschweißen usw. oder eine Kombination davon. In einigen Fällen sind der Einlass und/oder der Auslass der Mikrofluidik-Kanäle auf dem Chip Öffnungen auf der Oberseite des Chips, und die Fluidadapter können am Einlass und Auslass der Mikrofluidik-Chips angebracht oder gekoppelt sein.
  • Wenn der zentrale Bereich einen Mikrofluidik-Chip umfasst, weist der in den offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen verwendete Chip-Mikrofluidik-Chip mindestens eine einzelne Schicht mit einem oder mehreren Kanälen auf. In einigen Aspekten weist der Mikrofluidik-Chip zwei Schichten auf, die miteinander verbunden sind, um einen oder mehrere Kanäle zu bilden. In einigen Aspekten kann der Mikrofluidik-Chip drei Schichten enthalten, die miteinander verbunden sind, um einen oder mehrere Kanäle zu bilden. In einigen Ausführungsformen hat der Mikrofluidik-Kanal eine offene Oberseite. In einigen Ausführungsformen ist der Mikrofluidik-Kanal zwischen einer oberen Schicht und einer unteren Schicht positioniert.
  • Im Allgemeinen weist der Mikrofluidik-Chip, der in den offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen (und den nachstehend zu beschreibenden Durchflusszellenpatronen) verwendet wird, mindestens einen internen, axial ausgerichteten Fluidströmungskanal (oder „Lumen“) auf, der über die gesamte Länge oder eine Teillänge des Chips verläuft. In einigen Aspekten kann die Kapillare zwei, drei, vier, fünf oder mehr als fünf interne, axial ausgerichtete Mikrofluidik-Kanäle (oder „Lumen“) aufweisen. Der Mikrofluidik-Kanal kann in mehrere Rahmen unterteilt werden.
  • Eine Anzahl spezifizierter Querschnittsgeometrien für einen einzelnen Kanal stimmt mit der hierin enthaltenen Offenbarung überein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf kreisförmige, elliptische, quadratische, rechteckige, dreieckige, abgerundete quadratische, abgerundete rechteckige oder abgerundete dreieckige Querschnittsgeometrien. In einigen Aspekten kann der Kanal eine bestimmte Querschnittsabmessung oder einen Satz von Abmessungen haben.
  • Der Mikrofluidik-Chip, der zum Aufbau der offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen verwendet werden, können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glas (z. B. Borosilikatglas, Kalknatronglas usw.), Quarz, Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET), Polydimethylsiloxan (PDMS) usw.), Polyetherimid (PEI) und Perfluorelastomer (FFKM) als eher chemisch inerte Alternativen. In einigen Ausführungsformen umfasst der Mikrofluidik-Chip Quarz. In einigen Ausführungsformen umfasst der Mikrofluidik-Chip Borosilikatglas.
  • Die Mikrofluidik-Chips, die zum Aufbau der beschriebenen Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen verwendet werden, können unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei die Wahl der Herstellungstechnik häufig von der Wahl des verwendeten Materials abhängt und umgekehrt. Die Mikrofluidik-Kanäle auf dem Chip können unter Verwendung von Techniken konstruiert werden, die zur Bildung einer Mikrostruktur oder eines Mikromusters auf der Oberfläche geeignet sind. In einigen Aspekten wird der Kanal durch Laserbestrahlung gebildet. In einigen Aspekten wird der Mikrofluidik-Kanal durch fokussierte Femtosekundenlaserstrahlung gebildet. In einigen Aspekten wird der Mikrofluidik-Kanal durch Ätzen gebildet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf chemisches oder Laserätzen.
  • Wenn die Mikrofluidik-Kanäle durch Ätzen auf dem Mikrofluidik-Chip gebildet werden, umfasst der Mikrofluidik-Chip mindestens eine geätzte Schicht. In einigen Aspekten kann der Mikrofluidik-Chip eine nicht geätzte Schicht und eine nicht geätzte Schicht umfassen, wobei die geätzte Schicht mit der nicht geätzten Schicht verbunden ist, sodass die nicht geätzte Schicht eine Bodenschicht oder eine Deckschicht für die Kanäle bildet. In einigen Aspekten kann der Mikrofluidik-Chip eine nicht geätzte Schicht und zwei nicht geätzte Schichten umfassen, wobei die geätzte Schicht zwischen den beiden nicht geätzten Schichten positioniert ist.
  • Der hierin beschriebene Chip enthält einen oder mehrere Mikrofluidik-Kanäle, die auf die Oberfläche des Chips geätzt sind. Die Mikrofluidik-Kanäle sind als Fluidleitungen mit mindestens einer Mindestabmessung von <1 nm bis 1000 µm definiert. Die Mikrofluidik-Kanäle können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, wie Laserstrahlung (z. B. Femtosekundenlaserstrahlung), Lithographie, chemisches Ätzen und andere geeignete Verfahren. Kanäle auf der Chipoberfläche können durch selektive Strukturierung und Plasma- oder chemisches Ätzen erzeugt werden. Die Kanäle können offen sein oder sie können durch einen konform abgeschiedenen Film oder eine Schicht auf der Oberseite versiegelt werden, um unterirdische oder vergrabene Kanäle im Chip zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen werden die Kanäle aus dem Entfernen einer Opferschicht auf dem Chip erzeugt. Bei diesem Verfahren muss der Bulk-Wafer nicht weggeätzt werden. Stattdessen befindet sich der Kanal auf der Oberfläche des Wafers. Beispiele für die direkte Lithographie umfassen Elektronenstrahl-Direktschreib- und fokussiertes Ionenstrahlfräsen.
  • Das Mikrofluidik-Kanalsystem ist mit einem Bildgebungssystem gekoppelt, um Signale von DNA-Basen einzufangen oder zu erfassen. Das Mikrofluidik-Kanalsystem, das entweder auf einem Glas- oder Siliziumsubstrat hergestellt ist, weist Kanalhöhen und -breiten in der Größenordnung von <1 nm bis 1000 µm auf. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen ein Kanal eine Tiefe von 1-50 µm, 1-100 µm, 1-150 µm, 1-200 µm, 1-250 µm, 1-300 µm, 50-100 µm, 50-200 µm oder 50-300 µm oder mehr als 300 µm oder einen Bereich, der durch zwei beliebige dieser Werte definiert ist, aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Tiefe von 3 mm oder mehr aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Tiefe von 30 mm oder mehr aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Länge von weniger als 0,1 mm, zwischen 0,1 mm und 0,5 mm, zwischen 0,1 mm und 1 mm, zwischen 0,1 mm und 5 mm, zwischen 0,1 mm und 10 mm, zwischen 0,1 mm und 25 mm, zwischen 0,1 mm und 50 mm, zwischen 0,1 mm und 100 mm, zwischen 0,1 mm und 150 mm, zwischen 0,1 mm und 200 mm, zwischen 0,1 mm und 250 mm, zwischen 1 mm und 5 mm, zwischen 1 mm und 10 mm, zwischen 1 mm und 25 mm, zwischen 1 mm und 50 mm, zwischen 1 mm und 100 mm, zwischen 1 mm und 150 mm, zwischen 1 mm und 200 mm, zwischen 1 mm und 250 mm, zwischen 5 mm und 10 mm, zwischen 5 mm und 25 mm, zwischen 5 mm und 50 mm, zwischen 5 mm und 100 mm, zwischen 5 mm und 150 mm, zwischen 5 mm und 200 mm, zwischen 1 mm und 250 mm oder mehr als 250 mm oder einen durch zwei dieser Werte definierten Bereich aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Länge von 2 m oder mehr aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Länge von 20 m oder mehr aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Breite von weniger als 0,1 mm, zwischen 0,1 mm und 0,5 mm, zwischen 0,1 mm und 1 mm, zwischen 0,1 mm und 5 mm, zwischen 0,1 mm und 10 mm, zwischen 0,1 mm und 15 mm, zwischen 0,1 mm und 20 mm, zwischen 0,1 mm und 25 mm, zwischen 0,1 mm und 30 mm, zwischen 0,1 mm und 50 mm oder mehr als 50 mm oder einen durch zwei dieser Werte definierten Bereich aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Breite von 500 mm oder mehr aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann ein Kanal eine Breite von 5 m oder mehr aufweisen. Die Kanallänge kann im Mikrometerbereich liegen.
  • Das eine oder die mehreren Materialien, die zur Herstellung der Kapillaren oder Mikrofluidik-Chips für die offenbarten Vorrichtungen verwendet werden, sind häufig optisch transparent, um die Verwendung mit spektroskopischen oder bildgebenden Detektionstechniken zu erleichtern. Die gesamte Kapillare ist optisch transparent. Alternativ ist nur ein Teil der Kapillare (z. B. ein optisch transparentes „Fenster“) optisch transparent. In einigen Fällen ist der gesamte Mikrofluidik-Chip optisch transparent. In einigen Fällen ist nur ein Teil des Mikrofluidik-Chips (z. B. ein optisch transparentes „Fenster“) optisch transparent.
  • Wie oben erwähnt, sind die Fluidadapter, die an den Kapillaren oder Mikrofluidik-Kanälen der hierin offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und -patronen angebracht sind, so ausgelegt, dass sie mit Standard-OD-Polymer- oder Fluidrohren aus Glas oder Mikrofluidik-Kanälen zusammenpassen. Wie in 1 dargestellt, kann ein Ende des Fluidadapters so konstruiert sein, dass es mit einer Kapillare mit spezifischen Abmessungen und Querschnittsgeometrie zusammenpasst, während das andere Ende so konstruiert sein kann, dass es mit einem Fluidrohr mit gleichen oder unterschiedlichen Abmessungen und Querschnittsgeometrie zusammenpasst. Die Adapter können unter Verwendung einer Vielzahl geeigneter Techniken (z. B. Extrusionsformen, Spritzgießen, Formpressen, Präzisions-CNC-Bearbeitung usw.) und Materialien (z. B. Glas, Quarzglas, Keramik, Metall, Polydimethylsiloxan, Polystyrol (PS), makroporösem Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclischen Olefinpolymeren (COP), cyclischen Olefincopolymeren (COC), Polyethylenterephthalat (PET) usw.) hergestellt werden, wobei die Wahl der Herstellungstechnik häufig von der Wahl des verwendeten Materials abhängt und umgekehrt.
  • Oberflächenbeschichtungen: Eine Innenfläche (oder Oberfläche eines Kapillarlumens) einer oder mehrerer Kapillaren oder des Kanals auf dem Mikrofluidik-Chip wird häufig unter Verwendung einer Vielzahl von Oberflächenmodifikationstechniken oder Polymerbeschichtungen beschichtet, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Beispiele für geeignete Oberflächenmodifizierungs- oder Beschichtungstechniken umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung von Silanchemien (z. B. Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS), Aminopropyltriethoxysilan (APTES), Triethoxysilan, Diethoxydimethylsilan und anderen linearen, verzweigten oder cyclischen Silanen) zur kovalenten Anlagerung von funktionellen Gruppen oder Molekülen an Kapillarlumenoberflächen, kovalent oder nicht kovalent gebundene Polymerschichten (z. B. Schichten aus Streptavidin, Polyacrilamid, Polyester, Dextran, Polylysin, Polyacrylamid/Polylysin-Copolymeren, Polyethylenglycol (PEG), Poly(n-Isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat (POEGMA), Polyacrylsäure (PAA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylimidazol) und Polylysincopolymere) oder eine beliebige Kombination davon.
  • Beispiele für Konjugationschemien, die verwendet werden können, um eine oder mehrere Materialschichten (z. B. Polymerschichten) auf die Trägeroberfläche zu pfropfen und/oder die Schichten miteinander zu vernetzen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen (oder Variationen davon), his-Tag-Ni/NTA-Konjugationschemie, Methoxyether-Konjugationschemie, Carboxylatkonjugationschemie, Aminkonjugationschemie, NHS-Ester, Maleimide, Thiol, Epoxy, Azid, Hydrazid, Alkin, Isocyanat und Silanchemie.
  • Die Anzahl der Schichten aus Polymer oder anderen chemischen Schichten auf der Innen- oder Lumenoberfläche kann im Bereich von 1 bis etwa 10 oder mehr als 10 liegen. In einigen Fällen beträgt die Anzahl der Schichten mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder mindestens 10. In einigen Fällen kann die Anzahl der Schichten höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Schichten im Bereich von etwa 2 bis etwa 4 liegen. In einigen Fällen können alle Schichten das gleiche Material umfassen. In einigen Fällen kann jede Schicht ein anderes Material umfassen. In einigen Fällen können die mehreren Schichten mehrere Materialien umfassen.
  • In einem bevorzugten Aspekt können eine oder mehrere Schichten eines Beschichtungsmaterials auf die Kapillarlumenoberfläche oder die Innenfläche des Kanals auf dem Mikrofluidik-Chip aufgebracht werden, wobei die Anzahl der Schichten und/oder die Materialzusammensetzung jeder Schicht ausgewählt wird, um eine oder mehrere Oberflächeneigenschaften des Kapillar- oder Kanallumens, wie in der US-Patentanmeldung Nr. 16/363.842 angegeben, einzustellen.
  • Beispiele für Oberflächeneigenschaften, die eingestellt werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Oberflächenhydrophilie/-hydrophobie, Gesamtbeschichtungsdicke, Oberflächendichte chemisch reaktiver funktioneller Gruppen, Oberflächendichte gepfropfter Linkermoleküle oder Oligonukleotidprimer usw. In einigen bevorzugten Anwendungen werden eine oder mehrere Oberflächeneigenschaften des Kapillar- oder Kanallumens eingestellt, um beispielsweise (i) eine sehr geringe unspezifische Bindung von Proteinen, Oligonukleotiden, Fluorophoren und anderen molekularen Komponenten chemischer oder biologischer Analyseanwendungen bereitzustellen; einschließlich Festphasennukleinsäureamplifikations- und/oder Sequenzierungsanwendungen, (ii) für eine verbesserte Festphasennukleinsäurehybridisierungsspezifität und -effizienz zu sorgen und (iii) für eine verbesserte Festphasennukleinsäureamplifikationsrate, -spezifität und -effizienz zu sorgen.
  • Eine oder mehrere Oberflächenmodifizierungs- und/oder Polymerschichten können aufgebracht werden, indem ein oder mehrere geeignete chemische Kopplungs- oder Beschichtungsreagenzien durch die Kapillaren oder den Kanal geleitet werden, bevor sie für ihre beabsichtigte Anwendung verwendet werden. Ein oder mehrere Beschichtungsreagenzien können zu einem verwendeten Puffer gegeben werden, z. B. eine Nukleinsäurehybridisierung, Amplifikationsreaktion und/oder Sequenzierungsreaktion, um eine dynamische Beschichtung der Kapillarlumenoberfläche bereitzustellen.
  • Unspezifische Oberfläche mit geringer Bindung: Die hierin beschriebene Innenfläche des Kanals und des Kapillarröhrchens kann mit einer Zusammensetzung gepfropft oder beschichtet werden, die unspezifische Oberflächenzusammensetzungen mit geringer Bindung umfasst, die eine verbesserte Nukleinsäurehybridisierungs- und Amplifikationsleistung ermöglichen.
  • In einigen Fällen zeigen Fluoreszenzbilder der offenbarten unspezifischen Oberflächen mit geringer Bindung, wenn sie in Nukleinsäurehybridisierungs- oder Amplifikationsanwendungen verwendet werden, um Cluster von hybridisierten oder klonal amplifizierten Nukleinsäuremolekülen zu erzeugen (z. B. die direkt oder indirekt mit einem Fluorophor markiert wurden), Kontrast-Rausch-Verhältnisse (CNRs) von mindestens 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 210, 220, 230, 240, 250 oder mehr als 250.
  • Um die Dichte der Primeroberfläche zu skalieren und hydrophilen oder amphoteren Oberflächen zusätzliche Dimensionalität zu verleihen, wurden Substrate entwickelt, die mehrschichtige Beschichtungen aus PEG und anderen hydrophilen Polymeren umfassen. Durch Verwendung von hydrophilen und amphoteren Oberflächenschichtungsansätzen, die die nachstehend beschriebenen Polymer/Copolymer-Materialien umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, ist es möglich, die Primerbeladungsdichte auf der Oberfläche signifikant zu erhöhen. Traditionelle PEG-Beschichtungsansätze verwenden die Monoschicht-Primer-Abscheidung, über die allgemein für Einzelmolekülanwendungen berichtet wurde, die jedoch für Nukleinsäureamplifikationsanwendungen keine hohen Kopienzahlen ergibt. Wie hierin beschrieben, kann „Schichtung“ unter Verwendung herkömmlicher Vernetzungsansätze mit beliebigen kompatiblen Polymer- oder Monomeruntereinheiten erreicht werden, sodass eine Oberfläche, die zwei oder mehr stark vernetzte Schichten umfasst, nacheinander aufgebaut werden kann. Beispiele für geeignete Polymere umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Streptavidin, Polyacrylamid, Polyester, Dextran, Polylysin und Copolymere von Polylysin und PEG. In einigen Fällen können die verschiedenen Schichten durch eine Vielzahl von Konjugationsreaktionen aneinander gebunden sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Biotin-Streptavidin-Bindung, Azid-Alkin-Klick-Reaktion, Amin-NHS-Ester-Reaktion, Thiol-Maleimid-Reaktion, und ionische Wechselwirkungen zwischen positiv geladenem Polymer und negativ geladenem Polymer. In einigen Fällen können Materialien mit hoher Primerdichte in Lösung konstruiert und anschließend in mehreren Schritten auf die Oberfläche geschichtet werden.
  • Fachleute werden erkennen, dass eine gegebene hydrophile, Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung einen Wasserkontaktwinkel mit einem beliebigen Wert unter 50 Grad aufweisen kann.
  • Die offenbarte Innenfläche des Kanals und der Kapillare kann ein Substrat (oder eine Trägerstruktur), eine oder mehrere Schichten einer kovalent oder nicht kovalent gebundenen niedrigbindenden chemischen Modifikationsschicht, z. B. Silanschichten, Polymerfilme, und eine oder mehrere kovalent oder nicht kovalent gebundene Primersequenzen umfassen, die zum Binden von einzelsträngigen Matrizenoligonukleotiden an die Trägeroberfläche verwendet werden können. In einigen Fällen kann die Formulierung der Oberfläche, z. B. die chemische Zusammensetzung einer oder mehrerer Schichten, die Kopplungschemie, die zum Vernetzen der einen oder mehreren Schichten mit der Trägeroberfläche und/oder untereinander verwendet wird, und die Gesamtzahl von Schichten können so variiert werden, dass die unspezifische Bindung von Proteinen, Nukleinsäuremolekülen und anderen Hybridisierungs- und Amplifikationsreaktionskomponenten an die Trägeroberfläche im Vergleich zu einer vergleichbaren Monoschicht minimiert oder reduziert wird. Oft kann die Formulierung der Oberfläche so variiert werden, dass eine unspezifische Hybridisierung auf der Trägeroberfläche minimiert wird oder relativ zu einer vergleichbaren Monoschicht reduziert wird. Die Formulierung der Oberfläche kann so variiert werden, dass eine unspezifische Verstärkung auf der Trägeroberfläche minimiert oder relativ zu einer vergleichbaren Monoschicht reduziert wird. Die Formulierung der Oberfläche kann so variiert werden, dass spezifische Amplifikationsraten und/oder Ausbeuten auf der Trägeroberfläche maximiert werden. Zum Nachweis geeignete Amplifikationsniveaus werden in einigen hierin offenbarten Fällen in nicht mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 oder mehr als 30 Amplifikationszyklen erreicht.
  • Beispiele für Materialien, aus denen das Substrat oder die Trägerstruktur hergestellt werden kann, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Glas, Quarzglas, Silizium, ein Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET)) oder eine beliebige Kombination davon. Es werden verschiedene Zusammensetzungen sowohl von Glas- als auch von Kunststoffsubstraten in Betracht gezogen.
  • Das Substrat oder die Trägerstruktur kann in einer Vielzahl von Geometrien und Abmessungen ausgeführt sein, die dem Fachmann bekannt sind, und kann eine Vielzahl von Materialien umfassen, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise kann in einigen Fällen das Substrat oder die Trägerstruktur lokal planar sein (z. B. einen Objektträger oder die Oberfläche eines Objektträgers umfassen). Global kann das Substrat oder die Trägerstruktur zylindrisch (z. B. eine Kapillare oder die Innenfläche einer Kapillare umfassend), kugelförmig (z. B. die Außenfläche einer nicht porösen Perle umfassend) oder unregelmäßig (z. B. die Außenfläche einer unregelmäßig geformten, nicht porösen Perle oder eines Partikels umfassend) sein. In einigen Fällen kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur, die für die Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation verwendet wird, eine feste, nicht poröse Oberfläche sein. In einigen Fällen kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur, die für die Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation verwendet wird, porös sein, sodass die hierin beschriebenen Beschichtungen die poröse Oberfläche durchdringen, und darauf durchgeführte Nukleinsäurehybridisierungs- und Amplifikationsreaktionen können innerhalb der Poren auftreten.
  • Das Substrat oder die Trägerstruktur, die die eine oder mehreren chemisch modifizierten Schichten umfasst, z. B. Schichten eines niedrigspezifischen Bindungspolymers, kann unabhängig sein oder in eine andere Struktur oder Anordnung integriert sein. Beispielsweise kann in einigen Fällen das Substrat oder die Trägerstruktur eine oder mehrere Oberflächen innerhalb einer integrierten oder zusammengesetzten Mikrofluidik-Durchflusszelle umfassen. Das Substrat oder die Trägerstruktur kann eine oder mehrere Oberflächen innerhalb eines Mikroplattenformats umfassen, z. B. die Bodenfläche der Vertiefungen in einer Mikroplatte. Wie oben erwähnt, umfasst in einigen bevorzugten Ausführungsformen das Substrat oder die Trägerstruktur die Innenfläche (wie die Lumenoberfläche) einer Kapillare. In alternativen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Substrat oder die Trägerstruktur die Innenfläche (wie die Lumenoberfläche) einer Kapillare, die in einen planaren Chip geätzt ist.
  • Die chemischen Modifizierungsschichten können gleichmäßig über die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur aufgebracht werden. Alternativ kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur ungleichmäßig verteilt oder strukturiert sein, sodass die chemischen Modifikationsschichten auf einen oder mehrere diskrete Bereiche des Substrats beschränkt sind. Beispielsweise kann die Substratoberfläche unter Verwendung photolithographischer Techniken strukturiert werden, um eine geordnete Anordnung oder ein zufälliges Muster chemisch modifizierter Bereiche auf der Oberfläche zu erzeugen. Alternativ oder in Kombination kann die Substratoberfläche unter Verwendung von beispielsweise Kontaktdruck- und/oder Tintenstrahldrucktechniken strukturiert werden. In einigen Fällen kann ein geordnetes Array oder zufälliges Muster chemisch modifizierter diskreter Regionen mindestens 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10.000 oder mehr diskrete Regionen oder jede Zwischenzahl, die durch den hierin angegebenen Bereich umfasst wird, umfassen.
  • Um niedrige unspezifische Bindungsoberflächen (hierin auch als „niedrige Bindung“ oder „passivierte“ Oberflächen bezeichnet) zu erzielen, können hydrophile Polymere unspezifisch adsorbiert oder kovalent auf das Substrat oder die Trägeroberfläche gepfropft werden. Typischerweise wird die Passivierung unter Verwendung von Poly(ethylenglykol) (PEG, auch bekannt als Polyethylenoxid (PEO) oder Polyoxyethylen), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin, Dextran oder andere hydrophile Polymere mit unterschiedlichen Molekulargewichten und Endgruppen, die beispielsweise unter Verwendung von Silanchemie an eine Oberfläche gebunden sind, durchgeführt. Die von der Oberfläche distalen Endgruppen können Biotin, Methoxyether, Carboxylat, Amin, NHS-Ester, Maleimid und Bis-Silan umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. In einigen Fällen können zwei oder mehr Schichten eines hydrophilen Polymers, z. B. eines linearen Polymers, eines verzweigten Polymers oder eines mehrfach verzweigten Polymers, auf der Oberfläche abgeschieden werden. In einigen Fällen können zwei oder mehr Schichten kovalent miteinander gekoppelt oder intern vernetzt sein, um die Stabilität der resultierenden Oberfläche zu verbessern. In einigen Fällen können Oligonukleotidprimer mit unterschiedlichen Basensequenzen und Basenmodifikationen (oder anderen Biomolekülen, z. B. Enzymen oder Antikörpern) bei verschiedenen Oberflächendichten an die resultierende Oberflächenschicht gebunden sein. In einigen Fällen können beispielsweise sowohl die Dichte der funktionellen Oberflächengruppe als auch die Oligonukleotidkonzentration variiert werden, um auf einen bestimmten Primerdichtebereich abzuzielen. Zusätzlich kann die Primerdichte durch Verdünnen des Oligonukleotids mit anderen Molekülen gesteuert werden, die dieselbe funktionelle Gruppe tragen. Beispielsweise kann aminmarkiertes Oligonukleotid mit aminmarkiertem Polyethylenglykol in einer Reaktion mit einer mit NHS-Ester beschichteten Oberfläche verdünnt werden, um die endgültige Primerdichte zu verringern. Primer mit unterschiedlichen Linkerlängen zwischen dem Hybridisierungsbereich und der funktionellen Gruppe der Oberflächenanhaftung können ebenfalls angewendet werden, um die Oberflächendichte zu steuern. Beispiele für geeignete Linker umfassen Poly-T- und Poly-A-Stränge am 5'-Ende des Primers (z. B. 0 bis 20 Basen), PEG-Linker (z. B. 3 bis 20 Monomereinheiten) und Kohlenstoffketten (z. B. C6), C12, C18 usw.). Um die Primerdichte zu messen, können fluoreszenzmarkierte Primer an die Oberfläche gebunden und ein Fluoreszenzwert mit dem für eine Farbstofflösung bekannter Konzentration verglichen werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann das hydrophile Polymer ein vernetztes Polymer sein. In einigen Ausführungsformen kann das vernetzte Polymer einen Polymertyp umfassen, der mit einem anderen Polymertyp vernetzt ist. Beispiele für das vernetzte Polymer können Poly(ethylenglykol) sein, das mit einem anderen Polymer vernetzt ist, ausgewählt aus Polyethylenoxid (PEO) oder Polyoxyethylen), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin, Dextran oder anderen hydrophilen Polymeren. In einigen Ausführungsformen kann das vernetzte Polymer ein mit Polyacrylamid vernetztes Poly(ethylenglykol) sein.
