KR20230153706A - 핵산의 검출 또는 분리용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 검출 또는 분리 방법 - Google Patents
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Abstract
일 양상은 핵산의 검출 또는 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 핵산의 검출 또는 분리 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 핵산의 검출 또는 분리용 조성물, 키트 및 방법을 이용하면, 종래의 칼럼 및 비드에 기초한 방법에서 사용되는 전기 및 특별한 장비, 예를 들어, 원심분리, 진공 펌프 및 열-조절제 없이, 저비용으로 고농도 및 고순도 핵산을 신속하고 간단하며, 정확하게 검출 또는 분리할 수 있다. 나아가, 일 양상에 따른 조성물을 이용하여 핵산 중 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산을 검출 또는 분리함으로써, 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa)을 신속, 정밀 및 조기 진단할 수 있으며, 감염성 질환을 유발하는 미생물 유래 핵산을 검출 또는 분리함으로써 감염성 질환을 신속, 정밀 및 조기 진단할 수 있다.
Description
핵산의 검출 또는 분리용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 검출 또는 분리 방법에 관한 것이다.
1948년에 처음 기술된 순환 핵산(Circulating NAs)은 혈장, 소변 및 타액과 같은 체액에서 안정적인 순환 DNA 및 RNA 분자이며 유망한 진단, 예후 및 예측 비침습적 바이오마커로 간주되었다. 이 분자는 괴사 및 세포 사멸 세포에서 유래하며 암의 초기 단계에서도 다른 세포와 통신하기 위해 다양한 세포에서 분비된다. 이러한 순환 핵산의 발현 변화는 암 발달 및 진행과 같은 생리학 및 병리학에 직접적인 영향을 미친다. 순환 핵산은 액체 생검에서 암 바이오마커로 사용되며 침습성, 고위험, 고비용, 종양 위치 및 크기의 제한과 같은 기존 생검의 단점이 없다. 또한, 순환하는 핵산은 암의 종류와 병기에 따라 이질적으로 변화하기 때문에 분자적 특성화를 통해 암 전이 및 치료 예후를 모니터링할 수 있다. 이러한 장점 때문에 순환형 핵산은 암의 조기 또는 정밀 진단을 위한 진단 도구로 활용되고 있으며 종점(end-point), 실시간(real-time), droplet-digital PCR 등 고감도 검출 방법을 활용하여 새로운 진단 플랫폼으로 제안되고 있다. 그러나 순환 핵산을 이용한 진단 플랫폼의 개발은 액체 표본에서 소량의 순환 핵산으로 인해 감도가 저하되는 것으로 간주되지 않았다. 다량의 시료를 이용하여 고농도의 순환 핵산을 추출하기 위한 논의가 부족하다.
전립선암(PCa: prostate cancer)은 전 세계적으로 남성에서 가장 흔한 악성 종양 중 하나이며, 모든 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. 전립선특이항원(PSA) 검사는 전립선암의 조기진단에 널리 활용되고 있으며, 치료 가능한 전립선암 환자가 증가하여 전립선암 사망률이 현저히 감소하고 있습니다. 그러나 PSA 검사의 낮은 민감도와 특이도로 인해 불필요한 진단과 치료가 필요했고, PSA 수치가 4 ngmL-1 내지 10 ngmL-1인 PSA gray zone에서는 양성 전립선 비대증(BPH: benign prostatic hyperplasia) 및 전립선염과 같은 일부 비악성 질환과 밀접한 관련이 있다는 한계가 있다. 따라서, PCa 진단에 사용할 수 있는 더 나은 바이오마커를 발견하기 위한 요구가 있다. 최근에는 순환하는 핵산의 다양한 장점으로 인해 순환 miRNA와 순환 mRNA를 포함하는 PCa 진단 플랫폼이 집중적으로 개발되고 있다. miRNA는 mRNA의 3'UTR에 우선적으로 결합하고 세포 주기, 증식 및 세포 사멸과 같은 중요한 세포 과정에 영향을 미치는 전사 후 조절자 역할을 하는 약 22개의 뉴클레오티드(17-27 nts)의 비암호화 RNA 분자이다. 전립선암에서 순환하는 miRNA-141-3p 및 miRNA-375-3p는 건강한 대조군에 비해 증가되어 바이오마커로서 유망한 miRNA로 알려져 있다. 그러나 이러한 miRNA의 역할은 아직 불분명하고 수많은 miRNA 중에서 전립선암 특이적 miRNA 바이오마커를 발굴하는데 한계가 있다. 또한, 지금까지의 연구는 순환 miRNA에 초점을 맞추었고 순환 mRNA에 대한 연구는 제대로 탐구되지 않았다.
순환 RNA 분석의 중요한 고려 사항 중 하나는 고농도 순환 RNA 추출을 위한 시료 처리 방법이다. 희귀 순환 RNA를 포착하기 위해 페놀-클로로포름 기반, 스핀 컬럼 기반 또는 비드 기반 방법을 사용하는 기존의 분리 및 정제 기술이 제안되었다. 그러나 이들 대부분은 비싸고 시간이 많이 걸리고(> 30분) 노동 집약적이며 페놀과 같은 위험한 화학 물질에 의존하며 원심분리 및 온도 제어를 위한 대형 또는 특수 장비가 필요하다. 또한, 이러한 방법은 비암성 세포에서 유래한 유전적 배경을 증가시키는 구아니딘 티오시아네이트(GITC)와 같은 카오트로픽 시약을 포함하는 용해 완충액을 사용하며, 대량의 임상 검체를 처리하는 것이 불가능하고, 낮은 농도의 순환 RNA를 사용하기 때문에 재현성이 좋지 않다. 따라서 높은 재현성을 얻기 위해 순환 RNA의 농축 및 분리 기술을 개발하고 전 세계적으로 공통 순환 RNA 추출 방법을 확립하는 것은 여전히 과제로 남아 있다.
이에, 본 발명자는 PCa 환자의 소변에서 순환 RNA를 간단하고 신속하게 농축 및 분리하기 위한 새로운 플랫폼인 HAZIS-CirR을 개발하였다. 이 플랫폼은 반응성 그룹으로 히드라지드(hydrazides)를 포함하는 동종이기능성 가교제인 아디프산 디히드라지드(ADH: adipic acid dihydrazide)를 사용하며, ADH와 제올라이트 및 순환 RNA의 공유 및 정전기 상호작용을 기반으로 한다. 기존의 순환 RNA 추출 방법의 제한된 샘플 사용에 비해 대용량 샘플을 사용하여 희귀한 순환 RNA를 농축할 수 있어 20분 이내에 고농도의 순환 RNA 추출이 가능하다. HAZIS-CirR은 세포 용해 과정이 없기 때문에 chaotropic 및 유해 시약을 사용하지 않으며, 전기를 사용하는 대형 원심분리기 및 온도 조절기가 필요하지 않다. 본 발명자는 HAZIS-CirR에서 총 89개의 소변 샘플을 사용하여 여러 순환 mRNA와 순환 miRNA를 분석하였다. 순환 RNA는 PCa(55개 검체), BPH(24개 검체), 건강한 대조군(10개 검체)의 소변을 이용해 빠르고 저렴하며 효과적으로 농축·추출이 가능하다는 것을 입증하고, BPH 환자의 PCa 바이오마커로 사용할 수 있는 mRNA와 순환 miRNA를 제시하였다. 본 발명자가 개발한 HAZIS-CirR은 종양 부위로 분비되고, 다양한 체액에서 발견되는 순환 RNA의 농축 및 분리, 암 초기 단계를 포함한 PCa의 고농도 바이오마커 분석을 위한 기술을 제공한다.
일 양상은 하기 화학식 1의 화합물 또는 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
.
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
다른 양상은 상기 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 핵산의 검출 또는 분리 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
또 다른 양상은 청구항 1의 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 양성 전립선비대증(BPH: benign prostatic hyperplasia) 환자의 전립선암(PCa: prostate cancer) 진단용 조성물로서,
상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
또 다른 양상은 상기 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 감염성 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 감염성 질환의 진단용 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 감염성 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 감염성 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
일 양상은 하기 화학식 1의 화합물 또는 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
일 양상에 있어서, 상기 n은 0 내지 10, 0 내지 9, 0 내지 8, 0 내지 7, 0 내지 6, 0 내지 5 또는 0 내지 4 중 선택되는 하나의 정수일 수 있다.
상기 n이 0인 경우, 상기 화학식 1의 화합물은 옥살릴 디히드라지드(ODH: oxalyl dihydrazide)이고, 상기 n이 1인 경우, 상기 화학식 1의 화합물은 말론산 디히드라지드(MDH: malonic dihydrazide)이고, 상기 n이 2인 경우, 상기 화학식 1의 화합물은 숙신산 디히드라지드(SDH: succinic dihydrazide)이고, 상기 n이 3인 경우, 상기 화학식 1의 화합물은 글루타릭 디히드라지드(GDH: glutaric dihydrazide)이고, 상기 n이 4인 경우, 상기 화학식 1의 화합물은 아디프산 디히드라지드(ADH: adipic acid dihydrazide)이다. 상기 화학식 1의 화합물은 천연으로부터 유래되는 것일 수 있고, 공지의 유기 합성 방법을 이용하여 합성되는 것일 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물은 탄소 디히드라지드(CDH: carbonic dihydrazide)이며, 90.08의 분자량(MW: molecular weight)으로 존재하며, 천연으로부터 유래되는 것일 수 있고, 공지의 유기 합성 방법을 이용하여 합성되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 n이 4인 경우, 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 조성물은 상기 n이 0 내지 3 및 5 내지 10인 경우의 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 조성물 보다 간단하고 신속하게 핵산을 분리할 수 있다.
상기 용어 "핵산(nucleic acid)"은 선형 또는 환상 입체형태 및 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA 및 shRNA으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있고, 구체적으로, RNA, miRNA, tRNA 및 mRNA으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로, RNA 또는 miRNA일 수 있다.
상기 용어 "검출"은 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
상기 용어 "분리"는 임상 샘플(예를 들어, 핵산)을 적어도 2개의 개별 분획으로 물리적으로 분할하는 것을 지칭한다.
다른 양상은 상기 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 키트를 제공한다.
상기 "핵산", "검출", "분리" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 제올라이트(zeolite), 크로모솔브(Chromosorb) 및 규조토 (Diatomaceous earth)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 제올라이트 또는 규조토일 수 있고, 보다 구체적으로는 제올라이트일 수 있다.
상기 고체 지지체는 표면이 아민기를 가지거나, 아민기로 개질될 수 있으면 족하며, 상기 고체 지지체의 표면이 수산기를 가지는 경우, 실란화를 통해 아민기로 개질되는 것일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 고체 지지체의 표면은 아민(amine)기로 개질된 것일 수 있으며, 상기 고체 지지체의 형태는 미세유체 플랫폼 형태일 수 있다.
상기 용어 "표면"은 고체 지지체의 내부 부분 또는 외부층을 의미하는 것으로 의도된다. 표면은 또 다른 물질, 예를 들어, 기체, 액체, 겔, 중합체, 유기 중합체, 유사하거나 상이한 물질의 두번째 표면, 금속, 또는 코트와 접촉될 수 있다. 표면 또는 이의 영역은 실질적으로 편평할 수 있다. 표면은 표면 특징부, 예를 들어, 웰, 피트, 채널, 릿지(ridge), 상승된 영역, 페그(peg), 기둥 등을 가질 수 있다.
상기 용어 "아민(amine)"은 염기로 질소 원자에 비공유전자쌍을 가진 유기 화합물과 작용기를 의미하며, 암모니아의 유도체로서, 수소 원자가 들어갈 자리가 알킬기나 아릴기 같은 치환기로 대체된 형태이다.
상기 용어 "개질"은 형태를 재구성한다는 의미로 재료의 성분에서 화학 구조의 형태를 전환하고, 그 과정에서 원하는 재료를 합성하고 추출하는 방법을 통칭한다.
상기 용어 "실란화(silanization)"는 디메틸클로로실란(Dimethyl chlorosilane)을 사용하여 가스크로마토그래피(gas chromatography) 담체내의 시라놀기(Silanol radical)≡SiOH를, 불황성인 알킬실리기≡Sio-R에 치환하는 처리법으로, 일 양상에 있어서, 실란화는 수산기를 아민기로 개질한 것일 수 있다.
상기 용어 "고체 지지체"는 임의로 핵산을 부착시키기 위해 이용되는 화학 물질에 대해 비활성일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 핵산을 부착시키기 위해 이용되는 화학 물질에 대해 비활성일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 제올라이트, 상기 크로모솔브 및 상기 규조토의 직경은 0.1 내지 100 μm, 0.1 내지 60 μm, 0.1 내지 20 μm, 0.5 내지 100 μm, 0.5 내지 60 μm, 0.2 내지 20 μm, 1 내지 100 μm, 1 내지 60 μm 및 1 내지 20 μm일 수 있다.
