KR20230165871A - 핵산 분석을 위한 다가 결합 조성물 - Google Patents

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몰리 헤
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제이크 레비유
마이클 프리바잇
준후아 자오
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Abstract

입자에 부착된 뉴클레오타이드의 복수의 카피를 가지는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 다가 결합 조성물이 기재된다. 다가 결합 조성물은 검출가능한 신호를 생화학적 상호작용의 활성 영역, 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용, 단백질-핵산 상호작용, 핵산 혼성화, 또는 효소 반응의 부위에 국소화할 수 있도록 하며, 폴리머라제 반응 동안 연장되는 핵산 사슬 내 염기 혼입 부위를 확인하고 시퀀싱 및 어레이 기반 적용을 위한 개선된 염기 식별을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

Description

핵산 분석을 위한 다가 결합 조성물{MULTIVALENT BINDING COMPOSITION FOR NUCLEIC ACID ANALYSIS}
상호 참조
본 출원은 2019년 9월 23일자 미국 특허 출원 제16/579,794호의 일부계속출원이며, 2019년 9월 6일자 미국 가특허출원 제62/897,172호, 및 2019년 5월 24일자 미국 가특허출원 제62/852,876호의 이익을 주장하고, 상기 특허 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 다가 결합 조성물(multivalent binding composition) 및 핵산 분자의 분석에 사용하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 뉴클레오타이드의 국소 농도를 효과적으로 증가시키고 결합 신호를 향상시키는 입자 또는 중합체 코어에 부착된 뉴클레오타이드의 다중 카피를 가지는 다가 결합 조성물에 관한 것이다. 다가 결합 조성물은, 예를 들어, 시퀀싱 및 바이오센서 마이크로어레이(biosensor microarray) 분야에 적용될 수 있다.
핵산 시퀀싱(nucleic acid sequencing)은 진단, 예후, 생명 공학 및 법의학 생물학을 포함하는 다양한 생물의학 맥락에서 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. 막삼-길버트 시퀀싱(Maxam-Gilbert sequencing) 및 사슬-종결 방법, 또는 샷건(shotgun) 시퀀싱 및 브릿지 PCR을 비롯한 드 노보 시퀀싱(de novo sequencing) 방법, 또는 폴로니 시퀀싱(polony sequencing), 454 파이로시퀀싱(454 pyrosequencing), 일루미나 시퀀싱(Illumina sequencing), SOLiD 시퀀싱, 이온 토렌트 반도체 시퀀싱(Ion Torrent semiconductor sequencing), 헬리스콥 단일 분자 시퀀싱(HeliScope single molecule sequencing), SMRT® 시퀀싱(SMRT® sequencing), 및 기타를 포함하는 차세대 방법을 포함하는 다양한 시퀀싱 방법이 개발되었다. DNA 시퀀싱의 발전에도 불구하고, 비용 효과적인 고처리량 시퀀싱에 대한 많은 해결과제가 해결되지 않은 채로 남아있다. 본 발명은 기존 기술의 많은 단점을 해결하는 신규한 해결책 및 접근법을 제공한다.
본 명세서에는 표적 핵산 서열에서 뉴클레오타이드의 실체(identity)를 결정하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: a. 다음을 포함하는 조성물을 제공하는 단계: i. 상기 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피(copy); ii. 상기 표적 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 상보적인 2개 이상의 프라이머 핵산 분자; 및 iii. 2개 이상의 폴리머라제(polymerase) 분자; b. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트(polymer nucleotide conjugate)와 상기 (a)의 조성물의 상기 표적 핵산 서열의 상기 2개 이상의 카피 사이에 다가 결합 복합체(multivalent binding complex)가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서, 상기 조성물을 상기 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 뉴클레오타이드 모이어티의 2개 이상의 카피 및 선택적으로 하나 이상의 검출가능한(detectable) 표지를 포함하는 단계; 및 c. 상기 다가 결합 복합체를 검출하여, 표적 핵산 서열에서 상기 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 다가 결합 복합체의 검출 단계는 결합되지 않은(unbounded) 또는 용액형(solution-borne) 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 부재하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 복제 또는 증폭되었거나, 또는 복제 또는 증폭에 의해 생성되었다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 형광 표지(fluorescent label)이다. 일부 실시양태에서, 다가 복합체의 검출 단계는 형광 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 1가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하며, 여기서 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸(3'-O-azidomethyl) 뉴클레오타이드, 3'-O-메틸(3-O-Methyl) 뉴클레오타이드, 또는 3'-O-알킬 하이드록실아민(3'-O-alkyl hydroxylamine) 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉 단계는 상기 다가 결합 복합체를 안정화하는 이온의 존재하에 발생한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 스트론튬 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 또는 이의 임의의 조합의 존재하에 이루어진다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 불활성이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 돌연변이 또는 화학적 변형에 의해 촉매적으로 불활성이 되었다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 필요한 이온 또는 보조인자의 부재에 의해 촉매적으로 불활성이 되었다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 다가 결합 복합체는 지속 시간이 2 초 초과이다. 일부 실시양태에서, 방법은 25 ℃ 내지 62 ℃ 범위 내의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 형광 표지를 추가로 포함하고, 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피는 표면에 침착, 부착 또는 혼성화되며, 여기서 표면 상의 다가 결합 복합체의 형광 이미지는 검출 단계에서 대조도 대 잡음비(contrast to noise ratio)가 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 단계 (a)의 조성물은 극성 비양성자성 용매를 혼입하는 완충액을 사용하여 표면 상에 침착된다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 상기 뉴클레오타이드 모이어티가 상기 표적 핵산 서열의 다음 염기에 상보적인 경우 상기 다가 결합 복합체를 안정화하고, 상기 뉴클레오타이드 모이어티가 상기 표적 핵산 서열의 상기 다음 염기에 상보적이지 않을 경우 상기 다가 결합 복합체를 불안정화하는 조건하에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 분지를 가지는 중합체를 포함하며, 상기 2개 이상의 뉴클레오타이드 모이어티는 상기 분지에 부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체는 별형(star), 빗형(comb), 가교형(cross-linked), 병솔형(bottle brush), 또는 덴드리머형(dendrimer) 형태를 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 아비딘(avidin), 비오틴(biotin), 친화성 태그(affinity tag), 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 결합 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 단계 (a)의 조성물과 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 사이에 형성된 상기 다가 결합 복합체를 불안정화하는 해리 단계를 추가로 포함하며, 상기 해리 단계는 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제거를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 핵산 서열의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를, 상기 2개 이상의 프라이머 핵산 분자에 혼입하는 연장 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 연장 단계는 상기 해리 단계와 동시에 또는 그 이후에 발생한다.
본 명세서에는 표적 핵산 서열에서 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: a. 다음을 포함하는 조성물을 제공하는 단계: i. 상기 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피; ii. 상기 표적 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 상보적인 2개 이상의 프라이머 핵산 분자; 및 iii. 2개 이상의 폴리머라제 분자; b. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 상기 (a)의 조성물의 상기 표적 핵산 서열의 상기 2개 이상의 카피 사이에 다가 결합 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서, 상기 조성물을 상기 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드 모이어티의 2개 이상의 카피 및 선택적으로 하나 이상의 절단가능하며 검출가능한 표지를 포함하는 단계; 및 c. 상기 다가 복합체를 검출하여, 표적 핵산 서열에서 상기 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 다가 결합 복합체의 검출 이후 단계 (a)의 조성물을 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드 또는 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드의 2개 이상의 카피를 포함하는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 복제 또는 증폭되었거나, 또는 복제 또는 증폭에 의해 생성되었다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시양태에서, 다가 복합체의 검출 단계는 형광 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 1가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 단계는 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하며, 여기서 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸, 3'-O-메틸, 또는 3'-O-알킬 하이드록실아민이다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉 단계는 상기 다가 결합 복합체를 안정화하는 이온의 존재하에 발생한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 불활성이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 돌연변이 또는 화학적 변형에 의해 촉매적으로 불활성이 되었다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 방법은 25 ℃ 내지 80 ℃ 범위 내의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 형광 표지를 추가로 포함하고, 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피는 표면에 침착, 부착 또는 혼성화되며, 여기서 표면 상의 다가 결합 복합체의 형광 이미지는 검출 단계에서 대조도 대 잡음비가 20 초과이다.
또한 본 명세서에는 다음을 포함하는 시스템이 개시된다: a) 다음의 단계를 포함하는 방법을 구현하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서: i) 기질의 표면에 테더링된(tethered) 표적 핵산 서열의 다중 카피를 포함하는 기질을 폴리머라제 및 상기 표적 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 상보적인 하나 이상의 프라이머 핵산 서열을 포함하는 시약과 접촉시켜, 프라이밍된 표적 핵산 서열을 형성하는 단계; ii) 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 상기 프라이밍된 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피 사이에 다가 결합 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서, 기질 표면을 상기 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 공지된 뉴클레오타이드 모이어티의 2개 이상의 카피 및 검출가능한 표지를 포함하는 단계; iii) 상기 다가 결합 복합체를 검출하기 위해 기질 표면의 이미지를 획득 및 처리하여, 표적 핵산 서열에서 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계. 일부 실시양태에서, 시스템은 일련의 시약을 기질 표면에 지정된 순서로 그리고 지정된 시간 간격 동안 전달하도록 구성된 유체 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 기질 표면의 이미지를 획득하도록 구성된 영상화 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (ii) 및 (iii)는 2회 이상 반복되어, 표적 핵산 서열에서 일련의 2개 이상의 뉴클레오타이드의 실체를 결정한다. 일부 실시양태에서, 일련의 단계는 상기 다가 결합 복합체를 불안정화하는 해리 단계를 추가로 포함하고, 상기 해리 단계는 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제거를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 일련의 단계는 표적 핵산 서열의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를, 상기 2개 이상의 프라이머 핵산 분자에 혼입하는 연장 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 연장 단계는 상기 해리 단계와 동시에 또는 그 이후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 형광단을 포함하며, 이미지는 형광 이미지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기질 표면 상의 다가 결합체 복합체의 형광 이미지는, 형광단이 사이아닌 염료 3 (Cy3)이고, 20X 대물렌즈, NA = 0.75, 532 nm 광에 최적화된 이색성 미러, 사이아닌 염료-3 방출에 최적화된 대역통과 필터, 및 카메라가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여, 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충액에 침지되면서, 비신호 포화 조건하에서 이미지가 획득된 경우, 대조도 대 잡음비가 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 일련의 단계는 60 분 미만 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 일련의 단계는 30 분 미만 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 일련의 단계는 10 분 미만 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 염기 확정의 정확도는 결정된 뉴클레오타이드 실체의 적어도 80%에 대해 Q-점수가 25를 초과하는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 염기 확정의 정확도는 결정된 뉴클레오타이드 실체의 적어도 80%에 대해 Q-점수가 30을 초과하는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 염기 확정의 정확도는 결정된 뉴클레오타이드 실체의 적어도 80%에 대해 Q-점수가 40을 초과하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에는 다음을 포함하는 조성물이 개시된다: a) 중합체 코어; 및 b) 중합체 코어에 부착된 2개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티; 여기서 링커의 길이는 중합체 코어에 부착된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티에 의존한다. 또한 본 명세서에는 다음을 포함하는 조성물이 개시된다: a) 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 혼합물로서, 여기서 각각의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는: i) 중합체 코어; 및 ii) 중합체 코어에 부착된 2개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트이며, 여기서 링커의 길이는 중합체 코어에 부착된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티에 의존하고; 여기서 혼합물은 적어도 2가지의 상이한 유형의 부착된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 코어는 복수의 분지를 가지는 중합체를 포함하며, 2개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티는 상기 분지에 부착된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 별형, 빗형, 가교형, 병솔형, 또는 덴드리머형 형태를 가진다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 아비딘, 비오틴, 친화성 태그, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 결합 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 코어는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸 뉴클레오타이드, 3'-O-메틸 뉴클레오타이드, 또는 3'-O-알킬 하이드록실아민 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 형광 표지를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서 본 명세서는 표적 핵산에서 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 임의의 특정 작업 순서에 관계없이, 다음의 단계를 포함한다: 1) 다음을 포함하는 조성물을 제공하는 단계: 동일한 서열의 2개 이상의 반복을 포함하는 표적 핵산; 상기 표적 핵산의 하나 이상의 영역에 상보적인 2개 이상의 프라이머 핵산; 및 2개 이상의 폴리머라제 분자; 2) 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 단계 (a)의 조성물 사이에 결합 또는 혼입된 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서 상기 조성물을 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 다가 결합 또는 혼입 조성물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 뉴클레오타이드의 2개 이상의 카피 및 선택적으로 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함하는 것인 단계; 및 3) 상기 결합 또는 혼입된 복합체를 검출하여, 표적 핵산 중합체에서 상기 뉴클레오타이드의 실체를 확립하는 단계. 일부 추가의 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 표적 핵산이 DNA이고, 및/또는 표적 핵산이 예컨대 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification), 브릿지 증폭(bridge amplification), 헬리카제 의존성 증폭(helicase dependent amplification), 등온 브릿지 증폭(isothermal bridge amplification), 롤링 서클 다중 치환 증폭(rolling circle multiple displacement amplification, RCA/MDA)과 같은 임의의 일반적으로 실행되는 DNA 복제 또는 증폭 방법, 및/또는 리콤비나제(recombinase) 기반의 복제 또는 증폭 방법에 의해 복제된 것이다. 일부 추가의 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 검출가능한 표지가 형광 표지이고 및/또는 복합체 검출 단계는 형광 측정을 포함하는 것이다. 일부 추가의 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 다가 결합 조성물이 1가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하고, 다가 결합 조성물은 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하고, 및/또는 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 결합 복합체 또는 혼입된 복합체가 차단된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 특히 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸 뉴클레오타이드, 3'-O-알킬 하이드록실아미노 뉴클레오타이드, 또는 3'-O-메틸 뉴클레오타이드인 것이다. 일부 추가의 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 접촉 단계가 스트론튬 이온, 바륨, 마그네슘 이온, 및/또는 칼슘 이온의 존재하에 이루어지는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 폴리머라제 분자가 촉매적으로 불활성이며, 예컨대 폴리머라제 분자는 돌연변이에 의해, 화학적 변형에 의해, 또는 필요한 이온 또는 보조인자의 부재로 인해 촉매적으로 불활성이 된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 또한 제공하는 상기 방법은, 폴리머라제 분자가 촉매적으로 활성이고, 및/또는 결합 복합체가 차단된 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 결합 복합체가 2 초 초과의 지속 시간을 가지고, 및/또는 방법이 15 ℃ 이상, 20 ℃ 이상, 25 ℃ 이상, 35 ℃ 이상, 37 ℃ 이상, 42 ℃ 이상, 55 ℃ 이상, 60 ℃ 이상, 또는 72 ℃ 이상, 또는 전술한 것 중 어느 하나에 의해 정의된 범위 이내의 온도에서 수행되거나 또는 수행될 수 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 결합 복합체가 검출 단계에서 20을 초과하는 대조도 대 잡음비를 나타내는 표면에 침착, 부착 또는 혼성화되는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 조성물이 극성 비양성자성 용매를 혼입하는 완충 조건하에 침착되는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 뉴클레오타이드가 상기 표적 핵산의 다음 염기에 상보적인 경우 상기 결합 복합체를 안정화하고, 상기 뉴클레오타이드가 상기 표적 핵산의 상기 다음 염기에 상보적이지 않은 경우 상기 결합 복합체를 불안정화하는 조건하에서 접촉 단계가 수행되는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 복수의 분지를 가지는 중합체를 포함하고, 상기 제1 뉴클레오타이드의 상기 복수의 카피가 상기 분지에 부착되며, 특히 상기 제1 중합체는 별형, 빗형, 가교형, 병솔형, 또는 덴드리머형 형태를 가지는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 아비딘, 비오틴, 친화성 태그, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 결합 기를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 단계 (a)의 조성물과 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 사이에 형성된 상기 결합 복합체를 불안정화하여, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 제거하는 해리 단계를 추가로 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 표적 핵산의 상기 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 상기 프라이머 핵산에 혼입하는 연장 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로 연장 단계는 상기 해리 단계와 동시에 또는 그 이후에 일어나는 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 2개 이상의 분지를 가지는 분지형 중합체 및 뉴클레오타이드의 2개 이상의 카피를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 뉴클레오타이드는 제1 복수의 상기 분지 또는 아암(arm)에 부착되며, 선택적으로, 하나 이상의 상호작용 모이어티는 제2 복수의 상기 분지 또는 아암에 부착된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 중합체 상에 하나 이상의 표지를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 뉴클레오사이드가 중합체당 적어도 4 개의 뉴클레오타이드의 표면 밀도를 가지는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 폴리머라제 반응 동안 연장되는 핵산 사슬로 혼입을 방지하기 위해 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함 또는 혼입하는 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 폴리머라제 반응 동안 연장되는 핵산 사슬 내로 혼입을 방지하기 위해 가역적으로 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함 또는 혼입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 하나 이상의 표지가 형광 표지, FRET 공여체, 및/또는 FRET 수용체를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 이상의 분지 또는 아암, 또는 2, 4, 8, 16, 32, 64개 이상의, 분지 또는 아암을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지 또는 아암은 중심 모이어티로부터 방사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 상호작용 모이어티를 포함할 수 있으며, 여기서 상호작용 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘; 비오틴 모이어티; 친화성 태그; 효소, 항체, 미니바디(minibody), 수용체, 또는 다른 단백질; 비-단백질 태그; 금속 친화성 태그, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 아세테이트, 폴리락트산, 또는 폴리글리콜산을 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 링커를 통해 분지 또는 아암에 부착되며; 특히 링커가 PEG를 포함하고, 여기서 PEG 링커 모이어티는 평균 분자량이 약 1 K Da, 약 2 K Da, 약 3 K Da, 약 4 K Da, 약 5 K Da, 약 10 K Da, 약 15 K Da, 약 20 K Da, 약 50 K Da, 약 100 K Da, 약 150 K Da, 또는 약 200 K Da, 또는 약 200 K Da 초과인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 링커가 PEG를 포함하고, 여기서 PEG 링커 모이어티는 평균 분자량이 약 5 K Da 내지 약 20 K Da인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 디옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오사이드, 또는 리보뉴클레오사이드를 포함하고; 및/또는 여기서 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 5' 말단을 통해 링커에 컨쥬게이션된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 중 하나가 디옥시아데노신, 디옥시구아노신, 티미딘, 디옥시우리딘, 디옥시시티딘, 아데노신, 구아노신, 5-메틸-우리딘, 및/또는 시티딘을 포함하고; 여기서 링커의 길이가 1 nm 내지 1,000 nm인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 폴리머라제 반응 또는 시퀀싱 반응 동안 신장을 억제하도록 변형된, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 뉴클레오타이드이며, 예컨대 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 3' 하이드록실 기를 가지지 않는 뉴클레오타이드; 3' 위치에 차단기를 포함하도록 변형된 뉴클레오타이드; 및/또는 3'-O-아지도 기, 3'-O-아지도메틸 기, 3'-O-알킬 하이드록실아미노 기, 3'-포스포로싸이오에이트 기, 3'-O-말론일 기, 또는 3'-O-벤질 기로 변형된 뉴클레오타이드인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 3' 위치에 변형되지 않은 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 뉴클레오타이드인 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 임의의 특정 작업 순서에 관계없이 다음의 단계를 포함한다: 1) 주형 가닥 및 주형 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 상보적 가닥을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계; 2) 핵산 분자를 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태에 따른 하나 이상의 핵산 결합 조성물과 접촉시키는 단계; 3) 핵산 분자에 대한 핵산 결합 조성물의 결합을 검출하는 단계, 및 4) 상기 핵산 분자의 상기 상보적 가닥에 혼입될 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계. 일부 실시양태에서, 본 명세서는 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 임의의 특정 작업 순서에 관계없이 다음의 단계를 포함한다: 1) 주형 가닥 및 주형 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 상보적 가닥을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계; 2) 핵산 분자를 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태에 따른 하나 이상의 핵산 결합 조성물과 접촉시키는 단계; 3) 핵산 분자에 대한 핵산 결합 조성물의 부분적 또는 완전한 혼입을 검출하는 단계, 및 4) 본 명세서에 기재된 실시양태의 부분적 또는 완전한 혼입으로부터 상기 핵산 분자의 상기 상보적 가닥에 혼입될 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 말단 뉴클레오타이드를 상기 상보적 가닥에 혼입하는 단계, 및 하나 이상의 추가적인 반복을 위한 상기 접촉, 검출, 및 혼입 단계를 반복하여, 상기 핵산 분자의 상기 주형 가닥의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 핵산 분자가 고체 지지체에 테더링되고; 특히 고체 지지체는 유리 또는 중합체 기질, 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅층, 및 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅층에 부착된 복수의 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 적어도 하나의 친수성 중합체 코팅층이 PEG를 포함하고; 및/또는 적어도 하나의 친수성 중합체 층이 적어도 8개의 분지를 가지는 분지형 친수성 중합체를 포함하는 실시양태를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 복수의 올리고뉴클레오타이드 분자가 적어도 500 분자/mm2, 적어도 1,000 분자/mm2, 적어도 5,000 분자/mm2, 적어도 10,000 분자/mm2, 적어도 20,000 분자/mm2, 적어도 50,000 분자/mm2, 적어도 100,000 분자/mm2, 또는 적어도 500,000 분자/mm2의 표면 밀도로 존재하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 핵산 분자가 고체 지지체 상에 클론 증폭된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 클론 증폭이 폴리머라제 사슬 반응 (PCR), 다중 치환 증폭 (MDA), 전사 매개 증폭 (TMA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 실시간 SDA, 브릿지 증폭, 등온 브릿지 증폭, 롤링 서클 증폭 (RCA), 서클 투 서클(circle-to-circle) 증폭, 헬리카제 의존성 증폭, 리콤비나제 의존성 증폭, 단일-가닥 결합 (SSB) 단백질 의존성 증폭, 또는 이의 임의의 조합의 사용을 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 하나 이상의 핵산 결합 조성물이 형광단으로 표지되고 검출 단계는 형광 영상화의 사용을 포함하며; 특히 형광 영상화는 이중 파장 여기/4파장 방출 형광 영상화를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 4가지 상이한 핵산 결합 조성물로서, 각각 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 조성물이 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하기 위해 사용되며, 4가지 상이한 핵산 결합 조성물은 별개의 개별적인 형광단으로 표지되고, 검출 단계는 4개의 모든 형광단을 여기하기에 충분한 파장에서 동시 여기(simultaneous excitation) 및 각각 개별적인 형광단을 검출하기에 충분한 파장에서 형광 방출의 영상화를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 4가지 상이한 핵산 결합 조성물로서, 각각 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 조성물이 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하기 위해 사용되며, 4가지 상이한 핵산 결합 조성물은 각각 사이아닌 염료 3 (Cy3), 사이아닌 염료 3.5 (Cy3.5), 사이아닌 염료 5 (Cy5), 및 사이아닌 염료 5.5 (Cy5.5)로 표지되고, 검출 단계는 각각 532 nm, 568 nm 및 633 nm 중의 임의의 두 파장에서의 동시 여기, 및 약 570 nm, 592 nm, 670 nm, 및 702 nm에서의 형광 방출의 영상화를 포함하고; 및/또는 형광 영상화는 이중 파장 여기/이중 파장 방출 형광 영상화를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 4가지 상이한 핵산 결합 조성물로서, 각각 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 조성물이 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하기 위해 사용되며, 여기서 1, 2, 3, 또는 4가지 상이한 핵산 결합 조성물이 각각 별도의 형광단 또는 형광단 세트로 각각 표지되고, 검출 단계는 1, 2, 3, 또는 4개의 형광단 또는 형광단 세트를 여기하기에 충분한 파장에서의 동시 여기, 및 각각 개별적인 형광단을 검출하기에 충분한 파장에서 형광 방출의 영상화를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 3가지 상이한 핵산 결합 또는 혼입 조성물로서, 각각 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 조성물이 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하기 위해 사용되며, 여기서 1, 2, 또는 3가지 상이한 핵산 결합 또는 혼입 조성물은 각각 별도의 형광단 또는 형광단 세트로 각각 표지되며, 검출 단계는 1, 2, 또는 3개의 형광단 또는 형광단 세트를 여기하기에 충분한 파장에서의 동시 여기, 및 각각 개별적인 형광단을 검출하기에 충분한 파장에서 형광 방출의 영상화를 포함하고, 여기서 제4 뉴클레오타이드의 검출은 "진한색(dark)" 또는 표지되지 않은 스팟 또는 표적 뉴클레오타이드를 참조하여 결정되거나 또는 결정할 수 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 다가 결합 또는 혼입 조성물이 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함할 수 있고 여기서 3 가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 결합 또는 혼입 복합체의 검출이 결합되지 않은 또는 용액형 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 부재하에 수행되는 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 4가지 상이한 핵산 결합 조성물, 또는 3가지 상이한 핵산 결합 또는 혼입 조성물로서, 각각 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 조성물이 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하기 위해 사용되며, 여기서 4가지 또는 3가지 상이한 핵산 결합 또는 혼입 조성물 중 하나는 제1 형광단으로 표지되고, 하나는 제2 형광단으로 표지되고, 하나는 제1 및 제2 형광단 둘 모두로 표지되고, 하나는 표지되지 않거나 부재하고, 여기서 검출 단계는 제1 여기 파장 및 제2 여기 파장에서 동시 여기를 포함하며 이미지는 제1 형광 방출 파장 및 제2 형광 방출 파장에서 획득된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 제1 형광단이 Cy3이고, 제2 형광단이 Cy5이고, 제1 여기 파장이 532 nm 또는 568 nm이고, 제2 여기 파장이 633 nm이고, 제1 형광 방출 파장이 약 570 nm이고, 제2 형광 방출 파장이 약 670 nm인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 검출 표지가 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍의 하나 이상의 부분을 포함하여, 이로 인해 단일 여기 및 영상화 단계 하에 다중 분류화가 수행될 수 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 접촉, 검출, 및 혼입/연장 단계를 포함하는 시퀀싱 반응 사이클이 30 분 미만, 20 분 미만, 또는 10 분 미만으로 수행되는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 시퀀싱 실행에 걸친 염기 확정 정확도에 대한 평균 Q-점수가 30 이상, 및/또는 40 이상인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 식별된 말단 뉴클레오타이드 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 30 초과 및/또는 40 이상의 Q-점수를 가지는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 식별된 말단 뉴클레오타이드 중 적어도 95%가 30 초과의 Q-점수를 가지는 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 핵산 결합 조성물 및 완충제를 포함하는 시약을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 명세서는 시약을 제공하며, 여기서 상기 시약은 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물을 포함하고, 여기서 각각 핵산 결합 또는 혼입 조성물은 단일 유형의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서의 시약은 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물을 포함하며, 여기서 각각 핵산 결합 또는 혼입 조성물은 단일 유형의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체는 각각 다음에 해당할 수 있다: 아데노신 트라이포스페이트 (ATP), 아데노신 다이포스페이트 (ADP), 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 디옥시아데노신 트라이포스페이트 (dATP), 디옥시아데노신 다이포스페이트 (dADP), 및 디옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상; 티미딘 트라이포스페이트 (TTP), 티미딘 다이포스페이트 (TDP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 디옥시티미딘 트라이포스페이트 (dTTP), 디옥시티미딘 다이포스페이트 (dTDP), 디옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 우리딘 트라이포스페이트 (UTP), 우리딘 다이포스페이트 (UDP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 디옥시우리딘 트라이포스페이트 (dUTP), 디옥시우리딘 다이포스페이트 (dUDP), 및 디옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상; 시티딘 트라이포스페이트 (CTP), 시티딘 다이포스페이트 (CDP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 디옥시시티딘 트라이포스페이트 (dCTP), 디옥시시티딘 다이포스페이트 (dCDP), 및 디옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상; 및 구아노신 트라이포스페이트 (GTP), 구아노신 다이포스페이트 (GDP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 디옥시구아노신 트라이포스페이트 (dGTP), 디옥시구아노신 다이포스페이트 (dGDP), 및 디옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상. 일부 다른 예시 또는 일부 추가적인 예시에서, 본 명세서는 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물을 포함하거나, 또는 추가로 포함하는 시약을 제공하며, 여기서 각각 핵산 결합 또는 혼입 조성물은 단일 유형의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체는 각각 ATP, ADP, AMP, dATP, dADP, dAMP, TTP, TDP, TMP, dTTP, dTDP, dTMP, UTP, UDP, UMP, dUTP, dUDP, dUMP, CTP, CDP, CMP, dCTP, dCDP, dCMP, GTP, GDP, GMP, dGTP, dGDP, 및 dGMP로 이루어진 군으로부터 하나 이상에 해당할 수 있다.