  • Die Innenfläche einer oder mehrerer Kapillaren oder der Kanäle auf dem Mikrofluidik-Chip oder der Wand der Kapillare kann eine geringe unspezifische Bindung von Proteinen und anderen Amplifikationsreaktionsreagenzien oder -komponenten sowie eine verbesserte Stabilität gegenüber wiederholter Exposition gegenüber verschiedenen Lösungsmitteln und Temperaturänderungen, chemischen Angriffen wie niedriger pH-Wert oder Langzeitlagerung aufweisen.
  • Die offenbarten niedrigen unspezifischen Bindungsträger umfassen eine oder mehrere Polymerbeschichtungen, z. B. PEG-Polymerfilme, die die unspezifische Bindung von Protein und markierten Nukleotiden an den festen Träger minimieren. Der anschließende Nachweis einer verbesserten Nukleinsäurehybridisierungs- und Amplifikationsrate und -spezifität kann durch einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Aspekte der vorliegenden Offenbarung erreicht werden: (i) Primerdesign (Sequenz und/oder Modifikationen), (ii) Kontrolle der Dichte des gebundenen Primers auf dem festen Träger, (iii) die Oberflächenzusammensetzung des festen Trägers, (iv) die Oberflächenpolymerdichte des festen Trägers, (v) die Verwendung verbesserter Hybridisierungsbedingungen vor und während der Amplifikation und/oder (vi) die Verwendung verbesserter Amplifikationsformulierungen, die die unspezifische Primeramplifikation verringern oder die Effizienz der Matrizenamplifikation erhöhen.
  • Die Vorteile der offenbarten niedrigen unspezifischen Bindungsträger und der damit verbundenen Hybridisierungs- und Amplifikationsverfahren verleihen jedem Sequenzierungssystem einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Vorteile: (i) verringerte Waschzeiten für Fluid (aufgrund einer verringerten unspezifischen Bindung und damit schnellere Sequenzierungszykluszeiten), (ii) verringerte Bildgebungszeiten (und damit schnellere Durchlaufzeiten für Assay-Auslese- und Sequenzierungszyklen), (iii) verringerte Anforderungen an die Gesamtarbeitsablaufzeit (aufgrund verringerter Zykluszeiten), (iv) verringerte Detektionsinstrumentierungskosten (aufgrund der Verbesserungen des CNR), (v) verbesserte Auslesegenauigkeit (Base-Calling) (aufgrund von Verbesserungen des CNR), (vi) verbesserte Reagenzstabilität und verringerte Anforderungen an den Reagenzienverbrauch (und damit reduzierte Reagenzienkosten) und (vii) weniger Laufzeitfehler aufgrund von Fehlern bei der Nukleinsäureamplifikation.
  • Die niedrig bindenden hydrophilen Oberflächen (Mehrschicht und/oder Monoschicht) für Oberflächen-Bioassays, z. B. Genotypisierungs- und Sequenzierungsassays, werden unter Verwendung einer beliebigen Kombination der folgenden erzeugt.
  • Polare protische, polare aprotische und/oder unpolare Lösungsmittel zum Abscheiden und/oder Koppeln linearer oder mehrfach verzweigter hydrophiler Polymeruntereinheiten auf einer Substratoberfläche. Einige mehrfach verzweigte hydriphile Polymeruntereinheiten können funktionelle Endgruppen enthalten, um die kovalente Kopplung oder nichtkovalente Bindungswechselwirkungen mit anderen Polymeruntereinheiten zu fördern. Beispiele für geeignete funktionelle Endgruppen umfassen Biotin, Methoxyether, Carboxylat, Amin, Esterverbindungen, Azid, Alkin, Maleimid, Thiol und Silangruppen.
  • Jede Kombination von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeruntereinheiten, die durch anschließende Schichtaddition über modifizierte Kopplungschemie/Lösungsmittel/Puffersysteme gekoppelt sind und einzelne Untereinheiten mit orthogonalen Endkopplungschemien oder eine der jeweiligen Kombinationen enthalten können, sodass die resultierende Oberfläche hydrophil ist und eine geringe unspezifische Bindung von Proteinen und anderen molekularen Testkomponenten zeigt. In einigen Fällen weisen die hydrophilen, funktionalisierten Substratoberflächen der vorliegenden Offenbarung Kontaktwinkelmessungen auf, die 35 Grad nicht überschreiten.
  • Anschließende Anlagerung von Biomolekülen (z. B. von Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden oder Zellen) an die niedrig bindenden/hydrophilen Substrate über eine Vielzahl von nachstehend beschriebenen einzelnen Konjugationschemien oder eine beliebige Kombination davon.Schichtabscheidungs- und/oder Konjugationsreaktionen können unter Verwendung von Lösungsmittelgemischen durchgeführt werden, die ein beliebiges Verhältnis der folgenden Komponenten enthalten können: Ethanol, Methanol, Acetonitril, Aceton, DMSO, DMF, H2O und dergleichen.Darüber hinaus können kompatible Puffersysteme im gewünschten pH-Bereich von 5 bis 10 zur Steuerung der Geschwindigkeit und Effizienz der Abscheidung und Kopplung verwendet werden, wobei Kopplungsraten erzielt werden können, die > 5x über denen für herkömmliche wässrige pufferbasierte Verfahren liegen.
  • Die offenbarten niedrigen unspezifischen Bindungsträger und die damit verbundenen Nukleinsäurehybridisierungs- und -amplifikationsverfahren können zur Analyse von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die von einer Vielzahl verschiedener Zell-, Gewebe- oder Probentypen stammen, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können Nukleinsäuren aus Zellen oder Gewebeproben extrahiert werden, die einen oder mehrere Zelltypen umfassen, die von Eukaryoten (wie Tieren, Pflanzen, Pilzen, Protisten), Archaebakterien oder Eubakterien stammen. In einigen Fällen können Nukleinsäuren aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen wie anhaftenden oder nicht anhaftenden eukaryotischen Zellen extrahiert werden. Nukleinsäuren werden auf verschiedene Weise beispielsweise aus primären oder immortalisierten Zelllinien von Nagetieren, Schweinen, Katzen, Hunden, Rindern, Pferden, Primaten oder Menschen extrahiert. Nukleinsäuren können aus einer Vielzahl verschiedener Zell-, Organ- oder Gewebetypen extrahiert werden (z. B. weißen Blutzellen, roten Blutkörperchen, Blutplättchen, Epithelzellen, Endothelzellen, Neuronen, Gliazellen, Astrozyten, Fibroblasten, Skelettmuskelzellen, glatten Muskelzellen, Gameten oder Zellen aus Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Niere, Milz, Bauchspeicheldrüse, Thymus, Blase, Magen, Dickdarm oder Dünndarm). Nukleinsäuren können aus normalen oder gesunden Zellen extrahiert werden. Alternativ oder in Kombination werden Säuren aus erkrankten Zellen wie Krebszellen oder aus pathogenen Zellen, die einen Wirt infizieren, extrahiert. Einige Nukleinsäuren können aus einer bestimmten Untergruppe von Zelltypen extrahiert werden, z. B. Immunzellen (wie T-Zellen, zytotoxischen (Killer-)T-Zellen, Helfer-T-Zellen, Alpha-Beta-T-Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, T-Zell-Vorläufern, B-Zellen, B-Zell-Vorläufern, lymphoiden Stammzellen, myeloischen Vorläuferzellen, Lymphozyten, Granulozyten, natürlichen Killerzellen, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen, Mastzellen, Monozyten, dendritischen Zellen und/oder Makrophagen oder einer beliebigen Kombination davon), undifferenzierten menschlichen Stammzellen, menschlichen Stammzellen, die zur Differenzierung induziert wurden, seltenen Zellen (z. B. zirkulierenden Tumorzellen (CTCs), zirkulierenden Epithelzellen, zirkulierenden Endothelzellen, zirkulierenden Endometriumzellen, Knochenmarkszellen, Vorläuferzellen, Schaumzellen, Mesenchymzellen oder Trophoblasten). Andere Zellen werden in Betracht gezogen und stimmen mit der Offenbarung hierin überein.
  • Infolge der hierin offenbarten Oberflächenpassivierungstechniken „haften“ Proteine, Nukleinsäuren und andere Biomoleküle nicht an den Substraten, d. h. sie zeigen eine geringe unspezifische Bindung (NSB). Beispiele sind nachstehend unter Verwendung von Oberflächenvorbehandlungen mit Standard-Monoschicht mit unterschiedlichen Bedingungen der Glasvorbehandlung gezeigt. Hydrophile Oberflächen, die passiviert wurden, um eine extrem niedrige NSB für Proteine und Nukleinsäuren zu erreichen, erfordern neue Reaktionsbedingungen, um die Effizienz der Primerabscheidungsreaktion, die Hybridisierungsleistung und die effektive Amplifikation zu verbessern. Alle diese Prozesse erfordern eine Oligonukleotidanlagerung und eine anschließende Proteinbindung und Abgabe an eine Oberfläche mit geringer Bindung. Wie nachstehend beschrieben, ergab die Kombination einer neuen Primeroberflächenkonjugationsformulierung (Cy3-Oligonukleotidtransplantat-Titration) und der daraus resultierende extrem niedrige unspezifische Hintergrund (NSB-Funktionstests, die unter Verwendung von rot und grün fluoreszierenden Farbstoffen durchgeführt wurden), Ergebnisse, die die Lebensfähigkeit der offenbarten Ansätze zeigen. Einige hierin offenbarte Oberflächen zeigen ein Verhältnis von spezifischer (z. B. Hybridisierung mit einem gebundenen Primer oder Sonde) zu unspezifischer Bindung (z. B. Binter) eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 7 : 1, 8 : 1, 9 : 1, 10 : 1, 11 : 1, 12 : 1, 13 : 1, 14 : 1, 15 : 1, 16 : 1, 17 : 1, 18 : 1, 19 : 1, 20 : 1, 25 : 1, 30 : 1, 35 : 1, 40 : 1, 50 : 1, 75 : 1, 100 : 1 oder größer als 100 : 1 oder jeder Zwischenwert, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird. Einige hierin offenbarte Oberflächen zeigen ein Verhältnis von spezifischem zu unspezifischem Fluoreszenzsignal (z. B. für spezifisch hybridisierte zu unspezifisch gebundenen markierten Oligonukleotiden oder für spezifisch amplifizierte zu nicht spezifisch gebundenen (Binter) oder unspezifisch amplifizierten (Bintra) markierten Oligonukleotiden oder eine Kombination davon (Binter + Bintra)) für ein Fluorophor wie Cy3 von mindestens 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 7 : 1, 8 : 1, 9 : 1, 10 : 1, 11 : 1, 12 : 1, 13 : 1, 14 : 1, 15 : 1, 16 : 1, 17 : 1, 18 : 1, 19 : 1, 20 : 1, 25 : 1, 30 : 1, 35 : 1, 40 : 1, 50 : 1, 75 : 1, 100 : 1 oder größer als 100 : 1 oder ein beliebiger Zwischenwert, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird.
  • Pfropfen einer niedrigen unspezifischen Bindungsschicht: Die Anlagerungschemie, die zum Pfropfen einer ersten chemisch modifizierten Schicht auf eine Innenfläche der Durchflusszelle (Kapillare oder Kanal) verwendet wird, hängt im Allgemeinen sowohl vom Material ab, aus dem der Träger hergestellt wird, als auch von der chemischen Beschaffenheit der Schicht. In einigen Fällen kann die erste Schicht kovalent an die Trägeroberfläche gebunden sein. In einigen Fällen kann die erste Schicht nicht kovalent gebunden sein, z. B. durch nichtkovalente Wechselwirkungen wie elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken oder Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und den molekularen Komponenten der ersten Schicht an der Oberfläche adsorbiert sein. In jedem Fall kann die Substratoberfläche vor dem Anbringen oder Abscheiden der ersten Schicht behandelt werden. Zum Reinigen oder Behandeln der Trägeroberfläche kann eine Vielzahl von Oberflächenvorbehandlungstechniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können Glas- oder Siliziumoberflächen unter Verwendung einer Piranha-Lösung (einer Mischung aus Schwefelsäure (H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2)) mit Säure gewaschen und/oder unter Verwendung eines Sauerstoffplasmabehandlungsverfahrens gereinigt werden.
  • Die Silanchemie stellt einen nicht einschränkenden Ansatz zur kovalenten Modifizierung der Silanolgruppen auf Glas- oder Siliziumoberflächen dar, um reaktivere funktionelle Gruppen (z. B. Amine oder Carboxylgruppen), die dann zur Kopplung von Linkermolekülen (z. B. linearen Kohlenwasserstoffmolekülen von verschiedenen Längen, wie C6-, C12-, C18-Kohlenwasserstoffen, oder linearen Polyethylenglykol(PEG)-Molekülen) oder Schichtmolekülen (z. B. verzweigten PEG-Molekülen oder anderen Polymeren) an die Oberfläche verwendet werden können, zu binden. Beispiele für geeignete Silane, die zur Herstellung einer der offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS), (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), ein beliebiges von einer Vielzahl von PEG-Silanen (z. B. umfassend Molekulargewichte von 1 K, 2 K, 5 K, 10 K, 20 K usw.), Amino-PEG-Silan (d. h. umfassend eine freie aminofunktionelle Gruppe), Maleimid-PEG-Silan, Biotin-PEG-Silan und dergleichen.
  • Eine Vielzahl von Molekülen, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Aminosäuren, Peptide, Nukleotide, Oligonukleotide, andere Monomere oder Polymere oder Kombinationen davon, können zur Herstellung des einen oder der mehreren chemisch modifizierten Schichten auf der Trägeroberfläche verwendet werden, wobei die Auswahl der verwendeten Komponenten variiert werden kann, um eine oder mehrere Eigenschaften der Trägeroberfläche zu verändern, z. B. die Oberflächendichte von funktionellen Gruppen und/oder gebundenen Oligonukleotidprimern, die Hydrophilie/Hydrophobizität der Trägeroberfläche; oder die dreidimensionale Beschaffenheit (d. h. „Dicke“) der Trägeroberfläche. Beispiele für bevorzugte Polymere, die verwendet werden können, um eine oder mehrere Schichten aus wenig unspezifischem Bindungsmaterial in einer der offenbarten Trägeroberflächen zu erzeugen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyethylenglykol (PEG) mit verschiedenen Molekulargewichten und Verzweigungsstrukturen; Streptavidin-, Polyacrylamid-, Polyester-, Dextran-, Polylysin- und Polylysin-Copolymere oder eine beliebige Kombination davon. Beispiele für Konjugationschemien, die verwendet werden können, um eine oder mehrere Materialschichten (z. B. Polymerschichten) auf die Trägeroberfläche zu pfropfen und/oder die Schichten miteinander zu vernetzen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen (oder Variationen davon), his-Tag-Ni/NTA-Konjugationschemie, Methoxyetherkonjugationschemie, Carboxylatkonjugationschemie, Aminkonjugationschemie, NHS-Ester, Maleimide, Thiol, Epoxy, Azid, Hydrazid, Alkin, Isocyanat und Silan.
  • Eine oder mehrere Schichten einer mehrschichtigen Oberfläche können ein verzweigtes Polymer umfassen oder können linear sein. Beispiele für geeignete verzweigte Polymere umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, verzweigtes PEG, verzweigten Poly(vinylalkohol) (verzweigten PVA), verzweigtes Poly(vinylpyridin), verzweigtes Poly(vinylpyrrolidon) (verzweigtes PVP), verzweigtes Poly(acrylsäure) (verzweigte PAA), verzweigtes Polyacrylamid, verzweigtes Poly(N-isopropylacrylamid) (verzweigtes PNIPAM), verzweigtes Poly(methylmethacrylat) (verzweigtes PMA), verzweigtes Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (verzweigtes PHEMA), verzweigtes Poly(oligo(ethylenglykol)methylethermethacrylat) (verzweigtes POEGMA), verzweigte Polyglutaminsäure (verzweigte PGA), verzweigtes Polylysin, verzweigtes Polyglucosid und Dextran.
  • In einigen Fällen können die verzweigten Polymere, die zum Erzeugen einer oder mehrerer Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, mindestens 4 Verzweigungen, mindestens 5 Verzweigungen, mindestens 6 Verzweigungen, mindestens 7 Verzweigungen, mindestens 8 Verzweigungen, mindestens 9 Verzweigungen, mindestens 10 Verzweigungen, mindestens 12 Verzweigungen, mindestens 14 Verzweigungen, mindestens 16 Verzweigungen, mindestens 18 Verzweigungen, mindestens 20 Verzweigungen, mindestens 22 Verzweigungen, mindestens 24 Verzweigungen, mindestens 26 Verzweigungen, mindestens 28 Verzweigungen, mindestens 30 Verzweigungen, mindestens 32 Verzweigungen, mindestens 34 Verzweigungen, mindestens 36 Verzweigungen, mindestens 38 Verzweigungen oder mindestens 40 Verzweigungen umfassen. Moleküle weisen häufig eine Zweierpotenz von Verzweigungen auf, wie z. B. 2, 4, 8, 16, 32, 64 oder 128 Verzweigungen.
  • Beispielhafte PEG-Mehrfachschichten umfassen PEG (8-armig, 16-armig, 8-armig) auf PEG-Amin-APTES. Ähnliche Konzentrationen wurden bei mehrarmigem 3-Schicht-PEG (8-armig, 16-armig, 8-armig) und (8-armig, 64-armig, 8-armig) auf PEG-Amin-APTES, die 8 µM Primer ausgesetzt waren, und mehrarmigem 3-Schicht-PEG (8-armig, 8-armig, 8-armig) mit sternförmigem PEG-Amin als Ersatz für 16 und 64 Arme beobachtet. PEG-Mehrfachschichten mit vergleichbaren ersten, zweiten und dritten PEG-Schichten werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Lineare, verzweigte oder mehrfach verzweigte Polymere, die verwendet werden, um eine oder mehrere Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen zu erzeugen, können ein Molekulargewicht von mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 7.500, mindestens 10.000, mindestens 12.500, mindestens 15.000, mindestens 17.500, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000 oder mindestens 50.000 Dalton. In einigen Fällen können die linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymere, die zur Erzeugung einer oder mehrerer Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, ein Molekulargewicht von höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 17.500, höchstens 15.000, höchstens 12.500, höchstens 10.000, höchstens 7.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500 höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000 oder höchstens 500 Dalton aufweisen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen das Molekulargewicht von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeren, die zur Erzeugung einer oder mehrerer Schichten von jeder der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, im Bereich von etwa 1.500 bis etwa 20.000 Dalton liegen. Fachleute werden erkennen, dass das Molekulargewicht von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeren, die zur Erzeugung einer oder mehrerer Schichten einer der hierin offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. 1.260 Dalton.
  • In einigen Fällen, z. B. wobei mindestens eine Schicht einer mehrschichtigen Oberfläche ein verzweigtes Polymer umfasst, kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der abgeschiedenen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht im Bereich von etwa einer kovalenten Bindung pro Molekül und etwa 32 kovalenten Bindungen pro Molekül liegen. In einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 22, mindestens 24, mindestens 26, mindestens 28, mindestens 30 oder mindestens 32 oder mehr als 32 kovalente Bindungen pro Molekül betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht höchstens 32, höchstens 30, höchstens 28, höchstens 26, höchstens 24, höchstens 22, höchstens 20, höchstens 18, höchstens 16, höchstens 14, höchstens 12, höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht im Bereich von etwa 4 bis etwa 16 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 11 in einigen Fällen oder eine durchschnittliche Anzahl von etwa 4,6 in anderen Fällen.
  • Alle reaktiven funktionellen Gruppen, die nach der Kopplung einer Materialschicht an die Trägeroberfläche verbleiben, können gegebenenfalls durch Kopplung eines kleinen inerten Moleküls unter Verwendung einer Kopplungschemie mit hoher Ausbeute blockiert werden. Zum Beispiel können in dem Fall, dass die Aminkopplungschemie verwendet wird, um eine neue Materialschicht an die vorherige zu binden, alle verbleibenden Amingruppen anschließend durch Kopplung mit einer kleinen Aminosäure wie Glycin acetyliert oder deaktiviert werden.
  • Die Anzahl der Schichten aus wenig unspezifischem Bindungsmaterial, z. B. einem hydrophilen Polymermaterial, die auf der Oberfläche der offenbarten Träger mit geringer Bindung abgeschieden sind, kann im Bereich von 1 bis etwa 10 liegen. In einigen Fällen beträgt die Anzahl der Schichten mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder mindestens 10. In einigen Fällen kann die Anzahl der Schichten höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Schichten im Bereich von etwa 2 bis etwa 4 liegen. In einigen Fällen können alle Schichten das gleiche Material umfassen. In einigen Fällen kann jede Schicht ein anderes Material umfassen. In einigen Fällen können die mehreren Schichten mehrere Materialien umfassen. In einigen Fällen kann mindestens eine Schicht ein verzweigtes Polymer umfassen. In einigen Fällen können alle Schichten ein verzweigtes Polymer umfassen.
  • Eine oder mehrere Schichten eines niedrigen unspezifischen Bindungsmaterials können in einigen Fällen unter Verwendung eines polaren protischen Lösungsmittels, eines polaren aprotischen Lösungsmittels, eines unpolaren Lösungsmittels oder einer beliebigen Kombination davon auf der Substratoberfläche abgeschieden und/oder an diese konjugiert werden. In einigen Fällen kann das zur Schichtabscheidung und/oder Kopplung verwendete Lösungsmittel einen Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Propanol usw.), ein anderes organisches Lösungsmittel (z. B. Acetonitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) usw.), Wasser, eine wässrige Pufferlösung (z. B. Phosphatpuffer, phosphatgepufferte Salzlösung, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) usw.) oder jede Kombination davon umfassen. In einigen Fällen kann eine organische Komponente des verwendeten Lösungsmittelgemisches mindestens 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % der Gesamtmenge oder einen beliebigen Prozentsatz, der sich über den hierin angegebenen Bereich erstreckt oder diesem benachbart ist, umfassen, wobei der Rest aus Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung besteht. In einigen Fällen kann eine wässrige Komponente des verwendeten Lösungsmittelgemisches mindestens 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % der Gesamtmenge oder einen beliebigen Prozentsatz, der sich über den hierin angegebenen Bereich erstreckt oder diesem benachbart ist, umfassen, wobei der Rest aus einem organischen Lösungsmittel besteht. Der pH-Wert des verwendeten Lösungsmittelgemisches kann kleiner als 5, 5, 5, 5, 6, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 oder größer als 10 oder ein beliebiger Wert sein, der von dem hierin beschriebenen Bereich umfasst oder diesem benachbart ist.
  • In einigen Fällen können eine oder mehrere Schichten aus wenig unspezifischem Bindungsmaterial unter Verwendung eines Gemischs organischer Lösungsmittel auf der Substratoberfläche abgeschieden und/oder an diese konjugiert werden, wobei die Dielektrizitätskonstante mindestens einer Komponente weniger als 40 beträgt und diese mindestens 50 Vol.-% des Gesamtgemischs ausmacht. In einigen Fällen kann die Dielektrizitätskonstante der mindestens einen Komponente weniger als 10, weniger als 20, weniger als 30, weniger als 40 betragen. In einigen Fällen macht die mindestens eine Komponente mindestens 20 %, mindestens 30 %, mindestens 40 %, mindestens 50 %, mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 % oder mindestens 80 % des Gesamtgemischs nach Volumen aus.
  • Wie erwähnt, zeigen die niedrigen unspezifischen Bindungsträger der vorliegenden Offenbarung eine verringerte unspezifische Bindung von Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Komponenten der Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsformulierung, die für die Festphasennukleinsäureamplifikation verwendet wird. Der Grad der unspezifischen Bindung, der von einer gegebenen Trägeroberfläche gezeigt wird, kann entweder qualitativ oder quantitativ bewertet werden. Zum Beispiel kann in einigen Fällen die Exposition der Oberfläche gegenüber fluoreszierenden Farbstoffen (z. B. Cy3, Cy5 usw.), fluoreszenzmarkierten Nukleotiden, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden und/oder fluoreszenzmarkierten Proteinen (z. B. Polymerasen) unter einem standardisierten Satz von Bedingungen, gefolgt von einem spezifizierten Spülprotokoll und Fluoreszenzbildgebung, als qualitatives Werkzeug zum Vergleich der unspezifischen Bindung auf Trägern verwendet werden, die verschiedene Oberflächenformulierungen umfassen. In einigen Fällen kann die Exposition der Oberfläche gegenüber fluoreszierenden Farbstoffen, fluoreszenzmarkierten Nukleotiden, fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden und/oder fluoreszenzmarkierten Proteinen (z. B. Polymerasen) unter einem standardisierten Satz von Bedingungen, gefolgt von einem spezifizierten Spülprotokoll und Fluoreszenzbildgebung als quantitatives Instrument zum Vergleich der unspezifischen Bindung auf Trägern mit verschiedenen Oberflächenformulierungen verwendet werden - vorausgesetzt, es wurde darauf geachtet, dass die Fluoreszenzbildgebung unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen das Fluoreszenzsignal linear (oder auf vorhersagbare Weise) zu der Anzahl der Fluorophore auf der Trägeroberfläche (z. B. unter Bedingungen, bei denen die Signalsättigung und/oder Selbstlöschung des Fluorophors kein Problem darstellt) in Beziehung steht und geeignete Kalibrierungsstandards verwendet werden. In einigen Fällen können andere dem Fachmann bekannte Techniken, beispielsweise Radioisotopenmarkierungs- und Zählverfahren, zur quantitativen Beurteilung des Ausmaßes verwendet werden, in dem die verschiedenen Trägeroberflächenformulierungen der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Bindung aufweisen.
