JP5043186B2 - 微細流路型センサー複合構造物 - Google Patents
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Description
前記中間基板に形成された微細流路に毛細管現象を誘導するように積層される上部基板とを備える。
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記流動性感知電極は、試料の到達を感知することによって、基質溶液の注入時点を知らせることが好ましい。
本発明による微細流路型センサー複合構造物において、前記検定電極は、基礎信号を測定する検定電極(第1検定電極)と飽和または一部飽和された酵素接合体の飽和信号を測定する検定電極(第2検定電極)であることが好ましい。
以下、図参照して本発明をさらに詳しく説明する。
本発明による微細流路型センサー複合構造物は、電極部(作用電極101、基準電極102及び電極連結部103)が形成された下部基板100;試料が試料導入部203から前記電極部を経て前記吸収部209に至るように構成された微細流路を含む中間基板200;及び上部基板(またはカバー)300が積層された構造からなる。
図3に示したように、微細流路が形成されている中間基板200には、試料が導入される試料導入部203から反応に必要な酵素接合体貯蔵所204及び基質貯蔵所205、空気排出口207、検出部208及び試料の流れを維持させて反応及び洗浄効果を持続させる吸収部209が含まれる。試料導入部203以後の流路は、二つの流路に分岐し、分岐流路上にそれぞれ酵素接合体貯蔵所204と前記酵素接合体に反応する基質が貯蔵されている基質貯蔵所205が位置する。
図4に示したように、試料導入部を通じて注入された試料は、毛細管現象で二つの流路に同時に移送される。前記試料は、酵素接合体貯蔵所204が含まれている流路と前記酵素接合体に反応する基質が貯蔵されている基質貯蔵所205が含まれている流路に、試料が同時に移送されて酵素接合体貯蔵所204に塗布されている酵素接合体及び基質貯蔵所205に塗布されている基質を溶解させて流路にしたがって継続して移送される。ここで、酵素接合体貯蔵所で溶解された酵素接合体は、試料内分析物質の特定部位と結合する。しかし、電極が形成されている検出部208接点入口で二つの流路にしたがって移送されてきた試料の流れは異なる。すなわち、酵素接合体と結合された分析物質を含む試料は、検出部208に含まれている電極に移動する一方、基質を溶解させながら流れた試料は、検出部の近い位置にある酵素接合体貯蔵所流路によって移送された試料で空気排出が塞がれて、毛細管現象を維持することができなくなる。ここで、電極中で抗体または分子認知物質が固定されている作用電極101では免疫反応が起きる。前記免疫反応後、空気排出口207を開放すると、溶解された基質が混合部206で試料と混じった後、吸収部209による毛細管現状の持続によって作用電極101に移送される。注入された基質は、検出部208で反応できなかった酵素接合体を洗浄すると同時に信号発生を誘導させ、分析物質によって信号強度が変わるようになり、これを通じて電気化学方法で測定することができる。
図5は、本発明の他の一実施形態による微細流路型センサー複合構造物の分解斜視図である。図6はその結合図及び平面図であり、図7はその微細流路の平面図を示す。
試料が試料導入部203に移動して流路にしたがって流れ込み酵素接合体貯蔵所204、検出部208を経て吸収部209まで満たされると、基質貯蔵所205流路にとどまっている基質を検出部208に移動させて信号を検出することができる。ここで、基質を検出部208に移動させる時点を知らせる感知手段を備えることが好ましく、前記感知手段としては、一例として流動性感知電極を使用することができる。吸収部209内に配置されている流動性感知電極104は、試料の流入を感知した時に微細信号を読んで音に変換して注入時点を知らせることができる。前記感知手段によって測定結果の再現性を高めることができる。ここで、感知手段は、吸収部209の構造によって一定位置に配置することができ、好ましくは、免疫反応が終わって洗浄作用が目的どおりに起きるように吸収部209の末端に位置させる。また、基質が注入される量を把握して感知手段を備えた以後の流路の長さと幅を調節することができる。
図8は、本発明のまた他の一実施形態による検出部208に自体検定機能の検定電極(第1検定電極105、第2検定電極106を含んだ微細流路型センサー複合構造物の平面図を示したものである。
まず、下部基板100の上部に炭素または金属導体物質を印刷または蒸着方法によって電極(作用電極101、基準電極102、電極連結部103、流動性感知電極104)を形成する。そして、中間基板を通じて試料導入部203、酵素接合体貯蔵所204、基質貯蔵所205、混合部206、空気排出口207、検出部208、吸収部209を含む微細流路を形成させる。ここで、微細流路は、プレスを使用した成形によって形成することができ、前記有機高分子材料で作られた両面テープにプレス金型を使用して形成することもでき、感光剤フィルムを使用してエッチング法を用いて形成することができる。以後、露出した作用電極101上に抗体または分子認知物質を固定化させて、酵素接合体貯蔵所204には酵素接合体を、基質貯蔵所205には基質を塗布する。適切な条件で物質の分散後に固着すると上部基板300を微細流路型複合構造物全体で毛細管現象が維持されるよう、試料導入部と通気部が開放されるように付着させる。