상기 제올라이트, 상기 크로모솔브 및 상기 규조토의 직경이 0.1 내지 100 μm인 경우, 고체 지지체가 핵산의 검출 또는 분리용 조성물 및 핵산과의 상호작용 후에도 안정한 구조를 유지할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 아민기 및 상기 핵산은 이민 결합(Immine bond), 히드라존 결합(Hydrazone bond) 및 정전기적 인력(Electrostatic attraction)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 인력으로 상호 작용하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물의 알데히드기와 고체 지지체의 아민기 또는 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물의 알데히드기와 핵산의 질소 염기가 반응성 이민 결합으로 상호 작용하는 것일 수 있고, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물과 핵산의 질소 염기의 알데히드 또는 케톤기가 반응성 히드라존 결합으로 상호 작용하는 것일 수 있고, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 고체 지지체의 양전하와 핵산의 포스페이트기의 음전하가 반응성 정전기적 인력으로 상호 작용하는 것일 수 있다.
상기 용어 "반응성 결합"은 결합을 새로 형성할 수 있는 예비 기질 또는 결합을 파괴할 수 있는 물질이 존재하는 경우, 기존의 결합이 파괴되고 예비 기질과 동일한 결합을 형성하거나, 기존의 결합이 쉽게 파괴될 수 있는 결합을 의미한다.
상기 용어 "이민 결합(Immine bond)"은 탄소와 질소 사이에 이중 결합하는 것을 의미하며, 이민 결합을 갖는 화합물을 imine 또는 Schiff 염기라고 통칭한다.
상기 용어 "히드라존 결합(Hydrazone bond)"은 히드라지드와 알데히드의 반응에 의해 형성되는 결합으로, 상기 "히드라존"은 알데히드, 케톤과 히드라진의 반응으로 카르보닐기 >C＝O가 >C＝N－NH2로 변해 얻어지는 화합물을 의미한다.
상기 용어 "정전기적 인력(Electrostatic attraction)"은 반대된 양(+)과 음(-)의 하전이 만나 인력이 작용하는 것을 의미한다.
상기 용어 "상호 작용"은 둘 이상의 물체나 대상이 서로 영향을 주고받는 일종의 행동을 의미하고, 양쪽 방향으로 영향이 나타나야 한다.
일 양상에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체는 상기 키트 내에서 30:1 내지 1:10, 30:1 내지 1:1, 30:1 내지 5:1, 20:1 내지 1:10, 20:1 내지 1:1, 20:1 내지 5:1, 15:1 내지 1:10, 15:1 내지 1:1 또는 15:1 내지 5:1 중량비로 존재하는 것일 수 있다.
상기 키트 내 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체의 중량비가 30:1 내지 1:10 인 경우, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체의 핵산(예를 들어, RNA) 포획 효율이 보다 우수할 수 있다.
상기 키트는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real time RT-PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR), 역 중합효소 연쇄반응(Inverse PCR), 길고 정확한 중합효소 연쇄반응(Long and Accurate PCR), RNase 보호 분석법(RNaseprotection assay; RPA), 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real time RT-PCR) 및 실시간 정량중합효소 연쇄반응(RT-qPCR: real-time quantitative polymerase chain reaction)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기법에 의해 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 RT-qPCR 또는 역전사 중합효소반응(RT-PCR)에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 핵산의 검출 또는 분리용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 종류의 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있고, 상기 키트는 핵산의 검출 또는 분리를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고핵산(oligonucleotide)이 부착되어 있는 기판 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고핵산을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 핵산 검출 또는 분리용 조성물 및 키트는 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체가 시료 내 핵산과 상호 작용을 이루는 것을 이용하여 시료 내 표적하는 핵산을 저비용으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있고, 나아가, 고농도로 분리할 수 있다.
구체적으로, 일 실시예에서는 핵산(순환 RNA) 검출(농축) 및 분리를 위한 HAZIS-CirR(일 양상에 따른 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물(아디프산 디히드라지드 (ADH: adipic acid dihydrazide), 탄소 디히드라지드(CDH: carbonic dihydrazide), 옥살릴 디히드라지드 (ODH: oxalyl dihydrazide), 말론산 디히드라지드(MDH: malonic dihydrazide), 숙신산 디히드라지드 (SDH: succinic dihydrazide))로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 고체 지지체(제올라이트))을 제조하였다. 상기 HAZIS-CirR을 이용하여 하기 단계들을 수행함으로써, 단시간 내로 핵산의 검출 및 분리하였다: (1) 샘플(일 양상에 따른 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물, 고체 지지체(제올라이트) 및 소변(핵산을 포함하는 시료))을 혼합하고, 상기 혼합물을 배양(인큐베이션)하는 단계; (2) 상기 혼합물을 필터에 여과하여, 포획되지 않은 물질을 제거하고, 고농도로 핵산을 농축하는 단계; (3) 상기 고체 지지체의 표면을 세척함으로써, 고체 지지체에 남아있는 오염물을 제거하는 단계; (4) 완충제를 사용하여 상기 화합물, 상기 고체 지지체 및 상기 핵산 사이의 상호 작용을 파괴함으로써, 핵산을 분리하는 단계(실시예 1-1(1) 참조).
또한, 일 실시예에서는 상기 (1) 단계에서 일 양상에 따른 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체(제올라이트) 및 핵산 간의 이민 결합, 히드라존 결합 및 정전기적 인력으로 상호 작용이 이루어짐을 확인하였다(실시예 1-1(1) 참조).
다른 실시예에서는 상기 HAZIS-CirR에서 특성화를 수행하여 아디프산 디히드라지드(ADH), 제올라이트 및 핵산 사이의 분자 특성 및 결합 메커니즘을 확인하였다. 그 결과, 아민기가 제올라이트 표면 상에 형성됨을 확인하였고, 이민 결합에 의해 제올라이트와 아디프산 디히드라지드(ADH)가 결합하고, 제올라이트의 표면에 하이드라지드가 발생하여 관능기로서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 제올라이트의 제타 전위를 분석하였으며, 그 결과, 제올라이트 및 HAZ는 높은 제타 전위를 갖고, HAZ가 순환 RNA의 음전하와 전기적으로 결합하는 것을 확인하였다(실시예 1-2(2) 참조).
또 다른 실시예에서는 HAZIS-CirR에서 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드(ADH)의 최적화된 농도를 측정하였으며, 그 결과, 샘플 1 mL 당 5 mg의 제올라이트와 50 mg의 아디프산 디히드라지드(AHD)가 사용될 때 RNA 포획 효율이 높은 것을 확인하였다(실시예 1-2(3) 참조).
또 다른 양상은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 핵산의 검출 또는 분리 방법을 제공한다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
.
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
상기 "화학식 1의 화합물", "화학식 2의 화합물", "핵산", "고체 지지체", "분리", "검출" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 고체 지지체의 표면은 아민(amine)기로 개질된 것일 수 있다.
상기 용어 "표면"은 고체 지지체의 내부 부분 또는 외부층을 의미하는 것으로 의도된다. 표면은 또 다른 물질, 예를 들어, 기체, 액체, 겔, 중합체, 유기 중합체, 유사하거나 상이한 물질의 두번째 표면, 금속, 또는 코트와 접촉될 수 있다. 표면 또는 이의 영역은 실질적으로 편평할 수 있다. 표면은 표면 특징부, 예를 들어, 웰, 피트, 채널, 릿지(ridge), 상승된 영역, 페그(peg), 기둥 등을 가질 수 있다.
상기 용어 "아민(amine)"은 염기로 질소 원자에 비공유전자쌍을 가진 유기 화합물과 작용기를 의미하며, 암모니아의 유도체로서, 수소 원자가 들어갈 자리가 알킬기나 아릴기 같은 치환기로 대체된 형태이다.
상기 용어 "개질"은 형태를 재구성한다는 의미로 재료의 성분에서 화학 구조의 형태를 전환하고, 그 과정에서 원하는 재료를 합성하고 추출하는 방법을 통칭한다.
일 양상에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 아민기 및 상기 핵산은 이민 결합(Immine bond), 히드라존 결합(Hydrazone bond) 및 정전기적 인력(Electrostatic attraction)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 인력으로 상호 작용하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물의 알데히드기와 고체 지지체의 아민기 또는 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물의 알데히드기와 핵산의 질소 염기가 반응성 이민 결합으로 상호 작용하는 것일 수 있고, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물과 핵산의 질소 염기의 알데히드 또는 케톤기가 반응성 히드라존 결합으로 상호 작용하는 것일 수 있고, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 고체 지지체의 양전하와 핵산의 포스페이트기의 음전하가 반응성 정전기적 인력으로 상호 작용하는 것일 수 있다.
상기 용어 "반응성 결합"은 결합을 새로 형성할 수 있는 예비 기질 또는 결합을 파괴할 수 있는 물질이 존재하는 경우, 기존의 결합이 파괴되고 예비 기질과 동일한 결합을 형성하거나, 기존의 결합이 쉽게 파괴될 수 있는 결합을 의미한다.
상기 용어 "이민 결합(Immine bond)"은 탄소와 질소 사이에 이중 결합하는 것을 의미하며, 이민 결합을 갖는 화합물을 imine 또는 Schiff 염기라고 통칭한다.
상기 용어 "히드라존 결합(Hydrazone bond)"은 히드라지드와 알데히드의 반응에 의해 형성되는 결합으로, 상기 "히드라존"은 알데히드, 케톤과 히드라진의 반응으로 카르보닐기 >C＝O가 >C＝N－NH2로 변해 얻어지는 화합물을 의미한다.
상기 용어 "정전기적 인력(Electrostatic attraction)"은 반대된 양(+)과 음(-)의 하전이 만나 인력이 작용하는 것을 의미한다.
상기 용어 "상호 작용"은 둘 이상의 물체나 대상이 서로 영향을 주고받는 일종의 행동을 의미하고, 양쪽 방향으로 영향이 나타나야 한다.
상기"개체"는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 혈액, 소변, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 조직, 세포, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 양상에 따른 핵산 검출 또는 분리 방법을 이용하면, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체가 시료 내 핵산과 상호 작용을 이루는 것을 이용하여 시료 내 표적하는 핵산을 저비용으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있고, 나아가, 고농도로 분리할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 핵산을 분리하는 단계 이전에 상기 고체 지지체의 표면을 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법이 상기 핵산을 분리하는 단계 이전에 상기 세척 단계를 더 포함하는 경우, 고체 지지체에 남아있는 오염물을 제거함으로써, 보다 정확하고 핵산을 검출 또는 분리할 수 있다.
상기 세척 단계는 예를 들어, PBS 완충액, 에탄올, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 고체 지지체는 제올라이트(zeolite), 크로모솔브(Chromosorb) 및 규조토 (Diatomaceous earth)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 제올라이트 또는 규조토일 수 있고, 보다 구체적으로는 제올라이트일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 핵산을 분리하는 단계 이전에 상기 결합된 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체 및 핵산을 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 용어 "여과(filtration)"는 액체와 고체가 혼합된 물질을 입자의 크기 차이를 이용해 분리하는 방법을 의미한다.
예를 들어, 상기 여과는 정밀여과막(MF; Microfiltration Membrane), 한외여과막(UF; Ultrafiltration membrane), 나노여과막(NF; Nanofiltration Membrane), 역삼투막(RO; Reverse Osmosis Membrane) 및 PVDF(polyvinylidene fluoride) 시린지 필터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로 PVDF 시린지 필터, 정밀여과막 및 한외여과막으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로 수행되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 PVDF 시린지 필터로 수행되는 것일 수 있다.
상기 용어"PVDF 시린지 필터(Syringe Filter)"는 친수성 PVDF 멤브레인 사용하여, 액체 샘플 내에 있는 부유 물질을 여과할 때 사용하는 일회용 필터이며, 멤브레인(Membrane, 특정 성분을 분리해 통과시킴으로써 혼합물을 분리할 수 있는 액체 혹은 고체 막) 필터로 여과할 수 있고, 빠른 정화 및 입자 제거를 할 수 있다.
상기 방법이 상기 핵산을 분리하는 단계 이전에 상기 여과 단계를 더 포함하는 경우, 상기 방법에 따르면, 고체 지지체에 포획되지 않은 물질을 제거함으로써, 보다 정확하고 신속하게 고농도의 핵산을 검출 또는 분리할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 여과 단계는 0.1 μm 미만의 기공을 갖는 필터로 수행될 수 있고, 구체적으로는 0.3 μm의 기공을 갖는 필터로 수행될 수 있고, 보다 구체적으로는 0.4 μm의 기공을 갖는 필터로 수행될 수 있다.
상기 필터의 기공이 0.1 μm 미만인 경우, 0.1 μm 보다 작은 파편 및 비결합 분자가 필터를 통과하여 제거되고, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 핵산(예를 들어, 순환 RNA)이 고체 지지체에 의해 필터 표면 상에 농축될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산을 분리하는 단계는 완충액, 구체적으로는 용리 완충제를 사용하여 상기 화합물, 상기 고체 지지체 및 상기 핵산 사이의 상호 작용을 파괴함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 양성 전립선비대증(BPH: benign prostatic hyperplasia) 환자의 전립선암(PCa: prostate cancer) 진단용 조성물로서,
상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물을 제공한다.