  • Einige hierin offenbarte Oberflächen zeigen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder größer als 100 oder ein beliebiger Zwischenwert, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird. Einige hierin offenbarte Oberflächen zeigen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Fluoreszenz eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder größer als 100 oder einen beliebigen Zwischenwert, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird.
  • Wie erwähnt, kann in einigen Fällen der Grad der unspezifischen Bindung, der von den offenbarten Trägern mit geringer Bindung gezeigt wird, unter Verwendung eines standardisierten Protokolls zum Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem markierten Protein (z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Streptavidin, einer DNA-Polymerase, einer reversen Transkriptase, einer Helikase, einem einzelsträngigen Bindungsprotein (SSB) usw. oder einer beliebigen Kombination davon), einem markierten Nukleotid, einem markierten Oligonukleotid usw. unter einem standardisierten Satz von Inkubations- und Spülbedingungen, gefolgt von der Erfassung der Menge der auf der Oberfläche verbleibenden Markierung und dem Vergleich des daraus resultierenden Signals mit einem geeigneten Kalibrierungsstandard. In einigen Fällen kann die Markierung eine fluoreszierende Markierung umfassen. In einigen Fällen kann die Markierung ein Radioisotop umfassen. In einigen Fällen kann die Markierung jede andere nachweisbare Markierung umfassen, die dem Fachmann bekannt ist. In einigen Fällen kann der Grad der unspezifischen Bindung, den eine gegebene Trägeroberflächenformulierung aufweist, somit als Anzahl nicht spezifisch gebundener Proteinmoleküle (oder anderer Moleküle) pro Flächeneinheit bewertet werden. In einigen Fällen können die Träger mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Proteinbindung (oder unspezifische Bindung anderer spezifizierter Moleküle, z. B. Cy3-Farbstoff) von weniger als 0,001 Molekülen pro um2, weniger als 0,01 Molekülen pro um2, weniger als 0,1 Molekülen pro um2, weniger als 0,25 Molekülen pro µm2, weniger als 0,5 Molekülen pro µm2, weniger als 1 Molekül pro µm2, weniger als 10 Molekülen pro µm2, weniger als 100 Molekülen pro µm2 oder weniger als 1.000 Molekülen pro µm2 zeigen. Fachleute werden erkennen, dass eine gegebene Trägeroberfläche der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Bindung aufweisen kann, die in diesen Bereich fällt, beispielsweise von weniger als 86 Molekülen pro µm2. Beispielsweise zeigen einige hierin offenbarte modifizierte Oberflächen eine unspezifische Proteinbindung von weniger als 0,5 Molekülen/µm2 nach 15-minütigem Kontakt mit einer 1 µM Lösung von Cy3-markiertem Streptavidin (GE Amersham) in phosphatgepuffertem Salzpuffer (PBS), gefolgt von 3 Spülungen mit entionisiertem Wasser. Einige hierin offenbarte modifizierte Oberflächen zeigen eine unspezifische Bindung von Cy3-Farbstoffmolekülen von weniger als 2 Molekülen pro µm2. In unabhängigen unspezifischen Bindungsassays wurden 1 µM markierter Cy3 SA (ThermoFisher), 1 µM Cy5 SA-Farbstoff (ThermoFisher), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-647N (Jena Biosciences), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 µM Aminoallyl-dUTP - ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 µM 7-Propargylamino-7-deaza-dGTP - Cy5 (Jena Biosciences) und 10 µM 7-Propargylamino-7-deaza-dGTP - Cy3 (Jena Biosciences) auf den niedrigbindenden Substraten 15 Minuten bei 37 °C in einem 384-Well-Plattenformat inkubiert. Jede Vertiefung wurde 2-3 x mit 50 µl entionisiertem RNase/DNase-freiem Wasser und 2-3 x mit 25 mM ACES-Puffer, pH-Wert 7,4, gespült. Die 384-Well-Platten wurden auf einem GE Typhoon-Instrument (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA) unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Cy3-, AF555- oder Cy5-Filtersätze (gemäß durchgeführtem Farbstofftest) bei einer PMT-Verstärkungseinstellung von 800 und Auflösung von 50-100 µm abgebildet. Für eine Bildgebung mit höherer Auflösung wurden Bilder auf einem Olympus IX83-Mikroskop (Olympus Corp., Center Valley, PA) mit einem Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Objektiv (20x, 0,75 NA oder 100X, 1,5 NA, Olympus) erfasst, eine sCMOS Andor-Kamera, (Zyla 4). Dichroitische Spiegel wurden von Semrock (IDEX Health & Science, LLC, Rochester, New York) gekauft, z. B. dichroitische Reflektoren/Strahlteiler mit 405, 488, 532 oder 633 nm, und Bandpassfilter wurden als 532 LP oder 645 LP in Übereinstimmung mit der entsprechenden Anregungswellenlänge ausgewählt. Einige hierin offenbarte modifizierte Oberflächen zeigen eine unspezifische Bindung von Farbstoffmolekülen von weniger als 0,25 Molekülen pro µm2.
  • In einigen Fällen weisen die hierin offenbarten Oberflächen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder mehr als 100 oder einen beliebigen Zwischenwert auf, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird. In einigen Fällen weisen die hierin offenbarten Oberflächen ein Verhältnis von spezifischen zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen für ein Fluorophor wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder größer als 100 oder einen beliebigen Zwischenwert auf, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird.
  • Die Oberflächen mit niedrigem Hintergrund, die mit der Offenbarung hierin übereinstimmen, können eine spezifische Farbstoffanlagerung (z. B. Cy3-Anlagerung) an unspezifische Farbstoffadsorptionsverhältnisse (z. B. Cy3-Farbstoffadsorption) von mindestens 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 7 : 1, 8 : 1, 9 : 1, 10 : 1, 15 : 1, 20 : 1, 30 : 1,40 : 1, 50 : 1 oder mehr als 50 spezifischen Farbstoffmolekülen, die pro unspezifisch adsorbiertem Molekül angelagert sind, aufweisen. In ähnlicher Weise können Oberflächen mit niedrigem Hintergrund, die mit der hierin offenbarten Offenbarung übereinstimmen, an die Fluorophore, z. B. Cy3, gebunden wurden, Verhältnisse eines spezifischen Fluoreszenzsignals (z. B. aufgrund von an die Oberfläche gebundenen Cy3-markierten Oligonukleotiden), wenn sie einer Anregungsenergie ausgesetzt werden, zu unspezifischen adsorbierten Farbstofffluoreszenzsignalen von mindestens 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 7 : 1, 8 : 1, 9 : 1, 10 : 1, 15 : 1, 20 : 1, 30 : 1, 40 : 1, 50 : 1 oder mehr als 50 : 1 aufweisen.
  • In einigen Fällen kann der Grad der Hydrophilie (oder „Benetzbarkeit“ mit wässrigen Lösungen) der offenbarten Trägeroberflächen beispielsweise durch Messung, beispielsweise mit einem optischen Tensiometer, von Wasserkontaktwinkeln bewertet werden, bei denen ein kleiner Wassertropfen auf die Oberfläche und deren Kontaktwinkel mit der Oberfläche aufgebracht wird. In einigen Fällen kann ein statischer Kontaktwinkel bestimmt werden. In einigen Fällen kann ein fortschreitender oder zurückgehender Kontaktwinkel bestimmt werden. In einigen Fällen kann der hierin offenbarte Wasserkontaktwinkel für den hierin offenbarten hydrophilen Träger mit geringer Bindung im Bereich von etwa 0 Grad bis etwa 50 Grad liegen. In einigen Fällen darf der hierin offenbarte Wasserkontaktwinkel für den hierin offenbarten hydrophilen Träger mit geringer Bindung nicht mehr als 50 Grad, 45 Grad, 40 Grad, 35 Grad, 30 Grad, 25 Grad, 20 Grad, 18 Grad, 16 Grad, 14 Grad, 12 Grad, 10 Grad, 8 Grad, 6 Grad, 4 Grad, 2 Grad oder 1 Grad betragen. In vielen Fällen beträgt der Kontaktwinkel nicht mehr als einen Wert innerhalb dieses Bereichs, z. B. nicht mehr als 40 Grad. Fachleute werden erkennen, dass eine gegebene hydrophile, Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung einen Wasserkontaktwinkel mit einem beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs aufweisen kann, z. B. etwa 27 Grad.
  • In einigen Fällen erleichtern die hierin offenbarten hydrophilen Oberflächen verkürzte Waschzeiten für Bioassays, häufig aufgrund einer verringerten unspezifischen Bindung von Biomolekülen an die Oberflächen mit geringer Bindung. In einigen Fällen können angemessene Waschschritte in weniger als 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 oder weniger als 10 Sekunden durchgeführt werden. In einigen Fällen können beispielsweise angemessene Waschschritte in weniger als 30 Sekunden durchgeführt werden.
  • Oligonukleotidprimer und Adaptersequenzen: Im Allgemeinen kann mindestens eine Schicht der einen oder der mehreren Schichten aus wenig unspezifischem Bindungsmaterial funktionelle Gruppen für die kovalente oder nichtkovalente Bindung von Oligonukleotidmolekülen umfassen, z. B. Adapter- oder Primersequenzen oder die mindestens eine Schicht kann bereits kovalent oder nicht kovalent gebundene Oligonukleotidadapter- oder Primersequenzen zum Zeitpunkt der Abscheidung auf der Trägeroberfläche umfassen. In einigen Fällen können die Oligonukleotide, die an die Polymermoleküle von mindestens einer dritten Schicht gebunden sind, in mehreren Tiefen über die Schicht verteilt sein.
  • In einigen Fällen werden der Oligonukleotidadapter oder die Primermoleküle kovalent an das Polymer in Lösung gekoppelt, d. h. vor dem Koppeln oder Abscheiden des Polymers auf der Oberfläche. In einigen Fällen werden der Oligonukleotidadapter oder die Primermoleküle kovalent an das Polymer gekoppelt, nachdem es an die Oberfläche gekoppelt oder auf dieser abgeschieden wurde. In einigen Fällen umfasst mindestens eine hydrophile Polymerschicht mehrere kovalent gebundene Oligonukleotidadapter- oder Primermoleküle. In einigen Fällen umfassen mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier oder mindestens fünf Schichten eines hydrophilen Polymers mehrere kovalent gebundene Adapter- oder Primermoleküle.
  • In einigen Fällen können die Oligonukleotidadapter- oder Primermoleküle unter Verwendung einer Vielzahl geeigneter Konjugationschemien, die dem Fachmann bekannt sind, an die eine oder mehreren Schichten eines hydrophilen Polymers gekoppelt werden. Beispielsweise können die Oligonukleotidadapter- oder Primersequenzen Einheiten umfassen, die mit Amingruppen, Carboxylgruppen, Thiolgruppen und dergleichen reaktiv sind. Beispiele für geeignete aminreaktive Konjugationschemien, die verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Reaktionen, an denen Isothiocyanat-, Isocyanat-, Acylazid-, NHS-Ester-, Sulfonylchlorid-, Aldehyd-, Glyoxal-, Epoxid-, Oxiran-, Carbonat-, Arylhalogenid-, Imidoester-, Carbodiimid-, Anhydrid- und Fluorphenylestergruppen beteiligt sind. Beispiele für geeignete carboxylreaktive Konjugationschemien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Reaktionen, an denen Carbodiimidverbindungen beteiligt sind, z. B. wasserlösliches EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl). Beispiele für geeignete sulfydrylreaktive Konjugationschemien umfassen Maleimide, Halogenacetyle und Pyridyldisulfide.
  • Eine oder mehrere Arten von Oligonukleotidmolekülen können an die Trägeroberfläche gebunden oder gebunden sein. In einigen Fällen können der eine oder die mehreren Arten von Oligonukleotidadaptern oder -primern Spacersequenzen, Adaptersequenzen zur Hybridisierung an Nukleinsäuresequenzen der adapterligierten Matrizenbibliothek, Vorwärtsamplifikationsprimer, Rückwärtsamplifikationsprimer, Sequenzierungsprimer und/oder molekulare Barcodierungssequenzen oder eine beliebige Kombination davon umfassen. In einigen Fällen kann 1 Primer- oder Adaptersequenz an mindestens eine Schicht der Oberfläche gebunden sein. In einigen Fällen können mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 verschiedene Primer- oder Adaptersequenzen an mindestens eine Schicht der Oberfläche gebunden sein.
  • In einigen Fällen können die gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen eine Länge von etwa 10 Nukleotiden bis etwa 100 Nukleotiden betragen. In einigen Fällen können die gebundene Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90 oder mindestens 100 Nukleotide lang sein. In einigen Fällen dürfen die gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20 oder höchstens 10 Nukleotide lang sein. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Länge der gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen im Bereich von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 80 Nukleotiden liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Länge der gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 24 Nukleotide.
  • In einigen Fällen können die gebundenen Adapter- oder Primersequenzen Modifikationen umfassen, die entworfen wurden, um die Spezifität und Effizienz der Nukleinsäureamplifikation, wie sie auf den Trägern mit geringer Bindung durchgeführt wird, zu erleichtern. Zum Beispiel kann der Primer in einigen Fällen Polymerase-Stopppunkte umfassen, sodass die Strecke der Primersequenz zwischen dem Oberflächenkonjugationspunkt und der Modifikationsstelle immer in Einzelstrangform vorliegt und bei einigen Helikaseabhängigen isothermen Amplifikationsverfahren als Beladungsstelle für 5'- bis 3'-Helikasen fungiert. Andere Beispiele für Primermodifikationen, die verwendet werden können, um Polymerasestopppunkte zu erzeugen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Insertion einer PEG-Kette in das Grundgerüst des Primers zwischen zwei Nukleotiden in Richtung des 5'-Endes, die Insertion eines abasischen Nukleotids (d. h. eines Nukleotids, das weder eine Purinnoch eine Pyrimidinbase aufweist) oder eine Läsionsstelle, die von der Helikase umgangen werden kann.
  • Wie in den folgenden Beispielen weiter erläutert wird, kann es wünschenswert sein, die Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidadaptern oder -primern auf der Trägeroberfläche und/oder den Abstand des angebundenen Adapters oder der angebundenen Primer von der Trägeroberfläche zu variieren (z. B. durch Variieren der Länge eines Linkermoleküls, das verwendet wird, um den Adapter oder die Primer an die Oberfläche zu binden), um den Träger für eine optimale Leistung bei Verwendung eines bestimmten Amplifikationsverfahrens „abzustimmen“. Wie unten angegeben, kann das Einstellen der Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidadaptern oder -primern den Grad der spezifischen und/oder unspezifischen Amplifikation, die auf dem Träger beobachtet wird, auf eine Weise beeinflussen, die gemäß dem ausgewählten Amplifikationsverfahren variiert. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidadaptern oder - primern durch Einstellen des Verhältnisses der zur Erzeugung der Trägeroberfläche verwendeten molekularen Komponenten variiert werden. Zum Beispiel kann in dem Fall, dass ein Oligonukleotidprimer-PEG-Konjugat verwendet wird, um die letzte Schicht eines Trägers mit geringer Bindung zu erzeugen, das Verhältnis des Oligonukleotidprimer-PEG-Konjugats zu einem nicht konjugierten PEG-Molekül variiert werden. Die resultierende Oberflächendichte von gebundenen Primermolekülen kann dann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken geschätzt oder gemessen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung von Radioisotopenmarkierungs- und Zählverfahren, die kovalente Kopplung eines spaltbaren Moleküls, das eine optisch nachweisbare Markierung (z. B. eine fluoreszierende Markierung) umfasst, die von einer Trägeroberfläche eines definierten Bereichs abgespalten, in einem festen Volumen eines geeigneten Lösungsmittels gesammelt und dann durch Vergleich von Fluoreszenzsignalen mit denen für eine Kalibrierungslösung mit bekannter optischer Markierungskonzentration oder unter Verwendung von Fluoreszenzbildgebungstechniken quantifiziert werden kann, vorausgesetzt, dass die Markierungsreaktionsbedingungen und Bildaufnahmeeinstellungen sorgfältig berücksichtigt wurden, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzsignale linear mit der Anzahl der Fluorophore auf der Oberfläche korrelieren (z. B. dass es keine signifikante Selbstlöschung der Fluorophore auf der Oberfläche gibt).
  • In einigen Fällen kann die resultierende Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptern oder -primern auf den Trägeroberflächen mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung im Bereich von etwa 100 Primermolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Primermolekülen pro µm2 liegen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptern oder -primern mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400, mindestens 500, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800, mindestens 900, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 5.500, mindestens 6.000, mindestens 6.500, mindestens 7.000, mindestens 7.500, mindestens 8.000, mindestens 8.500, mindestens 9.000, mindestens 9.500, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptern oder -primern höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.500, höchstens 9.000, höchstens 8.500, höchstens 8.000, höchstens 7.500, höchstens 7.000, höchstens 6.500, höchstens 6.000, höchstens 5.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000, höchstens 900, höchstens 800, höchstens 700, höchstens 600, höchstens 500, höchstens 400, höchstens 300, höchstens 200 oder höchstens 100 Moleküle pro µm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Adapter oder Primer im Bereich von etwa 10.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 100.000 Molekülen pro µm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von Adapter- oder Primermolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. in einigen Fällen etwa 3.800 Moleküle pro µm2 oder in anderen Fällen etwa 455.000 Moleküle pro µm2. In einigen Fällen kann, wie weiter unten diskutiert wird, die Oberflächendichte von Nukleinsäuresequenzen der Matrizenbibliothek (z. B. Proben-DNA-Moleküle), die anfänglich an Adapter- oder Primersequenzen auf der Trägeroberfläche hybridisiert wurden, kleiner oder gleich der für die Oberfläche angegebenen Dichte der gebundenen Oligonukleotidprimer sein. In einigen Fällen kann, wie auch weiter unten diskutiert wird, die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Nukleinsäuresequenzen der Matrizenbibliothek, die an Adapter- oder Primersequenzen auf der Trägeroberfläche hybridisiert sind, den gleichen Bereich oder einen anderen Bereich als den für die Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidadaptern oder -primern angegebenen umfassen.
  • Lokale Oberflächendichten von Adapter- oder Primermolekülen, wie oben aufgeführt, schließen eine Variation der Dichte über eine Oberfläche nicht aus, sodass eine Oberfläche eine Region mit einer Oligodichte von beispielsweise 500.000/µm2 umfassen kann, während sie gleichzeitig mindestens eine zweite Region mit einer wesentlich anderen lokalen Dichte umfasst.
  • Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen an Träger mit geringer Bindung: In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Hybridisierungspufferformulierungen beschrieben, die in Kombination mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung für verbesserte Hybridisierungsraten, Hybridisierungsspezifität (oder Stringenz) und Hybridisierungseffizienz (oder Ausbeute) sorgen. Wie hierin verwendet, ist die Hybridisierungsspezifität ein Maß für die Fähigkeit von gebundenen Adaptersequenzen, Primersequenzen oder Oligonukleotidsequenzen im Allgemeinen, nur an vollständig komplementäre Sequenzen korrekt zu hybridisieren, während die Hybridisierungseffizienz ein Maß für den Prozentsatz der insgesamt verfügbaren gebundenen Adaptersequenzen, Primersequenzen oder Oligonukleotidsequenzen im Allgemeinen ist, die an komplementäre Sequenzen hybridisiert sind.
  • Eine verbesserte Hybridisierungsspezifität und/oder -effizienz kann durch Optimierung der Hybridisierungspufferformulierung erreicht werden, die mit den offenbarten Oberflächen mit geringer Bindung verwendet wird, und wird in den nachstehenden Beispielen ausführlicher erörtert. Beispiele für Hybridisierungspufferkomponenten, die eingestellt werden können, um eine verbesserte Leistung zu erzielen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Puffertyp, organische Lösungsmittelgemische, Puffer-pH, Pufferviskosität, Detergenzien und zwitterionische Komponenten, Ionenstärke (einschließlich Einstellung sowohl einwertiger als auch zweiwertiger Ionenkonzentrationen), Antioxidantien und Reduktionsmittel, Kohlenhydrate, BSA, Polyethylenglykol, Dextransulfat, Betain, andere Additive und dergleichen.
  • Als nicht einschränkendes Beispiel können geeignete Puffer zur Verwendung bei der Formulierung eines Hybridisierungspuffers phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Succinat, Citrat, Histidin, Acetat, Tris, TAPS, MOPS, PIPES, HEPES, MES und dergleichen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Wahl des geeigneten Puffers hängt im Allgemeinen vom Ziel-pH-Wert der Hybridisierungspufferlösung ab. Im Allgemeinen liegt der gewünschte pH-Wert der Pufferlösung im Bereich von etwa pH-Wert 4 bis etwa pH-Wert 8,4. In einigen Ausführungsformen kann der Puffer-pH-Wert mindestens 4,0, mindestens 4,5, mindestens 5,0, mindestens 5,5, mindestens 6,0, mindestens 6,2, mindestens 6,4, mindestens 6,6, mindestens 6,8, mindestens 7,0, mindestens 7,2, mindestens 7,4, mindestens 7,6, mindestens 7,8, mindestens 8,0, mindestens 8,2 oder mindestens 8,4 betragen. In einigen Ausführungsformen kann der Puffer-pH-Wert höchstens 8,4, höchstens 8,2, höchstens 8,0, höchstens 7,8, höchstens 7,6, höchstens 7,4, höchstens 7,2, höchstens 7,0, höchstens 6,8, höchstens 6,6, höchstens 6,4, höchstens 6,2, höchstens 6,0, höchstens 5,5, höchstens 5,0, höchstens 4,5 oder höchstens 4,0 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen der gewünschte pH-Wert im Bereich von etwa 6,4 bis etwa 7,2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass der Puffer-pH-Wert einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, beispielsweise etwa 7,25.
  • Geeignete Detergenzien zur Verwendung in der Hybridisierungspufferformulierung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, zitterionische Detergenzien (z. B. 1-Dodecanoyl-snglycero-3-phosphocholin, 3-(4-tert-Butyl-1-pyridinio)-1-propansulfonat, 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propansulfonat, 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propansulfonat, ASB-C80, C7BzO, CHAPS, CHAPS-Hydrat, CHAPSO, DDMAB, Dimethylethylammoniumpropansulfonat, N,N-Dimethyldodecylaminnoxid, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat oder N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat) sowie anionische, kationische und nichtionische Detergenzien. Beispiele für nichtionische Detergenzien umfassen Poly(oxyethylen)ether und verwandte Polymere (z. B. Brij®, TWEEN®, TRITON®, TRITON X-100 und IGEPAL® CA-630), Gallensalze und glykosidische Detergenzien.