본 명세서에는 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태의 핵산 결합 또는 혼입 조성물 및/또는 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태의 시약, 및/또는 하나 이상의 완충제; 및 이의 사용 지침을 포함하는 키트가 개시된다.
본 명세서에는 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태의 방법을 수행하기 위한 시스템이 개시되며, 이는 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태의 핵산 결합 또는 혼입 조성물, 및/또는 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태의 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 테더링된, 프라이밍된 핵산 분자와 상기 핵산 결합 또는 혼입 조성물 및/또는 상기 시약의 순차적인 접촉; 및 하나 이상의 프라이밍된 핵산 분자에 대한 개시된 핵산 결합 또는 혼입 조성물의 결합 또는 혼입의 검출을 반복적으로 수행하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 입자 (예를 들어, 나노입자 또는 중합체 코어)를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 입자는 복수의 효소 또는 단백질 결합 또는 혼입 기질을 포함하고, 여기서 효소 또는 단백질 결합 또는 혼입 기질은 하나 이상의 효소 또는 단백질과 결합하여, 하나 이상의 결합 또는 혼입 복합체 (예를 들어, 다가 결합 또는 혼입 복합체)를 형성하고, 여기서 상기 결합 또는 혼입은 하나 이상의 결합 또는 혼입 복합체의 위치, 존재, 또는 지속성을 관찰함으로써 모니터링 또는 식별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 입자는 중합체, 분지형 중합체, 덴드리머, 리포솜, 미셀, 나노입자, 또는 퀀텀 닷(quantum dot)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기질은 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 또는 단백질 결합 또는 혼입 기질은 폴리머라제와 결합할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 또는 단백질은 폴리머라제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 결합 또는 혼입 복합체의 위치, 존재, 또는 지속성의 상기 관찰은 형광 검출을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 바와 같은 다수의 별도의 입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 각각 입자는 단일 유형의 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하고, 이러한 각각 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체는 검출가능하게 상이한 방출 또는 여기 파장의 형광 표지와 회합된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 입자 상에 하나 이상의 표지, 예를 들어, 형광 표지를 추가로 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 조성물이 입자에 테더링된 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 20 개 초과의 테더링된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체가 μm2당 0.001 내지 1,000,000, μm2당 0.01 내지 1,000,000, μm2당 0.1 내지 1,000,000, μm2당 1 내지 1,000,000, μm2당 10 내지 1,000,000, μm2당 100 내지 1,000,000, μm2당 1,000 내지 1,000,000, μm2당 1,000 내지 100,000, μm2당 10,000 내지 100,000, 또는 μm2당 50,000 내지 100,000, 또는 전술한 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위 이내의 표면 밀도로 존재하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체가 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 내에 존재하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 조성물이 폴리머라제 반응 동안 연장되는 핵산 사슬로 혼입을 방지하기 위해 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함 또는 혼입하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 조성물이 폴리머라제 반응 동안 연장되는 핵산 사슬로 혼입을 방지하기 위해 가역적으로 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함 또는 혼입하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 하나 이상의 표지가 형광 표지, FRET 공여체, 및/또는 FRET 수용체를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 기질 (예를 들어, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체)가 링커를 통해 입자에 부착되는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 조성물은, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 폴리머라제 반응 또는 시퀀싱 반응 동안 신장을 억제하도록 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 예를 들어, 3' 하이드록실 기를 가지지 않는 뉴클레오타이드; 3' 위치에 차단기를 포함하도록 변형된 뉴클레오타이드; 3'-O-아지도 기, 3'-O-아지도메틸 기, 3'-O-알킬 하이드록실아미노 기, 3'-포스포로싸이오에이트 기, 3'-O-말론일 기, 또는 3'-O-벤질 기로 변형된 뉴클레오타이드; 및/또는 3' 위치에서 변형되지 않은 뉴클레오타이드인 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 순서에 관계없이 다음의 단계를 포함한다: 1) 주형 가닥 및 주형 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 상보적 가닥을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계; 2) 핵산 분자를 본 명세서에 개시된 임의의 실시양태에 따른 하나 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물과 접촉시키는 단계; 3) 핵산 분자에 대한 핵산 결합 또는 혼입 조성물의 결합 또는 혼입을 검출하는 단계, 및 4) 상기 핵산 분자의 상기 상보적 가닥에 혼입될 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 말단 뉴클레오타이드를 상기 상보적 가닥에 혼입하는 단계, 및 하나 이상의 추가적인 반복을 위한 상기 접촉, 검출, 및 혼입 단계를 반복하여, 상기 핵산 분자의 상기 주형 가닥의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 핵산 분자가 고체 지지체 상에 클론 증폭된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 클론 증폭이 폴리머라제 사슬 반응 (PCR), 다중 치환 증폭 (MDA), 전사 매개 증폭 (TMA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 실시간 SDA, 브릿지 증폭, 등온 브릿지 증폭, 롤링 서클 증폭, 서클 투 서클(circle-to-circle) 증폭, 헬리카제 의존성 증폭, 리콤비나제 의존성 증폭, 단일-가닥 결합 (SSB) 단백질 의존성 증폭, 또는 이의 임의의 조합의 사용을 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 접촉, 검출, 및 혼입 단계를 포함하는 시퀀싱 반응 사이클이 30 분 미만, 20 분 미만, 또는 10 분 미만으로 수행되는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 시퀀싱 실행에 걸친 염기 확정 정확도에 대한 평균 Q-점수가 30 이상, 또는 40 이상인 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 식별된 말단 뉴클레오타이드 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 30 초과; 또는 40 초과의 Q-점수를 가지는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 식별된 말단 뉴클레오타이드 중 적어도 95%가 30 초과의 Q-점수를 가지는 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물, 및 완충제를 포함하는 시약을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 시약은, 상기 시약이 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물을 포함하고, 여기서 각각 핵산 결합 또는 혼입 조성물이 단일 유형의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 시약이 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물을 포함하고, 여기서 각각 핵산 결합 또는 혼입 조성물이 단일 유형의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 각각 ATP, ADP, AMP, dATP, dADP, 및 dAMP으로 이루어진 군으로부터 하나 이상; TTP, TDP, TMP, dTTP, dTDP, dTMP, UTP, UDP, UMP, dUTP, dUDP, 및 dUMP으로 이루어진 군으로부터 하나 이상; CTP, CDP, CMP, dCTP, dCDP, 및 dCMP으로 이루어진 군으로부터 하나 이상; 및 GTP, GDP, GMP, dGTP, dGDP, 및 dGMP으로 이루어진 군으로부터 하나 이상에 해당할 수 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 상기 시약이 1, 2, 3, 4개 이상의 핵산 결합 또는 혼입 조성물을 포함하고, 여기서 각각 핵산 결합 또는 혼입 조성물이 단일 유형의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 각각 ATP, ADP, AMP, dATP, dADP, dAMP TTP, TDP, TMP, dTTP, dTDP, dTMP, UTP, UDP, UMP, dUTP, dUDP, dUMP, CTP, CDP, CMP, dCTP, dCDP, dCMP, GTP, GDP, GMP, dGTP, dGDP, 및 dGMP으로 이루어진 군으로부터 하나 이상에 해당할 수 있는 것이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 임의의 조성물; 및/또는 본 명세서에 개시된 임의의 시약; 하나 이상의 완충제; 및 이의 사용 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 임의의 방법을 수행하기 위한 시스템을 제공하며; 여기서 상기 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 조성물; 및/또는 본 명세서에 개시된 임의의 시약; 하나 이상의 완충제, 및 고체 지지체에 선택적으로 테더링된 또는 부착된 하나 이상의 핵산 분자의 사용을 포함할 수 있고, 여기서 상기 시스템은 상기 핵산 분자와 상기 조성물 및/또는 상기 시약의 순차적인 접촉; 및 하나 이상의 핵산 분자에 대한 핵산 결합 또는 혼입 조성물의 결합 또는 혼입을 검출을 반복적으로 수행하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 표면에 결합 또는 회합된, 표지된 핵산 복합체의 대조도 대 잡음비 (CNR)를 증가시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 표면에 결합 또는 회합된, 표지된 핵산 복합체로부터 신호의 지속 시간에 대한 제어를 확립 또는 유지하는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 표면에 결합 또는 회합된, 표지된 핵산 복합체로부터 형광, 발광, 전기, 전기화학, 비색, 방사성, 자기, 또는 전자기 신호의 지속 시간에 대한 제어를 확립 또는 유지하는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 핵산 시퀀싱 및/또는 유전형 분석(genotyping) 적용의 특이성, 정확성, 또는 판독 길이를 증가시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 결합 또는 혼입에 의한 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱, 또는 앙상블 시퀀싱 방법에서 특이성, 정확성, 또는 판독 길이를 증가시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 표면에 결합 또는 회합된, 표지된 핵산 복합체의 대조도 대 잡음비 (CNR)를 증가시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 시약을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 표면에 결합 또는 회합된, 표지된 핵산 복합체로부터 신호의 지속 시간에 대한 제어를 확립 또는 유지하는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 시약을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 표면에 결합 또는 회합된, 표지된 핵산 복합체로부터 형광, 발광, 전기, 전기화학, 비색, 방사성, 자기, 또는 전자기 신호의 지속 시간에 대한 제어를 확립 또는 유지하는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 시약을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 핵산 시퀀싱 및/또는 유전형 분석 적용의 특이성, 정확성, 또는 판독 길이를 증가시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 시약을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서는 결합 또는 혼입에 의한 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱, 또는 앙상블 시퀀싱 방법에서 특이성, 정확성, 또는 판독 길이를 증가시키는데 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 시약을 제공한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원 그 전체가 구체적으로 및 개별적으로 참조 문헌으로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 인용된다. 본 명세서의 용어와 포함되는 참조 문헌의 용어가 상충되는 경우, 본 명세서의 용어가 우선한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)과 함께 공개된 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 특허청에 요청 및 필요한 요금 지불시 제공될 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 개념의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 개시된 구성, 방법 및 시스템의 특징 및 이점의 더 나은 이해가 본 발명의 개념의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1A-1H는 표적 핵산을 시퀀싱하기 위한 다가 결합 조성물의 비제한적인 예를 활용하는 단계를 도시하며: 도 1A는 표적 핵산을 표면에 부착하는 비제한적인 예시 4를 도시하고; 도 1B는 증폭된 표적 핵산 분자의 클러스터를 형성하기 위한 표적 핵산을 클론적으로 도시하고; 도 1C는 프라이밍된 표적 핵산을 생성하기 위한 표적 핵산의 프라이밍의 비제한적인 예시를 도시하고; 도 1D는 프라이밍된 표적 핵산을 다가 결합 조성물 및 폴리머라제와 접촉시켜 결합 복합체를 형성하는 비제한적인 예시를 도시하고; 도 1E는 표면에 포착된 결합 복합체의 이미지의 비제한적인 예시를 도시하고; 도 1F는 하나의 뉴클레오타이드로 프라이머 가닥을 연장하는 비제한적인 예시를 도시하고; 도 1G 는 프라이밍된 표적 핵산을 다가 결합 조성물 및 폴리머라제와 접촉시켜 결합 복합체를 형성하는 또 다른 사이클의 비제한적적인 예시를 도시하고; 도 1H는 후속 시퀀싱 사이클에서 표면에 포착된 결합 복합체의 이미지의 비제한적인 예시를 도시한다.
도 2는 표적 핵산을 시퀀싱하고 단일 염기 첨가를 통해 프라이머 가닥을 연장하는 단계를 개략적으로 설명하는 흐름도를 도시한다.
도 3은 표적 핵산을 시퀀싱하고 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 뉴클레오타이드를 혼입함으로써 프라이머 가닥을 연장하는 단계를 개략적으로 설명하는 흐름도를 도시한다.
도 4A-4B는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용한 표적 핵산 검출의 비제한적인 예시를 예시한다. 도 4A는 폴리머라제 및 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 일부 핵산 분자에 접촉하는 단계를 도시하고; 도 4B는 폴리머라제, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 및 표적 핵산 분자 사이에 형성된 결합 복합체를 도시한다.
도 5A-5C는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 다양반 배열의 비제한적인 예시를 개략도로 도시한다: 도 5A는 다양한 다중 아암 구조를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 도시하고; 도 5B는 중심으로부터 방사되는 중합체 분지를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 도시하고; 도 5C는 결합 모이어티 비오틴을 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 도시한다.
도 6은 다가 기질의 결합, 지속 및 세척 및 제거 동안 관찰된 신호 강도의 증가를 일반화된 그래프 묘사로 도시한다.
도 7A-7J는 다가 PEG-기질 조성물을 사용한 시퀀싱 반응의 단계의 형광 이미지를 도시한다. 도 7A: DNA RCA 주형 (G 및 A 제1 염기)를 500 nM 염기 표지된 뉴클레오타이드 (A-Cy3 및 G-Cy5)에 대해 -20 nM Klenow 폴리머라제 및 2.5 mM Sr+2를 포함하는 노출 완충액에서 노출한 후 적색 및 녹색 형광 이미지. 노출 완충액과 동일한 조성이지만 뉴클레오타이드 또는 폴리머라제를 포함하지 않는 영상화 완충액으로 세척한 후 이미지를 수집하였다. 가장 희미한 신호의 시각화를 최대화하도록 대비를 조정했지만, 영상화 완충액으로 세척한 후 신호가 지속되지 않았다 (도 7A, 삽입 그림). 도 7B-7E: 노출 완충액에서 혼합 및 상기와 같은 영상화 완충액에서 영상화 후 500 nM에서 다가 PEG-뉴클레오타이드 (염기-표지) 리간드 PB1 (도 7B), PB2 (도 7C), PB3 (도 7D), 및 PB5 (도 7E)를 도시하는 형광 이미지. 도 7F: 노출 완충액에서 혼합 및 상기와 같은 영상화 완충액에서 영상화 후 2.5uM에서 다가 PEG-뉴클레오타이드 (염기-표지) 리간드 PB5를 도시하는 형광 이미지. 도 7G-7I: Klenow 폴리머라제의 불활성 돌연변이 (도 7G: D882H; 도 7H: D882E; 도 7I: D882A), 대 야생형 Klenow (대조군) 효소(도 7J)에 대한 다가 리간드 노출에 의한 추가적인 염기 구별을 도시하는 형광 이미지.
도 8A-8B는 5개의 시퀀싱 사이클에 걸쳐 DNA 서열의 염기 서열을 결정하는데 있어서 다가 리포터 조성물의 효능을 도시한다: 도 8A는 각 시퀀싱 사이클 이후 취해진 주형에 대한 이미지 및 예상 서열을 도시하고; 도 8B는 도 8A에 촬영된 이미지를 활용하여 정렬된 시퀀싱 결과를 도시한다.
도 9A-9J는 500 nM의 유효 뉴클레오타이드 농도 및 다양한 PEG 분지 길이를 가지는 다가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체-뉴클레오타이드 (염기-표지된) 컨쥬게이트를, 20 nM Klenow 폴리머라제 및 2.5 mM Sr+2를 포함하는 노출 완충액에서 DNA 주형을 포함하는 지지체 표면 (제1 염기로서 G 또는 A 포함; 롤링 서클 증폭 (RCA)을 사용하여 제조)에 접촉시킨 후의 형광 이미지를 도시한다. 노출 완충액과 동일한 조성이지만 뉴클레오타이드 및 폴리머라제를 포함하지 않는 영상화 완충액으로 세척한 후 이미지를 획득하였다. 패널은 다음과 같은 아암 길이를 가지는 다가 PEG-뉴클레오타이드 리간드를 사용하여 수득된 이미지를 도시한다. 도 9A: 1 K PEG. 도 9B: 2 K PEG. 도 9C: 3 K PEG. 도 9D: 5 K PEG. 도 9E: 10 K PEG. 도 9F: 20 K PEG. 도 9G는 10 K PEG 및 돌연변이 D882H를 포함하는 불활성 klenow 폴리머라제를 사용하여 수득된 이미지를 도시한다. 도 9H는 10 K PEG 및 돌연변이 D882E를 포함하는 불활성 klenow 폴리머라제를 사용하여 수득된 이미지를 도시한다. 도 9I는 10 K PEG 및 돌연변이 D882A를 포함하는 불활성 klenow 폴리머라제를 사용하여 수득된 이미지를 도시한다. 도 9J는 10 K PEG 및 활성 야생형 klenow 폴리머라제를 사용하여 수득된 이미지를 도시한다.
도 10은 도 9A-9F에 도시된 이미지의 형광 강도를 정량적인 표현을 도시하며, with 적색 표지 (Cy3 표지; A 염기)에 해당하는 주황색 추적 및 녹색 표지 (Cy5 표지; G 염기)에 해당하는 청색 추적의, 색상값으로 구분된다.
도 11은 도 7A-7J에 기재된 바와 같은 DNA 클러스터에 결합된 다가 기질로부터 정규화된 형광을 도시하며, 기질 복합체는 Triton-X100 (0.016%)의 존재 (조건 B) 및 부재 (조건 A) 하에 형성된다.
도 12A-12B는 다가 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 유리 뉴클레오타이드에 대해 측정된 정규화된 형광 강도의 플롯을 도시한다. 도 12A: 1 분후, DNA 클러스터에 결합된 다가 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 (조건 A 및 B) 대 표지된 유리 뉴클레오타이드를 사용하여 결합 복합체 (조건 C)의 두 가지 복제물; 도 12B: 60 분 경과에 걸친 다가 기질 복합체로부터의 형광 시간 경과.
상세한 설명
I. 정의
본 명세서에서 사용 시, "핵산" (또한 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", 리보핵산 (RNA), 또는 디옥시리보핵산 (DNA)으로 지칭)은 공유적인 뉴클레오사이드간 연결부에 의해 연결된 2개 이상의 뉴클레오타이드의 선형 중합체, 또는 이의 변이체 또는 기능적 단편이다. 핵산의 천연 발생 예시에서, 뉴클레오사이드간 연결부는 포스포다이에스터 결합(phosphodiester bond)이다. 그러나, 다른 예시는 선택적으로 다른 뉴클레오사이드간 연결부, 예컨대 포스포로싸이올레이트(phosphorothiolate) 연결부를 포함하거나, 또는 포스페이트 기를 포함하지 않을 수도 있다. 핵산은 이중- 및 단일-가닥 DNA, 뿐만 아니라 이중- 및 단일-가닥 RNA, DNA/RNA 혼성체, 펩타이드-핵산 (PNA), PNA와 DNA 또는 RNA 사이의 혼성체를 포함하며, 다른 유형의 핵산 변형체를 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 또는 이의 유사체를 지칭한다. 뉴클레오타이드는 천연 존재 및 화학적 변형 뉴클레오타이드 둘 모두를 지칭하며, 뉴클레오사이드, 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 단백질-핵산 잔기, 또는 유도체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드의 예로는 아데닌, 타이민, 우라실, 사이토신, 구아닌, 또는 이의 잔기; 디옥시아데닌, 디옥시타이민, 디옥시우라실, 디옥시사이토신, 디옥시구아닌, 또는 이의 잔기; 아데닌 PNA, 타이민 PNA, 우라실 PNA, 사이토신 PNA, 구아닌 PNA, 또는 이의 잔기 또는 등가물, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코사이드 (예를 들어, 2-디옥시-D-리보스를 포함하는 디옥시리보뉴클레오사이드 또는 D-리보스를 포함하는 리보뉴클레오사이드)를 포함한다.
본 명세서에서 사용 시, "상보적(complementary)"은 또는 리간드 분자 및 이의 수용체의 상호작용하는 표면의 위상학적 적합성(topological compatibility) 또는 함께 일치(matching)하는 것을 지칭한다. 이에 따라, 수용체 및 이의 리간드는 상보적이라고 설명될 수 있으며, 더 나아가, 접폭 표면 특성은 서로 상보적이다.
본 명세서에서 사용 시, "분지형 중합체"는 뉴클레오타이드와 같은 생물학적 활성 분자를 컨쥬게이션하도록 돕는 복수의 작용기를 가지는 중합체를 지칭하며, 이러한 작용기는 중합체의 곁사슬에 있거나, 또는 중합체의 중심 코어 또는 중심 골격에 직접적으로 부착할 수 있다. 분지형 중합체는 컨쥬게이션을 위한 골격에서 나오는 하나 이상의 작용기를 가지는 선형 골격을 가질 수 있다. 분지형 중합체는 또한 하나 이상의 곁사슬을 가지는 중합체일 수 있으며, 이러한 곁사슬은 컨쥬게이션에 적합한 부위를 가진다. 작용기의 예로는 하이드록실, 에스터, 아민, 카보네이트, 아세탈, 알데하이드, 알데하이드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 활성 설폰, 하이드라자이드, 싸이올, 알칸산, 산 할로겐화물, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 다이싸이오피리딘, 비닐피리딘, 아이오도아세트아마이드, 에폭사이드, 글리옥살, 다이온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 시, "폴리머라제"는 뉴클레오타이드 결합 모이어티를 포함하는 효소를 지칭하며, 표적 핵산과 상보적인 뉴클레오타이드 사이에 결합 복합체의 형성을 돕는다. 폴리머라제는 하나 이상의 활성을 가질 수 있으며, 이러한 활성으로 염기 유사체 검출 활성, DNA 중합 활성, 역전사효소 활성, DNA 결합 또는 혼입, 가닥 치환 활성, 및 뉴클레오타이드 결합 또는 혼입 및 인식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리머라제는 촉매적으로 불활성인 폴리머라제, 촉매적으로 활성인 폴리머라제, 역전사효소, 및 뉴클레오타이드 결합 또는 혼입 모이어티를 포함하는 다른 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "지속 시간"은 표적 핵산, 폴리머라제, 컨쥬게이션된 또는 컨쥬게이트되지 않은 뉴클레오타이드 사이에 형성된 결합 복합체가, 결합 복합체로부터 임의의 결합 구성요소이 해리되지 않고 안정한 상태로 남아있는 시간의 길이를 지칭한다. 지속 시간은 결합 복합체의 안정성 및 결합 상호작용의 강도를 나타낸다. 지속 시간은 결합 복합체의 시작 및/또는 지속 시간을 관찰함으로써, 예컨대 결합 복합체의 표지된 구성요소로부터 신호를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 표지된 시약이 결합 복합체에 존재할 수 있으며, 따라서 결합 복합체의 지속 시간 동안 표지로부터 신호가 검출될 수 있다. 표지 중 하나의 비제한적인 예시가 형광 표지이다.