상기 "핵산", "검출", "분리"등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P일 수 있다.
상기 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 이용하여 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산을 검출 또는 분리하는 경우, 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단이 가능하며, 상기 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P를 모두 검출 또는 분리하는 경우, 상기 조성물의 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단능이 보다 우수해질 수 있다.
상기 용어 "양성 전립선비대증(BPH: benign prostatic hyperplasia)"은 전립선 비대증이라고도 하며, 전립선의 크기가 증가하는 질환을 의미한다. 증상에는 잦은 배뇨, 배뇨 곤란, 약한 흐름, 배뇨 곤란 또는 방광 조절 상실이 있을 수 있고, 합병증에는 요로 감염, 방광 결석 및 만성 신장 문제가 있을 수 있다.
상기 용어 "환자(patient)"는 인간, 인간 이외의 영장류 또는 다른 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스(mouse), 랫트(rat) 등과 같은 포유동물을 의미하며, 보다 구체적으로, 상기 환자는 인간이다.
상기 용어 "전립선암(PCa: prostate cancer)"은 전립선의 세포가 비정상적으로 분열하고, 성장하여 결국은 악성종양이 되는 질환이다. 악성 종양은 전립선에 국한되지 않고 주위 조직을 침범할 수 있고, 혈관이나 림프관을 통하여 다른 장기로 전이될 수도 있다.
상기 용어 "진단"은 질병 유무, 질병의 상태 및 질병의 예후를 확인하는 것을 포함하며, 질병상태 및 결정을 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 말한다.
또 다른 양상은 상기 진단용 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단용 키트를 제공한다.
상기 "진단", "고체 지지체", "양성 전립선비대증(BPH)", "환자", "전립선암(PCa)", "키트" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따른 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단용 조성물 및 키트를 이용하는 경우, 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa)을 정확하고, 신속하게 진단할 수 있다.
구체적으로, 일 실시예에서는 핵산(순환 miRNA)-기반 전립선암(PCa) 진단에 대한 HAZIS-CirR의 임상 유용성을 확인하고자 하였으며, 핵산의 분석 결과, miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P가 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa)에서 과발현되는 것을 확인하였는 바, 상기 핵산들을 이용하여 양성 전립선비대증 환자의 전립선암 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 1-2-(5) 참조).
또 다른 양상은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계;
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 방법을 제공한다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
상기 "화학식 1의 화합물", "화학식 2의 화합물", "개체", "핵산", "고체 지지체", "양성 전립선비대증(BPH)", "환자", "전립선암(PCa)", "진단" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 혈액, 소변, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 조직, 세포, 세포 조직액 또는 소변일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P일 수 있다.
상기 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단 방법을 이용하여 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산을 검출 또는 분리하는 경우, 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단이 가능하며, 상기 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P를 모두 검출 또는 분리하는 경우, 상기 방법의 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단능이 보다 우수해질 수 있다.
또 다른 양상은 상기 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 감염성 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 "핵산", "검출", "분리"등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 "감염성 질환"은 세균, 스피로헤타, 리케차, 바이러스, 진균, 기생충과 같은 여러 병원체에 의해 감염되어 발병하는 질환을 의미한다.일 양상에 있어서, 상기 감염성 질환은 수족구병, 풍진, 유행성결막염, 독감, 장염, 홍역, 농가진, 수두, 세균성뇌수막염 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 독감, 장염, 수두, 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 결핵일 수 있다.
상기 용어 "결핵"은 결핵균(Mycobacterium Tuberculosis)이라는 세균에 의해 전염되는 감염성 질환으로 활동성 결핵환자가 기침이나 재채기를 하면 침방울이나 비말핵을 통해 공기 중으로 배출된 결핵균이 호흡을 통해 감염된다.
일 양상에 있어서, 상기 감염성 질환은 콕사키 A 바이러스(Coxsackie A virus), 루벨라바이러스(Rubella virus), 아데노바이러스(Adeno virus), 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 노로바이러스(Norovirus), 밀슬레 모르빌리바이러스(Measles morbillivirus), 스타필로코커스 아우레어스(Staphylococcus aureus), 버리셀라조스타 바이러스(Varicella zoster virus), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 마이코박테리움 튜벌큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물로부터 유발되는 것일 수 있고, 구체적으로는 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 노로바이러스(Norovirus), 밀슬레 모르빌리바이러스(Measles morbillivirus) 및 마이코박테리움 튜벌큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물로부터 유발되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 마이코박테리움 튜벌큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)으로부터 유발되는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 핵산은 결핵균 유래 IS6110 유전자일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 감염성 질환의 진단용 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 감염성 질환의 진단용 키트를 제공한다.
상기 "감염성 질환", "고체 지지체", "진단", "키트" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따른 키트는 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체가 시료 내 핵산과 상호 작용을 이루는 것을 이용하여 시료 내 표적하는 핵산을 저비용으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 바, 감염성 질환을 유발하는 미생물 유래 유전자를 검출 또는 분리함으로써, 신속하고 정확한 감염성 질환의 진단이 가능하다.
구체적으로, 일 실시예에서는 병원체 농축 및 핵산 추출을 위해 미세유체 플랫폼 및 제올라이트 필터를 이용하였다: (1) 샘플(일 양상에 따른 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물, 고체 지지체(미세유체 플랫폼 및 제올라이트 필터) 및 Brucella Ovis (핵산을 포함하는 시료))을 혼합하고, 상기 혼합물을 배양(인큐베이션)하는 단계; (2) 상기 혼합물을 필터에 여과하여, 포획되지 않은 물질을 제거하고, 고농도로 핵산을 농축하는 단계; (3) 상기 고체 지지체의 표면을 세척함으로써, 고체 지지체에 남아있는 오염물을 제거하는 단계; (4) 완충제를 사용하여 상기 화합물, 상기 고체 지지체 및 상기 핵산 사이의 상호 작용을 파괴함으로써, 핵산을 분리하는 단계(실시예 2-1(2) 및 2-1(3) 참조).
다른 실시예에서는 병원체 농축 및 핵산 추출을 위한 아디프산 디히드라지드 기반 시료 전처리 시스템의 작동 및 효율성을 확인하고자 하였으며, 동형이기능성 히드라지드를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출을 수행한 결과, 동형이기능성 히드라지드 중에서 아디프산 디히드라지드가 가장 높은 포획 효율이 나타났고, 모든 후보물질을 사용한 시료 준비에서 유사한 수준으로 병원균 농축 및 핵산 추출이 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 2-2(1) 참조).
일 실시예에 있어서, 결핵균을 농축하고 3개의 비인두 면봉 샘플을 이용하여, 아디프산 디히드라지드 기반 샘플 전처리의 임상 유용성을 확인하고자 하였으며, 그 결과, 세 샘플 모두 컬럼 기반 키트를 이용하여 추출한 DNA에서 IS6110 유전자를 검출하여 양성 판정을 받은 것을 확인하였다. 또한, 기존의 방법에 비해 아디프산 디히드라지드 기반 시료 전처리 시스템은 Ct 값이 낮고 핵산 검출량이 더 많은 것을 확인하였는 바, 저검출 감도로 인한 오음성(false negatives)이 고효율 병원체 농축을 기반으로 감소될 수 있음을 보여주며, 간편하고 빠른 과정으로 신속한 진단이 필요한 감염성 질환에 사용할 수 있음을 확인하였다(실시예 2-2(3) 참조).
또 다른 양상은 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 감염성 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
상기 "화학식 1의 화합물", "화학식 2의 화합물", "개체", "핵산", "고체 지지체", "감염성 질환", "진단" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 혈액, 타액, 소변, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 타액, 조직, 세포, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 양상에 따른 핵산의 검출 또는 분리용 조성물, 키트 및 방법을 이용하면, 종래의 칼럼 및 비드에 기초한 방법에서 사용되는 전기 및 특별한 장비, 예를 들어, 원심분리, 진공 펌프 및 열-조절제 없이, 저비용으로 고농도 및 고순도 핵산을 신속하고 간단하며, 정확하게 검출 또는 분리할 수 있다. 나아가, 일 양상에 따른 조성물을 이용하여 핵산 중 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산을 검출 또는 분리함으로써, 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa)을 신속, 정밀 및 조기 진단할 수 있으며, 감염성 질환을 유발하는 미생물 유래 핵산을 검출 또는 분리함으로써 감염성 질환을 신속, 정밀 및 조기 진단할 수 있다.
도 1은 HAZIS-CirR의 개략도를 나타내는 도이다.
도 2는 변형 제올라이트(아민-개질된 제올라이트(AZ), 히드라지드 개질된 아민-개질된 제올라이트(HAZ) 및 핵산(NA)이 있는 히드라지드 개질된 아민-개질된 제올라이트(HAZ))의 구조를 나타내는 도이다.
도 3은 임상 표본을 나타내는 도이다.
도 4는 주사 전자 현미경(SEM) 이미지 및 동적 광 산란(DLS: dynamic light scattering)을 이용하여 제올라이트의 형상 및 크기 분포를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 아민-개질된 제올라이트(AZ) 농도에 따른 순환 RNA 포획 효율 및 아디프산 디히드라지드(ADH) 농도에 따른 순환 RNA 포획 효율을 비교한 HAZIS-CirR의 최적화를 나타내는 도이다.
도 6은 HAZIS-CirR의 카피수와 포획 효율을 hsa-mir-21-5p ss mimics의 연속 희석에 의해 얻어진 표준 곡선을 통해 나타낸 도이다.
도 7은 HAZIS-CirR에서 PCA3(prostate cancer antigen 3) 및 TMPRSS2-ERG 유전자 융합 3의 순환 mRNA 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 HAZIS-CirR에서 PCA3(prostate cancer antigen 3) 및 TMPRSS2-ERG 유전자 융합 3의 순환 miRNA 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 동형이기능성 히드라지드를 이용한 병원체 농축 방법을 나타내는 도이다.
도 10은 동형이기능성 히드라지드를 이용한 병원체 농축 효율을 비교한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 미세유체 플랫폼과 제올라이트 및 실린지 필터를 이용한 DNA 및 RNA 검출의 효율을 비교 분석한 결과이다.
도 2는 변형 제올라이트(아민-개질된 제올라이트(AZ), 히드라지드 개질된 아민-개질된 제올라이트(HAZ) 및 핵산(NA)이 있는 히드라지드 개질된 아민-개질된 제올라이트(HAZ))의 구조를 나타내는 도이다.
도 3은 임상 표본을 나타내는 도이다.
도 4는 주사 전자 현미경(SEM) 이미지 및 동적 광 산란(DLS: dynamic light scattering)을 이용하여 제올라이트의 형상 및 크기 분포를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 아민-개질된 제올라이트(AZ) 농도에 따른 순환 RNA 포획 효율 및 아디프산 디히드라지드(ADH) 농도에 따른 순환 RNA 포획 효율을 비교한 HAZIS-CirR의 최적화를 나타내는 도이다.
도 6은 HAZIS-CirR의 카피수와 포획 효율을 hsa-mir-21-5p ss mimics의 연속 희석에 의해 얻어진 표준 곡선을 통해 나타낸 도이다.
도 7은 HAZIS-CirR에서 PCA3(prostate cancer antigen 3) 및 TMPRSS2-ERG 유전자 융합 3의 순환 mRNA 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 HAZIS-CirR에서 PCA3(prostate cancer antigen 3) 및 TMPRSS2-ERG 유전자 융합 3의 순환 miRNA 분석의 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 동형이기능성 히드라지드를 이용한 병원체 농축 방법을 나타내는 도이다.
도 10은 동형이기능성 히드라지드를 이용한 병원체 농축 효율을 비교한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 미세유체 플랫폼과 제올라이트 및 실린지 필터를 이용한 DNA 및 RNA 검출의 효율을 비교 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 제올라이트를 이용한 RNA 검출
1. 실험 방법 및 재료
(1) 제올라이트 필터 시스템 제작
제올라이트(96096-100G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출을 위한 아민 개질된 제올라이트를 다음과 같이 2 단계로 제작하였다: (1) 제올라이트 세척단계; 초순수 증류수 150 mL에 제올라이트 3 g을 상온에서 550 rpm으로 10분간 교반하고, 2회 세척하였다. 침전물은 같은 조건에서 150 mL의 증류수로 두 번 더 세척하였다. 세척 후 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브로 분리하여, 1,400 rpm으로 1분간 원심분리하였다. 상등액은 버리고, 순수한 제올라이트 침전물을 건조하여 저장하였다. (2) APDMS 기능화 단계; 3-아미노프로필-메틸-디톡시실레인(APDMS, 371890-50ML, Sigma-Aldrich) 3 mL를 95% 에탄올 150 mL에 첨가하고 상온에서 3분간 550 rpm으로 교반하였다. 순수한 제올라이트는 3-아미노프로필-메틸-디톡시실레인을 함유한 95% 에탄올과 혼합한 후 상온에서 4시간 동안 450 rpm으로 교반하였다. 실린화 후 침전물은 초순수 증류수와 95% 에탄올을 사용하여, 수 회 세척하여 잔여 3-아미노프로필-메틸-디톡시실레인를 제거하였다. 세척 후 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브로 분리하여 1,400 rpm으로 1분간 원심분리하였다. 상등액은 버리고, 아민-개질된 제올라이트 침전물은 남은 에탄올이 모두 증발할 때까지 진공 챔버를 사용하여 건조한 후 저장하였다.