  • Die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen kann relative Hybridisierungsraten ergeben, die etwa 2x bis etwa 20x schneller sind als die für ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll. In einigen Fällen kann die relative Hybridisierungsrate mindestens 2x, mindestens 3x, mindestens 4x, mindestens 5x, mindestens 6x, mindestens 7x, mindestens 8x, mindestens 9x, mindestens 10x, mindestens 12x, mindestens 14x, mindestens 16x, mindestens 18x, mindestens 20x, mindestens 25x, mindestens 30x oder mindestens 40x so viel wie bei einem herkömmlichen Hybridisierungsprotokoll betragen.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen Gesamthybridisierungsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % der Vervollständigung der Hybridisierungsreaktion) von weniger als 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten, 15 Minuten, 10 Minuten oder 5 Minuten für eine dieser Vervollständigungsmetriken ergeben.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen eine verbesserte Hybridisierungsspezifität im Vergleich zu der für ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll ergeben. In einigen Fällen ist die Hybridisierungsspezifität, die erreicht werden kann, besser als 1 Basenfehlpaarung bei 10 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 20 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 30 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 40 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 50 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 75 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 100 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 200 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 300 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 400 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 500 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 600 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 700 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 800 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 900 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 1.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 2.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 3.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 4.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 5.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 6.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 7.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 8.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 9.000 Hybridisierungsereignissen oder 1 Basenfehlpaarung bei 10.000 Hybridisierungsereignissen.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen eine verbesserte Hybridisierungseffizienz (z. B. die Fraktion verfügbarer Oligonukleotidprimer auf der Trägeroberfläche, die erfolgreich an Zieloligonukleotidsequenzen hybridisiert wurden) im Vergleich zu der für ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll ergeben. In einigen Fällen ist die Hybridisierungseffizienz, die erreicht werden kann, besser als 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % für eine der angegebenen eingegebenen Ziel-Oligonukleotidkonzentrationen unter und in einer der oben angegebenen Hybridisierungsreaktionszeiten. In einigen Fällen, wenn z. B. die Hybridisierungseffizienz weniger als 100 % beträgt, kann die resultierende Oberflächendichte von Zielnukleinsäuresequenzen, die an die Trägeroberfläche hybridisiert sind, geringer sein als die Oberflächendichte von Oligonukleotidadapter- oder Primersequenzen auf der Oberfläche.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für Nukleinsäurehybridisierungs- (oder Amplifikations-) Anwendungen unter Verwendung herkömmlicher Hybridisierungs- (oder Amplifikations-) Protokolle oder optimierter Hybridisierungs- (oder Amplifikations-) Protokolle zu einer verringerten Anforderung an die Eingangskonzentration der Ziel- (oder Proben-) Nukleinsäuremoleküle, die mit der Trägeroberfläche in Kontakt stehen, führen. Beispielsweise können in einigen Fällen die Ziel-(oder Proben-) Nukleinsäuremoleküle mit der Trägeroberfläche in einer Konzentration im Bereich von etwa 10 pM bis etwa 1 µM (d. h. vor dem Anellieren oder Amplifizieren) in Kontakt gebracht werden. In einigen Fällen können die Ziel- (oder Proben-) Nukleinsäuremoleküle in einer Konzentration von mindestens 10 pM, mindestens 20 pM, mindestens 30 pM, mindestens 40 pM, mindestens 50 pM, mindestens 100 pM, mindestens 200 pM, mindestens 300 pM, mindestens 400 pM, mindestens 500 pM, mindestens 600 pM, mindestens 700 pM, mindestens 800 pM, mindestens 900 pM, mindestens 1 nM, mindestens 10 nM, mindestens 20 nM, mindestens 30 nM, mindestens 40 nM, mindestens 50 nM, mindestens 60 nM, mindestens 70 nM, mindestens 80 nM, mindestens 90 nM, mindestens 100 nM, mindestens 200 nM, mindestens 300 nM, mindestens 400 nM, mindestens 500 nM, mindestens 600 nM, mindestens 700 nM, mindestens 800 nM, mindestens 900 nM oder mindestens 1 µM verabreicht werden. In einigen Fällen können die Ziel- (oder Proben-) Nukleinsäuremoleküle in einer Konzentration von höchstens 1 µM, höchstens 900 nM, höchstens 800 nm, höchstens 700 nM, höchstens 600 nM, höchstens 500 nM, höchstens 400 nM, höchstens 300 nM, höchstens 200 nM, höchstens 100 nM, höchstens 90 nM, höchstens 80 nM, höchstens 70 nM, höchstens 60 nM, höchstens 50 nM, höchstens 40 nM, höchstens 30 nM, höchstens 20 nM, höchstens 10 nM, höchstens 1 nM, höchstens 900 pM, höchstens 800 pM, höchstens 700 pM, höchstens 600 pM, höchstens 500 pM, höchstens 400 pM, höchstens 300 pM, höchstens 200 pM, höchstens 100 pM, höchstens 90 pM, höchstens 80 pM, höchstens 70 pM, höchstens 60 pM, höchstens 50 pM, höchstens 40 pM, höchstens 30 pM, höchstens 20 pM oder höchstens 10 pM verabreicht werden. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise können in einigen Fällen die Ziel- (oder Proben-) Nukleinsäuremoleküle im Bereich von etwa 90 pM bis etwa 200 nM liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Ziel- (oder Proben-) Nukleinsäuremoleküle in einer Konzentration mit einem beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs verabreicht werden können, z. B. etwa 855 nM.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Hybridisierungspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von hybridisierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmolekülen (d. h. vor dem Durchführen einer nachfolgenden festen Phase oder klonalen Amplifikationsreaktion) im Bereich von etwa 0,0001 Zieloligonukleotidmolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Zieloligonukleotidmolekülen pro µm2führen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen mindestens 0,0001, mindestens 0,0005, mindestens 0,001, mindestens 0,005, mindestens 0,01, mindestens 0,05, mindestens 0,1, mindestens 0,5, mindestens 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400, mindestens 500, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800, mindestens 900, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 5.500, mindestens 6.000, mindestens 6.500, mindestens 7.000, mindestens 7.500, mindestens 8.000, mindestens 8.500, mindestens 9.000, mindestens 9.500, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000 mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.500, höchstens 9.000, höchstens 8.500, höchstens 8.000, höchstens 7.500, höchstens 7.000, höchstens 6.500, höchstens 6.000, höchstens 5.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000, höchstens 900, höchstens 800 höchstens 700, höchstens 600, höchstens 500, höchstens 400, höchstens 300, höchstens 200, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 1, höchstens 0,5, höchstens 0,1, höchstens 0,05, höchstens 0,01, höchstens 0,005, höchstens 0,001, höchstens 0,0005 oder höchstens 0,0001 Moleküle pro µm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen im Bereich von etwa 3.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 20.000 Molekülen pro µm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 2.700 Moleküle pro µm2.
  • Anders ausgedrückt kann in einigen Fällen die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Hybridisierungspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von hybridisierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmolekülen (d. h. vor dem Durchführen einer nachfolgenden Festphase oder klonalen Amplifikationsreaktion) im Bereich von etwa 100 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 bis etwa 1 x 107 Oligonukleotidmolekülen pro mm2 oder von etwa 100 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 bis etwa 1 x 1012 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 führen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 4.000, mindestens 5.000, mindestens 6.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 x 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 x 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000 höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 50.700 Moleküle pro mm2.
  • In einigen Fällen können die Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle), die an den Oligonukleotidadapter oder die Primermoleküle hybridisiert sind, die an die Trägeroberfläche mit geringer Bindung gebunden sind, eine Länge von etwa 0,02 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb oder von etwa 0,1 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb aufweisen. In einigen Fällen können die Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 0,6 kb lang, mindestens 0,7 kb lang, mindestens 0,8 kb lang, mindestens 0,9 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang, mindestens 20 kb lang, mindestens 30 kb lang oder mindestens 40 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der mit dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. mindestens 0,85 kb Länge.
  • In einigen Fällen können die Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die ferner Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen können die einzelsträngigen oder doppelsträngigen multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb lang, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang, mindestens 20 kb lang, mindestens 30 kb lang oder mindestens 40 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der mit dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. mindestens 2,45 kb Länge.
  • In einigen Fällen können die Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die etwa 2 bis etwa 100 Kopien einer sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55, mindestens 60, mindestens 65, mindestens 70, mindestens 75, mindestens 80, mindestens 85, mindestens 90, mindestens 95 und mindestens 100 betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit höchstens 100, höchstens 95, höchstens 90, höchstens 85, höchstens 80, höchstens 75, höchstens 70, höchstens 65, höchstens 60, höchstens 55, höchstens 50, höchstens 45, höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 15, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3 oder höchstens 2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit im Bereich von etwa 4 bis etwa 60 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 17. Somit kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von hybridisierten Zielsequenzen in Bezug auf die Anzahl von Kopien einer Zielsequenz pro Flächeneinheit der Trägeroberfläche die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern überschreiten, selbst wenn die Hybridisierungseffizienz weniger als 100 % beträgt.
  • Nukleinsäureoberflächenamplifikation (NASA): Wie hierin verwendet, wird der Ausdruck „Nukleinsäureoberflächenamplifikation“ (NASA) austauschbar mit dem Ausdruck „Festphasen-Nukleinsäureamplifikation“ (oder einfach „Festphasenamplifikation“) verwendet. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung werden Nukleinsäureamplifikationsformulierungen beschrieben, die in Kombination mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung für verbesserte Amplifikationsraten, Amplifikationsspezifität und Amplifikationseffizienz sorgen. Wie hierin verwendet, bezieht sich die spezifische Amplifikation auf die Amplifikation von Oligonukleotidsträngen der Matrizenbibliothek, die entweder kovalent oder nichtkovalent an den festen Träger gebunden wurden. Wie hierin verwendet, bezieht sich unspezifische Amplifikation auf die Amplifikation von Primer-Dimeren oder anderen Nicht-Template-Nukleinsäuren. Wie hierin verwendet, ist die Amplifikationseffizienz ein Maß für den Prozentsatz an gebundenen Oligonukleotiden auf der Trägeroberfläche, die während eines gegebenen Amplifikationszyklus oder einer gegebenen Amplifikationsreaktion erfolgreich amplifiziert werden. Eine Nukleinsäureamplifikation, die an hierin offenbarten Oberflächen durchgeführt wird, kann Amplifikationseffizienzen von mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder mehr als 95 % erhalten, wie 98 % oder 99 %.
  • Mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung kann ein beliebiges von einer Vielzahl von thermischen Zyklen oder isothermen Nukleinsäureamplifikationsschemata verwendet werden. Beispiele für Nukleinsäureamplifikationsverfahren, die mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polymerasekettenreaktion (PCR), Mehrfachverdrängungsamplifikation (MDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), Nukleinsäuresequenz -basierte Amplifikation (NASBA), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), Echtzeit-SDA, Brückenamplifikation, isotherme Brückenamplifikation, Rolling-Circle-Amplifikation, Kreis-zu-Kreis-Amplifikation, Helikase-abhängige Amplifikation, Rekombinase-abhängige Amplifikation oder proteinabhängige Einzelstrangbindungs-Amplifikation.
  • Oft können Verbesserungen der Amplifikationsrate, der Amplifikationsspezifität und der Amplifikationseffizienz erreicht werden, wenn die offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit Formulierungen der Amplifikationsreaktionskomponenten verwendet werden. Zusätzlich zum Einschluss von Nukleotiden, einer oder mehreren Polymerasen, Helikasen, einzelsträngigen Bindungsproteinen usw. (oder einer beliebigen Kombination davon) kann das Amplifikationsreaktionsgemisch auf verschiedene Arten eingestellt werden, um eine verbesserte Leistung zu erzielen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Wahl des Puffertyps, des Puffer-pH, der organischen Lösungsmittelgemische, der Pufferviskosität, der Detergenzien und zwitterionischen Komponenten, der Ionenstärke (einschließlich der Einstellung sowohl einwertiger als auch zweiwertiger Ionenkonzentrationen), Antioxidationsmittel und Reduktionsmittel, Kohlenhydrate, BSA, Polyethylenglykol, Dextransulfat, Betain, anderer Additive und dergleichen.
  • Die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen kann zu erhöhten Amplifikationsraten im Vergleich zu denen führen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhalten werden. In einigen Fällen können die relativen Amplifikationsraten, die erreicht werden können, mindestens 2x, mindestens 3x, mindestens 4x, mindestens 5x, mindestens 6x, mindestens 7x, mindestens 8x, mindestens 9x, mindestens 10x, mindestens 12x, mindestens 14x, mindestens 16x, mindestens 18x oder mindestens 20x so hoch wie für die Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle für eines der oben beschriebenen Amplifikationsverfahren sein.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen Gesamtamplifikationsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % Vervollständigung der Amplifikationsreaktion zu erreichen) von weniger als 180 Minuten, 120 Minuten, 90 Minuten, 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten, 15 Minuten, 10 Minuten, 5 Minuten, 3 Minuten, 1 Minute, 50 s, 40 s, 30 s, 20s oder 10 s für eine dieser Abschlussmetriken ergeben.
  • Einige hierin offenbarte Trägeroberflächen mit geringer Bindung zeigen ein Verhältnis von spezifischer Bindung zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2: 1,3: 1,4: 1,5: 1,6: 1,7: 1,8: 1,9: 1, 10 : 1, 11 : 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17 : 1, 18 : 1, 19 : 1, 20 : 1, 25 : 1, 30 : 1, 35 : 1, 40 : 1, 50 : 1, 75 : 1, 100 : 1 oder größer als 100 : 1 oder einem beliebigen Zwischenwert, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird. Einige hierin offenbarte Oberflächen mit geringer Bindung zeigen ein Verhältnis von spezifischem zu unspezifischem Fluoreszenzsignal eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2: 1,3: 1,4: 1,5: 1,6: 1,7: 1,8: 1,9: 1, 10 : 1, 11 : 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17 : 1, 18 : 1, 19 : 1, 20 : 1, 25 : 1, 30 : 1, 35 : 1, 40 : 1, 50 : 1, 75 : 1, 100 : 1 oder größer als 100 : 1 oder einem beliebigen Zwischenwert, der von dem hierin angegebenen Bereich umfasst wird.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen schnellere Amplifikationsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % Vervollständigung der Amplifikationsreaktion zu erreichen) von nicht mehr als 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten oder 10 Minuten ermöglichen. In ähnlicher Weise kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen ermöglichen, dass Amplifikationsreaktionen in einigen Fällen in nicht mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 oder nicht mehr als 30 Zyklen abgeschlossen werden.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer erhöhten spezifischen Amplifikation und/oder einer verringerten unspezifischen Amplifikation im Vergleich zu der unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhaltenen führen. In einigen Fällen beträgt das resultierende Verhältnis von spezifischer Amplifikation zu unspezifischer Amplifikation, das erreicht werden kann, mindestens 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 7 : 1, 8 : 1, 9 : 1, 10 : 1, 20 : 1, 30 : 1, 40 : 1, 50 : 1, 60 : 1, 70 : 1, 80 : 1, 90 : 1, 100 : 1, 200 : 1, 300 : 1, 400 : 1, 500 : 1, 600 : 1, 700 : 1, 800 : 1, 900 : 1 oder 1.000 : 1.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer erhöhten Amplifikationseffizienz im Vergleich zu derjenigen führen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhalten wird. In einigen Fällen ist die Hybridisierungseffizienz, die erreicht werden kann, besser als 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % für eine der oben angegebenen Amplifikationsreaktionszeiten.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle), die an den Oligonukleotidadapter oder die Primermoleküle hybridisiert sind, die an die Trägeroberfläche mit geringer Bindung gebunden sind, eine Länge von etwa 0,02 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb oder von etwa 0,1 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb aufweisen. In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der von dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. mindestens 0,85 kb Länge.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die ferner Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen können die klonal amplifizierten einzelsträngigen oder doppelsträngigen multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang sein oder einen beliebigen Zwischenwert aufweisen, der von dem hierin beschriebenen Bereich umfasst wird, z. B. etwa 2,45 kb Länge.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die etwa 2 bis etwa 100 Kopien einer sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55, mindestens 60, mindestens 65, mindestens 70, mindestens 75, mindestens 80, mindestens 85, mindestens 90, mindestens 95 und mindestens 100 betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit höchstens 100, höchstens 95, höchstens 90, höchstens 85, höchstens 80, höchstens 75, höchstens 70, höchstens 65, höchstens 60, höchstens 55, höchstens 50, höchstens 45, höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 15, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3 oder höchstens 2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit im Bereich von etwa 4 bis etwa 60 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 12. Somit kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Zielsequenzen in Bezug auf die Anzahl von Kopien einer Zielsequenz pro Flächeneinheit der Trägeroberfläche die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern überschreiten, selbst wenn die Hybridisierungs- und/oder Amplifikationseffizienz weniger als 100 % beträgt.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungeneine erhöhte klonale Kopienzahl im Vergleich zu derjenigen ergeben, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhalten wird. In einigen Fällen, wobei beispielsweise die klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle verkettete, multimere Wiederholungen einer monomeren Zielsequenz umfassen, kann die klonale Kopienzahl wesentlich kleiner sein im Vergleich zu derjenigen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erhalten wird. Somit kann in einigen Fällen die klonale Kopienzahl im Bereich von etwa 1 Molekül bis etwa 100.000 Molekülen (z. B. Zielsequenzmolekülen) pro amplifizierter Kolonie liegen. In einigen Fällen kann die klonale Kopienzahl mindestens 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 2.000, mindestens 3.000, mindestens 4.000, mindestens 5.000, mindestens 6.000, mindestens 7.000, mindestens 8.000, mindestens 9.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000 oder mindestens 100.000 Moleküle pro amplifizierter Kolonie betragen. In einigen Fällen kann die klonale Kopienzahl höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.000, höchstens 8.000, höchstens 7.000, höchstens 6.000, höchstens 5.000, höchstens 4.000, höchstens 3.000, höchstens 2.000, höchstens 1.000, höchstens 500, höchstens 100, höchstens 50, höchstens 10, höchstens 5 oder höchstens 1 Molekül pro amplifizierter Kolonie betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die klonale Kopienzahl im Bereich von etwa 2.000 Molekülen bis etwa 9.000 Molekülen liegen. Fachleute werden erkennen, dass die klonale Kopienzahl einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 2.220 Moleküle in einigen Fällen oder etwa 2 Moleküle in anderen.
  • Wie oben erwähnt, können in einigen Fällen die amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle) verkettete, multimere Wiederholungen einer monomeren Zielsequenz umfassen. In einigen Fällen können die amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmoleküle (oder Nukleinsäuremoleküle) mehrere Moleküle umfassen, von denen jedes eine einzelne monomere Zielsequenz umfasst. Somit kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen zu einer Oberflächendichte von Zielsequenzkopien führen, die im Bereich von etwa 100 Zielsequenzkopien pro mm2 bis etwa 1 x 1012 Zielsequenzkopien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Zielsequenzkopien mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 x 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 klonierte amplifizierte Zielsequenzmoleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Zielsequenzkopien höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000 höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Zielsequenzkopien pro mm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von Zielsequenzkopien im Bereich von etwa 1.000 Zielsequenzkopien pro mm2 bis etwa 65.000 Zielsequenzkopien pro mm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von hybridisierten Zielsequenzkopien einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 49.600 Zielsequenzkopien pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmolekülen (oder - clustern) führen, die im Bereich von etwa 100 Molekülen pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Kolonien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 x 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000 höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 48.800 Moleküle pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidmolekülen (oder - clustern) führen, die im Bereich von etwa 100 Molekülen pro mm2 bis etwa 1 × 109 Kolonien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000 höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Molekülen im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 48.800 Moleküle pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen zu einer Oberflächendichte von klonal amplifizierten Ziel- (oder Proben-) Oligonukleotidkolonien (oder - clustern) führen, die im Bereich von etwa 100 Kolonien pro mm2 bis etwa 1 × 109 Kolonien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Kolonien pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 x 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Kolonien pro mm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien im Bereich von etwa 5.000 Kolonien pro mm2 bis etwa 50.000 Kolonien pro mm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Kolonien einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 48.800 Kolonien pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung allein oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen ein Signal von den amplifizierten und markierten Nukleinsäurepopulationen (z. B. ein Fluoreszenzsignal) ergeben, das einen Varianzkoeffizienten von nicht mehr als 50 % aufweist, wie 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % oder weniger als 5 %.
  • In ähnlicher Weise ergibt in einigen Fällen die Verwendung optimierter Amplifikationsreaktionsformulierungen in Kombination mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung ein Signal von den Nukleinsäurepopulationen, das einen Varianzkoeffizienten von nicht mehr als 50 % aufweist, wie 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % oder weniger als 10 %.
  • In einigen Fällen ermöglichen die hierin offenbarten Trägeroberflächen und -verfahren eine Amplifikation bei erhöhten Dehnungstemperaturen, wie bei 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 40 °C oder mehr oder beispielsweise bei etwa 21 °C oder 23 °C.
  • In einigen Fällen ermöglichen die Verwendung der hierin offenbarten Trägeroberflächen und -verfahren vereinfachte Amplifikationsreaktionen. Beispielsweise werden in einigen Fällen Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von nicht mehr als 1, 2, 3, 4 oder 5 diskreten Reagenzien durchgeführt.
  • In manchen Fällen ermöglicht die Verwendung der hierin offenbarten Trägeroberflächen und Verfahren die Verwendung vereinfachter Temperaturprofile während der Amplifikation, sodass Reaktionen bei Temperaturen ausgeführt werden, die von einer Mindesttemperatur von 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C oder 40 °C bis zu einer Höchsttemperatur von 40 °C, 45 °C, 50 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C oder mehr als 80 °C, beispielsweise in einem Bereich von 20 °C bis 65 °C, reichen.
  • Amplifikationsreaktionen werden auch so verbessert, dass geringere Mengen an Matrize (z. B. Ziel- oder Probenmoleküle) ausreichen, um zu erkennbaren Signalen auf einer Oberfläche zu führen, wie 1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 900 pM, 1.000 pM, 2.000 pM, 3.000 pM, 4.000 pM, 5.000 pM, 6.000 pM, 7.000 pM, 8.000 pM, 9.000 pM, 10.000 pM oder mehr als 10.000 pM einer Probe, z. B. 500 nM. In beispielhaften Ausführungsformen sind Eingaben von etwa 100 pM ausreichend, um Signale für eine zuverlässige Signalbestimmung zu erzeugen.
  • Fluoreszenzbildgebung von Trägeroberflächen: Die offenbarten Festphasen-Nukleinsäureamplifikationsreaktionsformulierungen und Träger mit geringer Bindung können in einer Vielzahl von Nukleinsäureanalyseanwendungen verwendet werden, z. B. Nukleinsäurebasenunterscheidung, Nukleinsäurebasenklassifizierung, Nukleinsäure-„Base Calling“ (Detektieren von Nukleinsäurebasen), Nukleinsäuredetektionsanwendungen, Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen und auf Nukleinsäuren basierende (genetische und genomische) diagnostische Anwendungen. In vielen dieser Anwendungen können Fluoreszenzbildgebungstechniken verwendet werden, um Hybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsreaktionen zu überwachen, die an den Trägern mit geringer Bindung durchgeführt werden.
  • Die Fluoreszenzbildgebung kann unter Verwendung einer Vielzahl von Fluorophoren, Fluoreszenzbildgebungstechniken und Fluoreszenzbildgebungsinstrumenten durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele für geeignete Fluoreszenzfarbstoffe, die verwendet werden können (z. B. durch Konjugation an Nukleotide, Oligonukleotide oder Proteine), umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluorescein, Rhodamin, Cumarin, Cyanin und Derivate davon, einschließlich der Cyaninderivate Cyaninfarbstoff-3 (Cy3), Cyaninfarbstoff-5 (Cy5), Cyaninfarbstoff-7 (Cy7) usw. Beispiele für Fluoreszenzbildgebungstechniken, die verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung, Fluoreszenz-Konfokalitäts-Bildgebung, Zwei-Photonen-Fluoreszenz und dergleichen. Beispiele für Fluoreszenzbildgebungsinstrumente, die verwendet werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluoreszenzmikroskope, die mit einem Bildsensor oder einer Kamera ausgestattet sind, Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Fluoreszenzmikroskope, Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskope oder kundenspezifische Instrumente, die eine geeignete Auswahl von Lichtquellen, Linsen, Spiegeln, Prismen, dichroitischen Reflektoren, Aperturen und Bildsensoren oder Kameras usw. umfassen. Ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Fluoreszenzmikroskop, das zur Aufnahme von Bildern der offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung und klonal amplifizierten Kolonien (oder Clustern) von darauf hybridisierten Zielnukleinsäuresequenzen ausgestattet ist, ist das invertierte Fluoreszenzmikroskop Olympus IX83, ausgestattet mit 20x, 0,75 NA, einer 532 nm Lichtquelle, einem Bandpass- und dichroitischen Spiegelfiltersatz, der für 532-nm-Langpassanregungs- und Cy3-Fluoreszenzemissionsfilter optimiert ist, einem dichroitischer Semrock-532-nm-Reflektor und einer Kamera (Andor sCMOS, Zyla 4), bei der die Intensität des Anregungslichts angepasst wird, um eine Signalsättigung zu vermeiden. Oft kann die Trägeroberfläche in einen Puffer (z. B. 25 mM ACES, pH-7,4-Puffer) eingetaucht werden, während das Bild aufgenommen wird.
  • In einigen Fällen kann die Leistung von Nukleinsäurehybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionen unter Verwendung der offenbarten Reaktionsformulierungen und Träger mit geringer Bindung unter Verwendung von Fluoreszenzbildgebungstechniken bewertet werden, wobei das Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) der Bilder eine wichtige Metrik bei der Beurteilung der Amplifikationsspezifität und der unspezifischen Bindung an den Träger liefert. CNR wird üblicherweise definiert als: CNR = (Signal-Hintergrund) / Rauschen. Der Hintergrundterm wird üblicherweise als das Signal angesehen, das für die interstitiellen Bereiche gemessen wird, die ein bestimmtes Merkmal (beugungsbegrenzter Punkt, DLS) in einem bestimmten interessierenden Bereich (ROI) umgeben. Während das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) häufig als Benchmark für die Gesamtsignalqualität angesehen wird, kann gezeigt werden, dass ein verbessertes CNR einen signifikanten Vorteil gegenüber SNR als Benchmark für die Signalqualität in Anwendungen bietet, die eine schnelle Bilderfassung erfordern (z. B. Sequenzierungsanwendungen, für die Zykluszeiten minimiert werden müssen), wie im folgenden Beispiel gezeigt. Bei einem hohen CNR kann die Bildgebungszeit, die erforderlich ist, um eine genaue Unterscheidung zu erreichen (und somit ein genaues Detektieren von Basen bei Sequenzierungsanwendungen), selbst bei moderaten Verbesserungen des CNR drastisch reduziert werden.
  • Bei den meisten ensemblebasierten Sequenzierungsansätzen wird der Hintergrundterm typischerweise als das Signal gemessen, das mit „interstitiellen“ Regionen assoziiert ist. Zusätzlich zum „interstitiellen“ Hintergrund (Binter) existiert ein „intrastitieller“ Hintergrund (Bintra) innerhalb der Region, die von einer amplifizierten DNA-Kolonie besetzt ist. Die Kombination dieser beiden Hintergrundsignale bestimmt das erreichbare CNR und wirkt sich anschließend direkt auf die Anforderungen an optische Instrumente, die Architekturkosten, die Reagenzienkosten, Laufzeiten, Kosten/Genom und letztendlich die Genauigkeit und Datenqualität für zyklische Array-basierte Sequenzierungsanwendungen aus. Das Binter-Hintergrundsignal stammt aus einer Vielzahl von Quellen; einige Beispiele umfassen Autofluoreszenz von verbrauchbaren Durchflusszellen, unspezifische Adsorption von Nachweismolekülen, die falsche Fluoreszenzsignale liefern, die das Signal von dem ROI verdecken können, das Vorhandensein unspezifischer DNA-Amplifikationsprodukte (z. B. solche, die aus Primerdimeren stammen). In typischen Next Generation Sequencing(NGS)-Anwendungen wird dieses Hintergrundsignal im aktuellen Sichtfeld (FOV) über die Zeit gemittelt und subtrahiert. Das Signal, das von einzelnen DNA-Kolonien (d. h. (S)-Binter im FOV) stammt, ergibt ein erkennbares Merkmal, das klassifiziert werden kann. In einigen Fällen kann der intrastitielle Hintergrund (Bintra) ein verwirrendes Fluoreszenzsignal liefern, das nicht spezifisch für das interessierende Ziel ist, aber in demselben ROI vorhanden ist, wodurch es weitaus schwieriger wird, zu mitteln und zu subtrahieren.