II. 표적 핵산의 분석 방법
본 명세서에는 다가 결합 또는 혼입 조성물과 시퀀싱 또는 기타 생물검정 적용을 비롯한 핵산 분자의 분석에서 이의 용도가 개시된다. 효소 (예를 들어, 폴리머라제) 또는 효소 복합체에 대한 뉴클레오타이드의 결합 또는 혼입 증가는 뉴클레오타이드의 유효 농도 증가에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 증가는 자유 용액에서 뉴클레오타이드의 농도를 증가시키거나, 또는 관련 결합 또는 혼입 부위 근처에 뉴클레오타이드의 양을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 증가는 또한 제한된 부피로 뉴클레오타이드의 수를 물리적으로 제한하여 농도를 국부적으로 증가시킴으로써 달성될 수 있고, 이에 따라 이러한 구조가 컨쥬게이트되지 않은(unconjugated), 테더링되지 않은(untethered), 또는 그렇지 않으면 제한되지 않은(unrestricted) 개별 뉴클레오타이드에서 관찰되는 것보다 더 높은 겉보기 결합력(apparent avidity)으로 결합 또는 혼입 부위에 결합 또는 혼입될 수 있다. 이러한 제한을 수행하는 하나의 비제한적 수단으로는 다중 뉴클레오타이드가 입자에 결합된 다가 결합 또는 혼입 조성물을 제공하는 것이며, 이러한 입자로는 중합체, 분지형 중합체, 덴드리머, 미셀, 리포솜, 마이크로입자, 나노입자, 퀀텀 닷, 또는 다른 기술 분야에 공지된 적합한 입자가 있다.
본 명세서에 개시된 다가 결합 또는 혼입 조성물은 적어도 하나의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함할 수 있으며, 이러한 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 입자에 부착된 동일한 뉴클레오타이드의 복수의 카피를 가진다. 뉴클레오타이드가 표적 핵산에 상보적일 때, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 폴리머라제 및 표적 핵산과 결합 또는 혼입 복합체를 형성하고, 결합 또는 혼입 복합체는 단일 컨쥬게이트되지 않은 또는 테더링되지 않은 뉴클레오타이드를 사용하여 형성된 결합 또는 혼입 복합체보다 증가된 안정성, 및 더욱 길어진 지속시간을 나타낸다. 다가 결합 조성물의 뉴클레오타이드 모이어티 각각은 프라이밍된 표적 핵산 분자의 상보적인 N+1 뉴클레오타이드에 결합하여, 2개 이상의 표적 핵산 분자, 2개 이상의 폴리머라제 (또는 다른 효소) 분자, 및 다가 결합 조성물 (예를 들어, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트)를 포함하는 다가 결합 복합체를 형성할 수 있다. 다가 결합 조성물의 뉴클레오타이드 모이어티 각각은 프라이밍된 표적 핵산 분자의 상보적인 N 뉴클레오타이드에 결합하여, 2개 이상의 표적 핵산 분자, 2개 이상의 폴리머라제 (또는 다른 효소) 분자, 및 다가 결합 조성물 (예를 들어, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트)를 포함하는 다가 결합 복합체를 형성할 수 있다. 상기 결합된 복합체로부터 뉴클레오타이드는 복제 가닥을 1개의 염기만큼 연장하는 변형된 가역적으로 차단된 뉴클레오타이드를 혼입하기 전에 상보적인 염기를 조사할 수 있다. 또한, 결합된 복합체로 N 뉴클레오타이드를 조사하고, 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드로 나아가고, 이어서 N+1 염기를 보호 해제 전후로 프로빙하는 것을 생각해볼 수 있다. 이러한 방식으로 오류 검사를 수행하고 조사 대상을 2회 판독함으로써 염기 확정의 전체적인 정확도를 개선할 수 있다. 전통적인 방법과의 중요한 구별 요소는, 결합이 일치하는 염기를 조사하는데 사용되는 반면, 단계화 또는 혼입 단계는 연장 가닥에서 앞으로 이동하는 것에만 사용된다는 점이다.
다가 결합 또는 혼입 조성물은 검출가능한 신호를 상호작용의 활성 영역, 예컨대 단백질-핵산 상호작용, 핵산 혼성화 반응, 또는 폴리머라제 반응과 같은 효소 반응의 부위에 국소화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 다가 결합 또는 혼입 조성물은 폴리머라제 반응 동안 핵산 사슬을 연장하는 염기 혼입 부위를 식별하고 시퀀싱 및 어레이 기반 적용을 위한 염기 구별을 제공하도록 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드가 표적 핵산에 상보적일 때, 다가 결합 또는 혼입 조성물에서 표적 핵산과 뉴클레오타이드 사이의 결합 또는 혼입이 증가하면 신호가 향상되어 염기 확정 정확도를 크게 개선하고 영상화 시간을 단축한다.
또한, 다가 결합 조성물을 사용하면 주어진 서열로부터의 시퀀싱 신호가 표적 서열의 다중 카피를 포함하는 클러스터 영역 내에서 발생하도록 할 수 있다. 표적 서열의 다중 카피를 혼입하는 시퀀싱 방법은 정의된 영역 내에서 다중 동시 시퀀싱 반응의 존재로 인해 신호가 증폭되어, 각각 고유의 신호를 제공하는 이점을 제공한다. 정의된 영역 내에 다중 신호의 존재는 또한 많은 수의 정확한 염기 확정의 신호가 적은 수의 스킵 또는 잘못된 염기 확정 신호를 압도할 수 있다는 사실때문에, 임의의 스킵한 단일 주기의 영향을 감소시켜 페이징 오류(phasing error)를 감소시키고 및/또는 시퀀싱 반응에서 판독 길이를 개선하기 위한 방법을 제공한다.
본 명세서에 개시된 다가 결합 조성물 및 이의 용도는 다음 중 하나 이상을 야기한다: (i) 종래의 핵산 증폭 및 시퀀싱 방법론과 비교하여 더 나은 염기 확정 정확도를 위한 더 강한 신호; ii) 백그라운드 신호로부터 서열 특이적 신호의 더 큰 구별 허용; (iii) 필요한 출발 물질의 양에 대한 요건 감소, (iv) 시퀀싱 속도 증가 및 시퀀싱 시간 단축; (v) 페이징 에러 감소, 및 (vi) 시퀀싱 반응에서 판독 길이 개선.
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 하나 이상의 핵산 분자를 가지는 표적 핵산 샘플을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 복수의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 2개 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 동일한 서열을 가지는 2개 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
A. 표적 핵산 시퀀싱
도 1A-1H는 다가 결합 조성물이 표적 핵산을 시퀀싱하는데 사용되는 예시적인 방법을 예시한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 표적 핵산(102)은 고체 지지체 표면(101)에 테더링될 수 있다. 표적 핵산은 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 도 1A에 도시되어 있지 않지만, 표적 핵산(102)은 공유 또는 비공유 결합을 통해 표면에 부착되는 어댑터에 혼성화될 수 있다. 하나 이상의 어댑터가 표적 핵산을 표면에 부착하기 위해 사용되는 경우, 표적 표면은 어댑터에 상보적이며 따라서 어댑터에 혼성화하는 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 어댑터 서열이 표면에 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 어댑터 서열이 표면에 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 표적 핵산(102)은 또한 어댑터를 사용하지 않고 고체-지지체 표면에 직접적으로 부착될 수 있다. 고체 지지체는 낮은 비특이적 결합 표면일 수 있다.
도 1B에서, 표적 핵산을 고체 지지체 표면 (예를 들어, 어댑터에 대한 혼성화를 통해)의 표면에 부착하는 초기 단계 이후, 표적 핵산은 증폭된 핵산의 클러스터를 형성하도록 클론 증폭된다. 표적 핵산이 어댑터를 통해 표면에 부착될 때, 지지체 표면의 어댑터에 혼성화된 클론 증폭 핵산 서열의 표면 밀도는 테더링된 어댑터 (또는 프라이머)의 표면 밀도와 동일한 범위에 걸쳐 있을 수 있다. 클론 증폭은 폴리머라제 사슬 반응 (PCR), 다중 치환 증폭 (MDA), 전사 매개 증폭 (TMA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 가닥 치환 증폭 (SDA), 실시간 SDA, 브릿지 증폭, 등온 브릿지 증폭, 롤링 서클 증폭, 서클 투 서클(circle-to-circle) 증폭, 헬리카제 의존성 증폭, 리콤비나제 의존성 증폭, 단일-가닥 결합 (SSB) 단백질 의존성 증폭, 또는 이의 임의의 조합의 사용하여 수행될 수 있다.
도 1C는 프라이머(103)가 표적 핵산(102)에 어닐링하여 프라이밍된 표적 핵산(104)을 형성하는 비제한적인 단계를 예시한다. 도 1B가 어닐링 단계에서 하나의 프라이머만 사용되는 것을 도시하지만, 표적 핵산의 유형에 따라 하나 이상의 프라이머가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 표적 핵산을 표면에 부착하는데 사용되는 어댑터는 프라이밍된 표적 핵산을 제조하는데 사용되는 프라이머와 동일한 서열을 가진다. 프라이머는 정방향 증폭 프라이머, 역방향 증폭 프라이머, 시퀀싱 프라이머, 및/또는 분자 바코딩 서열, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 프라이머 서열이 혼성화 단계에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 복수의 상이한 프라이머 서열이 혼성화 단계에 사용될 수 있다.
도 1D에 도시된 바와 같이, 프라이밍된 표적 핵산(104)은 다가 결합 또는 혼입 조성물 및 폴리머라제(106)와 조합되어 결합 또는 혼입 복합체를 형성한다. 도 1D의 다가 결합 또는 혼입 조성물의 비제한적인 예시로는 4가지 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트(105a), (105b), (105c), 및 (105d)를 포함한다. 각각의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 입자에 부착된 뉴클레오타이드의 다중 카피를 가지며, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 4가지 유형의 뉴클레오타이드 각각을 커버한다. 프라이밍된 표적 핵산의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 가지는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 폴리머라제 및 표적 핵산과 함께 결합 또는 혼입 복합체를 형성할 것이다. 일부 경우에, 다가 결합 또는 혼입 조성물은 1, 2 또는 3개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각 상이한 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 별개의 표지로 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 4가지 유형의 뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 3가지 유형이 표지될 수 있고, 네 번째 유형은 표지되지 않거나 검출불가능한 표지에 또는 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 동일한 표지로, 또는 각각 이의 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드의 실체에 상응하는 표지로 표지될 수 있고, 각각, 3, 2, 1개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는, 또는 어떠한 컨쥬게이트도 표지되지 않거나, 또는 검출불가능한 표지에 또는 컨쥬게이션된 상태로 남아있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 혼입하는 폴리머라제 복합체의 검출은 4색 검출을 사용하여 수행될 수 있으며, 따라서 모든 4개의 뉴클레오타이드에 상응하는 컨쥬게이트가 샘플에 존재하며, 각각 컨쥬게이트는 그에 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드에 상응하는 별개의 표지를 가진다. 일부 실시양태에서, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 표적 핵산에 동시에 노출 또는 접촉될 수 있고; 일부 다른 실시양태에서, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 순차적으로, 개별적으로, 또는 2개 또는 3개의 그룹으로, 표적 핵산에 노출 또는 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 혼입한 폴리머라제 복합체의 검출은 3색 검출을 사용하여 수행될 수 있으며, 따라서 4개 뉴클레오타이드 중 3개에 상응하는 컨쥬게이트가 샘플에 존재하며, 3개의 컨쥬게이트는 그에 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드에 상응하는 별개의 표지를 가지고 하나의 컨쥬게이트는 표지되지 않거나 또는 검출불가능한 표지에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에서, 오직 3가지 유형의 컨쥬게이트만이 제공되어, 4개 뉴클레오타이드 중 3개에 상응하는 컨쥬게이트가 샘플에 존재하며, 3개의 컨쥬게이트는 그에 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드에 상응하는 별개의 표지를 가지고 하나의 컨쥬게이트는 부재한다. 일부 실시양태에서, 표지되지 않은 또는 뉴클레오타이드 부재 컨쥬게이트에 상응하는 뉴클레오타이드의 실체는 형광 신호를 나타내지 않는 공지된 표적 핵산 위치 및/또는 "진한색" 스팟 또는 위치의 식별과 관련하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서가 제공하는 상기 방법은, 결합 또는 혼입 복합체의 검출이 결합되지 않은 또는 용액형 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 부재하에 수행되는 것이다.
4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 3개가 표지되거나, 또는 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 오직 3개가 존재하는 일부 실시양태에서, 표지되지 않은 또는 부재 컨쥬게이트에 상응하는 뉴클레오타이드의 실체는 신호의 부재에 의해 또는 표지되지 않은 복합체의 존재를 모니터링함으로써, 예컨대 시퀀싱 반응에서 "진한색" 스팟 또는 표지되지 않은 영역의 식별에 의해 확립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 혼입한 폴리머라제 복합체의 검출은 2색 검출을 사용하여 수행될 수 있으며, 따라서 4개 뉴클레오타이드 중 2개에 상응하는 컨쥬게이트가 샘플에 존재하며, 2개의 컨쥬게이트는 그에 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드에 상응하는 별개의 표지를 가지고 2개의 컨쥬게이트는 표지되지 않거나 또는 검출불가능한 표지에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에서, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 2개만이 표지된다. 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 2개가 표지된 일부 실시양태에서, 표지되지 않은 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트에 상응하는 뉴클레오타이드의 실체는 신호의 부재에 의해 또는 표지되지 않은 복합체의 존재를 모니터링함으로써, 예컨대 시퀀싱 반응에서 "진한색" 스팟 또는 표지되지 않은 영역의 식별에 의해 확립될 수 있다. 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 2개가 표지된 일부 실시양태에서, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 표적 핵산에 순차적으로, 개별적으로, 또는 2개 또는 3개의 그룹으로 노출 또는 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 2개가 공통 표지를 공유할 수 있고, 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 표적 핵산에 순차적으로, 개별적으로, 또는 2개 또는 3개의 그룹으로 노출 또는 접촉되며, 이러한 각각의 접촉 단계는 2, 3, 4개 이상의 이러한 접촉 단계 이후 모든 미지의 염기의 실체가 결정되도록 2개 이상의 상이한 염기 사이의 구별을 나타낸다.
도 1E는 결합 또는 혼입 복합체가 폴리머라제, 표적 핵산, 및 프라이밍된 표적 핵산의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를 가지는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 사이에 형성된 이후 표면에 포착된 이미지를 도시한다. 포착된 이미지는 표면에 형성된 4개의 결합 또는 혼입 복합체 (107a), (107b), (107c), 및 (107d)를 포함하며, 각각의 결합 또는 혼입 복합체는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서 표지 (예를 들어, 형광 방출 색상)에 따라 구별될 수 있는 상이한 뉴클레오타이드를 가진다. 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하면 주어진 서열로부터의 결합 또는 혼입 신호가 표적 서열의 다중 카피를 포함하는 클러스터 영역 내에서 발생하기 때문에, 시퀀싱 신호가 크게 향상된다. 도 1E가 각각 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 가지는 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하지만, 일부 방법은 각각 상이한 유형의 뉴클레오타이드 및 표지를 가지는 1, 2, 또는 3개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각 상이한 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 동일한 표지로, 또는 각각 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드의 실체에 상응하는 표지로 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 4가지 유형의 뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 3가지 유형이 표지될 수 있고, 네 번째 유형은 표지되지 않거나 검출불가능한 표지에 또는 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 별개의 표지로 표지될 수 있고, 각각, 3, 2, 1개의 컨쥬게이트는, 또는 어떠한 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트도 표지되지 않거나, 검출불가능한 표지에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에서, 검출 단계는 최대 4 개의 상이한 여기 파장의 동시 및/또는 직렬 여기(serial excitation)를 포함할 수 있으며, 예컨대 형광 영상화는 가능한 염기 쌍(A, G, C, 또는 T) 각각을 고유하게 분류하는 단일 및/또는 다중 형광 방출 밴드(emission band)를 검출함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 4가지 상이한 핵산 결합 또는 혼입 조성물로서, 각각 상이한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 조성물은 말단 뉴클레오타이드의 실체를 결정하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 4가지 또는 3가지 상이한 핵산 결합 또는 혼입 조성물 중 하나는 제1 형광단으로 표지되고, 하나는 제2 형광단으로 표지되고, 하나는 제1 및 제2 형광단 둘 모두로 표지되고, 하나는 표지되지 않거나 부재하고, 여기서 검출 단계는 제1 여기 파장 및 제2 여기 파장에서 동시 여기를 포함하며 이미지는 제1 형광 방출 파장 및 제2 형광 방출 파장에서 획득된다.
다가 결합 또는 혼입 조성물이 폴리머라제 및 프라이밍된 표적 핵산과 결합 또는 혼입 복합체를 형성하기 위해 단일 컨쥬게이트되지 않은 또는 테더링되지 않은 뉴클레오타이드의 대체에 사용되는 경우, 뉴클레오타이드의 국소 농도가 여러 배 증가하고, 그 결과 신호 강도가 향상된다. 형성된 결합 또는 혼입 복합체는 또한 지속 시간이 더 길며, 그 결과 영상화 단계를 단축하는데 도움이 된다. 높은 신호 강도는 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 높은 결합 또는 혼입 결합력으로 인해 발생하며 (이는 또한 다중 형광단 또는 다른 표지를 포함할 수도 있음), 따라서 전체 결합 또는 혼입 및 영상화 단계 동안 안정하게 유지되는 복합체를 형성한다. 폴리머라제, 프라이밍된 표적 가닥, 및 중합체-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 컨쥬게이트 사이의 강한 결합 또는 혼입은 또한 이에 따라 형성된 다가 결합 또는 혼입 복합체가 세척 단계 동안 안정하게 유지될 것이며, 다른 반응 혼합물 구성요소 및 일치하지 않는 뉴클레오타이드 유사체가 씻겨 나갈때 신호 강도가 높게 유지된다는 것을 의미한다. 영상화 단계 후, 결합 또는 혼입 복합체는 (예를 들어, 완충액 조성을 변경함으로써) 불안정화될 수 있고, 프라이밍된 표적 핵산은 이어서 하나의 염기에 대해 연장될 수 있다.
시퀀싱 방법은 도 1F에 도시된 바와 같이 N+1 또는 말단 뉴클레오타이드를 프라이밍된 가닥에 혼입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 도 1F에서, 프라이밍된 표적 핵산(108)의 프라이머 가닥은 1개 염기만큼 연장되어 연장된 핵산(109)을 형성할 수 있다. 연장 단계는 다가 결합 또는 혼입 복합체의 불안정화 이후 또는 이와 동시에 발생할 수 있다. 프라이밍된 표적 핵산(108)은 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 입자에 부착된 상보적인 뉴클레오타이드를 사용하여, 또는 다가 결합 또는 혼입 조성물이 제거된 이후 제공되는 컨쥬게이트되지 않은 또는 테더링되지 않은 유리 뉴클레오타이드를 사용하여 연장될 수 있다.
연장 단계 이후, 도 1G에 도시된 바와 같이, 결합 또는 혼입 복합체를 형성하고 다음 시퀀싱 사이클을 모방하기 위해 접촉 단계가 다시 수행되될 수 있다. 접촉, 검출, 및 연장 단계가 하나 이상의 사이클에 대해 반복되어, 표적 핵산 분자의 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 도 1H는 다중 시퀀싱 사이클을 수행한 이후 수득된 표면 이미지를 도시하며, 이러한 이미지는 표적 핵산 분자의 서열을 결정하도록 처리될 수 있다.
프라이밍된 표적 핵산의 연장은 가닥 상의 차단된 뉴클레오타이드 또는 촉매적으로 불활성인 폴리머라제의 사용으로 인해 방지 또는 억제될 수 있다. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드가 핵산의 연장을 방지하는 차단기를 가지는 경우, 뉴클레오타이드의 혼입은 상기 뉴클레오타이드로부터 차단기를 제거하여 (예컨대 중합체, 분지형 중합체, 덴드리머, 입자, 등으로부터 상기 뉴클레오타이드의 분리에 의해) 달성될 수 있다. 프라이밍된 표적 핵산의 연장이 촉매적으로 불활성인 폴리머라제의 사용으로 인해 억제되는 경우, 뉴클레오타이드의 혼입은 금속 이온과 같은 보조인자 또는 활성화제의 제공에 의해 달성될 수 있다
또한 본 명세서에는 개시된 임의의 핵산 시퀀싱 또는 핵산 분석 방법을 수행하도록 구성된 시스템이 개시된다. 시스템은 고체 지지체에 부착된 프라이밍된 표적 핵산 분자를 개시된 폴리머라제 및 다가 결합 또는 혼입 조성물 및/또는 시약과 순차적으로 및 반복적으로 접촉시키도록 구성된 유체 흐름 제어기(fluid flow controller) 및/또는 유체 분배 시스템을 포함할 수 있다. 접촉 단계는 하나 이상의 플로우 셀(flow cell) 내에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 상기 플로우 셀은 시스템의 고정 구성요소일 수 있다. 일부 경우에, 상기 플로우 셀은 시스템의 제거 가능한 및/또는 일회용 구성요소일 수 있다.
시퀀싱 시스템은 영상화 모듈을 포함할 수 있으며, 즉, 고체 지지체 또는 플로우 셀 내부에 테더링된 표적 핵산 분자에 개시된 핵산 결합 또는 혼입 조성물의 결합 또는 혼입의 영상화 및 검출을 위한 하나 이상의 광원, 하나 이상의 광학 부품, 및 하나 이상의 이미지 센서를 포함할 수 있다. 개시된 조성물, 시약, 및 방법은 임의의 다양한 핵산 시퀀싱 및 분석 적용에 사용될 수 있다. 예로는 DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱, 전체 게놈 시퀀싱, 표적화 시퀀싱, 엑솜 시퀀싱, 유전형 분석, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
시퀀싱 시스템은 또한 본 발명의 방법을 구현하도록 프로그래밍된 컴퓨터 제어 시스템을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 본 발명의 방법을 구현하도록 프로그래밍 또는 구성되며, 핵산 시퀀싱 방법, 핵산 시퀀싱 데이터의 해석 및 세포 핵산 RNA (예를 들어, mRNA) 분석, 및 시퀀싱 데이터로부터 세포의 특성화를 포함한다. 컴퓨터 시스템은 사용자의 전자 장치 또는 전자 장치와 관련하여 원격으로 위치된 컴퓨터 시스템일 수 있다. 전자 장치는 모바일 전자 장치일 수 있다.
도 2는 표적 핵산을 시퀀싱하는 단계를 개략적으로 설명하는 흐름도이다. (201)은 표적 핵산 분자를 기질 표면 상의 상보적인 어댑터에 혼성화함으로써 고체 지지체 표면에 표적 라이브러리 서열을 부착하는 단계를 설명한다. 표적 핵산 분자는 단일 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. (201) 이전에, 표적 라이브러리의 핵산 분자가 결찰 또는 다른 방법을 통해 어댑터 서열에 상보적인 단편을 포함하도록 제조되었을 수 있다. (202)는 표면에 표적 핵산 분자의 클러스터를 생성하기 위한 클론 증폭 단계를 설명한다. (203)은 표적 핵산에서 시퀀싱 프라이머를 상보적인 프라이머 결합 또는 혼입 서열에 혼성화하여 프라이밍된 표적 핵산을 형성하는 단계를 설명한다. (204)는 폴리머라제, 다가 결합 또는 혼입 조성물로서 표지된 (예를 들어, 형광-표지된) 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 조성물, 및 프라이밍된 표적 핵산을 조합하는 단계를 설명한다. (204)는 또한 폴리머라제 및 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 비롯한 결합되지 않은 시약을 세척 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
도 2를 다시 참조하여, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드가 프라이밍된 표적 핵산의 다음 염기에 상보적인 경우 (205), 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 폴리머라제, 및 프라이밍된 표적 핵산이 삼원 결합(ternary binding) 또는 혼입 복합체를 형성하며, 이는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 표지와 사용성이 있는 검출 방법 (예를 들어, 형광 영상화)에 의해 검출될 수 있다. (205)는 또한 삼원 결합 또는 혼입 복합체의 지속 시간을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. (206)에서, 결합 또는 혼입 복합체는 불안정화되어 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및 폴리머라제의 결합 또는 혼입을 제거한다. 해리는 폴리머라제의 입체 구조를 변경하고 결합 또는 혼입을 불안정화하는 조건 (예를 들어, 스트론튬 이온 첨가)에 결합 또는 혼입 복합체를 배치함으로써 달성될 수 있다. (206)은 또한 해리된 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및/또는 폴리머라제를 세척 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다. (207)은 단일 염기 첨가 반응에 의해 프라이밍된 표적 핵산의 프라이밍된 가닥을 연장하는 단계를 설명한다. 단일 염기 연장 이후, 단계 (204), (205), (206), 및 (207)은 표적 핵산의 서열을 결정하기 위해 다중 사이클로 반복될 수 있다.