(2) HAZIS-CirR의 제조 및 작동
HAZIS-CirR에 제올라이트(96096-100G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하기 위해, 실란화(silanization)를 통한 제올라이트(zeolite)의 아민 개질을 여러 단계로 수행하였다. 우선, 제올라이트의 세정을 위해, 150 mL의 초순수 증류수(DW: distilled water) 및 95% 에탄올-DW(95:5, v/v)를 3 g의 제올라이트에 사용하고, 실온(RT: room temperature)에서 10분 동안 550 rpm에서 교반하였다. 세척 후, 150 mL의 2% 3-아미노프로필 디에톡시메틸실란 (APDMS: aminopropyl diethoxymethylsilane, 371890-50ML, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)-95% 에탄올 (2:98, v/v)을 세척된 제올라이트의 실란화에 사용하고, 실온에서 4시간 동안 450 rpm에서 교반하였다. 실란화 후, 150 mL의 초고순도 DW 및 95% 에탄올을 아민-개질된 제올라이트 (AZ: amine-modified zeolite)의 세척에 사용하고, 실온에서 10분 동안 550 rpm에서 교반하였다. 수 회 세척한 후, 아민-개질된 제올라이트를 진공 챔버 및 펌프를 사용하여 완전히 건조시키고, 사용할 때까지 실온에서 저장하였다.
순환 RNA 농축 및 단리를 위한 HAZIS-CirR의 공정은 4 단계로 구성된다(도 1): (1) 샘플 혼합 및 인큐베이션(incubation), (2) 농축, (3) 세척 및 (4) 단리. hsa-mir-21-5p 모방체(Shanghai GenePharma Co., Ltd., Shanghai, China)를 함유하는 1 mL 용액을 HAZIS-CirR의 최적화를 위해 사용하였고, HAzIS- CirR에서 4 mL 소변 샘플 내 순환 RNA를 분석함으로써 임상 유용성을 확인하기 위해 사용하였다. 구체적으로, (1) 샘플 혼합 및 인큐베이션 단계에서 2.5 mg, 5 mg 또는 10 mg의 아민-개질된 제올라이트 및 10 mg, 25 mg 또는 50 mg의 아디프산 디히드라지드 (ADH: adipic acid dihydrazide, 8.41689.0050, Merck Millipore), 동형이기능성 히드라지드 (HHs: homobifunctional hydrazides) 중 하나를 샘플 1 mL 당 첨가하였다. 아디프산 디히드라지드는 동형이기능성 히드라지드를 사용하여 HAZIS-CirR의 최적화에 의해 선택되었다(도 2): 탄소 디히드라지드(CDH: carbonic dihydrazide, C11006-100G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 옥살릴 디히드라지드 (ODH: oxalyl dihydrazide, 131296-25G, Sigma-Aldrich, st. Luis, M0, USB), 말론산 디히드라지드(MDH: malonic dihydrazide, M3206, Tokyo Chemical Industry, Japan) 및 숙신산 디히드라지드 (SDH: succinic dihydrazide, S5502-25 G, Si gma - Aldrich(St. Lurous, MO 및 USA)). 샘플 혼합 후, 공유 및 정전기 반응을 위한 인큐베이션을 실온에서 10분 동안 수행하였다. (2) 농축 단계에서, 1 mL 내지 4 mL의 인큐베이션된 샘플을 1 mL 내지 5 mL 시린지 (Korea Vaccine Co., Ltd, Yongin, Korea)를 사용하여 멸균 0.45 μm PVDF(polyvinylidene fluoride) 시린지 필터 (FJ13BSCPV004AL01, GVS Filter Technology, Indianapolis, USA)에 통과시켰다. 공유 및 정전 결합에 의해 아민-개질된 제올라이트로 포획된 순환 RNA는 아민-개질된 제올라이트의 크기에 기초하여 여과되고, 아민-개질된 제올라이트와 포획되지 않은 파편은 필터를 통과하여 폐기된다. (3) 세척 단계에서, 3 mL의 PBS를 사용하여 남아있는 오염물을 제거하였다. (4) 단리 단계에서, 100 μL의 50 mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate, S5761-500G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용리 완충제(pH 10.6)를 사용하여 순환 RNA와 아디프산 디히드라지드의 아민-개질된 제올라이트 상에서의 가교결합을 파괴하였다. 용리된 순환 RNA를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에서 수집하고, 추가로 사용할 때까지 영하 온도 (-20℃또는 -80℃에서 저장하였다.
(3) HAZIS-CirR의 검출 한계 및 순환 RNA 포획 효율 평가
HAZIS-CirR의 검출 한계 및 순환 RNA 포획 효율을 평가하기 위해, hsa-mir-21-5p ss 모방체(mimics)를 사용하였다. hsa-mir-21-5p ss 모방체는 20 μM(1.204 x 1013 copies/reaction)으로부터 2 aM(1204 x 100 copies/reaction)으로의 연속 희석에 의해 사용되었다. hsa-mir-21-5p ss 모방체를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 희석하고, 사용할 때까지 영하 온도(-20℃또는 -80℃에서 저장하였다. 제올라이트, 아민-개질된 제올라이트, 동형이기능성 히드라지드와 아민-개질된 제올라이트(히드라지드 개질 아민-개질된 제올라이트, HAZ: hydrazide-modified AZ) 및 히드라지드 개질 아민-개질된 제올라이트(HAZ)와 핵산의 제타 전위 및 푸리에 변환-적외선 분광법(FT-IR) 결과를 동적 광 산란(Nano ZS DLS, Malvern Panalytical Ltd, UK) 및 FT-IR 푸리에 변환 적외선 분광계(Vertex 70, Bruker, Germany)를 사용하고 측정하여 물질 정보를 화학적 변형에 의해 분석하였다. 전계 방출 주사 전자 현미경(JSM-7800F Prime, JEOL Ltd, Japan)을 사용하여 핵산을 갖는 제올라이트, 아민-개질된 제올라이트, 히드라지드 개질 아민-개질된 제올라이트(HAZ) 및 히드라지드 개질 아민-개질된 제올라이트(HAZ)의 주사 전자 현미경(SEM: scanning electron microscope) 이미지를 얻었다.
(4) cDNA 합성 및 실시간 PCR
제조자의 권장 프로토콜에 따라, 순환 RNA는 mRNA에 대한 Sensiscript RT Kit (205213, Qiagen, Hilden, Germany) 및 miRNA에 대한 Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit (638313, Takara Bio USA, Inc., Kyoto, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사되었다. 합성된 cDNA를 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 순환 mRNA 분석을 위해, QuantiTect SYBR green PCR Kit (204145, Qiagen, Hilden, Germany)를 전립선암 항원 3(PCA3: prostate cancer antigen 3), 막관통 프로테아제 세린 2 (TMPRSS2: transmembrane protease serine 2)-ERG 유전자 융합 3 및 18S 리보솜 RNA(18S rRNA)의 검출에 사용하였다. 정방향 및 역방향 프라이머를 약 24 bp의 통상적인 길이로 합성하였다(표 1). 증폭 프로토콜은 95℃에서 10분 동안 초기 변성 단계, 95℃에서는 30초, 62℃에서는 3초, 72℃에서 3초의 40 사이클, 및 40℃에서 30초 동안 냉각 단계로 구성되었다. 순환 miRNA 분석을 위해, TB Green Advantage qPCR Premix kit (639676, Takara Bio USA, Inc., Kyoto, Japan)를 has-miR-21-5p, 141-3p, 375-3p, 148a-3-p, 483-5p, 574-3p 및 U6 snRNP의 비-코딩 소형 핵 RNA 성분(U6snRNA)의 검출에 사용하였다. 성숙한 서열(mature sequences)을 정방향 프라이머로서 사용하고, miRNA의 역방향 프라이머 및 U6 snRNA 프라이머는 키트에서 제공된 프라이머를 사용하였다(표 1). TB Green 신호를 갖는 증폭된 생성물은 QuantStudio 3 Real Time PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 획득하였다. 겔 전기영동을 수행하여 LoadingSTAR (A750, Dyne Bio Inc., Seoul, Korea)을 함유하는 2% 아가로스 겔 상에서 PCR 생성물을 분리하였다. 겔을 ChemiDoc XRS + system (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)을 사용하여 가시화하였다.
| Target | Location | Sequence (5'-3') | Length (bp) |
서열
번호 |
|
| mRNA | PCA3 | Forward | GAG AAC AGG GGA GGG AGA G | 19 | 서열번호 1 |
| Reverse | ACG TTC TGG GAT ACA TGT GC | 20 | 서열번호 2 | ||
|
TMPRSS2-
ERG fusion |
Forward | CCT GGA GCG CGG CAG GAA GCC TTA TCA GTT G | 31 | 서열번호 3 | |
| Reverse | TCC TGC TGA GGG ACG CGT GGG CTC ATC TTG | 30 | 서열번호 4 | ||
| 18S rRNA | Forward | CCT GGA TAC CGC AGC TAG GA | 20 | 서열번호 5 | |
| Reverse | GCG GCG CAA TAC GAA TGC CCC | 21 | 서열번호 6 | ||
| microRNA | has-miR-21-5p | Forward | TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A | 22 | 서열번호 7 |
| has-miR-141-3p | Forward | TAA CAC TGT CTG GTA AAG ATG G | 22 | 서열번호 8 | |
| has-miR-375-3p | Forward | TTT GTT CGT TCG GCT CGC GTG A | 22 | 서열번호9 | |
| has-miR-148a-3p | Forward | TCA GTG CAC TAC AGA AGT TTG T | 22 | 서열번호 10 | |
| has-miR-483-5p | Forward | AAG ACG GGA GGA AAG AAG GGA G | 22 | 서열번호 11 | |
| has-miR-574-3p | Forward | CAC GCT CAT GCA CAC ACC CAC A | 22 | 서열번호 12 | |
| Universal | Reverse | mRQ 3' Primer (provided in kit) | . | ||
| U6 snRNA | Forward | U6 Forward Primer (provided in kit) | . | ||
| Reverse | U6 Reverse Primer (provided in kit) | . | |||
(5) 순환 RNA의 분석
순환 RNA의 상대 정량(RQ: Relative quantification) 값은 mRNA에 대한 18S rRNA 및 miRNA에 대한 U6 snRNA가 기준 유전자로서 존재하는 비교 Ct 방법을 사용하여 계산하였다. 유전자 발현의 상대 정량 값을 하기의 수학식 1 내지 3을 사용하여 분석하였다:
[수학식 1]
△Ct = Ct (Target gene) - Ct (Reference gene),
[수학식 2]
△△Ct = △Ct (PCa, BPH, or Normal) - △Ct (Average of Normal),
[수학식 3]
Relative Quantification (RQ) value = 2-△△Ct.
모든 상대 정량 값은 공식에 의해 자동으로 계산되었고, 쌍을 이루지 않은 t-테스트에 의한 P 값 및 그래프는 GraphPad Prism 8 statistical software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 획득하였다.
(6) 임상 분석 방법
임상 분석을 위해 PCa 환자 55명, BPH 환자 24명, 대조군 10명으로부터 소변 샘플을 채취하였다(도 3). 모든 피험자는 연구에 참여하기 전에 사전 동의서를 작성하였다. 실험에서 사용한 소변 샘플은 비슷한 연령의 환자에서 선택하였고, 실험 방법은 다음과 같이 진행하였다: (1) 4 mL의 소변샘플을 준비하고 샘플 혼합 및 인큐베이션 단계에서 샘플 1 mL 당 5 mg의 아민-개질된 제올라이트 및 50 mg의 아디프산 디히드라지드를 첨가하였다. 샘플 혼합 후, 공유 및 정전기 반응을 위한 인큐베이션을 실온에서 10분 동안 수행하였다. (2) 농축 단계에서, 4 mL의 인큐베이션된 샘플을 5 mL 시린지 (Korea Vaccine Co., Ltd, Yongin, Korea)를 사용하여 멸균 0.45 μm PVDF 시린지 필터 (FJ13BSCPV004AL01, GVS Filter Technology, Indianapolis, USA)에 통과시켰다. 공유 및 정전 결합에 의해 아민-개질된 제올라이트로 포획된 순환 RNA는 아민-개질된 제올라이트의 크기에 기초하여 여과하고, 아민-개질된 제올라이트와 포획되지 않은 파편은 필터를 통과하여 폐기하였다. (3) 세척 단계에서, 3 mL의 PBS를 사용하여 남아있는 오염물을 제거하였다. (4) 단리 단계에서, 100 μL의 50 mM 중탄산나트륨(sodium bicarbonate, S5761-500G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용리 완충제(pH 10.6)를 사용하여 순환 RNA와 아디프산 디히드라지드의 아민-개질된 제올라이트 상에서의 가교결합을 파괴하였다. 용리된 순환 RNA를 1.5 mL 미세원심분리 튜브에서 수집하고, 추가로 사용할 때까지 영하 온도 (-20℃또는 -80℃에서 저장하였다.