  • Wie in den folgenden Beispielen gezeigt werden wird, kann die Implementierung der Nukleinsäureamplifikation auf den Substraten mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung das Binter-Hintergrundsignal durch Reduzieren der unspezifischen Bindung verringern, zu Verbesserungen bei der spezifischen Nukleinsäureamplifikation führen und kann zu einer Abnahme der unspezifischen Verstärkung führen, die sich auf das Hintergrundsignal auswirken kann, das sowohl aus dem interstitiellen als auch aus dem intrastitiellen Bereich stammt. In einigen Fällen können die offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung, die gegebenenfalls in Kombination mit den offenbarten Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionsformulierungen verwendet werden, zu einer Verbesserung des CNR um den Faktor 2, 5, 10, 100 oder 1000 gegenüber denjenigen führen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Hybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsprotokolle erreicht wurden. Obwohl hierin im Zusammenhang mit der Verwendung der Fluoreszenzbildgebung als Auslese- oder Detektionsmodus beschrieben, gelten die gleichen Prinzipien für die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung und Nukleinsäurehybridisierungs- und Amplifikationsformulierungen auch für andere Detektionsmodi, einschließlich sowohl optischer und nicht optischer Erfassungsmodi.
  • Die offenbarten Träger mit geringer Bindung, die gegebenenfalls in Kombination mit den offenbarten Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsprotokollen verwendet werden, ergeben Festphasenreaktionen, die Folgendes aufweisen: (i) vernachlässigbare unspezifische Bindung von Protein und anderen Reaktionskomponenten (wodurch der Substrathintergrund minimiert wird); (ii) vernachlässigbares unspezifisches Nukleinsäureamplifikationsprodukt und (iii) einstellbare Nukleinsäureamplifikationsreaktionen liefern. Obwohl hierin hauptsächlich im Zusammenhang mit Nukleinsäurehybridisierungs-, Amplifikations- und Sequenzierungsassays beschrieben, versteht es der Fachmann, dass die offenbarten Träger mit geringer Bindung in einer Vielzahl anderer Bioassayformate verwendet werden können, einschließlich: aber nicht beschränkt auf Sandwich-Immunoassays, enzymgebundene Immunosorbens-Assays (ELISAs) usw.
  • Kunststoffoberfläche: Beispiele für Materialien, aus denen das Substrat oder die Trägerstruktur hergestellt werden kann, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Glas, Quarzglas, Silizium, ein Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET)) oder eine beliebige Kombination davon. Es werden verschiedene Zusammensetzungen sowohl von Glas- als auch von Kunststoffsubstraten in Betracht gezogen.
  • Das Modifizieren einer Oberfläche für die hierin offenbarten Zwecke beinhaltet das Reaktivieren von Oberflächen gegen viele chemische Gruppen (-R), einschließlich Amine. Bei Herstellung auf einem geeigneten Substrat können diese reaktiven Oberflächen bei Raumtemperatur beispielsweise mindestens 3 Monate oder länger langfristig gelagert werden. Solche Oberflächen können weiter mit R-PEG und R-Primer-Oligomer zur Oberflächenamplifikation von Nukleinsäuren gepfropft werden, wie an anderer Stelle hierin beschrieben. Kunststoffoberflächen, wie z. B. cyclisches Olefinpolymer (COP), können unter Verwendung einer großen Anzahl von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren modifiziert werden. Zum Beispiel können sie mit Ti:Sapphire-Laserablation, UV-vermittelter Ethylenglykolmethacrylat-Phototransplantation, Plasmabehandlung oder mechanischem Rühren (z. B. Sandstrahlen oder Polieren usw.) behandelt werden, um hydrophile Oberflächen zu erzeugen, die monatelang gegen viele chemische Gruppen wie Amine reaktiv bleiben können. Diese Gruppen können dann die Konjugation von Passivierungspolymeren wie PEG oder Biomolekülen wie DNA oder Proteinen ohne Verlust der biochemischen Aktivität ermöglichen. Beispielsweise ermöglicht die Anlagerung von DNA-Primer-Oligomeren die DNA-Amplifikation auf einer passivierten Kunststoffoberfläche, während die unspezifische Adsorption von Proteinen, Fluorophormolekülen oder anderen hydrophoben Molekülen minimiert wird.
  • Zusätzlich kann die Oberflächenmodifikation mit beispielsweise Laserdruck oder UV-Maskierung kombiniert werden, um strukturierte Oberflächen zu erzeugen. Dies ermöglicht die strukturierte Anlagerung von DNA-Oligomeren, Proteinen oder anderen Einheiten, wodurch eine oberflächenbasierte enzymatische Aktivität, Bindung, Detektion oder Prozessierung ermöglicht wird. Beispielsweise können DNA-Oligomere verwendet werden, um DNA nur innerhalb strukturierter Merkmale zu amplifizieren oder amplifizierte lange DNA-Concatemere strukturiert einzufangen. In einigen Ausführungsformen können Enzyminseln in den strukturierten Bereichen erzeugt werden, die mit lösungsbasierten Substraten reagieren können. Da Kunststoffoberflächen diesen Verarbeitungsmodi besonders zugänglich sind, können in einigen Ausführungsformen, wie sie hierin in Betracht gezogen werden, Kunststoffoberflächen als besonders vorteilhaft erkannt werden.
  • Darüber hinaus kann Kunststoff viel einfacher als Glassubstrate spritzgegossen, geprägt oder in 3D gedruckt werden, um eine beliebige Form zu bilden, einschließlich Mikrofluidikvorrichtungen, und kann daher verwendet werden, um Oberflächen für die Bindung und Analyse von biologischen Proben in mehreren Konfigurationen zu erzeugen, z. B. Mikrofluidik-Chips von Probe bis zum Ergebnis für den Nachweis von Biomarkern oder die DNA-Seq uenzieru ng.
  • Eine spezifische lokalisierte DNA-Amplifikation auf modifizierten Kunststoffoberflächen kann hergestellt werden und Flecken erzeugen, die einen extrem hohen Kontrast zum Rauschverhältnis und einen sehr niedrigen Hintergrund aufweisen, wenn sie mit fluoreszierenden Markierungen untersucht werden.
  • Es kann eine hydrophile und aminreaktive cyclische Olefinpolymeroberfläche mit Aminprimer und Amin-PEG hergestellt werden, die die Rolling-Circle-Amplifikation unterstützt. Bei der Untersuchung mit Fluorophor-markierten Primern oder bei der Markierung von dNTPs, die den hybridisierten Primern durch eine Polymerase zugesetzt wurden, wurden helle Flecken von DNA-Amplikons beobachtet, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 100 mit extrem niedrigen Hintergründen zeigten, was auf eine hochspezifische Amplifikation hinweist, und ultraniedrige Protein- und hydrophobe Fluorophor-Bindungsniveaus, die Kennzeichen der hochgenauen Nachweissysteme wie fluoreszenzbasierter DNA-Sequenzierer sind.
  • Oligonukleotidprimer und Adaptersequenzen: Im Allgemeinen kann mindestens eine Schicht der einen oder mehreren Oberflächenmodifikations- oder Polymerschichten, die auf die Kapillar- oder Kanallumenoberfläche aufgebracht sind, funktionelle Gruppen zum kovalenten oder nichtkovalenten Anhaften von Oligonukleotidadapter- oder Primersequenzen umfassen oder die mindestens eine Schicht kann bereits kovalent oder nicht kovalent gebundene Oligonukleotidadapter- oder Primersequenzen zu dem Zeitpunkt umfassen, zu dem sie auf die Trägeroberfläche gepfropft oder auf dieser abgeschieden wird. In einigen Aspekten umfasst der Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanal eine Oligonukleotidpopulation, die darauf gerichtet ist, ein prokaryotisches Genom zu sequenzieren. In einigen Aspekten umfasst der Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanal eine Oligonukleotidpopulation, die darauf gerichtet ist, ein Transkriptom zu sequenzieren.
  • Der zentrale Bereich der Durchflusszellenvorrichtungen oder -systeme kann eine Oberfläche aufweisen, an die mindestens ein Oligonukleotid gebunden ist. In einigen Ausführungsformen kann die Oberfläche eine Innenfläche eines Mikrofluidik-Kanals oder eines Kapillarröhrchens sein. In einigen Aspekten ist die Oberfläche eine lokal planare Oberfläche. In einigen Ausführungsformen ist das Oligonukleotid direkt an die Oberfläche gebunden. In einigen Ausführungsformen ist das Oligonukleotid über ein Zwischenmolekül an die Oberfläche gebunden.
  • Das an die Innenfläche der zentralen Region gebundene Oligonukleotid kann Segmente enthalten, die an verschiedene Ziele binden. In einigen Fällen weist das Oligonukleotid ein Segment auf, das spezifisch an ein eukaryotisches genomisches Nukleinsäuresegment hybridisiert. In einigen Fällen weist das Oligonukleotid ein Segment auf, das spezifisch mit einem prokaryotischen genomischen Nukleinsäuresegment hybridisiert. In einigen Fällen weist das Oligonukleotid ein Segment auf, das spezifisch an ein virales Nukleinsäuresegment hybridisiert. In einigen Fällen weist das Oligonukleotid ein Segment auf, das spezifisch an ein Transkriptom-Nukleinsäuresegment hybridisiert. Wenn der zentrale Bereich eine Oberfläche mit einem oder mehreren daran gebundenen Oligonukleotiden umfasst, kann das Innenvolumen des zentralen Bereichs basierend auf den durchgeführten Sequenzierungsarten eingestellt werden. In einigen Ausführungsformen umfasst die zentrale Region ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines eukaryotischen Genoms geeignet ist. In einigen Ausführungsformen umfasst die zentrale Region ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines prokaryotischen Genoms geeignet ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der zentrale Bereich ein Innenvolumen, das zur Sequenzierung eines Transkriptoms geeignet ist. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen das Innenvolumen des zentralen Bereichs ein Volumen von weniger als 0,05 µl, zwischen 0,05 µl und 0,1 µl, zwischen 0,05 µl und 0,2 µl, zwischen 0,05 µl und 0,5 µl, zwischen 0,05 µl und 0,8 µl, zwischen 0,05 µl und 1 µl, zwischen 0,05 µl und 1,2 µl, zwischen 0,05 µl und 1,5 µl, zwischen 0,1 µl und 1,5 µl, zwischen 0,2 µl und 1,5 µl, zwischen 0,5 µl und 1,5 µl, zwischen 0,8 µl und 1,5 µl zwischen 1 µl und 1,5 µl, zwischen 1,2 µl und 1,5 µl oder mehr als 1,5 µl oder einen Bereich, der durch zwei der vorstehenden Punkte definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen des zentralen Bereichs ein Volumen von weniger als 0,5 µl, zwischen 0,5 µl und 1 µl, zwischen 0,5 µl und 2 µl, zwischen 0,5 µl und 5 µl, zwischen 0,5 µl und 8 µl, zwischen 0,5 µl und 10 µl, zwischen 0,5 µl und 12 µl, zwischen 0,5 µl und 15 µl, zwischen 1 µl und 15 µl, zwischen 2 µl und 15 µl, zwischen 5 µl und 15 µl, zwischen 8 µl und 15 µl, zwischen 10 µl und 15 µl, zwischen 12 µl und 15 µl oder mehr als 15 µl oder einen Bereich, der durch zwei der vorstehenden Punkte definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen des zentralen Bereichs ein Volumen von weniger als 5 µl, zwischen 5 µl und 10 µl, zwischen 5 µl und 20 µl, zwischen 5 µl und 500 µl, zwischen 5 µl und 80 µl, zwischen 5 µl und 100 µl, zwischen 5 µl und 120 µl, zwischen 5 µl und 150 µl, zwischen 10 µl und 150 µl, zwischen 20 µl und 150 µl, zwischen 50 µl und 150 µl, zwischen 80 µl und 150 µl, zwischen 100 µl und 150 µl, zwischen 120 µl und 150 µl oder mehr als 150 µl oder einen Bereich, der durch zwei der vorstehenden Punkte definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen des zentralen Bereichs ein Volumen von weniger als 50 µl, zwischen 50 µl und 100 µl, zwischen 50 µl und 200 µl, zwischen 50 µl und 500 µl, zwischen 50 µl und 800 µl, zwischen 50 µl und 1000 µl, zwischen 50 µl und 1200 µl, zwischen 50 µl und 1500 µl, zwischen 100 µl und 1500 µl, zwischen 200 µl und 1500 µl, zwischen 500 µl und 1500 µl, zwischen 800 µl und 1500 µl, zwischen 1000 µl und 1500 µl, zwischen 1200 µl und 1500 µl oder mehr als 1500 |j| oder einen Bereich, der durch zwei der vorstehenden Punkte definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen des zentralen Bereichs ein Volumen von weniger als 500 µl, zwischen 500 µl und 1000 µl, zwischen 500 µl und 2000 µl, zwischen 500 µl und 5 ml, zwischen 500 µl und 8 ml, zwischen 500 µl und 10 ml, zwischen 500 µl und 12 ml, zwischen 500 µl und 15 ml, zwischen 1 ml und 15 ml, zwischen 2 ml und 15 ml, zwischen 5 ml und 15 ml, zwischen 8 ml und 15 ml, zwischen 10 ml und 15 ml, zwischen 12 ml und 15 ml oder mehr als 15 ml oder ein Bereich, der durch zwei der vorgenannten definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Innenvolumen des zentralen Bereichs ein Volumen von weniger als 5 ml, zwischen 5 ml und 10 ml, zwischen 5 ml und 20 ml, zwischen 5 ml und 50 ml, zwischen 5 ml und 80 ml, zwischen 5 ml und 100 ml, zwischen 5 ml und 120 ml, zwischen 5 ml und 150 ml, zwischen 10 ml und 150 ml, zwischen 20 ml und 150 ml, zwischen 50 ml und 150 ml, zwischen 80 ml und 150 ml, zwischen 100 ml und 150 ml, zwischen 120 ml und 150 ml oder mehr als 150 ml oder einen Bereich, der durch zwei der vorgenannten definiert ist, umfassen. In einigen Ausführungsformen umfassen die hierin beschriebenen Verfahren und Systeme, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Anordnung oder Sammlung von Durchflusszellenvorrichtungen oder -systemen, die mehrere diskrete Kapillaren, Mikrofluidik-Kanäle, Fluidkanäle, Kammern oder Lumenbereiche umfassen, wobei das kombinierte Innenvolumen einen der innerhalb eines hierin offenbarten Bereichs liegenden Werte darstellt, umfasst oder beinhaltet.
  • Eine oder mehrere Arten von Oligonukleotidprimern können an die Trägeroberfläche angelagert oder gebunden sein. In einigen Fällen können der eine oder die mehreren Arten von Oligonukleotidadaptern oder -primern Spacersequenzen, Adaptersequenzen zur Hybridisierung an Nukleinsäuresequenzen der adapterligierten Matrizenbibliothek, Vorwärtsamplifikationsprimer, Rückwärtsamplifikationsprimer, Sequenzierungsprimer und/oder molekulare Barcodierungssequenzen oder eine beliebige Kombination davon umfassen.
  • Die gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen können in der Länge von etwa 10 Nukleotiden bis etwa 100 Nukleotiden reichen. In einigen Fällen dürfen die gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen nicht mehr als 10, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90 oder mindestens 100 Nukleotide lang sein. In einigen Fällen dürfen die gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20 oder höchstens 10 Nukleotide lang sein. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist, beispielsweise kann in einigen Fällen die Länge der gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen im Bereich von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 80 Nukleotiden liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Länge der gebundenen Oligonukleotidadapter- und/oder Primersequenzen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 24 Nukleotide.
  • Die Anzahl der Beschichtungsschichten und/oder die Materialzusammensetzung jeder Schicht wird so gewählt, dass die resultierende Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern (oder anderen gebundenen Molekülen) auf der beschichteten Kapillarlumenoberfläche eingestellt wird. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern im Bereich von etwa 1.000 Primermolekülen pro pM 2 bis etwa 1.000.000 Primermolekülen pro µm2 liegen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern mindestens 1.000, mindestens 10.000, mindestens 100.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern höchstens 1.000.000, höchstens 100.000, höchstens 10.000 oder höchstens 1.000 Moleküle pro µm2 betragen. Jeder der in diesem Absatz beschriebenen unteren und oberen Werte kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Beispielsweise kann in einigen Fällen die Oberflächendichte von Primern im Bereich von etwa 10.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 100.000 Molekülen pro µm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von Primermolekülen einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben kann, z. B. etwa 455.000 Moleküle pro µm2. In einigen Fällen können die Oberflächeneigenschaften der Kapillar- oder Kanallumenbeschichtung, einschließlich der Oberflächendichte von gebundenen Oligonukleotidprimern, eingestellt werden, um beispielsweise die Spezifität und Effizienz der Festphasennukleinsäurehybridisierung und/oder die Festphasen-Nukleinsäureamplifikationsrate, Spezifität und Effizienz zu optimieren.
  • Kapillarflusszellenpatronen: Hierin werden auch Kapillarflusszellenpatronen offenbart, die eine, zwei oder mehr Kapillaren umfassen können, um unabhängige Flusskanäle zu erzeugen. 2 stellt ein nicht einschränkendes Beispiel einer Kapillarflusszellenpatrone bereit, die zwei Glaskapillaren, Fluidadapter (in diesem Beispiel zwei pro Kapillare) und ein Patronengehäuse umfasst, das mit den Kapillaren und/oder Fluidadaptern zusammenpasst, sodass die Kapillaren in einer festen Ausrichtung relativ zur Patrone gehalten werden. In einigen Fällen können die Fluidadapter in das Patronengehäuse integriert sein. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter umfassen, die mit den Kapillaren und/oder Kapillarfluidadaptern zusammenpassen. In einigen Fällen sind die Kapillaren fest in der Patrone montiert. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so ausgelegt, dass eine oder mehrere Kapillaren der Durchflusszellenpatrone austauschbar entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen kann das Patronengehäuse beispielsweise eine schwenkbare „Clamshell“-Konfiguration aufweisen, die es ermöglicht, es zu öffnen, sodass eine oder mehrere Kapillaren entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so konfiguriert, dass es beispielsweise auf dem Tisch eines Mikroskopsystems oder in einem Patronenhalter eines Instrumentensystems montiert werden kann.
  • Die Kapillarflusszellenpatronen der vorliegenden Offenbarung können eine einzelne Kapillare umfassen. In einigen Fällen können die Kapillarflusszellpatronen der vorliegenden Offenbarung 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr als 20 Kapillaren umfassen. Die eine oder mehreren Kapillaren der Durchflusszellenpatrone können eine der Geometrien, Abmessungen, Materialzusammensetzungen und/oder Beschichtungen aufweisen, wie oben für die Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen beschrieben. In ähnlicher Weise können die Fluidadapter für die einzelnen Kapillaren in der Patrone (typischerweise zwei Fluidadapter pro Kapillare) eine der Geometrien, Abmessungen und Materialzusammensetzungen aufweisen, wie oben für die Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Fluidadapter in einigen Fällen direkt in das Patronengehäuse integriert werden können, wie in 2 dargestellt. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter (d. h. zusätzlich zu den Fluidadaptern) umfassen, die mit den Kapillaren und/oder Fluidadaptern zusammenpassen und dabei helfen, die Kapillaren innerhalb der Patrone zu positionieren. Diese Adapter können unter Verwendung der gleichen Herstellungstechniken und Materialien wie die oben für die Fluidadapter beschriebenen hergestellt werden.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Offenbarung eine erste Oberfläche in einer Ausrichtung umfassen, die im Allgemeinen dem Inneren des Strömungskanals zugewandt ist, wobei die Oberfläche ferner eine Polymerbeschichtung umfassen kann, wie an anderer Stelle hierin offenbart, und wobei die Oberfläche ferner ein oder mehrere Oligonukleotide wie ein Einfangoligonukleotid, ein Adapteroligonukleotid oder ein beliebiges anderes Oligonukleotid, wie hierin offenbart, umfassen kann. In einigen Ausführungsformen können die Vorrichtungen ferner eine zweite Oberfläche in einer Ausrichtung umfassen, die allgemein dem Inneren des Strömungskanals zugewandt ist und ferner allgemein der ersten Oberfläche zugewandt ist oder parallel dazu verläuft, wobei die Oberfläche ferner eine Polymerbeschichtung umfassen kann, wie sie an anderer Stelle hierin offenbart ist, und wobei die Oberfläche ferner ein oder mehrere Oligonukleotide, wie ein Einfangoligonukleotid, ein Adapteroligonukleotid oder ein beliebiges anderes Oligonukleotid, wie hierin offenbart, umfassen kann. In einigen Ausführungsformen kann eine Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung eine erste Oberfläche in einer Ausrichtung umfassen, die im Allgemeinen dem Inneren des Strömungskanals zugewandt ist, eine zweite Oberfläche in einer Ausrichtung, die im Allgemeinen dem Inneren des Strömungskanals zugewandt ist und ferner im Allgemeinen der ersten Oberfläche zugewandt ist oder parallel zu dieser verläuft, eine dritte Oberfläche, die im Allgemeinen dem Inneren eines zweiten Strömungskanals zugewandt ist, und eine vierte Oberfläche, die im Allgemeinen dem Inneren des zweiten Strömungskanals zugewandt ist und im Allgemeinen der dritten Oberfläche gegenüberliegt oder parallel dazu ist; wobei die zweite und die dritte Oberfläche auf einander gegenüberliegenden Seiten eines allgemein planaren Substrats angeordnet oder an diesen angebracht sein können, das ein reflektierendes, transparentes oder durchscheinendes Substrat sein kann. In einigen Ausführungsformen können sich eine Abbildungsfläche oder Abbildungsflächen innerhalb einer Durchflusszelle innerhalb der Mitte einer Durchflusszelle oder innerhalb oder als Teil einer Unterteilung zwischen zwei Untereinheiten oder Unterteilungen einer Durchflusszelle befinden, wobei die Durchflusszelle eine obere Oberfläche und eine untere Oberfläche umfassen kann, von der eine oder beide für einen solchen Nachweismodus transparent sein können, wie er verwendet werden kann; und wobei eine Oberfläche, die Oligonukleotide oder Polynukleotide und/oder eine oder mehrere Polymerbeschichtungen umfasst, innerhalb des Lumens der Durchflusszelle platziert oder angeordnet sein kann. In einigen Ausführungsformen umfassen die oberen und/oder unteren Oberflächen keine gebundenen Oligonukleotide oder Polynukleotide. In einigen Ausführungsformen umfassen die oberen und/oder unteren Oberflächen gebundene Oligonukleotide und/oder Polynukleotide. In einigen Ausführungsformen kann entweder die obere oder die untere Oberfläche gebundene Oligonukleotide und/oder Polynukleotide umfassen. Eine Oberfläche oder Oberflächen, die innerhalb des Lumens einer Strömungszelle positioniert oder angeordnet sind, können auf einer Seite, einer gegenüberliegenden Seite oder beiden Seiten eines allgemein planaren Substrats platziert oder angeordnet sein, das ein reflektierendes, transparentes oder durchscheinendes Substrat sein kann. In einigen Ausführungsformen wird eine optische Vorrichtung, wie sie an anderer Stelle hierin bereitgestellt oder auf andere Weise im Stand der Technik bekannt ist, verwendet, um Bilder einer ersten Oberfläche, einer zweiten Oberfläche, einer dritten Oberfläche, einer vierten Oberfläche, einer Oberfläche, die in dem Lumen einer Strömungszelle angeordnet ist, oder jede andere hierin bereitgestellte Oberfläche, die ein oder mehrere daran gebundene Oligonukleotide oder Polynukleotide enthalten kann, bereitzustellen.
  • Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellenpatronen: Hierin werden auch Mikrofluidik-Kanalflusszellenpatronen offenbart, die mehrere unabhängige Durchflusskanäle können. Ein nicht einschränkendes Beispiel einer Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellenpatrone, die einen Chip mit zwei oder mehr parallelen Glaskanälen, die auf dem Chip ausgebildet sind, Fluidadaptern, die mit dem Chip gekoppelt sind, und ein Patronengehäuse umfasst, das mit dem Chip und/oder Fluidadaptern zusammenpasst, sodass der Chip in einer festen Ausrichtung relativ zur Patrone positioniert ist. In einigen Fällen können die Fluidadapter in das Patronengehäuse integriert sein. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter umfassen, die mit dem Chip und/oder den Fluidadaptern zusammenpassen. In einigen Fällen ist der Chip fest in der Patrone montiert. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so ausgelegt, dass ein oder mehrere Chips der Durchflusszellenpatrone austauschbar entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen kann das Patronengehäuse beispielsweise eine schwenkbare „Clamshell“-Konfiguration aufweisen, die es ermöglicht, es zu öffnen, sodass eine oder mehrere Kapillaren entfernt und ersetzt werden können. In einigen Fällen ist das Patronengehäuse so konfiguriert, dass es beispielsweise auf dem Tisch eines Mikroskopsystems oder in einem Patronenhalter eines Instrumentensystems montiert werden kann. Selbst wenn in dem nicht einschränkenden Beispiel nur ein Chip beschrieben ist, versteht es sich, dass mehr als ein Chip in der Mikrofluidik-Kanalflusszellenpatrone verwendet werden kann
  • Die Durchflusszellenpatronen der vorliegenden Offenbarung können einen einzelnen Mikrofluidik-Chip oder mehrere Mikrofluidik-Chips umfassen. In einigen Fällen können die Durchflusszellenpatronen der vorliegenden Offenbarung 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr als 20 Mikrofluidik-Chips umfassen. In einigen Fällen kann der Mikrofluidik-Chip einen Kanal aufweisen. In einigen Fällen kann der Mikrofluidik-Chip 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr als 20 Kanäle aufweisen. Der eine oder die mehreren Chips der Durchflusszellenpatrone können eine der oben für die einzelnen mikrofluidischen Chip-Durchflusszellenvorrichtungen beschriebenen Geometrien, Abmessungen, Materialzusammensetzungen und/oder Beschichtungen aufweisen. In ähnlicher Weise können die Fluidadapter für den einzelnen Chip in der Patrone (typischerweise zwei Fluidadapter pro Kapillare) eine der Geometrien, Abmessungen und Materialzusammensetzungen aufweisen, wie oben für die Einzelmikrofluidik-Chip-Durchflusszellenvorrichtungen beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Fluidadapter in einigen Fällen direkt in das Patronengehäuse integriert werden können. In einigen Fällen kann die Patrone zusätzliche Adapter (d. h. zusätzlich zu den Fluidadaptern) umfassen, die mit dem Chip und/oder den Fluidadaptern zusammenpassen und dabei helfen, den Chip innerhalb der Patrone zu positionieren. Diese Adapter können unter Verwendung der gleichen Herstellungstechniken und Materialien wie die oben für die Fluidadapter beschriebenen hergestellt werden.
  • Das Patronengehäuse (oder „Gehäuse“) kann aus Metall- und/oder Polymermaterialien wie Aluminium, eloxiertem Aluminium, Polycarbonat (PC), Acryl (PMMA) oder Ultem (PEI) hergestellt sein, während andere Materialien ebenfalls mit der Offenlegung übereinstimmen. Ein Gehäuse kann unter Verwendung von CNC-Bearbeitungs- und/oder Formtechniken hergestellt und so konstruiert werden, dass eine, zwei oder mehr als zwei Kapillaren durch das Gehäuse in einer festen Ausrichtung begrenzt werden, um unabhängige Strömungskanäle zu erzeugen. Die Kapillaren können in dem Gehäuse montiert werden, indem beispielsweise eine Kompressionsanpassung verwendet wird oder indem komprimierbare Adapter aus Silikon oder einem Fluorelastomer zusammengefügt werden. In einigen Fällen werden zwei oder mehr Komponenten des Patronengehäuses (z. B. eine obere und eine untere Hälfte) unter Verwendung von z. B. Schrauben, Clips, Klemmen oder anderen Befestigungselementen zusammengebaut, sodass die beiden Hälften trennbar sind. In einigen Fällen werden zwei oder mehr Komponenten des Patronengehäuses unter Verwendung von beispielsweise Klebstoffen, Lösungsmittelbindung oder Laserschweißen zusammengebaut, sodass die zwei oder mehr Komponenten dauerhaft angebracht sind.
  • Einige Durchflusszellenpatronen der vorliegenden Offenbarung umfassen ferner zusätzliche Komponenten, die in die Patrone integriert sind, um eine verbesserte Leistung für bestimmte Anwendungen bereitzustellen. Beispiele für zusätzliche Komponenten, die in die Patrone integriert werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluidströmungssteuerungskomponenten (z. B. Miniaturventile, Miniaturpumpen, Mischverteiler usw.), Temperatursteuerungskomponenten (z. B. Widerstandsheizelemente, Metallplatten, die als Wärmequellen oder -senken dienen, piezoelektrische (Peltier) Geräte zum Heizen oder Kühlen, Temperatursensoren) oder optische Komponenten (z. B. optische Linsen, Fenster, Filter, Spiegel, Prismen, Glasfasern und/oder Leuchtdioden (LEDs) oder andere Miniaturlichtquellen, die gemeinsam verwendet werden können, um spektroskopische Messungen und/oder die Abbildung eines oder mehrerer Kapillarflusskanäle zu erleichtern).
  • Systeme und Systemkomponenten: Die hierin offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und Durchflusszellenpatronen können als Komponenten von Systemen verwendet werden, die für eine Vielzahl von chemischen Analysen, biochemischen Analysen, Nukleinsäureanalysen, Zellanalysen oder Gewebeanalyseanwendungen ausgelegt sind. Im Allgemeinen können solche Systeme ein oder mehrere Fluidströmungssteuerungsmodule, Temperatursteuerungsmodule, spektroskopische Mess- und/oder Bildgebungsmodule und Prozessoren oder Computer sowie eine oder mehrere der Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen und Kapillarflusszellenpatronen oder die hierin beschriebenen mikrofluidischen Chip-Durchflusszellenvorrichtungen und Durchflusszellenpatronen umfassen.
  • Die hierin offenbarten Systeme können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen umfassen. In einigen Fällen können die Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen entfernbare, austauschbare Komponenten der offenbarten Systeme sein. In einigen Fällen können die Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen Einweg- oder Verbrauchskomponenten der offenbarten Systeme sein. Die hierin offenbarten Systeme können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 einzelne Mikrofluidik-Kanalflusszellenvorrichtungen oder Mikrofluidik-Kanalflusszellenpatronen umfassen. In einigen Fällen können die einzelnen Mikrofluidik-Kanalflusszellenvorrichtungen oder Mikrofluidik-Kanalflusszellenpatronen entfernbare, austauschbare Komponenten der offenbarten Systeme sein. In einigen Fällen können die Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen Einweg- oder Verbrauchskomponenten der offenbarten Systeme sein.
  • 3 zeigt eine Ausführungsform eines einfachen Systems, das eine einzelne Kapillarflusszelle umfasst, die mit verschiedenen Fluidströmungssteuerungskomponenten verbunden ist, wobei die einzelne Kapillare optisch zugänglich und kompatibel mit der Montage auf einem Mikroskoptisch oder in einem kundenspezifischen Bildgebungsinstrument zur Verwendung in verschiedenen Bildgebungsanwendungen ist. Mehrere Reagenzbehälter sind fluidisch mit dem Einlassende der Einzelkapillarflusszellenvorrichtung gekoppelt, wobei das zu einem bestimmten Zeitpunkt durch die Kapillare fließende Reagenz mittels eines programmierbaren Drehventils gesteuert wird, mit dem der Benutzer Zeitpunkt und Dauer des Reagenzstroms steuern kann. In diesem nicht einschränkenden Beispiel wird der Fluidstrom mittels einer programmierbaren Spritzenpumpe gesteuert, die eine präzise Steuerung und zeitliche Steuerung des Fluidvolumenstroms und der Fluidstromgeschwindigkeit ermöglicht.
  • 4 zeigt eine Ausführungsform eines Systems, das eine Kapillarflusszellenpatrone mit integrierten Membranventilen umfasst, um das Totvolumen zu minimieren und bestimmte Schlüsselreagenzien zu schonen. Durch die Integration von Miniatur-Membranventilen in die Patrone kann das Ventil in unmittelbarer Nähe zum Einlass der Kapillare positioniert werden, wodurch das Totvolumen innerhalb der Vorrichtung minimiert und der Verbrauch kostspieliger Reagenzien verringert wird. Die Integration von Ventilen und anderen Fluidsteuerungskomponenten in die Kapillarflusszellenpatrone ermöglicht auch die Integration einer größeren Fluidstromsteuerungsfunktionalität in das Patronendesign.
  • 5 zeigt ein Beispiel eines auf Kapillarflusszellenpatronen basierenden Fluidiksystems, das in Kombination mit einem Mikroskopaufbau verwendet wird, wobei die Patrone eine Temperatursteuerungskomponente wie eine Metallplatte enthält oder mit dieser zusammenpasst, die mit den Kapillaren in der Patrone in Kontakt kommt und als Wärmequelle/- senke dient. Der Mikroskopaufbau besteht aus einem Beleuchtungssystem (z. B. einem Laser, einer LED oder einer Halogenlampe usw. als Lichtquelle), einer Objektivlinse, einem Bildgebungssystem (z. B. einer CMOS- oder CCD-Kamera) und einer Übersetzungsstufe, um die Patrone relativ zum optischen System zu bewegen, wodurch beispielsweise Fluoreszenz- und/oder Hellfeldbilder für verschiedene Bereiche der Kapillarflusszellen aufgenommen werden können, wenn die Stufe bewegt wird.
  • 6 zeigt ein nicht einschränkendes Beispiel für die Temperatursteuerung der Durchflusszellen (z. B. Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanalflusszellen) unter Verwendung einer Metallplatte, die in Kontakt mit der Durchflusszellenpatrone gebracht wird. In einigen Fällen kann die Metallplatte in das Patronengehäuse integriert sein. In einigen Fällen kann die Metallplatte unter Verwendung einer Peltier- oder einer Widerstandsheizung temperaturgesteuert werden.
  • 7 zeigt einen nicht einschränkenden Ansatz zur Temperatursteuerung der Durchflusszellen (z. B. Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanalflusszellen), der einen berührungslosen Wärmesteuerungsmechanismus umfasst. Bei diesem Ansatz wird ein Strom temperaturgesteuerter Luft unter Verwendung eines Lufttemperatursteuersystems durch die Durchflusszellenpatrone (z. B. zu einer Einzelkapillarflusszellenvorrichtung oder einer Mikrofluidik-Kanalflusszellenvorrichtung) geleitet. Das Lufttemperatursteuersystem umfasst einen Wärmetauscher, z. B. eine Widerstandsheizspule, an einer Peltier-Vorrichtung angebrachte Rippen usw., die die Luft erwärmen und/oder kühlen und auf einer konstanten, benutzerdefinierten Temperatur halten können. Das Lufttemperatursteuersystem umfasst auch eine Luftzufuhrvorrichtung, wie beispielsweise einen Ventilator, der den Strom erwärmter oder gekühlter Luft zur Kapillarflusszellenpatrone leitet. In einigen Fällen kann das Lufttemperatursteuersystem auf eine konstante Temperatur T1 eingestellt werden, sodass der Luftstrom und folglich die Strömungszelle oder Patrone (z. B. Kapillarflusszelle oder Mikrofluidik-Kanalflusszelle) auf einer konstanten Temperatur T2 gehalten werden, die in einigen Fällen von der Solltemperatur T1 in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur, Luftströmungsgeschwindigkeit, usw. abweichen kann. In einigen Fällen können zwei oder mehr solche Lufttemperaturkontrollsysteme um die Kapillarflusszellenvorrichtung oder die Patrone eingebaut werden, sodass die Kapillare oder Patrone schnell zwischen mehreren verschiedenen Temperaturen gewechselt werden kann, indem gesteuert wird, welches der Lufttemperaturregelungssysteme zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv ist. Bei einem anderen Ansatz kann die Temperatureinstellung des Lufttemperatursteuersystems variiert werden, sodass die Temperatur der Kapillarflusszelle oder -patrone entsprechend geändert werden kann.
  • Fluidflusssteuerungsmodul: Im Allgemeinen bieten die offenbarten Instrumentensysteme eine Fluidstromsteuerungsfunktion zum Abgeben von Proben oder Reagenzien an eine oder mehrere Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen (z. B. Einzelkapillarflusszellenvorrichtung oder Mikrofluidik-Kanalflusszellenvorrichtung), die mit dem System verbunden sind. Reagenzien und Puffer können in Flaschen, Reagenzien- und Pufferpatronen oder anderen geeigneten Behältern aufbewahrt werden, die über Rohre und Ventilverteiler mit den Einlässen der Durchflusszellen verbunden sind. Die offenbarten Systeme können auch verarbeitete Proben- und Abfallbehälter in Form von Flaschen, Patronen oder anderen geeigneten Behältern zum Sammeln von Flüssigkeiten stromabwärts der Kapillarflusszellenvorrichtungen oder Kapillarflusszellenpatronen umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Fluidstromsteuerungsmodul (oder „Fluidik“-Modul) ein programmierbares Umschalten des Stroms zwischen verschiedenen Quellen, z. B. Proben- oder Reagenzbehältern oder Flaschen, die sich im Instrument befinden, und dem Einlass (den Einlässen) des zentralen Bereichs (z. B. Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanal) bereitstellen. In einigen Ausführungsformen kann das Fluidströmungssteuermodul ein programmierbares Umschalten des Flusses zwischen den Auslässen des zentralen Bereichs (z. B. Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanal) und verschiedenen Sammelstellen bereitstellen, z. B. verarbeiteten Probenbehältern, Abfallbehältern usw., die mit dem System verbunden sind. In einigen Fällen können Proben, Reagenzien und/oder Puffer in Behältern aufbewahrt werden, die in die Durchflusszellenpatrone selbst integriert sind. In einigen Fällen können verarbeitete Proben, verbrauchte Reagenzien und/oder gebrauchte Puffer in Behältern gelagert werden, die in die Durchflusszellenpatrone selbst integriert sind.
  • Die Steuerung des Fluidstroms durch die offenbarten Systeme wird typischerweise unter Verwendung von Pumpen (oder anderen Fluidbetätigungsmechanismen) und Ventilen (z. B. programmierbaren Pumpen und Ventilen) durchgeführt. Beispiele für geeignete Pumpen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Spritzenpumpen, programmierbare Spritzenpumpen, Schlauchpumpen, Membranpumpen und dergleichen. Beispiele für geeignete Ventile umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Rückschlagventile, elektromechanische Zweiwege- oder Dreiwegeventile, pneumatische Zweiwege- und Dreiwegeventile und dergleichen. In einigen Ausführungsformen kann der Fluidstrom durch das System durch Anlegen eines positiven pneumatischen Drucks an einen oder mehrere Einlässe des Reagenz- und Pufferbehälters oder an Einlässe gesteuert werden, die in (eine) Durchflusszellenpatrone(n) eingebaut sind (z. B. Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanalflusszellenpatronen). In einigen Ausführungsformen kann der Fluidstrom durch das System durch Ziehen eines Vakuums an einem oder mehreren Auslässen von Abfallbehältern oder an einem oder mehreren Auslässen, die in Durchflusszellenpatronen (z. B. Kapillar- oder Mikrofluidik-Kanalflusszellenpatronen) eingebaut sind, gesteuert werden.
  • In einigen Fällen werden verschiedene Modi der Fluidstromsteuerung an verschiedenen Punkten in einem Assay- oder Analyseverfahren verwendet, z. B. Vorwärtsfluss (relativ zum Einlass und Auslass für eine bestimmte Kapillarflusszellenvorrichtung), Rückfluss, oszillierender oder pulsierender Fluss oder Kombinationen davon. In einigen Anwendungen kann ein oszillierender oder pulsierender Fluss angewendet werden, beispielsweise während der Wasch- /Spülschritte des Assays, um einen vollständigen und effizienten Austausch von Flüssigkeiten innerhalb der einen oder mehreren Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen (z. B. Einzelkapillarflusszellenvorrichtungen oder -patronen und mikrofluidische Chip-Durchflusszellenvorrichtungen oder -patronen) zu ermöglichen.
  • In ähnlicher Weise können in einigen Fällen unterschiedliche Fluidströme an unterschiedlichen Punkten im Assay- oder Analyseprozess-Workflow verwendet werden, beispielsweise kann in einigen Fällen der Volumenstrom von -100 ml/s bis +100 ml/s variieren. In einigen Ausführungsformen kann der Absolutwert des Volumenstroms mindestens 0,001 ml/s, mindestens 0,01 ml/s, mindestens 0,1 ml/s, mindestens 1 ml/s, mindestens 10 ml/s oder mindestens 100 ml/s betragen. In einigen Ausführungsformen kann der Absolutwert des Volumenstroms höchstens 100 ml/s, höchstens 10 ml/s, höchstens 1 ml/s, höchstens 0,1 ml/s, höchstens 0,01 ml/s oder höchstens 0,001 ml/s betragen. Der Volumenstrom zu einem bestimmten Zeitpunkt kann einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs haben, z. B. einen Vorwärtsstrom von 2,5 ml/s, einen Rückfluss von -0,05 ml/s oder einen Wert von 0 ml/s (d. h. gestoppter Strom).
  • Temperaturregelungsmodul: Wie oben erwähnt, enthalten die offenbarten Systeme in einigen Fällen Temperaturregelungsfunktionen, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Assay- oder Analyseergebnissen zu erleichtern. Beispiele für Temperaturregelungskomponenten, die in das Design des Instrumentensystems (oder der Kapillardurchflusszellenpatrone) eingebaut werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Widerstandsheizelemente, Infrarotlichtquellen, Peltier-Heiz- oder Kühlvorrichtungen, Kühlkörper, Thermistoren, Thermoelemente, und dergleichen. In einigen Fällen kann das Temperatursteuermodul (oder der „Temperaturregler“) eine programmierbare Temperaturänderung zu einer festgelegten, einstellbaren Zeit vor der Durchführung bestimmter Assay- oder Analyseschritte bereitstellen. In einigen Fällen kann der Temperaturregler programmierbare Temperaturänderungen über bestimmte Zeitintervalle bereitstellen. In einigen Ausführungsformen kann der Temperaturregler ferner einen Temperaturwechsel zwischen zwei oder mehr eingestellten Temperaturen mit spezifizierten Frequenz- und Rampenraten vorsehen, sodass ein Wärmezyklus für Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden kann.
  • Spektroskopie- oder Bildgebungsmodule: Wie oben angegeben, umfassen die offenbarten Systeme in einigen Fällen optische Bildgebung oder andere spektroskopische Messfähigkeiten. Beispielsweise kann eine Vielzahl von Bildgebungsmodi implementiert werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder Phosphoreszenzbildgebung. In einigen Ausführungsformen umfasst der zentrale Bereich ein Fenster, durch das mindestens ein Teil des zentralen Bereichs beleuchtet und abgebildet werden kann. In einigen Ausführungsformen umfasst das Kapillarröhrchen ein Fenster, durch das mindestens ein Teil des Kapillarröhrchens beleuchtet und abgebildet werden kann. In einigen Ausführungsformen umfasst der Mikrofluidik-Chip ein Fenster, durch das mindestens ein Teil des Chip-Kanals beleuchtet und abgebildet werden kann.
  • In einigen Ausführungsformen kann eine Einzelwellenlängenanregungs- und Emissionsfluoreszenzbildgebung durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Fluoreszenzbildgebung mit Anregung und Emission mit zwei Wellenlängen (oder Anregung oder Emission mit mehreren Wellenlängen) durchgeführt werden. In einigen Fällen ist das Bildgebungsmodul so konfiguriert, dass Videobilder aufgenommen werden. Die Wahl des Bildgebungsmodus kann sich auf das Design der Durchflusszellenvorrichtungen oder Durchflusszellenpatronen auswirken, da alle oder ein Teil der Kapillaren oder Patronen notwendigerweise über den interessierenden Spektralbereich optisch transparent sein müssen. In einigen Fällen können mehrere Kapillaren innerhalb einer Kapillarflusszellenpatrone in ihrer Gesamtheit innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Ausführungsformen kann nur eine einzelne Kapillare oder eine Teilmenge von Kapillaren innerhalb einer Kapillarflusszellenpatrone oder Teile davon innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Reihe von Bildern „gekachelt“ werden, um ein einzelnes hochauflösendes Bild von einer, zwei, mehreren oder den gesamten mehreren Kapillaren innerhalb einer Patrone zu erzeugen. In einigen Fällen können mehrere Kapillaren innerhalb eines Mikrofluidik-Chips in ihrer Gesamtheit innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Ausführungsformen kann nur ein einzelner Kanal oder eine Teilmenge von Kanälen innerhalb eines Mikrofluidik-Chips oder Teile davon innerhalb eines einzelnen Bildes abgebildet werden. In einigen Ausführungsformen kann eine Reihe von Bildern „gekachelt“ werden, um ein einzelnes hochauflösendes Bild von einer, zwei, mehreren oder den gesamten mehreren Kapillaren oder Mikrofluidik-Kanälen innerhalb einer Patrone zu erzeugen.
  • Ein Spektroskopie- oder Bildgebungsmodul kann beispielsweise ein Mikroskop umfassen, das mit einem CMOS einer CCD-Kamera ausgestattet ist. In einigen Fällen kann das Spektroskopie- oder Bildgebungsmodul beispielsweise ein kundenspezifisches Instrument umfassen, das konfiguriert ist, eine spezifische Spektroskopie- oder Bildgebungstechnik von Interesse durchzuführen. Im Allgemeinen kann die dem Bildgebungsmodul zugeordnete Hardware Lichtquellen, Detektoren und andere optische Komponenten sowie Prozessoren oder Computer umfassen.
  • Lichtquellen: Zur Bereitstellung des Bildgebungs- oder Anregungslichts kann eine Vielzahl von Lichtquellen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wolframlampen, Wolframhalogenlampen, Bogenlampen, Laser, Leuchtdioden (LEDs) oder Laserdioden. In einigen Fällen kann eine Kombination aus einer oder mehreren Lichtquellen und zusätzlichen optischen Komponenten, z. B. Linsen, Filtern, Aperturen, Blenden, Spiegeln und dergleichen, als Beleuchtungssystem (oder Teilsystem) konfiguriert sein.
  • Detektoren: Für Bildgebungszwecke kann eine Vielzahl von Bildsensoren verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Fotodiodenarrays, CCD-Kameras (Charge Coupled Device) oder CMOS-Bildsensoren (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor). Wie hierin verwendet, können „Bildsensoren“ eindimensionale (lineare) oder zweidimensionale Array-Sensoren sein. In vielen Fällen kann eine Kombination aus einem oder mehreren Bildsensoren und zusätzlichen optischen Komponenten, z. B. Linsen, Filtern, Aperturen, Membranen, Spiegeln und dergleichen, als Bildgebungssystem (oder Subsystem) konfiguriert werden. In einigen Fällen, z. B. wenn spektroskopische Messungen vom System anstelle der Bildgebung durchgeführt werden, können geeignete Detektoren Fotodioden, Lawinenphotodioden und Fotovervielfacher umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Andere optische Komponenten: Die Hardwarekomponenten des spektroskopischen Mess- oder Bildgebungsmoduls können auch eine Vielzahl von optischen Komponenten zum Lenken, Formen, Filtern oder Fokussieren von Lichtstrahlen durch das System enthalten. Beispiele für geeignete optische Komponenten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Linsen, Spiegel, Prismen, Aperturen, Beugungsgitter, farbige Glasfilter, Langpassfilter, Kurzpassfilter, Bandpassfilter, Schmalbandinterferenzfilter, Breitbandinterferenzfilter, dichroitisch Reflektoren, optische Fasern, optische Wellenleiter und dergleichen. In einigen Fällen kann die spektroskopische Messung oder das Bildgebungsmodul ferner eine oder mehrere Übersetzungsstufen oder andere Steuerbewegungsmechanismen umfassen, um Kapillarflusszellenvorrichtungen und -patronen relativ zu der Beleuchtung und/oder zu Erkennungs-/Bildgebungsuntersystemen oder umgekehrt zu bewegen.
  • Totalreflexion: In einigen Fällen kann das optische Modul oder Teilsystem so ausgelegt sein, dass es die gesamte oder einen Teil einer optisch transparenten Wand der Kapillaren oder Mikrofluidik-Kanäle in Durchflusszellenvorrichtungen und -patronen als Wellenleiter zur Abgabe von Anregungslicht an das Kapillar- oder Kanallumen über Totalreflexion verwendet. Wenn einfallendes Anregungslicht in einem Winkel zu einer Normalen zur Oberfläche auf die Oberfläche des Kapillar- oder Kanallumens trifft, der größer als der kritische Winkel ist (bestimmt durch die relativen Brechungsindizes des Kapillar- oder Kanalwandmaterials und des in der Kapillare oder dem Kanal enthaltenen wässrigen Puffers), tritt die Totalreflexion an der Oberfläche auf und das Licht breitet sich durch die Kapillare oder Kanalwand entlang der Länge der Kapillare oder des Kanals aus. Die Totalreflexion erzeugt eine evaneszente Welle an der Lumenoberfläche, die über extrem kurze Strecken in das Lumeninnere eindringt und zur selektiven Anregung von Fluorophoren an der Oberfläche verwendet werden kann, z. B. markierten Nukleotide, die von einer Polymerase in ein wachsendes Oligonukleotid durch eine Festphasen-Primerverlängerungsreaktion eingebaut wurden.
  • Bildverarbeitungssoftware: In einigen Fällen kann das System ferner einen Computer (oder Prozessor) und ein computerlesbares Medium umfassen, das Code zum Bereitstellen von Bildverarbeitungs- und Analysefunktionen enthält. Beispiele für Bildverarbeitungs- und Analysefunktionen, die von der Software bereitgestellt werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine manuelle, halbautomatische oder vollautomatische Anpassung der Bildbelichtung (z. B. Weißabgleich, Kontrastanpassung, Signalmittelung und andere Rauschunterdrückungsfunktionen usw.), automatisierte Kantenerkennung und Objektidentifikation (z. B. zur Identifizierung von klonal amplifizierten Clustern fluoreszenzmarkierter Oligonukleotide auf der Lumenoberfläche von Kapillarflusszellenvorrichtungen), automatisierte statistische Analyse (z. B. zur Bestimmung der Anzahl klonal amplifizierte Cluster von Oligonukleotiden, die pro Flächeneinheit der Kapillarlumenoberfläche identifiziert wurden, oder für automatisierte Nukleotidbasendetektion in Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen) und manuelle Messfunktionen (z. B. zum Messen von Abständen zwischen Clustern oder anderen Objekten usw.). Optional können Instrumentensteuerungs- und Bildverarbeitungs-/Analysesoftware als separate Softwaremodule geschrieben werden. In einigen Ausführungsformen können Instrumentensteuerungs- und Bildverarbeitungs-/Analysesoftware in ein integriertes Paket integriert sein.