도 3은 표적 핵산을 시퀀싱하는 단계를 개략적으로 설명하는 또 다른 흐름도이며, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트로부터 뉴클레오타이드를 절단하고 절단된 뉴클레오타이드를 혼입하는 단계를 포함한다. (301)은 표적 핵산 분자를 기질 표면 상의 상보적인 어댑터에 혼성화함으로써 고체 지지체 표면에 표적 라이브러리 서열을 부착하는 단계를 설명한다. 표적 핵산 분자는 단일 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. (301) 이전에, 표적 라이브러리의 핵산 분자가 결찰 또는 다른 방법을 통해 어댑터 서열에 상보적인 단편을 포함하도록 제조되었을 수 있다. (302)는 표면에 표적 핵산 분자의 클러스터를 생성하기 위한 클론 증폭 단계를 설명한다. (303)은 표적 핵산에서 시퀀싱 프라이머를 상보적인 프라이머 결합 또는 혼입 서열에 혼성화하여 프라이밍된 표적 핵산을 형성하는 단계를 설명한다. (304)는 폴리머라제, 다가 결합 또는 혼입 조성물로서 표지된 (예를 들어, 형광-표지된) 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 조성물, 및 프라이밍된 표적 핵산을 조합하는 단계를 설명한다. 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 뉴클레오타이드는 나중에 절단될 수 있는 화학 결합 또는 상호작용을 통해 입자에 부착된다. (404)는 또한 폴리머라제 및 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 비롯한 결합되지 않은 시약을 세척 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
도 3을 다시 참조하여, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드가 프라이밍된 표적 핵산의 다음 염기에 상보적인 경우 (305), 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트, 폴리머라제, 및 프라이밍된 표적 핵산이 삼원 결합 또는 혼입 복합체를 형성하며, 이는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 표지와 사용성이 있는 검출 방법 (예를 들어, 형광 영상화)에 의해 검출될 수 있다. (305)는 또한 삼원 결합 또는 혼입 복합체의 지속 시간을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. (306)에서, 폴리머라제는 뉴클레오타이드를 혼입하기 위해 촉매적으로 활성화되는 조건에 배치된다. 이러한 조건은 폴리머라제를 반응 용액의 Mg 또는 Mn 이온에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 폴리머라제 및 프라이밍된 표적 핵산에 결합된 뉴클레오타이드는 이후 입자로부터 절단되고, 프라이밍된 표적 핵산의 프라이밍된 가닥으로 혼입된다. 결합 또는 혼입 복합체가 불안정화된다. (306)은 또한 해리된 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 및/또는 폴리머라제를 세척 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 연장 이후, 단계 (304), (305), (306), 및 (307)은 표적 핵산의 서열을 결정하기 위해 다중 사이클로 반복될 수 있다.
B. 표적 핵산 분자의 검출
도 4A-4B는 다가 결합 또는 혼입 조성물이 표적 핵산을 검출하는데 사용되는 예시적인 방법을 예시한다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트(401)는 폴리머라제(406), 제1 핵산 분자(404) 및 제2 핵산 분자(405)와 접촉하여 배치된다. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트(401)는 코어로부터 방사되는 다중 중합체 분지를 가지며, 일부 분지는 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드(402)에 부착되고, 일부 분지는 표지(403)에 부착된다. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트(401)의 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드(402)가 제1 핵산(404)의 적어도 분획에 상보적인 경우, 도 4B에 도시된 바와 같이 다가 결합 또는 혼입 복합체가 형성되며, 강한 결합 또는 혼입 신호는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 대해 상보적인 또는 부분적으로 상보적인 서열을 가지는 표적 핵산을 검출하는 것을 도울 수 있다. 일부 경우에, 폴리머라제, 핵산 분자, 및 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 중 적어도 하나가 고체 지지체에 부착된다.
본 명세서에 기재된 다가 결합 또는 혼입 조성물은 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법에 사용될 수 있다. 또한 본 명세서에는 개시된 임의의 핵산 분석 방법을 수행하도록 구성된 시스템이 개시된다. 시스템은 핵산 분자를 개시된 폴리머라제 및 다가 결합 또는 혼입 조성물 및/또는 시약과 순차적으로 및 반복적으로 접촉시키도록 구성된 유체 흐름 제어기 및/또는 유체 분배 시스템을 포함할 수 있다. 접촉 단계는 하나 이상의 플로우 셀 내에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 상기 플로우 셀은 시스템의 고정 구성요소일 수 있다. 일부 경우에, 상기 플로우 셀은 시스템의 제거 가능한 및/또는 일회용 구성요소일 수 있다. 시스템은 또한 샘플 수집 유닛 및 분석 어셈블리를 포함하는 카트리지를 포함할 수 있으며, 여기서 샘플 수집 유닛은 샘플을 수집하도록 구성되며, 분석 어셈블리는 상기 분석물과 상호작용하도록 구성된 다가 결합 또는 혼입 조성물을 포함하는 적어도 하나의 반응 부위를 포함하여, 미리 결정된 샘플 부분이 분석 어셈블리 내에 포함된 분석 시약과 반응하여 샘플 내 분석물의 존재를 나타내는 신호를 산출하고, 분석물로부터 생성된 신호를 검출한다.
III. 다가 결합 또는 혼입 조성물
본 발명은 입자 (예를 들어, 중합체, 분지형 중합체, 덴드리머, 또는 등가 구조)에 컨쥬게이션된 복수의 뉴클레오타이드를 가지는 다가 결합 또는 혼입 조성물에 관한 것이다. 다가 결합 또는 혼입 조성물을 폴리머라제 및 프라이밍된 표적 핵산의 다중 카피와 접촉시키는 단계는 검출될 수 있는 삼원 복합체의 형성을 야기할 수 있으며, 결과적으로 보다 정확하게 표적 핵산의 염기를 결정할 수 있다.
다가 결합 또는 혼입 조성물이 폴리머라제 및 표적 핵산의 하나 이상의 카피와 복합체를 형성하기 위해 컨쥬게이트되지 않은 또는 테더링되지 않은 단일 뉴클레오타이드의 대체에 사용되는 경우, 뉴클레오타이드의 국소 농도, 뿐만 아니라 복합체의 결합 결합력 (2개 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 복합체가 형성된 경우)이 여러 배 증가하며, 그 결과 신호 강도, 구체적으로 정확한 신호 대 불일치를 향상시킨다. 본 명세서에 기재된 다가 결합 또는 혼입 조성물은 표적 핵산과 상호작용하기 위해 적어도 하나의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 (각 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 단일 뉴클레오타이드 모이어티의 다중 카피를 포함)를 포함할 수 있다. 다가 조성물은 또한 2, 3, 또는 4개의 상이한 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함할 수 있으며, 각각은 입자에 컨쥬게이션된 상이한 뉴클레오타이드를 가진다.
다가 결합 또는 혼입 조성물은 1, 2, 3, 4개 이상 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함할 수 있고, 각 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 상이한 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 제1 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 ATP, ADP, AMP, dATP, dADP, 및 dAMP으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제2 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 TTP, TDP, TMP, dTTP, dTDP, dTMP, UTP, UDP, UMP, dUTP, dUDP, 및 dUMP으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제3 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 CTP, CDP, CMP, dCTP, dCDP, 및 dCMP으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제4 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 GTP, GDP, GMP, dGTP, dGDP, 및 dGMP으로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 각각 ATP, ADP, AMP, dATP, dADP, dAMP TTP, TDP, TMP, dTTP, dTDP, dTMP, UTP, UDP, UMP, dUTP, dUDP, dUMP, CTP, CDP, CMP, dCTP, dCDP, dCMP, GTP, GDP, GMP, dGTP, dGDP, 및 dGMP으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드에 상응하는 단일 유형의 뉴클레오타이드를 포함한다. 각각 다가 결합 또는 혼입 조성물은 각각 개별적인 컨쥬게이트에 컨쥬게이션된 특정 뉴클레오타이드에 상응하는 하나 이상의 표지를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 표지의 예시로는 형광 표지, 비색 표지, 전기화학 표지 (예를 들어, 글루코스 또는 다른 환원당, 또는 싸이올 또는 다른 환원 활성 모이어티), 발광 표지, 화학발광 표지, 스핀 표지, 방사성 표지, 입체구조적 표지, 친화성 태그, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
A. 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트
입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 동일한 뉴클레오타이드의 다중 카피는 입자에 대해 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 입자의 예로는 분지형 중합체; 덴드리머; 가교된 중합체 입자 예컨대 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 사이아노아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트 입자; 유리 입자; 세라믹 입자; 금속 입자; 퀀텀 닷; 리포솜; 에멀전 입자, 또는 기술 분야에 공지된 임의의 다른 입자 (예를 들어, 나노입자, 마이크로입자, 등)을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 입자는 분지형 중합체이다.
일부 경우에, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 (예를 들어, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트)는 입자에 테더링된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10 초과의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오타이드는 링커를 통해 입자에 연결될 수 있으며, 뉴클레오타이드는 중합체의 한쪽 말단 또는 위치에 부착될 수 있다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 5' 말단을 통해 입자에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 하나의 뉴클레오타이드는 중합체의 한쪽 말단 또는 위치에 부착된다. 일부 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 다중 뉴클레오타이드는 중합체의 한쪽 말단 또는 위치에 부착된다. 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드는 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 효소, 및 뉴클레오타이드 결합 또는 혼입 모이어티에 입체구조적으로 접근할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 결합 또는 혼입 모이어티 예컨대 폴리머라제로부터 별도로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 광 방출 또는 광 흡수 그룹을 포함하지 않는다.
입자는 또한 결합 또는 혼입 모이어티를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자는 별개의 상호작용 모이어티를 사용하지 않고 자가-회합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자는 예를 들어, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 입자의 칼슘 매개 상호작용, 미셀 또는 리포솜의 지질 또는 중합체 매개 상호작용, 또는 금속 (예컨대 철 또는 금) 나노입자의 염 매개 응집의 경우와 같은 완충 조건 또는 염 조건으로 인해 자가 회합할 수 있다.
입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 표지를 가질 수 있다. 표지의 예로는 형광단, 스핀 표지, 금속 또는 금속 이온, 비색 표지, 나노입자, PET 표지, 방사성 표지, 또는 거대분자 또는 분자 상호작용의 검출 분야에 공지된 방법에 의해 상기 조성물을 검출가능하게 할 수 있는 기타 표지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 표지는 뉴클레오타이드에 (예를 들어, 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트 모이어티에 부착하여), 입자 자체에 (예를 들어, PEG 서브유닛에), 중합체의 말단에, 중심 모이어티에, 또는 기술 분야에 공지되거나 또는 본 명세서의 다른 부분에 기재된 방법에 의해 검출 가능한 상기 조성물을 제공하기에 충분하다고 당업자에 의해 인식되는 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 내의 임의의 다른 위치, 예컨대 입자에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표지가 특정 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 상응하거나 분화되도록 제공된다.
일부 실시양태에서, 표지는 형광단이다. 형광 모이어티의 비제한적인 예로는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 플루오레세인(fluorescein) 및 플루오레세인 유도체 예컨대 카복시플루오레세인(carboxyfluorescein), 테트라클로로플루오레세인(tetrachlorofluorescein), 헥사클로로플루오레세인(hexachlorofluorescein), 카복시나프토플루오레세인(carboxynapthofluorescein), 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate), NHS-플루오레세인, 아이오도아세트아마이도플루오레세인(iodoacetamidofluorescein), 플루오레세인 말레이미드(fluorescein maleimide), SAMSA-플루오레세인, 플루오레세인 싸이오세미카바자이드(fluorescein thiosemicarbazide), 카보하이드라지노메틸싸이오아세틸-아미노 플루오레세인(carbohydrazinomethylthioacetyl-amino fluorescein), 로다민(rhodamine) 및 로다민 유도체 예컨대 TRITC, TMR, 리싸민 로다민(lissamine rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 10, NHS-로다민, TMR-(lissamine rhodamine B sulfonyl chloride), 리싸민 로다민 B 설포닐 하이드라진(lissamine rhodamine B sulfonyl hydrazine), 텍사스 레드 설포닐 클로라이드, 텍사스 레드 하이드라자이드, 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체 예컨대 AMCA, AMCA-NHS, AMCA-설포-NHS, AMCA-HPDP, DCIA, AMCE-하이드라자이드, BODIPY 및 유도체 예컨대 BODIPY FL C3-SE, BODIPY 530/550 C3, BODIPY 530/550 C3-SE, BODIPY 530/550 C3 하이드라자이드, BODIPY 493/503 C3 하이드라자이드, BODIPY FL C3 하이드라자이드, BODIPY FL IA, BODIPY 530/551 IA, Br-BODIPY 493/503, 캐스케이드 블루(Cascade Blue) 및 유도체 예컨대 캐스케이드 블루 아세틸 아자이드(Cascade Blue acetyl azide), 캐스케이드 블루 카다베린(Cascade Blue cadaverine), 캐스케이드 블루 에틸렌다이아민(Cascade Blue ethylenediamine), 캐스케이드 블루 하이드라자이드(Cascade Blue hydrazide), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow) 및 유도체 예컨대 루시퍼 옐로우 아이오도아세트아마이드, 루시퍼 옐로우 CH, 사이아닌 및 유도체 예컨대 인돌륨(indolium)계 사이아닌 염료, 벤조-인돌륨(benzo-indolium)계 사이아닌 염료, 피리듐(pyridium)계 사이아닌 염료, 싸이오졸륨(thiozolium)계 사이아닌 염료, 퀴놀리늄(quinolinium)계 사이아닌 염료, 이미다졸륨계 사이아닌 염료, Cy 3, Cy5, 란탄족 킬레이트 및 유도체 예컨대 BCPDA, TBP, TMT, BHHCT, BCOT, 유로퓸(Europium) 킬레이트, 테르븀(Terbium) 킬레이트, Alexa Fluor 염료, DyLight 염료, Atto 염료, LightCycler Red 염료, CAL Flour 염료, JOE 및 이의 유도체, Oregon Green 염료, WellRED 염료, IRD 염료, 피코에리트린(phycoerythrin) 및 피코빌린(phycobilin) 염료, 말라카이트 그린(Malachite green), 스틸벤(stilbene), DEG 염료, NR 염료, 근적외선 염료 및 문헌 [Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 6th Edition; Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Plenum Press New York (1999), 또는 Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd Edition]에 기재된 것과 같은 기타 염료, 또는 이의 유도체, 또는 이의 임의의 조합. 사이아닌 염료는 설폰화 또는 비설폰화 형태로 존재하며, 2개의 질소 원자 사이의 폴리메틴 브릿지에 의해 분리된 2개의 인돌레닌, 벤조-인돌륨, 피리듐, 싸이오졸륨, 및/또는 퀴놀리늄 기로 구성될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 사이아닌 형광단으로는, 예를 들어, Cy3, (이는 1-[6-(2,5-다이옥소피롤리딘-1-일옥시)-6-옥소헥실]-2-(3-{1-[6-(2,5-다이옥소피롤리딘-1-일옥시)-6-옥소헥실]-3,3-다이메틸-1,3-다이하이드로-2H-인돌-2-일리덴}프로프-1-엔-1-일)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 또는 1-[6-(2,5-다이옥소피롤리딘-1-일옥시)-6-옥소헥실]-2-(3-{1-[6-(2,5-다이옥소피롤리딘-1-일옥시)-6-옥소헥실]-3,3-다이메틸-5-설포-1,3-다이하이드로-2H-인돌-2-일리덴}프로프-1-엔-1-일)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨-5-설포네이트를 포함할 수 있음), Cy5 (이는 1-(6-((2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)-6-옥소헥실)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)-6-옥소헥실)-3,3-다이메틸-5-인돌린-2-일리덴)펜타-1,3-다이엔-1-일)-3,3-다이메틸-3H-인돌-1-윰 또는 1-(6-((2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)-6-옥소헥실)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-다이옥소피롤리딘-1-일)옥시)-6-옥소헥실)-3,3-다이메틸-5-설포인돌린-2-일리덴)펜타-1,3-다이엔-1-일)-3,3-다이메틸-3H-인돌-1-윰-5-설포네이트를 포함할 수 있음), 및 Cy7 (이는 1-(5-카복시펜틸)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-에틸-1,3-다이하이드로-2H-인돌-2-일리덴)헵타-1,3,5-트라이엔-1-일]-3H-인돌륨 또는 1-(5-카복시펜틸)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-에틸-5-설포-1,3-다이하이드로-2H-인돌-2-일리덴)헵타-1,3,5-트라이엔-1-일]-3H-인돌륨-5-설포네이트를 포함할 수 있음)를 포함하고, 여기서 "Cy"는 '사이아닌(cyanine)'을 나타내며, 첫 번째 숫자는 2 개의 인돌레닌 기 사이의 탄소 원자 수를 나타낸다. 인돌레닌이 아닌 옥사졸 유도체인 Cy2, 및 벤조-유도체화된 Cy3.5, Cy5.5 및 Cy7.5는 이러한 규칙의 예외이다.
일부 실시양태에서, 검출 표지는 FRET 쌍일 수 있으며, 이로 인해 단일 여기 및 영상화 단하에 다중 분류가 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, FRET는 여기 교환 (Forster) 전달, 또는 전자-교환 (Dexter) 전달을 포함할 수 있다.
B. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트
입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 하나의 예로는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트이다. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 일부 비제한적인 예시가 도 5A-5C에 도시된다. 예를 들어, 도 5A는 다양한 구성을 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 도시하며, 예를 들어, "스타버스트(starburst)"구성은 형광-표지된 스트렙타비딘 코어 및 분자량이 1 K 달톤 내지 10 K 달톤 범위인 비오틴화된, 선형 PEG 링커를 통해 코어에 결합된 4개 뉴클레오타이드를 포함하고; 도 5B는 예를 들어, 12, 24, 48, 또는 96개의 아암, 및 중심으로부터 방사되는 분자량이 1 K 달톤 내지 10 K 달톤의 범위인 선형 PEG 링커를 가지는 덴드리머형 코어를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 도시하고; 도 5C는 비오틴과 같은 결합 또는 혼입 모이어티를 포함하는 분지형 PEG 링커와 함께 연결된, 예를 들어, 스트렙타비딘 코어의 네트워크를 포함하는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 예를 도시한다.
적합한 선형 또는 분지형 중합체의 예로는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 선형 또는 분지형 폴리프로필렌 글리콜, 선형 또는 분지형 폴리비닐 알코올, 선형 또는 분지형 폴리락트산, 선형 또는 분지형 폴리글리콜산, 선형 또는 분지형 폴리글리신, 선형 또는 분지형 폴리비닐 아세테이트, 덱스트란, 또는 전술한 중합체 중 임의의 2개 이상을 혼입하는 또는 기술 분야 내 공지된 다른 중합체를 혼입하는 다른 중합체, 또는 공중합체를 포함한다. 하나의 구체예에서, 중합체는 PEG이다. 또 다른 구체예에서, 중합체는 PEG 분지를 가질 수 있다.
적합한 중합체는 유도체화에 적합한 작용기, 예컨대 아민, 하이드록실, 카보닐, 또는 알릴 기를 혼입하는 반복 유닛을 특징으로 할 수 있다. 중합체는 또한 다른 서브유닛이 동일한 부위, 치환체, 또는 모이어티를 혼입하는지 여부와 관계없이, 하나 이상의 특정 서브유닛이 유도체화 부위 또는 분지 부위를 혼입하도록 하나 이상의 사전 유도체화된 치환기를 가질 수 있다. 사전 유도체화된 치환체로는 예를 들어, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 유사체, 표지 예컨대 형광 표지, 방사성 표지, 또는 스핀 표지, 상호작용 모이어티, 추가적인 중합체 모이어티, 등, 또는 전술한 것의 임의의 조합을 포함할 수 있거나, 또는 추가로 포함할 수 있다.
중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 중합체는 복수의 분지를 가질 수 있다. 분지형 중합체는 다양한 구성을 가질 수 있으며, 별모양 ("스타버스트") 형태, 집합된 별모양 ("헬터 스켈터") 형태, 병 브러쉬형, 또는 덴드리머형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 분지형 중합체는 중심 부착점 또는 중심 모이어티로부터 방사될 수 있거나, 또는 다중 분지점, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 분지점을 혼입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 각 서브유닛은 선택적으로 별개의 분지점을 구성할 수 있다.
분지의 길이 및 크기는 유형의 중합체의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일부 분지형 중합체에서, 분지는 길이가 1 내지 1,000 nm, 1 내지 100 nm, 1 내지 200 nm, 1 내지 300 nm, 1 내지 400 nm, 1 내지 500 nm, 1 내지 600 nm, 1 내지 700 nm, 1 내지 800 nm, 또는 1 내지 900 nm, 이상, 또는 본 명세서에 개시된 임의의 값 내에 또는 그 사이에 속하는 길이일 수 있다.
일부 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 중합체 코어는 1 K Da, 2 K Da, 3 K Da, 4 K Da, 5 K Da, 10 K Da, 15 K Da, 20 K Da, 30 K Da, 50 K Da, 80 K Da, 100 K Da, 또는 전술한 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 값의 겉보기 분자량에 해당하는 크기를 가질 수 있다. 중합체의 겉보기 분자량은 크기 배제 크로마토그래피에 결정되거나, 질량 분석법에 의해 결정되거나, 또는 기술 분야 내 공지된 임의의 다른 방법에 의해 결정된 바와 같이, 대표적인 수의 서브유닛 공지된 분자량으로부터 계산될 수 있다.
일부 분지형 중합체에서, 분지는 1 K Da, 2 K Da, 3 K Da, 4 K Da, 5 K Da, 10 K Da, 15 K Da, 20 K Da, 30 K Da, 50 K Da, 80 K Da, 100 K Da, 또는 전술한 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 값의 겉보기 분자량에 해당하는 크기를 가질 수 있다. 중합체의 겉보기 분자량은 크기 배제 크로마토그래피에 결정되거나, 질량 분석법에 의해 결정되거나, 또는 기술 분야 내 공지된 임의의 다른 방법에 의해 결정된 바와 같이, 대표적인 수의 서브유닛 공지된 분자량으로부터 계산될 수 있다. 중합체는 다중 분지를 가질 수 있다. 중합체 내 분지 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 24, 32, 64, 128 이상, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에 속하는 수일 수 있다.
예를 들어, 4, 8, 16, 32, 또는 64개의 분지를 포함하는 분지형 PEG의 분지형 중합체를 포함하는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 경우, 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트 PEG 분지의 말단에 부착된 뉴클레오타이드를 가질 수 있으며, 이에 따라 각 말단에 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상 뉴클레오타이드가 부착되도록 할 수 있다. 하나의 비제한적인 예시에서, 3 내지 128개의 PEG 아암의 분지형 PEG 중합체는 중합체 분지의 말단에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 부착시킬 수 있으며, 이에 따라 각 말단에 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 부착되도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지형 중합체 또는 덴드리머는 짝수의 아암을 가진다. 일부 실시양태에서, 분지형 중합체 또는 덴드리머는 홀수의 아암을 가진다.
일부 경우에, 링커 (예를 들어, PEG 링커)의 길이는 약 1 nm 내지 약 1,000 nm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 링커의 길이는 적어도 1 nm, 적어도 10 nm, 적어도 25 nm, 적어도 50 nm, 적어도 75 nm, 적어도 100 nm, 적어도 200 nm, 적어도 300 nm, 적어도 400 nm, 적어도 500 nm, 적어도 600 nm, 적어도 700 nm, 적어도 800 nm, 적어도 900 nm, 또는 적어도 1,000 nm일 수 있다. 일부 경우에, 링커의 길이는 본 단락의 값 중 임의의 두 값 사이의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 링커의 길이는 약 75 nm 내지 약 400 nm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 당업자는 링커의 길이가 본 단락의 값의 범위 이내의 임의의 값, 예를 들어, 834 nm일 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 링커의 길이는 상이한 뉴클레오타이드 (디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드 포함), 뉴클레오타이드 유사체 (디옥시리보뉴클레오타이드 유사체 및 리보뉴클레오타이드 유사체 포함), 뉴클레오사이드 (디옥시리보뉴클레오사이드 또는 리보뉴클레오사이드 포함), 또는 뉴클레오사이드 유사체 (디옥시리보뉴클레오사이드 유사체 또는 리보뉴클레오사이드 유사체 포함)에 따라 상이하다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 디옥시아데노신을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 디옥시구아노신을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 티미딘을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 디옥시우리딘을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 디옥시시티딘을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 아데노신을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 구아노신을 포함하며, 링커의 길이는 1 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 5-메틸-우리딘을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 우리딘을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 중 하나는, 예를 들어, 시티딘을 포함하며, 링커의 길이는 1 nm 내지 1,000 nm이다.
중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서, 중합체의 각 분지 또는 분지의 서브세트에 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데닌, 타이민, 우라실, 사이토신, 또는 구아닌 잔기 또는 이의 유도체 또는 모방체)를 포함하는 모이어티가 부착될 수 있고, 이러한 모이어티는 폴리머라제, 역전사효소, 또는 다른 뉴클레오타이드 결합 또는 혼입 도메인에 결합 또는 혼입될 수 있다. 선택적으로, 모이어티는 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산 사슬에 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 상기 모이어티는 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산 사슬에 혼입될 수 없도록 차단될 수 있다. 일부 다른 경우에, 상기 모이어티는 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산 사슬에 혼입되지 않을 수 있도록 차단이 제거될 때까지 가역적으로 차단될 수 있고, 그 후에 상기 모이어티가 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산 사슬에 혼입될 수 있다.
뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 5' 말단을 통해 중합체 분지에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드는 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산 사슬로 뉴클레오타이드가 혼입하는 것을 억제 또는 방지하도록 변형될 수 있다. 예시로서, 뉴클레오타이드는 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산 사슬로 혼입될 수 없도록 3' 디옥시리보뉴클레오타이드, 3' 아지도뉴클레오타이드, 3'-메틸 아지도 뉴클레오타이드, 또는 그 자체로 또는 기술 분야 내 공지되어 있을 수 있는 또 다른 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도 기, 3'-O-아지도메틸 기, 3'-포스포로싸이오에이트 기, 3'-O-말론일 기, 3'-O-알킬 하이드록실아미노 기, 또는 3'-O-벤질 기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드는 3' 하이드록실 기를 가지지 않는다.