2. 실험 결과
(1) HAZIS-CirR을 이용한 순환 RNA 농축 및 분리
HAZIS-CirR은 아민-개질된 제올라이트(AZ) 및 아디프산 디히드라지드(ADH)의 분자 특성 및 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멸균 필터의 크기-기반 여과에 기초한 신규한 순환 RNA 농축 및 단리 플랫폼이다. 도 1A는 전립선암(PCa: Prostate cancer) 또는 양성 전립선 비대증(BPH: benign prostatic hyperplasia) 또는 건강한 대조군(healthy control)을 갖는 소변 샘플로부터 유래된 순환 RNA의 농축 및 단리를 위해 설계된 HAZIS-CiR을 예시한다. 순환 RNA 농축 및 분리를 위한 HAZIS-CirR의 공정은 4 단계로 구성된다(도 1): (1) 샘플 혼합 및 인큐베이션, (2) 순환 RNA의 농축, (3) 순환 RNA 세척 및 (4) 순환 RNA 분리. 이들 절차는 제올라이트의 기능화 이외의 조작 전에 임의의 추가 단계를 필요로 하지 않으며, 아민-개질된 제올라이트, 아디프산 디히드라지드 및 순환 RNA 사이의 직접적인 상호작용을 통해, 10분 동안의 인큐베이션 시간을 포함하여 20분 이내에 순환 RNA 농축 및 단리가 가능하다. (1) 샘플 혼합 및 인큐베이션 단계에서 아민-개질된 제올라이트, 아디프산 디히드라지드 및 순환 RNA 사이의 공유 및 정전기적 커플링이 도 1B에 제시되어 있다. 아디프산 디히드라지드는 수용성이고 무취이며, 낮은 독성을 가지며, 주로 기계적 라텍스 필름 및 주사 가능한 산화 히알루론산 하이드로겔의 제조를 포함하는 많은 분야에서 가교제로서 사용된다. 본 실험에서는 아디프산 디히드라지드를 이용한 분자 진단을 위한 간단하고 신속한 핵산(NA:nucleic acid) 농축 및 단리 방법으로 최초로 제안하였다. 아디프산 디히드라지드, pH 민감성 링커 및 비-카오트로픽 시약은 C4 골격 및 히드라지드의 반응성기(C=ONHNH2)를 갖는 대칭 분자이다. 아디프산 디히드라지드의 히드라지드기는 다른 분자의 알데히드 또는 케톤기와 반응하여 반응성 히드라존 결합을 형성할 수 있다. 또한, 1개의 하이드라지드기 중에 2개의 1급 아민기와 1개의 알데히드기를 갖기 때문에, 친핵성이고, 아민 반응성 및 알데히드 반응성기와 반응할 수 있다. HAZIS-CirR에서, 아민-개질된 제올라이트, 아디프산 디히드라지드 및 순환 RNA 사이의 결합 메커니즘은 다음과 같이 설명할 수 있다: 1) 아디프산 디히드라지드의 알데히드기는 아민-개질된 제올라이트의 아민기 및 RNA 뉴클레오티드의 질소 염기(G, A 및 C)와 반응하고, 아디프산 디히드라지드의 아민기는 질소 염기 (G, C 및 U)의 알데히드 또는 케톤기와 반응하여 반응성 이민 결합을 형성한다. 2) 아디프산 디히드라지드의 히드라지드기는 RNA 뉴클레오티드의 질소 염기(G, C 및 U)의 알데히드 또는 케톤기와 반응하여 반응성 히드라존 결합을 형성한다. 3) 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드의 양전하는 정전 인력에 의해 RNA 뉴클레오티드의 포스페이트기의 음전하와 반응한다. 질소 염기의 작용기는 도 1에 존재한다. 아민-개질된 제올라이트 표면 상에 포획된 순환 RNA는 PVDF 시린지 필터 내로 주입되고, 필터 기공 크기(0.45 μm)보다 작은 파편 및 비결합 분자가 필터를 통과하여 폐기되고, 순환 RNA가 아민-개질된 제올라이트에 의해 필터 표면 상에 농축된다. 잔류 파편은 PBS 세척을 통해 제거되고, 순환 RNA는 용리 완충액(pH 10.6)을 사용하여 아민-개질된 제올라이트, 아디프산 디히드라지드 및 순환 RNA 사이의 반응성 결합을 파괴함으로써 추출된다. HAZIS-CirR은 세포 용해 단계를 갖지 않고, 비-카오트로픽 시약을 사용하기 때문에, 세포 용해 동안 나올 수 있는 세포 배경 핵산(NA: nucleic acid)에 의한 오염이 없고, 카오트로픽 시약의 사용으로 인한 추출된 RNA의 분해가 없다. 또한, 종래의 칼럼 및 비드에 기초한 방법에서 사용되는 전기 및 특별한 장비, 예를 들어, 원심분리, 진공 펌프 및 열-조절제 없이, 고농도 및 고순도 RNA를 신속하고 간단하게 추출할 수 있다.
(2) HAZIS-CirR의 특성화
먼저 HAZIS-CirR에서 특성화를 수행하여 아민-개질된 제올라이트, 아디프산 디히드라지드 및 핵산 사이의 분자 특성 및 결합 메커니즘을 확인하였다. 제올라이트의 형상 및 크기 분포는 주사 전자 현미경(SEM) 이미지 및 동적 광 산란(DLS: dynamic light scattering)을 사용하여 확인하였다(도 4). 제올라이트는 약 2 μm 내지 18 μm(대부분 6 μm 내지 14 μm)의 크기를 가지며, 실란화 후 아디프산 디히드라지드 및 핵산 (HAz-NA)과의 상호작용 후에도 안정한 구조를 유지한다. 도 4C는 HAZIS-CirR에서 FT-IR 결과를 보여준다. 순수한 제올라이트는 464(TO의 대칭 벤딩, T: 사면체 결합된 Si 또는 Al), 547(TOT 대칭적 스트레칭의 2중 6원 고리), 667(SiOSi 대칭적 스트레칭), 777(대칭 TOT 스트레칭) 및 1028(TO에 대한 SiOAl 비대칭적 스트레칭)에서 흡수 피크를 보였고, 1654(OH 벤딩) 및 넓은 3467-3572(히드록실기) cm-1을 보였다. 실란화 후, 아민-개질된 제올라이트는 NH 스트레칭(stretching) 및 NH 벤딩(bending)에 의해 각각 1654 및 넓은 3467-3572 cm-1에서 증가된 흡수 피크를 나타냈다. 이들 결과는 아민기가 아민-개질된 제올라이트 표면 상에 형성됨을 보여준다. 또한, HAZ는 1471(CN 스트레칭), 1535(NH 벤딩), 2864(CH 스트레칭 및 벤딩) 및 2925(CH 스트레칭) 및 3317(NH 스트레칭) cm-1에서 추가의 흡수 피크를 보였고, 아디프산 디히드라지드에 의해 1654(C=O 스트레칭) 및 넓은 3467-3572(NH 스트레치 및 벤딩(bending))cm-1에서 흡수 피크를 증가시켰다. 이들 결과로부터, 도 1B에 나타낸 이민 결합에 의해 아민-개질된 제올라이트와 아디프산 디히드라지드가 결합하고, 아민-개질된 제올라이트의 표면에 하이드라지드가 발생하여 관능기로서 사용할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, HAZ-NA는 히드라지드(1471, 1535, 2864, 2925 및 3317 cm-1)를 나타내는 흡수 피크가 이민, 히드라진 결합 및 정전 인력에 의해 감소하고, 핵산에 의해 야기되는 흡수 피크(넓은 3317-3572 cm-1)가 증가하는 것을 보여준다. FT-IR의 분석에 기초하여, 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드는 순환 RNA를 포획하는데 사용될 수 있다. 도 4D는 순수한 제올라이트, 아민-개질된 제올라이트, HAZ 및 HAZ-핵산의 제타 전위를 나타낸다. 순수한 제올라이트의 제타 전위는 -44.58 mV였으며, 이는 제올라이트 표면 상에 존재하는 OH 및 산소-함유기에 기인한다. 아민-개질된 제올라이트의 제타 전위는 제올라이트 표면 상의 고정된 아민 기로 인해 순수한 제올라이트에 비해 -11.62 mV로 증가하였다. HAZ의 제타 전위는 아민-개질된 제올라이트와 유사한 -13.82 mV였고, 이 결과는 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드와 하이드라지드기 내의 아민 및 알데히드기 사이의 상호작용에 기인한다. HAZ-NA의 제타 전위는 -33.92 mV였으며, 이는 HAZ와 결합하는 핵산의 포스페이트기의 강한 음전하에 기인한다. 제타 전위의 분석에 기초하여, 아민-개질된 제올라이트 및 HAZ는 높은 제타 전위를 갖고, HAZ가 순환 RNA의 음전하와 전기적으로 결합하는 것을 확인하였다. 따라서, 이들 특성화 결과는 HAZIS-CirR이 순환 RNA 농축 및 단리를 위한 새로운 플랫폼으로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
(3) HAZIS-CirR의 최적화
HAZIS-CirR에서 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드의 최적화된 농도를 측정하였다. 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드 농도의 최적화는 저농도에 의한 낮은 결합 친화도 및 고농도에 의한 분자 사이의 간섭으로 인한 순환 RNA의 낮은 포획 효율을 피하기 위해 필수적이다. 최적화의 기준을 샘플 1 mL로 설정하고, 샘플 부피의 변화에 따라 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드를 동일한 비율로 첨가하였다. 본 발명자들은 상이한 농도의 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드를 사용하였고, 샘플 1 mL 당 5 mg의 아민-개질된 제올라이트와 50 mg의 아디프산 디히드라지드가 사용될 때 RNA 포획 효율이 높은 것을 확인하였다(도 5). 또한, HAZIS-CirR에 있어서, HH의 5개의 후보 물질(아디프산 디히드라지드(ADH), 탄소 디히드라지드(CDH), 옥살릴 디히드라지드(ODH), 말론산 디히드라지드(MDH) 및 숙신산 디히드라지드(SDH))을 이용하여 RNA를 포착하고, 아디프산 디히드라지드(ADH)를 이용한 경우의 포착 효율이 가장 양호한 것을 확인하였다(도 4B 및 도 4C). 또한, HAZIS-CirR의 검출 한계 및 포착 효율을 확인하였다. 동일한 농도의 hsa-mir-21-5p ss 모방체를 사용하여 HAZIS-CirR 전후의 카피수와 포획 효율을 비교하였다. hsa-mir-21-5p ss 모방체의 연속 희석에 의해 얻어진 표준 곡선의 식 값을 사용하여 계산하였다(도 6 및 표 2). 본 발명자들은 HAZIS-CirR 후에도 검출 한계가 이전과 동일하고(1.204 Х 103 copies/reaction), 82.03-92.38%의 고효율로 순환 RNA의 농축 및 단리가 가능하다는 것을 확인하였다(표 3). 이들 최적화 데이터는 HAZIS-CirR이 샘플 부피를 제한하지 않고, 높은 효율로 순환 RNA를 포획할 수 있다는 것을 확인하였다.