このように製造された微細流路型センサー複合構造物を使用して、一例としてミオグロビンの量によって電流値を測定した結果、図10に示したようにミオグロビンの量に電流値が比例することを確認し、その標準の標準偏差も0.02〜0.18と低いので、高感度で定量的測定が可能であることを確認した。したがって、前記構造を有する微細流路型センサー複合構造物は、様々な分析物質に適用することができるバイオセンサーに有用に使用することができる。
但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するだけのものであって、本発明の範囲が実施例によって限定されるのではない。
(1)電極及び微細流路製作
微細流路の製作は、半導体製作工程の一部である光エッチング法を使用して製作した。使用するフィルムは、一般的に使用されるアクリルコーティングされたポリエチレンテレフタルレート(PET)フィルムを使用し、そのフィルム上に炭素ペーストでスクリーン印刷法を使用して作用電極、電極連結部及び流動性感知電極を、銀ペーストで基準電極と電極連結部を形成した。以後、液状ではない乾燥した感光剤フィルムを使用して、電極が形成されたフィルムと熱圧着して、露光機を使用して所望する微細流路を形成させた。所望する毛細管流路は、CADプログラムを使用してデザインし、OHPフィルムに印刷してパターンマスクに使用した。一定光量で露光をさせた後、2%炭酸ナトリウムでエッチング過程を経て、パターンを精密化した。エッチング液は、30℃程度に維持させた。製作されたセンサチップを陰条件で乾燥させて保管した。
作用電極に物理的な吸着方法で抗体を固定化させるためにミオグロビン抗体を0.01Mリン酸緩衝溶液pH7.2に希釈して作用電極表面に滴下して25℃で乾燥させた。酵素接合体貯蔵所に塗布する酵素接合体は、アルカリホスファターゼを使用した2次ミオグロビン抗体集合体を使用してサンドイッチ免疫分析法を適用した。酵素接合体貯蔵所上に酵素接合体を高濃度に希釈して適正量載せて25℃で乾燥した。酵素接合体を希釈する緩衝溶液は、20mMリン酸緩衝溶液pH7.2に0.5%BSA、1%トレハロース、0.1%ポリビニルアルコール(PVA)、0.01%ツイーン20を添加した溶液を使用した。乾燥した酵素接合体が水和して流れやすいように酵素接合体希釈緩衝液に様々な添加剤を含ませた。基質貯蔵所には、アルカリホスファターゼの基質である4−アミノフェニルホスフェートを乾燥させた。基質も短時間内に水和させるために、1.0M炭酸塩緩衝溶液に、0.5%トレハロース、0.05%ツイーン20、0.5%CMC(カルボキシメチルセルロース)など、さまざまな添加剤を含ませた。
<実施例2>ミオグロビン定量分析用微細流路型センサー製作2
試料導入部に血液分離フィルターパッドを導入して、吸収部末端に流動感知電極を備えたことを除き実施例1と同一方法で微細流路型センサーを製作した。
作用電極の他に二つの検定電極を追加したことを除き、実施例1と同一方法で微細流路型センサーを製作した。ここで、前記検定電極は、炭素ペーストで電極を製造した後、第1検定電極は、その上にBSAを塗布して、第2検定電極はIgGを塗布した。
抗生物質(例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、スルファジメトキシン等)を定量分析するための微細流路型センサーの製作は、ミオグロビン定量分析用のものと同一である。低分子量のため、抗生物質は、サンドイッチ酵素免疫分析法ではなく、競争酵素免疫分析法で測定した。抗生物質と酵素の接合体は、抗体を作用電極上に固定することにより、競争的にすることができる。
<実施例5>抗生物質定量分析用の微細流路型センサー製作2
実施例4とは異なるように競争酵素免疫分析法を設計することができる。抗生物質−タンパク質接合体を作用電極上に固定することで、固定化された抗生物質−タンパク質接合体及び遊離の抗生物質の両方を、抗生物質抗体−酵素接合体上で競争的にすることができる。
<実験例1>ミオグロビン濃度測定
本発明による微細流路型センサー複合型構造物を使用して製作した微細流路型センサーのバイオセンサーとしての作用を確認するために、次のような実験を行なった。
101:作用電極
102:基準電極
103:電極連結部
104:流動性感知電極
105:第1検定電極
106:第2検定電極
200:中間基板
201:血液フィルターパッド部
202:血液フィルターパッド
203:試料導入部
204:酵素接合体貯蔵所
205:基質貯蔵所
206:混合部
207:空気排出口