중합체는 각각 분지 또는 분지의 서브세트에 결합 또는 혼입 모이어티를 추가적으로 가질 수 있다. 결합 또는 혼입 모이어티의 일부 예로는 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 등, 폴리히스티딘 도메인, 상보적 쌍을 이루는 핵산 도메인, G-사중체 형성 핵산 도메인, 칼모듈린, 말토스-결합 단백질, 셀룰라제, 말토스, 수크로스, 글루타티온-S-전이효소, 글루타티온, O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 벤질구아닌 및 이의 유도체, 벤질시스테인 및 이의 유도체, 항체, 에피토프, 단백질 A, 단백질 G를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 결합 또는 혼입 모이어티는 단백질 사이, 단백질와 리간드 사이, 단백질과 핵산 사이, 핵산 사이, 또는 소분자 상호작용 도메인 또는 모이어티 사이에 결합하거나, 또는 상호작용을 촉진하는 것으로 기술 분야 내 공지된 임의의 상호작용 분자 또는 이의 단편일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 상보적 상호작용 모이어티 중 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다. 상보적 상호작용 모이어티의 비제한적인 예시로는, 예를 들어, 비오틴 및 아비딘; SNAP-벤질구아노신; 항체 또는 FAB 및 에피토프; IgG FC 및 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 단백질 L; 말토스 결합 단백질 및 말토스; 레시틴 및 동족 다당류; 이온 킬레이트 모이어티, 상보적인 핵산, 삼중 또는 삼중 나선 상호작용을 형성할 수 있는 핵산; G-쿼텟(quartet)을 형성할 수 있는 핵산, 등을 포함한다. 당업자는 많은 쌍의 모이어티가 존재하며 서로 강력하게 및 특이적으로 상호작용하는 특성을 위해 일반적으로 사용된다는 것을 쉽게 인식할 것이고; 따라서 임의의 이러한 상보적인 쌍 또는 세트는 본 발명의 조성물을 구상하거나 또는 구현하는데 있어서 이러한 목적에 적합한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 상보적 상호작용 모이어티 중 하나의 요소가 하나의 분자 또는 다가 리간드에 부착되고, 상보적 상호작용 모이어티의 다른 요소는 별개의 분자 또는 다가 리간드에 부착된 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 상보적 상호작용 모이어티의 둘 모두 또는 모든 요소가 단일 분자 또는 다가 리간드에 부착된 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 상보적 상호작용 모이어티의 둘 모두 또는 모든 요소가 단일 분자 또는 다가 리간드의 별개의 아암, 또는 위치에 부착된 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 상보적 상호작용 모이어티의 둘 모두 또는 모든 요소가 단일 분자 또는 다가 리간드의 동일한 아암, 또는 위치에 부착된 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 상호작용 모이어티 중 하나의 요소를 포함하는 조성물 및 상보적 상호작용 모이어티 중 또 다른 요소를 포함하는 조성물은 동시에 또는 순차적으로 혼합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 분자 또는 입자 사이의 상호작용은 다중 분자 또는 입자가 회합 또는 응집하도록 하여, 예를 들어, 검출가능한 신호가 증가된다. 일부 실시양태에서, 형광, 비색, 또는 방사성 신호가 향상된다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 또는 기술 분야 내 공지된 기타 상호작용 모이어티가 고려된다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 제1 상호작용 모이어티, 예를 들어, 하나 이상의 이미다졸 또는 피리딘 모이어티를 포함하는 하나 이상의 분자, 및 제2 상호작용 모이어티, 예를 들어, 히스티딘 잔기를 포함하는 하나 이상의 추가적인 분자가 동시에 또는 순차적으로 혼합되도록 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상 이미다졸 또는 피리딘 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상 히스티딘 잔기를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 제공된 분자 또는 입자 사이의 상호작용은 니켈, 망간, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 등과 같은 2가 양이온의 존재에 의해 촉진될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, (His)3 기는 니켈 또는 망간 이온의 배위를 통해 또 다른 분자 또는 입자의 (His)3 기와 상호작용할 수 있다.
다가 결합 또는 혼입 조성물은 하나 이상의 완충제, 염, 이온, 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대표적인 첨가제로는 다음을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 베타인(betaine), 스페르미딘(spermidine), 세제 예컨대 Triton X-100, Tween 20, SDS, 또는 NP-40, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 비닐 알코올, 메틸셀룰로스, 헤파린, 헤파란 설페이트, 글리세롤, 수크로스, 1,2-프로판다이올, DMSO, N,N,N-트라이메틸글리신, 에탄올, 에톡시에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 블록 공중합체 예컨대 플루로닉 (r) 시리즈 중합체, 아르기닌, 히스티딘, 이미다졸, 또는 이의 임의의 조합, 또는 기술 분야 내 DNA "이완제(relaxer)"로서 공지된 임의의 물질 (DNA의 지속 길이를 변경하거나, 중합체 내 접합 또는 교차의 수를 변경하거나, 또는 DNA 분자의 입체형태 역학을 변경하여 DNA 결합 또는 혼입 모이어티에 대한 가닥 내 부위의 접근성이 증가시키는 효과를 가지는 화합물).
다가 결합 또는 혼입 조성물은 첨가제로서 쯔비터이온 화합물을 포함할 수 있다. 추가적으로 대표적인 첨가제는 문헌 [Lorenz, T.C. J. Vis. Exp. (63), e3998, doi:10.3791/3998 (2012)]에서 확인할 수 있으며 상기 문헌은 핵산 결합 또는 역학의 촉진, 또는 핵산의 조작, 사용 또는 저장을 수반하는 공정의 촉진을 위한 첨가제의 개시와 관련하여 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 일부 실시양태에서, 대표적인 양이온으로는 다음을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 소듐, 마그네슘, 스트론튬, 포타슘, 망간, 칼슘, 리튬, 니켈, 코발트, 또는 자가-회합, 2차 또는 3차 구조 형성, 염기 쌍, 표면 회합, 펩타이드 회합, 단백질 결합, 등과 같은 핵산 상호작용을 촉진하는 것으로 기술 분야 내 공지된 기타 양이온.
IV. 표적 핵산과 다가 결합 또는 혼입 조성물 사이의 결합
다가 결합 또는 혼입 조성물이 폴리머라제 및 표적 핵산의 하나 이상의 카피와 복합체를 형성하기 위해 컨쥬게이트되지 않은 또는 테더링되지 않은 단일 뉴클레오타이드의 대체에 사용되는 경우, 뉴클레오타이드의 국소 농도, 뿐만 아니라 복합체의 결합 결합력 (2개 이상의 표적 핵산 분자를 포함하는 복합체가 형성된 경우)이 여러 배 증가하며, 그 결과 신호 강도, 구체적으로 정확한 신호 대 불일치를 향상시킨다. 본 발명은 다가 결합 또는 혼입 조성물을 폴리머라제 및 프라이밍된 표적 핵산과 접촉시켜 삼원 결합 또는 혼입 복합체의 형성을 결정하는 것을 고려한다.
도 6은 결합, 지속, 및 세척/제거 단계 동안 증가된 신호 강도를 달성하기 위한 개시된 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 예시한다. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에서 뉴클레오타이드의 국소 농도가 증가하고 및/또는 2개 이상의 프라이밍된 표적 핵산 분자와 비공유결합을 형성하는 것으로 인해, 폴리머라제, 프라이밍된 표적 가닥, 및 중합체-컨쥬게이션된 뉴클레오타이드사이의 결합은, 뉴클레오타이드가 표적 핵산의 다음 염기에 상보적일 때, 더욱 유리해진다. 형성된 결합 복합체는 지속 시간이 더 길며, 그 걸과 신호를 증가시키고 영상화 단계를 단축하는데 도움이 된다. 개시된 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트 사용으로 인한 높은 신호 강도는 전체 결합 및 영상화 단계에 안정하게 유지된다. 폴리머라제, 프라이밍된 표적 가닥, 및 중합체-컨쥬게이션된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이의 강한 결합은 또한 이에따라 형성된 결합 복합체가 다른 반응 혼합물 구성요소 및 일치하지 않는 뉴클레오타이드 유사체가 씻겨나가는 세척 단게 동안 안정적으로 유지될 것임을 의미한다. 영상화 단계 후, 결합 복합체는 (예를 들어, 완충액 조성을 변경함으로써) 불안정화될 수 있고, 프라이밍된 표적 핵산은 이어서 하나의 염기에 대해 연장될 수 있다. 연장 이후, 다음 염기의 실체를 결정하기 위해 개시된 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하여 결합 및 영상화 단계가 반복될 수 있다.
예시로서, 본 명세서에 기재된 다가 기질의 결합, 지속, 및 세척/제거 동안 신호 강도의 증가에 대한 그래프 묘사가 도 6에 제공되며, 이는 실험적으로 관찰된 신호 강도의 변화를 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 조성물 및 방법은 삼원 효소 복합체를 확립 및 유지하는 강력하고 제어가능한 수단, 뿐만 아니라 상기 복합체의 존재가 식별 및/또는 측정될 수 있도록 크게 개선된 수단, 및 상기 복합체의 지속성이 제어될 수 있는 수단을 제공한다. 이는 핵산 시퀀싱 적용에서 N+1 염기의 실체를 결정하는 것과 같은 문제에 대한 가장 중요한 솔루션을 제공한다.
본 명세서에 개시된 다가 결합 조성물이 삼원 결합 복합체를 형성하기 위해 시간 의존적 속도로 폴리머라제 뉴클레오타이드 복합체와 회합하지만, 유리 용액에서 뉴클레오타이드에 의해 수득가능한 것으로 공지된 회합 속도보다 실질적으로 느리다는 것이 관찰되었으나, 임의의 특정 이론에 제한되고자 하는 것은 아니다. 이에 따라, 회합 속도 (on-rate, Kon)는 실질적으로 및 놀랍게도 다가 리간드 복합체에 부착되지 않은 단일 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드에 대한 회합 속도보다 느리다. 그러나, 중요한 것은 다가 리간드 복합체의 해리 속도 (off rate, Koff)가 유리 용액에서 뉴클레오타이드에 대해 관찰되는 속도보다 상당히 느리다는 것이다.그러므로, 본 명세서의 다가 리간드 복합체는 (특히 유리 뉴클레오타이드로 형성된 이러한 복합체에 비해) 삼원 폴리머라제-폴리뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 복합체의 지속성의 놀랍고 유익한 개선을 제공하며, 예를 들어, 현재 이용가능한 방법 및 시약에 비해 핵산 시퀀싱 적용을 위한 영상화 품질을 상당히 개선하도록 한다. 중요한 것은, 본 명세서에 개시된 다가 결합 조성물의 이러한 특성이 가시적 삼원 복합체의 형성을 제어가능하게 하여, 후속적인 가시화, 변형, 또는 가공 단계가 복합체의 해리와 상관없이 본질적으로 일어날 수 있으며, 즉, 복합체가 필요에 따라 형성, 영상화, 변형, 또는 사용될 수 있으고, 복합체를 해리 완충액에 노출시키는 것과 같은 적극적 해리 단계를 수행할 때까지 안정적으로 유지된다는 것이다.　
일부 경우에, 개시된 입자-뉴클레오타이드 또는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하여 형성된 다가 결합 복합체의 지속 시간은 불안정하지 않은 조건하에서 약 0.1 초 내지 약 600 초의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 지속 시간은 적어도 0.1 초, 적어도 1 초, 적어도 2 초, 적어도 3 초, 적어도 4 초, 적어도 5 초, 적어도 6 초, 적어도 7 초, 적어도 8 초, 적어도 9 초, 적어도 10 초, 적어도 20 초, 적어도 30 초, 적어도 40 초, 적어도 50 초, 적어도 60 초, 적어도 120 초, 적어도 180 초, 적어도 240 초, 적어도 300 초, 적어도 360 초, 적어도 420 초, 적어도 480 초, 적어도 540 초, 또는 적어도 600 초일 수 있다. 일부 경우에, 지속 시간은 본 단락의 값 중 임의의 두 값 사이의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 지속 시간은 약 10 초 내지 약 360 초의 범위일 수 있다. 일부 경우에 당업자는 지속 시간이 본 단락에 명시된 값의 범위 이내의 임의의 값, 예를 들어, 78 초일 수 있음을 인식할 것이다.
다양한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 결합 또는 혼입 상호작용에 적합한 폴리머라제는 그 자체로 또는 기술 분야 내 공지될 수 있는 임의의 폴리머라제를 포함한다. 예를 들어, 모든 유기체는 게놈 내에서 하나 이상의 DNA 폴리머라제를 인코딩하는 것으로 알려져 있다. 적합한 폴리머라제의 예로는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: Klenow DNA 폴리머라제, 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제 I (Taq 폴리머라제), KlenTaq 폴리머라제, 및 박테리오파지 T7 DNA 폴리머라제; 인간 알파, 델타 및 엡실론 DNA 폴리머라제; 박테리오파지 폴리머라제 예컨대 T4, RB69 및 phi29 박테리오파지 DNA 폴리머라제, 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) DNA 폴리머라제 (Pfu 폴리머라제); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) DNA 폴리머라제 III, 및 E. coli DNA 폴리머라제 III 알파 및 엡실론; 9도 N 폴리머라제, 역전사효소 예컨대 HIV M형 또는 O형 역전사효소, 조류 골수아구증 바이러스(avian myeloblastosis virus) 역전사효소, 또는 몰로니 설치류 백혈병 바이러스 (Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV) 역전사효소, 또는 텔로머라제. DNA 폴리머라제의 추가적으로 비제한적인 예시로는 다양한 고세균 속(Archaea genera), 예컨대 에로피룸속(Aeropyrum), 아르케오글로부스속(Archaeoglobus), 데술푸로콕쿠스속(Desulfurococcus), 피로바쿨룸속(Pyrobaculum), 피로콕쿠스속(Pyrococcus), 피롤로부스속(Pyrolobus), 피로딕티움속(Pyrodictium), 스타필로테르무스속(Staphylothermus), 스텟테리아속(Stetteria), 설폴로부스(Sulfolobus), 테르모코커스속(Thermococcus), 및 불카니세타속(Vulcanisaeta)등 또는 이의 변이체로부터 유래한 폴리머라제를 비롯하여, 기술 분야 내 공지된 폴리머라제 예컨대 Vent ™, Deep Vent ™, Pfu, KOD, Pfx, Therminator™ 및 Tgo 폴리머라제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 klenow 폴리머라제이다.
삼원 복합체는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드가 표적 핵산에 상보적일 때 상보적이지 않은 뉴클레오타이드일 때보다 지속 시간이 더 길다. 삼원 복합체는 또한 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드가 표적 핵산에 상보적일 때, 컨쥬게이션 또는 테더링되지 않은 상보적인 뉴클레오타이드보다 지속 시간이 더 길다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 삼원 복합체는 지속 시간이 1s 미만, 1s 초과, 2s 초과, 3s 초과, 5s 초과, 10s 초과, 15s 초과, 20s 초과, 30s 초과, 60s 초과, 120s 초과, 360s 초과, 3600s 초과, 또는 그 이상, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위 내에 속하는 시간일 수 있다.
지속 시간은, 예를 들어 결합 복합체의 시작 및/또는 지속 시간을 관찰함으로써, 예컨대 결합 복합체의 표지된 성분으로부터 신호를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 표지된 시약이 결합 복합체에 존재할 수 있으며, 따라서 결합 복합체의 지속 시간 동안 표지로부터 신호가 검출될 수 있다.
상이한 염 또는 이온으로 상이한 범위의 지속 시간이 달성될 수 있는 것이 관찰되었으며, 예를 들어, 마그네슘 이온 (Mg2+)의 존재하에 형성된 복합체가 다른 이온으로 형성된 복합체보다 더 빨리 형성되는 것을 나타낸다.또한, 예를 들어, 스트론튬 이온 (Sr2+)의 존재하에 형성된 복합체가 용이하게 형성되며, 이온의 회수 시에, 또는 본 조성물의 하나 이상의 구성요소, 예를 들어, 중합체 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 및/또는 하나 이상의 상호작용 모이어티를 가지지 않는 완충액, 또는 예를 들어, 복합체를 포함하는 다가 시약으로부터 2가 양이온의 제거를 유발하거나 또는 가속화할 수 있는 킬레이트제를 포함하는 완충액으로의 세척 시에 완전히 또는 실질적으로 완전히 해리되는 것으로 관찰되었다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 Mg2+를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 Ca2+를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 Sr2+를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 코발트 이온 (Co2+)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 MgCl2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 CaCl2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 SrCl2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 CoCl2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 마그네슘을 포함하지 않거나, 또는 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 칼슘을 포함하지 않거나, 또는 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 핵산을 본 명세서에 개시된 하나 이상의 조성물과 접촉하는 단계를 제공하며, 여기서 상기 조성물은 칼슘 또는 마그네슘 중 하나를 가지지 않거나, 또는 칼슘 또는 마그네슘 둘 모두를 가지지 않는다.
삼원 복합체의 해리는 완충 조건을 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 영상화 단계 이후, 삼원 복합체의 해리를 야기하여 표지된 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가 세척될 수 있도록 염 함량이 증가한 완충액을 사용하여, 하나의 시퀀싱 사이클 및 다음 사이클 사이의 전환에서와 같이 신호가 감쇠 또는 종료될 수 있는 수단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 해리는 필요한 금속 또는 보조인자를 가지지 않는 완충액으로 복합체를 세척함으로써 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 pH 제어를 유지하기 위한 목적으로 하나 이상의 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 하나 이상의 1가 양이온, 예컨대 소듐을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 2가 양이온을 포함하지 않거나 또는 실질적으로 포함하지 않으며, 예를 들어, 스트론튬, 칼슘, 마그네슘, 또는 망간을 가지지 않거나 또는 실질적으로 가지지 않는다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 킬레이트제, 예를 들어, EDTA, EGTA, 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid), 폴리히스티딘, 이미다졸, 등을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 환경의 pH를 결합된 복합체와 동일한 수준으로 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척 완충액은 결합된 복합체에서 발견되는 수준에 대해 환경의pH를 더 높이거나 또는 낮출 수 있다. 일부 실시양태에서, pH는 2-4, 2-7, 5-8, 7-9, 7-10, 또는 2 미만, 또는 10 초과의 범위, 또는 본 명세서에 제공된 값 중 임의의 두 값에 의해 정의된 범위 내일 수 있다.
특정 이온의 첨가는 프라이밍된 표적 핵산에 대한 폴리머라제의 결합, 삼원 복합체의 형성, 삼원 복합체의 해리, 또는 폴리머라제 반응 동안 연장하는 핵산으로 하나 이상의 뉴클레오타이드의 혼입에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 관련 음이온은 클로라이드, 아세테이트, 글루코네이트, 설페이트, 포스페이트, 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온은 하나 이상의 산, 염기, 또는 염, 예컨대 NiCl2, CoCl2, MgCl2, MnCl2, SrCl2, CaCl2, CaSO4, SrCO3, BaCl2 등을 첨가하여 본 명세서의 조성물로 혼입될 수 있다. 대표적인 염, 이온, 용액 및 조건은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th. Edition, Gennaro, A.R., Ed. (2000)] (상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함), 및 특히 챕터 17 및 염, 이온, 염 용액, 및 이온 용액의 관련 개시에서 확인할 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 다가 결합 또는 혼입 조성물을 하나 이상의 폴리머라제와 접촉시키는 것을 고려한다. 접촉은 하나 이상의 표적 핵산 존재하에 선택적으로 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산은 단일 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산은 프라이밍된 단일 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 다가 결합 또는 혼입 조성물을 하나의 폴리머라제와 접촉하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 접촉은 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 상기 조성물을 다중 폴리머라제와 접촉시키는 것을 포함한다. 폴리머라제는 단일 핵산 분자에 결합될 수 있다.
표적 핵산과 다가 결합 조성물 사이의 결합은 촉매적으로 불활성이 된 폴리머라제의 존재하에 제공될 수 있다. 하나의 구체예에서, 폴리머라제는 돌연변이에 의해 촉매적으로 불활성이 되었을 수 있다. 하나의 구체예에서, 폴리머라제는 화학적 변형에 의해 촉매적으로 불활성이 되었을 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 분자는 필수적인 기질, 이온 또는 보조인자의 부재에 의해 촉매적으로 불활성화되었을 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제 효소는 마그네슘 이온의 부재에 의해 촉매적으로 불활성화 되었을 수 있다.
표적 핵산과 다가 결합 조성물 사이 결합은 폴리머라제의 존재하에 발생하며 여기서 결합 용액, 반응 용액, 또는 완충액은 마그네슘 또는 망간을 가지지 않는다. 대안적으로, 표적 핵산과 다가 결합 조성물 사이 결합은 폴리머라제의 존재하에 발생하며 여기서 결합 용액, 반응 용액, 또는 완충액은 칼슘 또는 스트론튬을 포함한다.
핵산이 다가 결합 조성물과 상호작용하도록 돕기 위해 촉매적으로 불활성인 폴리머라제가 사용되는 경우, 상기 조성물과 상기 폴리머라제 사이의 상호작용이 삼원 복합체를 안정화하여, 복합체가 형광에 의해 또는 본 명세서에 개시되거나 또는 기술 분야 내 공지된 다른 방법에 의해 검출가능하게 된다. 결합되지 않은 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 삼원 결합 복합체의 검출 이전에 선택적으로 세척될 수 있다.
칼슘 또는 마그네슘 중 하나 또는 칼슘 및 마그네슘 둘 모두를 포함하는 용액에서, 하나 이상의 핵산을 본 명세서에 개시된 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계. 대안적으로, 칼슘 또는 마그네슘 중 하나, 또는 칼슘 또는 마그네슘 둘 모두를 가지지 않는 용액에서, 하나 이상의 핵산을 본 명세서에 개시된 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계 및 단계의 순서와 관계없이, 별개의 단계로, 용액에 칼슘 또는 마그네슘 중 하나, 또는 칼슘 및 마그네슘 둘 모두를 첨가하는 단계. 일부 실시양태에서, 스트론튬을 가지지 않는 용액에서 하나 이상의 핵산을 본 명세서에 개시된 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계는, 단계의 순서와 관계없이, 별개의 단계로 용액에 스트론튬을 첨가하는 단계를 포함한다.
V. 낮은 비특이적 결합 표면과 조합된 다가 결합 또는 혼입 조성물의 용도
본 명세서에는 핵산 혼성화 및 증폭 성능을 개선할 수 있는, 낮은 비특이적 결합 표면 조성물을 포함하는 고체 지지체가 개시된다. 일반적으로, 개시된 지지체는 기질 (또는 지지체 구조), 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 하나 이상의 낮은-결합층, 화학적 변형층, 예를 들어, 실란층, 중합체 필름, 및 단일-가닥 표적 핵산(들)을 지지체 표면에 연결하기 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 지지체 표면에 대한 단백질, 핵산 분자, 및 다른 혼성화 및 증폭 반응 구성요소의 비특이적 결합이 유사한 단층에 비해 최소화되거나 감소되도록, 표면의 제형, 예를 들어, 하나 이상의 층의 화학적 조성, 하나 이상의 층을 지지체 표면에 및/또는 서로 가교하기 위해 사용되는 커플링 화학 물질, 및 전체 층의 수는 달라질 수 있다. 종종, 표면의 제형은 지지체 표면에서의 비특이적 혼성화가 유사한 단층에 비해 최소화 또는 감소되도록 달라질 수 있다. 표면의 제형은 지지체 표면에서의 비특이적 증폭이 유사한 단층에 비해 최소화 또는 감소되도록 달라질 수 있다. 표면의 제형은 지지체 표면에서의 특이적 증폭 비율 및/또는 산출량이 최대화되도록 달라질 수 있다. 검출에 적합한 증폭 수준은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30회 이하 또는 본 명세서에 개시된 일부 경우에 30회 이상의 증폭 사이클로 달성된다.
기질 또는 지지체 구조가 제조될 수 있는 재료의 예로는 다음을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 유리, 접합된-실리카, 규소, 중합체 (예를 들어, 폴리스타이렌 (PS), 거대다공성 폴리스타이렌 (MPPS), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리카보네이트 (PC), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 (PE), 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE), 사이클릭 올레핀 중합체 (COP), 사이클릭 올레핀 공중합체 (COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET)), 또는 이의 임의의 조합. 유리 및 플라스틱 기질 둘 모두의 다양한 조성이 고려된다.
기질 또는 지지체 구조는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기하학적 구조 및 크기가 될 수 있고, 및 당업자에게 공지된 임의의 다양한 재료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 기질 또는 지지체 구조는 국소적으로 평면일 수 있다 (예를 들어, 현미경 슬라이드 또는 현미경 슬라이드의 표면을 포함). 전체적으로, 기질 또는 지지체 구조는 원통형 (예를 들어, 모세관 또는 모세관의 내부 표면 포함), 구형 (예를 들어, 비-다공성 비드의 외부 표면 포함), 또는 불규칙형 (예를 들어, 불규칙한 모양의, 비-다공성 비드 또는 입자의 외부 표면 포함)일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 혼성화 및 증폭에 사용되는 기질 또는 지지체 구조의 표면은 고체, 비-다공성 표면일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 혼성화 및 증폭에 사용되는 기질 또는 지지체 구조의 표면은 다공성일 수 있으며, 이로 인해 본 명세서에 기재된 코팅이 다공성 표면을 침투하고, 그 위에서 수행되는 핵산 혼성화 및 증폭 반응이 기공 내에서 일어날 수 있다.
