JP3116709U - 微小流路チップ - Google Patents

Abstract

【課題】 基板上に形成した微小な流路を用いて多項目の化学・生化学機能を同時に測定できるような微小流路チップの提供を目的とする。
【解決手段】 本考案の微小流路チップでは、基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、互いに異なる化学修飾が施されたキャピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キャピラリーに流体を供給し検出データを取得することができる。当該微小流路チップにより多項目の化学・生化学機能が同時に測定される。
【選択図】 図１

Description

本考案は複数の微小なキャピラリーに流体を通過させ、該キャピラリーにおける化学修飾により所要の機能を発揮してデータの検出が可能な微小流路チップに関する。

従来より、ガラスやプラスチックの基板上に微細加工技術を利用して微小な流路を形成し、該流路に固定された機能性分子によって必要な反応や分離等の生化学・化学的な操作や検出を行うためのチップとして、例えばμTAS（Micro Total Analysis Systems）と呼ばれる集積化されたチップが知られている。

また、このような微小流路を基板上に形成した微小流路チップの一例としては、微小スケールで様々なサイズのＤＮＡ断片をはじめとする核酸、あるいは、アミノ酸・ペプチド・タンパク質などの有機分子、金属イオンなどを分離する際などに用いるキャピラリーゲル電気泳動用マイクロチップなども知られている（例えば、特許文献１参照。）。

さらに、従来の技術として、基板の表面に流路形成用の所要の幅と深さを有する溝が格子状に設けられ、この溝の一部に流路形成用の角型キャピラリーが密接状に埋設され、溝が設けられた側の基板の表面が透明ガラスからなる透明カバーで被覆されてなる微小流路デバイスも知られており（例えば、特許文献２参照。）、このような微小流路デバイスを用いることで、簡便かつ安価であって、流路パターンを容易かつ自由自在に変えることができる。

特開２００１−１５７８５５号公報 特開２００５−１４０６８１号公報

前述のキャピラリーゲル電気泳動用マイクロチップやマイクロＴＡＳなどのチップでは、ウエットエッチングのような微細加工技術が必須であり、これらの方法では、ある１つの流路パターンを形成してしまうと、その流路パターンを変える場合のコストが非常に高価になり、流路パターンの融通性が欠けている。

前述の特許文献２に記載された技術では、流路パターンを容易かつ自由自在に変えることができ、必要に応じて化学的機能を集積することが可能であるが、化学分野・生化学分野での応用として例えばウィルス検診などでは多項目を同時測定することで、その検出データの取得までの時間を極めて短くすることが考えられており、前記文献では具体的なデータの取得までは開示されていない。

本考案は、このような技術的な課題に鑑みなされたものであり、基板上に形成した微小な流路を用いて多項目の化学・生化学機能を同時に測定できるような微小流路チップの提供を目的とする。

前述の技術的な課題を解決するため、本考案の微小流路チップは、基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、互いに異なる化学修飾が施されたキャピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キャピラリーに流体を供給し検出データを取得することを特徴する。

本考案の微小流路チップによれば、予め形成された基板上の溝にキャピラリーを埋め込むため、例えば、検査項目を入れ替えるような場合でも、キャピラリーを交換すれば対応することができ、融通性に富む構造を有している。また、キャピラリー同士は、異なる化学修飾がなされたのものとされ、互いに干渉することなく多項目の化学・生化学機能を同時に測定できる。

本考案の微小流路チップにおいて、異なる化学修飾とは広い意味を有するものであり、化学分野に限定されず生化学分野、医薬分野、環境測定分野、分子生物分野などの広い範囲で混合、反応、分離などの化学的操作を実現するものであり、例えば、多種の動物系免疫グロブリンＧ（immunogloburin G；IgG）抗体を固定したキャピラリーを並べて配することで、抗原抗体反応による同時検出や同時検量が可能となる。