| Replicate No. | 1.204 Х 10 N copies reaction -1 (CT) |
|||||
| 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | |
| #1 | 14.121 | 18.533 | 23.883 | 27.251 | 31.902 | 35.100 |
| #2 | 14.333 | 18.933 | 24.256 | 27.249 | 32.396 | 36.272 |
| #3 | 14.093 | 19.323 | 24.770 | 28.600 | 32.791 | 36.241 |
| Mean | 14.182 | 18.930 | 24.303 | 27.700 | 32.363 | 35.871 |
| STDEV | 0.132 | 0.395 | 0.445 | 0.779 | 0.446 | 0.668 |
| Replicate No. | 1.204 Х 10 N copies reaction -1 (CT) |
||||
| 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | |
| #1 | 19.173 | 24.513 | 27.513 | 31.984 | 35.984 |
| #2 | 19.057 | 24.615 | 27.615 | 32.849 | 36.349 |
| #3 | 19.365 | 24.487 | 28.487 | 32.707 | 36.407 |
| Mean | 19.198 | 24.539 | 27.872 | 32.514 | 36.247 |
| Capture efficiency (%) | 86.81 | 88.34 | 91.35 | 92.38 | 82.03 |
(4) HAZIS-CirR에서 순환 mRNA의 임상적 유용성
84개의 소변 샘플로부터 순환 mRNA를 분석하여 순환 mRNA-기반 PCa 진단에 대한 HAZIS-CirR의 임상 유용성을 확인하였다(도 3). 전립선암 항원 3(PCA3: prostate cancer antigen 3) 및 막관통 프로테아제 세린 2 (TMPRSS2: transmembrane protease serine 2)-ERG 유전자 융합체 3을 순환 mRNA 바이오마커로서 사용하고, 상대 정량 (RQ) 값을 계산하였다. PCA3 유전자는 전립선암 세포에서 과발현된 긴 비암호화 RNA이고, 최근 PCa 바이오마커로서 임상 적용에 사용되어 왔다. ERG 종양유전자는 PCa의 50% 초과에서 과발현되는 것으로 알려져 있고, ERG 과발현은 TMPRSS2, 전립선-특이적 및 안드로겐-조절 유전자와의 융합에 의해 유도되고, TMRPSS2-ERG 유전자 융합은 PCa의 40-70%에서 발견되는 돌연변이이다. 두 바이오마커를 함께 사용함으로써 잠재적 값을 입증하고 적용하기 위한 연구가 진행중이다. 도 7A 및 도 7B는 HAZIS-CirR에서 60 샘플에 대한 PCA3 및 33 샘플에 대한 TMPRSS2-ERG 유전자 융합 3의 순환 mRNA 분석의 결과를 나타낸다. 순환 mRNA의 분석에서, PCA3는 PCa (평균 RQ = 0.64 ± 0.68), BPH (평균RQ = 0.71 ± 0.46) 및 건강한 대조군 (평균 RQ= 0.93 ± 0.96) 사이에서 유의하게 상이하지 않았다. 이들 결과는 PCa, BPH 및 건강한 대조군 사이에 PCA3에서 상당한 차이가 있을 것이라는 우리의 예상과 반대였다. TMPRSS2-ERG 유전자 융합체 3은 BPH (평균 RQ = 1.41 ± 1.81) (P < 0.01)와 비교할 때 PCa에서 고도로 과발현되는 것으로 밝혀졌다 (평균RQ = 6.58 ± 6.23). 그 결과, HAZIS-CirR에 있어서의 순환 mRNA를 이용한 PCa의 진단에서는, 바이오마커로서의 TMPRSS2-ERG 유전자 융합체 3은 BPH와 비교하여 명확한 차이를 보였지만, PCA3은 PCa와 BPH와의 유의한 차이를 보이지 않았고, 건강한 대조군이었다. 이러한 결과는 PCa 바이오마커로서 소변 순환 mRNA의 사용에 대한 일부 논의를 제공한다. 첫째, 순환 mRNA는 짧은 길이로 단편화되고 소변에서 쉽게 분해된다. 혈장에서 순환하는 핵산의 약 160-167 뉴클레오티드(NT: nucleotide)와 달리, 비뇨기 순환 핵산은 사구체 여과를 통해 더 짧은 길이 (100 nt 미만)로 더 단편화되고, 이는 순환 핵산의 용이한 분해를 야기한다. Oreskovic et al.은 작은 크기의 단편화된 핵산에 대한 추출 플랫폼의 개발을 제안하였고, 임상 연구에서 소변 순환 핵산을 사용하기 위해서는 짧은 길이의 표적 서열의 선택이 요구된다. 종래의 실리카 물질을 사용한 핵산 추출은 짧은 순환 핵산의 추출에 적합하지 않은데, 이는 실리카 및 핵산 표면의 탈수 및 실리카와 핵산 백본 사이의 수소 결합에 의해 야기되는 소수성 상호작용으로 인한 핵산의 길이에 의존하는 방법이기 때문이다. 이는 공유 및 정전 커플링을 사용하는 HAZIS-CirR이 작은 크기의 순환 mRNA를 추출할 수 있는 핵산 농축 및 단리 플랫폼으로서 더 적합할 수 있음을 보여준다. 그러나, 세포로부터 유래된 mRNA에 대해 사용된 것과 동일한 조건 하에서 설계된 프라이머 및 표적 서열이 선택되었기 때문에, PCa 진단 바이오마커로서 짧은 순환 mRNA를 사용하기 위해 짧은 표적 서열을 선택하는 것이 필요하다. 두번째는 용해 단계의 부재로 인한 낮은 순환 mRNA 추출 효율이다. 기존의 순환 핵산 추출 방법의 경우, 소량의 샘플로부터 순환 핵산의 회수율을 향상시키기 위해, 생체분자에 부착되거나 함유된 단편화된 핵산을 추출하기 위해 용해 단계가 수행된다. 용해 단계가 고농도의 순환 핵산을 추출할 수 있지만, PCa 세포 및 소변 엑소좀으로부터 추출된 세포-유래 게놈 핵산 및 전립선-관련 핵산의 카오트로픽 시약에 의한 오염은 순수한 순환 핵산 분석에서 민감성 및 특이성을 감소시킬 수 있다. 이러한 관점에서, 용해 과정이 없는 순환 핵산 농축 및 분리 플랫폼의 개발을 통한 소변 내의 순수한 순환 핵산의 추가 분석 및 조사가 필수적이다. 본 발명자들은 다양한 임상 환경에서 HAZIS-CirR의 추가 분석 및 확장이 순환 mRNA 분석의 한계를 보완하고 암 바이오마커로서 그의 임상 유용성을 추가로 입증할 것으로 예상한다.
(5) HAZIS-CirR에서 순환 miRNA의 임상적 유용성
순환 miRNA-기반 PCa 진단에 대한 HAZIS-CirR의 임상 유용성을 확인하기 위해 소변 샘플로부터 순환 miRNA를 분석하였다(도 8). 임상 관련성을 확인하기 위하여, 순환 miRNA 바이오마커 및 상대 정량 값으로서, 기존의 PCa 바이오마커로서 공지된 miR-21-5p, miR-141-3p 및 miR-375-3p를 사용하였다. miR-21-5p는 oncomiRs 중 하나이고, 상향-조절된 발암성 miRNAs로서 PCa를 포함하는 여러 암에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 유사하게, miR-141-3p 및 miR-375-3p는 유사한 발현 패턴을 가지며 PCa에서 과발현된 miRNA인 것으로 알려져 있다. 순환하는 miRNA의 분석에서, miR-21-5p (평균 RQ = 8.91 ± 12.92) (P < 0.01), miR-141-3p (평균 RQ= 12.26 ± 13.37) (p < 0.001) 및 miR-375-3p (평균 RQ=2 17.30 ± 18.69)(P < 0.001)가 건강한 대조군에서보다 PCa에서 과발현된다는 것을 확인하였다(각각 평균RQ = 1.16 ± 0.62, 1.69 ± 1.44 및 1.73 ± 1.64). 이 결과는 miR-21-5p, miR-141-3p 및 miR-375-3p가 PCa 바이오마커로서 사용될 수 있음을 보여준다. 그러나, BPH 환자에서조차, miR-21-5p (평균 RQ = 4.22 ± 4.75)(P < 0.01), miR-141-3p (평균 RQ= 5.04 ± 6.68) (P < 0.05) 및 miR-375-3p (평균 R Q = 7.57 ± 8.21)(P ≤ 0.01)는 건강한 대조군에서보다 과발현되었다. 이는 PCa 바이오마커를 사용하기 위해 BPH 환자로부터 상당한 차이 PCa가 있어야 함을 시사한다. miR-141-3p (P < 0.05) 및 miR-375-3p (p < 0.05 )는 BPH 환자 보다 PCa에서 과발현되고, miR-21-5p (P < 0.075, ns)에서 통계적으로 유의한 차이가 없는 것을 확인하였다. 이 결과는 miR-141-3p 및 miR-375-3p가 BPH 환자로부터 PCa를 식별하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 보여준다. miR-21-5p는 PCa에서 높은 발현율을 나타내지만, BPH와 비교하여 통계적으로 유의하지 않기 때문에 PCa와 BPH를 구별할 수 있는 바이오마커로서 사용될 수 없다. 또한, 본 발명자들은 miR-148a-3p, miR-483-5p 및 miR-574-3p의 임상적 관련성을 분석하여 BPH 환자와 PCa를 구별할 수 있는 잠재적인 바이오마커를 확인하였다. miR-148a-3p (평균 RQ 19.45 ± 34.51) (P < 0.01), miR-483-5p (평균 RQ= 49.53 ± 60.83) (P ≤ 0.001) 및 miR-574-3p (평균 R Q 17.28 ± 18.82) (P < 0.001)가 건강한 대조군 보다 PCa에서 과발현된다는 것을 확인하였다(평균RQ = 2.27 ± 2.73, 1.44 ± 1.58 및 1.35 ± 1.29). 그러나, 건강한 대조군 보다 BPH에서 miR-148a-3p(평균 RQ = 9.32 ± 13.51) (P < 0.05), miR-483-5p (평균 RQ = 6.98 ± 11.64) (P ≤ 0.05) 및 miR-574-3p (평균 RQ= 4.68 ± 4.34) (P < 0.01)이 과발현되었다. PCa와 BPH를 비교할 때, miR-483-5p(P < 0.001) 및 miR-574-3p (P < 0.001)가 BPH 환자에서보다 PCa에서 과발현되고, miR-148a-3p(p < 0.076, ns)에서 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 이 결과는 PCa와 BPH를 구별할 수 있는 바이오마커로서 miR-483-5p 및 miR-574-3p를 나타낸다. miR-148a-3p는 PCa에서 높은 발현율을 나타내지만, BPH와 비교하여 통계적으로 유의하지 않기 때문에 PCa와 BPH를 구별할 수 있는 바이오마커로서 사용될 수 없다. 그 결과, HAZIS-CirR은 환자의 소변 시료 중의 순환 miRNA를 단시간에 농축 추출할 수 있고, PCa 진단용의 시료 제작 플랫폼으로서 사용할 수 있는 것을 확인하였다. 또한, miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P가 PCa를 BPH 환자와 구별하는 바이오마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 HAZIS-CirR이 환자 샘플에 존재하는 순환 miRNA의 저농도의 농도 및 추출을 통해 miRNA의 고농도를 수득함으로써 기존의 검출 방법의 낮은 검출 감도의 한계를 해결하고, 조기 및 정밀 암 진단을 위한 플랫폼으로서 사용될 것으로 예상한다.
(6) 임상분석 결과
임상 분석 결과, PCa 환자의 PSA 수치는 다른 그룹에 비해 상대적으로 높다는 것을 확인하였다(표4).
| Demographics in HAZIS-CirR | Age (median, IQR) | Initial PSA value | |
| Circulating mRNA (PCA3) |
PCa (35) | 70 (63-72) | 6.60 (4.00-12.69) |
| BPH (20) | 68 (63.3-74) | 4.62 (3.35-7.09) | |
| Normal (5) | 64 (60-68.8) | 2.31 (1.50-6.29) | |
| Circulating mRNA (TMPRSS2-ERG gene fusion) |
PCa (22) | 70 (68-72.8) | 5.06 (3.70-8.93) |
| BPH (11) | 70 (63.5-75) | 3.13 (1.64-4.70) | |
| Circulating miRNAs | PCa (30) | 70 (62.5-73) | 6.56 (4.30-12.09) |
| BPH (22) | 68 (62.5-74) | 4.45 (3.13-6.61) | |
| Normal (10) | 68.0 (66-71) | 2.31 (0.86-6.98) | |
실시예 2. 미세유체 플랫폼 또는 제올라이트를 이용한 병원체의 농축 및 핵산 추출
1. 실험 방법 및 재료
(1) 미세유체 플랫폼 제작
샘플 준비를 위해 이전에 보고된 바와 같이 나선 모양의 미세 채널로 구성된 미세유체 플랫폼을 이용하였다. 미세유체 칩은 신용카드 크기(70.16 mm x 85 mm x 0.5 mm)이며, AutoCAD 프로그램(Autodesk, Inc., San Rafael, CA)을 이용하여 설계하였고, CO2 레이저 절단기(VLS3. 50 Universal Laser Systems, Scottsdale, AZ)를 이용하여 제작하였다. 친수성 박막 외층(Kemafoil hydrophilic lm, HNW-100, COVEME, Italy)과 양면 테이프 내층(Adhesive 300LSE-9495LE, 3M, St. Paul, MN)은 O2 플라즈마 처리(10분, 100 W, 60 sccm) 후 조립하였다. 미세유체 칩의 입구와 출구에 샘플 주입 및 배출을 위한 아크릴 어댑터를 부착하고, 에폭시(epoxy)를 이용해 어댑터 구멍에 Tygon tubing(AAD04103, Saint-Gobain PPL Corp, USA)을 배치하였다. 내부 표면 실란화는 초순수 증류수(DW)에 3-아미노프로필 디에톡시메틸실란 (APDMS: aminopropyl diethoxymethylsilane, 371890-50ML, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2%를 주사기로 주입하여, 65℃에서 60분간 배양한 후 초순수 증류수 1 mL로 3회 세척하였다. 제작된 미세유체 칩은 사용할 때까지 실온(21℃ 내지 22℃)에서 저장하였다.