하나 이상의 화학적으로 변형된 층, 예를 들어, 낮은 비특이적 결합 중합체의 층을 포함하는 기질 또는 지지체 구조는 독립적이거나 또는 또 다른 구조 또는 어셈블리에 통합될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 기질 또는 지지체 구조는 통합 또는 조립된 미세유체 플로우 셀 내에 하나 이상의 표면을 포함할 수 있다. 기질 또는 지지체 구조는 마이크로플레이트 형식 내에 하나 이상의 표면, 예를 들어, 마이크로플레이트의 웰의 바닥 표면을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 바람직한 실시양태에서 기질 또는 지지체 구조는 모세관의 내부 표면 (예컨대, 루멘(lumen) 표면)을 포함한다. 대안적인 바람직한 실시양태에서, 기질 또는 지지체 구조는 평면 칩으로 에칭된 모세관의 내부 표면 (예컨대, 루멘 표면)을 포함한다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 낮은 비특이적 결합 지지체는 단백질, 핵산, 및 고상 핵산 증폭에 사용되는 혼성화 및/또는 증폭 제형의 다른 구성요소의 감소된 비특이적 결합을 나타낸다. 주어진 지지체 표면에 의해 나타나는 비특이적 결합의 정도는 정성적으로 또는 정량적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 표준화된 조건 세트에서 형광 염료 (예를 들어, 사이아닌 예컨대 Cy3, 또는 Cy5, 등, 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 등 또는 본 명세서에 개시된 다른 염료), 형광-표지된 뉴클레오타이드, 형광-표지된 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 형광-표지된 단백질 (예를 들어, 폴리머라제)에 대해 표면을 노출한 다음, 지정된 세정 프로토콜 및 형광 영상화를 수행하여 상이한 표면 제형을 포함하는 지지체에서 비특이적 결합을 비교하기 위한 정성적 도구로서 사용할 수 있다. 일부 경우에, 표준화된 조건 세트 하에서 형광 염료, 형광-표지된 뉴클레오타이드, 형광-표지된 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 형광-표지된 단백질 (예를 들어, 폴리머라제)에 표면을 노출시킨 후, 지정된 세정 프로토콜 및 형광 영상화를 수행하여 상이한 표면 제형을 포함하는 지지체에서 비특이적 결합을 비교하기 위한 정성적 도구로서 사용할수 있는데, 단 형광 신호가 지지체 표면의 형광단의 수에 대해 (예를 들어, 형광단의 신호 포화 및/또는 자가 소광은 문제가 되지 않는 조건하에서) 선형으로 관련되고 (또는 예측 가능한 방식으로 관련), 적합한 보정 표준이 사용되는 조건하에서 형광 영상화가 수행되도록 주의를 기울였다. 일부 경우에, 당업자에게 공지된 다른 기법, 예를 들어, 방사성 동위원소 표지 및 계수 방법이 본 발명의 상이한 지지체 표면 제형에 의해 비특이적 결합이 나타나는 정도를 정량적으로 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 일부 표면은 Cy3와 같은 형광단의 특이적 대 비특이적 결합 비율이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 100 초과, 또는 본 명세서의 범위에 의해 포괄되는 임의의 중간값을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 일부 표면은 Cy3와 같은 형광단의 특이적 대 비특이적 형광 비율이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 100 초과, 또는 본 명세서의 범위에 의해 포괄되는 임의의 중간값을 나타낸다.
언급된 바와 같이, 일부 경우에, 개시된 낮은-결합 지지체에 의해 나타나는 비특이적 결합의 정도는 표준화된 프로토콜을 사용하여, 표면을 표지된 단백질 (예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA), 스트렙타비딘, DNA 폴리머라제, 역전사효소, 헬리카제, 단일-가닥 결합 단백질 (SSB), 등, 또는 이의 임의의 조합), 표지된 뉴클레오타이드, 표지된 올리고뉴클레오타이드, 등과 표준화된 인큐베이션 및 세정 조건 세트 하에서 접촉시킨 다음, 표면에 남아있는 표지 양을 검출하고 이로부터 발생하는 신호를 적절한 보정 표준과 비교하여 평가할 수 있다. 일부 경우에, 표지는 형광 표지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표지는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표지는 당업자에게 공지된 임의의 다른 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 주어진 지지체 표면 제형에 의해 나타난 비특이적 결합의 정도는 따라서 단위 면적당 비특이적으로 결합된 단백질 분자 (또는 다른 분자)의 수의 관점에서 평가될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 낮은-결합 지지체는 μm2당 0.001 분자 미만, μm2당 0.01 분자 미만, μm2당 0.1 분자 미만, μm2당 0.25 분자 미만, μm2당 0.5 분자 미만, μm2당 1 분자 미만, μm2당 10개 분자 미만, μm2당 100 분자 미만, 또는 μm2당 1,000 분자 미만의 비특이적 단백질 결합 (또는 다른 지정된 분자, (예를 들어, Cy3, 또는 Cy5, 등과 같은 사이아닌 염료, 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 등, 또는 본 명세서에 개시된 다른 염료)의 비특이적 결합)을 나타낼 수 있다. 당업자는 본 발명의 주어진 지지체 표면이 상기 범위 내의 임의의 위치에 속하는, 예를 들어, μm2당 86 분자 미만의 비특이적 결합을 나타낼 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 일부 변형된 표면은 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 완충액에서 15 분간 Cy3 표지된 스트렙타비딘 (GE Amersham)의 1 μM 용액과 접촉한 다음, 탈이온수로 3회 세정한 후, 0.5 분자/μm2 미만의 비특이적 단백질 결합을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 일부 변형된 표면은 μm2당 0.25 분자 미만의 Cy3 염료 분자의 비특이적 결합을 나타낸다. 독립적인 비특이적 결합 분석에서, 1 μM 표지된 Cy3 SA (ThermoFisher), 1 μM Cy5 SA 염료 (ThermoFisher), 10 μM 아미노알릴-dUTP-ATTO-647N (Jena Biosciences), 10 μM 아미노알릴-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 μM 아미노알릴-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 μM 7-프로파길아민-7-디아자-dGTP-Cy5 (Jena Biosciences, 및 10 μM 7-프로파길아민-7-디아자-dGTP-Cy3 (Jena Biosciences)를 384 웰 플레이트 형식으로 15 분간 37 ℃에서 낮은 결합 기질에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 50 ul 탈이온 RNase/DNase 유리수로 2-3회 세정하고 25 mM ACES 완충액 (pH 7.4)으로 2-3회 세정하였다. 384 웰 플레이트를 GE Typhoon 기기에서 제조업체가 지정한 Cy3, AF555, 또는 Cy5 필터 세트 (수행되는 염료 테스트에 따라)를 사용하여 800의 PMT 게인(gain) 설정 및 50-100 μm의 분해능으로 영상화하였다. 고분해능 영상화를 위헤, Olympus IX83 현미경 (Olympus Corp., Center Valley, PA)에서, 전체 내부 형광 형광 (TIRF) 대물렌즈 (100X, 1.5 NA, Olympus), CCD 카메라 (예를 들어, Olympus EM-CCD 흑백 카메라, Olympus XM-10 흑백 카메라, 또는 Olympus DP80 컬러 및 흑백 카메라), 조명 공급원 (예를 들어, Olympus 100W Hg 램프, Olympus 75W Xe 램프, 또는 Olympus U-HGLGPS 형광 광원), 및 532 nm 또는 635 nm의 여기 파장으로 이미지를 수집하였다. 이색성 거울을 Semrock (IDEX Health & Science, LLC, Rochester, New York)으로부터, 예를 들어, 405, 488, 532, 또는 633 nm 이색상 반사기/빔스플리터를 구입하였으며, 대역 통과 필터는 적절한 여기 파장과 일치하는 532 LP 또는 645 LP로 선택하였다. 본 명세서에 개시된 일부 변형된 표면은 μm2당 0.25 분자 미만의 염료 분자의 비특이적 결합을 나타낸다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 일부 표면은 Cy3와 같은 형광단의 특이적 대 비특이적 결합 비율이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 100 초과, 또는 본 명세서의 범위에 의해 포괄되는 임의의 중간값을 나타낸다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 일부 표면은 Cy3와 같은 형광단의 특이적 대 비특이적 형광 신호의 비율이 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 또는 100 초과, 또는 본 명세서의 범위에 의해 포괄되는 임의의 중간값을 나타낸다.
본 명세서의 개시 내용과 일치하는 낮은-백그라운드 표면은 비특이적으로 흡착된 분자당 부착된 특이적 염료 분자가 적어도 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 또는 50 초과인, 특이적 염료 부착 (예를 들어, Cy3 부착) 대 비특이적 염료 흡착 (예를 들어, Cy3 염료 흡착) 비율을 나타낼 수 있다. 이와 유사하게, 여기 에너지가 가해지는 경우, 본 명세서의 개시 내용과 일치하는, 형광단, 예를 들어, Cy3이 부착되는 낮은-백그라운드 표면은 특이적 형광 신호 (예를 들어, 표면에 부착된 Cy3-표지된 올리고뉴클레오타이드로부터 발생) 대 비특이적 흡수된 염료 형광 신호의 비율이 적어도 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 또는 50:1 초과를 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 개시된 지지체 표면 친수성 (또는 수용액에 대한 "습윤성")의 정도는, 예를 들어, 물 접촉각을 측정하여 평가될 수 있으며, 이는 작은 물방울을 표면에 배치하고, 예를 들어, 광학 장력계를 사용하여 표면과의 접촉각을 측정한다. 일부 경우에, 정적 접촉각이 결정될 수 있다. 일부 경우에, 전진 또는 후진 접촉각이 측정될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 친수성의, 낮은-결합 지지체 표면에 대한 물 접촉각은 약 0 도 내지 약 30 도의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 개시된 친수성의, 낮은-결합 지지체 표면에 대한 물 접촉각은 50 도, 40 도, 30 도, 25 도, 20 도, 18 도, 16 도, 14 도, 12 도, 10 도, 8 도, 6 도, 4 도, 2 도, 또는 1 도 이하일 수 있다. 많은 경우에 접촉각은 40 도 이하이다. 당업자는 본 명세서의 주어진 친수성, 낮은-결합 지지체 표면이 상기 범위 내의 임의의 값을 가지는 물 접촉각을 나타낼 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 친수성 표면은 종종 낮은-결합 표면에 대한 생체 분자의 비특이적 결합이 감소함으로 인해, 생물검정을 위한 감소된 세척 시간을 용이하게 한다. 일부 경우에, 적절한 세척 단계는 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 초 미만, 또는 10 초 미만으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 적절한 세척 단계는 30 초 미만으로 수행될 수 있다.
본 명세서의 일부 낮은-결합 표면은 용매 및 고온에 대한 장기간 노출, 또는 용매 노출 또는 온도 변화의 반복되는 사이클에 대한 안정성 또는 내구성의 상당한 개선을 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 개시된 표면의 안정성은 표면의 작용기, 또는 표면에 테더링된 생체 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 프라이머)를 형광 표지하고, 용매 및 고온에 대한 장기간 노출, 또는 용매 노출 또는 온도 변화의 반복되는 사이클 이전, 동안 및 이후 형광 신호를 모니터링함으로써 시험할 수 있다 일부 경우에, 표면의 품질을 평가하는데 사용되는 형광의 변화 정도는 용매 및/또는 고온에 대해 노출된 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 15 시간, 20 시간, 25 시간, 30 시간, 35 시간, 40 시간, 45 시간, 50 시간, 또는 100 시간의 기간에 걸쳐, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만 (또는 상기 기간에 걸쳐 측정된 상기 백분율의 임의의 조합)일 수 있다. 일부 경우에, 표면의 품질을 평가하는데 사용되는 형광의 변화 정도는 용매 변화 및/또는 온도 변화에 반복 노출된 5 사이클, 10 사이클, 20 사이클, 30 사이클, 40 사이클, 50 사이클, 60 사이클, 70 사이클, 80 사이클, 90 사이클, 100 사이클, 200 사이클, 300 사이클, 400 사이클, 500 사이클, 600 사이클, 700 사이클, 800 사이클, 900 사이클, 또는 1,000 사이클에 걸쳐, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만 (또는 상기 사이클 범위에 걸쳐 측정된 상기 백분율의 임의의 조합)일 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 표면은 특이적 신호 대 비특이적 신호 또는 다른 백그라운드의 비율이 높게 나타날 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭에 사용되는 경우, 일부 표면은 표면의 인접한 비밀집 영역의 신호보다 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100배, 또는 100 배 초과하는 증폭 신호를 나타낼 수 있다. 이와 유사하게, 일부 표면은 표면의 인접한 증폭된 핵산 밀집 영역의 신호를 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100 배, 또는 100-배 초과하는 증폭 신호를 나타낸다.
일부 경우에, 개시된 낮은 백그라운드 표면의 형광 이미지는, 혼성화된 또는 클론 증폭된 핵산 분자(예를 들어, 형광단으로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된)의 클러스터를 생성하기 위해 핵산 혼성화 또는 증폭 적용에 사용될 때, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 210, 220, 230, 240, 250, 또는 250을 초과하는 대조도 대 잡음비 (CNR)를 나타낸다.
하나 이상 유형의 프라이머는 지지체 표면에 부착 또는 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상 유형의 어댑터 또는 프라이머는 스페이서 서열, 어댑터-결찰 표적 라이브러리 핵산 서열에 혼성화하기 위한 어댑터 서열, 정방향 증폭 프라이머, 역방향 증폭 프라이머, 시퀀싱 프라이머, 및/또는 분자 바코딩 서열, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 1개의 프라이머 또는 어댑터 서열은 표면의 적어도 하나의 층에 테더링될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 개 초과의 상이한 프라이머 또는 어댑터 서열은 표면의 적어도 하나의 층에 테더링될 수 있다.
일부 경우에, 테더링된 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 길이가 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 테더링된 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 길이가 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, 테더링된 어댑터 및/또는 프라이머 서열은 길이가 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 또는 최대 10개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 하한값은 본 명세서 내에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 테더링된 어댑터 및/또는 프라이머 서열의 길이는 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 80개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 당업자는 테더링된 어댑터 및/또는 프라이머 서열의 길이가 상기 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 24 뉴클레오타이드일 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 본 발명의 낮은 결합 지지체 표면 상에서 프라이머의 생성된 표면 밀도는 μm2당 약 100 프라이머 분자 내지 μm2당 약 100,000 프라이머 분자의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 낮은 결합 지지체 표면 상에서 프라이머의 생성된 표면 밀도는 μm2당 약 1.000 프라이머 분자 내지 μm2당 약 1,000,000 프라이머 분자의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 프라이머의 표면 밀도는 μm2당 적어도 1,000개, 적어도 10,000개, 적어도 100,000개, 또는 적어도 1,000,000개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 프라이머의 표면 밀도는 μm2당 최대 1,000,000개, 최대 100,000개, 최대 10,000개, 또는 최대 1,000개의 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 하한값은 본 명세서 내에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 프라이머의 표면 밀도는 μm2당 약 10,000개 분자 내지 μm2당 약 100,000개 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 프라이머 분자의 표면 밀도가 상기 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, μm2당 약 455,000개의 분자를 가질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에, 지지체 표면 상의 어댑터 또는 프라이머 서열에 초기에 혼성화된 표적 라이브러리 핵산 서열의 표면 밀도는 테더링된 프라이머의 표면 밀도에 대해 표시된 것보다 작거나 같을 수 있다. 일부 경우에, 지지체 표면 상의 어댑터 또는 프라이머 서열에 혼성화된 클론 증폭된 표적 라이브러리 핵산 서열의 표면 밀도는 테더링된 프라이머의 표면 밀도에 대해 표시된 것과 동일한 범위에 걸쳐 있을 수 있다.
상기 열거된 국부 밀도는 표면에 걸친 밀도 변화를 배제하지 않으므로, 표면은 예를 들어, 500,000/μm2의 올리고 밀도를 가지는 영역을 포함하면서, 또한 실질적으로 상이한 국부 밀도를 가지는 적어도 제2 영역을 포함할 수 있다.
VI. 예시적인 대안의 실시양태
표적 핵산의 서열을 결정하는 개시된 방법은 다음의 단계를 포함한다: a) 시퀀싱될 주형 가닥 및 연장될 프라이머 가닥을 포함하는 이중-가닥 또는 부분적으로 이중-가닥 표적 핵산 분자를 하나 이상의 개시된 핵산 결합 조성물과 접촉시키는 단계; 및 b) 핵산 분자에 대한 핵산 결합 조성물의 결합을 검출하여, 상기 핵산 분자 상의 상기 하나 이상의 핵산 결합 조성물 중 하나의 존재 및 상보적 가닥에 혼입될 다음 뉴클레오타이드 (즉, N+1 또는 말단 뉴클레오타이드)의 실체를 결정하는 단계.
시퀀싱 방법은 추가적으로 N+1 또는 말단 뉴클레오타이드를 프라이머 가닥에 혼입한 다음, 하나 이상의 추가적인 반복에 대해 접촉, 검출, 및 혼입 단계를 반복하여, 핵산 분자의 주형 가닥의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 삼원 결합 복합체를 검출하는 단계 이후, 프라이밍된 표적 핵산의 프라이밍된 가닥은 또 다른 차례의 분석이 수행디기 전에 하나의 염기에 대해 연장된다. 프라이밍된 표적 핵산은 다가 결합 조성물 내 중합체에 부착된 컨쥬게이션된 뉴클레오타이드를 사용하여 또는 다가 결합 조성물이 제거된 이후 제공되는, 컨쥬게이트되지 않은 또는 테더링되지 않은 유리 뉴클레오타이드를 사용하여 연장될 수 있다.
프라이밍된 표적 핵산의 연장은 가닥 상의 차단된 뉴클레오타이드 또는 촉매적으로 불활성인 폴리머라제의 사용으로 인해 방지 또는 억제될 수 있다. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 뉴클레오타이드가 핵산의 연장을 방지하는 차단기를 가지는 경우, 뉴클레오타이드의 혼입은 상기 뉴클레오타이드로부터 차단기를 제거하여 (예컨대 중합체, 분지형 중합체, 덴드리머, 입자, 등으로부터 상기 뉴클레오타이드의 분리에 의해) 달성될 수 있다. 프라이밍된 표적 핵산의 연장이 촉매적으로 불활성인 폴리머라제의 사용으로 인해 억제되는 경우, 뉴클레오타이드의 혼입은 금속 이온과 같은 보조인자 또는 활성화제의 제공에 의해 달성될 수 있다
삼원 복합체의 검출은 뉴클레오타이드 잔기의 혼입 이전, 동시에, 또는 이후에 달성된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍된 표적 핵산은 폴리머라제 및/또는 핵산 결합 모이어티의 부착을 위해 다중 프라이밍된 위치를 가지는 표적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중 폴리머라제는 단일 표적 핵산 분자에, 예컨대 표적 핵산 분자 내에 다중 부위로 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중 폴리머라제는 다중 뉴클레오타이드를 포함하는 본 명세서에 개시된 다가 결합 조성물에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 분자는 가닥 치환 합성, 롤링 서클 증폭, 질의 서열의 다중 서열의 연결(concatenation) 또는 융합, 또는 동일한 서열의 다중 카피를 포함하는 핵산 분자를 생성하기 위해 기술 분야 내 공지된 또는 본 명세서 다른 곳에 개시된 다른 방법의 생성물일 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 다중 폴리머라제는 질의 서열의 다수의 동일한 또는 실질적으로 동일한 카피를 포함하는 표적 핵산 내에 다수의 동일한 또는 실질적으로 동일한 위치에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 다중 폴리머라제는 하나 이상의 다가 결합 복합체와의 상호작용에 관여할 수 있다; 그러나, 바람직한 실시양태, 표적 핵산 내의 결합 부위의 수는 적어도 2이고, 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 예컨대 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트에 존재하는 뉴클레오타이드 또는 기질 모이어티의 수도 또한 2 이상이다.
예를 들어 핵산 서열의 특정 위치에서 뉴클레오타이드의 식별을 제공하기 위해, 최적화된 신호를 제공하는 것과 같이 다른 요소와의 조합하여 다가 결합 조성물을 제공하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 낮은 백그라운드 결합 또는 낮은 수준의 단백질 결합을 제공하는 표면, 특히 친수성 또는 중합체 코팅된 표면과 조합하여 제공된다. 대표적인 표면은, 예를 들어, 미국 특허 출원 제16/363,842호에서 확인할 수 있으며, 상기 특허의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
일부 경우에, 핵산 분자는, 예를 들어, 고체 지지체에 테더링된 어댑터 핵산 서열 또는 프라이머 핵산 서열에 대한 주형 가닥의 혼성화를 통해 고체 지지체의 표면에 테더링된다. 일부 경우에, 고체 지지체는 유리, 접합된-실리카, 규소, 또는 중합체 기질을 포함한다. 일부 경우에, 고체 지지체는 하나 이상의 친수성 중합체 층 (예를 들어, PEG 층)을 포함하는 낮은 비특이적 결합 코팅을 포함하며, 여기서 친수성 중합체 층 중 적어도 하나는 분지형 중합체 분자 (예를 들어, 4, 8, 16, 또는 32개 분지를 포함하는 분지형 PEG 분자)를 포함한다.
고체 지지체는 μm2당 약 1,000개 프라이머 분자 내지 μm2당 약 1,000,000개의 프라이머 분자 범위의 표면 밀도로, 적어도 하나의 친수성 중합체층에 테더링된 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 프라이머를 포함한다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 표면 밀도는 μm2당 적어도 1,000개, 적어도 10,000개, 적어도 100,000개, 또는 적어도 1,000,000개의 분자일 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 표면 밀도는 μm2당 최대 1,000,000개, 최대 100,000개, 최대 10,000개, 또는 최대 1,000개의 분자일 수 있다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 하한값은 본 명세서 내에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 프라이머의 표면 밀도는 μm2당 약 10,000개 분자 내지 μm2당 약 100,000개의 분자의 범위일 수 있다. 당업자는 프라이머 분자의 표면 밀도가 상기 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, μm2당 약 455,000개의 분자를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
당업자는 일련의 반복적인 시퀀싱 반응에서, 떼때로 하나 이상의 부위가 주어진 사이클 동안 뉴클레오타이드를 혼입하는데 실패하여, 하나 이상의 부위가 연장하는 핵산 사슬의 벌크와 동기화되지 않음(unsynchronized)을 인식할 것이다. 시퀀싱 신호가 표적 핵산의 단일 카피에서 발생하는 반응에서 파생되는 조건에서, 이러한 혼입 실패는 출력 시퀀스에 개별 오류를 산출한다. 본 명세서의 목적은 시퀀싱 반응에서 이러한 유형의 오류를 감소하는 방법을 설명하는 것이다. 예를 들어, 삼원 폴리머라제 복합체의 조기 해리 시에 증가된 재결합의 가능성을 제공함으로써, 연장하는 가닥으로 혼입할 수 있는 다가 기질의 사용은 염기가 혼입되지 않은 "스킵된" 사이클의 빈도를 감소시킬 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 본 발명은 뉴클레오사이드 모이어티가 유리, 또는 가역적으로 개질된, 5' 포스페이트, 다이포스페이트, 또는 트라이포스페이트 모이어티를 가지는 뉴클레오타이드 내에 포함되며, 이러한 뉴클레오타이드가는, 불안정하거나 또는 절단 가능한 연결부를 통해 본 명세서에 개시된 입자 또는 중합체에 연결되는, 본 명세서에 개시된 다가 기질의 사용을 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 명세서는 본 명세서에 개시된 다가 기질을 사용한 결과로서 스킵된 혼입으로 인한 고유 오류율의 감소를 고려한다.
본 발명은 또한 주어진 서열로부터 또는 이와 관련된 시퀀싱 신호가 표적 서열의 다중 카피를 포함하는 정의가능한 영역으로부터 유래되거나 그 내부에서 유래하는 시퀀싱 반응을 고려한다. 표적 서열의 다중 카피를 혼입하는 시퀀싱 방법은 정의된 영역 내에서 다중 동시 시퀀싱 반응의 존재로 인해 신호가 증폭되어, 각각 고유의 신호를 제공하는 이점을 제공한다. 정의된 영역 내에 다중 신호의 존재는 또한 많은 수의 정확한 염기 확정의 신호가 적은 수의 스킵 또는 잘못된 염기 확정 신호를 압도할 수 있다는 사실때문에, 임의의 스킵한 단일 주기의 영향을 감소시킨다. 본 발명은 이전의 사이클에서 스킵되었을 수도 있는 부위에 혼입을 제공하기 위해, 신장 반응 동안, 또는 신장 사이클 중 별도의 부분 동안, 유리, 표지되지 않은 뉴클레오타이드의 포함을 추가적으로 고려한다. 예를 들어, 혼입 사이클 동안 또는 그 이후에, 표지되지 않은 차단된 뉴클레오타이드가 스킵된 부위에 혼입될 수 있도록 첨가될 수 있다. 표지되지 않은 차단된 뉴클레오타이드 특정 사이클 동안 존재하거나 존재했던 다가 결합 기질 또는 기질에 부착된 뉴클레오타이드와 동일한 유형 또는 유형들일 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 4가지 이상 유형의 표지되지 않은 차단된 뉴클레오타이드의 혼합물이 포함될 수 있다.
각각의 시퀀싱 사이클이 완벽하게 진행되면, 정의된 영역 내의 각각의 반응이 동일한 신호를 제공할 것이다. 그러나, 본 명세서의 다른 부분에서 언급한 바와 같이, 일련의 반복적인 시퀀싱 반응에서, 떼때로 하나 이상의 부위가 주어진 사이클 동안 뉴클레오타이드를 혼입하는데 실패하여, 하나 이상의 부위가 연장하는 핵산 사슬의 벌크와 동기화되지 않음을 인식할 것이다. "페이징(phasing)"이라고도 하는 이러한 문제는 신호가 스킵된 하나 이상의 사이클을 가지는 부위로부터 거짓(spurious) 신호로 오염되기 때문에 시퀀싱 신호의 저하로 이어진다. 이것은, 결과적으로 염기 식별의 오류에 대한 가능성을 생성한다. 여러 사이클을 통해 스킵된 사이클이 점진적으로 누적되면 각 사이클에서 시퀀싱 신호가 점진적으로 저하되기 때문에 유효 판독 길이도 또한 감소한다. 추가적으로 본 발명의 목적은 페이징 에러를 감소시키고 및/또는 시퀀싱 반응에서 판독 길이를 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
시퀀싱 방법은 표적 서열의 다중 연결된 또는 연결되지 않은 카피를 포함하는, 표적 핵산 또는 다중 표적 핵산을 본 명세서에 기재된 다가 결합 조성물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 표적 서열의 다중 연결된 또는 연결되지 않은 카피를 포함하는 상기 표적 핵산, 또는 다중 표적 핵산과 하나 이상의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 접촉은 주어진 시퀀싱 사이클에서 조사되는 정확한 뉴클레오타이드의 국소 농도를 실질적으로 증가시킬 수 있고, 따라서부적절한 혼입 또는 페이징된 핵산 사슬 (즉, 하나 이상의 스킵된 사이클을 가지는 연장하는 핵산 사슬)로부터 신호를 억제할 수 있다.