埋設された複数の前記キャピラリーに流体を供給することで同時に反応、分離、混合などの化学的な操作が行われるが、例えばＥＬＩＳＡ法などにより発色性の基質を導入することで、定量や検量などが可能となる。ここで、ＥＬＩＳＡ（イムノアッセイ或いは酵素免疫測定法法）とは、測定したい物質（被検物質）と特異的に反応する抗体（たんぱく質）を固相化したマイクロプレートに、測定したい物質と酵素標識抗原とを同時に加えて反応させ、プレートに結合した酵素標識物の酵素活性を吸光光度法により計測して、被検物質の濃度を求める手法であり、並べられた複数のキャピラリーを透過或いは反射する光で同時或いは順次走査するように光線を解析し、検量を行う手法である。解析には、熱レンズ顕微鏡、蛍光顕微鏡、ＣＣＤカメラなどを用いて画像処理からデータを得るようにすることが可能である。また、抗原をキャピラリーに固定するように構成しても良い。

本考案の微小流路チップを用いることで、基板上に形成した微小な流路を用いて多項目の化学・生化学機能を同時に測定することができ、例えばウィルスの特定などの本来多数の化学的操作が必要な作業も極めて短時間に行うことができ、且つ量産できるチップ構造から非常に安価に作業を進めることができる。

図面を参照しながら、本実施形態の微小流路チップについて説明する。本実施形態の微小流路チップの要部断面を図１に示す。本実施形態の微小流路チップは、図１に示すように、高分子材料基板であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる基板１０を使用し、基板１０の表面１１に形成された４つの溝１３〜１６に、４本の角柱状のキャピラリー２１〜２４がそれぞれ埋設されている。４本の角柱状のキャピラリー２１〜２４の一端側は、流路１２に臨むように形成されている。

基板１０は、前述の特許文献２に記載される格子状に溝が配設されるようなパターンを有していても良く、或いは、多種類のキャピラリーを埋設するために、その本数だけ溝が形成されているようなものであっても良い。基板１０は、本実施形態では平板状であるが、キャピラリーを保持できる他の形状であっても良い。この基板１０は、高分子材料であることから多少の可とう性を有しており、キャピラリーを埋設する際に挿入部分となる溝をやや広げながらキャピラリーを挿入し、溝内にキャピラリーを配置した際には隙間無くキャピラリーを溝内に保持することができる。基板は例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）やポリジフェニルシロキサンなどのシリコンゴム、ガラスまたはその他の高分子材料から構成することができる。

ここで、溝の寸法については、一例として幅３００ミクロン、深さ３００ミクロン程度の極めて小さな断面正方形状の溝とすることができ、正方形の断面とすることで、キャピラリーの側面と底面側が同じ寸法になることから、どちらが側面でどちらが底面というような方向性を問題にせずに埋設することができる。また、キャピラリーの流路は１００ミクロン角であり、外形は３００ミクロン角であって、溝のサイズとキャピラリーの外形は同じサイズとされる。

このような溝１３〜１６に埋設される４本の角柱状のキャピラリー２１〜２４は、異なる化学修飾を施し異なる化学機能を付加したシリカガラスからなる可とう性の微小角柱部材であり、その内部に角柱状の流路２５〜２８が形成され、その流路２５〜２８の内壁に抗体や酵素などの反応を起因させる物質が固定される。

例えば、流路を通過させる流体を人の血液とする場合では、１つのキャピラリーがエイズ検査用の試薬を固定したものとされ、次のキャピラリーが肝炎検査用の試薬を固定したものとされ、他のキャピラリーが例えばガンと性病などの検査に適用できる。このような４つの異なるキャピラリーに共通の血液を流すことで、これらの４つの疫病に関してそれぞれ独立した検査は不要となり、一回の検査で陽性又は陰性の判断ができることになり、特に処置に緊急性を有する場合に極めて有効である。このようなキャピラリーの組み合わせとしては、例えば肝炎の複数の型について同時に検査するような組み合わせや、ウィルスの如き種々のタイプのものがある場合に、どの種類かを一度に検査するための組み合わせなども可能である。また、血液を利用する例としては、例えば高脂血症、糖尿病、脂肪肝などの検査を同時に行うようなそれぞれキャピラリーを配列させても良く、膀胱ガン、前立腺ガン、子宮ガン、或いはドーピング検査などのように、尿や血液などの体液を利用し複数のキャピラリーを用いて同時に検査をするようにしても良い。また、本考案の微小流路チップをサイトカイン、ホルモン、環境ホルモンなどの特定や検量などに適用することも可能である。更に、食品分野への応用としては、食品中の農薬や細菌の検出や検量に用いることができ、有害物質の特定も可能である。また、また、生化学分野では、細胞中の各種の分子、例えば各種の蛋白質、核酸、生理活性低分子などの成分分析や細胞内の各種の酵素活性の検出や検量などが実現可能とされる。更に温泉などの鉱水に含まれる複数の金属イオンなどを検量するための組み合わせなどがあげられる。