208:検出部
209:吸収部
210:通気部
300:上部基板
Claims (11)
- 基準電極、作用電極及び基準電極及び作用電極それぞれの電極連結部を備えた下部基板と、
試料が試料導入部から吸収部に至るようにする微細流路が形成されている前記下部基板上に積層される中間基板であって、前記微細流路は試料を導入する試料導入部、酵素接合体貯蔵所、基質貯蔵所、混合部、検出部、吸収部及び通気部を含みながら中間基板に形成されていて、前記試料導入部以後の流路は、二つの流路に分岐して、二つの流路の中で検出部に近い位置の流路は酵素接合体が貯蔵される酵素接合体貯蔵所を含み、もう1つの流路は前記酵素接合体の酵素と反応することができる基質が貯蔵されている基質貯蔵所及び混合部を順に含み、前記微細流路上の混合部に連通する空気排出口が中間基板上に具備され、分岐した二つの流路はそれぞれ酵素接合体貯蔵所及び混合部を経て一つに合されて、合された流路以後で中間基板が下部基板上に積層される時、基準電極及び作用電極が露出する検出部、及び前記検出部を通過した流体が吸収される吸収部、前記吸収部末端に前記通気部を順番に備える前記中間基板と、
前記中間基板に形成された微細流路に毛細管現象を誘導するように試料導入部と通気部が開放されるように積層される上部基板とを備える、試料内の分析物質を検出するために酵素免疫分析法に用いるための微細流路型センサー複合構造物において、
前記酵素免疫分析法が固相サンドイッチ酵素免疫分析法の場合においては、
作用電極上には試料内の分析物質と免疫反応を誘導することができる抗体または分子認知物質が固定化されていて、酵素接合体は試料内の分析物質と免疫反応を誘導することができる抗体または分子認知物質と酵素が接合された酵素接合体であり、
前記酵素免疫分析法が競合的酵素免疫分析法の場合においては、
作用電極上には試料内の分析物質と免疫反応を誘導することができる分析物質に対する抗体が固定化されていて、酵素接合体は試料内の分析物質と酵素が接合された酵素接合体であるかまたは、
作用電極上には試料内の分析物質にタンパク質が接合された分析物質−タンパク質接合体が固定化されていて、酵素接合体は分析物質に対する抗体と酵素の接合体である、微細流路型センサー複合構造物。 - 前記下部基板が、中間基板の吸収部末端での試料到達を感知する流動性感知電極を前記中間基板の吸収部末端に位置するようにさらに備えることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記酵素免疫分析法が競合的酵素免疫分析法の場合における分析物質は抗生物質であることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記下部基板が、検出信号の偏差を最小化することができる単数または複数の検定電極を前記中間基板の検出部に露出するようにさらに備えることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記検定電極が、基礎信号を測定する第1検定電極と飽和または一部飽和された酵素接合体の飽和信号を測定する第2検定電極であることを特徴とする、請求項4に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記中間基板が、分析物質のみを選別して試料導入部に供給することができるフィルターパッド部及びフィルターパッドをさらに備えることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記フィルターパッドが、血液の血清のみを選別して試料導入部に供給する血液フィルターパッドであることを特徴とする、請求項6に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記作用電極に試料が到達する順序が、試料溶液によって溶解された酵素接合体溶液が到達して、一定時間経過後に基質溶液が到達することを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記検出部が、抗体または分子認識物質と試料内の分析物質間の免疫反応後酵素接合体及び基質溶液間の酵素−基質反応によって発生する電気化学的信号を検出装置に送信して、分析物質の定量的な情報を得ることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記吸収部が、毛細管現象によって試料の流れを持続的に維持させることにより、検出部での反応を持続させて、未反応物質に対する洗浄効果を高めて高感度の検出信号を得ることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
- 前記上部基板が、微細流路型センサー複合構造物全体で毛細管現象が維持されるように試料導入部と通気部が開放されるように積層されることを特徴とする、請求項1に記載の微細流路型センサー複合構造物。
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