핵산 서열 정보를 획득하는 방법은 표적 핵산, 또는 다중 표적 핵산을 하나 이상의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 표적 핵산 또는 다중 표적 핵산은 표적 서열의 다중 연결된 또는 연결되지 않은 카피를 포함한다. 이러한 방법은 염기의 오식별, 존재하지 않는 염기 보고, 또는 정확한 염기 보고 실패에서 감소에 의해 나타난 바와 같이 시퀀싱의 오류율을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 시퀀싱의 오류율의 감소는 유리 뉴클레오타이드, 표지된 유리 뉴클레오타이드, 단백질 또는 펩타이드 결합된 뉴클레오타이드, 또는 표지된 단백질 또는 펩타이드 결합된 뉴클레오타이드를 비롯한, 1가 리간드를 사용하여 관찰된 오류율과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20% 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 이상의 감소를 포함할 수 있다.
핵산 서열 정보를 획득하는 방법은 표적 핵산, 또는 다중 표적 핵산을 하나 이상의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 주형 핵산 또는 다중 표적 핵산은 표적 서열의 다중 연결된 또는 연결되지 않은 카피를 포함한다. 이러한 방법은 유리 뉴클레오타이드, 표지된 유리 뉴클레오타이드, 단백질 또는 펩타이드 결합된 뉴클레오타이드, 또는 표지된 단백질 또는 펩타이드 결합된 뉴클레오타이드를 비롯한, 1가 리간드를 사용하여 관찰된 평균 판독 길이와 비교하여, 평균 판독 길이를 5%, 10%, 15%, 20% 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 이상 증가시킨다.
본 명세서에는 핵산 서열 정보를 획득하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 표적 핵산, 또는 다중 표적 핵산을 하나 이상의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 표적 핵산 또는 다중 표적 핵산은 표적 서열의 다중 연결된 또는 연결되지 않은 카피를 포함한다. 이러한 방법은 유리 뉴클레오타이드, 표지된 유리 뉴클레오타이드, 단백질 또는 펩타이드 결합된 뉴클레오타이드, 또는 표지된 단백질 또는 펩타이드 결합된 뉴클레오타이드를 비롯한, 1가 리간드를 사용하여 관찰된 평균 판독 길이와 비교하여, 평균 판독 길이를 10개의 뉴클레오타이드 (NT), 20 NT, 25 NT, 30 NT, 50 NT, 75 NT, 100 NT, 125 NT, 150 NT, 200 NT, 250 NT, 300 NT, 350 NT, 400 NT, 500 NT 증가시킨다.
일부 경우에, 개시된 조성물 및 방법은 시퀀싱 적용을 위해 100개의 뉴클레오타이드 내지 1,000개의 뉴클레오타이드 범위인 평균 판독 길이를 야기할 수 있다. 일부 경우에, 평균 판독 길이는 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 225개의 뉴클레오타이드, 적어도 250개의 뉴클레오타이드, 적어도 275개의 뉴클레오타이드, 적어도 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 325개의 뉴클레오타이드, 적어도 350 뉴클레오타이드, 적어도 375개의 뉴클레오타이드, 적어도 400개의 뉴클레오타이드, 적어도 425개의 뉴클레오타이드, 적어도 450개의 뉴클레오타이드, 적어도 475개의 뉴클레오타이드, 적어도 500개의 뉴클레오타이드, 적어도 525개의 뉴클레오타이드, 적어도 550개의 뉴클레오타이드, 적어도 575개의 뉴클레오타이드, 적어도 600개의 뉴클레오타이드, 적어도 625개의 뉴클레오타이드, 적어도 650개의 뉴클레오타이드, 적어도 675개의 뉴클레오타이드, 적어도 700개의 뉴클레오타이드, 적어도 725개의 뉴클레오타이드, 적어도 750개의 뉴클레오타이드, 적어도 775개의 뉴클레오타이드, 적어도 800개의 뉴클레오타이드, 적어도 825개의 뉴클레오타이드, 적어도 850개의 뉴클레오타이드, 적어도 875개의 뉴클레오타이드, 적어도 900개의 뉴클레오타이드, 적어도 925개의 뉴클레오타이드, 적어도 950개의 뉴클레오타이드, 적어도 975개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 1,000개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, 평균 판독 길이는 상기 범위 내의 임의의 두 값에 의해 묶인 범위, 예를 들어, 375 뉴클레오타이드 내지 825 뉴클레오타이드의 평균 판독 길이일 수 있다. 당업자는 일부 경우에, 평균 판독 길이가 본 단락에 지정된 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 523 뉴클레오타이드를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
시퀀싱을 위한 다가 결합 조성물의 사용은 시퀀싱 시간을 효과적으로 단축시킨다. 접촉, 검출, 및 혼입 단계를 포함하는 시퀀싱 반응 사이클은 약 5 분 내지 약 60 분 범위의 전체 시간으로 수행된다. 일부 경우에, 시퀀싱 반응 사이클은 적어도 5 분, 적어도 10 분, 적어도 20 분, 적어도 30 분, 적어도 40 분, 적어도 50 분, 또는 적어도 60 분 이내로 수행된다. 일부 경우에, 시퀀싱 반응 사이클은 최대 60 분, 최대 50 분, 최대 40 분, 최대 30 분, 최대 20 분, 최대 10 분, 또는 최대 5 분 이내로 수행된다. 본 단락에 기재된 임의의 하한값 및 하한값은 본 명세서 내에 포함되는 범위를 형성하도록 조합될 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 시퀀싱 반응 사이클은 약 10 분 내지 약 30 분 범위의 전체 시간으로 수행될 수 있다. 당업자는 시퀀싱 사이클 시간이 상기 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 16 분일 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 시퀀싱 실행 과정에 걸쳐 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 정확한 평균 염기 확정 정확도를 제공할 것이다. 일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법 호출된 1,000 염기, 10,0000 염기, 25,000 염기, 50,000 염기, 75,000 염기, 또는 100,000개의 염기마다, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 정확한 평균 염기 확정 정확도를 제공할 것이다.
시퀀싱을 위한 다가 결합 조성물의 사용은 보다 정확한 염기 판독을 제공한다. 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 시퀀싱 실행에 걸쳐 염기 확정 정확도에 대해 약 20 내지 약 50 범위의 평균 Q-점수를 제공할 것이다. 일부 경우에, 평균 Q-점수는 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50이다. 당업자는 평균 Q-점수가 상기 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 32일 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%에 대해 30 초과의 Q-점수를 제공할 것이다. 일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%에 대해 35 초과의 Q-점수를 제공할 것이다. 일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%에 대해 40 초과의 Q-점수를 제공할 것이다. 일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%에 대해 45 초과의 Q-점수를 제공할 것이다. 일부 경우에, 핵산 시퀀싱을 위한 개시된 조성물 및 방법은 식별된 말단 (또는 N+1) 뉴클레오타이드의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%에 대해 50 초과의 Q-점수를 제공할 것이다.
개시된 낮은 비특이적 결합 지지체 및 관련된 핵산 혼성화 및 증폭 방법은 임의의 다양한 상이한 세포, 조직, 또는 당업자에게 공지된 샘플 유형으로부터 유도된 핵산 분자의 분석에 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 진핵 생물 (예컨대 동물, 식물, 진균, 원생생물), 고세균, 또는 유박테리아로부터 유래된 하나 이상 유형의 세포를 포함하는 세포, 또는 조직 샘플로부터 추출될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 원핵 또는 진핵 세포, 부착성(adherent) 또는 비부착성(non-adherent) 진핵 세포로부터 추출될 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 1차 또는 불멸화된(immortalized) 설치류, 돼지, 고양이, 개, 소, 말, 영장류 또는 인간 세포주로부터 다양하게 추출된다. 핵산은 임의의 다양한 상이한 세포, 기관, 또는 조직 유형 (예를 들어, 백혈구 세포, 적혈구 세포, 혈소판, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 신경교 세포, 성상 세포, 섬유아세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 생식자 또는 심장, 폐, 뇌, 간, 신장, 비장, 췌장, 흉선, 방광, 위, 결장 또는 소장으로부터의 세포)로부터 추출될 수 있다. 핵산은 정상 또는 건강한 세포로부터 추출될 수 있다. 대안적으로 또는 조합으로, 핵산은 암 세포와 같은 질병 세포로부터, 또는 숙주를 감염시키는 병원성 세포로부터 추출된다. 일부 핵산 세포 유형의 별개의 하위 집합, 예를 들어, 면역 세포 (예컨대 T 세포, 세포 독성 (살해) T 세포, 헬퍼 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, T 세포 전구세포, B 세포, B-세포 전구세포, 림프 줄기 세포, 골수성 전구 세포, 림프구, 과립구, 자연 살해 세포, 형질 세포, 기억 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 대식 세포, 또는 이의 임의의 조합), 미분화 인간 줄기 세포, 분화가 유도된 인간 줄기 세포, 희귀 세포 (예를 들어, 순환 종양 세포 (CTC), 순환 상피 세포, 순환 내피 세포, 순환 자궁내막 세포, 골수 세포, 전구 세포, 거품 세포, 중간엽 세포, 또는 영양막)으로부터 추출될 수 있다. 핵산은 바이러스 샘플 및 서브바이러스 병원체, 예컨대 바이로이드(viroid) 및 감염성 RNA로부터 유래된 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 임상 또는 기타 샘플, 예컨대 가래, 타액, 안구액, 활액, 혈액, 대변, 소변, 조직 삼출물, 땀, 고름, 배액액 등으로부터 유래될 수 있다. 핵산은 식물 또는 진균 샘플로부터, 예컨대 잎, 형성층, 뿌리, 분열조직, 꽃가루, 난자, 종자, 포자, 꽃차례, 균사체 등으로부터 추가적으로 유래될 수 있다. 핵산은 또한 환경적 또는 산업적 샘플, 예컨대 물, 공기, 먼지, 식품 등으로부터 유래될 수 있다. 다른 세포, 조직, 및 샘플이 고려되며 본 발명의 개시 내용과 일치한다.
세포 또는 다른 생물학적 샘플로부터의 핵산 추출은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 추출 절차는 다음의 단계를 포함할 수 있다: (i) DNA가 추출될 세포 샘플 또는 조직 샘플 수집, (ii) DNA 및 다른 세포질 성분 방출을 위해 세포막 파괴 (즉, 세포 용해), (iii) 용해된 샘플을 농축된 염 용액으로 처리하여 단백질, 지질, 및 RNA를 침전시키고, 원심분리하여, 침전된 단백질, 지질, 및 RNA를 분리 및 (iv) 상등액으로부터 DNA를 정제하여, 세포막 용해 단계에서 사용된 세제, 단백질, 염, 또는 기타 시약 제거.
다양한 적합한 상업용 핵산 추출 및 정제 키트가 본 발명의 개시 내용과 일치한다. 예로는 Qiagen (Germantown, MD)의 QIAamp 키트 (인간 샘플로부터 게놈 DNA 단리) 및 DNAeasy 키트 (동물 또는 식물 샘플로부터 게놈 DNA 단리), 또는 Promega (Madison, WI)의 Maxwell® 및 ReliaPrep™ 시리즈 키트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
VII. 시스템
시스템 모듈: 상기 언급된 바와 같이, 또한 본 명세서에는 개시된 임의의 핵산 시퀀싱 또는 핵산 검출 및 분석 방법을 수행하도록 구성된 시스템이 개시된다. 일부 경우에, 개시된 시스템은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 다가 결합 조성물, 하나 이상의 완충제, 및/또는 고체 지지체에 테더링된 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 시스템은 고체 지지체에 테더링된 핵산 분자 (예를 들어, 어댑터 또는 프라이머)에 혼성화된 테더링된 주형 핵산 분자를 개시된 다가 결합 조성물 및/또는 시약과 순차적으로 및 반복적으로 접촉시키도록 구성된 유체 흐름 제어기 및/또는 유체 분배 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 접촉 단계는 하나 이상의 플로우 셀 내에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 상기 플로우 셀은 시스템의 고정 구성요소일 수 있다. 일부 경우에, 상기 플로우 셀은 시스템의 제거 가능한 및/또는 일회용 구성요소일 수 있다.
일부 경우에, 시스템은 영상화 모듈을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 영상화 모듈은, 고체 지지체 또는 플로우 셀 내부에 테더링된 표적 (또는 주형) 핵산 분자에 대한 개시된 다가 결합 조성물의 결합의 영상화 및 검출을 위해, 예를 들어, 하나 이상의 광원, 하나 이상의 광학 부품 (예를 들어, 렌즈, 거울, 프리즘, 광학 필터, 컬러 유리 필터, 협대역 간섭 필터, 광대역 간섭 필터, 이색성 반사기, 회절 격차, 개구, 광섬유, 또는 광 도파관 등), 및 하나 이상의 이미지 센서 (예를 들어, 전하 결합 소자 (charge-coupled device, CCD) 센서 또는 카메라, 상보적 금속-산화물-반도체 (complementary metal-oxide-semiconductor, CMOS) 이미지 센서 또는 카메라, 또는 네거티브 채널 금속-산화물 반도체 (negative-channel metal-oxide semiconductor, NMOS) 이미지 센서 또는 카메라)를 포함한다.
프로세서 및 컴퓨터 시스템: 하나 이상의 프로세서가 본 명세서에 개시된 핵산 시퀀싱 또는 다른 핵산 검출 및 분석 방법을 위한 시스템을 구현하도록 사용될 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 하드웨어 프로세서, 예컨대 중앙 처리 장치 (CPU), 그래픽 처리 장치 (GPU), 범용 처리 장치, 또는 컴퓨팅 플랫폼(computing platform)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 임의의 다양한 적합한 집적 회로 (예를 들어, 딥 러닝 네트워크 아키텍쳐를 구현하기 위해 특별히 설계된 특정 용도용 집적 회로 (ASIC), 또는 계산 시간 등을 가속화하기 위한, 및/또는 배치를 용이하게 하기 위한 필드-프로그래머블 게이트 어레이 (field-programmable gate array, FPGA)), 마이크로프로세서, 신흥 차세대 마이크로프로세서 설계 (예를 들어, 멤리스터(memristor) 기반 프로세서), 논리 소자 등으로 구성될 수 있다. 본 명세서가 프로세서를 참조하여 기재되지만, 다른 유형의 집적 회로 및 논리 소자가 또한 적용될 수 있다. 프로세서는 임의의 적합한 데이터 연산 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 512 비트, 256 비트, 128 비트, 64 비트, 32 비트, 또는 16 비트 데이터 연산을 수행할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 단일 코어 또는 멀티 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위해 구성된 복수의 프로세서일 수 있다.
개시된 방법을 구현하기 위해 사용되는 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터는 더 큰 컴퓨터 시스템의 일부일 수 있고 및/또는 데이터의 전송 및 공유를 용이하게 하기 위해 통신 인터페이스 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크")에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 네트워크는 근거리 네트워크, 인트라넷 및/또는 익스트라넷, 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 익스트라넷, 또는 인터넷일 수 있다. 네트워크는 일부 경우에 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있으며, 이는 일부 경우에 클라우드 컴퓨팅과 같은 분산 컴퓨팅을 가능하게 한다. 네트워크는, 일부 경우에 컴퓨터 시스템의 도움으로, 피어 투 피어(peer-to-peer) 네트워크를 구현할 수 있으며, 이는 컴퓨터 시스템과 연결된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 동작할 수 있도록 한다.
컴퓨터 시스템은 또한 메모리 또는 메모리 위치 (예를 들어, 랜덤-액세스 메모리, 읽기 전용 메모리, 플래쉬 메모리, Intel®Optane™ technology), 전자 저장 장치 (예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스 (예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치, 예컨대 캐시, 기타 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함할 수 있다. 메모리, 저장 장치, 인터페이스 및 주변 장치는 예를 들어, 마더보드에서 발견되는 바와 같이 통신 버스를 통해, 하나 이상의 프로세서, 예를 들어, CPU와 통신할 수 있다. 저장 장치(들)은 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치(들) (또는 데이터 저장소)일 수 있다.
하나 이상의 프로세서, 예를 들어, CPU는 일련의 기계 판독 가능한 명령어를 실행하며, 이는 프로그램 (또는 소프트웨어)에 구현된다. 명령어는 메모리 위치에 저장된다. 명령어는 CPU로 향하며, 이는 후속적으로 본 개시내용의 방법을 구현하도록 CPU를 프로그래밍 또는 그렇지 않으면 구성한다. CPU가 수행하는 작업의 예로는 가져오기, 디코딩(decode), 실행 및 다시 쓰기가 있다. CPU는 집적 회로와 같은 회로의 일부일 수 있다. 시스템의 하나 이상의 다른 구성요소가 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 특정 용도용 집적 회로(application specific integrated circuit, ASIC)이다.
저장 장치는 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장한다. 저장 장치는 사용자 데이터, 예를 들어, 사용자-지정 선호도 및 사용-지정 프로그램을 저장한다. 컴퓨터 시스템은 일부 경우에 컴퓨터 시스템 외부에 있는, 예컨대 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템과 통신하는 원격 서버에 위치하는 하나 이상의 추가적인 데이터 저장 장치를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 방법 및 시스템의 일부 양태는 컴퓨터 시스템의 전자 저장 장치, 예를 들어, 메모리 또는 전자 저장 장치에 저장된 기계 (예를 들어, 프로세서) 실행 코드(executable code)를 통해 구현될 수 있다. 기계-실행(machine-executable) 또는 기계-판독(machine-readable) 코드는 소프트웨어의 형태로 제공될 수 있다. 사용하는 동안, 코드는 하나 이상의 프로세서에 의해 실행된다. 일부 경우에, 코드는 저장 장치로브터 검색되어 하나 이상의 프로세서가 즉시 액세스할 수 있도록 메모리에 저장된다. 일부 상황에서, 전자 저장 장치가 제외되고, 기계-실행 명령어가 메모리에 저장된다. 코드는 미리 컴파일되어 코드를 실행하도록 구성된 하나 이상의 프로세서가 있는 기계와 함께 사용하도록 구성되거나 런타임에 컴파일될 수 있다. 코드는 미리 컴파일되거나 컴파일된 대로(as-compiled fashion) 실행할 수 있도록 선택된 프로그래밍 언어로 제공될 수 있다.
기술의 다양한 측면은 종종 기계 판독 매체 유형에 저장된 기계- (또는 프로세서-) 실행 코드 및/또는 관련 데이터의 형태로 "제품" 또는 "제조 물품", 예를 들어, "컴퓨터 프로그램 또는 소프트웨어 제품"으로 간주될 수 있고, 여기서 실행 코드는 본 명세서에 개시된 방법 중 하나 이상을 수행하는데 컴퓨터 또는 컴퓨터 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령어를 포함한다. 기계-실행 코드는 광학 디스크, CD-ROM, DVD 또는 블루레이 디스크와 같은 광학적으로 판독 가능한 매체를 포함하는 광학 저장 장치에 저장될 수 있다. 기계-실행 코드는 메모리 (예를 들어, 읽기 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크와 같은 전자 저장 장치에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리 또는 다양한 반도체 메모리 칩, 광학 드라이브, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등과 같은 관련 모듈의 유형 메모리 중 일부 또는 전부를 포함하며, 이는 본 명세서에 개시된 방법과 알고리즘을 인코딩하는 소프트웨어를 위한 임시 저장소를 제공할 수 있다.
소프트웨어 코드의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷이나 다양한 기타 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 예를 들어, 이러한 통신은 하나의 컴퓨터 또는 프로세서에서 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로, 소프트웨어의 로딩을 가능하게 한다. 이에 따라, 소프트웨어로 인코딩된 명령을 전달하는데 사용되는 다른 유형의 매체로는 로컬 장치 간의 물리적 인터페이스, 유선 및 광학 유선 네트워크, 다양한 대기 링크를 통해 사용되는 것과 같은 광학, 전기 및 전자기파를 포함한다. 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등과 같은 이러한 파동을 전달하는 물리적 요소는 또한 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위한 소프트웨어 인코딩된 명령어를 전달하는 매체로 간주된다. 본 명세서에 사용 시, 임시 유형의 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령어를 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 의미한다.
컴퓨터 시스템은 종종 예를 들어 머신 비전 시스템에 의해 캡처된 이미지를 제공하기 위한 전자 디스플레이를 포함하거나 전자 디스플레이와 통신할 수 있다. 디스플레이는 종종 사용자 인터페이스 (UI)를 제공할 수도 있다. UI의 예로는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI), 웹 기반 사용자 인터페이스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
시스템 제어 소프트웨어: 일부 경우에, 개시된 시스템은 사용자 인터페이스, 뿐만 아니라 모든 시스템 기능의 수동, 반자동, 또는 전자동 제어, 예를 들어, 유체 흐름 제어기 및/또는 유체 분배 시스템 (또는 하위-시스템), 온도 제어 시스템 (또는 하위-시스템), 영상화 시스템 (또는 하위-시스템), 등의 제어를 제공하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터 (또는 프로세서) 및 컴퓨터-판독 매체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스템 컴퓨터 또는 프로세서는 기기 시스템의 통합 구성요소 (예를 들어, 기기 내부에 내장된 마이크로프로세서 또는 마더 보드)일 수 있다. 일부 경우에, 시스템 컴퓨터 또는 프로세서는 독립형 모듈, 예를 들어, 개인용 컴퓨터 또는 랩탑 컴퓨터일 수 있다. 기기 제어 소프트웨어에 의해 제공될 수 있는 유체 흐름 제어 기능의 예로는 체적 유체 유속, 유체 흐름 속도, 샘플 및 시약 추가를 위한 타이밍 및 지속 시간, 세정 단계 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기기 제어 소프트웨어에 의해 제공될 수 있는 온도 제어 기능으로는 온도 설정점(들) 지정 및 온도 변화에 대한 타이밍, 지속 시간, 및 램프 속도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기기 제어 소프트웨어에 의해 제공될 수 있는 영상화 시스템 제어 기능의 예로는 자동 초점 기능, 조명 또는 여기광 노출 시간 및 강도 제어, 이미지 획득 속도 제어, 노출 시간, 데이터 저장 옵션, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
이미지 처리 소프트웨어: 개시된 시스템의 일부 경우에, 시스템은 이미지 처리 및 분석 능력을 제공하기 위한 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 매체를 추가로 포함할 수 있다. 소프트웨어에 의해 제공될 수 있는 이미지 처리 및 분석 능력으로는 수동, 반자동, 또는 전자동 이미지 노출 조정 (예를 들어, 화이트 밸런스, 대비 조정, 신호-평균화 및 다른 노이즈 감소 능력, 등), 수동, 반자동, 또는 전자동 에지 검출 및 물체 식별 (예를 들어, 기질 표면에서 증폭된 주형 핵산 분자의 클러스터 식별), 수동, 반자동, 또는 전자동 신호 강도 측정 및/또는 하나 이상의 검출 채널 (예를 들어, 하나 이상의 형광 방출 채널에서) 임계값 설정, 수동, 반자동, 또는 전자동 통계 분석 (예를 들어, 염기 확정 목적을 위한 참조값과 신호 강도를 비교)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에, 시스템 소프트웨어는 통합 실시간 이미지 분석 및 기구 제어를 제공하여, 샘플 로딩, 시약 첨가, 세정, 및/또는 영상화/염기 확정 단계가 예를 들어, 최적의 염기 확정 결과가 달성될 때까지 필요에 따라 연장, 변형 또는 반복될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다양한 이미지 처리 및 분석 알고리즘이 실시간 또는 후처리 이미지 분석 능력을 구현하도록 사용될 수 있다. 이러한 알고리즘의 예로는 캐니(Canny)에지 검출 방법, 캐니-데리히(Canny-Deriche) 에지 검출 방법, 1차 구배 에지 검출 방법 (예를 들어, 소벨 연산자(Sobel operator)), 2차 미분 에지검출 방법, 위상 일치 (위상 일관) 에지 검출 방법, 다른 이미지 분할 알고리즘 (예를 들어, 강도 임계값 설정, 강도 클러스터링 방법, 강도 히스토그램-기반 방법, 등), 특징 및 패턴 인식 알고리즘 (예를 들어, 임의의 모양을 감지하기 위한 일반화된 허프 변환(Hough transform), 원형 허프 변환, 등), 및 수학적 분석 알고리즘 (예를 들어, 푸리에 변환(Fourier transform), 고속 푸리에 변환, 웨이블릿 분석, 자동 상관, 등), 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에, 시스템 제어 및 이미지 처리/분석 소프트웨어는 별개의 소프트웨어 모듈로서 작성될 수 있다. 일부 경우에, 시스템 제어 및 이미지 처리/분석 소프트웨어는 통합 소프트웨어 패키지에 포함될 수 있다.