(2) 병원체 농축 및 핵산 추출에서 미세유체 플랫폼의 이용
미세유체 플랫폼 내 병원체 농축 및 핵산 추출을 위한 핵심 소재로 동형이기능성 히드라지드 중 하나인 아디프산 디히드라지드를 사용하였다. 동형이기능성 히드라지드는 양 쪽에 두개의 히드라지드 그룹이 있기 때문에 정전기 및 공유 결합을 통해 병원체와 핵산에 직접 결합할 수 있다. 동형이기능성 히드라지드는 미세유체 칩의 실란화된 내부 표면과의 상호작용에 의해 교차 링커 역할을 하며, 동형이기능성 히드라지드 기반 1 단계 병원체 농축 및 DNA 추출 플랫폼의 경우, PBS 1 mL에 희석된 Brucella Ovis(ATCC 25840)를 아디프산 디히드라지드 100 mg과 혼합한 다음 시린지 펌프(KD Scient, MaIUCon, Hollciston)를 사용하여 100 μL의 미세유체 플랫폼에 주입하였다. 병원체 및 미세유체성 내부 표면과 아디프산 디히드라지드의 상호작용을 위해 상온에서 인큐베이션(20분)한 후 PBS 1 mL와 공기를 주입하여 이물질을 세척하고, 50 mg의 아디프산 디히드라지드를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer) 1 mL(20 μL 단백질분해효소 K, 100 mM pH 8.0 Tris-HCl, 10 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid), 1% 로릴 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate) 및 10% Triton X- 100)을 칩(750 μL) 내부에 주입하고, 세포 용해와 DNA 추출을 위해서 56℃에서 배양하였다. PBS와 공기 1 mL를 주입하여 이물질을 세척한 후, 포획된 DNA를 pH 10.6 용출 완충액(10 mM 중탄산나트륨)로 50 μL min-1에서 채취하였다. 아디프산 디히드라지드 기반 RNA 추출 플랫폼의 경우, PBS 200 μL에 희석한 열 비활성화 SARS-Related Corona 2(SARS-CoV-2) 배양액(ZeptoMetrix, Buffalo, NY, USA)을 아디프산 디히드라지드 50 mg, 용해 완충액 200μL, DNase(only RNA) 10 μL 및 PBS 약 350 μL을 주입한 후 시린지 펌프를 이용하여 100 μL min-1로 미세유체 플랫폼에 주입하였다. 세포 용해 및 RNA 농축을 위해 상온에서 인큐베이션(20분)한 후 PBS 1 mL와 공기를 주입하여 이물질을 세척하였다. 포획된 RNA는 pH 10.6 용출 완충액(10 mM 중탄산나트륨)에 의해 50 μL min-1에서 용출되었다. 용출된 핵산은 영하 온도(-20℃ 또는 -80℃)에서 사용할 때까지 저장하였다.
(3) 병원체 농축 및 핵산 추출에서 제올라이트 필터의 이용
아민-개질된 제올라이트, 아디프산 디히드라지드 및 0.45 μm PVDF 시린지 필터를 이용한 병원체 농축 및 핵산추출은 다음과 같이 수행하였다: 구체적으로, 임상 효용 최적화 및 평가에 Brucella Ovis(ATCC 25840)를 함유한 1 mL 용액 또는 임상 샘플을 사용하였고, Brucella Ovis 또는 임상 샘플이 포함된 용액 1 mL에 아민-개질된 제올라이트 5 mg과 아디프산 디히드라지드 50 mg을 첨가하였다. 정전기 상호작용을 위한 인큐베이션은 병원체를 포획하기 위해서 상온에서 20분 동안 수행하였다. 정전기 커플링으로 아민-개질된 제올라이트 표면에 포획한 병원체를 1 ㎖ 주사기(Korea Vaccine Co., Ltd., Yongin, Korea)를 이용하여, 0.45 ㎛ 크기의 주사기 필터를 통해 여과하였다. 아민-개질된 제올라이트에 의해 포획되지 않은 잔여물은 걸러내고, 나머지 잔여물은 PBS 1 ml로 세척하였다. 1 단계 핵산 추출의 경우, 50 mg 아디프산 디히드라지드, 20 μL 단백질분해효소 K, 10 μL DNase(only RNA), 100 mM Tris-HCiam(pH 8.0), 10 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetra-acetic acid), 1% 로릴 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate) 및 10% Triton X-100를 주사기 필터에 넣고, 주사기 필터를 56℃(DNA의 경우) 또는 상온(RNA의 경우)에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해 완충액에 의해 방출된 핵산은 정전기 결합과 공유 결합에 의해 아민-개질된 제올라이트 표면에 포획되었고, 포획되지 않은 잔류물은 필터를 통해 제거되었다. 나머지 잔여물은 PBS 3 mL로 세척하였다. 농축된 병원체는 핵산 추출 단계 이전에 50 mM 중탄산나트륨(S5761-500G, Sigma-Aldrich)의 높은 pH(pH 10.6) 용출 완충액 100 μL를 사용하여 병원체, 아민-개질된 제올라이트 및 아디프산 디히드라지드 사이의 교차 결합을 끊음으로써 용출되었다. 용출된 병원체 및 핵산은 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 수집하고, 사용하기 전까지 -20℃또는 -80℃에서 저장하였다.
(4) Brucella Ovis 및 SARS-CoV-2 배양액의 검출 한계 및 포획 효율 평가
동형이기능성 히드라지드 기반 샘플 준비 시스템인 Brucella Ovis(1 x 105 mL-1 내지 1 x 100 CFUs mL-1) 및 열 비활성화 SARS-Related Coronavirus 2(SARS-CoV-2) 배양액의 검출 한계 및 포획 효율을 평가하기 위해 연속적으로 희석된 PBS(0.96 x 105 PFUs mL-1 내지 0.96 x 100 PFUs mL-1)를 사용하였다. 제올라이트와 시린지 필터를 이용한 방법에서는 DNA 및 RNA 분석에 Brucella Ovis를 이용하였고, 미세유체 플랫폼을 이용한 방법에서는 Brucella Ovis를 DNA 분석에 이용하고, 열 비활성화 SARS-Related Coronavirus 2(SARS-CoV-2) 배양액을 RNA 분석에 이용하였다. 준비된 샘플은 즉시 사용하거나 사용할 때까지 영하의 온도(-20℃ 또는 -80℃)에 저장하였다.
동형이기능성 디히드라지드 후보물질(아디프산 디히드라지드, 탄산 디히드라지드, 옥살릴 디히드라지드, 말론산 디히드라지드 및 숙신산 디히드라지드)을 이용하여 병원체 및 핵산에 직접 결합하는 능력을 비교하였으며, 각 물질은 아디프산 디히드라지드와 동일한 조건에서 테스트하였다.
(5) 핵산 추출 및 PCR 검출을 위한 기존 방법
동형이기능성 디히드라지드 기반 시료 준비를 비교 및 검증하기 위해 컬럼 기반 핵산 추출 키트 및 PCR과 같은 기존 방법을 사용하였다. DNA 추출을 위해 QIAamp DNA Mini 및 Blood Mini 키트를 사용하여 Brucella Ovis에서 DNA를 추출하였고, 모든 절차는 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 샘플은 100 μL 내지 200 μL의 시작 부피(starting volume)로 사용되었으며, Qiagen AE 용출 버퍼를 사용하여 100 μL를 용리하였다. 용출된 DNA를 용출하고 사용하기 전까지 -20℃에서 저장하였다.
종점 및 정량적 PCR(qPCR)의 경우, 합성된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 프로브의 서열 및 상세 정보를 표 5에 나타내었다. DNA 및 RNA는 Brucella Ovis 및 열 비활성화 SARS-관련 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 배양액에서 획득하였다. DNA에 대한 종점 PCR은 수정된 제조업체 지침에 따라 Taq PCR Core Kit(201225, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행하였다. 종점 PCR 증폭은 95℃에서 15분, 이어서 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 40회 사이클을 수행한 후 T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 72℃에서 10분간 최종 연장된 상태로 종료된다. 모든 종점 PCR 반응은 25 μL의 PCR 반응 완충액에서 5 μL의 DNA를 이용하여 수행하였고, LoadingSTAR(A750, Dyne Bio Inc., Seoul, Korea)를 함유한 2% 아가로스겔 상에서 PCR 산물을 분리하기 위해 겔 전기영동을 수행하였다. 아가로스겔은 ChemiDoc XRS + 시스템(Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)을 사용하여 시각화하였고, DNA에 대한 qPCR은 수정된 제조업체 지침과 함께 Brilliant III SYBR Green QPCR Master Mix(600882, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 수행하였다. qPCR 증폭은 95℃에서 10분, 그 후 95℃에서 10초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초의 40주기로 구성되고, 종료는 1%의 램프 비율로 구성된 용융 곡선 단계에서 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃에서 1분으로 구성되고, 그 후 CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 15초 동안 60℃에서 15초로 구성된다. 모든 qPCR 반응은 20 μL의 PCR 반응 완충액에 5 μL의 DNA를 사용하였고, 바이러스 RNA에 대한 TaqMan RT-qPCR은 수정된 제조업체 지침과 함께 LightCycler® Multiplex RNA Virus Master(07083173001, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행하였다. TaqMan RT-qPCR 증폭은 CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR 검출 시스템에서 95℃에서 5분, 95℃에서 5초, 60℃에서 20초의 40주기로 구성되고, 모든 TaqMan RT-qPCR 반응은 20μL의 PCR 반응 완충액에 5μL의 DNA를 사용하였다.
| Target | Location | Sequence (5'-3') | Length (bp) |
서열 번호 | |
| DNA | Brucella Ovis (pgk) |
Forward | GCT TTC GAC CGA CCT CAT TG | 20 | 서열번호 13 |
| Reverse | CCG CCA GCG GTT GAG ATA TA | 20 | 서열번호 14 | ||
| MTB (IS6110) |
Forward | CTA ACC GGC TGT GGG TAG | 18 | 서열번호 15 | |
| Reverse | GTC TTT CAG GTC GAG TAC | 18 | 서열번호 16 | ||
| RNA | Brucella Ovis (IS711) |
Forward | GCT TGA AGC TTG CGG ACA GT | 20 | 서열번호 17 |
| Reverse | GGC CTA CCG CTG CGA AT | 17 | 서열번호 18 | ||
| SARS-CoV-2 (N) |
Forward | TGG CAG TAA CCA GAA TGG AGA AC | 23 | 서열번호 19 | |
| Reverse | AGT GAG AGC GGT GAA CCA AGA | 21 | 서열번호 20 | ||
| Probe | CGC GAT CAA AAC AAC GTC GGC C | 22 | 서열번호 21 | ||
(6) 임상 분석 방법
임상 분석을 위해 OMNIgene을 이용하여 구강 면봉을 수행하였고, 제조업체의 지침에 따라 ORAL OMR-110 키트(DNA Genotek, Ottawa, Canada)를 이용하였다. 면봉을 피험자의 입천장, 잇몸 위쪽 및 혀 뒤쪽을 따라 약 10초(부위당 5 내지 6회, 총 20회) 동안 앞뒤로 닦은 후 다시 입을 만지기 위해 닦았다. 면봉을 안정화 용액이 들어 있는 튜브에 삽입한 후 샘플을 즉시 실험실로 보내고, 분석하기 전까지 -80℃에서 저장하였다. 구강 면봉 샘플(1 mL)은 Ganoza et al(9) 및 기존 방법에 따라 1:1 비율의 액화 용액(4% NALC, 1·45% 시트르산나트륨 및 2·67% NaOH)에 액화시키고, 아디프산 디히드라지드 기반 시료 제조에 사용하였다.