本実施形態の微小流路チップにおいては、後述するようにＥＬＩＳＡ法による検出が可能であり、４本の角柱状のキャピラリー２１〜２４の内壁に抗体を固定し、抗原溶液を供給することで、抗原抗体反応が生じて、検量などが実現される構造を有しており、疾患の診断やウィルス診断時に特に有効である。

図２及び図３はキャピラリー２１、２２の上面図と断面図であり、キャピラリー２１、２２には、異なる化学修飾のための内部に角柱状の流路２５、２６を有している。キャピラリー２１、２２は、本実施形態においては、シリカガラスにより構成されるが、他のガラスや合成樹脂材などを用いて構成することも可能である。内壁の形状は、本実施形態においては、角柱状の空洞部が形成されるものとされるが、円筒形状やその他の形状であっても良い。キャピラリー内壁は、イオンセンシング、分子センシング、ｐＨセンシング、フィルタリング、濃縮、抗原抗体反応、酵素反応、触媒反応、免疫反応、油水分離または流量制御のために化学修飾されて、化学修飾部にされていてもよい。その場合には、分子認識、反応、分離、検出などの多種類の化学的機能を１つの微小流路チップに自由自在に集積化することができる。また、キャピラリーは例えば、ガラスまたはプラスチックからなるが、前者の一例としては、シリカガラスからなり、外形の横断面形状が正方形である可撓性角型キャピラリー（商品名：Square flexible fused silica capillary tubing、米国Polymicro社が販売）が使われる。このような角型キャピラリーは外形の横断面形状が正方形であるので、横断面形状が正方形であってキャピラリー外形と同じ寸法の溝を基板に設け、その溝の一部に所要長さに切断した所要本数の同キャピラリーを埋め込むことで、所望パターンの微小流路を容易かつ自由自在に形成することができる。

本考案に係る微小流路チップのキャピラリーは、少なくともその一面が透明であるのが好ましい。その場合には、微小流路における化学操作の進行状況や結果などを容易に認識することができ、後述するようなＥＬＩＳＡ法による検量にも好適である。なお、キャピラリーの内壁の横断面形状は、特定の形状に限定されるものではないが、前記の化学的機能をより確実に発揮させることなどを考慮すると、略方形であるのがより好ましい。

次に、図４乃至図７を参照して、本実施形態の微小流路チップの組み立てについて説明する。図４及び図５は、基板１０と流路となる溝１９の関係を示す図であり、図４は一部を省略して示す平面図、図５は斜視図である。図４及び図５に示すように、ガラスやポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような高分子材料からなる基板１０には、縦横に格子状に溝１９が形成され、その溝１９に囲まれてマトリクス状に正方形状に溝底部から突出する形状の表面が形成される。縦横に格子状に溝１９が形成されることから、１つの溝の横方向の格子点間の距離と縦方向の格子点間の距離は略同等であるが、横方向の格子点間の距離と縦方向の格子点間の距離を変えることもできる。

このような基板１０を用いて、４種類のキャピラリー２１〜２４が図６に示すように準備され、図７に示すように、それぞれ縦方向に延在される溝の部分に並列となるように４種類のキャピラリー２１〜２４が埋設される。溝として塞ぐ必要がある部分には、流路閉鎖用のダミーキャピラリー１８が埋設される。このダミーキャピラリー１８は、例えば、可撓性角型キャピラリーを所要本数、所要長さに切断し、それぞれの流路をＰＤＭＳなどの充填により閉鎖したものが使われる。このようなダミーキャピラリーが流路に埋設されたことにより、微小流路チップには、特定箇所の流路が閉鎖されて所要の流路パターンが形成されることになる。