VIII. 실시예
1. 다가 결합 조성물의 제조
프로파길아민 dNTP(propargylamine dNTP)를 비오틴-PEG-NHS과 반응시켜 도 5A에 도시된 한 유형의 다중-아암 기질을 제조하였다. 이러한 수성 반응을 완료하고 정제하여; 순수한 비오틴-PEG-dNTP 종을 생성하였다. 별도의 반응에서, 평균 분자량이 1 K Da에서 20 K Da까지 다양한, 여러 상이한 PEG 길이를 사용하였다. 비오틴-PEG-dNTP 종을 새롭게 제조되었거나 또는 상업적으로-공급된 염료-표지된 스트렙타비딘 (SA)과 3-5:1의 Dye:SA 비율로 혼합하였다. 비오틴-PEG-dNTP과 염료-표지된 스트렙타비딘의 혼합은 각 스트렙타비딘 사량체의비오틴 결합 부위에 포화를 보장하기 위해 과량의 비오틴-PEG-dNTP의 존재하에 수행하였다. 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 비오틴-PEG-dNTP로부터 완전한 복합체를 정제하였다. 각 뉴클레오타이드 유형을 개별적으로 컨쥬게이션 및 정제한 다음, 함께 혼합하여 시퀀싱을 위한 4 염기 혼합물을 생성하였다.
도 5A에 도시된 또 다른 유형의 다중 아암 기질은 단일 포트에서 다중 아암 PEG NHS를 과량의 염료-NH2 및 프로파길아민 dNTP와 반응시켜 제조하였다. 다양한 다중 아암 PEG NHS 변이체는 4-16 아암 범위 및 5 K Da 내지 40 K Da의 분자량 범위에서 사용되었다. 반응 후, 과량의 소분자 염료 및 dNTP를 크기 배제 크로마토그래피로 제거하였다. 각 뉴클레오타이드 유형을 독립적으로 컨쥬게이션 및 정제한 다음, 함께 혼합하여 시퀀싱을 위한 4 염기 혼합물을 생성하였다.
도 5B에 도시된 클래스 II 기질을 염료 및 dNTP를 동시에 컨쥬게이션하기위해 원 포트 반응을 사용하여 제조하였다. 알킨-PEG-NHS를 과량의 프로파길아민 dNTP와 반응시켰다. 이러한 생성물 (알킨-PEG-dNTP)을 크로마토그래피로 균질하게 정제하였다. 다중 PEG 길이가 사용되었으며, 평균 분자량은 1 K Da 내지 20 K Da 사이에서 다양하였다. 가변적이고 불연속적인 수(12, 24, 48, 96)의 아자이드 컨쥬게이션 부위를 포함하는 덴드리머 코어를 사용하였다. 덴드리머형 코어에 대한 알킨-염료 및 알킨-PEG-dNTP의 컨쥬게이션은 구리 매개 클릭 화학을 통해 과량의 염료 및 dNTP 종을 포함하는 원 포트 반응에서 발생하였다. 반응 후, 과량의 소분자 염료 및 dNTP를 크기 배제 크로마토그래피로 제거하였다. 각 뉴클레오타이드 유형을 독립적으로 컨쥬게이션 및 정제한 다음, 함께 혼합하여 시퀀싱을 위한 4 염기 혼합물을 생성하였다. 이러한 계획으로 덱스트란, 다른 중합체, 단백질, 등과 같은 대안의 코어를 즉시 대체할 수 있다는 점에 주목한다.
도 5C에 도시된 클래스 III 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 4- 또는 8-아암 PEG NHS를 비오틴 및 프로파길아민 dNTP의 포화 혼합물과 반응시켜 구성하였다. 상기 반응을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 반응의 결과로 비오틴 및 뉴클레오타이드이 개별 분포를 포함하는 다중 아암 PEG을 생성하였다. 상기 이종의 집단을 염료-표지된 스트렙타비딘과 반응시키고 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 각 뉴클레오타이드 유형을 독립적으로 컨쥬게이션 및 정제한 다음, 함께 혼합하여 시퀀싱을 위한 4 염기 혼합물을 생성하였다. 비오틴 및 뉴클레오타이드의 분포가 비오틴-NH2 대 프로파길아민 dNTP의 입력 비율에 의해 조정 가능하다는 점을 주목한다.
2. 삼원 복합체의 검출
PEG 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 가지는 다가 결합 조성물을 사용하는 결합 반응을 분석하여 삼원 결합 복합체의 가능한 형성을 검출하였으며, 다양한 단계의 형광 이미지가 도 7A-7J에 예시된다. 도 7A에서, 적색 및 녹색 형광 이미지는 DNA 롤링 서클 적용 (RCA) 주형 (G 및 A 제1 염기)를 500 nM 염기 표지된 뉴클레오타이드 (A-Cy3 및 G-Cy5)에 대해 20 nM Klenow 폴리머라제 및 2.5 mM Sr+2를 포함하는 노출 완충액에서 노출한 후이다. 다가 PEG-기질 조성물을 다음의 다양한 4-아암 EG-아민 (4ArmPEG-NH), 비오틴-PEG-아민 (비오틴-PEG-NH), 및 클레오타이드 (Nuc)의 비율을 사용하여 제조하였다: 샘플 PB1 및 PB5, 4ArmPEG-NH: 비오틴-PEG-NH: Nuc = 0.25: 1: 0.5; 샘플 PB2, 4ArmPEG-NH: 비오틴-PEG-NH: Nuc =0.125: 0.5: 0.25; 샘플 PB3, 4ArmPEG-NH: 비오틴-PEG-NH: Nuc = 0.25: 1: 0.5. 노출 완충액과 동일한 조성이지만 뉴클레오타이드 또는 폴리머라제를 포함하지 않는 영상화 완충액으로 세척한 후 이미지를 수집하였다.
가장 희미한 신호의 시각화를 최대화하도록 대비를 조정했지만, 영상화 완충액으로 세척한 후 신호가 지속되지 않았다 (도 7A, 삽입 그림). 도 7B-7E에서, 형광 이미지는 노출 완충액에서 혼합 및 상기와 같은 영상화 완충액에서 영상화 후 500 nM에서 다가 PEG-뉴클레오타이드 (염기-표지) 리간드를 도시한다 (도 7B: PB1; 도 7C: PB2; 도 7D: PB3; 도 7E: PB5). 도 7F: 노출 완충액에서 혼합 및 상기와 같은 영상화 완충액에서 영상화 후 2.5uM에서 다가 PEG-뉴클레오타이드 (염기-표지) 리간드 PB5를 도시하는 형광 이미지. 도 7G-7I에서, 형광 이미지는 Klenow 폴리머라제의 불활성 돌연변이에 대한 다가 리간드 노출에 의한 추가적인 염기 구별을 도시한다 (도 7G: D882H; 도 7H: D882E; 도 7I: D882A, 및 야생형 Klenow (대조군) 효소는 도 7J에 도시된 바와 같음).
다가 리간드 제형을 사용하여, 결합력이 증가된 폴리머라제-리간드 상호작용을 제공함으로써 염기 식별을 가능하게 할 수 있다. 또한, 다가 리간드의 농도가 증가하면 더 높은 신호, 뿐만 아니라 결합력-기반 시퀀싱에 사용될 수 있는 촉매 효소 활성을 녹아웃시키는 다양한 Klenow 돌연변이를 제공할 수 있음을 보여준다.
3. 삼원 복합체를 사용한 표적 핵산 분자의 시퀀싱
다가 리간드 리포터 기반의 시퀀싱을 입증하기 위해, 4개의 공지된 주형을 낮은 결합 기질에서 RCA 방법을 사용하여 증폭하였다. 20 nM Klenow 폴리머라제 및 2.5 mM Sr+2를 포함하는 노출 완충액에 연속적인 사이클을 노출시키고 영상화 완충액으로 세척하고 영상화하였다. 영상화 후, 기질을 세척 완충액 (EDTA 및 고농도 염)으로 세척하고 차단된 뉴클레오타이드를 첨가하여 다음 염기로 진행하였다. 사이클은 5 사이클 동안 반복하였다. 표준 영상화 처리 및 스팟 검출을 사용하여 스팟을 검출하였으며, 사이클되는 주형을 식별하기 위해 2색의 녹색 및 적색 구성표 (G-Cy3 및 A-Cy5)을 사용하여 서열을 호출하였다. 도 8A 및 도 8B에 도시된 바와 같이, 다가 리간드가 모든 5 개의 시퀀싱 사이클을 통해 염기 구별을 제공할 수 있다.
4. 삼원 복합체로부터 뉴클레오타이드 해리 제어
실시예 2에서와 같이 삼원 복합체를 제조하고 영상화하였다. 삼원 복합체의 지속성을 입증하기 위해 다양한 시간 길이 (예를 들어, 60 초)에 걸쳐 복합체를 이미지화한다. 일정 시간 후, 복합체의 형성에 사용된 완충액과 동일하지만, 임의의 2가 양이온, 예를 들어, 10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 0.016% Triton X100 (SrOAc 미함유)를 포함하지 않는 완충액으로 복합체를 세척하거나, 또는, 대안적으로, 복합체 형성에 사용된 완충액과 동일하게, 킬레이트제를 포함하지만, 임의의 2가 양이온, 예를 들어, 10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 0.016% Triton X100 (SrOAc 미함유), 및 100nm-100mM EDTA를 포함하지 않는 완충액으로 복합체를 세척한다. 시간이 지남에 따라 복합체로부터의 형광이 관찰되어, 삼원 복합체의 해리를 관찰하고 정량화할 수 있다. 이러한 용해의 대표적인 시간 경과가 도 6에 도시된다.
5. 표적 핵산 상보적인 서열의 연장
실시예 4에서와 같이 삼원 복합체를 제조, 영상화, 및 해리한 후, 연장하는 DNA 가닥의 3' 말단으로부터 차단 모이어티, 예컨대 O-아지도메틸 기, O-알킬 하이드록실아미노 기, 또는 O-아미노 기를 제거하기에 충분한 차단 해제 용액을 결합된 DNA 분자를 포함하는 챔버에 유입시킨다. 이에 따라 또는 이와 동시에, 연장 용액이 결합된 DNA 분자를 포함하는 챔버로 유입된다. 연장 용액은 완충액, 지지체 폴리머라제 활성을 돕기에 충분한 2가 양이온, 활성 폴리머라제, 및 적절한 양의 모든 4 가지 뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 뉴클레오타이드는 연장하는 DNA 가닥에 단일 뉴클레오타이드의 첨가 이후, 예컨대 3'-O-아지도메틸 기, 3'-O-알킬 하이드록실아미노 기, 또는 3'-O-아미노 기이 혼입에 의해 추가적으로 연장할 수 없도록 차단된다. 연장 가닥은 따라서 단 하나의 염기에 의해 연장되고, 촉매적으로 불활성인 폴리머라제 및 다가 결합 기질의 결합은 사이클에서 다음 염기를 호출하도록 사용될 수 있다.
대안적으로, 다가 기질에 부착된 뉴클레오타이드는 불안정한 결합을 통해 부착되어, 폴리머라제가 촉매적으로 활성이 되도록 하기에 충분한 2가 양이온 또는 다른 보조인자를 함유하는 결합된 DNA 분자를 포함하는 챔버 내로 완충액이 유입될 수 있다. 그 이전, 이후 또는 이와 동시에, 연장 가닥 내로 혼입될 수 있도록 다가 기질로부터 염기를 절단하기에 충분한 조건이 제공될 수 있다. 이러한 절단 및 혼입으로 인해 연장하는 DNA 가닥을 정확히 하나의 염기만큼 연장하면서, 다가 기질의 표지 및 중합체 골격이 해리된다. 사용된 중합체 골격을 제거하기 위한 세척을 수행하고, 결합된 DNA 분자가 포함된 챔버에 새로운 다가 기질을 유입시켜, 실시예 1과 같이 새로운 염기를 호출하게 한다.
6. 다양한 길이의 PEG 분지를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용
실시예 3에 기재된 다양한 PEG 아암 길이를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 단일 시퀀싱 사이클에 적용하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 영상화하였다. 도 9A-9J에 도시된 바와 같이, PEG 분지의 길이가 증가하면 5 K Da의 평균 PEG MW에 상응하는 길이까지 신호가 증가하였다 (도 9A-9D). 이보다 더 긴 PEG 아암을 사용하면 Cy3-A 및 Cy5-G 둘 모두에 대한 형광 신호가 감소하였다 (도 9E-9G). 신호 강도의 정량적 측정치가 도 10에 그래프로 도시된다.
7. 세제 첨가에 의한 다가 기질 결합의 향상
다가 기질을 제조하고, 세제의 존재 및 부재하에서 결합 복합체로 조립하였다: 하나의 세트는 10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 5mM SroAc, 0% TritonX100를 사용 (조건 A), 및 하나의 세트는 10mM Tris pH 8.0, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 5mM SroAc, 0.016% Triton X100를 사용. 도 11은 DNA 클러스터에 결합된 다가 기질로부터 정규화된 형광을 도시하며, Triton-X100 (0.016%)의 존재하에 (조건 B) 형성된 기질 복합체가 분명하게 향상된 형광 강도를 나타낸다.
8. 다가 기질 결합 시간 경과의 평가
다가 기질을 제조하고 실시예 2와 같이 결합 복합체로 조립하였다. 표지된 유리 뉴클레오타이드를 사용하여 동일한 완충 조건하에서 복합체를 또한 형성하였다. 복합체를 60 분 경과에 걸쳐 영상화하여 복합체의 지속 시간을 특성화하였다. 도12A-12B는 대표적인 결과를 도시한다. 다가 결합 복합체 >60 분 이상의 시간 척도에 걸쳐 안정한 반면 (도 12B) 표지된 유리 뉴클레오타이드는 1 분 미만에서 해리된다 (도 12A).
VIII. 결론
본 발명은 DNA 시퀀싱 및 바이오 센서 적용을 위해 매우 개선된 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 설명은 예시를 위한 것이며 제한적인 것이 아님을 이해해야 한다. 많은 실시양태가 상기 설명을 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다. 예시로서, 본 발명의 개념이 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용과 관련하여 기재되었지만, 다른 유형의 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트도 또한 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 쉽게 인식될 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 퀀텀 닷; 리포솜; 또는 에멀전 입자를 포함하는 입자-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 컨쥬게이션은 수소 결합 또는 다른 상호작용과 같은 비공유 결합에 의해 달성될 수 있다. 그러므로, 개시된 발명 개념의 범위는 상기 설명을 참조하지 않고 결정되어야 하며, 대신에 첨부된 청구범위와 이러한 청구범위가 부여된 균등물의 전체 범위를 참조하여 결정되어야 한다.

Claims (73)

  1. 표적 핵산 서열에서 뉴클레오타이드의 실체(identity)를 결정하는 방법으로서,
    a. i. 상기 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피(copy);
    ii. 상기 표적 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 상보적인 2개 이상의 프라이머 핵산 분자; 및
    iii. 2개 이상의 폴리머라제(polymerase) 분자
    를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    b. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트(polymer-nucleotide conjugate)와 상기 (a)의 조성물의 상기 표적 핵산 서열의 상기 2개 이상의 카피 사이에 다가 결합 복합체(multivalent binding complex)가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서, 상기 조성물을 상기 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 뉴클레오타이드 모이어티의 2개 이상의 카피 및 선택적으로 하나 이상의 검출가능한 표지(detectable label)를 포함하는 단계; 및
    c. 상기 다가 결합 복합체를 검출하여, 표적 핵산 서열에서 상기 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계
    를 포함하는 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열은 DNA인 것인 결정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다가 결합 복합체의 검출 단계는 결합되지 않은(unbound) 또는 용액형(solution-borne) 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 부재하에 수행되는 것인 결정 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 서열은 복제 또는 증폭되었거나, 또는 복제 또는 증폭에 의해 생성된 것인 결정 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 형광 표지(fluorescent label)인 것인 결정 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 복합체의 검출 단계는 형광 측정을 포함하는 것인 결정 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 1가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하는 것인 결정 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하는 것인 결정 방법.
  9. 제8항에 있어서, 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 결정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 접촉 단계는 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하며, 여기서 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 결정 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 결정 방법.
  12. 제11항에 있어서, 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸 뉴클레오타이드, 3'-O-메틸 뉴클레오타이드, 또는 3'-O-알킬 하이드록실아민 뉴클레오타이드인 것인 결정 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 다가 결합 복합체를 안정화하는 이온의 존재하에 발생하는 것인 결정 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 스트론튬 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 또는 이의 임의의 조합의 존재하에 이루어지는 것인 결정 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 불활성인 것인 결정 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 돌연변이 또는 화학적 변형에 의해 촉매적으로 불활성이 된 것인 결정 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 필요한 이온 또는 보조인자의 부재에 의해 촉매적으로 불활성이 된 것인 결정 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 활성인 것인 결정 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하지 않는 것인 결정 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 결합 복합체는 2초 초과의 지속 시간을 가지는 것인 결정 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃ 내지 62℃ 범위 내의 온도에서 수행될 수 있는 것인 결정 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 형광 표지를 추가로 포함하고, 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피는 표면에 침착, 부착 또는 혼성화되며, 여기서 표면 상의 다가 결합 복합체의 형광 이미지는 검출 단계에서 20 초과의 대조도 대 잡음비(contrast to noise ratio)를 가지는 것인 결정 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 조성물은 극성 비양성자성 용매를 혼입하는 완충액을 사용하여 표면 상에 침착되는 것인 결정 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는, 상기 뉴클레오타이드 모이어티가 상기 표적 핵산 서열의 다음 염기에 상보적인 경우 상기 다가 결합 복합체를 안정화하고, 상기 뉴클레오타이드 모이어티가 상기 표적 핵산 서열의 상기 다음 염기에 상보적이지 않을 경우 상기 다가 결합 복합체를 불안정화하는 조건하에서 수행되는 것인 결정 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 복수의 분지(branch)를 가지는 중합체를 포함하며, 상기 2개 이상의 뉴클레오타이드 모이어티가 상기 분지에 부착되는 것인 결정 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 중합체는 별형(star), 빗형(comb), 가교형(cross-linked), 병솔형(bottle brush), 또는 덴드리머형(dendrimer) 형태를 가지는 것인 결정 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 아비딘, 비오틴, 친화성 태그, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 결합 기를 포함하는 것인 결정 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 조성물과 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트 사이에 형성된 상기 다가 결합 복합체를 불안정화하는 해리 단계를 추가로 포함하며, 상기 해리 단계는 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제거를 가능하게 하는 것인 결정 방법.
  29. 제28항에 있어서, 표적 핵산 서열의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를, 상기 2개 이상의 프라이머 핵산 분자에 혼입하는 연장 단계를 추가로 포함하는 것인 결정 방법.
  30. 제29항에 있어서, 연장 단계는 상기 해리 단계와 동시에 또는 그 이후에 발생하는 것인 결정 방법.
  31. 표적 핵산 서열에서 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 방법으로서,
    a. i. 상기 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피;
    ii. 상기 표적 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 상보적인 2개 이상의 프라이머 핵산 분자; 및
    iii. 2개 이상의 폴리머라제 분자
    를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    b. 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 상기 (a)의 조성물의 상기 표적 핵산 서열의 상기 2개 이상의 카피 사이에 다가 결합 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서, 상기 조성물을 상기 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드 모이어티의 2개 이상의 카피 및 선택적으로 하나 이상의 절단가능하며 검출가능한 표지를 포함하는 단계; 및
    c. 상기 다가 복합체를 검출하여, 표적 핵산 서열에서 상기 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계
    를 포함하는 결정 방법.
  32. 제31항에 있어서, 표적 핵산 서열은 DNA인 것인 결정 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 다가 결합 복합체의 검출 이후, (a)의 조성물을, 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드 또는 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드의 2개 이상의 카피를 포함하는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 결정 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 서열은 복제 또는 증폭되었거나, 또는 복제 또는 증폭에 의해 생성된 것인 결정 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 형광 표지인 것인 결정 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 복합체의 검출 단계는 형광 측정을 포함하는 것인 결정 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 1가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하는 것인 결정 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하는 것인 결정 방법.
  39. 제38항에 있어서, 2가지 이상의 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 결정 방법.
  40. 제39항에 있어서, 접촉 단계는 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 사용을 포함하며, 여기서 3가지 유형의 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 각각의 유형은 상이한 유형의 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 결정 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 결정 방법.
  42. 제41항에 있어서, 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸, 3'-O-메틸, 또는 3'-O-알킬 하이드록실아민인 것인 결정 방법.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 다가 결합 복합체를 안정화하는 이온의 존재하에 발생하는 것인 결정 방법.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 불활성인 것인 결정 방법.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 돌연변이 또는 화학적 변형에 의해 촉매적으로 불활성이 된 것인 결정 방법.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제 분자는 촉매적으로 활성인 것인 결정 방법.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하지 않는 것인 결정 방법.
  48. 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃ 내지 80℃ 범위 내의 온도에서 수행될 수 있는 것인 결정 방법.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 형광 표지를 추가로 포함하고, 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피는 표면에 침착, 부착 또는 혼성화되며, 여기서 표면 상의 다가 결합 복합체의 형광 이미지는 검출 단계에서 20 초과의 대조도 대 잡음비를 가지는 것인 결정 방법.
  50. a) i) 기질의 표면에 테더링된(tethered) 표적 핵산 서열의 다중 카피를 포함하는 기질을, 폴리머라제 및 상기 표적 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 상보적인 하나 이상의 프라이머 핵산 서열을 포함하는 시약과 접촉시켜, 프라이밍된 표적 핵산 서열을 형성하는 단계;
    ii) 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트와 상기 프라이밍된 표적 핵산 서열의 2개 이상의 카피 사이에 다가 결합 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건하에서, 기질 표면을 상기 중합체 뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 시약과 접촉시키는 단계로서, 여기서 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 공지된 뉴클레오타이드 모이어티의 2개 이상의 카피 및 검출가능한 표지를 포함하는 단계;
    iii) 상기 다가 결합 복합체를 검출하기 위해 기질 표면의 이미지를 획득 및 처리하여, 표적 핵산 서열에서 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 단계
    를 포함하는 방법을 수행하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서
    를 포함하는 시스템.
  51. 제50항에 있어서, 일련의 시약을 기질 표면에 지정된 순서로 그리고 지정된 시간 간격 동안 전달하도록 구성된 유체 모듈을 추가로 포함하는 것인 시스템.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 기질 표면의 이미지를 획득하도록 구성된 영상화 모듈을 추가로 포함하는 것인 시스템.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 및 (iii)는 2회 이상 반복되어, 표적 핵산 서열에서 일련의 2개 이상의 뉴클레오타이드의 실체를 결정하는 것인 시스템.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 단계는 상기 다가 결합 복합체를 불안정화하는 해리 단계를 추가로 포함하고, 상기 해리 단계는 상기 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 제거를 가능하게 하는 것인 시스템.
  55. 제54항에 있어서, 일련의 단계는 표적 핵산 서열의 다음 염기에 상보적인 뉴클레오타이드를, 상기 2개 이상의 프라이머 핵산 분자에 혼입하는 연장 단계를 추가로 포함하는 것인 시스템.
  56. 제55항에 있어서, 연장 단계는 상기 해리 단계와 동시에 또는 그 이후에 발생하는 것인 시스템.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지는 형광단을 포함하며, 이미지는 형광 이미지를 포함하는 것인 시스템.
  58. 제57항에 있어서, 기질 표면 상의 다가 결합체 복합체의 형광 이미지는, 형광단이 사이아닌 염료 3 (Cy3)이고, 20X 대물렌즈, NA = 0.75, 532 nm 광에 최적화된 이색성 미러(dichroic mirror), 사이아닌 염료-3 방출에 최적화된 대역통과 필터, 및 카메라가 장착된 도립 형광 현미경(inverted fluorescence microscope)을 사용하여, 표면이 25 mM ACES, pH 7.4 완충액에 침지되면서 비신호 포화 조건하에서 이미지가 획득된 경우, 20 초과의 대조도 대 잡음비를 가지는 것인 시스템.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 단계는 60 분 미만 내에 완료되는 것인 시스템.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 단계는 30 분 미만 내에 완료되는 것인 시스템.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 단계는 10 분 미만 내에 완료되는 것인 시스템.
  62. 제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 확정(base-calling)의 정확도는 결정된 뉴클레오타이드 실체의 적어도 80%에 대해 Q-점수가 25를 초과하는 것을 특징으로 하는 것인 시스템.
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 확정의 정확도는 결정된 뉴클레오타이드 실체의 적어도 80%에 대해 Q-점수가 30을 초과하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  64. 제50항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 확정의 정확도는 결정된 뉴클레오타이드 실체의 적어도 80%에 대해 Q-점수가 40을 초과하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  65. a) 중합체 코어; 및
    b) 중합체 코어에 부착된 2개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티
    를 포함하는 조성물로서,
    링커의 길이가 중합체 코어에 부착된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티에 의존하는 것인 조성물.
  66. a) 각 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트가
    i) 중합체 코어; 및
    ii) 중합체 코어에 부착된 2개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티
    를 포함하는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트의 혼합물
    을 포함하는 조성물로서,
    링커의 길이가 중합체 코어에 부착된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티에 의존하고,
    혼합물은 적어도 2가지의 상이한 유형의 부착된 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티를 가지는 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 포함하는 것인 조성물.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 중합체 코어는 복수의 분지를 가지는 중합체를 포함하며, 2개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오사이드, 또는 뉴클레오사이드 유사체 모이어티는 상기 분지에 부착되는 것인 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 중합체는 별형, 빗형, 가교형, 병솔형, 또는 덴드리머형 형태를 가지는 것인 조성물.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 아비딘, 비오틴, 친화성 태그, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 결합 기를 포함하는 것인 조성물.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 코어는 분지형 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자를 포함하는 것인 조성물.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 차단된 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 차단된 뉴클레오타이드는 3'-O-아지도메틸 뉴클레오타이드, 3'-O-메틸 뉴클레오타이드, 또는 3'-O-알킬 하이드록실아민 뉴클레오타이드인 것인 조성물.
  73. 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체-뉴클레오타이드 컨쥬게이트는 하나 이상의 형광 표지를 추가로 포함하는 것인 조성물.
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