  • Systemsteuerungssoftware: In einigen Fällen kann das System einen Computer (oder Prozessor) und ein computerlesbares Medium umfassen, das Code zum Bereitstellen einer Benutzeroberfläche sowie eine manuelle, halbautomatische oder vollautomatisierte Steuerung aller Systemfunktionen enthält. z. B. Steuerung des Fluidikmoduls, des Temperatursteuerungsmoduls und/oder des Spektroskopie- oder Bildgebungsmoduls sowie anderer Datenanalyse- und Anzeigeoptionen. Der Systemcomputer oder -prozessor kann eine integrierte Komponente des Systems sein (z. B. ein in das Instrument eingebetteter Mikroprozessor oder eine Hauptplatine) oder kann ein eigenständiges Modul sein, beispielsweise ein Großrechner, ein Personal Computer oder ein Laptoprechner. Beispiele für Fluidsteuerungsfunktionen, die von der Systemsteuerungssoftware bereitgestellt werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluidvolumenströme, Fluidstromgeschwindigkeiten, den Zeitpunkt und die Dauer für die Proben- und Reagenzzugabe, die Pufferzugabe und die Spülschritte. Beispiele für Temperatursteuerungsfunktionen, die von der Systemsteuerungssoftware bereitgestellt werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, das Festlegen von Temperatursollwerten und die Steuerung des Zeitpunkts, der Dauer und der Rampenraten für Temperaturänderungen. Beispiele für spektroskopische Mess- oder Bildsteuerungsfunktionen, die von der Systemsteuerungssoftware bereitgestellt werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Autofokusfähigkeit, Steuerung der Belichtungszeiten und -intensitäten von Beleuchtungs- oder Anregungslicht, Steuerung der Bildaufnahmerate, Belichtungszeit und Datenspeicheroptionen.
  • Prozessoren und Computer: In einigen Fällen können die offenbarten Systeme einen oder mehrere Prozessoren oder Computer umfassen. Der Prozessor kann ein Hardwareprozessor sein, wie beispielsweise eine Zentraleinheit (CPU), eine Grafikverarbeitungseinheit (GPU), eine Allzweckverarbeitungseinheit oder eine Computerplattform. Der Prozessor kann aus einer Vielzahl geeigneter integrierter Schaltungen, Mikroprozessoren, Logikvorrichtungen, feldprogrammierbaren Gate-Arrays (FPGAs) und dergleichen bestehen. In einigen Fällen kann der Prozessor ein Einzelkern- oder Mehrkernprozessor sein, oder es können mehrere Prozessoren für die Parallelverarbeitung konfiguriert sein. Obwohl die Offenbarung unter Bezugnahme auf einen Prozessor beschrieben ist, sind auch andere Arten von integrierten Schaltungen und Logikvorrichtungen anwendbar. Der Prozessor kann jede geeignete Datenoperationsfähigkeit haben. Beispielsweise kann der Prozessor 512-Bit-, 256-Bit-, 128-Bit-, 64-Bit-, 32-Bit- oder 16-Bit-Datenoperationen ausführen.
  • Der Prozessor oder die CPU kann eine Folge von maschinenlesbaren Anweisungen ausführen, die in einem Programm oder einer Software enthalten sein können. Die Anweisungen können an einem Speicherort gespeichert werden. Die Anweisungen können an die CPU gerichtet werden, die anschließend die CPU programmieren oder auf andere Weise konfigurieren können, um beispielsweise die Systemsteuerungsverfahren der vorliegenden Offenbarung zu implementieren. Beispiele für Operationen, die von der CPU ausgeführt werden, können das Abrufen, Dekodieren, Ausführen und Zurückschreiben umfassen.
  • Einige Prozessoren sind eine Verarbeitungseinheit eines Computersystems. Das Computersystem kann eine cloudbasierte Datenspeicherung und/oder -verarbeitung ermöglichen. In einigen Fällen kann das Computersystem mit Hilfe einer Kommunikationsschnittstelle betriebsmäßig mit einem Computernetzwerk („Netzwerk“) gekoppelt sein. Das Netzwerk kann das Internet, ein Intranet und/oder Extranet, ein Intranet und/oder Extranet, das mit dem Internet kommuniziert, oder ein lokales Netzwerk (LAN) sein. Das Netzwerk ist in einigen Fällen ein Telekommunikations- und/oder Datennetz. Das Netzwerk kann einen oder mehrere Computerserver enthalten, die verteiltes Rechnen ermöglichen können, wie beispielsweise Cloud-basiertes Rechnen.
  • Das Computersystem kann auch Computerspeicher oder Speicherorte (z. B. Direktzugriffsspeicher, Nur-Lese-Speicher, Flash-Speicher), elektronische Speichereinheiten (z. B. Festplatte), Kommunikationsschnittstellen (z. B. Netzwerkadapter) zur Kommunikation mit einem oder mehreren anderen Systemen sowie Peripheriegeräte wie Cache, andere Speichereinheiten, Datenspeichereinheiten und/oder elektronische Anzeigeadapter enthalten. In einigen Fällen kann die Kommunikationsschnittstelle ermöglichen, dass der Computer mit einem oder mehreren zusätzlichen Geräten kommuniziert. Der Computer kann möglicherweise Eingabedaten von den gekoppelten Geräten zur Analyse empfangen. Arbeitsspeichereinheiten, Speichereinheiten, Kommunikationsschnittstellen und Peripheriegeräte können über einen Kommunikationsbus (durchgezogene Linien) mit dem Prozessor oder der CPU in Verbindung stehen, wie sie in ein Motherboard integriert sein können. Eine Arbeitsspeicher- oder Speichereinheit kann eine Datenspeichereinheit (oder ein Datenrepository) zum Speichern von Daten sein. Die Arbeitsspeicher- oder Speichereinheiten können Dateien wie Treiber, Bibliotheken und gespeicherte Programme speichern. Die Arbeitsspeicher- oder Speichereinheiten können Benutzerdaten speichern, z. B. Benutzereinstellungen und Benutzerprogramme.
  • Die hierin beschriebenen Systemsteuerungs-, Bildverarbeitungs- und/oder Datenanalyseverfahren können durch maschinenausführbaren Code implementiert werden, der in einem elektronischen Speicherort des Computersystems gespeichert ist, wie beispielsweise in dem Arbeitsspeicher oder der elektronischen Speichereinheit. Der maschinenausführbare oder maschinenlesbare Code kann in Form von Software bereitgestellt werden. Während der Verwendung kann der Code vom Prozessor ausgeführt werden. In einigen Fällen kann der Code von der Speichereinheit abgerufen und im Arbeitsspeicher gespeichert werden, damit der Prozessor darauf zugreifen kann. In einigen Situationen kann die elektronische Speichereinheit ausgeschlossen werden, und maschinenausführbare Anweisungen werden im Arbeitsspeicher gespeichert.
  • In einigen Fällen kann der Code vorkompiliert und für die Verwendung mit einer Maschine konfiguriert sein, deren Prozessor zur Ausführung des Codes angepasst ist. In einigen Fällen kann der Code während der Laufzeit kompiliert werden. Der Code kann in einer Programmiersprache bereitgestellt werden, die ausgewählt werden kann, damit der Code vorkompiliert oder wie kompiliert ausgeführt werden kann.
  • Einige Aspekte der hierin bereitgestellten Systeme und Verfahren können in Software enthalten sein. Verschiedene Aspekte der Technologie können als „Produkte“ oder „Herstellungsgegenstände“ betrachtet werden, typischerweise in Form von ausführbarem Code der Maschine (oder des Prozessors) und/oder zugehörigen Daten, die auf einer Art von maschinenlesbarem Medium übertragen oder in diesem verkörpert sind. Maschinenausführbarer Code kann auf einer elektronischen Speichereinheit wie einem Arbeitsspeicher (z. B. Nur-Lese-Speicher, Direktzugriffsspeicher, Flash-Speicher) oder einer Festplatte gespeichert werden. Medien vom Typ „Speicher“ können einen oder den gesamten materiellen Speicher der Computer, Prozessoren oder dergleichen oder zugehörige Module davon umfassen, wie verschiedene Halbleiterspeicher, Bandlaufwerke, Plattenlaufwerke und dergleichen, die jederzeit einen nichtflüchtigen Speicher für die Softwareprogrammierung bereitstellen können. Die gesamte oder Teile der Software können manchmal über das Internet oder verschiedene andere Telekommunikationsnetze kommuniziert werden. Eine solche Kommunikation kann beispielsweise das Laden der Software von einem Computer oder Prozessor auf einen anderen ermöglichen, beispielsweise von einem Verwaltungsserver oder Hostcomputer auf die Computerplattform eines Anwendungsservers. Somit umfasst ein anderer Medientyp, der die Softwareelemente tragen kann, optische, elektrische und elektromagnetische Wellen, wie sie über physikalische Schnittstellen zwischen lokalen Geräten, über drahtgebundene und optische Festnetznetze und über verschiedene Luftverbindungen verwendet werden. Die physischen Elemente, die solche Wellen tragen, wie drahtgebundene oder drahtlose Verbindungen, optische Verbindungen oder dergleichen, können auch als Medien betrachtet werden, die die Software tragen. Wie hierin verwendet, beziehen sich Begriffe wie „lesbares Medium“ für Computer oder Maschinen, sofern sie nicht auf nichtflüchtige, materielle „Speichermedien“ beschränkt sind, auf jedes Medium, das an der Bereitstellung von Anweisungen für einen Prozessor zur Ausführung beteiligt ist.
  • In einigen Fällen können die Systemsteuerungs-, Bildverarbeitungs- und/oder Datenanalyseverfahren der vorliegenden Offenbarung mittels eines oder mehrerer Algorithmen implementiert werden. Ein Algorithmus kann mittels Software bei Ausführung durch die Zentraleinheit implementiert werden.
  • Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen: Die Nukleinsäuresequenzierung liefert ein nicht einschränkendes Beispiel für eine Anwendung für die offenbarten Durchflusszellenvorrichtungen und -patronen (z. B. Kapillardurchflusszellen- oder Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellenvorrichtungen und -patronen). Viele Sequenzierungstechnologien der zweiten und der dritten Generation verwenden einen massiv parallelen, zyklischen Array-Ansatz für die Sequenzierung durch Synthese (SBS), bei dem sich eine genaue Decodierung einer an einen festen Träger gebundenen einzelsträngigen Template-Oligonukleotidsequenz auf das erfolgreiche Klassifizieren von Signalen, die sich aus der schrittweisen Addition von A-, G-, C- und T-Nukleotiden durch eine Polymerase an einen komplementären Oligonukleotidstrang ergeben, stützt. Diese Verfahren erfordern typischerweise, dass die Oligonukleotid-Matrize mit einer bekannten Adaptersequenz fester Länge modifiziert wird, die an einem festen Träger (z. B. der/den Lumenoberfläche(n) der offenbarten Kapillar- oder Mikrofluidik-Chip-Durchflusszellenvorrichtungen und -patronen) in zufälliger oder strukturierter Anordnung durch Hybridisierung an oberflächengebundene Sonden bekannter Sequenz angebracht ist, die zu jener der Adaptersequenz komplementär ist, und anschließend durch eine zyklische Reihe von Primerverlängerungsreaktionen mit einfacher Basenaddition, die z. B. fluoreszenzmarkierte Nukleotide verwenden, um die Sequenz von Basen in den Matrizen-Oligonukleotiden zu identifizieren, untersucht wird. Diese Prozesse erfordern daher die Verwendung miniaturisierter Fluidiksysteme, die eine präzise, reproduzierbare Kontrolle des Zeitpunkts der Reagenzieneinführung in die Durchflusszelle, in der die Sequenzierungsreaktionen durchgeführt werden, und kleine Volumina bieten, um den Verbrauch kostspieliger Reagenzien zu minimieren.
  • Bestehende im Handel erhältliche NGS-Durchflusszellen bestehen aus Glasschichten, die mit anderen Verfahren geätzt, geläppt und/oder verarbeitet wurden, um die engen Maßtoleranzen zu erfüllen, die für die Bildgebung, Kühlung und/oder andere Anforderungen erforderlich sind. Wenn Durchflusszellen als Verbrauchsmaterialien verwendet werden, führen die für ihre Herstellung erforderlichen kostspieligen Herstellungsprozesse zu Kosten pro Sequenzierungslauf, die zu hoch sind, um die Sequenzierung Wissenschaftlern und Medizinern im Forschungs- und klinischen Bereich routinemäßig zugänglich zu machen.
  • Diese Offenbarung stellt eine kostengünstige Durchflusszellenarchitektur bereit, die kostengünstige Glas- oder Polymerkapillaren oder Mikrofluidik-Kanäle, Fluidik-Adapter und Patronengehäuse umfasst. Die Verwendung von Glas- oder Polymerkapillaren, die in ihrer endgültigen Querschnittsgeometrie extrudiert werden, macht mehrere hochpräzise und kostspielige Glasherstellungsprozesse überflüssig. Das robuste Einschränken der Ausrichtung der Kapillaren oder Kanäle und das Bereitstellen bequemer Fluidverbindungen unter Verwendung von geformten Kunststoff- und/oder Elastomerkomponenten reduziert die Kosten weiter. Das Laserbonding der Komponenten des Polymerpatronengehäuses bietet ein schnelles und effizientes Mittel zum Abdichten der Kapillare oder der Mikrofluidik-Kanäle und zum strukturellen Stabilisieren der Kapillaren oder Kanäle und der Durchflusszellenpatrone, ohne dass Befestigungselemente oder Klebstoffe erforderlich sind.
  • Anwendungen von Durchflusszellenvorrichtungen und -systemen: Die hierin beschriebenen Durchflusszellenvorrichtungen und -systeme können in einer Vielzahl von Anwendungen wie der Sequenzanalyse verwendet werden, um die effiziente Verwendung der kostspieligen Reagenzien zu verbessern. Beispielsweise kann ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäureprobe und einer zweiten Nukleinsäureprobe das Abgeben mehrerer Oligonukleotide an eine Innenfläche einer zumindest teilweise transparenten Kammer; das Abgeben einer ersten Nukleinsäureprobe an die Innenfläche; das Abgeben mehrerer unspezifischer Reagenzien durch einen ersten Kanal an die Innenfläche; das Abgeben eines spezifischen Reagenzes durch einen zweiten Kanal an die Innenfläche, wobei der zweite Kanal ein geringeres Volumen als der erste Kanal aufweist; das Visualieren einer Sequenzierungsreaktion auf der Innenfläche der zumindest teilweise transparenten Kammer; und das Ersetzen der zumindest teilweise transparenten Kammer vor einer zweiten Sequenzierungsreaktion umfassen. In einigen Aspekten fließt ein Luftstrom an einer Außenfläche der zumindest teilweise transparenten Oberfläche vorbei. In einigen Aspekten kann das beschriebene Verfahren das Auswählen der mehreren Oligonukleotide umfassen, um ein eukaryotisches Genom zu sequenzieren. In einigen Aspekten kann das beschriebene Verfahren das Auswählen eines vorgefertigten Schlauchs als zumindest teilweise transparente Kammer umfassen. In einigen Aspekten kann das beschriebene Verfahren das Auswählen der mehreren Oligonukleotide umfassen, um ein prokaryotisches Genom zu sequenzieren. In einigen Aspekten kann das beschriebene Verfahren das Auswählen der mehreren Oligonukleotide umfassen, um ein Transkriptom zu sequenzieren. In einigen Aspekten kann das beschriebene Verfahren das Auswählen eines Kapillarröhrchens als zumindest teilweise transparente Kammer umfassen. In einigen Aspekten kann das beschriebene Verfahren das Auswählen eines Mikrofluidik-Chips als zumindest teilweise transparente Kammer umfassen.
  • Die beschriebenen Vorrichtungen und Systeme können auch in einem Verfahren zum Reduzieren eines in einer Sequenzierungsreaktion verwendeten Reagenzes verwendet werden, umfassend: Bereitstellen eines ersten Reagenzes in einem ersten Behälter; Bereitstellen eines zweiten Reagenzes in einem ersten zweiten Behälter, wobei jeder des ersten Behälters und des zweiten Behälters fluidisch an einen zentralen Bereich gekoppelt ist und wobei der zentrale Bereich eine Oberfläche für die Sequenzierungsreaktion umfasst; und sequentielles Einführen des ersten Reagenzes und des zweiten Reagenzes in einen zentralen Bereich der Durchflusszellenvorrichtung, wobei das Volumen des ersten Reagenzes, das vom ersten Behälter zum Einlass des zentralen Bereichs fließt, geringer ist als das Volumen des zweiten Reagenzes, das aus dem zweiten Behälter zum zentralen Bereich fließt.
  • Eine zusätzliche Verwendung der beschriebenen Vorrichtungen und Systeme ist ein Verfahren zum Erhöhen der effizienten Verwendung eines Reagenzes in einer Sequenzierungsreaktion, umfassend: Bereitstellen eines ersten Reagenzes in einem ersten Behälter; Bereitstellen eines zweiten Reagenzes in einem ersten zweiten Behälter, wobei jeder des ersten Behälters und des zweiten Behälters fluidisch an einen zentralen Bereich gekoppelt ist und wobei der zentrale Bereich eine Oberfläche für die Sequenzierungsreaktion umfasst; und Halten des Volumens des ersten Reagenzes, das vom ersten Behälter zum Einlass des zentralen Bereichs fließt, sodass es kleiner ist als das Volumen des zweiten Reagenzes, das vom zweiten Behälter zum zentralen Bereich fließt.
  • Im Allgemeinen ist das erste Reagenz teurer als das zweite Mittel. In einigen Aspekten ist das erste Reagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Polymerase, einem Nukleotid und einem Nukleotidanalogon.
  • Verfahren zum Herstellen des Mikrofluidik-Chips: Der Mikrofluidik-Chip kann durch eine Kombination von Mikrobearbeitungsverfahren hergestellt werden. Das hierin beschriebene Verfahren zum Herstellen des Mikrofluidik-Chips umfasst das Bereitstellen einer Oberfläche; und Bilden mindestens eines Kanals auf der Oberfläche. Das Herstellungsverfahren kann auch das Bereitstellen eines ersten Substrats, das mindestens eine erste planare Oberfläche aufweist, wobei die erste Oberfläche mehrere Kanäle aufweist; das Bereitstellen eines zweiten Substrats mit mindestens einer zweiten planaren Oberfläche; und das Binden der ersten planaren Oberfläche des ersten Substrats an die zweite planare Oberfläche des zweiten Substrats umfassen. In einigen Fällen haben die Kanäle auf der ersten Oberfläche eine offene Oberseite und eine geschlossene Unterseite, und die zweite Oberfläche ist durch die Unterseite der Kanäle mit der ersten Oberfläche verbunden und lässt daher die offene Oberseite der Kanäle unberührt. In einigen Fällen umfasst das hierin beschriebene Verfahren ferner das Bereitstellen eines dritten Substrats mit einer dritten planaren Oberfläche und das Verbinden der dritten Oberfläche mit der ersten Oberfläche durch die offene Oberseite der Kanäle. Die Bindungsbedingungen können beispielsweise das Erhitzen der Substrate oder das Aufbringen eines Klebstoffs auf eine der planaren Oberflächen des ersten oder des zweiten Substrats umfassen.
  • Da die Vorrichtungen mikrobearbeitet sind, werden Substratmaterialien typischerweise auf der Grundlage ihrer Kompatibilität mit bekannten Mikrobearbeitungstechniken ausgewählt, z. B. Fotolithografie, nasschemischem Ätzen, Laserablation, Laserbestrahlung, Luftabriebtechniken, Spritzgießen, Prägen und anderen Techniken. Die Substratmaterialien werden im Allgemeinen auch aufgrund ihrer Verträglichkeit mit dem gesamten Bereich von Bedingungen ausgewählt, denen die Mikrofluidikvorrichtungen ausgesetzt sein können, einschließlich extremer pH-Werte, Temperaturen, Salzkonzentrationen und Anlegen von Beleuchtung oder elektrischen Feldern. Dementsprechend kann das Substratmaterial in einigen bevorzugten Aspekten Substrate auf Siliziumdioxidbasis umfassen, wie Borosilikatglas, Quarz sowie andere Substratmaterialien.
  • In zusätzlichen bevorzugten Aspekten umfassen die Substratmaterialien polymere Materialien, z. B. Kunststoffe wie Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (TEFLON™), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon und dergleichen. Solche polymeren Substrate werden leicht unter Verwendung verfügbarer Mikrobearbeitungstechniken, wie oben beschrieben, oder aus mikrobearbeiteten Mastern unter Verwendung bekannter Formtechniken wie Spritzgießen, Prägen oder Stanzen oder durch Polymerisieren des polymeren Vorläufermaterials innerhalb der Form hergestellt (siehe US-Pat. Nr. 5.512.131 ). Solche polymeren Substratmaterialien werden wegen ihrer einfachen Herstellung, geringen Kosten und Verfügbarkeit sowie ihrer allgemeinen Inertheit gegenüber extremsten Reaktionsbedingungen bevorzugt. Wiederum können diese Polymermaterialien behandelte Oberflächen enthalten, z. B. derivatisierte oder beschichtete Oberflächen, um ihre Nützlichkeit im Mikrofluidsystem zu verbessern, z. B. um eine verbesserte Fluidrichtung bereitzustellen.
  • Die Kanäle und/oder Kammern der Mikrofluidikvorrichtungen werden typischerweise in der oberen Oberfläche des ersten Substrats als mikroskalige Kanäle (z. B. Rillen, Vertiefungen) unter Verwendung der oben beschriebenen Mikrobearbeitungstechniken hergestellt. Das erste Substrat umfasst eine Oberseite mit einer ersten planaren Oberfläche und eine Unterseite. In den Mikrofluidikvorrichtungen, die gemäß den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, sind mehrere Kanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) auf der ersten planaren Oberfläche gebildet. In einigen Fällen haben die in der ersten planaren Oberfläche (vor dem Hinzufügen eines zweiten Substrats) gebildeten Kanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) Boden- und Seitenwände, wobei die Oberseite offen bleibt. In einigen Fällen haben die Kanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) in der ersten planaren Oberfläche (vor dem Hinzufügen eines zweiten Substrats) Boden- und Seitenwände und die Oberseite bleibt geschlossen. In einigen Fällen haben die Kanäle (z. B. Rillen und/oder Vertiefungen) in den ersten planaren Oberflächen (vor dem Hinzufügen eines zweiten Substrats) nur Seitenwände und keine obere oder untere Fläche.
  • Wenn die erste planare Oberfläche des ersten Substrats in Kontakt mit der planaren Oberfläche des zweiten Substrats gebracht und mit dieser verbunden wird, kann das zweite Substrat die Rillen und/oder Vertiefungen in der Oberfläche des ersten Substrats bedecken und/oder abdichten, um die Kanäle und/oder Kammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung an der Schnittstelle dieser beiden Komponenten zu bilden.
  • Nachdem das erste Substrat mit einem zweiten Substrat verbunden ist, kann die Struktur weiter mit einem dritten Substrat in Kontakt gebracht und mit diesem verbunden werden. Das dritte Substrat kann in Kontakt mit der Seite des ersten Substrats gebracht werden, die nicht mit dem zweiten Substrat in Kontakt steht. In einigen Ausführungsformen ist das erste Substrat zwischen dem zweiten Substrat und dem dritten Substrat angeordnet. In einigen Ausführungsformen können das zweite Substrat und das dritte Substrat die Rillen, Vertiefungen oder Öffnungen auf dem ersten Substrat bedecken und/oder abdichten, um die Kanäle und/oder Kammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung an der Grenzfläche dieser Komponenten zu bilden.
  • Die Vorrichtung kann Öffnungen aufweisen, die so ausgerichtet sind, dass sie mit mindestens einem der Kanäle und/oder Kammern in Verbindung stehen, die im inneren Teil der Vorrichtung aus den Rillen oder Vertiefungen gebildet sind. In einigen Ausführungsformen sind die Öffnungen auf dem ersten Substrat ausgebildet. In einigen Ausführungsformen sind die Öffnungen auf dem ersten und dem zweiten Substrat ausgebildet. In einigen Ausführungsformen sind die Öffnungen auf dem ersten, dem zweiten und dem dritten Substrat ausgebildet. In einigen Ausführungsformen sind die Öffnungen an der Oberseite der Vorrichtung positioniert. In einigen Ausführungsformen sind die Öffnungen an der Unterseite der Vorrichtung positioniert. In einigen Ausführungsformen sind die Öffnungen am ersten und/oder am zweiten Ende der Vorrichtung positioniert und die Kanäle verlaufen entlang der Richtung vom ersten Ende zum zweiten Ende.
  • Die Bedingungen, unter denen Substrate miteinander verbunden werden können, sind allgemein bekannt, und eine solche Bindung von Substraten wird im Allgemeinen durch eine Reihe von Verfahren durchgeführt, die in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Substratmaterialien variieren können. Beispielsweise kann eine thermische Bindung von Substraten auf eine Anzahl von Substratmaterialien angewendet werden, einschließlich z. B. Substrate auf Glas- oder Siliziumdioxidbasis sowie Substrate auf Polymerbasis. Ein solches thermisches Verbinden umfasst typischerweise das Zusammenfügen der zu verbindenden Substrate unter Bedingungen erhöhter Temperatur und in einigen Fällen unter Anwendung von äußerem Druck. Die genauen Temperaturen und Drücke variieren im Allgemeinen in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Substratmaterialien.