図７に示す流路パターンは、横方向に４種類のキャピラリー２１〜２４が並列に配され、その入り口側の溝からなる流路１２aから流体が導入され、それぞれのキャピラリー２１〜２４を透過し、出口側の流路１２ｂから導入された流体が排出される。異なる２種類以上の流体を流入させる場合には、流路１２aを２カ所以上で開口して流体を導入するようにすることも可能である。

図示を省略しているが、基板上にはキャピラリーを埋設した後、所要のカバーを取り付けるようにすることもできる。カバーとして、例えば、ガラスまたはプラスチックからなる透明シートまたは透明フィルムを用いることができ、この場合は、微小流路の内部状態を外部から目視することができる。

次に図８を参照しながら、試薬を固定化させたキャピラリーの製法について簡単に説明する。図８の例では、メタノール（ＭｅＯＨ）溶液に試薬として機能する物質が溶解され、この溶液がキャピラリー３０の断面正方形の流路３１に注入される。断面正方形の流路３１に注入された溶液は、空気を封入することで中空状となり、２４時間程度の自然乾燥を経てキャピラリー３０の内壁に固定されるようになる。例えば、試薬を放出するキャピラリーとしては、蛍光検出用トリプシン基質（benzoyl-L-arginine 4-methyl-coumaryl-7-amide；Bz-Arg-MCA）やｐＨ検出用試薬(fluorescein)とポリエチレングリコールをメタノール（ＭｅＯＨ）溶液に溶解させて、キャピラリー３０の流路３１に導入後、２４時間程度の自然乾燥を経てキャピラリー３０の内壁に固定されるようにすることができる。

また、例えば、ＥＬＩＳＡ法による検出が可能なキャピラリー３０を得るためには、抗体を予め断面正方形の流路３１の内壁に固定化しておくことが好ましく、後述するような抗原、酵素標識抗体、基質を順次供給することで、ＥＬＩＳＡ法による識別が実現されることになる。

図９は検出作業におけるキャピラリー３２の状態を示した図である。キャピラリー３２の断面正方形の流路３３の内壁には図８に示した製法などにより、試薬を固定化した膜が形成されており、特に断面正方形の４つの角部に乾燥後の残差のように試薬成分が存在する。この状態で、キャピラリー３２には試料となる溶液が毛細管現象により導入される。試料がキャピラリー３２の断面正方形の流路３３に導入されることで、試薬を固定化した膜から試薬が放出され、所要の反応例えば発色や蛍光を示すなどの現象が現れることになる。

図９は内壁に形成された膜から試薬を放出する例であるが、化学的に反応を生じさせて発色するような反応と、酵素反応のようにキャピラリー３２の断面正方形の流路３３の内壁から基質を放出して発色反応を生じさせる例が挙げられる。なお、酵素系の反応としては、基質の放出の場合や酵素自体の放出を伴うキャピラリーを用いることも可能である。

次に、本件考案者が行った実験例に基づき、更に本考案の微小流路チップについて詳しく説明する。

図１０は、ＥＬＩＳＡ法を適用した測定方法を示すモデルであり、ヒトＩｇＧの反応系で酵素反応を調べた例である。先ず、基板４０上に格子状に溝部が形成され、そこに５つの角型キャピラリー４３a〜４３d、４３eが並列に並べられて埋設されている。流路として利用されない溝部にはダミーキャピラリー４２が取り付けられている。５つの並列する角型キャピラリー４３a〜４３d、４３eの入り口には、感温性高分子であるポリＮ−イソプロピルアクリルアミドからなるバルブキャピラリー４１が形成されている。このバルブキャピラリー４１により流路を温度で開閉制御することができる。