(7) 동형이기능성 디히드라지드 기반 샘플 준비의 작동 원리
액체 시료에서 세포와 유전 물질을 농축하는 것은 감염병의 검출 민감도를 높이기 위해 동반되어야 하는 중요한 기술이다. 비카오트로픽 및 pH 민감성 동형이기능성 디히드라지드는 생체 분자를 빠르고 간단하며 저렴하게 농축 및 추출하기 위해 고체 지지체에 적용된다. 도 9는 미세유체 칩 또는 제올라이트 필터를 고체 지지 물질로 하여, 병원체 농축 및 핵산 추출을 위한 동형이기능성 디히드라지드 기반의 시료 준비 시스템의 원리를 나타낸다. 동형이기능성 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드, 탄소 디히드라지드, 옥살릴 디히드라지드, 말론산 디히드라지드 및 숙신산 디히드라지드를 포함하고, 두개의 반응성 히드라지드기를 가지며, 생체 분자와 고체 지지 물질 사이의 가교제로 작용한다. 카르보닐 반응성 가교제로서 동형이기능성 히드라지드는 히드라존 결합을 통한 항체 및 당단백질 결합체 제조와 같은 단백질 관련 연구에 사용되어 왔다. 본 연구는 동형이기능성 히드라지드의 히드라존 결합과 두개의 친핵성 아민 그룹 및 히드라지드 그룹의 알데히드 그룹의 공유 결합 및 정전 결합의 추가 결합을 이용한다. 먼저 플라즈마, 소변, 비인두 면봉 안정화 용액 등의 액체 시료를 상온에서 동형이기능성 히드라지드와 혼합하여 제조한다. 미세유체 칩 또는 제올라이트에 주입된 준비된 샘플은 병원체 농축을 위해서 첨가되었다. 고체 지지 표면은 동형이기능성 히드라지드의 한 면과 이민 결합을 생성할 수 있다. 고정 또는 부유 동형이기능성 디히드라지드의 두 친핵성 아민 그룹뿐만 아니라 미세유체 칩의 내부 표면과 제올라이트 표면의 아민 그룹은 양전하를 띠고 있어 음전하를 띤 병원체를 포획하고 농축한다. 농축된 병원체는 동형이기능성 히드라지드를 포함하는 용해 완충제를 사용하여 추출된 핵산이고, 결합 메커니즘은 다음과 같다: (1) 양전하를 띤 고체 지지체와 동형이기능성 히드라지드는 음전하를 띤 핵산에 정전기적으로 결합한다. (2) 동형이기능성 히드라지드의 카르보닐 그룹은 고체 지지체 및 핵산의 아민 그룹과 이민 결합을 형성한다. (3) 동형이기능성 히드라지드의 히드라지드 그룹은 핵산의 카보닐 그룹과 히드라존 결합을 형성한다. 포획된 핵산은 고체 지지대에서 핵산을 분리하기 위해 용출 완충제를 사용하여 추출하였다. 두 개의 고체 지지체를 사용하는 아디프산 디히드라지드 기반 병원체 농축 및 핵산 추출 시스템은 병원체 용해 시 단일 온도(56℃)만 필요하며, 원심분리기와 온도 조절기와 같은 특수 장비가 필요하지 않다. 또한, 액체 임상 검체에 병원균을 신속하게 농축할 수 있을 뿐만 아니라 핵산 추출을 포함한 1 단계 샘플 준비도 1시간 이내에 완료할 수 있다.
2. 실험 결과
(1) 병원체 농축 및 핵산 추출을 위한 효율성
아디프산 디히드라지드 기반 시료 전처리 시스템의 작동 및 효율성을 확인하기 위해 Brucella Ovis를 이용하여 동형이기능성 히드라지드를 이용한 병원체 농축 및 핵산 추출을 수행하였다. 먼저 동형이기능성 히드라지드 후보 아디프산 디히드라지드, 탄산 디히드라지드, 옥살릴 디히드라지드, 말론산 디히드라지드 및 숙신산 디히드라지드를 이용한 시료 준비의 효율성을 평가하였다. 그 결과, 동형이기능성 히드라지드 중에서 아디프산 디히드라지드가 가장 높은 포획 효율이 나타났고, 모든 후보물질을 사용한 시료 준비에서 유사한 수준으로 병원균 농축 및 핵산 추출이 가능하다는 것을 확인하였다(도 10).
(2) 기존 PCR을 이용한 검출 한계
아디프산 디히드라지드 기반 시료 전처리 시스템의 민감도를 확인하기 위해 연속 희석된 Brucella Ovis와 열 불활성화된 SARS-CoV-2(SARS-CoV-2) 배양액을 사용하여 검출 한계를 결정하였다(도 11). DNA 추출을 위한 아디프산 디히드라지드 기반 시료 준비는 미세유체 칩과 제올라이트 필터를 이용하여 수행하였고, 농도 구배에 따라 시료가 점차 증폭되는 것을 확인하였다. 또한, 아디프산 디히드라지드 기반의 시료 전처리 시스템은 종래의 컬럼계 DNA 추출 키트(1 × 103 CFUs ML-1)에 비해, DNA(1 × 102 CFUs mL-1)의 검출 감도가 10배 높은 것을 확인하였다. 이는 제한된 부피의 사용으로 인한 낮은 검출 민감도가 병원체 농도와 핵산 추출을 통해 감염성 질환의 검출 민감도를 향상시킨다는 것을 의미한다. 또한, 추출된 RNA의 검출 한계는 원스텝 아디프산 디히드라지드 기반의 시료 전처리 시스템을 사용하여 결정한 결과, 미세유체 플랫폼과 제올라이트 필터의 검출 한계는 각각 1 × 102 CFUs mL-1 및 0.96 × 102 PFUs mL-1이라는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 아디프산 디히드라지드 기반 시료 전처리 시스템이 고농도 및 고효율 DNA 및 RNA 검출에 사용될 수 있음을 의미한다.
(3) 아디프산 디히드라지드 기반 샘플 전처리의 임상적 유용성
우리는 Mycobacterium tuberculosis(MTB)를 농축하고 3개의 비인두 면봉 샘플에서 DNA를 추출하여, 감염병 진단을 위한 아디프산 디히드라지드 기반 샘플 준비 시스템의 임상적 유용성을 확인하였다(표 6). 구체적으로, 비인두 면봉 샘플은 임상 진단을 받은 결핵 환자로부터 획득하였으며, 액체 샘플로 안정화 용액을 사용하였다. 세 샘플 모두 컬럼 기반 키트를 이용하여 추출한 DNA에서 IS6110 유전자(Genbank No. NC_000962.3)를 검출하여 양성 판정을 받았다. 그러나 기존의 방법에 비해 아디프산 디히드라지드 기반 시료 전처리 시스템은 Ct 값이 낮고 핵산 검출량이 더 많은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 저검출 감도로 인한 오음성(false negatives)이 고효율 병원체 농축을 기반으로 감소될 수 있음을 보여주며, 간편하고 빠른 과정으로 신속한 진단이 필요한 감염성 질환에 사용할 수 있다.
| Mycobacterium tuberculosis (MTB) (Nasopharyngeal swab) |
||
| Column-based Sample preparation (100 μL) |
HHs-based Sample preparation (1 mL) |
|
| Sample #1 (Ct value) |
29.25 | 26.35 |
| Sample #2(Ct value) | 34.01 | 31.81 |
| Sample #3(Ct value) | 34.19 | 31.68 |
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
<120> A composition for detecting or isolating nucleic acids and a
method for detecting or isolating nucleic acids using the same
<130> PD21-467
<160> 21
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting PCA3 mRNA
<400> 1
gagaacaggg gagggagag 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting PCA3 mRNA
<400> 2
acgttctggg atacatgtgc 20
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting TMRSS2-ERG fusion mRNA
<400> 3
cctggagcgc ggcaggaagc cttatcagtt g 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting TMRSS2-ERG fusion mRNA
<400> 4
tcctgctgag ggacgcgtgg gctcatcttg 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting 18S rRNA
<400> 5
cctggatacc gcagctagga 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting 18S rRNA
<400> 6
gcggcgcaat acgaatgccc c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting has-miR-21-5p micro RNA
<400> 7
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting has-miR-141-3p micro RNA
<400> 8
taacactgtc tggtaaagat gg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting has-miR-375-3p micro RNA
<400> 9
tttgttcgtt cggctcgcgt ga 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting has-miR-148a-3p micro RNA
<400> 10
tcagtgcact acagaagttt gt 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting has-miR-483-5p micro RNA
<400> 11
aagacgggag gaaagaaggg ag 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting has-miR-574-3p micro RNA
<400> 12
cacgctcatg cacacaccca ca 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting Brucella Ovis(pgk) DNA
<400> 13
gctttcgacc gacctcattg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting Brucella Ovis(pgk) DNA
<400> 14
ccgccagcgg ttgagatata 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting MTB(IS6110) DNA
<400> 15
ctaaccggct gtgggtag 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting MTB(IS6110) DNA
<400> 16
gtctttcagg tcgagtac 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting Brucella Ovis(IS711) RNA
<400> 17
gcttgaagct tgcggacagt 20
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting Brucella Ovis(IS711) RNA
<400> 18
ggcctaccgc tgcgaat 17
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for targeting SARS-CoV-2(N) RNA
<400> 19
tggcagtaac cagaatggag aac 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for targeting SARS-CoV-2(N) RNA
<400> 20
agtgagagcg gtgaaccaag a 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe for targeting SARS-CoV-2(N) RNA
<400> 21
cgcgatcaaa acaacgtcgg cc 22
Claims (25)
- 하기 화학식 1의 화합물 또는 하기 화학식 2의 화합물을 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 조성물:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
- 청구항 1에 있어서, 상기 n은 0 내지 4 중 선택되는 하나의 정수인, 핵산의 검출 또는 분리용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, miRNA, mRNA, siRNA, tRNA, sgRNA 및 shRNA으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산인, 핵산의 검출 또는 분리용 조성물.
- 청구항 1의 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 청구항 4에 있어서, 상기 고체 지지체의 표면은 아민(amine)기로 개질된 것인, 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 청구항 5에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 아민기 및 상기 핵산은 이민 결합(Immine bond), 히드라존 결합(Hydrazone bond) 및 정전기적 인력(Electrostatic attraction)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 인력으로 상호 작용하는 것인, 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 청구항 4에 있어서, 상기 고체 지지체는 제올라이트(zeolite), 크로모솔브(Chromosorb) 및 규조토 (Diatomaceous earth)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 청구항 7에 있어서, 상기 고체 지지체는 미세유체 플랫폼 형태인, 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 청구항 7에 있어서, 상기 제올라이트, 상기 크로모솔브 및 상기 규조토의 직경은 0.1 내지 100 μm 인, 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 청구항 4에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물 및 상기 고체 지지체는 30:1 내지 1:10의 중량비로 존재하는 것인, 핵산의 검출 또는 분리용 키트.
- 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 핵산의 검출 또는 분리 방법:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
- 청구항 11에 있어서, 상기 고체 지지체의 표면은 아민(amine)기로 개질된 것인, 핵산의 검출 또는 분리 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 시료인, 핵산의 검출 또는 분리 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 결합은 상기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 상기 고체 지지체의 표면에 존재하는 아민기 및 상기 핵산 간의 이민 결합(Immine bond), 히드라존 결합(Hydrazone bond) 및 정전기적 인력(Electrostatic attraction)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 인력인 것인, 핵산의 검출 또는 분리 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 핵산을 분리하는 단계 이전에 상기 고체 지지체의 표면을 세척하는 단계를 더 포함하는, 핵산 검출 또는 분리 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 고체 지지체는 제올라이트(zeolite), 크로모솔브(Chromosorb) 및 규조토(Diatomaceous earth)이며,
상기 핵산을 분리하는 단계 이전에 상기 결합된 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체 및 핵산을 여과하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 검출 또는 분리 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 여과 단계는 0.1 μm 미만의 기공을 갖는 필터로 수행되는 것인, 핵산의 검출 또는 분리 방법.
- 청구항 1의 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 양성 전립선비대증(BPH: benign prostatic hyperplasia) 환자의 전립선암(PCa: prostate cancer) 진단용 조성물로서,
상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
- 청구항 18의 전립선 암 진단용 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단용 키트.
- 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 양성 전립선비대증(BPH) 환자의 전립선암(PCa) 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
상기 핵산은 miR-141-3p, miR-375-3P, miR-483-5P 및 miR-574-3P로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 방법:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
- 청구항 1의 핵산의 검출 또는 분리용 조성물을 포함하는 감염성 질환의 진단용 조성물.
- 청구항 21에 있어서, 상기 감염성 질환은 수족구병, 풍진, 유행성결막염, 독감, 장염, 홍역, 농가진, 수두, 세균성뇌수막염 및 결핵으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
- 청구항 21에 있어서, 상기 핵산은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래 IS6110 유전자인, 조성물.
- 청구항 21의 감염성 질환의 진단용 조성물 및 고체 지지체를 포함하는 감염성 질환의 진단용 키트.
- 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 화합물, 고체 지지체의 표면 및 개체로부터 분리된 시료 내 핵산을 결합시키는 단계; 및
상기 고체 지지체의 표면으로부터 상기 핵산을 분리하는 단계를 포함하는 감염성 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법:
[화학식 1]
,
[화학식 2]
,
상기 n은 0 내지 10 중 선택되는 하나의 정수이다.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220053426A KR20230153706A (ko) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | 핵산의 검출 또는 분리용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 검출 또는 분리 방법 |
| PCT/KR2023/005646 WO2023211130A1 (ko) | 2022-04-29 | 2023-04-26 | 핵산의 검출 또는 분리용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 검출 또는 분리 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220053426A KR20230153706A (ko) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | 핵산의 검출 또는 분리용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 검출 또는 분리 방법 |
Publications (1)
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