  • Beispielsweise wird für Substratmaterialien auf Siliziumdioxidbasis, d. h. Glas (Borosilikatglas, Pyrex™, Kalknatronglas usw.), Quarz und dergleichen, die thermische Bindung von Substraten typischerweise bei Temperaturen im Bereich von etwa 500 °C bis etwa 1400 °C und vorzugsweise von etwa 500 °C bis etwa 1200 °C durchgeführt. Beispielsweise wird Kalknatronglas typischerweise bei Temperaturen um 550 °C gebunden, während Borosilikatglas typischerweise bei oder nahe 800 °C thermisch gebunden wird Andererseits werden Quarzsubstrate typischerweise bei Temperaturen bei oder nahe 1200 °C thermisch gebunden. Diese Bindungstemperaturen werden typischerweise erreicht, indem die zu verbindenden Substrate in Hochtemperaturglühöfen platziert werden.
  • Polymersubstrate, die thermisch gebunden sind, verwenden andererseits typischerweise niedrigere Temperaturen und/oder Drücke als Substrate auf Siliziumdioxidbasis, um ein übermäßiges Schmelzen der Substrate und/oder eine Verformung zu verhindern, z. B. ein Abflachen des inneren Teils der Vorrichtung, d. h. der Kanäle oder Kammern. Im Allgemeinen variieren solche erhöhten Temperaturen zum Binden von Polymersubstraten in Abhängigkeit von dem verwendeten Polymermaterial von etwa 80 °C bis etwa 200 °C und liegen vorzugsweise zwischen etwa 90 °C und 150 °C. Aufgrund der deutlich reduzierten Temperaturen, die zum Verbinden von polymeren Substraten erforderlich sind, kann ein solches Verbinden typischerweise ohne die Notwendigkeit von Hochtemperaturöfen durchgeführt werden, wie sie beim Verbinden von Substraten auf Siliziumdioxidbasis verwendet werden. Dies ermöglicht den Einbau einer Wärmequelle in ein einzelnes integriertes Verbindungssystem, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
  • Klebstoffe können auch verwendet werden, um Substrate nach bekannten Verfahren miteinander zu verbinden, die typischerweise das Aufbringen einer Klebstoffschicht zwischen den zu verbindenden Substraten und das Zusammenpressen dieser Substrate bis zum Aushärten des Klebstoffs umfassen. Eine Vielzahl von Klebstoffen kann gemäß diesen Verfahren verwendet werden, einschließlich z. B. UV-härtbarer Klebstoffe, die im Handel erhältlich sind. Alternative Verfahren können auch verwendet werden, um Substrate gemäß der vorliegenden Erfindung miteinander zu verbinden, einschließlich z. B. akustisches oder Ultraschallschweißen und/oder Lösungsmittelschweißen von Polymerteilen.
  • Typischerweise wird eine Anzahl der beschriebenen Mikrofluidik-Chips oder - Vorrichtungen gleichzeitig hergestellt. Beispielsweise können polymere Substrate in großen trennbaren Folien gestanzt oder geformt werden, die zusammengefügt und miteinander verbunden werden können. Einzelne Vorrichtungen oder gebundene Substrate können dann von der größeren Folie getrennt werden. In ähnlicher Weise können für Substrate auf Siliziumdioxidbasis einzelne Vorrichtungen aus größeren Substratwafern oder -platten hergestellt werden, was einen höheren Durchsatz des Herstellungsprozesses ermöglicht. Insbesondere kann eine Anzahl von Kanalstrukturen zu einem ersten Substratwafer oder einer ersten Substratplatte hergestellt werden, die dann mit einem zweiten Substratwafer oder einer zweiten Substratplatte und gegebenenfalls weiter mit einem dritten Substratwafer oder einer dritten Substratplatte überlagert werden. Die resultierenden Mehrfachvorrichtungen werden dann unter Verwendung bekannter Verfahren wie Sägen, Ritzen und Brechen und dergleichen von den größeren Substraten segmentiert.
  • Wie oben erwähnt, wird das obere oder zweite Substrat auf das untere oder erste Substrat gelegt, um die verschiedenen Kanäle und Kammern abzudichten. Bei der Durchführung des Verbindungsverfahrens gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Verbinden des ersten und des zweiten Substrats unter Verwendung von Vakuum durchgeführt, um die zwei Substratoberflächen in optimalem Kontakt zu halten. Insbesondere kann das untere Substrat in optimalem Kontakt mit dem oberen Substrat gehalten werden, indem die planare Oberfläche des unteren Substrats mit der planaren Oberfläche des oberen Substrats verbunden wird und ein Vakuum durch die Löcher angelegt wird, die durch das obere Substrat angeordnet sind. Typischerweise wird das Anlegen eines Vakuums an die Löcher im oberen Substrat durchgeführt, indem das obere Substrat auf ein Vakuumfutter gelegt wird, das typischerweise einen Montagetisch oder eine Oberfläche mit einer integrierten Vakuumquelle umfasst. Im Fall von Substraten auf Siliziumdioxidbasis werden die gebundenen Substrate erhöhten Temperaturen ausgesetzt, um eine anfängliche Bindung herzustellen, sodass die gebundenen Substrate dann in den Glühofen überführt werden können, ohne sich relativ zueinander zu verschieben.
  • Alternative Bindungssysteme zum Einbau in die hierin beschriebene Vorrichtung umfassen z. B. Klebstoffabgabesysteme zum Aufbringen von Klebstoffschichten zwischen den beiden planaren Oberflächen der Substrate. Dies kann erreicht werden, indem die Klebstoffschicht vor dem Zusammenfügen der Substrate aufgetragen wird oder indem eine Menge des Klebstoffs an einer Kante der angrenzenden Substrate platziert wird und die Dochtwirkung der beiden zusammengefügten Substrate den Klebstoff über den Raum zwischen den zwei Substraten ziehen lässt.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann das gesamte Verbindungssystem automatisierbare Systeme umfassen, um das obere und das untere Substrat auf der Montagefläche zu platzieren und sie für das nachfolgende Verbinden auszurichten. Typischerweise umfassen solche Systeme Übersetzungssysteme zum Bewegen entweder der Montagefläche oder eines oder mehrerer des oberen und des unteren Substrats relativ zueinander. Beispielsweise können Robotersysteme verwendet werden, um jedes des oberen und des unteren Substrats nacheinander auf den Montagetisch und innerhalb der Ausrichtungsstrukturen anzuheben, zu verschieben und zu platzieren. Nach dem Verbindungsprozess können solche Systeme auch das fertige Produkt von der Montagefläche entfernen und diese zusammengefügten Substrate auf einen nachfolgenden Vorgang übertragen, z. B. einen Trennvorgang, einen Glühofen für Substrate auf Siliziumdioxidbasis usw., bevor zusätzliche Substrate darauf zum Verbinden platziert werden.
  • In einigen Fällen umfasst das Herstellen des Mikrofluidik-Chips das Schichten oder Laminieren von zwei oder mehr Schichten von Substraten, um den Chip herzustellen. Beispielsweise werden in Mikrofluidikvorrichtungen die Mikrofluidikelemente der Vorrichtung typischerweise durch Laserbestrahlung, Ätzen oder anderweitiges Einarbeiten von Merkmalen in die Oberfläche eines ersten Substrats hergestellt. Ein zweites Substrat wird dann laminiert oder mit der Oberfläche des ersten verbunden, um diese Merkmale abzudichten und die Fluidelemente der Vorrichtung bereitzustellen, z. B. die Fluidkanäle.
  • BEISPIELE
  • Diese Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen den Umfang der hierin bereitgestellten Patentansprüche nicht einschränken.
  • Beispiel 1.
  • Nukleinsäurecluster wurden innerhalb einer Kapillare etabliert und einer Fluoreszenzbildgebung unterzogen. Für den Test wurde eine Fließvorrichtung mit einem Kapillarröhrchen verwendet. Die resultierenden Clusterbilder wurden in 8 dargestellt. Die Figur zeigte, dass Cluster innerhalb des Lumens eines Kapillarsystems, wie hierin offenbart, zuverlässig verstärkt und sichtbar gemacht werden können.
  • Beispiel 2.
  • Die Durchflusszellenvorrichtung kann aus einer, zwei oder drei Glasschichten unter Verwendung eines der in 9 gezeigten Schritte aufgebaut werden. In 9 können die Durchflusszellenvorrichtungen aus einer, zwei oder drei Schichten von Gläsern bestehen. Die Gläser können entweder Quarz- oder Borosilikatglas sein. 9A-9C zeigen die Verfahren, um solche Vorrichtungen auf Waferebene mit Technologien wie fokussierter Femtosekundenlaserstrahlung (1 Stück) und/oder Laser-Glasbonding (2- oder 3-teilige Konstruktion) herzustellen.
  • In 9A wird die erste Waferschicht mit einem Laser (z. B. Femtosekundenlaserstrahlung) bearbeitet, um das Wafermaterial abzutragen und eine strukturierte Oberfläche bereitzustellen. Die strukturierte Oberfläche kann eine Vielzahl von Kanälen auf der Oberfläche sein, beispielsweise 12 Kanäle pro Wafer. Der Wafer hat einen Durchmesser von 210 mm. Der verarbeitete Wafer kann dann auf eine Trägerplatte gelegt werden, um Kanäle zu bilden, die verwendet werden können, um den Fluidstrom durch eine bestimmte Richtung zu lenken.
  • In 9B kann die erste Waferschicht mit einer strukturierten Oberfläche in Kontakt mit einer zweiten Waferschicht gebracht und mit dieser verbunden werden. Das Verbinden kann mit einer Laser-Glasbonding-Technologie durchgeführt werden. Die zweite Schicht kann die Rillen, Vertiefungen oder Öffnungen auf dem Wafer mit der strukturierten Oberfläche bedecken und/oder abdichten, um die Kanäle und/oder Kammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung an der Grenzfläche dieser Komponenten zu bilden. Die verbundene Struktur mit zwei Waferschichten kann dann auf eine Trägerplatte gelegt werden. Die strukturierte Oberfläche kann eine Vielzahl von Kanälen auf der Oberfläche sein, beispielsweise 12 Kanäle pro Wafer. Der Wafer kann einen Durchmesser von 210 mm haben.
  • In 9C kann die erste Waferschicht mit einer strukturierten Oberfläche auf einer Seite mit einer zweiten Waferschicht in Kontakt gebracht und mit dieser verbunden werden, und eine dritte Waferschicht kann auf der anderen Seite mit der ersten Waferschicht verbunden werden, sodass die erste Schicht des Wafers zwischen der zweiten und der dritten Schicht des Wafers positioniert ist. Das Verbinden kann mit einer Laser-Glasbonding-Technologie durchgeführt werden. Die zweite Schicht und die dritte Schicht von Wafern können die Rillen, Vertiefungen oder Öffnungen auf dem Wafer mit der strukturierten Oberfläche bedecken und/oder abdichten, um die Kanäle und/oder Kammern (z. B. den inneren Teil) der Vorrichtung zu bilden. Die verbundene Struktur mit drei Waferschichten kann dann auf eine Trägerplatte gelegt werden. Die strukturierte Oberfläche kann eine Vielzahl von Kanälen auf der Oberfläche sein, beispielsweise 12 Kanäle pro Wafer. Der Wafer kann einen Durchmesser von 210 mm haben.
  • Beispiel 3.
  • 10A zeigt eine einteilige Durchflusszellenkonstruktion aus Glas. Bei dieser Konstruktion können Strömungskanäle und Einlass-Auslass-Löcher unter Verwendung eines fokussierten Femtosekunden-Laserstrahlungsverfahrens hergestellt werden. Es gibt zwei Kanäle/Spuren in der Durchflusszelle, und jeder Kanal hat 2 Zeilen mit 26 Rahmen in jeder Zeile. Der Kanal kann eine Tiefe von etwa 100 µm haben. Kanal 1 hat ein Einlassloch A1 und ein Auslassloch A2, und Kanal 2 hat ein Einlassloch B1 und ein Auslassloch B2. Die Durchflusszelle kann auch einen linearen und von Menschen lesbaren 1D-Code und optional einen 2D-Matrixcode aufweisen.
  • 10B zeigt eine zweiteilige Durchflusszelle aus Glas. Bei dieser Konstruktion können Strömungskanäle sowie Einlass- und Auslasslöcher unter Verwendung fokussierter Femtosekundenlaserstrahlung oder chemischer Ätztechnologie hergestellt werden. Die 2 Teile können mit Laser-Glasbonding-Technologie miteinander verbunden werden. Die Einlass- und Auslasslöcher können auf der obersten Schicht der Struktur positioniert und so ausgerichtet sein, dass sie mit mindestens einem der Kanäle und/oder Kammern in Verbindung stehen, die im inneren Teil der Vorrichtung ausgebildet sind. Es gibt zwei Kanäle in der Zelle, und jeder Kanal hat 2 Reihen mit 26 Frames in jeder Reihe. Der Kanal kann eine Tiefe von etwa 100 µm haben. Kanal 1 hat ein Einlassloch A1 und ein Auslassloch A2, und Kanal 2 hat ein Einlassloch B1 und ein Auslassloch B2. Die Durchflusszelle kann auch einen linearen und von Menschen lesbaren 1D-Code und optional einen 2D-Matrixcode aufweisen.
  • 10C zeigt eine dreiteilige Durchflusszelle aus Glas. Bei dieser Konstruktion können Strömungskanäle sowie Einlass- und Auslasslöcher unter Verwendung fokussierter Femtosekundenlaserstrahlung oder chemischer Ätztechnologie hergestellt werden. Die 3 Teile können mit Laser-Glasbonding-Technologie miteinander verbunden werden. Die erste Waferschicht mit einer strukturierten Oberfläche kann auf einer Seite mit einer zweiten Waferschicht verbunden sein, und eine dritte Waferschicht kann auf der anderen Seite mit der ersten Waferschicht verbunden sein, sodass die erste Waferschicht zwischen der zweiten und der dritten Waferschicht positioniert ist. Die Einlass- und Auslasslöcher können auf der obersten Schicht der Struktur positioniert und so ausgerichtet sein, dass sie mit mindestens einem der Kanäle und/oder Kammern in Verbindung stehen, die im inneren Teil der Vorrichtung ausgebildet sind. Es gibt zwei Kanäle in der Zelle, und jeder Kanal hat 2 Reihen mit 26 Frames in jeder Reihe. Der Kanal kann eine Tiefe von etwa 100 µm haben. Kanal 1 hat ein Einlassloch A1 und ein Auslassloch A2, und Kanal 2 hat ein Einlassloch B1 und ein Auslassloch B2. Die Durchflusszelle kann auch einen linearen und von Menschen lesbaren 1D-Code und optional einen 2D-Matrixcode aufweisen.
  • Beispiel 4.
  • Durchflusszellen wurden durch Waschen vorbereiteter Glaskanäle mit KOH und anschließendes Spülen mit Ethanol und 30-minütiges Silanisieren bei 65 °C beschichtet. Kanaloberflächen wurden 30 min mit EDC-NHS aktiviert, gefolgt von Pfropfen von Primern durch Inkubation mit 5 µm Primer über 20 Minuten und anschließender Passivierung mit 30 µm PEG-NH 2.
  • Mehrschichtige Oberflächen werden nach dem Ansatz von Beispiel 4 hergestellt, wobei nach der PEG-Passivierung nach Zugabe des PEG-NH2 ein mehrarmiges PEG-NHS durch die Kanäle fließt, gegebenenfalls gefolgt von einer weiteren Inkubation mit PEG-NHS und gegebenenfalls einer weiteren Inkubation mit mehrarmigem PEG-NH2. Für diese Oberflächen kann der Primer in jedem Schritt gepfropft werden, insbesondere nach der letzten Zugabe von mehrarmigem PEG-NH2.
  • Während bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin gezeigt und beschrieben wurden, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass solche Ausführungsformen nur beispielhaft bereitgestellt werden. Fachleute erkennen zahlreiche mögliche Variationen, Änderungen und Substitutionen, ohne von der Erfindung abzuweichen. Es versteht sich, dass verschiedene Alternativen zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung in beliebiger Kombination bei der Durchführung der Erfindung eingesetzt werden können. Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Patentansprüche den Umfang der Erfindung definieren und dass Verfahren und Strukturen im Rahmen dieser Patentansprüche und ihrer Äquivalente dadurch abgedeckt werden.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Reagenz 1
    2
    Reagenz 2
    3
    Reagenz 3
    4
    Reagenz 4
    5
    Reagenzventil
    6
    Kapillarflusszelle
    7
    Spritzpumpe
    8
    Abfall
    9
    Schlüsselreagenz
    10
    Membranventil 1
    11
    Membranventil 2
    12
    Kapillare
    13
    Patrone
    14
    Mikroskop und Kamera
    15
    Temperaturregelung
    16
    Bewegungsstadium
    17
    2 Reihen mit 26 Rahmen
    18
    Kanal 1
    19
    GS1 - 128 1D linearer und durch Menschen lesbarer Code
    20
    GS1 2D Matrix Code
    21
    Kanal 2
    22
    Bild-Ramen Detail B Maßstab 4 : 1
    23
    Schnitt A - A
    24
    Kanaltiefe 100mm
    25
    Schnitt E - E
    26
    Teil 1
    27
    Teil 2
    28
    Ablesebereich
    29
    Teil 1
    30
    Teil 2
    31
    Teil 3
  • Tabelle 1 zu Fig. 10A
    Zweisprurige, einteilige Durchflusszelle
    Größe Zchng. Nr. Vers.
    B 302_000 @01
    Tabelle 2 zu Fig. 10B
    Zweispurige, zweiteilige Durchflusszelle
    Größe Zchng. Nr. Vers .
    B 303_000 @01
    Tabelle 3 zu Fig. 10C
    Zweispurige, dreiteilig Durchflusszelle
    Größe Zchng. Nr. Vers .
    B 312_000 @01
    Tabelle 4 zu Fig. 10C
    STL-Tabelle
    NR. Nummer BESCHREIBUNG
    1 311_0001 Einlassschicht, 8-spurige Durchflusszelle 1
    2 311_0002 Kanalschicht, 8-spurige Durchflusszelle 1
    3 311_0003 Basisschicht, 8-spurige Durchflusszelle 1
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (34)

  1. Durchflusszellenvorrichtung, umfassend: (a) einen ersten Behälter, der konfiguriert ist, eine erste Lösung aufzunehmen und ein erstes Einlassende und ein erstes Auslassende umfasst; (b) einen zweiten Behälter, der konfiguriert ist, eine zweite Lösung aufzunehmen und ein zweites Einlassende und ein zweites Auslassende umfasst; und (c) einen zentralen Bereich, umfassend ein drittes Einlassende und ein drittes Auslassende, wobei das dritte Einlassende durch mindestens ein Ventil fluidisch mit dem ersten Auslassende und dem zweiten Auslassende gekoppelt ist; wobei eine Innenfläche des zentralen Bereichs mindestens eine hydrophile Polymerbeschichtungsschicht mit mehreren daran gekoppelten Oligonukleotidmolekülen umfasst; wobei mindestens ein Oligonukleotidmolekül der mehreren ein Segment umfasst, das spezifisch an ein eukaryotisches genomisches Nukleinsäuresegment, ein prokaryotisches genomisches Nukleinsäuresegment, ein virales Nukleinsäuresegment oder ein Transkriptom-Nukleinsäuresegment hybridisiert; und wobei ein Verhältnis eines Fluoreszenzsignals für Fluorophor-markierte komplementäre Oligonukleotide, die spezifisch an das mindestens eine Oligonukleotidmolekül der mehreren hybridisiert sind, zu einem Fluoreszenzsignal für Fluorophor-markierte Oligonukleotide, die nicht spezifisch an die Innenfläche gebunden sind, mindestens 2 : 1 in einem Fluoreszenzbild der Innenfläche beträgt, wenn das Fluorophor Cyaninfarbstoff 3 (Cy3) ist und das Fluoreszenzbild unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskops aufgenommen wird, das mit einem für 532 nm Licht optimierten dichroitischen Spiegel mit 20-fachem Objektiv und einem für Cy3-Emission optimierten Bandpassfilter und einer Kamera unter nicht signalgesättigten Bedingungen ausgestattet ist, während die Oberfläche in 25 mM ACES, pH-7,4-Puffer, eingetaucht ist.
  2. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei, wenn das mindestens eine Ventil geöffnet ist, ein Volumenstrom der ersten Lösung, die vom ersten Auslassende zum dritten Einlassende fließt, geringer ist als ein Volumenstrom der zweiten Lösung, die aus dem zweiten Auslassende zum dritten Einlassende fließt.
  3. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das erste Auslassende durch ein erstes Ventil fluidisch mit dem dritten Einlassende gekoppelt ist und das zweite Auslassende durch ein zweites Ventil fluidisch mit dem dritten Einlassende gekoppelt ist.
  4. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mindestens eine Ventil ein Membranventil ist.
  5. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das erste Auslassende näher an dem dritten Einlassende als das zweite Auslassende positioniert ist, um ein Totvolumen für die Abgabe der ersten Lösung an den zentralen Bereich zu verringern.
  6. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der zentrale Bereich ein oder mehrere Kapillarröhrchen umfasst.
  7. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 6, wobei das eine oder die mehreren Kapillarröhrchen ein Standardprodukt sind.
  8. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das eine oder die mehreren Kapillarröhrchen von der Vorrichtung entfernbar sind.
  9. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das eine oder die mehreren Kapillarröhrchen ein Fenster umfassen, durch das mindestens ein Teil des Kapillarröhrchens beleuchtet und abgebildet werden kann.
  10. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der zentrale Bereich einen Mikrofluidik-Chip umfasst.
  11. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 10, wobei der Mikrofluidik-Chip mindestens einen Fluidkanal umfasst.
  12. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der Mikrofluidik-Chip von der Vorrichtung entfernbar ist.
  13. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, wobei der mindestens eine Fluidkanal ein Fenster umfasst, durch das mindestens ein Teil des Kanals beleuchtet und abgebildet werden kann.
  14. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der mindestens eine Fluidkanal eine durchschnittliche Tiefe im Bereich von 50 bis 300 µm aufweist.
  15. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei der mindestens eine Fluidkanal eine durchschnittliche Länge im Bereich von 1 bis 200 mm aufweist.
  16. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei der mindestens eine Fluidkanal eine durchschnittliche Breite im Bereich von 0,1 bis 30 mm aufweist.
  17. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei der Mikrofluidik-Chip Quarz- oder Borosilikatglas umfasst.
  18. Durchflusszellenvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Vorrichtung einen Temperaturmodulator umfasst, der thermisch mit dem zentralen Bereich gekoppelt ist.
  19. Durchflusszellenvorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Temperaturmodulator einen Wärmeblock, eine Entlüftung, einen Luftstromverlauf oder einen Ventilator umfasst.
  20. System, umfassend: a) eine oder mehrere der Durchflusszellenvorrichtungen nach einem der Ansprüche 1 bis 19; und b) eine Fluidströmungssteuerung.
  21. System nach Anspruch 20, ferner umfassend ein Bildgebungsgerät.
  22. System nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, ferner umfassend einen Temperaturregler.
  23. System nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die Fluidströmungssteuerung ein(e)(n) oder mehrere Pumpen, Ventile, Mischverteiler, Reagenzbehälter, Abfallbehälter oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
  24. System nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Fluidströmungssteuerung konfiguriert ist, eine programmierbare Steuerung der Fluidströmungsgeschwindigkeit, des Fluidvolumenstroms, des Zeitpunkts der Reagenz- oder Puffereinführung oder einer beliebigen Kombination davon bereitzustellen.
  25. System nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei der Temperaturregler eine Metallplatte, die so positioniert ist, dass sie Kontakt mit dem zentralen Bereich herstellt, und eine Peltier- oder Widerstandsheizung, umfasst.
  26. System nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei der Temperaturregler eine oder mehrere Luftzufuhrvorrichtungen umfasst, die konfiguriert sind, einen Strom erwärmter oder gekühlter Luft so zu leiten, dass er Kontakt mit dem zentralen Bereich herstellt.
  27. System nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei der Temperaturregler ferner einen oder mehrere Temperatursensoren umfasst.
  28. System nach Anspruch 27, wobei der eine oder die mehreren Temperatursensoren in eine Patrone integriert sind, die den zentralen Bereich beherbergt.
  29. System nach einem der Ansprüche 22 bis 28, wobei der Temperaturregler ermöglicht, dass die Temperatur des zentralen Bereichs auf einer festen Temperatur gehalten wird.
  30. System nach einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei der Temperaturregler ermöglicht, dass die Temperatur des zentralen Bereichs auf programmierbare Weise zwischen mindestens zwei eingestellten Temperaturen gewechselt wird.
  31. System nach einem der Ansprüche 21 bis 30, wobei das Bildgebungsgerät ein Mikroskop umfasst, das mit einer CCD- oder CMOS-Kamera ausgestattet ist.
  32. System nach einem der Ansprüche 21 bis 31, wobei das Bildgebungsgerät eine oder mehrere Lichtquellen, eine oder mehrere Linsen, einen oder mehrere Spiegel, ein oder mehrere Prismen, einen oder mehrere Bandpassfilter, einen oder mehrere Langpassfilter, einen oder mehrere Kurzpassfilter, einen oder mehrere dichroitische Reflektoren, eine oder mehrere Aperturen und einen oder mehrere Bildsensoren oder eine beliebige Kombination davon umfasst.
  33. System nach einem der Ansprüche 21 bis 32, wobei das Bildgebungsgerät konfiguriert ist, Hellfeldbilder, Dunkelfeldbilder, Fluoreszenzbilder, Zwei-Photonen-Fluoreszenzbilder oder eine beliebige Kombination davon aufzunehmen.
  34. System nach einem der Ansprüche 21 bis 33, wobei das Bildgebungsgerät konfiguriert ist, Videobilder aufzunehmen.
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