概ね以上のような構造の微小流路チップにおいて、先ず、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を固定した５つの角型キャピラリー４３a〜４３d、４３eを並べ、チップを作成した。検証のため、バルブキャピラリー４１を開くように操作した上で、抗原溶液を入り口４４から導入し、排出口４５から導出するようにして、各角型キャピラリー４３a〜４３d、４３e自体を抗原溶液で満たし、次いでバルブキャピラリー４１を閉じて反応を進行させた。次いで、同様に酵素標識抗体溶液（Anti-IgG-HRP）、赤色色素を生成する基質溶液（TOSS,４−AA）を反応させて、熱レンズ顕微鏡（励起波長 532nm、検出波長 658nm）によって観測した。

抗原・酵素抗体溶液を導入し基質溶液を導入すると酵素反応が進行して，熱レンズ顕微鏡信号強度は約60秒で一定値に達した。次にこの系で十分に抗原抗体反応が完了する時間を調べた。その結果抗原抗体反応を12分以上行った場合，熱レンズ信号強度は一定となった。このことから，抗体固定キャピラリー内での総反応時間は30分程度であり，迅速なイムノアッセイが可能であることがわかった。

図１１は図１０の微小流路チップを用いた時の５本のキャピラリー間における信号強度を示す図である。信号強度の間には、約１９％程度のばらつきが見られたが、有意なデータが取得できることが実証された。

図１２はフルオレセイン放出キャピラリーを用いたモデルでの実験例を示す図である。基板５０に対して中央の溝にｐH値が測定されるべき試料溶液が供給されるように構成されており、その両側に配設されたフルオレセイン放出キャピラリー５１，５２の中央側端部は開口しており、その開口部から試料溶液がフルオレセイン放出キャピラリー５１，５２の内部に導入される。

図１２の写真部分は、実際に経時的に蛍光を呈するようになったところを示す写真部分であり、図１３は蛍光強度ΔFとｐH値の相関図である。フルオレセイン放出キャピラリーを用いて、ｐH値４〜８で十分な強度変化が現れ、検出データとして有意であることが実証されている。

図１４と図１５は酵素活性測定に利用可能な基質放出キャピラリーが微小流路チップとして機能することを示す図であり、図１４は実験例としての本考案の基質放出キャピラリーを用いて酵素活性を測定したデータであり、図１５は比較例としてマイクロタイタープレートを用いたアッセイでのデータである。基質放出キャピラリーを用いたアッセイでは、信号強度が弱くなるものの、トリプシン濃度において反応速度や反応温度の点で十分に汎用のマイクロタイタープレートを用いたアッセイと同格のデータが得られており、特に検量線が飽和するまでの曲線が相似であることから、多項目同時での計測に有利であることが示されており、基質放出キャピラリーを用いたアッセイはマイクロタイタープレートを用いたアッセイに比べて小さくできることから、非常に安価に作業を進めることができる。

図１６及び図１７はそれぞれ酵素活性アッセイとｐＨセンシングについての蛍光顕微鏡写真であり、酵素活性アッセイはトリプシン基質放出キャピラリーを用いたものであり、ｐＨセンシングはフルオレセイン放出キャピラリーを用いたモデルでの例である。両方とも約１００ミクロンの略方形のキャピラリーの流路内壁の幅に等しい幅で、蛍光が観測されており、有効な計測が実現されている。

図１８は図１０で示したモデルを利用して、ヒトＩｇＧだけではなく、チキンＩｇＧとヤギＩｇＧについても抗原濃度に対する検量線を作成した図である。これらイムノアッセイにおいても、先に説明したヒトＩｇＧの反応系と同様に、抗原抗体反応が生じて、同様な検量結果が得られることが示された。従って、異なる酵素反応や抗原抗体反応に対しても、異なる種類のキャピラリーを並べて配置し、同時に測定するという本考案の微小流路チップが有効であることが実証できた。

上述の実施形態では、異なる酵素反応や抗原抗体反応に対応して配置されるところの異なる種類のキャピラリーを並列に配設した例について説明したが、各キャピラリーに供給される液体に共通性があれば良く、各キャピラリー同士を直列接続させるようにしても良い。

本考案の微小流路チップの実施形態の要部斜視断面図である。 本考案の微小流路チップの実施形態に用いられるキャピラリーの平面図である。 本考案の微小流路チップの実施形態に用いられるキャピラリーの斜視断面図である。 本考案の微小流路チップの実施形態に用いられる基板の模式図である。 本考案の微小流路チップの実施形態に用いられる基板の斜視模式図である。 本考案の微小流路チップの実施形態において、キャピラリーを埋設する前の平面図である。 本考案の微小流路チップの実施形態において、キャピラリーを埋設した後の平面図である。 本考案の微小流路チップの実施形態において、キャピラリーに所要の試薬をコーティングするプロセスを説明する模式図である。 本考案の微小流路チップの実施形態のキャピラリーにおける所要の試薬を利用した反応プロセスを説明する模式図である。 本考案の微小流路チップでＥＬＩＳＡ法を適用した測定方法を示すモデルを示す模式図である。 図１０の微小流路チップを用いた時の５本のキャピラリー間における信号強度を示す図である。 本考案の微小流路チップにかかるフルオレセイン放出キャピラリーを用いたモデルでの実験例を示す模式図である。 図１２に示したモデルでのｐＨ測定値と蛍光強度の関係を示す図である。 酵素活性測定に利用可能な基質放出キャピラリーが微小流路チップとして機能することを示す図であって、実験例としての本考案の基質放出キャピラリーを用いて酵素活性を測定したデータを示す図である。 酵素活性測定に利用可能な基質放出キャピラリーが微小流路チップとして機能することを示す図であって、比較例としてマイクロタイタープレートを用いたアッセイでのデータを示す図である。 本考案の微小流路チップにかかる実験例として試薬放出後のキャピラリー内の状態を示す蛍光画像を示す図であり、トリプシン基質放出キャピラリーの蛍光画像を示す図である。 本考案の微小流路チップにかかる実験例として試薬放出後のキャピラリー内の状態を示す蛍光画像を示す図であり、フルオレセイン放出キャピラリーの蛍光画像を示す図である。 図１０で示したモデルを利用して、ヒトＩｇＧだけではなく、チキンＩｇＧとヤギＩｇＧについても抗原濃度に対する検量線を示した図である。

符号の説明

１０ 基板
１１ 表面
１２ 流路
１３〜１６ 溝
１８ ダミーキャピラリー
２１〜２４ キャピラリー
２５〜２８ 流路
３０、３２ キャピラリー
３１、３３ 流路
４０ 基板
４１ バルブキャピラリー
４２ ダミーキャピラリー
４３a〜４３d、４３e 角型キャピラリー
５０ 基板
５１、５２ フルオレセイン放出キャピラリー

Claims (7)

1. 基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、互いに異なる化学修飾が施されたキャピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キャピラリーに流体を供給し検出データを取得することを特徴とする微小流路チップ。
2. 前記キャピラリーは抗体を当該キャピラリーの内壁に固定した抗体固定キャピラリーであり、前記流体は抗原溶液であることを特徴とする請求項１記載の微小流路チップ。
3. 前記キャピラリーは抗原を当該キャピラリーの内壁に固定した抗原固定キャピラリーであり、前記流体は抗体溶液であることを特徴とする請求項１記載の微小流路チップ。
4. 溶液を前記キャピラリーに導入した後、前記キャピラリーの両端はシリコンオイルで封止されることを特徴とする請求項１記載の微小流路チップ。
5. 基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、抗体を固定したキャピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キャピラリーに抗原溶液を供給し検出データを取得することを特徴する微小流路チップ。
6. 基板上に並列若しくは直列に接続される複数の溝が形成され、抗原を固定したキャピラリーが前記複数の溝にそれぞれ埋設され、これらの埋設された複数の前記キャピラリーに抗体溶液を供給し検出データを取得することを特徴する微小流路チップ。
7. ＥＬＩＳＡ法により前記キャピラリーに発色反応を生じさせ、その発色濃度から検出データを取得することを特徴とする請求項１、請求項５、若しくは請求項６記載の微小流路チップ。